AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA DE ÓLEO DE PALMA
BRUTO APÓS A FRITURA DE ACARAJÉS
Alessandra Quirino Gonçalves
Rio de Janeiro
2012
ALESSANDRA QUIRINO GONÇALVES
Aluna do Curso de Ciências Biológicas
Matrícula 0913800225
AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA DE ÓLEO DE PALMA
BRUTO APÓS A FRITURA DE ACARAJÉS
Trabalho de Conclusão de Curso, TCC, apresentado
ao Curso de Graduação em Ciências Biológicas da
UEZO como parte dos requisitos para a obtenção de
grau de Bacharel em Ciências Biológicas, sob a
orientação do Prof. Dr. Israel Felzenszwalb.
Rio de Janeiro
Dezembro de 2012
ii
AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA DE ÓLEO DE PALMA
BRUTO APÓS A FRITURA DE ACARAJÉS
Elaborado por Alessandra Quirino Gonçalves
Aluna do Curso de Ciências Biológicas da UEZO
Este trabalho de graduação foi analisado e aprovado com
Grau:
Rio de Janeiro, 14 de Dezembro de 2012
______________________________________________
Andréia da Silva Fernandes Campos, Doutoranda em Biologia (Biociências)
______________________________________________
Cristiane Pimentel Victorio, Doutora em Ciências Biológicas (Biofísica)
______________________________________________
Israel Felzenszwalb, Doutor em Ciências da Vida (Biofísica)
Professor Orientador
______________________________________________
Adriano Arnóbio José da Silva e Silva, Doutorando em Ciências Médicas
Presidente da Banca
RIO DE JANEIRO, RJ – BRASIL
DEZEMBRO DE 2012
iii
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter me sustentado em todos os momentos. Por ter sido meu auxiliador e
grande amigo. Agradeço porque sem Ele eu não faria nada.
A minha família, que me apoiou desde o início da minha graduação e que tentou de
todas as maneiras possíveis me ajudar na realização deste trabalho, nem que fosse me
comprando um acarajé.
Aos meus grandes amigos Carlos e Joalmir que foram fundamentais para manter minha
sanidade durante esses anos e principalmente durante esse trabalho.
Agradeço à Célula – Marcelle, Rafael, Pedro, Yasmin, Agatha, Felipe e Rômulo – pelo
amor e amizade que compartilhamos durante esse período que será inesquecível. E
também pela ajuda e apoio em momentos essenciais. Tenho certeza que não conseguiria
chegar até aqui sem vocês.
Aos professores Israel Felzenszwalb e Claudia Aiub, agradeço pela dedicação, esforços
e orientação conferida. Agradeço também pela oportunidade de desenvolver esse
projeto e pela experiência adquirida durante esse período de iniciação científica.
À professora Deusdélia Almeida, pelo fornecimento das amostras de azeite e pela ajuda
concedida, sem a qual, não poderia realizar esse trabalho.
Ao pessoal da pós do Labmut - Andréia, Carlos, Felipe, Vanessa, Francisco, Claudia e
Raphael -, agradeço pela ajuda e amizade que recebi desde meu primeiro dia de estágio.
Pelos conhecimentos passados, pelos puxões de orelha e pela convivência mais que
agradável.
Aos meus Irmãos Científicos, guerreiros da pia, mestres autoclavadores, dominadores
do Ames e senhores do micronúcleo, agradeço pela companhia que foi essencial.
Ao Marcos e a Juliana, pelos momentos compartilhados, mesmo que raros. Pela ajuda
que ofereceram sempre que possível e pelo companheirismo que sempre existiu.
Ao Rafael, meu Irmão Científico mais velho e companheiro de muitas horas. Obrigada
por me fazer rir mesmo nos dias que eu só queria chorar.
Aos Namekuseijins serei eternamente grata por me fornecerem toda informação
necessária sobre o Dendê.
iv
RESUMO
O acarajé é um alimento comumente comercializado nas ruas de diversas cidades do
Brasil, sendo frito por imersão em óleo de palma bruto (OPB). Diversos pratos típicos da
cultura brasileira utilizam esse óleo como elemento fundamental na fritura por imersão, em
especial o acarajé. Sabe-se que a presença alimentos durante o processo de fritura afeta
significantemente a degradação do óleo. Tendo em vista o grande consumo brasileiro do
acarajé, avaliações toxicológicas foram realizadas no óleo utilizado em sua fritura, para
determinar se esse processo acrescenta ao óleo algum risco à saúde da população
consumidora. O OPB utilizado em 25 horas de fritura foi analisado pelo ensaio Salmonella/
microssoma utilizando as linhagens de Salmonella typhimurium TA97, TA98, TA100 e
TA102 na presença e ausência de ativação metabólica (S9 mix) e pelo ensaio de indução
de micronúcleo em macrófagos da linhagem RAW 264,7. Não foi identificada atividade
mutagênica no óleo, na presença e ausência de S9, pelo ensaio Salmonella/microssoma e
também não foi observada atividade genotóxica através do ensaio de indução de
micronúcleo em macrófagos, assim como nenhuma indução significativa de necrose e
apoptose. Os resultados sugerem que o óleo de palma bruto após o processo de fritura de
acarajés não oferece risco genotóxico à população consumidora desses alimentos.
Palavras-chave: óleo de palma, toxicologia, mutagenicidade, micronúcleo
v
ABSTRACT
The akara is a dish commonly commercialized in streets of various cities in Brazil, being
deep fried in crude palm oil (OPB). Several typical dishes from Brazilian culture utilize
this oil as a fundamental element in deep frying, in special the akara. It is known that the
presence of some food during this cooking process affects significantly the oil degradation.
In view of the great consumption of this dish in Brazil, toxicological evaluations have been
carried out on the oil used in its deep frying process to determine whether this process
makes the oil unsafe for human consumption. The OPB utilized in 25 hours of frying was
analyzed by the Salmonella/microssome assay using Salmonella typhimurium strains
TA97, TA98, TA100 and TA102 with and without exogenous metabolic activation (S-9
mix). It was also performed the micronucleus induction assay with macrophages RAW
264.7. No mutagenic activity induced by OPB was observed in the Salmonella/microssome
assay both in the presence and absence of S-9 mix. It was also observed no genotoxic
activity in the micronucleus induction assay, as well as no significant induction of cell
necrosis and apoptosis. The results of this study suggest that crude palm oil after the deep
frying of akaras does not offer genotoxical risks to the consuming population.
