EXTRAÇÃO DE PLASMÍDIOS RECOMBINANTES CONTENDO OS
GENES DE VirB9 e VirB10 DE Anaplasma marginale e IMUNIZAÇÃO DE
BOVINOS COM PLASMÍDIOS RECOMBINANTES (VACINA DE DNA)
Amanda Fonseca Zangirolamo (CNPq/balcão UEL), Aline Girotto
(Doutorado/Programa de Pós Graduação em Ciência Animal da UEL),
Adriana Letícia Côelho (Mestrado/Programa de Pós Graduação em Ciência
Animal da UEL), Marilda Carlos Vidotto (co-orientadora), Odilon Vidotto
(Orientador), e-mail: [email protected].
Universidade Estadual de Londrina/Departamento de Medicina Veterinária
Preventiva/Centro de Ciências Agrárias– Londrina – PR
Palavras-chave: Anaplasma marginale, vacina de DNA, bovinos.
Resumo:
A anaplasmose é uma doença hemolítica de bovinos, causada pelo
Anaplasma marginale (Família Anaplasmataceae). Uma vacina de DNA com
um pool de plasmídios (pcDNA3.1/MSP1a, MSP1b, MSP5, VirB9 e VirB10)
foi avaliada em bezerros. GI: 4 animais receberam a vacina de DNA; GII: 3
animais - controle do vetor de DNA, e GIII: 4 animais - controle negativo. Os
animais do GI receberam, via IM, três doses de 8,0 mL da vacina DNA, com
intervalo de 21 dias. Nas mesmas condições, os animais do GII e GIII foram
inoculados com o vetor de pcDNA3 e PBS. O desafio foi 30 dias após a
última dose da vacina, com 2 mL com 107 eritrócitos infectados com a cepa
PR-1 A. marginale. Os animais do GI apresentaram resposta de IgG total e
IgG2, 42 dias após a primeira dose da vacina e os animais dos grupos
controles não mostraram resposta humoral até o dia do desafio. Os
parâmetros clínicos e parasitológicos dos animais imunizados com a vacina
de DNA e dos grupos controles não apresentaram variações clínicas
significativas e a parasitemia permaneceu abaixo dos níveis detectáveis em
esfregaços de sangue corados pele panótipo. Embora tenha havido boa
resposta de anticorpos não foi possível concluir se houve proteção.
Introdução
Anaplasma marginale (THEILER, 1910) da Ordem Rickettsiales, Família
Anaplasmataceae, é o agente etiológico da anaplasmose dos bovinos,
doença de caráter febril e hemolítico que causa elevados prejuízos à
pecuária bovina mundial (RICHEY; PALMER, 1990). A imunização baseada
Anais do XIX EAIC – 28 a 30 de outubro de 2010, UNICENTRO, Guarapuava –PR.
em DNA iniciou uma nova era da pesquisa em vacinas e esta tecnologia
envolve a transferência de gene de interesse, codificando uma proteína
antigênica, para as células musculares do hospedeiro, e indução da
resposta imune. Diferentes vetores que expressam genes de mamíferos têm
sido desenvolvidos, mas os plasmídios recombinantes, DNA plasmidial
codificando genes de interesse, são os mais freqüentemente usados, já que
não apresentam o inconveniente das vacinas clássicas, uma vez, que as
principais vantagens da vacina de DNA são: eliminação dos riscos
associados com o uso de organismos atenuados, menores custos
comparáveis ao custo de expressão e purificação de proteínas
recombinantes e não tem requerimentos especiais de estocagem por ser
estável. Estudos imunológicos têm mostrado a participação de células
TCD4, interferon gama (INF-ϒ) e IgG2 na proteção contra A. marginale em
bovinos imunizados (GALE et al., 1996; BROWN et al., 1998a, b).
Materiais e métodos
Extração, purificação e quantificação de plasmídio
Após a etapa de clonagem dos genes responsáveis pelas proteínas VirB9 e
VirB10 de A. marginale, os plasmídios recombinantes pcDNA3.1/VirB9 e
pcDNA3.1/VirB10 foram extraídos a partir da cultura das bactérias E. coli
TOPO contendo os plasmídios, por lise alcalina segundo a técnica descrita
por BIRNBOIN; DOLLY (1979). A produção destes plasmídios em grande
escala foi realizada para o preparo da vacina de DNA, utilizando-se o kit
comercial Qiagen Plasmid Giga kit (Qiagen), seguindo as instruções do
fabricante.
