UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA Construção de uma vacina de DNA múltipla contendo dois antígenos micobacterianos (Ag85A+Hsp65) e avaliação da proteção contra tuberculose experimental Juliana Issa Hori RIBEIRÃO PRETO 2007 i Livros Grátis http://www.livrosgratis.com.br Milhares de livros grátis para download. UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA Construção de uma vacina de DNA múltipla contendo dois antígenos micobacterianos (Ag85A+Hsp65) e avaliação da proteção contra tuberculose experimental Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do Título de Mestre em Ciências Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada. Orientador: Prof. Dr. Célio Lopes Silva RIBEIRÃO PRETO 2007 ii AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE. FICHA CATALOGRÁFICA Preparada pela Biblioteca Central do Campus Administrativo de Ribeirão Preto / USP Hori, Juliana Issa Construção de uma vacina de DNA múltipla contendo dois antígenos micobacterianos (Ag85A+Hsp65) e avaliação da proteção contra tuberculose experimental. Ribeirão Preto, 2007. 137 p. : il.; 28cm Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de Concentração: Imunologia Básica e Aplicada. Orientador: Dr. Célio Lopes Silva. 1. Tuberculose 2. Vacina de DNA 3. Hsp65 4. Ag85A. iii Não faz mal que seja pouco, o que importa é que o avanço de hoje seja maior que o de ontem. Que nossos passos de amanhã sejam mais largos que os de hoje. Daisaku Ikeda. iv DEDICATÓRIA Aos meus pais Julio e Naza pelo apoio e incentivo incondicional. Pelo exemplo de vida e dedicação, por todo amor e carinho... Obrigada por tudo.. Amo vocês! Á toda minha família, em especial aos meus tios Abrahão, Kazu, Luís e tias Rosa, Maria, Cida e Má.... Aos primos Cris, Jú e Wander... Ao meu querido Bruno por todo amor, carinho, amizade e companherismo. Pelas conversas, risadas e momentos inesquecíveis... também pela imprescindível ajuda com a elaboração da capa desse trabalho. Obrigada.... Eu te amo!!! v AGRADECIMENTOS Ao meu professor e orientador Dr. Célio Lopes Silva, pela oportunidade de trabalhar em seu laboratório, pela confiança deposiatada em mim e em meu trabalho, pelos ensinamentos e pela grande contribuição em minha formação profissional. Muito obrigada!!! À professora Dra. Arlete Aparecida Martins Coelho-Castelo, pela co-orientação nesse trabalho, pelas valiosas sugestões e discussões que contribuíram sem dúvida para o enriquecimento desse trabalho. Obrigada por sua disponibilidade e atenção! À professora Dra. Vânia Luiza Deperon Bonato pela colaboração durante o desenvolvimento desse trabalho. Aos professores Dr. Marcelo Brocchi e Dr. Luis Carlos de Souza Ferreira, pela participação no julgamento desse trabalho, pelas excelentes sugestões e contribuições na elaboração final dessa dissertação. À professora Dra. Simone Gusmão Ramos, por toda avaliação dos cortes histológicos. À técnica Elaine Medeiros Floriano, por sua simpatia e disponibilidade na elaboração dos cortes histológicos. À Dra. Kris Huygen e Dra. Marta Romano, pela disponibilização de todo o material relacionado ao Ag85A. À professora Dra. Ana Paula Ulian Araújo, por todas as sugestões e recomendações. Ao professor Dr. João Santana da Silva, por toda sua dedicação ao Programa de PósGraduação em Imunologia Básica e Aplicada e inflexível preocupação com nossa formação acadêmico-profissional. À todos os docentes do Programa, pela contribuição em minha formação. À querida secretária Ana Cristine, pelo exemplo de competência nos serviços prestados à pós-graduação, por todo carinho e ajuda em todos os momentos que precisei. Ao professor Dr. Dario Simões Zamboni, pelo apoio ‘emocional’ nessa fase final de elaboração da dissertação, pelos conselhos e pela oportunidade me dada nessa nova fase que se iniciará em minha vida! Ao Dr. Carlos Rodrigo Zarate-Bladés, pela importante participação nesse trabalho, por todas suas sugestões, críticas e correções. À Izaíra Tincane Brandão (Iza!) e Ana Paula Masson (Aninha!), nossa mãezona e nossa mãezinha do laboratório, pelo apoio técnico nos experimentos realizados, pela amizade e ensinamentos. Obrigada! Às minhas queridas e companheiras, Bauxita, Lú, Marininha, Paty, Tati e Wendy, pela grande amizade, companherismo, conselhos e consolos! Obrigada pela ajuda com os vi experimentos (mesmo nas madrugadas!), pelas risadas, brincadeiras, enfim, pelos momentos inesquecíveis vividos durante esses três anos! À todos do laboratório que contribuíram de maneira direta ou indireta nesse trabalho, pela convivência diária, por todo apoio e principalmente pela amizade: Ana Paula (Pat), Ana Flávia, Beraba, Cássia, Deison (marmota!), Denise, Eduardo, Galetti, Julio, Marina, Pry, Ricardo, Rodrigo, Rogério, Rubinho, Sandra, Sheila, Thiago, Zé Eduardo e Willian. Ao pessoal do Núcleo de Pesquisas em Tuberculose (NPT): Ana, Carlos, Helena, Vanessa e em especial ao Rogério pelo auxílio na impressão final dessa dissertação, pelos socorros com os computadores e pela amizade. Ao WalterMiguel Turato pela ajuda indispensável nos experimentos de Citometria de Fluxo e pelos ótimos momentos de gargalhadas! Aos meus eternos amigos de Birigui: Josie, Jonas, Aline, André e Fer, que mesmo de tão longe, sempre me incentivaram e torceram por mim. Obrigada pela fiel amizade durante todos esses anos. Adoro muito todos vocês!!! Aos meus amigos do Laboratório de Biologia Molecular da UFSCar, por todos os ensinamentos durante a minha iniciação científica, que sem dúvida alguma foram muito importantes para a minha atual formação: ao professor Dr. Flávio Henrique Silva, que sempre confiou em mim e pelo grande incentivo ao meu crescimento acadêmico. Aos queridos Andréa, César, Dani, Elisete, Kelly, Maria Teresa, Marilena, Pat, Reis, Vivi, Wilson e principalmente à Déia, minha amiga e companheira de todas as horas! Muito obrigada por tudo!!! Aos novos companheiros de laboratório, pela recepção, amizade e apoio nessa minha ‘transição’! Ao Joni, Tati, Marcelo, Giu, Grace e Eulalia. Obrigada!!! À todos os amigos do Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada, em especial ao Antônio, Claudia, Carla, Ellen, Fabi, Silvinha e Vivi, por todos os momentos compartilhados. Ao professor e filósofo Dr. Daisaku Ikeda, por todas as orientações e ensinamentos proporcionados. À todos da ‘família Soka’, que são realmente uma família para mim, que sempre poderei contar! À FAEPA, pelos auxílios concedidos para a divulgação do presente trabalho em eventos científicos. À FAPESP, pelo auxílio financeiro essencial para o desenvolvimento desse trabalho. vii SUMÁRIO Abreviaturas xiii Resumo xix Abstract xxi 1- Introdução 1 1.1- Tuberculose 2 1.2- Resposta imune na tuberculose 3 1.3- Desenvolvimento de vacinas contra TB 10 1.4- Desenvolvimento da vacina DNA-Hsp65 15 2- Objetivos 20 2.1- Objetivo Geral 21 2.2- Objetivos Específicos 21 3- Material e Métodos 3.1- Primeira estratégia de construção da vacina múltipla 22 23 3.1.1- Amplificação do gene Ag85A 23 3.1.2- Clivagem e purificação do plasmídeo pVAX-Hsp65 24 3.1.3- Defosforilação do plasmídeo pVAX-Hsp65 linearizado e clonagem do inserto Ag85A 24 3.1.4- Preparação de bactérias E.coli DH5α CaCl2 competentes 25 3.1.5- Transformação das bactérias por choque térmico 25 3.1.6-Quantificação e avaliação da integridade dos plasmídeos purificados 26 3.2- Segunda estratégia de construção da vacina múltipla 27 3.2.1- Amplificação do gene Ag85A 27 3.2.2- Clivagem e purificação do plasmídeo pVAX-Hsp65 28 3.2.3- Preparação do plasmídeo pVAX-Hsp65 para clonagem do inserto Ag85A 28 3.2.4- Transformação das bactérias por choque térmico e identificação dos novos clones recombinantes 29 3.2.5- Quantificação e avaliação da integridade dos plasmídeos purificados 29 3.2.6- Construção do plasmídeo pVAX-Ag85A 30 3.3- Ensaio de transfecção de macrófagos J774 30 3.4- Extração do RNA total das células e realização de RT-PCR 31 3.5- Análise de western-blot 33 viii 3.6- Animais 34 3.7- Extração e purificação das construções de DNA 34 3.8- Quantificação e avaliação da integridade dos plasmídeos purificados 35 3.9- Obtenção das proteínas recombinantes: rHsp65 e rAg85A 36 3.10- Quantificação dos níveis de endotoxinas 37 3.11- Grupos experimentais e Imunizações 38 3.12- Obtenção do lisado de M. tuberculosis (Mtb) 39 3.13- Processamento do baço para cultura de células 40 3.14- Cultura de células para dosagem de citocinas 40 3.15- Cultura de células para linfoproliferação 40 3.16- Ensaio Imunoenzimático-ELISA para dosagem de anticorpos 41 3.17- Ensaio Imunoenzimático- ELISA para dosagem de citocinas 42 3.18- Preparo do inóculo de M. tuberculosis 43 3.19- Desafio dos animais com M. tuberculosis 44 3.20- Avaliação dos pulmões dos animais desafiados 44 3.21- Coleta, digestão e obtenção de células do pulmão 45 3.22- Ensaio imunoenzimático ELISA para dosagem de citocinas no homogenato de pulmão 46 3.23- Marcação de células para Citometria de Fluxo 46 3.24- Ensaio Imunoenzimático ELISA para dosagem de anticorpos 47 3.25- Determinação do número de unidades formadoras de colônia (UFC) 47 3.26- Análise histológica 48 3.27- Análise estatística 48 3.28- Delineamento experimental 48 4- Resultados 51 4.1- Primeira estratégia de construção da vacina múltipla 52 4.2- Identificação dos clones recombinantes 55 4.3- Nova estratégia de construção da vacina múltipla 57 4.4- Identificação dos novos clones recombinantes 60 4.5- Detecção do mRNA do gene Ag85A em macrófagos de linhagem J774 4.6- Detecção da proteína Ag85A por western-blot 63 65 4.7- Análise das vacinas gênicas purificadas 67 4.8- Obtenção da proteína Hsp65 recombinante (rHsp65) 69 4.9- Quantificação de endotoxina bacteriana 71 4.10- Ensaios de Imunogenicidade 72 ix 4.10.1- Resposta imune humoral anti-Hsp65 e anti-Ag85A 4.10.2- Detecção de citocinas em sobrenadante de cultura de células do baço 4.10.3- Resposta Linfoproliferativa após imunização 4.11- Ensaios de Proteção 4.11.1- Resposta imune humoral anti-Hsp65 e anti-Ag85A nos animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis 4.11.2- Análise da produção de citocinas no homogenato do pulmão de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis 4.11.3- Avaliação fenotípica das células presentes nos pulmões de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis 4.11.4- Avaliação das unidades formadoras de colônia (UFC) 4.11.5- Avaliação histopatológica do pulmão 72 76 82 84 84 88 91 95 97 5- Discussão 103 6- Conclusões 124 7- Referências Bibliográficas 126 7.1- Artigos Científicos 127 7.2- Livros, teses e dissertações 137 x ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1- Resultado da reação de amplificação do gene Ag85A, avaliado por gradiente em PCR 53 Figura 2- Resultado da clivagem do plasmídeo pVAX-Hsp65 54 Figura 3- Resultado do PCR de colônia 56 Figura 4- Resultado da nova reação de amplificação do gene Ag85A, avaliado por gradiente em PCR 58 Figura 5- Resultado das clivagens dos plasmídeos pVAX1 e pVAX-Hsp65 digeridos com BamHI e HindIII 59 Figura 6- Resultado da reação de PCR de colônia 61 Figura 7- Análise de restrição dos plasmídeos recombinantes 62 Figura 8- Avaliação do RNA total e detecção do mRNA de Ag85A 64 Figura 9- Detecção da proteína Ag85A por meio de western blot 66 Figura 10- Perfil eletroforético dos DNAs plasmídeais purificados 68 Figura 11- Expressão e purificação da proteína recombinante Hsp65 70 Figura 12- Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65 74 Figura 13- Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Ag85A 75 Figura 14- Detecção de IL-12 em sobrenadante de cultura de células do baço dos animais imunizados 78 Figura 15- Detecção de IFN-γ em sobrenadante de cultura de células do baço dos animais imunizados 79 Figura 16- Detecção de IFN-γ em sobrenadante de cultura de células do baço dos animais imunizados 80 Figura 17- Detecção de IL-10 em sobrenadante de cultura de células do baço dos animais imunizados 81 Figura 18- Resposta linfoproliferativa dos animais imunizados 83 Figura 19- Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65 nos animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis 86 Figura 20- Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Ag85A nos animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis 87 Figura 21- Detecção de citocinas em homogenato de pulmão de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis 89 Figura 22- Detecção de citocinas em homogenato de pulmão de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis 90 Figura 23- Análise da porcentagem de células pulmonares expressando o marcador CD3+ nos animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis 92 Figura 24- Análise da porcentagem de linfócitos T, expressando os marcadores CD4+ e 93 CD8+ no pulmão de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis xi Figura 25- Análise da porcentagem de linfócitos T CD4+ e T CD8+ expressando os marcadores CD44hi e CD62Llo no pulmão de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis 94 Figura 26- Número de UFC no pulmão de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis 96 Figura 27- Cortes histológicos dos pulmões de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis (aumento 40X) 99 Figura 28- Cortes histológicos dos pulmões de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis (aumento 200X) 101 xii xiii _________________________________________________________________Abreviaturas ABREVIATURAS Ag85: Antígeno 85 AIDS: Síndrome da Imunodeficiência Adquirida APC: Célula Apresentadora de Antígeno BAAR: Bacilo Álcool-Ácido Resistente BALT: Tecido Linfóide Associado ao Brônquio BCG: Bacilo de Calmette-Guérin BLAST: Basic Local Alignment Search Tool BSA: Albumina Sérica Bovina cDNA: DNA Complementar CFP: Proteínas de Filtrado de Cultura CIAP: Calf Intestinal Alkaline Phosphatase CMV: Citomegalovírus ConA: Concanavalina A CpG: Dinucleotídeos Citosina-Guanina CR: Receptor de Complemento CTL: Célula T citotóxica Cy: CyChrome DAB: 3,3’-Diaminobenzidine DC-SIGN: Dendritic Cell-Specific ICAM-3 Grabbing Non-integrin DEPC: Diethylpyrocarbonate DMT: Dimicolato de Trealose DNA: Ácido Desoxiribonucléico dNTPs: Dideoxinucleotídeos Fosfato xiv _________________________________________________________________Abreviaturas DO: Densidade Óptica DTT: Dithiothreitol EDTA: Ethylene Diamine Tetracetic Acid ELISA: Ensaio Immunoenzimático de Adsorção ESAT-6: 6-kDa Early Secreated Antigen Target FACs: Análise de Citometria de Fluxo FcγγR: Receptor para a porção constante de IgG FITC: Isotiocianato de Fluoresceína FSC: Forward Scartter HBHA: Heparin-Binding Hemagglutinin HE: Hematoxilina-Eosina HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana HLA: Antígeno Leucocitário Humano HSP65: Proteína de Choque Térmico de 65 kDa ICAM: Molécula de Adesão Intercelular 1 IFN-γγ: Interferon-gama Ig: Imunoglobulina IL: Interleucina iNOS: Óxido Nítrico Sintase induzida IPTG: Isopropiltio-β-D-Galactosídeo KatG: Gene que codifica para a enzima Catalase-Peroxidase LAL: Lisado de amebócito de Limulus sp LAM: Liporabinomanana LB: Luria Bertania xv _________________________________________________________________Abreviaturas LPS: Lipopolissacarídeo MCP-1: Monocyte Chemoattractant Protein-1 MDR: Multi-Droga Resistente MHC: Complexo Principal de Histocompatibilidade MIP-2: Macrophage Inflammatory Protein-2 MOPS: 3 -(N-Morpholino) propanesulfonic acid MSC: Sítio de Múltipla Clonagem Mtb: Mycobacterium tuberculosis MTP-64: M. tuberculosis secreted proteins MVA: Vírus da vaccinia Ankara modificado NCBI: Nacional Center for Biotechnology Information NI: Não Imunizado e Não Infectado NK: Natural Killer NO: Óxido Nítrico NPT: Núcleo de Pesquisas em Tuberculose OMS: Organização Mundial de Saúde OPD: Orto-phenilene-diamina ORF: Fase Aberta de Leitura PAMP: Padrão Molecular Associado ao Patógeno PBS: Salina Tamponada com Fosfato PCR: Reação em Cadeia da Polimerase PE: Ficoeritrina PMSF: Phenylmethylsulphonyl Fluoride PPD: Derivado Protéico Purificado xvi _________________________________________________________________Abreviaturas PRR: Receptor de Reconhecimento Padrão PstA1: Phosphate Transport System Permease Protein A-1 RANTES: Regulated upon activation normal T cell expressed and secreted RD1: Region of Difference 1 RNA: Ácido Ribonucléico RNIs: Intermediários Reativos do Nitrogênio ROIs: Intermediários Reativos do Oxigênio RpoB: Beta Subunit of RNA Polymerase SBF: Soro Bovino Fetal SBPT: Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisiologia SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis SPF: Livre de Patógenos Específicos SSC: Side Scartter TB: Tuberculose TCR: Receptor da Célula T TGF: Fator de Crescimento Tumoral Th1: Célula T auxiliar tipo 1 Th2: Célula T auxiliar tipo 2 ThyA: Thymidylate Synthase TLR: Receptor do Tipo Toll TM: Temperatura de Melting TNF: Fator de Necrose Tumoral tPA: Human Tissue Plasminogen Activator Treg: Célula T reguladora xvii _________________________________________________________________Abreviaturas UFC: Unidades Formadoras de Colônia XDR: Extremamente Resistente WHO: World Health Organization ZN: Ziehl-Neelsen xviii xix _____________________________________________________________________Resumo RESUMO Mais de 100 anos após sua descoberta, a tuberculose (TB) ainda é considerada uma das maiores causas de mortalidade em todo o mundo. A única vacina atualmente licenciada para uso na profilaxia da TB é o BCG, porém esta tem mostrado uma eficácia variável de 0 a 80%. Portanto, estratégias para o desenvolvimento de novas vacinas tem sido alvo de intensa investigação. A vacina DNA-Hsp65, desenvolvida pelo nosso grupo, tem demonstrado não só atividade preventiva como terapêutica contra a doença já estabelecida. No entanto, uma vacina baseada em um único antígeno poderia não proteger efetivamente toda a população humana. Assim, no intuito de otimizar essa vacina, o objetivo desse trabalho foi construir uma vacina múltipla de DNA, contendo dois antígenos micobacterianos: a Hsp65 e o Ag85A, e avaliar a sua eficácia protetora em modelo de TB experimental. Após a construção e caracterização da vacina múltipla DNA-Ag85A/Hsp65, os experimentos em modelo murino foram desencadeados. Camundongos Balb/c foram imunizados com 4 doses quinzenais de 100 µg de DNA e 15 dias após a última imunização, os animais foram mortos para realização dos ensaios de imunogenicidade, ou então desafiados com 105 bacilos H37Rv e mortos após 30 dias para realização dos ensaios de proteção. Os dados de imunogenicidade não mostraram uma boa indução de resposta. Entretanto, nos ensaios de proteção, os animais vacinados com DNA-Ag85A/Hsp65 apresentaram ativação de linfócitos B de memória, aumento no recrutamento de linfócitos TCD4+ e CD8+ efetores e TCD8+ de memória, produção de IL-12 e IFN-γ e diminuição de IL-4. Além disso, houve produção de IL-10, importante citocina antiinflamatória. Esse perfil de resposta gerado contribuiu para a redução do número de UFCs nos pulmões e também para uma maior preservação do parênquima pulmonar após infecção por Mtb se comparados com os animais controles. Assim, essa vacina apresentou-se como uma alternativa promissora para o uso na profilaxia contra TB experimental. xx xxi ____________________________________________________________________Abstract ABSTRACT More than 100 years after tuberculosis (TB) discovery, TB is still a main cause of mortality worldwide. The only vaccine currently accepted for TB prophylaxis is BCG, however, its effectiveness varies from 0 to 80%. Therefore, development of new vaccines strategies has been an issue of intense investigation. Our group developed the DNA-Hsp65 vaccine which has shown a preventive and therapeutical activity against the established illness. Nevertheless, a vaccine based only on one antigen could possibly not be able to protect effectively the human population. Therefore, in attempt to optimize our vaccine, this study objective was the construction of a multiple DNA vaccine with two mycobacterial antigens: Hsp65 and Ag85A, and the evaluation of its protective effectiveness in experimental TB. After the multiple vaccine DNA-Ag85A/Hsp65 construction and characterization, the experiments in murine model had been initiated. Balb/c mice had been immunized with 4 doses of DNA (100 µg) with 2 weeks interval and 15 days after the last immunization, the animals had been killed for the immunogenicity assays, or they were challenged with 105 H37Rv bacilli and killed after 30 days for the protection assays. The immunogenicity data did not show a strong induction of immune response. However, the protection assays demonstrated that DNA-Ag85A/Hsp65 vaccinated animals presented an activation of memory B lymphocytes, an increased mobilization of TCD4+ and TCD8+ effector and TCD8+ memory lymphocytes, a production of IL-12 and IFN-γ and a reduction of IL-4. Moreover, these animals produced IL-10, an important antiinflammatory cytokine. Also, we consider that this overall response contributed for a CFU reduction in lungs and for a better preservation of pulmonary parenchyma after Mtb infection when compared with the control animals. So, this vaccine was presented as a promising alternative for the use in the prophylaxis against experimental TB. xxii 1 __________________________________________________________________Introduçâo 1 INTRODUÇÃO 1.1 Tuberculose Cento e vinte e cinco anos se passaram desde a descoberta por Robert Koch do agente etiológico da tuberculose (TB), Mycobacterium tuberculosis (Mtb), denominado também como bacilo de Koch. Esse único microorganismo continua sendo um dos maiores causadores de morte no mundo atual (Andersen, 2001) (Kaufmann, 2006). Dados epidemiológicos mostram que a TB provocou a morte de mais de 1 bilhão de pessoas ao longo da estória e acredita-se que 32% da população mundial esteja infectada com o bacilo. É estimado que nos próximos 20 anos, haverá mais 1 bilhão de pessoas infectadas, com 36 milhões de óbitos (WHO, 2002). Segundo a Organização Mundial da Saúde (Content et al.), em 2003 foram reportados pelos 199 países participantes do Programa de Controle de Tuberculose Mundial, 8,8 milhões de novos casos de TB. Neste contexto, o Brasil ocupa o 15o lugar em um ranking de 22 países que, juntos, somam 80% dos casos dessa patologia no mundo todo (SBPT, 2004) (WHO, 2004). A TB sempre esteve presente em países não desenvolvidos ou em desenvolvimento, no entanto, essa última década foi marcada por uma reemergência global da doença, relacionada principalmente a co-infecção com o vírus da imunodeficiência humana (HIV, Human Immunodeficiency Virus) que causa a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS, Acquired Immunodeficiency Syndrome) (Nunn et al., 2005). Aliado a esse fato, a ineficiência dos sistemas de saúde, as condições de desnutrição e pobreza em determinadas regiões, a dificuldade de adesão aos extensos esquemas terapêuticos, que levam a seleção e surgimento de cepas de Mtb multi-drogas resistentes (MDR) (Espinal, 2003) e, mais recentemente, das cepas extremamente resistentes (XDR) (Raviglione, 2006), são fatores que contribuíram de forma decisiva para o aumento da incidência da tuberculose (Bloom and 2 __________________________________________________________________Introduçâo Murray, 1992) (Meacci et al., 2005). Apesar das estatísticas mostrarem que grande parte da população mundial já entrou em contato com o Mtb, apenas uma parcela relativamente pequena desses indivíduos (5 a 10%), desenvolvem a TB ativa. Noventa por cento das pessoas infectadas apresentam uma forma latente e assintomática da doença, o que não descarta a possibilidade de uma reativação da infecção em algum momento da vida, decorrente de um quadro de imunossupressão, desnutrição ou exposição aos bacilos MDR e XDR (Boom et al., 2003) (Rook et al., 2005a) (Flynn and Chan, 2005). A profilaxia da TB é realizada pela administração da vacina BCG (Bacilo de Calmette-Guérin) em recém-nascidos. A vacina BCG foi desenvolvida pelos pesquisadores Albert Calmétte e Camille Guérin, em 1921, sendo gerada a partir de uma cepa virulenta de Mycobacterium bovis que foi atenuada através da realização de vários subcultivos in vitro do bacilo (Bloom and Jacobs, 1989) (Bannon, 1999) (Chung and Biggers, 2001). No Brasil essa vacina tem se mostrado eficaz na proteção contra a tuberculose infantil. Mas não mostra atividade protetora em indivíduos adultos (Barreto et al., 2006). Até o momento, e apesar das cepas MDR e XDR, o tratamento de pacientes portadores de TB é realizado por meio de quimioterapia, que combina o uso de diferentes antibióticos e tem duração de no mínimo seis meses (Zhu et al., 2005). 1.2 Resposta imune na tuberculose M. tuberculosis é um patógeno intracelular obrigatório, aeróbio e apresenta uma parede celular peculiar composta por diferentes lipídeos, como: complexo de ácidos micólicos, arabinogalactano e peptidoglicano associados à liporabinomanana (LAM) (Chan et al., 1991) (Flynn and Chan, 2005). 