Keywords: palm oil, toxicology, mutagenicity, micronucleus
SUMÁRIO
Resumo ............................................................................................................................iv
Abstract............................................................................................................................v
1. INTRODUÇÃO........................................................................................................... 1
1.1. A ORIGEM DO ÓLEO DE PALMA...................................................................... 1
1.2. CARACTERÍSTICAS DO ÓLEO DE PALMA ..................................................... 2
1.3. A FRITURA POR IMERSÃO................................................................................ 2
1.4. ESTUDOS CITOTÓXICOS, MUTAGÊNICOS E GENOTÓXICOS ..................... 4
2. OBJETIVOS ............................................................................................................... 6
2.1. OBJETIVO GERAL............................................................................................... 6
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................................. 6
3. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................ 7
3.1. PREPARO DO ÓLEO DE PALMA BRUTO (OPB) .............................................. 7
3.1.2. O Processo De Fritura Do OPB..................................................................... 7
3.2. LINHAGENS BACTERIANAS ............................................................................. 9
3.2.1. Características Genéticas .............................................................................10
3.3. METABOLIZAÇÃO EXÓGENA (S9 MIX) .........................................................11
3.4. ENSAIO DE MUTAGENICIDADE......................................................................11
3.5. ENSAIO DE SOBREVIVÊNCIA..........................................................................12
3.6. CULTURA DE CÉLULAS RAW 264,7................................................................13
3.7. ENSAIO DO MICRONÚCLEO ............................................................................13
4. RESULTADOS ..........................................................................................................16
4.1. MUTAGENICIDADE...........................................................................................16
4.2. AVALIAÇÃO DE MICRONÚCLEO....................................................................20
5. DISCUSSÃO ..............................................................................................................22
6. CONCLUSÃO............................................................................................................24
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................25
1
1.1
INTRODUÇÃO
A ORIGEM DO ÓLEO DE PALMA
O óleo de palma ou, como é conhecido no Brasil, azeite de dendê é derivado do
mesocarpo do fruto da palmeira comumente chamada de Dendezeiro (Eleais guineensis).
(Figura 1). Possui, quando bruto, uma coloração avermelhada e se apresenta com
consistência semi-sólida em temperatura ambiente nos países de clima tropical e sólida em
países de clima temperado. Apenas no Brasil e na África, tal óleo é consumido no estado
natural (LODY, 2009). O Dendezeiro tem sua origem atribuída à região da floresta tropical
no oeste africano, onde o óleo de palma se constitui em um ingrediente essencial de grande
parte da culinária tradicional da região. (POKU, 2002)
No século XVII, frutos dessa palmeira foram transportados para as Américas, no
contexto da escravidão africana, e assim, tanto o cultivo do dendezeiro quanto o processo
de extração do azeite foram introduzidos no Brasil (VAINSENCHER, 2012). As regiões
produtoras do país são encontradas no Pará, Amazonas, Amapá e Bahia, áreas em que a
temperatura moderadamente alta, a distribuição das chuvas no decorrer do ano e adequada
insolação média anual viabilizam a produção do dendezeiro visando o mercado
consumidor (BASIRON, 2005; AGROPALMA, 2012).
Figura 1: Imagem de frutos do dendezeiro (Fonte: EMBRAPA)
2
1.2
CARACTERÍSTICAS DO ÓLEO DE PALMA
Igualmente a todos os óleos e gorduras, o azeite de dendê é composto
majoritariamente por materiais glicídicos, sendo que aproximadamente 50% dos ácidos
graxos nele presentes são saturados e 50% são insaturados. Os principais ácidos são o
palmítico, o mirístico, esteárico, oléico e linoléico (SAMBANTHAMURTHI et al., 2000;
BORA et al., 2003). O azeite também possui componentes minoritários, que, apesar de
constituírem uma pequena porcentagem do óleo de palma, tem um papel significante na
sua estabilidade e no aumento de seu valor nutritivo. Grande parte desses componentes
minoritários possui atividade antioxidante, a saber, os triterpenos (GOVIND, 1968; GOH,
1986), ubiquinonas (HAZURA, 1996), compostos fenólicos (AUDLEY, 1986), esteróis
(GORDON, 1983), carotenóides (YAP, 1991), de onde advém a cor avermelhada do azeite
de dendê e tocoferóis e tocotrienóis (GAPOR, 1981). O efeito combinado de suas
propriedades, juntamente com 50% de insaturação dos ácidos graxos, confere ao óleo de
palma uma maior estabilidade oxidativa em comparação aos outros óleos vegetais
(WATTANAPENPAIBOON e WAHLQVIST, 2003; BERGER, 2005; BASIRON, 2005;
MALASIAN PALM OIL COUNCIL, 2008). O conteúdo de tocoferóis, tocotrienóis e
carotenóides é maior no óleo de palma bruto (OPB), pois parte é degradada no processo de
refino, devido às altas temperaturas utilizadas (RODRIGUEZ-AMAYA, 1996).
1.3
A FRITURA POR IMERSÃO
No Brasil, principalmente na Bahia, o azeite de dendê é fundamental no preparo de
bolinhos de acarajé, uma iguaria largamente comercializada nas ruas das cidades não só da
Bahia, mas também em diversas regiões do país pelas chamadas baianas de acarajé.
Os acarajés são fritos por imersão no OPB, processo que se constitui no aquecimento
de uma grande quantidade de óleo em um recipiente apropriado e, imersão dos alimentos a
serem fritos, quando a temperatura ideal é atingida. A fritura é um procedimento muito
eficiente no preparo de alimentos. Isso é devido à maior facilidade que os óleos possuem
em transferir calor e às elevadas temperaturas que podem alcançar, bem acima da atingida
pela água usada no cozimento (BASIRON, 2005). A temperatura de fritura permite que
alterações químicas ocorram tornando o alimento mais saboroso e deixando-o mais atrativo
ao consumo, o que faz com que esse processo seja aceito e apreciado por diferentes grupos
3
populacionais no mundo (STEVENSON et al., 1984; DAMY e JORGE, 2003; CORSINI e
JORGE, 2006; REDA e CARNEIRO, 2007).
Há dois tipos de fritura por imersão: contínua e descontínua. A fritura contínua é
normalmente utilizada pelo mercado industrial para fritura de snacks extrusados, massas
fritas, pré-fritura e fritura de batatas. A descontínua é utilizada principalmente, pelo
mercado institucional que compreende as redes de fast-food, restaurantes e pastelarias,
assim como a fritura dos acarajés (McSAVAGE e TREVISAN, 2001; SANIBAL e
MANCINI-FILHO, 2002).
Durante esse processo de fritura por imersão, o óleo está propenso a alterações
provenientes de (1) reações térmicas, devido à elevada temperatura atingida pelo óleo de
palma; (2) hidrolíticas, devido à exposição à água, proveniente do próprio alimento; e (3)
oxidativas, a partir do contato da superfície do óleo com o ar (REDA e CARNEIRO, 2007;
VELASCO et al., 2008). Assim, mudanças físicas ocorrem com o óleo, entre os quais
escurecimento, aumento na viscosidade, diminuição do ponto de fumaça e formação de
espuma. Alterações químicas também acontecem, a saber, a formação de ácidos graxos
livres, monoacilgliceróis e diacilgliceróis originados da hidrólise do óleo (GERTZ, 2000).
Além disso, o óleo pode oxidar formando peróxidos, hidroperóxidos, dienos conjugados,
epóxidos, hidróxidos e cetonas; pode também se decompor em pequenos fragmentos ou
ainda manter-se na molécula do triacilglicerol e se associar, conduzindo a triacilgliceróis
diméricos e poliméricos (SANIBAL e MANCINI-FILHO, 2002).