Os plasmídios purificados foram visualizados em gel de agarose 1%
contendo uma solução de brometo de etídio a 25 µg/ml, e fotografados com
lâmpada UV. Para determinação da massa molecular dos plasmídios foi
utilizado o padrão lambda HindIII (Promega, Madison, WI), e posteriormente
os plasmídios foram submetidos a quantificação de DNA pela espectrometria
em comprimento de onda de 260 nm.
A vacina de DNA foi preparada com um pool de plasmídios (pcDNA3.1/
MSP1a, pcDNA3.1/MSP1b, pcDNA3.1/MSP5, pcDNA3.1/VirB9 e pcDNA3.1/
VirB10) na concentração de 1mg/ml foram armazenados em tampão Tris –
EDTA (TE) (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8,0) a – 70 oC., os quais serão
utilizados na imunização dos bezerros livres de A. marginale.
Imunização de bovinos com vacina de DNA
Foram utilizados 11 bezerros machos, com idade entre 6 e 8 meses, da raça
holandesa, provenientes de cidade de Castro-PR, comprovadamente livres
da infecção por A. Marginale através da PCR e ELISA. Os animais foram
distribuídos aleatoriamente entre os seguintes grupos: GI: 4 animais
receberam vacina de DNA; GII: 3 animais para o controle do vetor de DNA, e
GIII: 4 animais para o controle negativo.
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Cada animal do GI recebeu, via intramuscular (IM), três doses de 8,0
mL da vacina DNA contendo o pool de plasmídios recombinantes, com
intervalo de 21 dias. Nas mesmas condições, os animais do GII e GIII foram
inoculados com o vetor de DNA e PBS, respectivamente. Todos os animais
dos três grupos foram desafiados 30 dias após a última dose da vacina, por
via IM, com 2 mL contendo 4x107 eritrócitos infectados da cepa PR-1 A.
marginale, isolada de um bezerro com anaplasmose clínica (Kano et al.,
2002) e multiplicada em bezerros esplenectomizados um mês antes da
inoculação.
Resultados e Discussão
Os animais que receberam a vacina de DNA (GI) apresentaram resposta
humoral de IgG total e IgG2, pelo teste de ELISA, 42 dias após a primeira
dose da vacina. Enquanto que os animais dos dois grupos controles não
apresentaram resposta humoral significativa até o dia do desafio. Vinte dias
após o desafio a resposta de anticorpos contra A. marginale apresentada
por esses dois grupos foi semelhante à do grupo vacinado. Os parâmetros
clínicos e parasitológicos dos animais imunizados com a vacina de DNA e os
grupos controles não apresentaram variações clínicas significativas e a
parasitemia permaneceu abaixo dos níveis detectáveis em esfregaços de
sangue corados pele panótipo.
Conclusões
Pelos resultados obtidos podemos afirmar que a vacina de DNA contra A.
marginale estimulou a resposta imune específica dos bezerros vacinados,
porém não mostrou proteção, uma vez que não ocorreram diferenças nos
parâmetros clínicos e parasitológicos entre os grupos de bezerros vacinados
e controles.
Agradecimentos
Ao CNPq, CAPES, Fundação Araucária, PROPPG e Programa de Pósgraduação em Ciência Animal da UEL, pelo apoio financeiro, bolsas de IC,
Mestrado, Doutorado e Produtividade em Pesquisa.
Referências
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GALE, K.R., GARTSIDE M., DIMMOCK C.M., ZACKREWSKI, H., LEATCH,
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PALMER, G.H., OBERLE, S.M., BARBET, A.F., GOFF, W.L., DAVIS, W.C.,
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RICHEY, E. J.; PALMER, G. H. Bovine Anaplasmosis. Continuing Education
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THEILER, A. Anaplasma marginale (Genus nov. et. Species nov.) um
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TEBELE, N. AND PALMER, G.H. Cross protective immunity between the
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