3 __________________________________________________________________Introduçâo A transmissão do Mtb acontece pela via respiratória através da inalação de partículas, contendo a bactéria, que são expelidas em forma de aerosol por indivíduos com a doença ativa (Riley et al., 1995). Embora possa ocorrer em outras partes do corpo humano (ossos, rins, pleura, intestino, cérebro, etc), a tuberculose pulmonar é a forma mais comum da doença (Flynn and Chan, 2001). A infecção normalmente se inicia na superfície da mucosa pulmonar quando os bacilos inalados encontram os macrófagos alveolares. O estabelecimento da infecção depende de fatores como o número e a virulência dos bacilos inalados, características genéticas e a condição imunológica do indivíduo exposto (Dannenberg, 1993). A resposta imune desencadeada contra a TB é bastante complexa, e, muitos componentes do sistema imune estão envolvidos tanto na proteção, quanto na imunopatologia da doença. O sucesso do estabelecimento da infecção no pulmão depende da interação do patógeno com as células hospedeiras, usualmente os macrófagos alveolares. Essa interação ocorre por meio dos padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs, Pathogen Associated Molecular Pattern), expressos na superfície do bacilo, com os receptores de reconhecimento padrão (PRRs, Pattern Recognition Receptors) expressos nas superfície das células, tais como o CD14, os receptores do sistema complemento (CR1, CR3 e CR4), os receptores de manose e os receptores do tipo ‘Toll’ (TLRs, Toll Like Receptors), como Toll 2 e Toll 4 (Kaufmann, 2003) (Drennan et al., 2004) (Ernst, 1998) (Means et al., 1999). Além desses receptores, o receptor para a porção constante de IgG (FcγR) também reconhece o complexo anticorpo-micobactéria (Ernst, 1998). O bacilo também pode interagir com outras células do hospedeiro como as células dendríticas. Essa interação ocorre via um receptor tipo lectina presente na superfície dessas 4 __________________________________________________________________Introduçâo células, o DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific ICAM-3 Grabbing Non-integrin) ou CD209. Esse receptor interage com a lipoarabinomanana (LAM) de M. tuberculosis desencadeando efeitos antiinflamatórios, porém se essa propriedade é benéfica ou não para o bacilo, ainda é controversa (Herrmann and Lagrange, 2005). As interações iniciais entre o bacilo e as células do sistema imune desencadeiam a liberação de uma cascata de moléculas inflamatórias, incluindo citocinas e quimiocinas, que além de participarem no recrutamento celular também terão papel fundamental no estabelecimento da resposta imune contra o bacilo. Inicialmente, ocorre a migração de neutrófilos para o sítio da infecção, seguidos de monócitos que se diferenciam em macrófagos e de precursores de células dendríticas (Flynn and Chan, 2001) (Kaufmann, 2003). Dentre estas células, os macrófagos são descritos como essenciais na indução da resposta imune contra TB, pelo fato de serem as células que contêm os bacilos e também por exercerem funções microbicidas. Além disso, os macrófagos atuam como células apresentadoras de antígenos e podem ativar a resposta imune adaptativa (Flynn and Ernst, 2000) (Flynn, 2004). A resposta dos macrófagos, decorrente da presença dos bacilos fagocitados, induz a produção de TNF-α e IL-12 (Flynn and Ernst, 2000). A citocina IL-12 participa do processo de ativação das células NK (Natural Killer), induzindo-as a produzirem IFN-γ, a qual juntamente com o TNF-α, ativa as funções microbicidas dos macrófagos, como: (1) fusão do lisossoma ao fagossoma e liberação de enzimas com potencial lítico, (2) produção de intermediários reativos do oxigênio (ROIs, Reactive Oxigen Intermediary), tóxicos para os bacilos, (3) produção de intermediários reativos do nitrogênio (RNIs, Reactive Nitrogen Reactive) e (4) apoptose da célula infectada (Chan et al., 1995) (Hingley-Wilson et al., 2003) (Fairbairn, 2004). Além disso, os bacilos submetidos às condições variadas de estresse no 5 __________________________________________________________________Introduçâo interior dos macrófagos, como sua própria entrada na célula do hospedeiro, liberam altas concentrações de proteínas de choque térmico, ou Hsps (Heat Shock Protein), as quais podem induzir a liberação de IL-1β, IL-6 e GM-CSF e quimiocinas como MCP-1, MIP-2 e RANTES pelas células T (Srivastava, 2002) (Reimann and Schirmbeck, 2004). Entretanto, os bacilos são altamente adaptados ao homem e ao infectá-lo são capazes de escapar dos mecanismos iniciais de defesa desencadeados pelo hospedeiro. Algumas dessas estratégias de escape estão relacionadas ao metabolismo oxidativo dos macrófagos. A interação preferencial via receptores como o CR3, por exemplo, impede o “burst” oxidativo, diminuindo a produção de ROIs e evitando a ação tóxica dos mesmos sob M. tuberculosis (Wright and Silverstein, 1983). Além disso, enzimas como a catalase e superóxido dismutase produzidas pelas micobactérias são capazes de degradar espécies reativas do oxigênio (Roberts and Hirst, 1996) (Cole et al., 1998). O bacilo da TB também é capaz de sobreviver no interior de macrófagos evitando o seu processamento por impedir a fusão do fagossoma ao lisossoma, mecanismo este mediado por lipídeos (Russell, 1995) (Turner and Dockrell, 1996). Deste modo, a ativação inicial dos macrófagos decorrente da captura dos bacilos, na maioria das vezes, é insuficiente para eliminá-los, dado os mecanismos de evasão já comentados. Assim, o controle da infecção requer também a ativação da resposta imune celular específica, principalmente dos linfócitos T (Clemens and Horwitz, 1995) (Flynn, 2004) (Flynn and Chan, 2005). Os trabalhos realizados por North e colaboradores (1974), mostrando que camundongos isentos de linfócitos T eram mais suscetíveis à TB experimental e os estudos de Lefford e colaboradores (1975), comprovando que células T poderiam transferir imunidade, representaram um marco inicial na tentativa de se caracterizar as várias funções das subpopulações de linfócitos T na TB (North, 1974) (Lefford, 1975). 6 __________________________________________________________________Introduçâo A importância de linfócitos T CD4+ na imunidade contra TB humana foi evidenciada em pacientes infectados por HIV, onde a depleção dessas células foi correlacionada com a maior susceptibilidade a essa doença (Lai et al., 1997). Sua importância na resposta protetora está relacionada ao desenvolvimento da resposta de perfil Th1, ou seja, desenvolvida num microambiente em que prevalecem as citocinas como IFN-γ e IL-12. O IFN-γ é de fundamental importância na resposta contra M. tuberculosis e é produzido por células T CD4+, T CD8+ e NK (Fenton et al., 1997). Pacientes que apresentam deficiências nos receptores para o IFN-γ são mais susceptíveis às infecções micobacterianas (Jouanguy et al., 1997). Um dos principais papéis atribuídos ao IFN-γ e outras citocinas do padrão Th1 na resposta do hospedeiro contra TB consiste no recrutamento e ativação de macrófagos. Vários pesquisadores mostraram que o IFN-γ é uma das principais citocinas associadas à resposta protetora durante a infecção por micobactérias (Cooper et al., 1993) (Flynn et al., 1993) (Yang and Mitsuyama, 1997). Por outro lado, Fonseca e colaboradores (2007), evidenciaram que altos níveis de IFN-γ não estavam relacionados à proteção contra TB experimental. Dessa forma, células T CD4+ produtoras de IFN-γ seriam capazes de ativar macrófagos que, conseqüentemente, atuariam na destruição dos bacilos ou, pelo menos na inibição da multiplicação de bactérias remanescentes. Além das células CD4+ e macrófagos, um importante papel na resposta protetora contra TB também tem sido atribuído às células T CD8+ citotóxicas. A maioria dessas células medeia a lise de células infectadas por meio da formação de poros por perforina e pela ação das moléculas efetoras, granulisinas e granzimas (Silva et al., 2001). Tem sido descrito ainda, que células T CD8+ de camundongos infectados produzem IFN-γ em resposta ao reconhecimento de antígenos de Mtb apresentados por células dendríticas ou macrófagos (Serbina and Flynn, 1999) (Silva et al., 1996). Além disso, a cultura de linfócitos provenientes de pulmão de animais infectados na presença de células 7 __________________________________________________________________Introduçâo dendríticas também infectadas é capaz de gerar células T CD8+ que reconhecem e lisam macrófagos infectados por M. tuberculosis (Serbina et al., 2000). Esses dados mostram que células T CD8+, restritas ao reconhecimento de antígenos associados às moléculas de classe I do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), também participam do controle da TB (Bonato et al., 1998) (Silva et al., 2001). Células T ‘não convencionais’ também podem estar envolvidas na resposta para eliminação do bacilo. Estas células incluem os linfócitos Tγδ, específicos para fosfoantígenos micobacterianos, células NKT que reconhecem antígenos não protéicos apresentados pelas moléculas CD1 ou até mesmo, células T reguladoras (Treg) controlando o desenvolvimento da doença. As células Tγδ secretam diferentes citocinas como IL-17 e IFN-γ e podem exercer atividade citotóxica contra macrófagos infectados reduzindo a viabilidade de bacilos extra ou intracelulares (Tsukaguchi et al., 1995) (Boom, 1999) (Dieli et al., 2001) (Lockhart et al., 2006). Embora alguns trabalhos tenham mostrado que há um aumento na população de células Tγδ em pacientes com TB (Ito et al., 1992) (Ueta et al., 1994), outros grupos mostraram quem não há variação nessa população celular (Barnes et al., 1992) (Li et al., 1996). Com relação às células NKT, não existe um consenso sobre o seu papel durante a infecção por Mtb. Foi observarda uma falha na formação de granuloma em camundongos deficientes dessas células (Apostolou et al., 1999). Também foi descrito que a ativação de células NKT com seu ligante natural, a α-galactosilceramidase, protege camundongos contra TB (Chackerian et al., 2002). Por outro lado, outros pesquisadores mostraram que não há diferença entre camundongos deficientes de células NKT e selvagens após desafio com cepa virulenta de M. bovis (Kawakami et al., 2002). Da mesma forma, a depleção dessas células em camundongos infectados com Mtb não ocasionou diferença no número de UFC (Unidades Formadoras de Colônia) no pulmão desses animais (Junqueira-Kipnis et al., 2003). O papel 8 __________________________________________________________________Introduçâo das células T reguladoras na TB ainda é um pouco desconhecido. Embora elas sejam importantes para o controle de uma resposta imune exacerbada, no caso da TB elas parecem impedir o clearence de Mtb nos indivíduos infectados (Kursar et al., 2007). Experimentos do nosso grupo mostraram que as células T reguladoras podem ser um fator envolvido na susceptibilidade à TB experimental: camundongos com maior freqüência de células T reguladoras no sítio da infecção apresentam um menor influxo de células T efetoras e, consequentemente, menor capacidade de controlar o crescimento do bacilo (Paula, 2007). A contribuição das células B CD19+ na TB também permanece controversa. Camundongos deficientes de células B apresentaram aumento no número de UFC após desafio com M. tuberculosis em relação aos camundongos selvagens (Vordermeier et al., 1996). Entretanto, Johnson e colaboradores (1997) não observaram diferenças na UFC do pulmão de camundongos selvagens e deficientes de células B 45 dias após desafio com aerosol contendo baixo número de bacilos (Johnson et al., 1997). Por outro lado, Bosio e colaboradores (2000) mostraram que linfócitos B possuem um papel protetor durante as fases mais iniciais da infecção. Neste trabalho, camundongos deficientes de células B apresentaram aumento do comprometimento pulmonar e disseminação da bactéria quando comparados aos camundongos selvagens (Bosio et al., 2000). Uma das dificuldades de se estabelecer o verdadeiro papel das células B contra a infecção por Mtb, são as disparidades das condições experimentais, o que dificulta o estabelecimento de uma correlação precisa. Os bacilos da TB, que persistem no hospedeiro, normalmente permanecem dentro dos macrófagos, que se localizam em uma estrutura celular complexa conhecida como granuloma. Estas estruturas, claramente evidenciadas na reação inflamatória crônica, são capazes de limitar o crescimento da micobactéria e prevenir a disseminação da infecção para outros órgãos (Nau et al., 1997) (Bean et al., 1999). Estes granulomas constituem-se de uma área 9 __________________________________________________________________Introduçâo central de necrose circundada por macrófagos infectados. Linfócitos T CD4+ e T CD8+, distribuem-se mais perifericamente, ao redor dos macrófagos. Além disso, ocorre também um influxo de linfócitos B na periferia do granuloma. Na maioria das vezes, os macrófagos fundem-se formando as células gigantes, ou células de Langhans (Kaufmann, 2003) (Boom et al., 2003) (Cosma et al., 2004). No entanto, a formação granulomatosa muitas vezes não é capaz de eliminar completamente o bacilo, mantendo-o apenas isolado. Em indivíduos imunossuprimidos, onde o equilíbrio entre o sistema imune do hospedeiro e o patógeno é quebrado, ocorre a reativação e, muitas vezes, a disseminação da infecção (Rivas-Santiago et al., 2005) (Wallis, 2007). De forma geral, a compreensão dos mecanismos envolvidos na resposta imune protetora ou patológica é essencial para a identificação de marcadores imunológicos que possam ser correlacionados à proteção, susceptibilidade e progressão da doença, assim como para o desenvolvimento racional de vacinas e novos recursos terapêuticos contra a TB. 1.3 Desenvolvimento de vacinas contra a TB Desde a introdução do conceito de vacinação pelo médico inglês Edward Jenner, há mais de 200 anos, esta se tornou a medida mais eficiente e menos dispendiosa de evitar doenças infecciosas. As vacinas têm como objetivo fundamental a imunização prévia do indivíduo, de modo que este possa responder rápido e eficientemente quando em contato com o agente infeccioso, evitando assim, o desenvolvimento da doença. Como descrito anteriormente, o BCG é a única vacina atualmente licenciada para o uso na profilaxia da TB. Ela é produzida a partir de cepas atenuadas de M. bovis e estima-se que mais de 2,5 bilhões de pessoas já tenham sido vacinadas com a mesma (Martin, 2005). Essa vacina, administrada em dose única, apresenta uma série de vantagens, tais como: 1) 10 __________________________________________________________________Introduçâo pode ser administrada ao nascimento; 2) apresenta estabilidade ao calor na forma de vacina viva liofilizada e 3) é uma vacina cuja produção requer baixo custo (O' Donnell, 1997). Além disso, o BCG protege contra as formas mais graves de TB durante a infância, TB extrapulmonar e meningite, e também contra a hanseníase (Martin, 2005). Embora venha sendo amplamente utilizada, a eficácia do BCG permanece controversa. Estudos epidemiológicos mostraram que o nível de proteção alcançado, em diferentes populações, pode variar de 0 a 80% (Andersen and Doherty, 2005) (Rook et al., 2005b). Essa variabilidade está associada a vários fatores como: o contato prévio com micobactérias ambientais, principalmente nas regiões tropicais; o fato do BCG ser produzido por laboratórios de diferentes países, os quais empregam diferentes cepas do bacilo; além do fato dessa vacina estar sendo mantida em cultura há muitos anos, o que acarretou a perda de segmentos gênicos que poderiam ser imunogênicos (Enserink, 2001) (Brandt et al., 2002) (von Reyn and Vuola, 2002) (Britton and Palendira, 2003) (Martin, 2005). Além disso, a vacina BCG pode interferir no teste de sensibilidade para detecção da doença (PPD, Purified Protein Derivative) e não apresenta proteção adicional com a administração de reforços (Hess and Kaufmann, 1999) (Britton and Palendira, 2003) (Monteiro-Maia et al., 2006). No que concerne à segurança do BCG, existe uma preocupação crescente com o uso de organismos vivos em indivíduos imunocomprometidos, fato especialmente agravante se considerarmos que no caso da TB, a co-infecção pelo HIV tem se tornado cada vez mais comum (Grange et al., 1983) (Perronne, 1994) (Kaufmann and Schaible, 2003). Por todos os motivos acima expostos, a procura por uma alternativa de imunização mais segura e eficaz para a TB tem levado muitos pesquisadores a investirem no desenvolvimento de novas vacinas. As primeiras tentativas para o desenvolvimento de uma vacina contra TB envolviam o 11 __________________________________________________________________Introduçâo uso de microorganismos vivos (Smith, 1985). Essa estratégia de imunização é uma alternativa interessante, pois induz uma resposta imunológica celular e humoral, que pode ser de longa duração e, além disso, não necessitam de adição de adjuvante uma vez que os próprios componentes da bactéria possuem este papel. No entanto, esse tipo de vacina pode oferecer alguns riscos, como a reversão de virulência ou a possível indução de patologia mediante situações de imunossupressão (Frey, 2006). A disponibilidade da seqüência genômica de M. tuberculosis (Cole et al., 1998) deu um impulso importante na investigação de antígenos imunogênicos e/ou imunodominantes com potencial para o desenvolvimento de novas vacinas. A partir desses estudos, outras estratégias de imunizações foram propostas como, por exemplo, o uso de BCG recombinante. Neste caso, são inseridos, na micobactéria, genes que passam a expressar determinadas proteínas. Essas proteínas podem ser citocinas inflamatórias, como a IL-12, antígenos imunodominantes de Mtb, ou ambos (Martin, 2005) (Reed and Lobet, 2005) (Rook et al., 2005b). Entre as várias cepas de BCG recombinante encontram-se: o rBCG30, que expressa o antígeno 85B (Ag85B) de Mtb; o BCG RD1, uma cepa de BCG na qual foram inseridos genes do complexo RD1 de Mtb e o BCG ∆ure-Hly que expressa a proteína listeriolisina de Listeria monocytogenes e é deficiente da enzima urease (Horwitz and Harth, 2003) (Pym et al., 2003) (Grode et al., 2005). Outro tipo de vacina atualmente em desenvolvimento, são as vacinas de subunidades, as quais consistem no uso de um ou mais componentes da micobactéria como elementos da parede do bacilo ou moléculas secretadas como proteínas, carboidratos, lipoglicoproteínas e glicolipídeos (Reed and Lobet, 2005) (Fonseca et al., 2007). Apesar de serem consideradas seguras, essas vacinas exigem alto custo de produção e também se mostram pouco imunogênicas (Sable et al., 2007). Uma alternativa para minimizar o problema da baixa 12 __________________________________________________________________Introduçâo imunogenicidade seria a utilização de adjuvantes. Porém, há uma grande dificuldade de se atingir a resposta imune adequada sem a indução de persistentes processos inflamatórios, uma vez que é comum observar ulceração após a vacinação com a maioria dos adjuvantes conhecidos (Bomford, 1998). Na última década, os avanços na tecnologia do DNA recombinante para o desenvolvimento de novas vacinas, permitiram a introdução de novas estratégias para a obtenção e produção de antígenos, assim como foram otimizadas novas maneiras de se administrar e apresentar esses antígenos para as células do sistema imune. Estas estratégias abriram caminho para inovações, particularmente no contexto do desenvolvimento de vacinas mais seguras, eficazes e polivalentes (Wolff et al., 1990) (Gurunathan et al., 2000). Dentre essas estão as vacinas de DNA ou vacinas gênicas (Spier, 1996). As vacinas de DNA são métodos potentes para a geração de uma forte resposta humoral e celular (Huygen, 1998) (Gurunathan et al., 2000) (Silva, 2004). Essas vacinas são constituídas de plasmídeos bacterianos contendo um promotor viral que controla a expressão do gene de interesse dentro de uma célula eucariótica, levando à transcrição do mRNA no núcleo e a tradução da proteína no citoplasma (Donnelly et al., 2005). Quando o DNA é administrado, o organismo passa a produzir o antígeno por meios próprios, sem os efeitos indesejáveis da introdução de um agente infeccioso patogênico ou de vacinas contendo subunidades protéicas e adjuvantes (Spier, 1996). Dessa forma, o indivíduo vacinado é capaz de induzir uma resposta imune celular e humoral específica, bem como memória imunológica. Além disso, as vacinas de DNA mimetizam os efeitos das vacinas vivas por possibilitarem a geração de antígenos endógenos e, consequentemente, a ativação de linfócitos T CD8+. Adicionamente, também são adjuvantes por conter em sua estrutura seqüências de nucleotídeos CpGs (citosina-fosfato-guanina) não metilados, que difere do padrão dos 13 __________________________________________________________________Introduçâo eucariotos. Os motifs CpGs, têm capacidade imunoestimulatória ativando receptores TLR 9 e TLR 3, dando inicio a resposta imune inata, com um direcionamento para uma padrão Th1 (Krieg, 2002). Por fim, as vacinas de DNA oferecem também, a possibilidade da combinação de antígenos de um mesmo ou de diferentes patógenos, gerando as chamadas vacinas multigenes ou multivalentes (Gurunathan et al., 2000), permitindo imunizar simultaneamente contra diferentes enfermidades. Recentemente, vários estudos descreveram as vantagens da “co-entrega” de antígenos em uma proteína híbrida na imunização contra doenças infecciosas complexas, como a malária e a leishmaniose (Li et al., 1999) (Zadeh-Vakili et al., 2004). A vacinação com DNA pode ser feita em várias espécies animais, por diversas vias e esquemas. Além da injeção intramuscular, que é a via mais utilizada, as vacinas gênicas também podem ser administradas por via intranasal na forma de aerosol, por via oral ou por via intradérmica através do bombardeamento de micropartículas de ouro cobertas com o material genético (Pertmer et al., 1995). O custo de produção das vacinas gênicas em larga escala é significativamente menor do que o custo de produção das vacinas protéicas recombinantes, peptídeos sintéticos e outras. O controle de qualidade é mais fácil, e a comercialização não necessita de uma rede de refrigeração, uma vez que estas vacinas são estáveis à temperatura ambiente. Estes fatores facilitam o transporte, a distribuição e o estabelecimento de amplos programas de imunizações em regiões de difícil acesso. Os mecanismos envolvidos na ativação da resposta imune humoral e celular, pelas vacinas de DNA plasmideais, ainda não foram completamente elucidados. Alguns autores propõem que a indução da resposta imune possa ter início após a transfecção de uma célula somática, não apresentadora de antígeno profissional, enquanto outros autores têm demonstrado a importância de células CD11b+ ou CD11c+ da medula óssea na indução da 14 __________________________________________________________________Introduçâo resposta imune (Gurunathan et al., 2000). De qualquer modo, antígenos produzidos no citoplasma da célula hospedeira são processados por várias enzimas, e os fragmentos resultantes apresentados na superfície celular juntamente com moléculas de classe I do MHC para linfócitos T CD8+. Por outro lado, parte dos antígenos produzidos pelos miócitos ou APCs são secretados sem sofrerem processamento, podendo estimular tanto linfócitos B a produzirem anticorpos específicos, como serem endocitados por outras APCs e estimularem linfócitos T CD4+ (Liu, 2003). Recentemente, foi demonstrado pelo nosso grupo, que células B podem capturar o DNA plasmideal in vivo, sugerindo que essas células também possam participar do processo de apresentação de antígeno em modelos de vacinas de DNA (CoelhoCastelo et al., 2003). As vacinas de DNA continuam a ser testadas em uma série de modelos de infecção experimental em camundongos (Manickan et al., 1995), cobaias (de Paula et al., 2007) e também em primatas não humanos (Barouch et al., 2000), além de ensaios de fase clínica I e II (Wang et al., 1998) (Gilbert et al., 2003). Na tentativa de contribuir na busca de alternativas profiláticas e terapêuticas para a TB, o Núcleo de Pesquisas em Tuberculose (NPT) da FMRP-USP vêm desenvolvendo uma vacina de DNA contra a TB experimental, baseada no gene que codifica para a proteína de choque térmico de 65 kDa (Hsp65) de Mycobacterium leprae. 1.4 Desenvolvimento da vacina DNA-Hsp65 As proteínas de choque térmico ou chaperoninas são moléculas altamente conservadas entre as espécies e desempenham papel importante no dobramento e translocação de proteínas e montagem de complexos protéicos. A síntese de Hsps aumenta nas situações de estresse como um mecanismo de proteção celular (Lindquist and Craig, 1988). 