Estas alterações são afetadas por diversos fatores como tempo e temperatura de
fritura, composição de ácidos graxos e componentes minoritários do óleo, além da
composição do alimento submetido à fritura (FEDELI, 1988; HOUHOULA et al., 2003;
TYAGI e VASISHTHA, 1996). Sabe-se que a presença de determinados alimentos durante
o processo de fritura afeta significantemente a degradação do óleo utilizado (BELITZ et
al., 2004). Estudos realizados com a fritura por imersão de batatas investigaram o efeito da
adição desse alimento ao processo, utilizando óleo de oliva extra virgem (KALOGIANNI
et al., 2010) e óleo de palma (KALOGIANNI et al., 2009). Os autores demonstraram que a
presença das batatas acelerou o aparecimento de compostos de degradação no óleo de oliva
e aumentou a velocidade de polimerização no óleo de palma, o que não ocorreu quando o
óleo foi apenas aquecido à mesma temperatura sem a adição das batatas.
O conjunto das substâncias de degradação formadas a partir das reações químicas
originadas pela fritura é denominado quantitativamente de compostos polares (CP) e a
4
formação destes está intimamente ligada à estabilidade oxidativa dos óleos e gorduras
(AOAC, 2003). Tais reações foram esboçadas por Gertz (2000) e podem ser observadas no
esquema apresentado na figura 2.
Sabe-se que os compostos de degradação afetam a qualidade funcional, sensorial e
nutricional não apenas do óleo, mas também dos alimentos, pois devido a absorção do
óleo, esses compostos se tornam ingrediente do produto (FREITAS et al., 2009).
Processo de fritura por imersão – Mudanças em elevada temperatura
Fenômenos físicos
Aeração
Vaporização
Vapor
Espuma
Fumaça
Solubilização
Coloração
Mudanças em:
Viscosidade
Densidade
Tensão superficial
Constante
dielétrica
Condutividade
Meio
Alimento (proteínas,
água, gordura,
carboidratos, sais,
ácidos (pH))
Gordura
de Fritura
Reações Químicas
Hidrólise
Autoxidação
Oxidação
Desidratação
Di-Polimerização
Ciclização
Reação de Maillard
Antioxidantes
Aditivos
Gás protetivo
Antiespumante
Oxigênio
Calor
(Temperatura)
Produzindo:
"Compostos
polares" como
Aldeídos, Cetonas,
Compostos diméricos
e poliméricos, Ácidos
Graxos livres, etc.
Figura 2: Transformações físicas e químicas no processo de fritura (Fonte: GERTZ, 2000)
1.4
ESTUDOS CITOTÓXICOS, MUTAGÊNICOS E GENOTÓXICOS
Através da realização de estudos genotóxicos sobre determinada amostra é possível
que haja a detecção de agentes químicos ou físicos que possuem a capacidade de gerar
danos ao DNA de forma direta ou indireta.
O ensaio Salmonella/microssoma é uma metodologia rápida, segura e largamente
utilizada para detectar substâncias mutagênicas. O teste utiliza organismos procariotos
como ferramenta e avalia possível atividade mutagênica ou citotóxica de uma determinada
5
amostra. Por isso, devido a ausência de estudos na literatura com o óleo de palma não
processado, uma avaliação mutagênica e citotóxica desse óleo torna-se necessária, devido
ao cuidado com a saúde dos consumidores de azeite de dendê em seu estado natural.
6
2
OBJETIVOS
2.1
OBJETIVO GERAL
Avaliar possível atividade mutagênica e genotóxica de óleo de palma bruto antes e
após o tradicional processo de fritura das baianas de acarajé.
2.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Investigar a indução de mutações pontuais da cadeia de DNA pelo óleo de palma
bruto.

Investigar a indução genotóxica pelo óleo de palma bruto na formação de
micronúcleo e outros eventos celulares como necrose, apoptose e divisão celular.
7
3
MATERIAL E MÉTODOS
3.1
PREPARO DO ÓLEO DE PALMA BRUTO (OPB)
As amostras de OPB foram fornecidas pela professora Dra Deusdélia Teixeira de
Almeida - Departamento de Ciências dos Alimentos da Escola de Nutrição da
Universidade Federal da Bahia.
Foram adquiridos 30 litros de OPB integral (uma mistura da fase líquida e sólida do
óleo), industrializado na cidade Nazaré, no estado da Bahia, Brasil.
O óleo foi acondicionado em duas latas de folha de flandres com capacidade de 16
litros, posteriormente colocado em um recipiente de inox com capacidade para 50 litros e
aquecido a 45ºC, para que houvesse a fusão da fração sólida do óleo, possibilitando sua
homogeneização.
Filtrou-se 20 mL do óleo em lã de vidro, para obtenção da amostra antes da fritura ou
óleo de palma cru (OPC). A amostra foi armazenada em frasco âmbar à temperatura de –20
ºC evitando alterações oxidativas (JORGE E GONÇALVES, 1998).
3.1.1
O Processo de Fritura do OPB
A fritura foi efetuada por uma baiana de acarajé respeitando sua prática no processo.
O tempo total de fritura foi de 25 horas, sendo a fritura conduzida durante 5 dias por 5
horas/dia. Iniciou-se a fritura, a céu aberto, em uma panela específica chamada tacho,
sempre com 5 litros de OPB (Tabela 1) e uma cebola submersa no óleo, visando diminuir a
temperatura do óleo e retardar seu escurecimento. Após 12 minutos de aquecimento do
óleo, adicionaram-se os acarajés. Após 5 horas de fritura intermitente obteve-se 110
acarajés fritos/dia.
Após o término do processo de fritura, esperou-se decantar os resíduos de alimentos e
procedeu-se a filtragem do óleo em peneira de alumínio, sendo o mesmo armazenado no
tacho com tampa, em temperatura ambiente, aguardando a próxima fritura. Os
procedimentos citados acima foram seguidos nos quatro dias subseqüentes, diferenciandose apenas na forma de reposição (Tabela 1). Ocorreu reaproveitamento de óleo usado
misturado a novo, de acordo com as técnicas de fritura da baiana de acarajé. A cebola foi
8
reposta sempre que apresentava aspecto de queimada, utilizando-se em média 3
cebolas/dia. Além disso, a temperatura do óleo foi monitorada no inicio do procedimento
(após 12 minutos) e a cada hora, com termômetro tipo espeto (Incoterm). Após as 25 horas
totais do processo de fritura, uma nova alíquota de 20 mL do óleo foi filtrada em lã de
vidro, obtendo-se a segunda amostra, ou o óleo de palma frito (OPF).
Tabela 1. Óleo de palma, quantidades inicial, final e a reposição durante o experimento de
fritura contínua de acarajés, durante 5 dias, com 5h/dia
OPB
Óleo inicial
Reposição inicial
Reposição durante o
processo
TOTAL
Óleo
novo
Óleo
misturado
Óleo
novo
Óleo
misturado
Óleo final
DIA 1
DIA 2
DIA 3
DIA 4
DIA 5
5h
10h
15h
20h
25h
5L
4 L*
3,5 L**
3,5 L***
4 L****
-------
1,0 L
1,5 L
-------
-------
-------
-------
1,5 L a
1,0 L b
2L
2L
------
------
------
------
------
1,3 L a
0,7 L b
1,3 L b
4 L*
5,6 L**
4,8 L***
4 L****
5,2 L
------
*óleo usado do DIA 1; **óleo usado do DIA 2; ***óleo usado do DIA 3; ****óleo usado do DIA 4;
óleo novo + 2,1 L**); b (1 L óleo novo + 1,3 L usado*** + 2,2 La).
a
(3 L
9
3.2
LINHAGENS BACTERIANAS
Quatro linhagens de Salmonella typhimurium foram utilizadas: TA97, TA98, TA100
e TA102.
Quadro 1: Características genotípicas e fenotípicas das quatro cepas utilizadas derivadas de
Salmonella typhimurium LT2 sugeridas para o Teste de Ames
Cepas
Mutação his1
TA97
hisD6610
TA98
hisD3052
TA100
hisG46
TA102
hisG428
Tipo de
mutação/alvo
de mutação
Deslocamento
do quadro de
leitura / GC
Deslocamento
do quadro de
leitura / GC
Substituição de
pares de bases /
GC:TA
Substituição de
pares de bases /
AT:GC
bio / uvrB
Plasmídio
bio - /Δ uvrB
pKM101 (Apr)
bio - /Δ uvrB
pKM101 (Apr)
bio - /Δ uvrB
pKM101 (Apr)
+
pKM101 (Apr)
pAQ1 (Ttr)
As linhagens auxotróficas para histidina são derivadas da linhagem parental LT2 de
Salmonella typhimurium apresentando diferentes mutações no operon da histidina. A
mutação rfa causa perda parcial da barreira de lipossacarídeos que envolve a superfície da
bactérica e aumenta a permeabilidade da parece celular a moléculas maiores. A mutação
uvrB é causada pela deleção de um dos genes responsáveis pelo reparo de excisão, levando
a uma maior sensibilidade a agentes mutagênicos. A deleção do gene uvrB se estendeu até
o gene bio e as cepas se tornaram auxotróficas para biotina. A cepa TA102 não possui a
mutação uvrB pois foi construída para detectar agentes mutagênicos aos quais o sistema de
reparo por excisão é necessário. As linhagens TA97, TA98, TA100 e TA102 apresentam o
plasmídio fator R, PKM101, que aumenta a mutagênese química e espontânea por
aprimorar o sistema de reparo do DNA presente na cepa. A cepa TA102 também possui o
plasmídio em multicópia pAQ1 que apresenta a mutação hisG428 e o gene de resistência à
tetraciclina.
10
3.2.1
Características Genéticas
Os genótipos das cepas foram verificados com o objetivo de assegurar que as
características descritas acima são originais das bactérias. Através do crescimento em meio
nutriente, analisou-se a sensibilidade à radiação ultravioleta e ao cristal violeta e resistência
à ampicilina e à tetraciclina. Os números de colônias revertentes espontâneos por placa
para cada cepa estavam dentro da faixa aceitável descrita na literatura por Maron e Ames
(1983) e também estavam de acordo com o histórico do laboratório. Os genótipos das
linhagens foram confirmados antes dos ensaios através dos seguintes testes (Maron &
Ames, 1983):
Auxotrofia para histidina (his-): foi confirmado pela ausência de crescimento em
placas contendo ágar mínimo sem histidina. Uma alíquota de 100 µL das culturas de célula
pernoite e 500 µL de tampão fosfato de sódio pH 7,4 com 2 mL de top ágar são semeados
em placas de meio mínimo contendo apenas biotina (placas-teste) ou histidina (0,1 M) e
biotina (0,5 mM) (placa controle). Após incubação a 37 oC por uma noite, observou-se
ausência de crescimento nas placas-teste;
Mutação rfa: Uma alíquota de 100 µL das culturas de célula pernoite em gelose a
45 oC foi semeado em placas de meio nutriente. Um pequeno disco de papel filtro estéril foi
colocado no centro da placa e adicionado 10 µL de solução de cristal violeta. Após 12
horas de incubação a 37 oC, observou-se um halo de inibição do crescimento ao redor do
disco;
Mutação uvrB: Estrias paralelas das culturas de célula pernoite são realizadas em
placas de meio nutriente. Metades das placas foram recobertas e as outras metades foram
irradiadas com luz ultravioleta em lâmpada germicida de 15W a distância de 33 cm, por 8
segundos. Após incubação de 24 horas a 37oC, obsevou-se crescimento de células
bacterianas na metade das placas não irradiadas para as linhagens sensíveis ou em ambos
os lados, para a cepa proficiente na reparação por excisão (TA102);
Presença do plasmídeo pKM101: Estrias das culturas de célula pernoite foram
realizadas em placas de meio nutriente contendo ampicilina (20 µg/mL). Após incubação a
37 oC, observou-se o crescimento das linhagens portadoras do plasmídeo de resistência;
Presença do plasmídeo pAQ1: Estrias da cultura de célula pernoite (TA102) foram
realizadas em placas de meio nutriente contendo ampicilina (20 µg/mL) e tetraciclina (20
11
µg/mL). Após incubação a 37 oC, observou-se o crescimento na linhagem portadora do
plasmídeo de resistência.
3.3
METABOLIZAÇÃO EXÓGENA (S9 MIX)
Existe a necessidade de que os testes sejam realizados na presença e ausência de um
sistema de ativação metabólica in vitro, visto que algumas substâncias precisam ser
metabolizadas para que seus derivados apresentem atividade mutagênica. O mais
comumente utilizado é a fração microssomal (S9).
A fração S9 é composta por um homogenato de células de fígado de ratos SpragueDawley, pré-tratados com a mistura bifenil policlorinada (Aroclor 1254), que induz um
aumento de enzimas (P450) que são envolvidas na biotransformação de vários compostos
neste órgão. A fração S9 acrescida de co-fatores conforme descritos a seguir:
A preparação da solução de S9 mix (4%) foi realizada de acordo com Mortelmans e
Zeiger (2000) em condições de esterilidade e em banho de gelo: 19,75 mL de água
destilada; 25,0 mL de tampão fosfato de sódio 0,2M pH 7,4; 2,0 mL de solução NADP
0,1M; 0,25 mL de glicose-6-fosfato 1M, 1 mL de sais MgCl2-KCl e 2,1 mL de água
destilada reconstituída com fração S9 liofilizada.
3.4
ENSAIO DE MUTAGENICIDADE
A avaliação mutagênica do OPB antes e após a fritura foi realizada pelo método de
pré-incubação do ensaio Salmonella/microssoma como descrito por Maron e Ames (1983),
com pequenas modificações (MORTELMANS E ZEIGER, 2000). Uma alíquota de 100µl
de diferentes concentrações do óleo de palma antes ou após a fritura (todas as diluições
foram feitas em DMSO) e 100µl da suspensão bacteriana (2 x 108 células/mL) foram
adicionados a 500 µl de tampão fosfato de sódio 0,2M (pH 7,4) ou S9 mix. Após a préincubação da mistura acima por 30 minutos, a 37º C, 2 mL de top ágar foram adicionados e
o conteúdo foi incorporado em uma placa de ágar mínimo glicosado. As placas foram
incubadas a 37º C e o número de colônias revertentes (his-) foi contado após 72h.