15 __________________________________________________________________Introduçâo As Hsps são potentes ativadoras do sistema imune inato e adaptativo, podendo desempenhar um importante papel no mecanismo de ação de vacinas, por estarem envolvidas com os efeitos imunogênicos ou com a modulação dos mesmos (Srivastava et al., 1994) (Multhoff, 2006). Três distintos papéis das Hsps na atuação como vacinas foram descritos: 1) Hsps microbianas como antígenos imunodominantes; 2) Hsps como adjuvantes e 3) Hsps como chaperoninas ou carreadoras de peptídeos imunodominantes, facilitando a geração da resposta imune peptídeo-específica (Reimann and Schirmbeck, 2004). No início da década de 90, Silva e colaboradores (1992) utilizaram pela primeira vez a Hsp65 de M. leprae como antígeno para o desenvolvimento de vacinas contra a TB (Silva et al., 1992). Estudos envolvendo a transferência adotiva de células transfectadas (macrófagos, tanto derivados de linhagem celular como de medula óssea) expressando o antígeno Hsp65 induziram proteção contra desafio com cepa virulenta de Mtb H37Rv, em modelo experimental (Silva et al., 1994). Posteriormente, foi demonstrado que plasmídeos contendo o gene hsp65 também protegeram camundongos contra subseqüente desafio com Mtb (Lowrie et al., 1994) (Tascon et al., 1996). Quando administrada por via intramuscular em camundongos desafiados com M. tuberculosis ou previamente infectados com os bacilos por via endovenosa, a vacina DNA-Hsp65 apresentou efeito profilático e terapêutico, respectivamente (Lowrie et al., 1997) (Lowrie et al., 1999) (Bonato et al., 2004). Esses efeitos benéficos da vacina foram associados à participação de células T CD4+ e T CD8+ produtoras de IFN-γ e produtos citotóxicos, característicos do perfil Th1 de resposta (Silva et al., 1996) (Bonato et al., 1998) (Lowrie and Silva, 2000). O NPT vem se preocupando cada vez mais com a otimização dessa vacina, tanto na redução da dose (Lima et al., 2003), modo e rota de administração (Rosada, 2006) (Souza, 2006) (Gonçalves, 2006), como na sua biodistribuição (Coelho-Castelo et al., 2006) e 16 __________________________________________________________________Introduçâo segurança (Lima, 2006), na tentativa de garantir sua efetividade no uso clínico. No entanto, uma vacina baseada em um único antígeno micobacteriano poderia não proteger efetivamente toda a população humana, uma vez que há uma grande diversidade de HLA populacional. Assim, uma vacina composta de mais de um antígeno imunodominate, poderia melhorar a proteção alcançada pela vacina DNA-Hsp65, além de assegurar uma ampla cobertura de uma população geneticamente heterogênea. Diversos estudos têm sido realizados no sentido de identificar novos antígenos e epitopos imunodominantes de M. tuberculosis, candidatos ao desenvolvimento de novas vacinas contra a TB (Mustafa, 2002). Proteínas secretadas, presentes no filtrado de cultura (CFP, Culture Filtrate Protein) de Mtb têm sido o foco desses estudos, pelo fato desses antígenos serem considerados imunodominates por estimularem uma forte resposta imune celular e humoral (Andersen, 1997). Dentre alguns desses antígenos, estão o ESAT-6 (Early Secretory Antigenic Target of 6 kDa) (Lalvani et al., 1998), PstA1, ThyA, RpoB (Cho et al., 2000) (Bivas-Benita et al., 2004) e também aqueles pertencentes ao complexo Ag85 (Wiker et al., 1992). O complexo antígeno 85 (Ag85) consiste de três proteínas: Ag85A, Ag85B e Ag85C, com peso molecular entre 30-32kDa, que são codificadas por três genes parálogos localizados em diferentes regiões do genoma da micobactéria (Content et al., 1991). Juntas, essas proteínas constituem a maior porção das proteínas secretadas por M. tuberculosis e M. bovis (Wiker et al., 1992). Embora presente em grande quantidade nos filtrados de cultura, essas proteínas também podem ser encontradas em associação com a superfície da bactéria (Schou et al., 1985) (Wiker et al., 1992). As proteínas do complexo Ag85 possuem atividade enzimática de micolil transferases, requerida para a biogênese do ‘fator corda’, também conhecido como Dimicolato de Trealose 17 __________________________________________________________________Introduçâo (DMT), importante para a manutenção da integridade da parede celular micobacteriana (Belisle et al., 1997). Em adição a sua importância na biosíntese da parede celular, o complexo Ag85 também pode estimular a captura da micobactéria por macrófagos humanos através da interação dessas proteínas com a fibronectina presente na matrix extracelular. Esta interação resulta em um aumento da fagocitose do bacilo mediada pelos receptores do complemento presentes nos macrófagos do hospedeiro (Abou-Zeid et al., 1988). Diversos estudos vêm demonstrando a importância dessas proteínas como promissoras candidatas ao desenvolvimento de vacinas contra a TB. Em um desses estudos foi demonstrado que a vacinação com DNA plasmideal codificando para o Ag85B estimulou forte resposta humoral e celular, além de conferir proteção significativa em camundongos C57BL/6 desafiados com a cepa virulenta de Mtb H37Rv (Kamath et al., 1999). Langermans e colaboradores (2005) descreveram que a imunização de camundongos e também de primatas não humanos com a proteína de fusão ESAT-6/Ag85B em adjuvante conferiu proteção contra TB (Langermans et al., 2005). Estudos mostrando a disrupção dos genes que codificam para os três componentes do complexo Ag85 de M. tuberculosis sugerem que o Ag85A pode ser o componente essencial para a sobrevivência da bactéria dentro dos macrófagos (Jackson et al., 1999) (Armitige et al., 2000). Assim, atenção especial tem sido dada a essa proteína. O Ag85A induz uma forte proliferação de células T e produção de IFN-γ na maioria dos indivíduos infectados com M. tuberculosis ou M. leprae (Launois et al., 1994). Além disso, em modelo experimental, a vacina de DNA codificando para o Ag85A foi efetiva tanto nas primeiras semanas após o desafio com Mtb, como em uma fase mais tardia da infecção, observada pela diminuição das UFCs no pulmão dos animais (Tanghe et al., 1999). Recentemente, a vacina MVA-85A que utiliza como vetor o vírus vaccinia Ankara 18 __________________________________________________________________Introduçâo recombinante, modificado pela adição do gene que codifica o Ag85A, iniciou testes clínicos de fase I (McShane et al., 2004). Utilizando essa vacina como reforço da primeira imunização com BCG, os autores demonstraram indução de proteção contra TB em camundongos, além de níveis significativos de células CD4+ e CD8+ antígeno-específicas em relação aos animais somente imunizados com MVA-85A (Goonetilleke et al., 2003). Como descrito anteriormente, o NPT, vem realizando diversos estudos com a vacina gênica DNA-Hsp65, de forma a otimizar o seu uso e o seu desenvolvimento tecnológico. A vacinação baseada em DNA abre a possibilidade de combinar epitopos de diferentes proteínas em uma única vacina, aprimorando a sua utilização (Suhrbier, 1997) (An and Sette, 1999). Nesse sentido, a construção de uma vacina múltipla, contendo o gene que codifica para a proteína de choque térmico Hsp65 de M. leprae, e o gene que codifica para o Ag85A de M. tuberculosis se faz muito interessante, pois poderia possibilitar sua utilização em populações humanas geneticamente heterogêneas uma vez que múltiplos epitopos contidos em uma única vacina, poderiam assegurar uma maior cobertura dos diversos tipos de HLA dessas populações. 19 20 ___________________________________________________________________Objetivos 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral: Este trabalho tem como objetivo principal a construção de uma vacina múltipla de DNA, baseada na fusão entre dois antígenos imunogênicos: a Hsp65 de M. leprae e o Ag85A de M. tuberculosis, e a avaliação da sua eficácia protetora em modelo de tuberculose experimental murina. 2.2 Objetivos Específicos: • Construção e caracterização da vacina múltipla de DNA através de ensaios moleculares e ensaios in vitro. • Avaliação da imunogenicidade da vacina múltipla em relação às vacinas de DNA codificando os antígenos individualmente (DNA-Ag85A e DNA-Hsp65), através da produção de anticorpos específicos, proliferação celular e dosagem de citocinas do baço dos animais imunizados. • Avaliação da eficácia protetora da vacina múltipla de DNA em relação às vacinas DNA-Ag85A e DNA-Hsp65, através da produção de citocinas no pulmão, do grau de diferenciação das células pulmonares, contagem das unidades formadoras de colônias (UFCs) e da análise histológica dos pulmões dos animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis. 21 22 ___________________________________________________________ Material e Métodos 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Primeira estratégia de construção da vacina múltipla 3.1.1- Amplificação do gene Ag85A O gene Ag85A de M. tuberculosis foi obtido por amplificação a partir do plasmídeo pV1ns-tPA (gentilmente cedido pela Dra Kris Huygen do Instituto Pasteur, Bélgica), através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Aproximadamente 20 ng de DNA plasmideal foi incubado com os oligonucleotídeos Ag85F e Ag85R (10 pmol/µL), que hibridizam com o gene Ag85A, deoxinucleotídeos (dNTPs) a 10 mM, tampão da enzima (KCl a 500 mM; Tris-HCL a 200 mM, pH 8,4; MgCl2 a 1,5 mM) e 1 U da enzima Platinum Taq DNA polimerase (Invitrogen, USA) em um volume final de 50 µL. O material foi amplificado em termociclador PTC 200 (MJ Research, INC), com incubação inicial a 94°C por 5 min, seguido de 34 ciclos de 94°C, 1 min; um gradiente de temperatura de anelamento variando de 57-68°C por 40 s e 72°C para extensão final do fragmento por 1 min e 30 s. Os oligonucleotídeos empregados foram desenhados de forma a conter em suas extremidades um sítio para a enzima de restrição AflII (sublinhado), para posterior clonagem no vetor de expressão pVAX-Hsp65. As seqüências dos oligonucleotídeos foram as seguintes: Forward (Ag85F): 5´- AACTTAAGACCATGGATGCAAT - 3´ Reverse (Ag85R): 5´- AACTTAAGGTATGCTGCGGCGC - 3´ Após a reação, foram retiradas alíquotas para análise em gel de agarose 1% (GibcoBRL, USA), para verificar em qual temperatura de anelamento ocorreu a amplificação do gene, a quantificação do mesmo e se o produto apresentava uma única banda com o tamanho esperado. O produto de PCR amplificado foi então purificado com o uso do Kit “Wizard SV Gel and PCR Clean-up System” (Promega, USA) e digerido com 10 U da enzima AflII 23 ___________________________________________________________ Material e Métodos (Fermentas, Canada) e seu respectivo tampão (Tris-HCl a 50 mM, pH 7,5; MgCl2 a 10 mM; NaCl a 100 mM e BSA 0,1 mg/mL) em um volume final de 20 µL, a 37°C por 14 h. 3.1.2- Clivagem e purificação do plasmídeo pVAX-Hsp65 A vacina múltipla foi construída a partir da vacina original DNA-Hsp65 (já existente no nosso laboratório). Essa vacina foi construída mediante a clonagem do gene hsp65 no vetor de expressão eucariótico pVAX1 (Invitrogen, USA). O vetor pVAX1 foi especialmente desenhado para o uso no desenvolvimento de vacinas de DNA, ele possui o gene de resistência ao antibiótico canamicina para seleção em E. coli ao invés do gene de resistência ao antibiótico ampicilina, devido a esse último ter sido reportado causar uma resposta alérgica em alguns indivíduos. Além disso, a ampicilina é um antibiótico de uso corrente, sendo o seu gene não recomendado para uso em humanos (Romano et al., 1997) (Medrala et al., 2003). A enzima de restrição utilizada para a linearização do plasmídeo pVAX-Hsp65 foi a AflII (Fermentas, Canada), a mesma empregada para clivagem do inserto Ag85A, para que dessa forma pudesse ser realizada a clonagem devido às extremidades serem compatíveis. Cerca de 10 µg de DNA plasmideal foi incubado a 37ºC com 10 U de AflII (Fermentas, Canada) e seu tampão, em um volume final de 40 µL, durante 14 h para total digestão. A análise da reação de clivagem foi feita através de eletroforese em gel de agarose 1% e a banda correspondente ao vetor, foi purificada em coluna pelo Kit “Wizard SV Gel and PCR Clean-up System” (Promega, USA), de acordo com as recomendações do fabricante. 3.1.3– Defosforilação do plasmídeo pVAX-Hsp65 linearizado e clonagem do inserto Ag85A A defosforilação do vetor foi feita com a enzima Calf Intestinal Alkaline Phosphatase – CIAP (Invitrogen, USA). Para isso, foram adicionados à reação de clivagem, Tris-HCl a 24 ___________________________________________________________ Material e Métodos 200 mM, pH 8,0; MgCl2 a 100 mM e 1 U da enzima em uma reação final de 80 µL, incubada por 30 min a 37ºC e inativada por 15 min a 65ºC. Seguiu-se a defosforilação, o isolamento do vetor em gel de agarose 1% com o auxílio do Kit “Wizard SV Gel and PCR Clean-up System” (Promega, USA). A clonagem do inserto Ag85A no plasmídeo defosforilado foi realizada com o auxílio da enzima T4 DNA Ligase (Invitrogen, USA). A reação de ligação foi feita em um volume total de 10 µL, utilizando-se 1 U da enzima, e deixada a 4ºC, por 14 h. 3.1.4– Preparação de bactérias E.coli DH5α α CaCl2 competentes As bactérias foram quimicamente preparadas segundo Sambrook et al., (1989). A partir de uma colônia da bactéria E.coli DH5α, foi feita uma cultura por 16 h, sob agitação a 200 rpm a 37°C, em meio Luria Bertani (LB) líquido (Difco, USA) sem antibiótico. Posteriormente, o inóculo foi diluído 1:50 e mantido a 200 rpm e a 37°C até atingir a densidade óptica (DO) de aproximadamente 0,5 – 0,6 a 660 nm. A cultura foi resfriada e centrifugada a 4000 g, por 7 min a 4°C, o precipitado, ressuspendido com 1/3 do volume original com CaCl2 a 0,1 M gelado e mantido no gelo por mais 20 min. Após esse período, a cultura foi centrifugada novamente e o precipitado ressuspendido em CaCl2 a 0,1 M contendo 50% de glicerol. As alíquotas foram separadas, imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -70°C. 3.1.5– Transformação das bactérias por choque térmico Um volume de 5 µL da reação de ligação foi adicionado às bactérias competentes as quais foram incubadas no gelo por 10 min. Após esse período foi dado o choque térmico colocando as bactérias a 42°C por 90 s e logo em seguida a 0°C por 1 min. Foram adicionados à reação, 800 µL de meio de cultura LB líquido (Difco, USA) e a mesma foi incubada a 37°C 25 ___________________________________________________________ Material e Métodos por cerca de 1 h. Após esse período, foi retirada uma alíquota de 200 µL das bactérias que foram semeadas em meio seletivo LB ágar (Sigma, Germany) com o antibiótico canamicina (100 µg/mL) e as culturas foram incubadas a 37°C por 16 h. A partir das colônias formadas na placa, foi realizado um teste para identificação das colônias recombinantes, utilizando a técnica de PCR de colônia. Aproximadamente 10 ng de DNA plasmideal foi incubado com os oligonucleotídeos Ag85F e Ag85R (10 pmol/µL); deoxinucleotídeos (dNTPs) a 1,25 mM; tampão da enzima (KCl a 500 mM; Tris-HCL a 200 mM, pH 8,4; MgCl2 a 1,5 mM) e 0,1 U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen, USA) em um volume final de 20 µL. O material foi amplificado em termociclador PTC 200 (MJ Research, INC), com incubação inicial a 96ºC por 2 min; 39 ciclos de 94ºC, 15 s; 55ºC, 15 s, seguido de polimerização final a 72ºC por 40 s. As colônias com resultado positivo foram cultivadas em meio líquido LB, com canamicina (100 µg/mL), durante 16 h e utilizadas para uma minipreparação plasmideal utilizando o Kit de extração “Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System” (Promega, USA) para a extração dos DNAs plasmideais e posterior identificação dos clones recombinantes. 3.1.6– Quantificação e avaliação da integridade dos plasmídeos purificados Após a purificação dos clones recombinantes, foi realizada a quantificação desses plasmídeos por espectrofotometria nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm utilizando o aparelho GeneQuant IITM (Amershan, BioSciences, Sweden). A avaliação da positividade dos plasmídeos recombinantes quanto à presença do gene Ag85A foi feita através do sequênciamento das amostras utilizando o oligonucleotídeo T7 Promoter, (5´-TAATACGACTCACTATAGGG – 3´), e o oligonucleotídeo Ag85fim, (5´CCAAGACGCCTACAACGC–3´) como primers. O sequênciamento foi realizado em 26 ___________________________________________________________ Material e Métodos sequênciador automático ABI 377 (Perkin Elmer, USA), seguindo o método de Sanger et al., (1987), em colaboração com a professora Dra Maria Helena de Souza Goldman do Centro de Sequênciamento e Análise de Expressão Gênica, FFCLRP-USP (Sanger et al., 1977). A partir da sequência obtida, foi feito um alinhamento com o banco de dados do NCBI, Nacional Center for Biotechnology Information disponível no endereço eletrônico: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast.cgi, com o auxílio da ferramenta BLAST, para a confirmação da presença do gene Ag85A na construção. 3.2- Segunda estratégia de construção da vacina múltipla 3.2.1- Amplificação do gene Ag85A Uma segunda estratégia de construção da vacina múltipla foi elaborada uma vez que o sequênciamento dos clones recombinantes obtidos na primeira tentativa revelou que a ORF (Open Reading Frame) da proteína de fusão havia sido perdida. O gene que codifica para Ag85A foi novamente amplificado por PCR a partir do plasmídeo pV1ns-tPA como descrito no ítem 3.1.1, porém utilizando-se os novos oligonucleotídeos desenhados: Ag85ecorVfw: 5´- CCGGATATCACCATGGATGCAATG – 3´ e Ag85ecorVrev: 5´- GGATATCGGTATGCTGCGGCGC – 3´. Utilizou-se o mesmo ciclo de amplificação alterando-se somente o gradiente de temperatura de anelamento que variou de 53-64°C. Os novos oligonucleotídeos empregados foram desenhados de forma a conter em suas extremidades um sítio para a enzima de restrição EcoRV (sublinhado), que deixa as extremidades abruptas e um nucleotídeo a mais, a guanina, no ‘oligo’ reverse (em destaque). Após a reação, foram retiradas alíquotas para análise em gel de agarose 1%, para verificar em qual temperatura de anelamento ocorreu a amplificação do gene, a quantificação do mesmo e se o produto apresentava uma única banda com o tamanho esperado. 27 ___________________________________________________________ Material e Métodos O produto de PCR amplificado foi então purificado com o uso do Kit “Wizard SV Gel and PCR Clean-up System” (Promega, USA) e digerido com 10 U da enzima EcoRV (Invitrogen, USA) em um volume final de 50 µL, a 37°C por 14 h. 3.2.2- Clivagem e purificação do plasmídeo pVAX-Hsp65 As enzimas de restrição utilizadas para a linearização do vetor foram HindIII e BamHI (Invitrogen, USA), que deixam as extremidades coesivas. A reação foi deixada a 37°C por 14 h e a análise da clivagem foi feita através de eletroforese em gel de agarose 1%. A banda correspondente ao vetor foi isolada do gel e purificada em coluna pelo Kit “Wizard SV Gel and PCR Clean-up System” (Promega, USA), de acordo com as recomendações do fabricante. 3.2.3- Preparação do plasmídeo pVAX-Hsp65 para clonagem do inserto Ag85A Após a clivagem do vetor, as extremidades coesivas foram preenchidas com deoxinucleotídeos fosfato (dNTPs) pela atividade do fragmento Klenow da Polimerase I (Gibco-BRL, USA). O tratamento com Klenow consistiu de incubação do plasmídeo em Tris-HCl a 0,5 mM, pH 7,5; MgCl2 a 5 mM; DTT a 10 mM; 0,5 mg/ml BSA; dNTPs a 40 µM e 10 U da enzima por 30 min a 37ºC e 15 min a 70ºC para inativação da mesma. O DNA tratado foi então purificado com o Kit “Wizard SV Gel and PCR Clean-up System” e defosforilado com a enzima Calf Intestinal Alkaline Phosphatase – CIAP (Invitrogen, USA) como descrito no item 3.1.3. A clonagem do inserto Ag85A no vetor defosforilado foi realizada com o auxílio da enzima T4 DNA Ligase (Invitrogen, USA) e a reação de ligação foi feita em um volume final de 10 µL, utilizando-se 1 U da enzima e deixada a 4ºC, por 14 h. 28 ___________________________________________________________ Material e Métodos 3.2.4- Transformação das bactérias por choque térmico e identificação dos novos clones recombinantes Um volume de 5 µL da reação de ligação foi utilizado para transformar células de E. coli DH5-α CaCl2 competentes, como descrito no item 3.1.5. As bactérias foram semeadas em meio LB ágar (Sigma, Germany) contendo o antibiótico canamicina (100 µg/mL) e deixadas a 37°C por 16 h. A partir das colônias formadas na placa, foi realizado PCR para a identificação das colônias recombinantes. A reação de PCR foi idêntica a descrita no item 3.1.5 alterando-se somente os primers utilizados: Ag85EcorVfw e Ag85EcorVrev (10 pmol/µL). As colônias com resultado positivo foram cultivadas em meio líquido LB (Difco, USA), com canamicina (100 µg/mL), durante 16 h e utilizadas para uma minipreparação plasmideal utilizando o Kit de extração “Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System” (Promega, USA) para a extração dos prováveis clones recombinantes. 3.2.5 – Quantificação e avaliação da integridade dos plasmídeos purificados A quantificação dos clones recombinantes foi realizada por espectrofotometria à 260 e 280 nm utilizando o aparelho GeneQuant IITM (Amershan, BioSciences, Sweden) e a confirmação desses recombinantes foi feita por análise de restrição com a enzima PmeI (Fermentas, USA) a qual flanqueia o cassete Ag85A+Hsp65. Cerca de 200 ng dos plasmídeos foram incubados com 1 U da enzima em um volume final de 20 µL a 37ºC por 14 h. Em seguida, os produtos da digestão de cada amostra foram submetidos a eletroforese em gel de agarose 1% e a corrida foi realizada a 75 V por 1 h. O padrão 1 Kb Plus DNA Ladder (GibcoBRL, USA) foi utilizado como marcador de peso molecular; o gel foi corado com 0,5 mg/mL de brometo de etídio (Gibco-BRL, USA) e a visualização das bandas foi feita em luz ultravioleta no aparelho Image Master VDS (Pharmacia Biotech, USA). 29 ___________________________________________________________ Material e Métodos Em seguida foi realizado o sequênciamento desses plasmídeos, utilizando os oligonucleotídeos: T7 Promoter, (5´-TAATACGACTCACTATAGGG–3´), Ag85meio, (5´CGTCAAGCCCACCG-3´) e Ag85fim, (5´-CCAAGACGCCTACAACGC-3´) para verificar a integridade da junção Ag85A – Hsp65. O sequênciamento foi realizado em colaboração com a professora Dra Mayana Zatz do Centro de Estudos do Genoma Humano, ICB-USP. Após o sequênciamento, foi feito um alinhamento das seqüências obtidas com o banco de dados do NCBI, como citado anteriormente (item 3.1.6). 3.2.6- Construção do plasmídeo pVAX-Ag85A Para a construção do plasmídeo pVAX-Ag85A, o inserto Ag85A, obtido por amplificação (item 3.2.1) foi clonado no vetor pVAX1 (Invitrogen, USA), o qual foi previamente linearizado com as enzimas HindIII e BamHI (Invitrogen, USA). Esse vetor foi preparado da mesma maneira que o vetor pVAX-Hsp65 (item 3.2.3) para que pudesse ser realizada a clonagem. A caracterização desse plasmídeo foi realizada através de análise de restrição, PCR e sequênciamento, assim como realizado para a vacina múltipla. 