O critério utilizado para que a mutagenicidade fosse considerada positiva foi o índice
de mutagenicidade ser igual ou superior a dois (I.M. ≥ 2) (MORTELMANS E ZEIGER,
2000) e para confirmação do resultado positivo, a análise de variância apresentar valores
12
de pANOVA < 5% e as concentrações testadas apresentarem uma clara relação
concentração-resposta. A figura abaixo esquematiza o ensaio de mutagenicidade.
Figura 3: Esquema demonstrando o ensaio de mutagenicidade
3.5
ENSAIO DE SOBREVIVÊNCIA
Para a determinação de efeito citotóxico do azeite de dendê, amostras da suspensão
do protocolo de pré-incubação do teste de Ames foram diluídas em 0,9% de NaCl (v/v)
para obter-se uma suspensão contendo 2x102 células/mL. Uma alíquota de 100µl da
suspensão foi incorporada a uma placa contendo meio ágar nutriente. As placas foram
então incubadas a 37◦C por 24 horas e as unidades formadoras de colônias foram contadas.
Os resultados referentes foram expressos em porcentagem em relação ao controle negativo
e, para que esses resultados observados em cada concentração testada fossem considerados
positivos, a porcentagem de sobrevivência das células expostas ao óleo deve corresponder
a menos de 70%. (AIUB et al., 2003). Abaixo, a figura demonstra o ensaio de
sobrevivência.
13
100L
10L
100L
10L
990 mL de solução
salina a 0,9%
900 mL de solução
salina a 0,9%
Meio LB
Estufa 37ºC
24h
Figura 4: Esquema demonstrando o ensaio de sobrevivência
3.6
CULTURA DE CÉLULAS RAW 264,7
A linhagem de macrófagos de camundongo RAW 264,7 foi utilizada a partir de uma
cultura em boa confluência e mantidas em estufa com atmosfera de 5% de CO2, à
temperatura de 37ºC. A disjunção celular foi realizada mecanicamente com um scrap, em
seguida, a suspensão foi centrifugada a 5000 rpm por 5 minutos e as células foram
ressuspensas em meio Minimum Essential Medium (MEM) Eagle Ca++ 1,8 mM (Gibco®)
suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1,76 g/L de NaHCO3, 0,88 g/L de piruvato,
21,6 mg/L de ácido aspártico e 16,8 mg/L de L-serina. A viabilidade celular foi
determinada após coloração com azul de tripan e as células foram adicionadas a placas de
microtitulação de 24 poços na densidade de 2 x 105 células/ poço e mantidas em cultura
por 24 horas.
3.7
ENSAIO DO MICRONÚCLEO
O ensaio foi realizado conforme descrito anteriormente (AIUB et al., 2011), com
modificações. As células foram tratadas com 100 µL das diluições das amostras em
14
DMSO, equivalente a 10% do volume total e as placas foram incubadas por 24h. Após esse
período, o meio foi retirado e a placa foi rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca ++ 1,8
mM. Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 1,8 mM com soro e incubou-se por 24
horas em estufa com atmosfera de 5% de CO2. O ensaio utilizou como controle positivo Nmetil-N-nitro-N-nitrosoguanosina (MNNG) na concentração de 0,5 µM.
O meio MEM Eagle Ca++ 1,8 mM foi substituído pela solução gelada de Carnoy
(fixador metanol 3:1 ácido acético glacial) por 15 minutos. As células fixadas foram
rinsadas com tampão McIlvaine (MI) (21,01 g/L de ácido cítrico e 35,60 g/L de Na2HPO4,
pH 7,5) por 2 minutos e postos para secar a temperatura ambiente. As células fixadas
foram coradas com 4'-6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI) (0,2 µg/mL), dissolvido em
tampão MI, por 40 minutos. Após isso, foram lavadas com tampão MI por 2 minutos,
brevemente lavadas com água destilada e postas para secar novamente, a temperatura
ambiente.
Para determinar-se o índice mitótico e o número de células com micronúcleos,
assim como as percentagens de necrose e apoptose, as células por concentração foram
analisadas em microscópio de fluorescência (Reichert Univar) com excitação de
comprimento de onda de 350 nm. O experimento foi realizado em quintuplicata.
Os resultados obtidos no ensaio de micronúcleo foram expostos em valores
percentuais após a análise de 1000 células em cada réplica das cinco concentrações, além
dos controles positivos e negativos. Para ser considerado positivo, o resultado observado
no ensaio deve apresentar a aumento estatisticamente significante na freqüência de
micronúcleos em relação ao controle negativo. Abaixo, a figura demonstra o esquema do
ensaio de micronúcleo com macrófagos.
15
Figura 5: Esquema demonstrando o ensaio de micronúcleo com macrófagos
16
4
RESULTADOS
4.1
MUTAGENICIDADE
Após 72 horas de incubação com as cepas TA97, TA98, TA100 e TA102 na ausência
e presença de S9 não foi observado aumento significativo (P < 0,05) do número de
revertentes nas doses testadas em todas as cepas testadas após o tratamento com OPB antes
e após 25h do processo de fritura (Tabelas 2 a 5).
Tabela 2 - Avaliação mutagênica do óleo de palma (azeite de dendê) antes e após a fritura de
acarajés na linhagem TA97 de Salmonella typhimurium na ausência e presença de ativação
metabólica (S9)
-S9
Amostras
Concentração
a
b
+S9
Média ±DP
I.M
% Sobrevivência
c
a
b
Média ±DP
I.M
% Sobrevivência
OPC
0
1:128
1:64
1:32
1:16
1:8
CP
132 ± 22
138 ± 38
134 ± 11
115 ± 14
123 ±28
158 ± 66
483 ± 62
1.0
1.0
1.0
0.9
0.9
1.2
3.7
100
97
90
91
90
89
100
107 ± 14
130 ± 19
114 ± 9
119 ± 15
134 ± 11
118 ± 6
1016 ± 418
1.0
1.2
1.1
1.1
1.2
1.1
9.5
100
100
100
100
100
100
100
OPF
0
1:128
1:64
1:32
1:16
1:8
CP
341 ± 41
321 ± 91
319 ± 42
335 ± 15
238 ± 47
233 ± 59
2162 ± 499
1.0
0.9
0.9
1.0
0.7
0.7
6.3
100
100
100
100
100
95
70
202 ± 8
238 ± 7
116 ± 22
265 ± 37
287 ± 22
240 ± 6
2388 ± 399
1.0
1.2
0.6
1.3
1.4
1.2
11.8
100
100
100
100
100
100
78
c
a
Número de colônias revertentes por placa: valores de média e desvio padrão (DP) de três replicatas. b IM:
Índice de mutagenicidade: razão entre o número de colônias revertentes induzidas pela amostra/número
espontâneo pelo controle negativo. c Sobrevivência celular em relação com o controle negativo. Positivos
para citotoxicidade (sobrevivência < 70%) e mutagenicidade (IM > 2) estão indicados em negrito. A
concentração 0 corresponde ao controle negativo (solvente): 100 µl de DMSO. As doses dos controles
positivos (CP) por placa na ausência e presença de S9 mix foram 0,5 µg de 4-nitroquinolina-1-óxido e 1µg de
2-Aminoantraceno, respectivamente.
17
Tabela 3 - Avaliação mutagênica do óleo de palma (azeite de dendê) antes e após a fritura de
acarajés na linhagem TA98 de Salmonella typhimurium na ausência e presença de ativação
metabólica (S9)
-S9
Amostras
Concentração
a
b
+S9
Média ±DP
I.M
% Sobrevivência
c
b
Média ±DP
I.M
% Sobrevivênciac
OPC
0
1:128
1:64
1:32
1:16
1:8
CP
27 ± 4
22 ± 2
21 ± 3
20 ± 3
22 ± 12
31 ± 11
145 ± 5
1.0
0.8
0.8
0.8
0.8
1.1
5.4
100
100
100
100
100
100
90
42 ± 3
42 ± 4
45 ± 8
37 ± 4
56 ± 5
64 ± 6
224 ± 16
1.0
1.0
1.1
0.9
1.3
1.5
5.3
100
92
100
90
100
100
86
OPF
0
1:128
1:64
1:32
1:16
1:8
CP
19 ± 3
25 ± 4
35 ± 5
29 ± 2
31 ± 8
13 ± 3
322 ± 146
1.0
1.3
1.9
1.5
1.6
0.7
17.3
100
100
100
97
76
100
94
51 ± 4
59 ± 5
52 ± 0
65 ± 3
53 ± 6
69 ± 1
239 ± 12
1.0
1.1
1.0
1.3
1.0
1.3
4.7
100
100
100
100
100
100
82
a
Número de colônias revertentes por placa: valores de média e desvio padrão (DP) de três replicatas. b IM:
Índice de mutagenicidade: razão entre o número de colônias revertentes induzidas pela amostra/número
espontâneo pelo controle negativo. c Sobrevivência celular em relação com o controle negativo. Positivos
para citotoxicidade (sobrevivência < 70%) e mutagenicidade (IM > 2) estão indicados em negrito. A
concentração 0 corresponde ao controle negativo (solvente): 100 µl de DMSO. As doses dos controles
positivos (CP) por placa, na ausência e presença de S9 mix foram 0,5 µg de 4-nitroquinolina-1-óxido e 20 µg
de Benzo[α]pireno, respectivamente.
18
Tabela 4 - Avaliação mutagênica do óleo de palma (azeite de dendê) antes e após a fritura de
acarajés na linhagem TA100 de Salmonella typhimurium na ausência e presença de ativação
metabólica (S9)
-S9
Amostras
a
Concentração
a
Média ±DP
I.M
b
+S9
c
a
% Sobrevivência
Média ±DP
I.M
b
c
% Sobrevivência
OPC
0
1:128
1:64
1:32
1:16
1:8
CP
70 ± 8
68 ± 40
68 ± 47
86 ± 4
99 ± 13
65 ± 9
444 ± 6
1.0
1.0
1.0
1.2
1.4
0.9
6.0
100
100
100
100
100
99
100
186 ± 25
189 ± 17
190 ± 12
216 ± 5
221 ± 1
231 ± 11
2304 ± 153
1.0
1.0
1.0
1.2
1.2
1.2
12.4
100
100
100
99
100
100
100
OPF
0
1:128
1:64
1:32
1:16
1:8
CP
115 ± 15
109 ± 8
137 ± 13
118 ± 15
108 ± 1
111 ± 12
593 ± 214
1.0
1.0
1.2
1.0
0.9
1.0
5.2
100
100
100
100
100
100
86
221 ± 9
228 ± 14
242 ± 31
266 ± 20
281 ± 30
260 ± 0
986 ± 61
1.0
1.0
1.1
1.2
1.3
1.2
4.5
100
100
100
100
100
100
85
Número de colônias revertentes por placa: valores de média e desvio padrão (DP) de três replicatas. b IM:
Índice de mutagenicidade: razão entre o número de colônias revertentes induzidas pela amostra/número
espontâneo pelo controle negativo. c Sobrevivência celular em relação com o controle negativo. Positivos
para citotoxicidade (sobrevivência < 70%) e mutagenicidade (IM > 2) estão indicados em negrito. A
concentração 0 corresponde ao controle negativo (solvente): 100 µl de DMSO. As doses dos controles
positivos (CP) por placa, na ausência e presença de S9 mix foram 1,0 µg de Azida Sódica e 1µg de 2Aminoantraceno, respectivamente.
19
Tabela 5 - Avaliação mutagênica do óleo de palma (azeite de dendê) antes e após a fritura de
acarajés na linhagem TA102 de Salmonella typhimurium na ausência e presença de ativação
metabólica (S9)
-S9
Amostras
a
Concentração
a
Média ±DP
b
+S9
I.M
% Sobrevivência
c
a
Média ±DP
I.M
b
% Sobrevivência
OPC
0
1:128
1:64
1:32
1:16
1:8
CP
345 ± 64
356 ± 45
301 ± 15
337 ± 18
312 ± 10
295 ± 39
2207 ± 286
1.0
1.0
0.9
1.0
0.9
0.9
6.4
100
83
84
79
88
87
89
315 ± 31
431 ± 88
374 ± 23
332 ± 74
297 ± 4
416 ± 23
1016 ± 103
1.0
1.4
1.2
1.1
0.9
1.3
3.2
100
100
100
100
92
87
100
OPF
0
1:128
1:64
1:32
1:16
1:8
CP
341 ± 41
374 ± 7
336 ± 30
287 ± 18
264 ± 9
267 ± 4
2163 ± 499
1.0
1.1
1.0
0.8
0.8
0.8
6.3
100
88
90
90
100
100
75
483 ± 87
599 ± 63
639 ± 26
383 ± 49
911 ± 64
859 ± 33
1747 ± 260
1.0
1.2
1.3
0.8
1.9
1.8
3.6
100
100
100
100
100
100
81
c
Número de colônias revertentes por placa: valores de média e desvio padrão (DP) de três replicatas. b IM:
Índice de mutagenicidade: razão entre o número de colônias revertentes induzidas pela amostra/número
espontâneo pelo controle negativo. c Sobrevivência celular em relação com o controle negativo. Positivos
para citotoxicidade (sobrevivência < 70%) e mutagenicidade (IM > 2) estão indicados em negrito. A
concentração 0 corresponde ao controle negativo (solvente): 100 µl de DMSO. As doses dos controles
positivos (CP) por placa, na ausência e presença de S9 mix foram 0,5 µg de Mitomicina C e 20 µg de
Benzo[α]pireno, respectivamente.
20
4.2
AVALIAÇÃO DE MICRONÚCLEO
Os resultados obtidos no ensaio com OPC e OPF estão apresentados na tabela 6.
Ambas as amostras não induziram formação de micronúcleo, apoptose e necrose em
células de macrófago. Além disso, OPC e OPF não induziram aumento significativo de
divisão mitótica. Não houve diferença significativa entre os resultados obtidos com o óleo
antes e depois da fritura (P > 0,05).