3.3- Ensaio de transfecção de macrófagos J774 Macrófagos da linhagem J774 foram cultivados em placas de cultura de 6 poços (Corning, USA) em meio RPMI 1640 (Sigma, Germany), suplementado com 10% de soro bovino fetal - SBF (Gibco-BRL, USA), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 mg/mL) e gentamicina (10 mg/mL) (Gibco-BRL, USA), 50 mM de 2 mercaptoetanol (ME) (Sigma, Germany) e 200 mM de L-glutamina até atingirem a confluência de aproximadamente 50%. Para cada transfecção, diluiu-se 10 µL de Lipofectina (Invitrogen, USA) em 100 µL de meio Opti-MEM (Invitrogen, USA) e incubou-se a temperatura ambiente por cerca de 40 min. Em seguida, foram adicionados aproximadamente 2 µg de DNA, previamente diluído em 30 ___________________________________________________________ Material e Métodos 100 µL de Opti-MEM (Invitrogen, USA). A mistura foi incubada por mais 10 min a temperatura ambiente e então adicionados 800 µL de meio RPMI 1640 (Sigma, Germany) incompleto. A solução foi adicionada às células e deixada por cerca de 10 h. Após esse período, o meio contendo o DNA foi substituído por RPMI 1640 (Sigma, Germany) completo e as células foram incubadas a 37°C a 5% de CO2 por 72 h. 3.4- Extração do RNA total das células e realização de RT-PCR A extração do RNA total das células transfectadas foi realizada utilizando-se 1 mL do reagente Trizol (Invitrogen, USA) para cada poço contendo as células. Em seguida as amostras foram homogeneizadas, transferidas para um tubo de 1,5 mL e incubadas por 5 min a temperatura ambiente, para completa dissociação dos complexos de nucleoproteínas. Após esse período, adicionou-se 200 µL de clorofórmio e o material foi agitado vigorosamente por 30 s e mantido a temperatura ambiente por 3 min. Posteriormente as amostras foram centrifugadas a 10.500 g por 15 min a 4°C e a fase aquosa (sobrenadante) foi cuidadosamente retirada e transferida para um novo tubo. O RNA foi precipitado com 500 mL de isopropanol e armazenado por aproximadamente 15 h a -20°C. Em seguida as amostras foram novamente centrifugadas a 10.500 g por 15 min a 4°C e o precipitado foi ressuspendido em 50 µL de água DEPC (Dietil Pirocarbonato) (Sigma, Germany). O RNA total de cada amostra foi quantificado por espectrofotometria a 260 nm utilizando o aparelho GeneQuant IITM (Amershan, BioSciences, Sweden). Após a quantificação, foi feito um gel de agarose 1,5% desnaturante, para visualização da integridade dos RNAs obtidos. A preparação do gel foi realizada acrecentando-se 30 mL de formaldeído 37% e 33 mL de tampão de migração MOPS 5X (MOPS a 0,5 M; acetato de sódio a 50 mM; EDTA a 0,5 mM, pH 8,0) a 87 mL de agarose fundida em água Mili-Q estéril. As amostras (cerca de 1 µg) foram diluídas em tampão MOPS 1X, formaldeído 20%, 31 ___________________________________________________________ Material e Métodos formamida 50% e brometo de etídio (200 µg/mL) e incubadas a 65°C por 15 min. Após esse período, foi acrescentado tampão da amostra 1X (glicerol 50%; EDTA a 10 mM, pH 8,0; bromofenol blue 0,25% e xylene cyanol FF 0,25%) e aplicado no gel. A corrida foi realizada a 80 V por cerca de 1,3 h e a visualização das bandas foi feita em luz ultravioleta no aparelho Image Master VDS (Pharmacia Biotech, USA). O RNA total obtido, foi então tratado com a enzima Amplification grade DNAse I (Gibco-BRL, USA) para completa degradação de DNA, eliminando assim a possibilidade de contaminação com o DNA genômico ou plasmídeal. Para o tratamento de 1 µg de RNA total adicionou-se 1 U da enzima e seu respectivo tampão (Tris-HCl a 20 mM, pH 8,4; KCl a 50 mM e MgCl2 a 2 mM) em um volume final de 10 µL. A reação foi mantida por 15 min a 25°C e inativada com a adição de EDTA a 25 mM seguido de 15 min de incubação a 65°C. Para o controle desse processo, uma alíquota de cada amostra foi submetida à reação de PCR. Após o tratamento com DNAse, as amostras foram preparadas para a síntese do cDNA fita simples. Para tanto, foram adicionados oligo-dT (500 mg/mL) (Gibco-BRL, USA) e dNTPs (10 mM) e incubou-se por 10 min a 70°C. Em seguida, adicionou-se o tampão da enzima (Tris-HCl a 50 mM, pH 8,4; KCl a 75 mM), MgCl2 a 3 mM e DTT a 0,02 mM. A amostra foi equilibrada por 2 min a 42°C e em seguida adicionou-se 20 U da enzima SuperScript II (Gibco-BRL, USA) durante 50 min a 42°C. A reação foi inativada pela incubação por 15 min a 70°C. Em seguida, realizou-se uma reação de PCR para confirmação do cDNA específico para a proteína Ag85A. Para verificar a qualidade do cDNA obtido, realizou-se também PCR com oligos da actina como controle. Para cada reação adicionou-se dNTPs a 10 mM; Tris-HCl a 20 mM, pH 8,4; KCl a 50 mM; MgCl2 a 1,5 mM; oligonucleotídeos -actina-1 (5´- TGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3´) e -actina-2 (5’-CTCTTTGATGTCACGCACGATTT3’) a 10 pmol/µL e 2,5 U de Taq DNA Polimerase (Invitrogen, USA) em um volume final de 32 ___________________________________________________________ Material e Métodos 50 µL. A reação foi incubada em termociclador PTC-200 (MJ Research, INC), com incubação inicial de 95°C por 3 min, 35 ciclos de 94°C por 45 s, 60°C por 45 s, 72°C por 90 s e uma extensão final de 72°C por 10 min. Todas as reações de PCR obtidas foram analisadas através de eletroforese gel de agarose 1%. 3.5- Análise de Western blot Após 72 h de transfecção, foi coletado o sobrenadante dos macrófagos e à monocamada de células restantes foi adicionado tampão de lise: NaCl a 150 mM; Tris a 50 mM, pH 8,0; IgePal CA-630 1% (Sigma, Germany), 50 mM de PMSF (Gibco-BRL, USA), e deixado por cerca de 30 min no gelo. O lisado foi então centrifugado a 10.000 g, por 10 min a 4°C e o sobrenadante coletado. Uma alíquota de 20 µL de cada amostra foi utilizada para análise de eletroforese em gel de poliacrilamida 10% SDS-PAGE. As proteínas separadas no gel foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose através do aparelho mini trans-blot® (BioRad, USA) por 1,3 h a 100 V em tampão de transferência: Metanol 20%; Tris 6%; Glicina 0,3%. A membrana foi bloqueada com soro albumina bovina (BSA) 2% e Tween-20 0,05% em PBS 1X por 2 h a temperatura ambiente, e marcada com o anticorpo monoclonal contra a proteína Ag85A (TD 17-4, gentilmente cedido pela Dra Kris Huygen) em uma diluição de 1:500 em PBS 1X contendo 2% de BSA e 0,05% de Tween-20, por 18 h a 4°C. Após esse período, a membrana foi extensivamente lavada com PBS 1X contendo 0,5% de Tween-20 e incubada com anticorpo anti-IgG conjugado com peroxidade em uma diluição de 1:5000, por 1 h a temperatura ambiente. A membrana foi revelada utilizando o Kit de revelação “DAB Substrate Kit for peroxidase” (Vector, U.K). 33 ___________________________________________________________ Material e Métodos 3.6- Animais Foram utilizados camundongos BALB/c, SPF (Specific Patogen Free), fêmeas, com 6 a 8 semanas de idade, provenientes do Biotério de Animais Isogênicos da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto-USP. Os animais foram mantidos em isoladores de animais, com temperatura, umidade, fluxo de ar e ciclo de luz claro/escuro controlado, com livre acesso a água e ração. Os animais infectados com Mycobacterium tuberculosis foram mantidos em isoladores de animais, em laboratório de nível III de biossegurança, nas mesmas condições descritas acima. 3.7- Extração e purificação das construções de DNA Os plasmídeos pVAX1 (vetor), pVAX-Hsp65 (DNA-Hsp65), pVAX-Ag85A (DNAAg85A) e pVAX-Ag85A/Hsp65 (DNA-Ag85A/Hsp65) foram purificados por cromatografia de troca iônica, utilizando-se o “kit” comercial Qiagen Giga Plasmid Purification, EndoFree (Qiagen, USA.). Inicialmente foi realizada a cultura de bactérias E. coli DH5-α, transformadas com cada plasmídeo em questão, em meio LB ágar (Sigma, Germany) juntamente com o antibiótico canamicina (Cilinon) na concentração de 100 µg/mL, por 16 h a 37ºC. Após esse período, escolheu-se uma colônia, a qual foi inoculada em 5 mL de meio LB líquido (Gibco BRL) contendo canamicina (100 µg/mL) e incubada durante 8 h, 250 rpm a 37°C (Incubador shaker series 25, New Brunswick, USA). A seguir, essa cultura foi diluída 1/500 em 2,5 L de LB líquido, contendo canamicina (100 µg/mL), e incubada novamente a 37ºC sob agitação (250 rpm) durante 16 h. Após a incubação, o material foi centrifugado a 6800 g por 15 min a 4ºC. O sobrenadante foi desprezado e cerca de 7 gramas do precipitado foi ressuspenso em 125 mL de tampão P1 (Tris-HCl a 50 mM pH 8,0; EDTA a 10 mM e RNAse 100 µg/ml). Em seguida foram adicionados 125 mL de tampão P2 (NaOH a 200 mM; SDS1%) e esperou-se 5 34 ___________________________________________________________ Material e Métodos min para a completa lise da parede bacteriana. Logo após, adicionou-se 125 mL do tampão P3 (acetato de potássio a 3,0 M pH 5,5) e o material foi filtrado e mantido no gelo por 30 min após adição de tampão para remoção de endotoxinas (Qiagen, USA). O filtrado foi aplicado em uma coluna de troca iônica (Qiagen, USA) previamente equilibrada com tampão QBT (NaCl a 750 mM; MOPS a 50 mM pH 7,0; etanol 15% e Triton X-100 0,15%). Após a aplicação do filtrado, a resina foi lavada com 600 mL de tampão QC (NaCl a 1 M; MOPS a 50 mM pH 7,0; etanol 15%) e o DNA plasmideal foi eluído com 30 mL de tampão QN (NaCl a 1,25 M; MOPS a 50 mM pH 7,0; etanol 15%). O DNA eluído foi precipitado com isopropanol e centrifugado a 28600 g por 45 min a 4°C. Finalmente o sedimento foi ressuspenso em cerca de 1 mL de água estéril livre de endotoxinas (Qiagen, USA). 3.8- Quantificação e avaliação da integridade dos plasmídeos purificados Após a purificação dos diferentes plasmídeos correspondentes a cada uma das construções, foi realizada a quantificação e a avaliação da integridade dos produtos purificados. A quantificação dos plasmídeos se fez por espectrofotometria nos comprimentos de onda de 260 a 280 nm utilizando-se o aparelho GeneQuant IITM (Amershan-Pharmacia, BioSciences, USA). A caracterização dos plasmídeos pVAX1 (Invitrogen, USA) e DNA-Hsp65 foram feitas utilizando-se a enzima de restrição BamHI (Invitrogen, USA), enquanto que a caracterização dos plasmídeos DNA-Ag85A e DNA-Ag85A/Hsp65 foram realizadas com a enzima PmeI (Fermentas, Canada). Aproximadamente 1 µg dos plasmídeos foram incubados a 37°C por 16 h com as respectivas enzimas (1 U/µg) e seus tampões. Em seguida, os produtos da digestão de cada amostra, bem como os plasmídeos não digeridos, foram submetidos a eletroforese em gel de agarose 1%. As amostras foram 35 ___________________________________________________________ Material e Métodos ressuspensas em tampão de eletroforese 1 X (0,25% azul de bromofenol; 40% de sacarose em água) e o material submetido a eletroforese em tampão TAE (Tris-acetato a 40 mM; EDTA a 1 mM pH 8,3). O padrão 1Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA) foi utilizado como marcador de peso molecular; o gel foi corado com 0,5 mg/mL de brometo de etídio (GibcoBRL, USA) e a visualização das bandas foi feita em luz ultravioleta no aparelho Image Master VDS (Pharmacia Biotech, USA). Todas os DNAs purificados foram certificados quanto a presença de endotoxinas (LPS) pelo teste de LAL (Limulus Amebocyte Lysate) (Kit QCL-1000 – Quantitative Cromogenie – Bio Whittaker – CAMBREX Company), conforme descrito adiante. 3.9- Obtenção das proteínas recombinantes: rHsp65 e rAg85A Bactérias E. coli ER2566 transformadas com o plasmídeo pET28a (Novagen, UK) contendo o gene hsp65 foram cultivadas em 2,5 L de meio LB líquido (Gibco-BRL, USA) contendo canamicina na concentração de 100 µg/mL e 300 mM do indutor IPTG (Isopropylthio- -D-Galactoside, Gibco BRL) a 37°C sob agitação a 250 rpm por 18 h. Após incubação, as células foram coletadas por centrifugação a 5000 g por 15 min em centrífuga J2HS (Beckman, rotor JS-7.5), ressuspensas em 20 mL de tampão fosfato e lisadas em homogeneizador. Após centrifugação a 20600 g por 20 min, o sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspenso em 30 mL de tampão fosfato contendo Uréia a 5 M e agitado por 1 h. A suspensão foi então centrifugada a 20600 g por mais 20 min e o sobrenadante coletado e submetido à cromatografia de afinidade utilizando-se a coluna HiTrap Chelating HP (Amersham Pharmacia, USA), conforme o protocolo especificado pelo fornecedor. A amostra de proteína foi eluida da coluna por concentrações crescentes de imidazol. Após eluição a proteína foi dializada contra PBS 1X durante 16 h a 4°C. 36 ___________________________________________________________ Material e Métodos Para a quantificação da proteína Hsp65 recombinante utilizou-se Coomassie® Protein Assay Reagent (Pierce, USA) e para a quantificação de endotoxinas o teste de LAL. A proteína recombinante rAg85A de Mycobacterium tuberculosis, foi adquirida da empresa Lionex (Germany, Braunschweig) e também foi certificada quanto a presença de endotoxinas pelo teste de LAL. 3.10- Quantificação do nível de endotoxinas A determinação da presença de endotoxinas bacterianas nas vacinas gênicas, bem como nas proteínas purificadas, foi realizada através do teste cromogênico do lisado de amebócito de Limulus polyphemus (LAL), que é um teste quantitativo para avaliação de endotoxinas de bactérias gram-negativas utilizando o “QCL-100 LAL kit” (Cambrex). Primeiramente, a endotoxina foi reconstituída através da adição de 1 mL de água fornecida pelo próprio kit seguido de agitação vigorosa e homogeneização em vórtex por 15 min. Utilizando-se uma seringa de 10 mL, foi reconstituído o substrato cromogênico com a adição de 6,5 mL de água do kit. O frasco foi protegido da luz e posteriormente incubado em placa de 96 poços, a 37ºC até o momento do uso. A seguir, o LAL foi reconstituído pela adição de 1,4 mL de água com auxílio de uma seringa. Uma vez com os reagentes reconstituídos, retirou-se a placa da estufa e preparou-se a curva padrão através de diluições sucessivas da endotoxina partindo de uma concentração 1 Unidade de Endotoxina por mL (UE/mL) até 0,1 UE/mL. Posteriormente as amostras foram depositadas na placa, adicionados 50 µL do LAL e incubada a 37ºC por 10 min. Com auxílio de uma micropipeta, foram depositados 100 L do substrato cromogênico em todos os poços (amostras e curva), seguidos de homogeneização e incubação a 37ºC por 6 min. Posteriormente foram acrescentados 100 L de uma solução de ácido acético 25% para interrupção da reação. Finalmente foi feita a determinação das densidades ópticas (D.O.) em 37 ___________________________________________________________ Material e Métodos espectrofotômetro a 405 nm. Os resultados foram determinados correlacionando a curva padrão com a diluição das amostras, levando em consideração a absorbância e a concentração de endotoxina para esse ponto de cada uma das amostras, em relação à curva padrão. A fórmula aplicada para calcular a quantidade de LPS por micrograma de DNA foi: UE/mL X diluição UE/µg DNA = ________________________ amostra µg/mL Consideraram-se amostras livres de endotoxina, aquelas que apresentaram valores menores a 0,1 UE/µg DNA, de acordo com a farmacopéia americana e européia. 3.11- Grupos experimentais e Imunizações Os grupos experimentais foram constituidos de camundongos inoculados com as seguintes preparações: • Solução Salina (controle) • pVAX1 (vetor vazio, controle) • DNA-Hsp65 (pVAX-Hsp65) • DNA-Ag85A (pVAX-Ag85A) • DNA-Ag85A/Hsp65 (pVAX-Ag85A/Hsp65, vacina múltipla) • DNA-Ag85A+Hsp65 (pVAX-Ag85A e pVAX-Hsp65) • BCG (controle de padrão positivo) Os animais receberam 4 doses de 100 µg de DNA plasmideal purificado administrado em solução salina (NaCl a 0,9%, Equiplex) contendo 25% de sacarose por injeção intramuscular, em um volume total de 100 µL/dose, sendo administrado 50 µL em cada músculo quadríceps, direito e esquerdo, seguindo procedimentos de anti-sepsia. As injeções foram aplicadas com intervalos quinzenais, totalizando 400 µg de DNA. As preparações utilizadas para a imunização do grupo DNA-Ag85A+Hsp65, foram feitas utilizando 50 µg de 38 ___________________________________________________________ Material e Métodos cada DNA plasmideal (DNA-Ag85A e DNA-Hsp65) também administrado em solução salina contendo 25% de sacarose. As imunizações com BCG foram feitas em uma única dose com a inoculação de 105 bacilos da cepa Morreau (gentilmente cedido pelo Departamento de Vacinas do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto) por via subcutânea, 30 dias antes do desafio com Mtb. Como grupo controle os animais foram injetados com vetor pVAX1 ou com salina. Quinze dias após a última imunização, os animais foram sacrificados para coleta dos baços e realização dos ensaios de imunogenicidade ou então 30 dias após a última imunização os animais foram desafiados com 105 bacilos Mycobacterium tuberculosis da cepa H37Rv (ATCC 27294) por via intratraqueal e sacrificados 30 dias após o desafio para coleta dos pulmões e avaliação da proteção conferida contra a doença. 3.12– Obtenção do lisado de M. tuberculosis (Mtb) Para a preparação do lisado de Mtb, foi utilizada uma alíquota de M. tuberculosis da cepa H37RV (ATCC 27294) congelada a –70ºC (com viabilidade superior a 85%). Cerca de 200 µl dessa alíquota foram distribuídos em 10 mL de meio Middlebrook 7H9 (Difco Laboratories, USA) enriquecido com Middlebrook ADCTM (BD Biosciences, USA), e incubado por 7 dias a 37ºC. A suspensão de micobactérias obtida foi centrifugada a 2465 g por 20 min e o sedimento ressuspenso em 1 mL de PBS estéril e agitado vigorosamente por 2 a 3 min em tubo contendo pérolas de vidro, até adquirir aspecto homogêneo. Após serem homogeneizadas, as micobactérias foram mortas a 80ºC por 2 h, lisadas em homogeneizador de alta pressão, com aproximadamente 3 pulsos de 15 min cada, e filtradas em filtro 0,22 µm (Corning, USA). A quantificação e certificação quanto a presença de endotoxinas foram realizadas como descrito para a proteína rHsp65 (item 3.9). 39 ___________________________________________________________ Material e Métodos 3.13– Processamento do baço para cultura de células Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e o baço foi coletado em 2 mL de meio RPMI-1640 incompleto (Sigma, Germany) e mantido em gelo. Em câmara de fluxo laminar os baços foram divulssionados para a obtenção das células que foram contadas em câmara de Neubauer e diluídas em meio RPMI (Sigma, Germany) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (Gibco BRL, USA), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (10 mg/mL), gentamicina (100 µg/mL), L-glutamina (200mM) (Gibco BRL, USA) e 2Mercaptoetanol (5.10-5M) (Sigma, Germany) para uma concentração final de 5x106 células/mL. 3.14-Cultura de células para dosagens de citocinas Para dosagens de citocinas, 1 mL da suspensão celular obtida no item anterior foi distribuída em placas de 24 poços (Costar) para posterior estímulo in vitro com meio (RPMI), rHsp65 (20 µg/mL), rAg85A (20 µg/mL), lisado de Mtb (10 µg/mL) ou mitógeno concanavalina A (conA) (40 µg/mL). Após 48 horas de cultura, os sobrenadantes foram coletados e armazenados a – 20ºC para posterior dosagem de citocinas por ELISA. 3.15- Cultura de células para linfoproliferação Para o desenvolvimento do protocolo de linfoproliferação, 100 µL/poço da suspensão celular (5 x 105 células) obtida no item 3.13 foram distribuídas em placas de 96 poços (Costar) para posterior estímulo in vitro com meio (RPMI), rHsp65 (2 µg/mL), rAg85A (2 µg/mL) ou conA (4 µg/mL). A cultura de células foi pulsada com 50 µL por poço partindo de uma solução a 10 µCi/mL de timidina [3H] em RPMI-completo 16 h antes de completar o tempo total de incubação de 72 h, a 37oC em estufa a 5% CO2. 40 ___________________________________________________________ Material e Métodos 3.16- Ensaio Imunoenzimático ELISA para dosagem de anticorpos A resposta imune humoral foi avaliada através da produção de anticorpos específicos anti-Hsp65 e anti-Ag85A dos subtipos IgG1 e IgG2a, por ELISA nas amostras de soro préimunes e soros coletados através do plexo-retro orbital, duas semanas após a última imunização. Placas de 96 poços de poliestireno (Maxisorp Nunc-Immuno Plates, USA) foram sensibilizadas com 100 µL/poço da solução de proteína rHsp65 ou rAg85A diluídas em tampão de ligação (Na2HPO4 a 0,1M, pH 9,0) em uma concentração final de 5 µg/mL. As placas foram incubadas a 4ºC por 16 h e posteriormente lavadas com PBS 1X contendo 0,05% de Tween 20 e bloqueadas com 200 µL/poço de uma solução de gelatina 1% (Synth – Lote: 58681) com 0,05% de Tween 20. Após incubação por 1 h, a 37ºC, as placas foram novamente lavadas e adicionou-se 100 µL/poço dos soros, diluídos 1:10, 1:100, 1:500 e 1:1000, em solução de gelatina/Tween 20 (0,05%). As placas foram incubadas por 2 h a 37ºC, e após lavagem das mesmas, foi realizada incubação por 1 h, a 37ºC, com anticorpo monoclonal anti-IgG1 ou anti-IgG2a conjugados com biotina (PharMingen, USA), adicionando-se 100 µL/poço do anticorpo diluído em solução de gelatina/Tween 20 (0,05%) em uma concentração final de 0,5 µg/mL. Após procedimento de lavagem, foi adicionada 100 µL/poço da solução de avidina biotina peroxidase StrepAB kitTM (Dako, USA) sendo incubada por 30 min a temperatura ambiente. As placas foram reveladas pela adição da solução de OPD (Sigma, Germany) e a reação foi interrompida pela adição de 50 µL/poço de ácido sulfúrico 16%. A leitura da absorbância foi realizada em espectrofotômetro de placa (µQuant Bio-Tek Instruments Inc.) a 490 nm. Todos os anticorpos utilizados foram adquiridos da PharMingen e utilizados de acordo com as instruções do fabricante. 3.17- Ensaio Imunoenzimático ELISA para dosagem de citocinas 41 ___________________________________________________________ Material e Métodos A produção de citocinas em sobrenadante de cultura foi avaliada quanto à produção de IFN-γ, IL-12 e IL-10 por ELISA. Placas de 96 poços de poliestireno (Maxisorp NuncImmuno Plates, USA) foram sensibilizadas com 100 µL da solução de anticorpo monoclonal purificado específico para a citocina de interesse (PharMingen, USA - citados na tabela abaixo), diluídos em tampão de ligação (Na2HPO4 a 0,1 M, pH 9,0) em uma concentração final de 1 µg/mL. As placas foram incubadas a 4ºC por 16 h. Após sucessivas lavagens com solução PBS 1X contendo 0,05% de Tween 20 (Vetec), as placas foram incubadas com 200 µL/poço da solução de bloqueio, constituída de PBS 1X contendo 10% de soro bovino fetal – SBF (Gibco BRL, USA) durante 1 h, a temperatura ambiente. As placas foram novamente lavadas e as amostras foram adicionadas, 100 µL/poço juntamente com a curva padrão da citocina recombinante, diluída em PBS/SBF 10%/Tween 20 a 0,05%, e incubadas por 16 h a 4°C. Após lavagem, foi feita incubação por 1 h, a temperatura ambiente, com anticorpo monoclonal conjugado com biotina específico para a citocina de interesse (PharMingen, USA), adicionando-se 100 µL/poço do anticorpo diluído em PBS/SBF 10%/Tween 20 a 0,05% em uma concentração final de 0,5 µg/mL. Após lavagem, adicionou-se 100 µL/poço de solução de avidina biotina peroxidase StrepAB kitTM (Dako, USA) sendo incubada por 30 min a temperatura ambiente. As placas foram reveladas pela adição da solução de OPD (Sigma, Germany) após novo procedimento de lavagem. A reação foi interrompida pela adição de 50 µL/poço de ácido sulfúrico 16% (Merck). A leitura da absorbância foi realizada em espectrofotômetro de placa (mQuant Bio-Tek Instruments Inc.) a 490 nm. A determinação das concentrações das citocinas foi feita por interpolação dos resultados de absorbância obtidos nas amostras em relação aos da curva padrão. Todos os anticorpos e citocinas recombinantes foram adquiridos da PharMingen e utilizados de acordo com as instruções do fabricante. 42 ___________________________________________________________ Material e Métodos IFN-γ IL-12/p70 IL-10 Anticorpo Purificado Anticorpo Biotinilado Clone: R4-6A2 Clone: XGM1.2 Isotipo: IgG1 de rato Isotipo: IgG1 de rato Clone: 9A5 Clone: C17.8 Isotipo: IgG2b de rato Isotipo: IgG2a de rato Clone: JES5-2A5 Clone: SXC-1 Isotipo: IgG1 de rato Isotipo: IgM de rato 3.18- Preparo do inóculo de M. tuberculosis A suspensão de M. tuberculosis, linhagem H37Rv (ATCC 27294) foi obtida a partir de uma alíquota congelada a -70º C, na qual foi observada viabilidade superior a 85%. O volume total da alíquota (1 mL) foi semeado em 2,5 mL de meio Middlebrook 7H9 (Difco, USA). A cultura foi incubada por 7 dias, a 37º C. Após este período, a cultura foi centrifugada a 2465 g por 20 min, o sedimento foi ressuspenso em 1 mL de solução salina estéril e em seguida transferido para tubo contendo pérolas de vidro. Essa suspensão foi agitada em vórtex (Ika Works Inc., USA) por 2 a 3 min até adquirir aspecto homogêneo. Adicionou-se salina estéril a esta suspensão até que a mesma atingisse a turbidez equivalente à Escala de Mc Farland no 1, o que equivale a uma concentração de 1x107 bacilos/mL (Atlas, 1993). Para o preparo do inóculo de infecção, diluiu-se a suspensão com turbidez equivalente à escala numa proporção de dez vezes, obtendo-se assim uma suspensão com a concentração de 1x106 bacilos/mL. A viabilidade da cultura foi verificada, de acordo com a metodologia descrita por McDonough & Kress (1995), incubando-se por 10 min a 37ºC cerca de 100 µL desta suspensão de bactérias com 100 µL de diacetato de fluoresceína a 2 µg/mL (Acros Organics, USA) e 100 µL de brometo de etídio a 10 µg/mL (Sigma, Germany) (McDonough et al., 1993). A seguir, a suspensão de micobactérias foi observada em microscópio de fluorescência modelo Aristoplan (Leitz Wetzlar, Germany). As bactérias viáveis apresentam coloração verde 43 ___________________________________________________________ Material e Métodos enquanto as bactérias mortas coram-se com a solução de brometo, apresentando-se com uma coloração avermelhada. Outros controles realizados foram: coloração de Ziehl-Neelsen; contagem de bacilos presentes por mililitro de inóculo por meio da semeadura de várias diluições do mesmo, em meio 7H11 e a semeadura da cultura original em ágar-sangue. Todos os procedimentos de cultura da micobactéria, preparo do inóculo e desafio dos animais foram realizados em laboratório de biossegurança nível III. 3.19- Desafio dos animais com M. tuberculosis Cada animal foi desafiado com 100 µL da suspensão contendo 1x105 bacilos de M. tuberculosis H37Rv por via intratraqueal, 30 dias após a última imunização. Para esse procedimento, os animais foram previamente anestesiados com uma solução de tribromoetanol (Acros Organics, USA) a 2,5% em solução salina, por via intraperitoneal. Após a anestesia, realizou-se o procedimento cirúrgico para exposição da traquéia e inoculação da bactéria. Como controle experimental, foi acrescentado um grupo que recebeu solução salina por via intratraqueal ao invéz do desafio com a bactéria. 3.20- Avaliação do pulmão dos animais desafiados Trinta dias após o desafio, os animais foram sacrificados e os pulmões coletados e colocados em placas de Petri estéreis contendo 2 mL de meio RPMI-1640 Incompleto (Gibco BRL, USA). Os pulmões foram pesados e tiveram seus lóbulos separados para os diversos procedimentos experimentais: o lóbulo superior direito foi colocado em um tubo contendo 10 mL de formol tamponado para posterior processamento e análise histológica; os lóbulos superior e inferior esquerdos foram coletados em tubos contendo 2 mL de meio RPMI-1640 incompleto e armazenados a –20ºC para posterior detecção de citocinas; os lóbulos médio e inferior direitos foram coletados em placas de petri de 22 mm de diâmetro (Corning) para 44 ___________________________________________________________ Material e Métodos obtenção de células para análise de citometria de fluxo (FACs) e determinação do número de unidades formadoras de colônias (UFC). 