Tabela 6 - Ensaio de indução de micronúcleo em macrófagos usando as amostras de
óleo de palma bruto
Amostras
OPC
Concentração
CN
1:128
1:64
1:32
1:16
1:8
CP
OPF
CN
1:128
1:64
1:32
1:16
1:8
CP
‰ I.Mi.± DP1
7,9 ± 2,8
4,4 ± 1,4
4,5 ± 0,8
11,6 ± 0,4
8,4 ± 0,8
8,9 ± 1,5
6,7 ± 1,9
% Apoptose
3,6 ± 1,2
1,7 ± 0,9
1,4 ± 0,5
2,7 ± 2,8
3,5 ± 0,2
2,8 ± 0,5
4,7 ± 0,8
%Necrose
1,0 ± 0,3
1,0 ± 0,2
0,8 ± 0,3
0,6 ± 0,5
1,2 ± 0,3
0,8 ± 0,2
1,2 ± 0,1
7,9 ± 2,8
5,0 ± 0,9
6,4 ± 0,1
6,0 ± 3,2
5,4 ± 3,4
6,4 ± 3,1
6,7 ± 1,9
3,6 ± 1,2
1,9 ± 0,3
1,9 ± 1,8
1,7 ± 0,9
1,5 ± 0,5
1,5 ± 0,2
4,7 ± 0,8
1,0 ± 0,3
0,9 ± 0,4
0,6 ± 0,4
0,7 ± 0,2
1,0 ± 0,2
0,9 ± 0,4
1,2 ± 0,1
% Micronúcleo ± DP
3,8 ± 1,2
3,2 ± 0,3
3,0 ± 1,5
2,9 ± 1,3
4,4 ± 0,6
4,1 ± 1,3
7,9 ± 1,1
3,8 ± 1,2
3,0 ± 0,6
2,8 ± 1,2
2,6 ± 0,3
1,9 ± 0,6
2,8 ± 1,4
7,9 ± 1,1
1
Índice mitótico por mil. As doses do controle negativo (CN) e controle positivo (CP) foram 10% de
DMSO e 0.5 µM de MNNG, respectivamente. O experimento foi realizado em quintuplicata
O quadro abaixo apresenta algumas das imagens micrografadas, identificando os
casos de micronúcleo, divisão celular, apoptose e necrose.
21
Quadro 2: Micrografias das lamínulas coradas com 4'-6-Diamidino-2-fenilindol
(DAPI) do teste de micronúcleo em macrófagos, mostrando as situações de divisão celular,
apoptose, necrose e micronúcleo, indicadas pela seta branca
A)
B)
C)
D)
Legenda :A – Divisão Celular; B – Apoptose; C – Necrose e; D – Micronúcleo.
22
5
DISCUSSÃO
O presente trabalho buscou avaliar a segurança do OPB utilizado no processo de
fritura por imersão, em condições mais próximas da realidade prática, possibilitando
avaliar uma possível existência de riscos à população consumidora.
Os resultados obtidos indicam que o óleo de palma bruto nas condições descritas
anteriormente não induz citotoxicidade, uma vez que não foi encontrado uma redução
abaixo de 70% do número de colônias revertentes e também uma diminuição no número de
colônias revertentes no ensaio de Ames. Não se observou mutagenicidade, visto que tanto
o óleo antes da fritura quanto o após o processo não induziram um índice de
mutagenicidade igual ou acima de 2. Ademais, foi observado que o óleo de palma bruto
não induziu resposta genotóxica de acordo com o ensaio do micronúcleo em macrófagos,
utilizando a linhagem RAW 264,7.
Esses resultados podem ser atribuídos à estabilidade do óleo frente à fritura. Sabe-se
que o óleo de palma se deteriora mais lentamente na fritura quando comparado a outros
óleos vegetais, devido à razão de ácidos graxos saturados e insaturados de sua composição
ser próxima de 1 e também à presença de pequenas quantidades de ácido linoléico, traços
de linolênico e de antioxidantes naturais, os tocoferóis, tocotrienóis e carotenóides (EDEM,
2002; MATTHÄUS, 2007; TAVARES et al., 1989). Além disso, o OPB possui um
conteúdo maior desses antioxidantes do que no óleo refinado (RODRIGUEZ-AMAYA,
1996) o que contribui ainda mais para manter-se estável mesmo depois de repetidas
frituras.
Além dos fatores da constituição do OPB, a prática das baianas de reposição do óleo
também poderia estar minimizando a sua degradação. Quanto mais rápida a renovação do
óleo, mais lenta é a formação de ácidos graxos livres, ao mesmo tempo em que o constante
fluxo de óleo fresco acrescenta antioxidantes ao sistema, além de diluir os compostos de
degradação formados durante a fritura (MASSON, 1999).
Dessa forma, os resultados encontrados nesse trabalho corroboram com outros
estudos apontando a ausência de atividade mutagênica em óleos usados em fritura por
imersão (VAN GESTEL et al., 1984; SCHEUTWINKEL-REICH et al., 1980; TAYLOR
et al.,1982; FONG et al., 1980), em que apenas Fong (1980) observou mutagenicidade no
23
óleo de amendoim, embora essa atividade tenha sido correlacionada a uma contaminação
por aflatoxina B1 no óleo, o que era comum nos óleos vendidos no mercado local.
24
6
CONCLUSÃO
O óleo de palma bruto antes e após o tradicional processo de fritura de acarajés
realizado pelas baianas, não apresentou atividade citotóxica, mutagênica ou genotóxica.
25
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AIUB, C.; RIBEIRO PINTO, L.F.; FELZENSZWALB, I. N-Nitrosodiethylamine
mutagenicity at low concentrations. Toxicol. Lett., v.145, 36–45, 2003.
AIUB, C.A.F. et al. N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes:
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital. Toxicol. Lett. v.206, 139– 143,
2011.
AGROPALMA
S/A.
Linha
de
Produtos.
Disponível
<http://www.agropalma.com.br>. Acesso em: 10 de agosto de 2012.
em:
ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMIST (AOAC): Official methods
on analysis of AOAC international, Maryland, 17º Ed, 2v, 2003.
AUDLEY, B.W. Polar components of palm oil fruit and other tissues. PORIM Annual
Research Report. CTB3 374-376, 1986.
BASIRON, Y. Palm oil. In: SHAHIDI, F. (Ed.). Bailey’s industrial oil and fat products.
New Jersey: John Wiley, v. 2, cap. 8, 2005.
BELITZ, H.D.; GROSCH, W.; SCHIEBERLE, P. Food Chemistry, 3º Ed. SpringerVerlag, Berlin, Germany, 2004.
BERGER, K.G. The use of palm oil in frying. Frying oil series. Malaysian Palm Oil
Promotion Council (MPOPC), Malasya 2005. Disponível em: <http://www.mpoc.org.>.
Acesso em: 20 de agosto de 2012.
BORA, P.S. et al. Characterization of principal nutritional components of Brazilian
oil palm (Elaeis guineensis) fruits. Bioresource Technology, Palampur, n 87, p 1–5, 2003.
CORSINI, M.S; JORGE, N. Estabilidade oxidativa de óleos vegetais utilizados em
frituras de mandioca palito congelada. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas,
vol.26, n.2, p 27-32, 2006.
DAMY, P.C.; JORGE, N. Determinações físico-químicas do óleo de soja e da gordura
vegetal hidrogenada durante o processo de fritura descontínua. Brazilian Journal of
Food Technology, Campinas, vol. 6, n. 2, p. 251-257, 2003.
EDEM, D.O. Palm oil: Biochemical, physiological, nutritional, hematological, and
toxicological aspects: A review. Plant Foods for Human Nutrition, 57, 319-341, 1998.