3.21- Coleta, digestão e obtenção de células do pulmão Os lóbulos destinados aos ensaios de UFC e citometria de fluxo, foram pesados, cortados em pequenos fragmentos e transferidos para um tubo de fundo cônico (Falcon) de 50 mL contendo 15 mL da solução de digestão estéril. Essa solução foi preparada em meio de cultura RPMI-1640 incompleto contendo 0,5 µg/mL de Liberase (Liberase Blendzymez – Roche, IN) e 25 U/mL de Desoxiribonuclease I (Gibco BRL, USA). Após a adição da solução de digestão, os tubos foram incubados a 37ºC, sob agitação constante, durante 30 min. Após a digestão, as células foram dispersas com auxílio de uma seringa de 10 mL e centrifugadas a 1050 g por 10 min, a 4ºC. O sedimento foi ressuspenso em 1 mL de RPMI-1640 incompleto. Uma alíquota de 100 µL dessa suspensão foi retirada para o protocolo de UFC e o restante foi novamente centrifugado e o sedimento ressuspenso em 5 mL de meio RPMI-1640 contendo 10% de SBF para inibir a atividade da enzima liberase. As células presentes foram separadas do restante da matriz digerida utilizando-se organza estéril, seguida de lavagem da malha com mais 10 mL de meio RPMI-1640 completo. As células obtidas foram centrifugadas a 1050 g, por 10 min, a 4ºC, ressuspensas em 1 mL de meio RPMI-1640 completo e contadas em câmara de Neubauer. A concentração final foi acertada para 1x107 células/mL. Essas células foram utilizadas para avaliação da expressão de marcadores de superfície por citometria de fluxo. 3.22- Ensaio imunoenzimático ELISA para dosagem de citocinas no homogenato de pulmão 45 ___________________________________________________________ Material e Métodos Para a determinação das citocinas produzidas no pulmão após o desafio com Mtb, o órgão foi extraído, pesado, triturado e, após centrifugação e coleta do sobrenadante, esse foi empregado nos ensaios de ELISA. Foram avaliadas a produção de IFN-γ, IL-12, IL-10 e IL-4. O protocolo do ensaio de ELISA foi realizado como descrito no item 3.17, com a utilização dos mesmos clones dos anticorpos monoclonais purificados e biotinilados antiIL12/p40, anti-IL10, anti-IFN-γ. Os clones utilizados para IL-4 foram: anticorpo purificado clone: 11B11 e anticorpo biotinilado clone: BVD6-24G2. 3.23- Marcação das células para citometria de fluxo As populações de células do pulmão de animais imunizados e desafiados foram caracterizadas pela expressão de marcadores de superfície utilizando anticorpos monoclonais específicos conjugados a fluorocromos. As células obtidas após a digestão do pulmão foram distribuídas em tubos de poliestireno, 1x106 células em 100µL por tubo, e incubadas durante 30 min, a 4ºC, com anticorpo anti-CD16/CD32 (Fc BlockTM- PharMingen), na concentração de 0,5 µg/106 células. Esta incubação visa minimizar as ligações inespecíficas. Posteriormente, essas células foram incubadas com os respectivos anticorpos monoclonais de interesse, de acordo com a tabela abaixo (0,5 – 0,75 µg de anticorpo/1x106 células) durante 30 min, a 4ºC, no escuro. Após o tempo de incubação as células foram lavadas com 2 mL de PBS 1X contendo 2% de SBF, centrifugadas a 1050 g, por 10 min a 4ºC e ressuspensas em 300 µL de PBS 1X contendo 1% de formol (Nuclear) para a fixação das células. As preparações celulares foram adquiridas no aparelho FACSortTM (Becton & Dickinson, USA). Foram adquiridas 10.000 células por tubo, analisadas através do programa Cell Quest, de acordo com parâmetros de tamanho (FSC), granularidade (SSC) e intensidade de fluorescência dos anticorpos marcados com ficoeritrina (PE), isotiocianato de fluoresceína (FITC) e CyChrome (Cy). 46 ___________________________________________________________ Material e Métodos Inicialmente, foi determinada a população de linfócitos, baseada nos parâmetros FSC e SSC, para detecção das porcentagens de linfócitos T (CD4+ e CD8+) e linfócitos B (CD19+). A expressão de CD44hi e CD62Llo foi analisada nas populações de linfócitos CD4+ ou CD8+. Todos os anticorpos foram adquiridos da PharMingen e utilizados de acordo com as instruções do fabricante. Tubo Marcação FITC 1 PE CY Isotipo controle IgG2a de Isotipo controle IgG2a de Isotipo controle IgG2b de rato rato rato 2 CD4 CD8 3 CD62L CD44 CD4 4 CD62L CD44 CD8 5 CD3 CD19 3.24- Ensaio Imunoenzimático ELISA para dosagem de anticorpos A dosagem de anticorpos no soro dos animais imunizados e desafiados foi realizada como descrito no item 3.16. 3.25- Determinação do número de unidades formadoras de colônia (UFC) A partir da alíquota de 100 µL do pulmão digerido (item 3.21), foram feitas diluições em PBS 1X de 10, 100, 1000 e 10000 vezes. As diluições (100 µL) foram semeadas em meio sólido 7H11 (meio 7H9 acrescido de ágar bacteriológico (Difco, USA)). Foram adicionados 100 µL de cada diluição sobre as placas, as quais foram vedadas e incubadas a 37ºC por 30 dias. Após o período de incubação, as colônias de micobactérias foram contadas com auxílio de lupa (Leica Microsystems). O número de colônias foi corrigido de acordo com as diluições e o peso dos pulmões e expresso em Log10 do número de UFC por grama de pulmão. 47 ___________________________________________________________ Material e Métodos 3.26– Análise histológica Para a análise histológica do pulmão dos animais desafiados, imunizados ou não, o lóbulo superior direito do pulmão de cada animal foi coletado e fixado em formol tamponado com fosfato. Posteriormente o material foi processado pela técnica Elaine Medeiros Floriano, no laboratório coordenado pela Drª. Simone Gusmão Ramos, no Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. Foram realizados os cortes histológicos (5 µm) e as lâminas obtidas foram coradas com Hematoxilina e Eosina (HE). Também foi realizada uma coloração por Ziehl-Neelsen (ZN), específica para Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR) para a detecção de M. tuberculosis. As lâminas foram analisadas por microscopia óptica em conjunto com a patologista Drª. Simone Gusmão Ramos. 3.27- Análise estatística Para realização da análise estatística, utilizou-se o programa Prism 4.0, e foi empregado o teste t de Student não-pareado para comparar os dados entre os diferentes grupos experimentais. Foram considerados significativos os resultados cujas diferenças apresentaram p<0,05. 3.28- Delineamento experimental Os seguintes delineamentos experimentais foram utilizados no decorrer desse trabalho: 48 ___________________________________________________________ Material e Métodos • Construção da vacina de DNA múltipla PCR Ag85A Plasmídeo contendo Ag85A Clivagem com enzimas de restrição Ag85A Clonagem Ag85A pVAX-Hsp65 linearizado Hsp65 Ag85A Imunização Vacina múltipla • Ensaios de imunogenicidade Primeira Imunização Dias 0 Coleta do soro préimune Segunda imunização 15 Terceira imunização 30 Quarta imunização 45 Sacrifício dos animais e coleta do baço 60 - Linfoproliferação - ELISA (citocinas e anticorpos) Coleta do soro pósimune 49 ___________________________________________________________ Material e Métodos • Ensaios de proteção Primeira imunização Dias 0 Coleta do soro préimune Segunda imunização 15 Terceira imunização 30 Quarta imunização 45 Imunização do grupo BCG Desafio com Mtb 75 Sacrifício dos animais e coleta dos pulmões 105 - ELISA (citocinas e anticorpos) - FACs - UFC - Histologia Coleta do soro após desafio 50 51 __________________________________________________________________Resultados 4 RESULTADOS 4.1- Primeira estratégia de construção da vacina múltipla Para a obtenção do gene Ag85A do plasmídeo pV1ns-tPA foi realizado um PCR em gradiente, com temperaturas de anelamento variando entre 57 a 66°C. Essas temperaturas foram escolhidas de acordo com as temperaturas de melting (TM) especificadas pelos primers. O produto de amplificação do gene Ag85A observado em gel de agarose revelou uma banda única de aproximadamente 0,9 Kb correspondente ao tamanho esperado do gene. Esse produto de PCR amplificou em uma TM entre 57°C e 58,8°C (Figura 1). Para avaliar a integridade dos vetores pVAX1 e pVAX-Hsp65 para a posterior clonagem do gene Ag85A, foram realizadas digestões enzimáticas e análises eletroforéticas para checagem do mapa de restrição desses vetores. A reação de clivagem do plasmídeo pVAX1 mostrou uma banda de 3,0 Kb, correspondente ao tamanho esperado. Já a digestão do plasmídeo pVAX-Hsp65 revelou a presença de uma banda de aproximadamente 6,0 Kb. Esse tamanho era o esperado, uma vez que o gene para a Hsp65 clonado no vetor pVAX1 possui 3,0 Kb e o vetor vazio, 3,0 Kb. Já o plasmídeo não digerido apresentou um padrão de bandas típico de plasmídeos não linearizados, onde se observa duas bandas, que correspondem às formas mais espiraladas e menos espiraladas do vetor (Figura 2). 52 __________________________________________________________________Resultados L 1 2 3 4 5 1,0 Kb 6 7 8 N 0,9 Kb Figura 1- Resultado da reação de amplificação do gene Ag85A, avaliado por gradiente de temperatura em PCR. As amostras foram submetidas a eletroforese em gel de agarose 1%, e as bandas visualizadas por coloração com brometo de etídio. A pista L constitui o marcador de peso molecular em kilobase – 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA); As pistas 1 a 8 correspondem ao produto de amplificação do plasmídeo pV1Jns-tPA, utilizado como molde para amplificação do gene Ag85A em diferentes TMs (57; 57,3; 58; 58,8; 60,1; 61,8; 63,6; 65,5; 66°C), N: controle negativo. Kb: kilobases. O número circulado destaca a amostra escolhida para posterior purificação. 53 __________________________________________________________________Resultados L 1 2 3 4 6,0 Kb 3,0 Kb Figura 2- Resultado da clivagem do plasmídeo pVAX-Hsp65. As amostas foram submetidas a eletroforese em gel de agarose 1%, sendo as bandas reveladas pela coloração com brometo de etídio. A pista L: corresponde ao padrão de peso molecular, 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA); a pista 1, indica o vetor pVAX1 (vazio) não digerido; a 2, o vetor pVAX1 (vazio) linearizado com AflII, com o tamanho de 3,0 Kb, a pista 3, mostra o plasmídeo pVAX-Hsp65 não digerido e a pista 4, pVAX-Hsp65 linearizado com AflII, com o tamanho de 6,0 Kb. 54 __________________________________________________________________Resultados 4.2- Identificação dos clones recombinantes Uma das caracterizações realizadas para a identificação dos clones recombinantes foi através de PCR de colônia, utilizando-se oligonucleotídeos específicos para o gene de interesse. A análise das colônias recombinantes resultantes da ligação do gene Ag85A ao vetor pVAX1 (Invitrogen, USA) revelou a presença de três clones positivos (Figura 3A), enquanto que a análise da ligação do gene Ag85A no plasmídeo pVAX-Hsp65 revelou somente um clone positivo (Figura 3B). Todas as bandas apresentaram um tamanho aproximado de 0,9 Kb, coincidente com o tamanho do gene Ag85A. A confirmação dos quatro clones recombinantes obtidos foi realizada por meio de sequênciamento desses plasmídeos. Dos três clones pVAX-Ag85A positivos, somente um possuía o gene Ag85A inserido de forma correta. Em relação ao clone pVAX-Ag85A/Hsp65, o sequenciamento revelou a inserção correta do inserto porém, ao se analisar a seqüência completa do gene Ag85A e a junção com o gene hsp65, foi verificado que a proteína de fusão havia saído de sua fase aberta de leitura. Diante disso, foi decidido descartar todos os clones obtidos e foi elaborada uma nova estratégia para a construção das vacinas DNA-Ag85A e DNA-Ag85A/Hsp65. 55 __________________________________________________________________Resultados L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 N A 1,0 Kb 0,9 Kb L 1 2 3 4 5 6 7 N B 1,0 Kb 0,9 Kb Figura 3- Resultado do PCR de colônia. Eletroforese em gel de agarose 1%. Em A: análise da reação de ligação do gene Ag85A com o vetor pVAX1, L: padrão de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA); pistas: 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9 e 11 plasmídeos não recombinantes; pistas: 5, 6 e 10, plasmídeos pVAX-Ag85A recombinantes, N: controle negativo. Em B: análise da reação de ligação do gene Ag85A com o plasmídeo pVAX-Hsp65, L: padrão de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA); pistas: 1, 2, 3, 4, 5 e 7, plasmídeos não recombinantes; pista: 6 plasmídeo pVAXAg85A/Hsp65 recombinante; N: controle negativo. 56 __________________________________________________________________Resultados 4.3- Nova estratégia de construção da vacina múltipla Os produtos da nova reação de amplificação do gene Ag85A, observados por eletroforese em gel de agarose 1% revelaram uma banda de aproximadamente 0,9 Kb correspondente ao gene Ag85A. A reação de PCR foi realizada com um gradiente de temperatura de anelamento variando entre 53 a 60°C. Em todas as temperaturas ocorreu amplificação, porém, nas TMs mais baixas as bandas foram mais evidentes (Figura 4). A análise da clivagem do plasmídeo pVAX-Hsp65 revelou uma banda de 6,0 Kb (como o esperado), e a clivagem do vetor pVAX1 ‘vazio’, sem o gene hsp65, mostrou uma banda de 3,0 Kb (Figura 5). 57 __________________________________________________________________Resultados L 1 2 3 4 5 6 7 N 1,0 Kb 0,9 Kb Figura 4- Resultado da nova reação de amplificação do gene Ag85A, avaliado por gradiente em PCR. Após a realização do PCR, as amostras foram separadas por eletroforese em gel de agarose 1%, utilizando brometo etídio para visualização das bandas. L: marcador de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA); pistas: 1 a 7, pV1J.ns-tPA utilizado como molde para amplificação do gene Ag85A em diferentes TMs (53-60°C); N: controle negativo. O círculo destaca a amostra escolhida para purificação. 58 __________________________________________________________________Resultados L 1 2 3 4 6,0 Kb 3,0 Kb Figura 5- Resultado das clivagens dos plasmídeos pVAX1 e pVAX-Hsp65 digeridos com BamHI e HindIII. As amostas foram submetidas a gel de agarose 1%, sendo as bandas reveladas pela coloração com brometo de etídio. L: padrão de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA); pista 1: vetor pVAX1 não digerido; pista 2: vetor pVAX1 digerido; pista 3: pVAX-Hsp65 não digerido e pista 4: pVAX-Hsp65 digerido. 59 __________________________________________________________________Resultados 4.4- Identificação dos novos clones recombinantes A análise da reação de PCR por eletroforese em gel de agarose 1% revelou a presença de um único clone pVAX-Ag85A positivo (Figura 6A) e quatro possíveis clones pVAXAg85A/Hsp65 (Figura 6B). Em todos ocorreu a amplificação de uma banda de tamanho aproximado de 0,9 Kb, equivalente ao tamanho do gene Ag85A. O gene Ag85A e o cassete Ag85A-Hsp65, possui um sítio para a enzima PmeI flanqueando as suas extremidades (Figura 7A), o que possibilitou a realização de uma análise de restrição, para confirmar a presença dos insertos dentro dos vetores. A clivagem do plasmídeo pVAX-Ag85A revelou a presença de uma banda de 1,0 Kb, correspondente ao gene Ag85A e uma segunda banda de 3,0 Kb correspondente ao vetor pVAX1 (canaleta 5). Já a digestão do plasmídeo pVAX-Ag85A/Hsp65 resultou no aparecimento de uma banda com tamanho aproximado de 4,0 Kb e outra de 3,0 Kb (canaletas 1, 2, 3 e 4), a primeira correspondendo a fusão dos genes Ag85A (1,0 Kb) e hsp65 (3,0 Kb), e a segunda, correspondente ao vetor pVAX1 (3,0 Kb) na ausência dos genes (Figura 7B). A caracterização final foi realizada através do sequênciamento dos plasmídeos. A análise das seqüências mostrou que um dos clones pVAX-Ag85A/Hsp65 (clone 1), apesar de possuir o gene Ag85A, este havia se inserido na posição contrária, fato considerado normal, uma vez que tanto o inserto quanto o vetor possuíam extremidades abruptas, podendo, portanto ser clonado ou na posição 5´→ 3´ ou na 3´→ 5´. Esse clone foi então eliminado. Os três clones recombinantes restantes mostraram estar inseridos na direção correta de acordo com o software Multalin (www.prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html) e o alinhamento com o banco de dados do NCBI mostrou uma similaridade acima de 93% desses plasmídeos com o gene Ag85A. 60 __________________________________________________________________Resultados L 1 2 3 4 5 6 7 8 A 1,0 Kb B 0,9 Kb L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 N 1,0 Kb Figura 6- Resultado da reação de PCR de colônia. As amostas foram submetidas a gel de agarose 1%, sendo as bandas reveladas pela coloração com brometo de etídio. Em A: perfil plasmideal dos clones recombinantes provenientes da reação de ligação do gene Ag85A com o vetor pVAX1, L: padrão de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA); pistas: 1 – 7, plasmídeos não recombinantes; pista: 8 plasmídeo pVAX-Ag85A recombinante. Em B: perfil plasmideal dos clones recombinantes provenientes da reação de ligação do gene Ag85A com o plasmídeo pVAX-Hsp65, L: padrão de peso molecular 1Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA); pistas: 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, e 11, plasmídeos não recombinantes; pistas: 1, 5, 6 e 12 plasmídeos pVAX-Ag85A/Hsp65 recombinantes; N: controle negativo. 61 __________________________________________________________________Resultados A 5´ PmeI PmeI Ag85A A 1,0 Kb L Hsp65 3´ 3,0 Kb 1 2 3 4 5 B 4,0 Kb 3,0 Kb 1,0 Kb Figura 7- Análise de restrição dos plasmídeos recombinantes. As amostas foram submetidas a gel de agarose 1%, sendo as bandas reveladas pela coloração com brometo de etídio. Em A, esquema do cassete Ag85A+Hsp65 flanqueado pela enzima PmeI. Em B, perfil eletroforético dos plasmídeos recombinantes após digestão com a enzima PmeI. L: padrão de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA); pista 1: pVAX-Ag85A/Hsp65 (clone 1) digerido; pista 2: pVAX-Ag85A/Hsp65 (clone 5) digerido; pista 3: pVAXAg85A/Hsp65 (clone 6) digerido; pista 4: pVAX-Ag85A/Hsp65 (clone 12) digerido; pista 5: pVAX-Ag85A digerido. 62 __________________________________________________________________Resultados 4.5- Detecção do mRNA do gene Ag85A em macrófagos de linhagem J774 Após a análise das seqüências dos três clones recombinantes pVAX-Ag85A/Hsp65 obtidos não apontarem nenhuma diferença entre eles, optamos pela realização de um ensaio de RT-PCR para verificar qual deles produziria a mensagem para a proteína Ag85A para que dessa forma, pudesse ser escolhido o clone da vacina múltipla a ser utilizado nos ensaios posteriores. Macrófagos de linhagem J774 foram transfectados com os três diferente clones (clone 5, clone 6 e clone 12) por 72 h. Após esse período, o RNA total foi extraído e analisado quanto a sua integridade através da detecção dos RNAs ribossômicos 28S e 18S (Figura 8A). A análise detectou o mRNA para a proteína Ag85A somente no clone número 6 (Figura 8B). Esse resultado comprova que a célula foi eficientemente transfectada e que o DNA recombinante está sendo transcrito. Uma vez que o gene Ag85A está em fase com o gene hsp65, a produção da proteína de fusão deve ocorrer normalmente. Isso fica evidente na figura 9. 63 __________________________________________________________________Resultados clone 5 A clone 6 clone 12 28 S 18S B Ag85A (RT-) 0,4 Kb β actina (RT+) 0,9 Kb Ag85A (RT+) Figura 8- Avaliação do RNA total e detecção do mRNA de Ag85A. Macrófagos J774 foram transfectados com os três clones recombinantes pVAX-Ag85A/Hsp65 por 72 h. O RNA total foi extraído e avaliado por meio de eletroforese em gel de agarose 1%. Em A: avaliação da integridade do mRNA, mostrando as duas bandas, 28S e 18S. Em B: mensagem para o gene Ag85A, onde Ag85A (RT-) mostra o controle negativo da reação após tratamento com a enzima DNAse; β actina (RT+) mostra o controle positivo da reação com oligos para a β actina e Ag85A (RT+) mostra o PCR específico com oligos para Ag85A (descrito em material e métodos, item 3.4). 64 __________________________________________________________________Resultados 4.6- Detecção da proteína Ag85A por western blot Para verificar se o mRNA para o gene Ag85A estava sendo corretamente traduzido em proteína, foi feita uma análise de western blot, a qual revelou uma banda de aproximadamente 100 kDa, correspondente ao tamanho da proteína de fusão, sendo 32 kDa da proteína Ag85A somados a 65 kDa da proteína Hsp65 (Figura 9). Através dessa análise comprovou-se que além da transcrição do gene quimérico, estava ocorrendo também a tradução da proteína recombinante. A partir desses resultados, foi escolhido o clone número 6 para realização dos ensaios posteriores deste trabalho. 65 __________________________________________________________________Resultados L 1 2 3 4 5 6 7 8 121,3 kDa 68,8 kDa Figura 9- Detecção da proteína Ag85A por meio de western blot. Macrófagos J774 foram transfectados com os três clones recombinantes pVAX-Ag85A/Hsp65 por 72 h. Após esse período, as células foram lisadas e tiveram seus sobrenadantes e lisados coletados. As proteínas foram separadas por meio de eletroforese em gel SDS-PAGE 10% e, posteriormente, transferidas para membrana de nitrocelulose. A revelação das bandas foi realizada usando o kit “DAB Substrate Kit for peroxidase” com o anticorpo específico antiAg85A (TD-17-4). L: padrão de peso molecular BenchMark Pré-Stained Protein Ladder (Invitrogen, USA); pista 1: sobrenadante de células não transfectadas; pista 2: sobrenadante de células transfectadas com o clone 5; pista 3: sobrenadante de células transfectadas com o clone 6; pista 4: sobrenadante de células transfectadas com o clone 12; pista 5: lisado de células não transfectadas; pista 6: lisado de células transfectadas com o clone 5; pista 7: lisado de células transfectadas com o clone 6 e pista 8: lisado de células transfectadas com o clone 12. 66 __________________________________________________________________Resultados 4.7- Análise das vacinas gênicas purificadas Antes de se iniciar os protocolos de imunizações, todos os DNAs foram purificados por cromatografia de troca iônica, e verificados quanto a sua integridade. Amostras da vacina DNA-Hsp65 e do vetor pVAX1 foram digeridas com a enzima BamHI (Invitrogen, USA), a qual lineariza os plasmídeos. A digestão do vetor pVAX1 vazio revelou uma banda com tamanho aproximado de 3,0 Kb (pista 2) enquanto que a digestão da vacina DNA-Hsp65 revelou uma banda de aproximadamente 6,0 Kb (pista 4), sendo 3,0 Kb do vetor somados a 3,0 Kb do gene hsp65. A presença da formação de diversas bandas observadas no DNA não digerido (pistas 1 e 3) é característica de DNA super-enovelado, fato que não ocorre nos DNAs linearizados. É importante ressaltar também que não se observou contaminação dos plasmídeos com DNA nem RNA genômicos (Figura 10A). A mesma caracterização foi realizada com as vacinas DNA-Ag85A e DNAAg85A/Hsp65, porém, utilizando-se a enzima PmeI (Fermentas, Canada). Essa enzima flanqueia tanto o gene Ag85A quanto o cassete Ag85A/Hsp65. A clivagem da vacina DNA-Ag85A revelou a presença de uma banda de 1,0 Kb correspondente ao gene Ag85A e outra banda de 3,0 Kb correspondente ao vetor pVAX1 (pista 1). Já a digestão da vacina múltipla DNA-Ag85A/Hsp65 resultou no aparecimento de uma banda com tamanho aproximado de 4,0 Kb e outra de 3,0 Kb (pista 2), a primeira correspondendo a fusão dos genes Ag85A (1,0 Kb) + hsp65 (3,0 Kb), e a segunda banda (3,0 Kb), correspondente ao vetor pVAX1 na ausência dos genes (Figura 10B). 67 __________________________________________________________________Resultados L 1 2 3 4 A 6,0 Kb 3,0 Kb L 1 2 B 4,0 Kb 3,0 Kb 1,0 Kb Figura 10- Perfil eletroforético dos DNAs plasmídeais purificados. As amostas foram submetidas a eletroforese em gel de agarose 1%, sendo as bandas reveladas pela coloração com brometo de etídio. Os plasmídeos foram purificados com kit comercial QiagenTM (Gibco BRL, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Em A, pVAX1 e DNA-Hsp65 digeridos ou não com a enzima BamHI (Invitrogen, USA). L: padrão de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA); pista 1: pVAX1 não digerido; pista 2: pVAX1 digerido; pista 3: DNA-Hsp65 não digerido e pista 4: DNA-Hsp65 digerido. Em B, DNA-Ag85A e DNA-Ag85A/Hsp65 digeridos ou não com a enzima PmeI (Fermentas, Canada). L: padrão de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, USA); pista 1: DNA-Ag85A digerido; pista 2: DNA-Ag85A/Hsp65 digerido. 