FEDELI, E. The behavior of olive oil during cooking and frying, in: Varela, G., Bender,
A.E., Morton, I.D. (Eds.), Frying of food, Principles, Changes, New Approaches. Ellis
Horwood, Chichester, UK, pp. 58–81. 1988.
FONG, L.Y.Y.; TON, C.C.T. ; KOONANUWATCHAIDET, P. Mutagenicity of peanut
oils and effect of repeated cooking. Food Cosmet. Toxicol. 18, 467-470, 1980.
26
FREITAS, L.R. et al. Caracterização físico-química e toxicológica do óleo de soja, do
óleo composto (soja + algodão). Revista de Ciência, Tecnologia e Humanidades do IFPE
- Ano I, (1), 2009.
GAPOR, A.T., et al. Effect of processing on the content and composition of tocopheros
and tocotrienols in palm oil. In: Pushparajah, E., Rajadurai, M. (Eds). Palm Oil Product
Technology in the Eighties. Kuala Lumpur. Incorporated Society of Planters, 145-156,
1983.
GERTZ, C. Chemical e physical parameters as a quality indicator of used frying fats.
European Journal of Lipid Science and Technology, Weinheim, vol. 102, n 8-9, p.566-572,
2000.
GOH, S.H.; GEE. P.T. Non-carotenoid hydrocarbons in palm oil and palm fatty acid
distillate. J.Am.Oil.Chem.Soc. 63. 226-230, 1986.
GORDON, M.H. and MAGOS, P. The effect of sterols on the oxidation of edible oils.
Food. Chem. 10, 141-147, 1983.
GOVIND, R.; ACHAYA, K.T. Antioxidant activity of squalene. J.Am.Oil.Chem.Soc.
45. 296, 1968.
HAZURA, A.G.; CHOO, Y.H. Proceedings of World Conference on Oil Seeds. Istanbul.
Vol 2, 250-252, 1996.
HOUHOULA, D.P.; OREOPOULOU, V.; TZIA, C. The effect of process time and
temperature on the accumulation of polar compounds in cottonseed oil during deepfat frying. J. Sci. Food Agric. 83, 314–319, 2003.
JORGE, N.; GONÇALVES, L.A.G. Comportamento do óleo de girassol, com alto teor
de ácido oléico em termoxidação e fritura. Ciênc. Tecnol. Aliment. 18, 335-342, 1998.
KALOGIANNI, E.P.; KARASTOGIANNIDOU, C.; KARAPANTSIOS, T.D. Effect of
presence and absence of potatoes under repeated frying conditions on the
composition of palm oil. J. Am. Oil Chem. Soc. 86, 561–571, 2009.
KALOGIANNI, E.P.; KARASTOGIANNIDOU, C.; KARAPANTSIOS, T.D. Effect of
potato presence on the degradation of extra virgin olive oil during frying. Int. J. Food
Sci. Technol. 45, 765–775, 2010.
LODY, R.: Dendê símbolo e sabor, organizado por LODDY, R. Editora SENAC, 147 p.,
SãoPaulo, 2009.
MALASIAN PALM OIL COUNCIL – MPOC- Basic Background Information about
Palm Oil, Malasian – 1991. Disponível em http://mpoc.org.my. Acesso em 10 de agosto
de 2012.
27
MARON D.M.; AMES, B.N. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test.
Mutation Research. 113, 173-215, 1983.
MASSON, L. et al. Fat deterioration in deep fat frying of French fries potatoes at
restaurant and food shop sector. Grasas Aceites, Sevilha, vol. 5, 6, 460-468, 1999.
MATTHÄUS, B. Use of palm oil for frying in comparison with other high-stability
oils. European Journal of Lipids Science and Technology.109, 400-409, 2007.
McSAVAGE, E.; TREVISAN, S. The use and abuse of frying oil. Food and Service
Technology, 1, 85-92, 2001.
MORTELMANS, K.; ZEIGER, E. The Ames Salmonella/microsome mutagenicity
assay. Mutat. Res. 455, 29–60, 2000.
OLIVEIRA, H.P. Dendê: aspectos botânicos, agronômicos, ecológicos e econômicos In:
LODDY, R. (Ed.), Dendê símbolo e sabor. Editora SENAC., São Paulo, pp. 147, 2009.
POKU, K. Small Scale Palm Oil Processing in Africa, FAO Agricultural Services B.
148, Rome. pp. 3-46, 2002.
REDA, S.Y.; CARNEIRO, P.I.B. Óleos e gorduras: aplicações e implicações. Revista
Analytica, São Paulo, n.27, p. 60-67, 2007.
RODRIGUEZ – AMAYA, D.B. Assesment of Provitamin A contents of food – the
Brazilian experience. J.Food.Compos.Anal., 9, 196-230, 1996.
SAMBANTHAMURTHI, R.; SUDRAM, K.;TAN,Y.: Chemistry and biochemistry of
palm oil. Progress in Lipid Research, n. 39, p. 507-558, 2000.
SANIBAL E.A.A., MANCINI FILHO J. Alterações físicas, químicas e nutricionais de
óleos submetidos ao processo de fritura. Food Ingredients South American, São
Paulo,vol.18, p. 49-54, 2002.
SCHEUTWINKEL-REICH, M., INGEROWSKI, G., STAN, H.J. Microbiological studies
investigating mutagenicity of deep frying fat fractions and some of their components.
Lipids.15, 849-852, 1980.
STEVENSON, S. G., VAISEY-GENSER, M; ESKIN, N.A.M.: Quality control in use of
deep frying oils. Journal of the American Oil Chemists’ Society, Chicago, [S1], vol.61,n
6, 1984.
TAVARES, M. et al. Identificação e quantificação de adulterantes do óleo de dendê
por meio de cromatografia em fase gasosa. Revista do Instituto Adolf Lutz, 49 (2) 145150, 1989.
TAYLOR,S.L. et al. Lack of mutagens in deep-fat-fried foods obtained at the retail
level. Food Chem. Toxicol. 20, 209-212, 1982.
28
TYAGI, V.K., VASISHTHA, A.K. Changes in the characteristics and composition of
oils during deep-fat frying. J. Am. Oil Chem. Soc. 73, 499–506, 1996.
VAINSENCHER, S.A. Dendê. Pesquisa Escolar On-Line, Fundação Joaquim
Nabuco, Recife. Disponível em: <http://www.fundaj.gov.br>. Acesso em: 14 de
setembro de 2012.
VAN GASTEL A. et al. Ames mutagenicity tests of repeatedly heated edible oils. Food
Chem. Toxicol. 22 (5), 403-405, 1984.
VELASCO, J., MARMESAT, S., DOBARGANES, M.C. Chemistry of frying, in: Sahin,
S., Sumnu, S.G. (Eds.), Advances in deep-fat frying of foods. CRC Press, Taylor &
Francis Group, Boca Raton, London, New York, pp.33-56, 2008.
WATTANAPENPAIBOON, N.; WAHLQVIST, M.L. Phytonutrient deficiency: the
place of palm fruit. Ásia. Pac. J. Clin. Nutr. China, vol .3, 12, 363-368, 2003.