68 __________________________________________________________________Resultados 4.8- Obtenção da proteína Hsp65 recombinante (rHsp65) A proteína rHsp65, utilizada em nossos ensaios, foi obtida através de expressão em sistema procariótico, como descrito em material e métodos (item 3.9). A figura 11 mostra a expressão da proteína rHsp65 em gel de poliacrilamida SDS/PAGE 10% onde pudemos verificar o aparecimento de uma banda de expressão na altura de 65 kDa, no extrato de bactérias induzidas com IPTG, quando comparada com o extrato de bactérias não induzidas (Figura 11). A purificação da proteína rHsp65 do extrato bruto foi realizada em cromatografia de afinidade em resina Hi-Trap Chelating HP e a pureza da proteína pôde ser visualizada em gel de poliacrilamida SDS/PAGE 10% (Figura 11) onde se observa banda única cujo perfil eletroforético corresponde à proteína rHsp65. Essa proteína foi utilizada nos ensaios moleculares, descritos abaixo. Além disso, os resultados sugerem que a proteína expressa foi purificada por coluna de afinidade, com eliminação de outras proteínas contaminantes que poderiam interferir com os próximos experimentos. 69 __________________________________________________________________Resultados L 1 2 3 65 kDa Figura 11- Expressão e purificação da proteína recombinante Hsp65. Eletroforese em gel de poliacrilamida 10% em condições desnaturantes mostrando a expressão da proteína rHsp65 induzida pela adição de 300 mM de IPTG em bactérias ER2566 crescidas a 37°C, por 16 h e a purificação da rHsp65 realizada em coluna de afinidade (Amershan-Pharmacia). L: padrão de peso molecular BenchMark Pré-Stained Protein Ladder (Invitrogen, USA); pista 1: extrato de bactérias não induzidas; pista 2: extrato de bactérias induzidas com IPTG por 16 h; pista 3: rHsp65 purificada. As bandas protéicas foram visualizadas pela coloração com Coomassie Blue. 70 __________________________________________________________________Resultados 4.9- Quantificação de endotoxina bacteriana Com a finalidade de avaliar a quantidade de endotoxina contaminante presente nas construções vacinais e nas proteínas recombinantes, foi utilizado o teste Limulus Ameboyte Lysate (LAL), onde foram obtidos índices de endotoxina menores que 0,1 UE/µg de DNA, portanto aceitáveis para testes in vivo, como recomendado pela farmacopéia americana e européia (Tabela 1). Tabela 1. Quantificação de endotoxina pelo teste LAL. Amostra UE/µ µg de DNA Solução salina < 0,0001 Solução sacarose < 0,0001 pVAX1 < 0,0001 DNA-Hsp65 < 0,0001 DNA-Ag85A < 0,0001 DNA-Ag85A/Hsp65 < 0,0001 UE/µ µg: Unidades de endotoxina por micrograma de amostra 71 __________________________________________________________________Resultados 4.10- Ensaios de imunogenicidade O protocolo de imunização utilizado nos experimentos de imunogenicidade foi o seguinte: quatro imunizações com 100 µg de cada DNA com um intervalo de 15 dias entre cada dose. Após 15 dias da última imunização, os animais foram sacrificados e avaliados em relação a diversos parâmetros como: produção de anticorpos anti-Hsp65 e anti-Ag85A, produção de citocinas e resposta linfoproliferativa. 4.10.1- Resposta imune humoral anti-Hsp65 e anti-Ag85A A resposta imune humoral foi avaliada por meio da técnica de ELISA, onde se analisou a produção de anticorpos IgG específicos, anti-Hsp65 e anti-Ag85A, dos subtipos IgG1 e IgG2a. Como controles negativo foram utilizados amostras de soro de animais préimunizados e injetados com salina. A dosagem de anticorpos específicos foi realizada em amostras obtidas duas semanas após a última imunização com: DNA-Hsp65, DNA-Ag85A, DNA-Ag85A/Hsp65 e DNA-Ag85A+Hsp65. A análise da produção de anticorpos 15 dias após a última imunização com a vacina DNA-Hsp65, apresentou produção de anticorpos específicos tanto IgG1 como IgG2a (Figura 12), porém com uma tendência à polarização da resposta para o padrão Th1, visto que a razão IgG1/IgG2a entre esses dois subtipos foi em média de 0,6. Com relação a produção de anticorpos específicos anti-Ag85A (Figura 13), foi observado um aumento significativo de anticorpos do subtipo IgG2a no soro dos animais imunizados com DNA-Ag85A. Esses animais também apresentaram a produção de anticorpos do subtipo IgG1, quando comparados com os animais imunizados apenas com salina. Porém, assim como na imunização com DNA-Hsp65, a razão IgG1/IgG2a foi em média de 0,6 sugerindo assim a prevalência de um padrão de resposta do tipo Th1 nesses animais. 72 __________________________________________________________________Resultados A vacinação dos animais com DNA-Ag85A+Hsp65 revelou resultados interessantes quanto à produção de anticorpos. Na figura 12, pôde-se observar um aumento na detecção de anticorpos anti-Hsp65 apenas do subtipo IgG2a apesar de não ter sido significativo, enquanto que ao observarmos a produção de anticorpos anti-Ag85A nesses mesmos animais (Figura 13), vemos um aumento expressivo tanto de IgG1 quanto de IgG2a, inclusive com um leve aumento desse último subtipo quando comparado com a produção pelos animais imunizados somente com DNA-Ag85A. De forma inesperada, os animais imunizados com a vacina contendo os antígenos fusionados (DNA-Ag85A/Hsp65), não apresentaram anticorpos anti-Hsp65 ou anti-Ag85A (Figuras 12 e 13). 73 __________________________________________________________________Resultados Figura 12- Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com intervalos de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções. O grupo controle recebeu salina. Os níveis de anticorpos foram detectados por ELISA no soro dos animais (diluído 10 vezes) antes do início das imunizações (pré imune) e duas semanas após a última imunização (pós imune). Os resultados representam a média de 2 experimentos independentes. ** p<0,0001, * p<0,001 em relação ao grupo controle e aos animais pré imunizados. 74 __________________________________________________________________Resultados Figura 13- Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a antiAg85A. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com intervalos de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções. O grupo controle recebeu salina. Os níveis de anticorpos foram detectados por ELISA no soro dos animais (diluído 10 vezes) antes do início das imunizações (pré imune) e duas semanas após a última imunização (pós imune). Os resultados representam a média de 2 experimentos independentes. ** p<0,001, * p<0,05 em relação ao grupo controle e aos animais pré imunizados. 75 __________________________________________________________________Resultados 4.10.2- Detecção de citocinas em sobrenadante de cultura de células do baço Após a avaliação da produção de anticorpos foi determinado o perfil de citocinas produzidas pelas células do baço de animais imunizados mediante estímulo com o lisado de Mtb obtido por sonicação (antígenos totais). Para tanto foram analisadas as citocinas IL-12, IFN-γ e IL-10 com o intuito de conhecer o perfil da resposta imune celular induzida após a vacinação com as diferentes construções e mediante o estímulo com diferentes antígenos micobacterianos. Adicionalmente avaliou-se também a produção da citocina IFN-γ, na presença de estímulo específico com rHsp65 e rAg85A. Em relação a IL-12, pôde-se concluir que todas as construções induziram as células do baço a produzirem essa citocina mediante estímulo com o lisado de Mtb, inclusive os animais controle, injetados apenas com salina (Figura 14). Após a avaliação da produção de IL-12, passamos a avaliar os níveis de IFN-γ nas células do baço após estímulo com o lisado de Mtb. A produção dessa citocina nessas células mostrou diferença significativa somente nos animais imunizados com DNA-Ag85A, apesar de ter ocorrido também, um aumento na sua produção pelas células dos animais imunizados com ambas as vacinas (DNA-Ag85A+Hsp65) (Figura 15). Quando as células foram estimuladas especificamente com a proteína rHsp65, observamos um aumento na produção de IFN-γ naquelas provenientes de animais imunizados com DNA-Hsp65 e com DNA-Ag85A+Hsp65, o mesmo foi observado na cultura estimulada com a proteína rAg85A a qual mostrou produção significativa de IFN-γ nos animais imunizados com a construção DNA-Ag85A e com DNA-Ag85A+Hsp65 (Figura 16), porém em ambas as culturas celulares os níveis detectados da citocina foram mais baixos quando comparados com os mesmos animais estimulados com Mtb (Figura 15). A imunização com a vacina múltipla de DNA (DNA-Ag85A/Hsp65) não induziu níveis estatísticamente significativos de IFN-γ nas células dos animais em nenhum dos casos. 76 __________________________________________________________________Resultados Para ter uma idéia mais precisa do perfil de resposta imune apresentada pelos animais após as imunizações com as diferentes construções, foi dosada também a citocina IL-10 em cultura de células de baço, a qual é importante na regulação da inflamação. A análise em conjunto da detecção de IL-10, mostrou que houve uma pequena diminuição nos níveis dessa citocina nas células dos animais imunizados se comparados com os animais do grupo controle, mas essa diminuição só foi significativa para o grupo vacinado com a vacina múltipla DNA-Ag85A/Hsp65 (Figura 17). 77 __________________________________________________________________Resultados ConA 1250 IL-12 pg/mL 1000 750 500 250 sp 6 sp 6 5A +H /H -A g8 g8 D N A -A A N D 5 5 5A 5A -A A N D D N A -H g8 sp 6 Sa lin 5 a 0 Meio Mtb IL-12 pg/mL 2000 1000 Sa l in a D N A -H sp 65 D N A -A D g8 N A 5A -A g8 5A /H D N sp A 65 -A g8 5A +H sp 65 0 Figura 14- Detecção de IL-12 em sobrenadante de cultura de células do baço dos animais imunizados. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com 100 g das diferentes construções gênicas em 4 doses com intervalos de 2 semanas. O grupo controle recebeu solução salina. Duas semanas após a última imunização, os animais foram sacrificados e as células do baço foram estimuladas com meio (RPMI), 20 g/mL do lisado de Mtb ou 40 µg/mL de ConA. Após 48 h, os sobrenadantes das culturas foram coletados para detecção de citocinas por ELISA. Os resultados são expressos em média ± desvio padrão da concentração da citocina em pg/mL e representam a média de 2 experimentos independentes. 78 __________________________________________________________________Resultados ConA IFN-γγ pg/mL 30000 20000 10000 N sp 65 +H sp 65 H -A D NA D N A -A D D IFN-γ pg/mL 2000 g8 5A A g8 5A / -A g8 5A sp 65 A -H N Sa lin a 0 * Meio Mtb 1500 1000 500 sp 65 +H sp 65 D N A -A g8 5 A g8 5A -A A N D /H g8 5A -A A N D D N A -H sp 65 Sa lin a 0 Figura 15- Detecção de IFN-γγ em sobrenadante em cultura de células do baço dos animais imunizados. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com 100 g das diferentes construções gênicas em 4 doses com intervalos de 2 semanas. O grupo controle recebeu solução salina. Duas semanas após a última imunização, os animais foram sacrificados e as células do baço foram estimuladas com: meio (RPMI), 20 g/mL do lisado de Mtb ou 40 µg/mL de ConA. Após 48 h, os sobrenadantes das culturas foram coletados para detecção de citocinas por ELISA. Os resultados são expressos em média ± desvio padrão da concentração da citocina em pg/mL e representam a média de 2 experimentos independentes. * p<0,05 em relação ao grupo controle. 79 __________________________________________________________________Resultados rHsp65 * 800 600 500 * 400 ConA 300 35000 200 30000 IFN-γγ (pg/mL) IFN-γ (pg/mL) 700 100 -A g8 5A D /H N sp A -A 65 g8 5A +H sp 65 -A g8 5A 20000 15000 10000 5000 Sa lin a D N A -H sp 65 D N A -A D N g8 A 5A -A g8 5A D /H N sp A -A 65 g8 5A +H sp 65 0 D N A D N A -H sp 65 D N A Sa lin a 0 25000 rAg85A IFN-γγ (pg/mL) 200 * * 100 Sa lin a D N A -H sp 65 D N A -A D N g8 A 5A -A g8 5A D /H N sp A -A 65 g8 5A +H sp 65 0 Figura 16- Detecção de IFN-γγ em sobrenadante de cultura de células do baço de animais imunizados. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com 100 g das diferentes construções em 4 doses com intervalos de 2 semanas. O grupo controle recebeu solução salina. Duas semanas após a última imunização, os animais foram sacrificados e as células do baço foram estimuladas com 40 g/mL conA, 20 g/mL rHsp65 (gráfico acima) e 20 µg/mL rAg85A (gráfico abaixo). Após 48 h, os sobrenadantes das culturas foram coletados para detecção de citocinas por ELISA. Os resultados são expressos em média ± desvio padrão da concentração da citocina em pg/mL e representam a média de 2 experimentos independentes. * p<0,05 em relação ao grupo controle. 80 __________________________________________________________________Resultados ConA IL-10 (pg/mL) 3000 2000 1000 65 sp 65 +H sp /H g8 5A 5A g8 D D N N A A -A -A D D N N A A -A -H sp Sa lin a 65 g8 5A 0 Meio IL-10 (pg/mL) 400 Mtb 300 200 * 100 /H sp A 65 -A g8 5A +H sp 65 D -A A D N N g8 5A N D D N A A -A -H Sa lin a sp 65 g8 5A 0 Figura 17- Detecção de IL-10 em sobrenadante de cultura de células do baço dos animais imunizados. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com 100 g das diferentes construções gênicas em 4 doses com intervalos de 2 semanas. O grupo controle recebeu solução salina. Duas semanas após a última imunização, os animais foram sacrificados e as células do baço foram estimuladas com: meio (RPMI), 20 g/mL do lisado de Mtb ou 40 µg/mL de ConA. Após 48 h, os sobrenadantes das culturas foram coletados para detecção de citocinas por ELISA. Os resultados são expressos em média ± desvio padrão da concentração da citocina em pg/mL e representam a média de 2 experimentos independentes. * p<0,05 em relação ao grupo controle. 81 __________________________________________________________________Resultados 4.10.3- Resposta linfoproliferativa após imunização A análise da resposta linfoproliferativa das células do baço dos animais imunizados, e posteriormente estimuladas com rHsp65 e rAg85A demonstra que somente as células dos animais do grupo imunizado com a vacina múltipla (DNA-Ag85A/Hsp65) não proliferaram frente ao estímulo com a proteína rHsp65. Por outro lado, no caso do estímulo com a proteína rAg85A, os animais vacinados com DNA-Ag85A mostraram uma linfoproliferação específica. Já o grupo DNA-Ag85A+Hsp65 mostrou perfil de proliferação semelhante, independente do estímulo, ou seja: rHsp65 ou rAg85 (Figura 18). 82 __________________________________________________________________Resultados 3500 * 3000 ** # c.p.m 2500 meio ** 2000 ## rHsp65 1500 rAg85A 1000 500 sp 65 5A +H sp 65 D N -A g8 A -A g8 5A /H g8 5A D N A D N A -A -H D N A Sa l in a sp 65 0 Figura 18- Resposta linfoproliferativa de animais imunizados. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com 100 g das diferentes construções gênicas em 4 doses com intervalos de 2 semanas. O grupo controle recebeu solução salina. Duas semanas após a última imunização, os animais foram sacrificados e as células do baço (5 x 105 células) foram estimuladas com meio (RPMI), 2 g/mL de rHsp65 ou 2 µg/mL de rAg85A e a cultura de células foi pulsada com 50 µL por poço de timidina tritiada em RPMI Completo 16 h antes de completar o tempo de incubação de 72 h a 37oC em estufa 5% CO2. c.p.m: contagem por minuto. Os resultados representam a média de 2 experimentos independentes. * p<0,05; ** p<0,005 em relação às células estimuladas com rHsp65 do grupo controle, # p<0,05; ## p<0,005 em relação às células estimuladas com rAg85A do grupo controle. 83 __________________________________________________________________Resultados 4.11- Ensaios de proteção Após trinta dias da última imunização, os diferentes grupos (descritos em material e métodos e delineamento experimental) foram desafiados com a cepa virulenta de M. tuberculosis H37Rv e trinta dias após o desafio foram sacrificados. O pulmão foi removido para avaliação de diversos parâmetros como o número de unidades formadoras de colônia (UFC), detecção de citocinas, avaliação fenotípica das células presentes nos pulmões e análise histopatológica. Devido ao grupo DNA-Ag85A+Hsp65 ter sido inserido posteriormente e ao curto período de tempo para a realização de todos os experimentos, não há dados, referentes a esse grupo, da produção de citocinas e FACs, mas somente da produção de anticorpos e ensaio de UFC, o qual julgamos ser o mais relevante para o objetivo deste trabalho. 4.11.1- Resposta imune humoral anti-Hsp65 e anti-Ag85A nos animais imunizados e infectados Também foi analisado o perfil de anticorpos apresentado pelos animais imunizados e infectados com Mtb. Com relação aos animais vacinados com DNA-Hsp65, observamos que os níveis de imunoglobulinas anti-Hsp65 do subtipo IgG2a, se mantiveram iguais mesmo após a infecção. Entretanto, houve um pequeno aumento nos níveis de IgG1 nesses animais se comparados com os níveis produzidos quando eles foram somente imunizados (Figuras 12 e 19), sugerindo, nesse caso, uma mudança para um padrão misto de resposta após a infecção, com uma razão IgG1/IgG2a de aproximadamente 1. Um resultado interessante foi o demonstrado tanto pelos animais vacinados com DNA-Ag85A/Hsp65 (vacina múltipla), quanto pelos vacinados com DNA-Ag85A+Hsp65 que apresentaram uma produção significativa de anticorpos anti-Hsp65 tanto do subtipo 84 __________________________________________________________________Resultados IgG2a quanto de IgG1 após a infecção, fato que não foi observado nesses animais quando foram somente imunizados (Figuras 12 e 19). A vacina múltipla, assim como a vacina DNAHsp65, apresentou um padrão misto de resposta, já a vacina contendo os dois antígenos mostrou uma tendência ao padrão Th1, com uma razão IgG1/IgG2a de cerca de 0,4. Com relação ao grupo DNA-Ag85A os níveis de anticorpos específicos se mantiveram os mesmos. Já os animais vacinados com DNA-Ag85A+Hsp65, mostraram uma ligeira redução nos níveis de IgG2a após a infecção (Figuras 13 e 20). A vacinação com BCG induziu somente anticorpos anti-Hsp65 e anti-Ag85A do subtipo IgG1, sugerindo uma tendência ao padrão Th2 (Figuras 19 e 20). 85 __________________________________________________________________Resultados Figura 19- Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Hsp65 nos animais vacinados e desafiados com M. tuberculosis. Camundongos BALB/c foram vacinados por via intramuscular com intervalos de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções vacinais. O grupo BCG recebeu 105 bacilos por via subcutânea e o grupo controle recebeu solução salina. 30 dias após a ultima imunização os animais foram desafiados com cerca de 105 bacilos H37Rv. Os níveis de anticorpos foram detectados por ELISA no soro dos animais (diluído 10 vezes) 30 dias após o desafio. Os resultados representam a média de 2 experimentos independentes. ***p< 0,0001, ** p<0,01, * p<0,05 em relação ao grupo controle. 86 __________________________________________________________________Resultados Figura 20- Determinação da produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-Ag85A, nos animais vacinados e desafiados com M. tuberculosis. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com intervalos de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções vacinais. O grupo BCG recebeu 105 bacilos por via subcutânea e o grupo controle recebeu solução salina. 30 dias após a ultima imunização os animais foram desafiados com cerca de 105 bacilos H37Rv. Os níveis de anticorpos foram detectados por ELISA no soro dos animais (diluído 10 vezes) 30 dias após o desafio. Os resultados representam a média de 2 experimentos independentes.** p<0,005, * p<0,05 em relação ao grupo controle. 87 __________________________________________________________________Resultados 4.11.2- Análise da produção de citocinas no homogenato do pulmão de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis As citocinas analisadas foram: IL-12, IFN-γ, IL-10 e IL-4. Não houve produção, estatísticamente significativa, da citocina IL-12 entre os diferentes grupos imunizados e posteriormente infectados com M. tuberculosis. Já os animais imunizados com a vacina BCG tiveram uma produção menor se comparado com o grupo controle, o qual foi injetado somente solução salina (Figura 21A). Com relação à produção de IFN-γ, observamos o mesmo perfil detectado para a citocina IL-12, onde todos os grupos apresentaram uma produção da citocina, porém sem diferenças significativas entre eles. Podemos observar também que a baixa produção de IL-12 nos animais vacinados com BCG corrobora com os baixos níveis de IFN-γ detectados para esses mesmos animais (Figura 21B). A despeito da IL-10, os resultados obtidos mostraram que as diferentes construções vacinais também induziram a produção dessa citocina no pulmão, porém sem diferença estatística entre os diversos grupos experimentais (Figura 22A). Enquanto que a análise da produção de IL-4 mostrou uma menor produção pelos animais vacinados com DNA-Hsp65, DNA-Ag85A e DNA-Ag85A/Hsp65 se comparados com os animais injetados com solução salina (Figura 22B). 88 __________________________________________________________________Resultados A B Figura 21- Detecção de citocinas em homogenato de pulmão de animais imunizados e desafiados com Mtb. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com intervalos de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções. O grupo BCG recebeu 105 bacilos por via subcutânea e o grupo controle recebeu solução salina. 30 dias após a ultima imunização os animais foram desafiados com cerca de 105 bacilos H37Rv e 30 dias após o desafio os animais foram sacrificados e dosou-se as citocinas no homogenato dos pulmões por ELISA. Em A: análise da produção de IL-12. Em B: análise da produção de IFN-γ. Os resultados expressam a média ± desvio padrão da concentração de citocina em pg/mL e representam a média de 2 experimentos independentes. * p<0,05 em relação ao grupo controle. 89 __________________________________________________________________Resultados A B Figura 22- Detecção de citocinas em homogenato de pulmão de animais imunizados e desafiados com Mtb. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com intervalos de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções. O grupo BCG recebeu 105 bacilos por via subcutânea e o grupo controle recebeu solução salina. 30 dias após a ultima imunização os animais foram desafiados com cerca de 105 bacilos H37Rv e 30 dias após o desafio os animais foram sacrificados e dosou-se as citocinas no homogenato dos pulmões por ELISA. Em A: análise da produção de IL-10. Em B: análise da produção de IL-4. Os resultados expressam a média ± desvio padrão da concentração de citocina em pg/mL e representam a média de 2 experimentos independentes. * p<0,05; ** p< 0,0005 em relação ao grupo controle. 90 __________________________________________________________________Resultados 4.11.3- Avaliação fenotípica das células presentes nos pulmões de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis Visando conhecer o efeito das diferentes construções vacinais nas células dos animais, foi realizada a técnica de citometria de fluxo para avaliar o perfil fenotípico das células presentes nos pulmões dos animais infectados. Primeiramente foi avaliada a expressão da molécula CD3+, a qual se mostrou elevada em todos os grupos vacinados (Figura 23). O próximo passo foi analisar os marcadores CD4+ e CD8+ nesses linfócitos, os quais também apresentaram um aumento nos animais vacinados com as diferentes construções de DNA se comparados com o grupo controle, o qual foi injetado somente solução salina e posteriormente infectados (Figuras 24). Já com relação ao grupo BCG, observamos um aumento significativo somente de células T CD4+ (Figura 24). Do mesmo modo, foi avaliada a geração de células T CD4+ e T CD8+ de memória efetora, ou seja, expressando os marcadores CD44hi e CD62Llo. A análise da figura 25 evidencia um aumento no número de células T CD4+CD44hiCD62Llo somente nos animais imunizados com BCG e um aumento de células T CD8+CD44hiCD62Llo em todos os grupos vacinados. 91 __________________________________________________________________Resultados Figura 23- Análise da porcentagem de células pulmonares expressando o marcador CD3+. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com intervalos de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções vacinais. O grupo BCG recebeu 105 bacilos por via subcutânea e o grupo controle recebeu solução salina. 30 dias após a ultima imunização os animais foram desafiados com cerca de 105 bacilos H37Rv e 30 dias após o desafio os animais foram sacrificados e analisou-se expressão de marcadores de superfície nas células do pulmão por citometria de fluxo. Os resultados representam a média de 2 experimentos independentes. * p< 0,05; ** p< 0,001 em relação ao grupo controle. 92 __________________________________________________________________Resultados A B Figura 24- Análise da porcentagem de linfócitos T, expressando os marcadores + CD4 e CD8+ no pulmão de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com intervalos de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções vacinais. O grupo BCG recebeu 105 bacilos por via subcutânea e o grupo controle recebeu solução salina. 30 dias após a ultima imunização os animais foram desafiados com cerca de 105 bacilos H37Rv e 30 dias após o desafio os animais foram sacrificados e analisou-se expressão de marcadores de superfície nas células do pulmão por citometria de fluxo. Em A: Linfócitos T CD4+. Em B: Linfócitos T CD8+. Os resultados representam a média de 2 experimentos independentes. * p< 0,05; ** p< 0,001 em relação ao grupo controle. 93 __________________________________________________________________Resultados A B Figura 25- Análise da porcentagem de linfócitos T CD4+ e T CD8+ expressando os marcadores CD44hi e CD62Llo no pulmão de animais imunizados e desafiados com M. tuberculosis. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com intervalos de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções vacinais. O grupo BCG recebeu 105 bacilos por via subcutânea e o grupo controle recebeu solução salina. 30 dias após a ultima imunização os animais foram desafiados com cerca de 105 bacilos H37Rv e 30 dias após o desafio os animais foram sacrificados e analisou-se expressão de marcadores de superfície nas células do pulmão por citometria de fluxo. Em A: Linfócitos T CD4+CD44hiCD62Llo. Em B: Linfócitos T CD8+CD44hiCD62Llo. Os resultados representam a média de 2 experimentos independentes. * p< 0,05; ** p< 0,005 em relação ao grupo controle. 94 __________________________________________________________________Resultados 4.11.4- Avaliação das Unidades Formadoras de Colônias (UFC) Trinta dias após o desafio, os animais foram sacrificados e os bacilos presentes nos pulmões foram contados por meio do ensaio de UFC. Como pôde ser observado na figura 26, todas as construções vacinais foram capazes de reduzir de forma significativa o número de bactérias no pulmão de animais previamente vacinados e posteriormente infectados, quando comparados com os animais injetados somente com solução salina. Um resultado interessante foi o observado para os animais imunizados com a vacina múltipla (DNA-Ag85A/Hsp65), que reduziram a carga bacilar em cerca de 0,9 log10 nos ensaios de proteção, enquanto eles não apresentaram dados promissores na imunogenicidade. 95 __________________________________________________________________Resultados Figura 26- Número de UFC no pulmão de animais vacinados e desafiados com M. tuberculosis. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com intervalos de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções vacinais. O grupo BCG recebeu 105 bacilos por via subcutânea e o grupo controle recebeu solução salina. 30 dias após a ultima imunização os animais foram desafiados com cerca de 105 bacilos H37Rv e 30 dias após o desafio os animais foram sacrificados, o pulmão coletado e homogeneizados. As amostras foram diluídas 100 vezes e cultivadas em meio 7H11. Após 28 dias de cultura, o número de UFC foi analisado. N.I: animal não imunizado e não infectado. Os resultados são expressos em Log10 do número de UFC por grama de pulmão total e representam a média de 2 experimentos independentes. * p<0.05; ** p<0,005; *** p<0,0001 em relação ao grupo controle. 96 __________________________________________________________________Resultados 4.11.5- Avaliação histopatológica do pulmão Os cortes histológicos dos diferentes grupos foram avaliados quanto ao comprometimento pulmonar e a presença de bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR). O grupo N.I (não imunizado e não infectado) corresponde ao parênquima pulmonar natural. Nesses cortes observamos que os alvéolos estão preservados, garantindo a função respiratória desse tecido e que áreas ao redor dos brônquios (peribronquial) ou vasos (perivascular) não apresentam infiltrados inflamatórios. Os grupos infectados que receberam solução salina ou somente o vetor nas imunizações, apresentaram um comprometimento de cerca de 60 a 70% do parênquima pulmonar, com um intenso infiltrado inflamatório difuso, caracterizado pela presença de macrófagos xantomatosos, linfócitos e alguns neutrófilos. Foi observado também hiperplasia do tecido linfóide associado ao brônquio (BALT, BronchusAssociated Lymphoid Tissue) e um pouco de edema nesses pulmões. Já nos grupos imunizados com as diferentes construções gênicas, constatamos um menor comprometimento pulmonar, com áreas bem preservadas do pulmão. Além disso, o infiltrado celular nesses grupos apresenta-se mais focalizado, com formações granulomatosas, sugerindo uma tentativa de contenção da infecção. Também foi observado uma hiperplasia do BALT nesses animais, sugerindo que houve uma estimulação linfocítaria para o local da infecção. Essa hiperplasia foi mais acentuada nos animais imunizados com a vacina DNA-Ag85A/Hsp65. O grupo imunizado com BCG também apresentou um parênquima pulmonar mais preservado com pequeno infitrado peribronquiolar e congestão mínima do tecido quando comparado com os grupos controles (Figuras 27 e 28). 97 __________________________________________________________________Resultados A análise das lâminas coradas pelo método de Ziehl-Neelsen, as quais mostram a presença de bacilos Mtb nos pulmões, confirmaram os resultados obtidos no ensaio de UFC (dados não mostrados). 98 __________________________________________________________________Resultados Figura 27- Cortes histológicos dos pulmões de animais imunizados e desafiados com Mtb. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com intervalos de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções vacinais. O grupo BCG recebeu 105 bacilos por via subcutânea e o grupo controle recebeu solução salina. 30 dias após a ultima imunização os animais foram desafiados com cerca de 105 bacilos H37Rv e 30 dias após o desafio os animais foram sacrificados e os pulmões coletados para a análise histopatológica. Os cortes foram corados por hematoxilina e eosina e observados em microscópio óptico em um aumento de 40X. 99 __________________________________________________________________Resultados 100 __________________________________________________________________Resultados Figura 28- Cortes histológicos dos pulmões de animais imunizados e desafiados com Mtb. Camundongos BALB/c foram imunizados por via intramuscular com intervalos de 2 semanas com 4 doses de 100 µg de DNA das diferentes construções vacinais. O grupo BCG recebeu 105 bacilos por via subcutânea e o grupo controle recebeu solução salina. 30 dias após a ultima imunização os animais foram desafiados com cerca de 105 bacilos H37Rv e 30 dias após o desafio os animais foram sacrificados e os pulmões coletados para a análise histopatológica. Os cortes foram corados por hematoxilina e eosina e observados em microscópio óptico em um aumento de 200X. 101 __________________________________________________________________Resultados 102 103 ___________________________________________________________________Discussão 5 DISCUSSÃO Nas últimas décadas, os avanços na tecnologia para a pesquisa e desenvolvimento de vacinas permitiram a introdução de novas estratégias para a obtenção e produção de antígenos. Essas estratégias abriram caminhos para inovações, particularmente no contexto do desenvolvimento de vacinas mais seguras, eficazes e polivalentes. No caso da TB, a variabilidade na proteção conferida pela vacina BCG, têm levado muitos pesquisadores a busca de novos fármacos e vacinas que realmente combatam a epidemia existente atualmente. Entre as vacinas candidatas à profilaxia e terapia da TB, destaca-se a vacina de DNA que codifica para a proteína Hsp65, desenvolvida por Silva e colaboradores (1992). Como citado anteriormente na introdução, essa vacina destacou-se como importante ferramenta na indução de proteção contra a infecção por M. tuberculosis em modelo experimental murino (Bonato et al., 1998) (Silva, 1999) (Lowrie, 1999) (Lima et al., 2003) e vêm sendo alvo de diversos estudos com o intuito de otimizá-la de modo a garantir o seu uso clínico (Gonçalves, 2006) (Souza, 2006) (Rosada, 2006) (Coelho-Castelo et al., 2006). Nesse sentido, a proposta deste trabalho foi construir uma vacina múltipla de DNA, contendo mais de um antígeno imunogênico, utilizando um vetor plasmideal liberado para uso clínico, o pVAX1, e avaliar o papel dessas construções na eficácia da resposta protetora contra TB se comparada com a vacina DNA-Hsp65 já existente. A clonagem de genes em vetores de expressão é um processo delicado, pois é necessário considerar vários parâmetros importantes para a transcrição e tradução do mesmo. Em geral os vetores comerciais dispõem dessas seqüências na sua forma correta para favorecer a expressão do antígeno. No nosso caso, para montagem de um sistema de expressão contendo dois antígenos tivemos que usar mais de uma estratégia para se obter sucesso. Na primeira estratégia elaborada para a construção dessa vacina, o oligonucleotídeo 104 ___________________________________________________________________Discussão forward, utilizado para a amplificação do gene Ag85A, foi desenhado de maneira a conter na sua extremidade 5´, duas bases de adenina para servir como sítio de ancoragem para a enzima AflII e dessa forma facilitar a clivagem do produto de PCR. Com relação ao oligonucleotídeo reverse, tomou-se o cuidado para que fosse retirada a seqüência de terminação do gene (códon stop), para que ocorresse a fusão em fase com o gene hsp65. Além disso, esse oligo também continha o sítio para a enzima AflII e seu respectivo sítio de ancoragem, e uma seqüência codificadora para três aminoácidos espaçadores: alanina, alanina e tirosina (AAY). Estudos demonstram que a adição de seqüências espaçadoras adequadas, flanqueando epítopos, pode facilitar o processamento do peptídeo pelo proteassoma, resultando também em um aumento de células T citotóxicas (CTLs) específicas (Del Val et al., 1991) (Velders et al., 2001). A seleção desses aminoácidos como espaçadores, foi baseada no fato de o proteassoma clivar preferencialmente resíduos de aminoácidos básicos e hidrofóbicos (Beekman et al., 2000). Velders e colaboradores (2001), evidenciaram que a vacinação de camundongos com DNA contendo essa seqüência espaçadora flanqueando determinados epítopos, foi mais efetiva na indução de imunidade anti-tumor HPV16, do que a vacinação com o DNA na ausência de tais seqüências. Em adição, nesse mesmo trabalho, o grupo demonstrou um aumento do processamento e apresentação de epítopos restritos ao HLA-A2, portanto, sendo também relevante para a indução de uma resposta imune em humanos. A escolha da enzima AflII para a linearização do plasmídeo pVAX-Hsp65 também foi importante pois ele possuía um sítio único de clivagem para essa enzima, o que possibilitou a sua linearização sem que o gene hsp65 fosse digerido. Além disso, esse sítio de clonagem estava upstream da seqüência de hsp65, próximo ao promotor do CMV (citomegalovirus), o que permitiu que o gene Ag85A fosse clonado na posição 5’em relação ao gene hsp65. A vacina múltipla de DNA foi estrategicamente construída de maneira a conter logo após o promotor CMV, a seqüência KOZAK, uma seqüência consenso que permite a ligação 105 ___________________________________________________________________Discussão do mRNA ao ribossomo, possibilitando que o mesmo possa buscar o ATG inicial de forma correta e portanto inicie a tradução protéica (Lewin, 2001). Precedendo o gene Ag85A, está presente também, uma seqüência sinal eucariótica: o human tissue plasminogen activator ou tPA, importante para a secreção da proteína de fusão. Baldwin e colaboradores (1999) demonstraram que a imunização de camundongos com a vacina de DNA que codificava para a proteína Ag85A na forma secretada, ou seja, contendo o sinal tPA, foi mais eficaz do que a vacina de DNA que codificava para a forma não secretada, observado pela produção de altos títulos de anticorpos anti-Ag85A específicos, linfoproliferação e resposta CTLs Ag85A específicos (Baldwin et al., 1999). Além disso, foi demonstrado também, que a forma secretada foi capaz de conferir uma proteção mais duradoura contra a cepa altamente virulenta, CSU37 de M. tuberculosis se comparado com os animais imunizados com a forma não secretada. Após o sequênciamento dos clones recombinantes descritos acima, verificamos que o gene hsp65 clonado no vetor pVAX1, não se iniciava diretamente no códon de iniciação ATG, mas sim em 11 nucleotídeos upstream a esse códon. Como o gene Ag85A foi clonado a 5´do gene hsp65, a fase aberta de leitura da primeira proteína não conhecidiu com a da segunda, portanto uma nova estratégia foi elaborada. Para a nova amplificação do gene Ag85A, o oligonucleotídeo forward foi desenhado de forma a conter o sítio de reconhecimento da enzima EcoRV e um sítio de ancoragem (CCG) na extremidade 5´. Essa enzima foi escolhida, pois cliva deixando as extremidades abruptas ou “cegas”. Já o oligonucleotídeo reverse continha o sítio para a enzima EcoRV e o nucleotídeo guanina (G) como sítio de ancoragem. A inserção de somente um nucleotídeo para a ancoragem da enzima, foi devido ao TM do oligo estar muito alto uma vez que havia uma grande quantidade de seqüências GC na parte final do gene Ag85A. Logo em seguida ao sítio para a enzima EcoRV, foi adicionado também mais uma guanina, para que o gene Ag85A 106 ___________________________________________________________________Discussão entrasse em fase com o gene hsp65. A guanina foi o único nucleotídeo que após análise in silico, não criou nenhum códon de terminação em nenhuma das 3 fases aberta de leitura da proteína. A presença de um sítio de múltipla clonagem (MCS, Multiple Cloning Site) localizado imediatamente após o promotor CMV e anteriormente à seqüência que codificava para o gene hsp65, possibilitou a elaboração da estratégia de clivagem desse vetor para a inserção do gene Ag85A. Nessa nova construção, o vetor foi digerido com as enzimas HindIII e BamHI, para que fosse retirada uma pequena seqüência presente no próprio vetor que separaria um gene do outro. Porém essas enzimas clivam deixando as extremidades coesivas e, portanto incompatíveis com as extremidades abruptas do inserto. A clonagem do gene Ag85A só foi possível após o preenchimento das extremidades do vetor com deoxinucleotídeos fosfato pela atividade do fragmento Klenow da DNA Polimerase I. Esse fragmento é resultado da clivagem proteolítica da enzima DNA Polimerase I e é muito utilizado em reações de síntese de DNA in vitro, por conter as atividades de polimerase e exonucleolítica de revisão 5´→3´ (Voet, 2002). A transformação da reação de ligação do gene Ag85A no plasmídeo pVAX-Hsp65, resultou na formação de poucas colônias nas placas (média de duas a cinco colônias), o que indica uma alta eficiência da reação de defosforilação realizada no vetor. A identificação de plasmídeos recombinantes contendo ambas as extremidades abruptas é relativamente trabalhosa, pois na maioria das vezes, há o surgimento de muitos falsos recombinantes, uma vez que, os vetores podem voltar a se ligarem neles próprios. A enzima Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIAP), é uma das fosfatases alcalinas que podem ser utilizadas na remoção do fosfato 5´ terminal evitando assim a recircularização do DNA plasmideal (Sambrook, 1989). 107 ___________________________________________________________________Discussão Após a etapa de construção da vacina múltipla, foi necessário analisar a presença e a funcionalidade do gene Ag85A. O parâmetro utilizado para apontar a presença desse gene foi por meio de análise de restrição. Com relação à funcionalidade do gene, foi avaliada a produção de mRNA para Ag85A, como também a detecção da própria proteína de fusão em macrófagos de linhagem J774. Essas análises nos mostraram indiretamente que células apresentadoras de antígenos foram capazes de transcrever e traduzir a proteína de fusão, como observado no western blot (Figura 9), garantindo que a vacinação fosse realizada com uma construção plasmideal adequada. Uma das principais preocupações com relação à imunização com vacinas de DNA, devido ao seu modo de produção, é a contaminação por LPS. O LPS é uma endotoxina produzida por bactérias gram-negativas que pode “alterar” a imunogenicidade da vacina atuando como um adjuvante, pois é capaz de imunomodular APCs, promovendo a sua maturação, aumento na expressão de moléculas co-estimunlatórias e liberação de citocinas que direcionam a resposta imune para um perfil Th1 (Hawkins et al., 2003). Dessa forma, todas as construções vacinais foram testadas para excluir a presença de tal contaminação. Essa análise demonstrou a pureza de todos os DNAs obtidos, os quais foram considerados aceitáveis para testes in vivo de acordo com a Farmacopéia Européia que preconiza que o limite de contaminação por endotoxina não ultrapasse 5 UE/Kg peso corpóreo/hora. Após as construções gênicas terem sido certificadas iniciou-se os processos de imunizações e avaliação da resposta imune induzida por cada vacina de DNA. Primeiramente avaliou-se a resposta imune humoral desencadeada por essas construções. A avaliação da produção de anticorpos específicos representa um importante indicador da transcrição correta do gene contido na vacina de DNA, bem como do tipo de resposta celular gerada. Uma vez que IgG1 (Th2) e IgG2a (Th1) podem ser considerados marcadores do padrão de resposta imune gerada, a razão IgG1/IgG2a pode ajudar a definir o 108 ___________________________________________________________________Discussão fenótipo de células T induzidas pela vacinação (Coffman et al., 1988). Portanto, podemos inferir que apesar de a imunização com DNA-Hsp65 ter gerado ambos os subtipos de anticorpos (Figura 12), ela tendeu à uma polarização de uma resposta para o padrão Th1, visto que a razão IgG1/IgG2a entre esses dois subtipos foi em média de 0,6. A vacinação dos animais com DNA-Ag85A+Hsp65 revelou resultados interessantes quanto à produção de anticorpos. Interessantemente, mesmo os animais tendo sido imunizados com a mesma quantidade de DNA de ambos os antígenos (50 µg de cada), houve somente um aumento de anticorpos para o Ag85A (Figuras 12 e 13). Isso pode ter ocorrido devido à ‘competição antigênica’ a qual estaria priorizando a resposta para um dos antígenos. Morris e colaboradores (2000) mostraram em seu trabalho que a imunização com uma combinação de antígenos contra TB, induziu uma limitada competição antigênica, também observada por Corbel e colaboradores (1994) (Morris et al., 2000) (Corbel, 1994). Essa competição poderia estar ocorrendo provavelmente, devido a uma maior secreção da proteína Ag85A em relação a proteína Hsp65, uma vez que a sua construção foi feita de forma a conter a seqüência sinal eucariótica Human Tissue Plasminogen Activator ou tPA (descrito em material e métodos), dita como facilitadora para a secreção de proteínas pelas células do hospedeiro (Li et al., 1999) (Baldwin et al., 1999). Montgomery e colaboradores (1997) reportaram que a transfecção de uma determinada linhagem celular com uma vacina de DNA codificando para o Ag85A fusionada com a seqüência tPA, apresentava uma maior expressão da proteína quando comparada com células transfectadas com a vacina de DNA codificando o gene Ag85A sozinho (Montgomery et al., 1997). Li e colaboradores (1999), também relataram um aumento na expressão dos antígenos micobacterianos: MTP-64, KatG, ESAT-6 e HBHA, quando estes estavam fusionados a seqüência tPA (Li et al., 1999). Assim, acreditamos que no caso dos animais imunizados com a preparação contendo tanto DNA-Ag85A como DNAHsp65 (DNA-Ag85A+Hsp65), houve uma prevalência na produção da proteína Ag85A e 109 ___________________________________________________________________Discussão assim um aumento na produção de anticorpos específicos para essa proteína e não para a proteína Hsp65. Os animais imunizados com a vacina contendo os antígenos fusionados (DNA-Ag85A/Hsp65), não apresentaram anticorpos anti-Hsp65 ou anti-Ag85A, como observado nas figuras 12 e 13. Para explicarmos esse fato, poderíamos postular algumas hipóteses. Primeira, devido ao tamanho da proteína de fusão, essa não estaria sendo expressa em quantidades suficientes para gerar uma resposta imune humoral de mesma intensidade da gerada pelas construções individuais. Segunda, na expressão da proteína fusionada poderiam ocorrer mudanças conformacionais que resultariam na perda do seu reconhecimento pelos anticorpos anti-Hsp65 e anti-Ag85A devido à inacessibilidade dos epítopos para os quais esses anticorpos são específicos e que estão presentes nas proteínas nativas. Essa não detecção de imunoglobulinas não necessariamente significa que esses animais não estejam produzindo outros tipos de anticorpos específicos para outros epítopos presentes somente na proteína de fusão e que, portanto, não estamos conseguindo detectá-los, pois as proteínas utilizadas na sensibilização desses ensaios foram as proteínas nativas. Embora a produção de anticorpos não seja um fator preponderante no controle da resposta imune contra tuberculose, não podemos descartar totalmente sua participação na imunidade protetora. Vordermeier e colaboradores (1996) demonstraram que a infecção de camundongos deficientes de células B com uma cepa virulenta de Mtb levou a um aumento na carga bacilar nos pulmões desses animais quando comparados aos animais normais (Vordermeier et al., 1996). Algumas das funções sugeridas às células B seria a de célula apresentadora de antígenos (APCs), as quais estariam capturando antígenos através de seus receptores de imunoglobulinas, processando-os e apresentando-os para as células T (Ozaki and Berzofsky, 1987) ou expressando o antígeno, após captura do DNA plasmideal (CoelhoCastelo et al., 2003). Além disso, esses epítopos apresentados via MHC de classe II, poderiam direcionar a resposta das células T contra o determinado patógeno (Watts and Lanzavecchia, 110 ___________________________________________________________________Discussão 1993) (Simitsek et al., 1995). Uma outra função para os anticorpos seria a de neutralizar componentes solúveis da micobactéria como, por exemplo, as lipoarabinomananas (LAM), as quais foram descritas como supressoras da resposta mediada por células T in vitro (Moreno et al., 1989). Além disso, anticorpos opsonizantes poderiam facilitar a captura do bacilo e assim impedir a disseminação da infecção. Após a avaliação da resposta imune humoral, foi determinado o perfil de citocinas produzidas pelas células do baço mediante estímulo com o lisado de Mtb, o qual contém tanto a Hsp65 quanto o Ag85A. A produção de IL-12 induzida por todas as construções vacinais, inclusive nos animais controle, (Figura 14), sugere que isto tenha ocorrido devido a ação de certos componentes da parede micobacteriana e, portanto, presentes no lisado de Mtb, como por exemplo, a lipoarabinomanana (LAM), que pode interagir com receptores de reconhecimento padrão presentes nas APCs levando à ativação dessas células e conseqüente produção dessa citocina (Park and Scott, 2001). Esse tipo de ativação corresponderia a ativação da resposta imune inata do animal. A IL-12 representa uma importante ligação entre a imunidade inata e a adquirida, sendo produzida durante as reações imunes inatas iniciais contra microorganismos intracelulares e estimulando as respostas da imunidade adquirida que protegem o hospedeiro contra esses microorganismos (Flynn and Ernst, 2000). A respeito dos níveis de IFN-γ detectados no sobrenadante de cultura de células de baço após estímulo com o lisado de Mtb, observou-se que somente os animais imunizados com DNA-Ag85A apresentaram níveis significativos de produção dessa citocina, apesar de ter ocorrido também um pequeno aumento na sua produção pelos animais imunizados com ambas as vacinas: DNA-Ag85A+Hsp65 (Figura 15). Como citado anteriromente, a proteína Ag85A é uma das principais proteínas secretadas por M. tuberculosis, junto com Ag85B e Ag85C, essas proteínas constituem cerca de 20 a 30% de todas as proteínas presentes no 111 ___________________________________________________________________Discussão filtrado de cultura de Mtb (Wiker et al., 1992). Portanto, esse aumento na produção de IFN-γ observado nos animais imunizados com DNA-Ag85A e com DNA-Ag85A+Hsp65, pode estar relacionado com a imunogenicidade da proteína Ag85A, como já discutido. Adicionalmente foi avaliada a produção de IFN-γ pelas células do baço de animais imunizados, mediante estímulo específico com a proteína rHsp65 e rAg85A. Como já era esperado, os níveis detectados da citocina nas culturas foram mais baixos quando comparados com os mesmos animais estimulados com o lisado de Mtb (Figura 15 e 16). Por outro lado, observamos que a produção de IFN-γ pelas células dos animais do grupo DNAAg85A+Hsp65, estimulados com rHsp65, mostraram uma produção bastante sensível da citocina, se comparados com o mesmo grupo quando estímulado com rAg85A. Esse dado interessante parece contradizer nossa hipótese da imunodominância do Ag85A. Porém é bastante razoável supor que tal imunodominância se mostre mais aparente numa resposta imune humoral do que em uma resposta imune celular. Nesse sentido, podemos observar que a imunização apenas com a vacina contendo um único antígeno foi específica a esse antígeno (Figura 16). Resultado surpreendente foi observado com o grupo imunizado com a vacina múltipla de DNA (DNA-Ag85A/Hsp65) que não induziu níveis significativos de IFN-γ nos animais em nenhum dos casos. Os dados obtidos por essa construção são interessantes e merecem maiores avaliações. Baseado apenas nesse resultado de citocina não temos condições de levantar hipóteses plausíveis. A detecção de IFN-γ nos sobrenadantes das culturas de células dos animais imunizados com DNA-Hsp65, DNA-Ag85A e com a preparação contendo as duas construções (DNA-Ag85A+Hsp65), sugere que essas imunizações poderiam estar levando a ativação de uma resposta imune com diferenciação de linfócitos T produtores desta citocina, ou seja, do padrão Th1. O IFN-γ é responsável pela ativação de mecanismos microbicidas de 112 ___________________________________________________________________Discussão macrófagos, estimula a expressão de moléculas de MHC de classe I e II e de moléculas coestimulatórias na superfície de células apresentadoras de antígeno e promove a troca de isotipo de imunoglobulinas para anticopos opsonizantes, como por exemplo, IgG2a em camundongo (Boehm et al., 1997), o que condiz com os resultados de produção de anticorpos desse subtipo nesses mesmos animais (Figuras 12 e 13). Dessa forma, as vacinas DNAHsp65, DNA-Ag85A e DNA-Ag85A+Hsp65 podem ser efetivas para o controle da tuberculose, uma vez que induziram um padrão de resposta considerado protetor contra TB. Para ter uma idéia mais precisa do perfil de resposta imune apresentada pelos animais após as imunizações com as diferentes construções, dosamos também a citocina IL-10 a qual é importante na regulação da inflamação. Foi observado que somente os animais imunizados com a vacina múltipla apresentaram uma diminuição significativa dessa citocina. Em conjunto, as análises dos resultados referentes à imunogenicidade mostram que as construções vacinais: DNA-Hsp65, DNA-Ag85A e DNA-Ag85A+Hsp65 estimularam a diferenciação de linfócitos T naives em linfócitos T efetores específicos de padrão Th1, como observado pela proliferação antígeno específica (Figura 18) e pela elevada produção de anticorpos do subtipo IgG2a e produção de IFN-γ (Figuras 12, 13 e 16) por esses animais. Considerando que a micobactéria é um patógeno intracelular, é importante que uma vacina desencadeie uma resposta com a participação de células T CD8+ citotóxicas e produção de citocinas como IFN-γ que atuarão na ativação das APCs, para a produção de espécies reativas de oxigênio e lise de células infectadas, culminando assim com a eliminação do bacilo. O papel do IFN-γ na imunidade contra micobactéria foi primeiramente demonstrado através da observação de que camundongos geneticamente deficientes na produção dessa citocina eram extremamente susceptíveis à infecção por Mtb (Cooper et al., 1993) (Flynn et al., 1993). Além disso, estudos recentes mostram que humanos com mutações genéticas nos genes relacionados à produção de IFN-γ, têm uma maior predisposição a TB ou 113 ___________________________________________________________________Discussão a doenças bacterianas (Casanova and Abel, 2002). A maioria das vacinas que não induzem bons níveis de IFN-γ antígeno-específicos não induz imunidade efetiva em modelos animais (Agger and Andersen, 2001). Portanto, relacionando os dados obtidos em nossos ensaios, é possível estabelecer um quadro de resposta imunológica que comprova a eficácia das vacinações, visto que a imunidade protetora contra tuberculose é baseada na geração de células Th1 CD4+ (Flynn and Chan, 2001). Uma vez ativadas, essas células T CD4+ produtoras de IFN-γ passarão a expressar o fenótipo de ativação CD44hi e CD62Llo e poderão migrar para os sítios de infecção em resposta ao patógeno. Apesar de a imunização com as vacinas codificando os antígenos individualmente ter mostrado uma boa indução de resposta, o mesmo não ocorreu quando os animais foram imunizados com a vacina múltipla. Porém sua eficácia pôde ser avaliada em modelo de prevenção ou profilaxia, como descrito abaixo. Após a análise da resposta imune humoral e celular desencadeada pelas diferentes construções, foi feita uma investigação da resposta imune protetora gerada por essas vacinas, mediante desafio com a cepa virulenta de Mtb: H37Rv. Nesse sentido, o primeiro parâmetro avaliado foi a produção de anticorpos específicos pelos animais previamente vacinados e posteriormente infectados. Com relação aos animais vacinados com DNA-Hsp65, observamos que os níveis de imunoglobulinas anti-Hsp65 do subtipo IgG2a, se mantiveram os mesmos após a infecção, enquanto que houve um pequeno aumento nos níveis de IgG1 se comparados com os níveis produzidos pelos animais somente imunizados (Figuras 12 e 19), sugerindo, nesse caso, uma mudança para um padrão misto de resposta após a infecção, com uma razão IgG1/IgG2a de aproximadamente 1. Um resultado interessante foi o demonstrado tanto pelos animais vacinados com DNA-Ag85A/Hsp65 (vacina múltipla), quanto pelos vacinados com DNA-Ag85A+Hsp65 que apresentaram uma produção significativa de anticorpos anti-Hsp65 tanto do subtipo IgG2a quanto de IgG1, fato 114 ___________________________________________________________________Discussão que não foi observado nesses animais quando foram somente imunizados (Figuras 12 e 19). A vacina múltipla, assim como a vacina DNA-Hsp65, apresentou um padrão misto de resposta, já a vacina contendo os dois antígenos mostrou uma tendência ao padrão Th1, com uma razão IgG1/IgG2a de cerca de 0,4. A produção de anticorpos por esses grupos sugere que o bacilo poderia estar funcionando como um reforço na produção dos mesmos, comprovando que a vacinação foi eficiente, gerando células B e T de memórias específicas para antígenos da micobactéria. Com relação ao grupo DNA-Ag85A os níveis de anticorpos específicos se mantiveram os mesmos, após a infecção. Porém os animais vacinados com DNAAg85A+Hsp65 tiveram uma diminuição nos níveis de IgG2a anti-Ag85A (Figura 20) se comparados com os níveis detectados antes da infecção (Figura 13). Talvez essa diminuição possa estar relacionada com o aumento nesses mesmos animais de IgG2a anti-Hsp65 (Figura 19). Como discutido acima, no caso desses animais pode estar ocorrendo uma competição antigênica, onde após a imunização houve uma priorização da resposta para o antígeno Ag85A, contudo após a infecção com o Mtb essa resposta pode ter priorizado o antígeno Hsp65, uma vez que essa é uma proteína de choque térmico produzida em grandes quantidades pelo bacilo M. tuberculosis (Lee and Horwitz, 1995), principalmente após as condições de estresse estabelecidas pelas células do hospedeiro após a infecção pelo microorganismo (Silva, 1999). O desenvolvimento de uma vacina eficiente contra a TB deve ser embasado no bom entendimento da relação patógeno-hospedeiro, nesse sentido, a avaliação do local onde se estabelece a infecção é essencial. Assim, a análise em conjunto dos resultados obtidos referentes aos ensaios de proteção como a dosagem de citocinas nos pulmões, a caracterização das células presentes no local da infecção, a contagem de UFCs, bem como a análise histopatológica, representam parâmetros importantes na caracterização do efeito profilático de uma vacina contra TB. 115 ___________________________________________________________________Discussão Em nosso modelo, foi observado que as citocinas IL-12 e IFN-γ estavam presentes nos pulmões, porém sem diferença significativa entre os grupos. Somente o grupo BCG mostrou uma diminuição nos níveis das mesmas citocinas quando comparados com os grupos controles ou mesmo com os grupos vacinados com as construções gênicas (Figura 21) e um aumento de IL-10 (Figura 22). A detecção de citocinas após processos vacinais e desafio, é extremamente conflitante, uma vez que a própria infecção interfere com a produção detectada. Assim, o fato das construções vacinais não mostrarem diferença com relação a produção de IL-12 ou IFN- γ, não exclui nem minimiza a importância das mesmas. Outros parâmetros desse trabalho devem ser levados em consideração para verificação da eficácia das vacinas. Apesar da importância da citocina IFN-γ na proteção contra TB, ela não pode estar em níveis muito altos no local da infecção, pois pode gerar uma inflamação exacerbada e conseqüente dano tecidual, portanto, a não detecção de níveis maiores de IFN-γ nos grupos imunizados com as vacinas de DNA em relação ao grupo controle pode ser considerado um bom resultado. Dados recentes do nosso grupo mostram que animais imunizados com CFP (Proteínas do Filtrado de Cultura de Mtb) mais a seqüência imunoestimulatória CpG 1826, que induziram altos níveis de IFN-γ nos pulmões dos animais infectados, não foram protetoras e também foi observado a existência de áreas de necrose nos pulmões desses animais (Fonseca et al., 2007). Além disso, segundo Florido e colaboradores (2005) o excesso de IFNγ pode levar a apoptose de clones de linfócitos T CD4+ responsivos a micobactérias (Florido et al., 2005). Nesse sentido, parece que a magnitude ou o “tamanho” da resposta Th1, considerando-se a produção de IFN-γ, não pode ser considerada como parâmetro único associado com proteção na TB. Em relação à produção da citocina IL-10, os resultados obtidos demonstraram que as diferentes construções vacinais também induziram a produção dessa citocina no pulmão, porém sem diferença significativa entre os grupos experimentais (Figura 22A). Em função das 116 ___________________________________________________________________Discussão atividades biológicas da IL-10, é importante que haja uma concentração adequada dessa citocina no local da infecção para impedir uma resposta imune exacerbada que gere danos ao parênquima pulmonar. A citocina IL-10 é produzida principalmente pelas células T e macrófagos, e regula negativamente a ação dos macrófagos e down-regula a resposta inflamatória (Moore et al., 1993). O papel da IL-10 na infecção por M. tuberculosis continua controverso, em estudos para identificação dos fatores que causam necrose em granulomas, Ehlers e colaboradores (2001) descreveram que a ausência de IL-10 acelerou a formação de focos de necrose nos granulomas, provavelmente em função do aumento na produção de IFNγ (Ehlers and Daffe, 1998). Por outro lado, a regulação negativa da resposta imune celular pode ser prejudicial para a eliminação do bacilo. Camundongos geneticamente deficientes de IL-10 apresentaram aumento da imunidade contra a micobactéria, embora o melhor controle sobre a replicação dos bacilos não estivesse associado ao aumento da produção de IFN-γ (Murray and Young, 1999). Além disso, camundongos transgênicos que expressavam níveis aumentados de IL-10 apresentaram reativação da doença (Turner et al., 2002). Para uma avaliação mais precisa do perfil de resposta imune apresentada pelos animais imunizados com as diferentes construções vacinais, foi dosada também citocina IL-4, um dos principais estímulos para o desenvolvimento de células Th2 a partir de células T CD4 naive. A análise dos níveis de IL-4 mostrou uma diminuição da produção pelos animais vacinados com DNA-Hsp65, DNA-Ag85A e DNA-Ag85A/Hsp65 se comparados com os animais injetados com salina (Figura 22B). Essa diminuição de IL-4 sugere que as vacinações com as diferentes construções, de certa forma, modularam a resposta imune desses animais para um perfil Th1, mesmo não havendo uma produção exacerbada de IFN-γ. Segundo Rook e colaboradores (2004, 2005a, 2005b), as populações dos países em desenvolvimento já possuem naturalmente uma tendência a um perfil Th2, devido à exposição a parasitas, como os helmintos, e também a micobactérias ambientais, levando a produção de 117 ___________________________________________________________________Discussão IL-4 pelo hospedeiro, e o mesmo aconteceria com os animais de experimentação (Rook et al., 2004) (Rook et al., 2005b) (Rook et al., 2005a). Assim, quando o indivíduo é infectado pela micobactéria, ocorre o desenvolvimento de uma resposta inflamatória predominantemente Th1, porém é uma resposta Th1 “corrompida”, segundo Rook (2005b), devido a presença de citocinas Th2, pois mesmo que essa resposta tenha uma elevada amplitude, a presença de IL-4 pode inibir os mecanismos microbicidas dos macrófagos, diminuindo, por exemplo, a expressão da enzima óxido-nítrico sintase (iNOS), induzindo a toxicidade do TNF-α o que poderia explicar a progressão da doença devido a necrose e fibrose. Portanto, pode ser observado nos grupos imunizados com DNA-Hsp65, DNA-Ag85A e DNA-Ag85A/Hsp65, a presença de uma resposta Th1, ressaltada principalmente pela diminuição dos níveis de IL-4. Dessa forma, uma vacina que consiga modular essa resposta predominantemente Th2, deixando agir a resposta Th1, seria muito interessante principalmente para a população dos países em desenvolvimento. Além do perfil de citocinas induzido pelas diferentes vacinações, foi avaliado também o perfil fenotípico das células presentes nos pulmões dos animais infectados. Com relação aos marcadores CD4+ e CD8+, pôde-se observar que essas células estavam ligeiramente aumentadas nos animais que foram imunizados com as construções de DNA se comparados com os animais controles. Com excessão do grupo BCG, no qual houve um aumento somente de células CD4+ (Figuras 24). Porém esse aumento no número de células T CD4+ nos grupos imunizados não se correlaciona com os dados obtidos na produção de IFN-γ, onde não houve diferença significativa na produção dessa citocina quando comparada com os grupos controles (Figura 21B). Durante a infecção, muitas células migram para o parênquima pulmonar, onde ocorre a formação de granulomas, que são formados principalmente por células T CD4+ e CD8+, bem como células B, que circundam os macrófagos contendo Mtb (Ottenhoff et al., 1998) (Kaufmann, 2003) (Flynn, 2004). Vários modelos experimentais utilizando linhagens 118 ___________________________________________________________________Discussão de animais deficientes para CD4+ (Caruso et al., 1999), eliminando-se as células CD4+ pelo uso de anticorpos monoclonais (Scanga et al., 2000) e utilizando animais deficientes de células T CD8+ ou de MCH de classe I (Orme et al., 1992) (Sousa et al., 2000) mostraram uma maior susceptibilidade desses animais a infecção. Por isso a importância da participação dessas células no local da infecção. Além disso, vale a pena relembrar que células T CD4+ ativadas, presentes no pulmão, são importantes fontes de IFN-γ, a qual irá ativar os mecanismos microbicidas dos macrófagos que por sua vez poderá eliminar o bacilo contido no seu interior. Já as células T CD8+, por sua vez, também são importantes na resposta contra o bacilo, principalmente devido a sua atividade citotóxica (Stenger and Modlin, 2002) e produção de IFN- (Serbina et al., 2000). Estudos têm sugerido que o bacilo dentro do fagossoma possa ter acesso ao citoplasma sendo, então, apresentados aos linfócitos T CD8+ via MHC de classe I (Mazzaccaro et al., 1996). Segundo Grotzke e colaboradores (2005), em humanos e camundongos infectados é possível isolar grande quantidade de células T CD8+ específicas para o Mtb indicando que essas células são estimuladas pelo bacilo constantemente (Grotzke and Lewinsohn, 2005). Do mesmo modo, foi avaliada a geração de células T CD4+ e CD8+ de memória efetora, ou seja, expressando os marcadores CD44hi e CD62Llo. A análise da figura 25 mostra que não há uma diferença expressiva no número de células T CD4+ expressando esses marcadores nos animais vacinados com as construções, somente nos imunizados com BCG, o mesmo não acontece com as células T CD8+ efetoras, onde o número entre todos os animais vacinados é aumentado. A avaliação das subpopulações que expressam o marcador CD44hi nas células T CD4+ e CD8+ foi importante, pois nos mostrou a indução de células T efetoras, sugerindo que as construções vacinais foram eficientes em ativar tais células, e esse fenótipo ativado pode induzir proteção. Tal proteção é evidenciada em nossos ensaios pela recuperação de colônias e pela análise histológica pulmonar nos diferentes modelos. 119 ___________________________________________________________________Discussão Com relação a recuperação de unidades formadoras de colônias nos pulmões dos animais infectados observou-se que todas as construções foram capazes de reduzir de forma significativa o número de bactérias no pulmão quando comparadas com os animais injetados somente com salina (Figura 26). Porém a redução geral apresentada pelos diferentes grupos de cerca de 0,85 log10 não foi maior do que a observada para o grupo imunizado com BCG, o qual apresentou uma redução de 1.7 log10. Mesmo assim, esses resultados foram considerados promissores, uma vez que BCG já é descrito ter uma maior efetividade na proteção a TB, em comparação com vacinas de DNA, em modelos murinos (Baldwin et al., 1999) (Li et al., 1999). Um outro fator que devemos levar em consideração, é que em nosso modelo, a infecção se dá por via intratraqueal e não por aerosol, dessa forma a carga bacilar que atinge o pulmão é elevada, cerca de 105 bacilos, comparada com cerca de 200 a 300 bacilos na infecção por aerosol, portanto uma redução de cerca de 0.8 log10 é bastante relevante. Além disso, no modelo de infecção intratraqueal os bacilos atingem diretamente os pulmões e no caso de aerosol, os mesmos podem atingir também o trato gastrintestinal (Rook et al., 2005b). Um resultado interessante foi o observado para os animais imunizados com a vacina múltipla (DNA-Ag85A/Hsp65), os quais reduziram a carga bacilar em cerca de 0,9 log10 na proteção, enquanto eles não apresentaram dados promissores na imunogenicidade. Isso reforça mais uma vez nossa hipótese de que essa vacina é funcional, porém não conseguimos detectar a sua eficácia por não possuirmos ferramentas adequadas para a realização dos ensaios in vitro. Outro parâmetro de grande importância analisado nesse trabalho foi a análise histopatológica do pulmão dos animais infectados. Essa análise é essencial para avaliar a eficácia de novas vacinas uma vez que a resposta inflamatória induzida pelas estratégias vacinais propostas, pode levar a uma redução não só das UFCs, mas também deve ser capaz de não comprometer o parênquima pulmonar. Nesse sentido, constatamos que a análise dos cortes histológicos apresentados pelos animais imunizados com as vacinas de DNA 120 ___________________________________________________________________Discussão apresentaram um menor comprometimento do parêquima, o que correlacionou com os dados de redução da UFC nesses mesmos grupos. Além disso, houve uma tendência de focalizar o processo de infecção com formação de granulomas (Figuras 27 e 28). A análise em conjunto dos resultados referentes à proteção demonstra que as vacinações com as diferentes construções de DNA conseguiram induzir uma resposta imune nos animais que foram infectados com Mtb, com ativação de linfócitos B de memória, evidenciado pela detecção de anticorpos específicos no soro, mesmo passados 30 dias da infecção; além disso, houve também um aumento no recrutamento de linfócitos T CD4+ e T CD8+ efetores e T CD8+ de memória (Figuras 24 e 25) os quais são extremamente importantes para a eliminação do bacilo intracelular devido a sua atividade citolítica. Com relação às citocinas produzidas, podemos dizer que as imunizações levaram a um balanço na resposta, com uma produção não muito elevada de IL-12 e IFN-γ, porém diminuição de IL-4, o que é importante, se considerarmos que os animais já têm uma predisposição a um padrão Th2 e que esta citocina pode contribuir na formação de necrose e dano tecidual. Além de IL12 e IFN-γ, também houve produção de IL-10, importante citocina, responsável por downregular a resposta inflamatória. Esse perfil de resposta gerado contribuiu para a redução, em todos os grupos vacinados, no log10 de UFC nos pulmões dos animais e também para uma maior preservação do parênquima pulmonar após infecção por Mtb, como observado pelos cortes hitologicos. Uma nova vacina contra a TB precisa exercer um efeito modulador sobre o sistema imune e não simplesmente polarizar a resposta para o perfil Th1. Sabe-se que a infecção pela micobactéria por si só é capaz de induzir uma forte reposta de padrão Th1 no início da doença, com posterior resposta mista quando a patologia se torna crônica. No entanto, como discutido anteriormente, nos países em desenvolvimento, o perfil inicial de resposta à TB é tanto Th2 como Th1 devido ao contato prévio com parasitas. Portanto, uma estratégia de 121 ___________________________________________________________________Discussão imunização contra TB deve ser capaz de modular a resposta imune de forma adequada a fim de intervir eficientemente em ambos os cenários (Rook et al., 2005b) (Rook et al., 2005a). A despeito da vacina múltipla, contendo os dois antígenos fusionados, não induzir uma boa resposta quando observamos a sua imunogenicidade, ela foi eficaz em induzir uma resposta protetora, levando a uma redução de 0,9 log10 de UFC nos pulmões dos animais infectados. Essa vacina apresentou o mesmo perfil de resposta das vacinas anteriormente descritas, com produção balanceada de citocinas e aumento de células T CD4+ e T CD8+ e também CD8+ de memória. Apesar de não possuirmos os dados de citocinas e FACs para a vacina contendo os dois antígenos separados (DNA-Ag85A+Hsp65), ela também reduziu o log10 de UFC nos pulmões dos animais infectados, quando comparada com os animais infectados e não imunizados (grupo salina). Acreditamos que o perfil de resposta induzida seja o mesmo observado para as vacinas DNA-Hsp65 e DNA-Ag85A individuais. A proteção conferida pela vacina DNA-Hsp65+Ag85A, semelhante a induzida pela vacinação com os antígenos individuais, sugere que essa estratégia de imunização pode ser uma alternativa a mais, uma vez que teríamos em uma mesma preparação dois antígenos diferentes e assim uma maior cobertura da população, devido a diversidade de HLAs existentes. O mesmo vale para a vacina múltipla, a qual contém os dois antígenos, porém fusionados. Essa estratégia parece ser a mais adequada uma vez que essa proteína de fusão pode estar fornecendo mais epitopos imunogênicos para o sistema imune, por ser gerada uma nova proteína com uma nova conformação. Além disso, devemos levar em consideração o fato de que nesse tipo de imunização é introduzido apenas um plasmídeo com os genes ao invés de dois, diminuindo assim os custos de produção e a quantidade de material genético inserido nos seres humanos. 122 123 __________________________________________________________________Conclusões 6 CONCLUSÕES Os resultados apresentados neste trabalho nos permitem concluir que: 1) A vacina múltipla DNA-Ag85A/Hsp65 foi corretamente construída, como evidenciado pelas análises de caracterização. 2) Camundongos imunizados com a vacina múltipla, assim como aqueles imunizados com as contruções individuais (administradas isoladamente ou em conjunto) foram protegidos de forma similar contra a infecção por M. tuberculosis. 3) Considerando que a vacina múltipla codifica para dois antígenos distintos e que os níveis de IL-4 foram menores nos animais desse grupo, esta construção representa uma nova alternativa para o desenvolvimento de uma vacina anti-TB. 124 ! 125 _____________________________________________________Referências Bibliográficas 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 7.1 Artigos ciêntíficos Abou-Zeid, C., Smith, I., Grange, J.M., Ratliff, T.L., Steele, J., and Rook, G.A. 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Surveillance, 1999-2002, Geneva, Switzerland. 137 Livros Grátis ( http://www.livrosgratis.com.br ) Milhares de Livros para Download: Baixar livros de Administração Baixar livros de Agronomia Baixar livros de Arquitetura Baixar livros de Artes Baixar livros de Astronomia Baixar livros de Biologia Geral Baixar livros de Ciência da Computação Baixar livros de Ciência da Informação Baixar livros de Ciência Política Baixar livros de Ciências da Saúde Baixar livros de Comunicação Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE Baixar livros de Defesa civil Baixar livros de Direito Baixar livros de Direitos humanos Baixar livros de Economia Baixar livros de Economia Doméstica Baixar livros de Educação Baixar livros de Educação - Trânsito Baixar livros de Educação Física Baixar livros de Engenharia Aeroespacial Baixar livros de Farmácia Baixar livros de Filosofia Baixar livros de Física Baixar livros de Geociências Baixar livros de Geografia Baixar livros de História Baixar livros de Línguas Baixar livros de Literatura Baixar livros de Literatura de Cordel Baixar livros de Literatura Infantil Baixar livros de Matemática Baixar livros de Medicina Baixar livros de Medicina Veterinária Baixar livros de Meio Ambiente Baixar livros de Meteorologia Baixar Monografias e TCC Baixar livros Multidisciplinar Baixar livros de Música Baixar livros de Psicologia Baixar livros de Química Baixar livros de Saúde Coletiva Baixar livros de Serviço Social Baixar livros de Sociologia Baixar livros de Teologia Baixar livros de Trabalho Baixar livros de Turismo
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