ANDERSON SOARES PIRES
ESTABILIZAÇÃO DO COMPOSTO ÓLEO LUBRIFICANTE
SINTÉTICO X Salvinia sp.
CANOAS, 2007
ANDERSON SOARES PIRES
ESTABILIZAÇÃO DO COMPOSTO ÓLEO LUBRIFICANTE
SINTÉTICO X Salvinia sp.
Trabalho de conclusão de curso
apresentado ao Curso de Graduação em
Ciências Biológicas – Bacharelado como
exigência parcial para a obtenção do grau
de Bacharel em Ciências Biológicas, sob
orientação do Prof. Ms. Giovani André
Piva.
CANOAS, 2007
2
TERMO DE APROVAÇÃO
ANDERSON SOARES PIRES
ESTABILIZAÇÃO DO COMPOSTO ÓLEO LUBRIFICANTE
SINTÉTICO X Salvinia sp.
Trabalho de conclusão aprovado como requisito parcial para a obtenção do grau de
Bacharel em Ciências Biológicas do Centro Universitário La Salle – Unilasalle, pelo
avaliador:
Prof. Ms. Giovani André Piva
Unilasalle
Canoas, 13 de julho de 2007.
3
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador e amigo, Prof. Ms. Giovani André Piva pelo constante
incentivo, sempre indicando a direção a ser tomada nos momentos de maior
dificuldade. Agradeço, principalmente, pela confiança, mais uma vez depositada.
A todos os professores, funcionários, colegas e todos aqueles que, direta ou
indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho, dando-me força e
incentivo, em especial a colega Karina Minozzo.
À Agnes pelo apoio incondicional, paciência, compreensão, incentivo em todos
os momentos, e principalmente por me fazer acreditar que no final tudo dá certo.
Aos meus pais, Adão Jair S. Pires e Marinês Pires, fica a minha consideração e
reconhecimento, por serem pessoas imprescindíveis, insubstituíveis em minha vida e
por estarem sempre ao meu lado.
4
RESUMO
Com o intuito de dar uma solução para um destino “ecologicamente correto”, ao resíduo
fruto da aplicação do pó da macrófita aquática Salvinia sp. em ambientes contaminados
por óleo lubrificante usado (OLU), buscou-se através de biorremediação, aplicando
técnica de bioenriquecimento, estimular a fixação do poluente no húmus, buscando a
atoxidade do óleo no solo. Para isso, uma coleção de culturas de fungos foi elaborada
atrás da cepa com maior capacidade de realizar a tarefa, meio de cultura alternativo
contendo soro de queijo foi utilizado para diminuir gastos e propor uma alternativa para
este efluente. O composto OLU x Salvinia sp. foi elaborado a partir da mistura do óleo
com o pó de Salvinia obtido por secagem a 60 °C e posterior moagem, nas proporções
de 1:1 e 5:1. Para o experimento, foram adicionados ao composto, 240 g de solo e
cultivares de Pisolithus tinctorius previamente elaborados. O tratamento se realizou
durante trinta dias, ao final, bioensaios com Lactuca sativa (alface) demonstraram que
foi possível, através da metodologia aplicada, a estabilização da amostra contendo 10 g
de óleo (ensaio 1), porém o mesmo sucesso não se obteve com 50 g de óleo (ensaio
2).
Palavras-chave: bioenriquecimento, Pisolithus tinctorius, bioensaio, podridão branca.
5
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...............................................................................................................6
2 BIORREMEDIAÇÃO......................................................................................................9
2.1 Bioenriquecimento..................................................................................................10
3 FUNGOS......................................................................................................................12
3.1 Fungos Filamentosos.............................................................................................12
3.2 Fungos de Podridão Branca...................................................................................13
3.3 Exigências nutricionais..........................................................................................14
4 SUBSTÂNCIAS HÚMICAS..........................................................................................16
5 METODOLOGIA..........................................................................................................17
5.1 Escolha das espécies.............................................................................................17
5.1.1 Análise estatística..................................................................................................18
5.2 Ensaio com o composto OLU................................................................................18
5.3 Avaliação da toxicidade do solo com sementes de Lactuca sativa...................19
5.3.1 Análise estatística...................................................................................................19
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................................20
6.1 Seleção das cepas fúngicas...................................................................................20
6.1.1 Análise estatística da comparação de ganho de biomassa...................................20
6.2 Aplicação no composto Salvinia X Óleo lubrificante usado...............................22
6.3 Teste de Toxicidade................................................................................................23
6.3.1 Análise estatística do teste de toxicidade...............................................................23
7 CONCLUSÕES............................................................................................................26
REFERÊNCIAS...............................................................................................................27
APÊNDICE A - Batata dextrose ágar (BDA)...................................................................30
APÊNDICE B - Meio de cultura batata dextrose ágar resorcinol (BDAR).......................31
APÊNDICE C – Meio de cultura peptona dextrose (PD).................................................32
APÊNDICE D - Meio de cultura Soro de Queijo..............................................................33
6
1 INTRODUÇÃO
O descarte indiscriminado de óleo lubrificante em sistemas hídricos pode trazer
inúmeros danos à natureza e em conseqüência à humanidade.
O óleo lubrificante é um derivado do refino do petróleo composto por substâncias
aromáticas que podem causar nos seres vivos intoxicação, hemorragia de órgãos
internos, complicações circulatórias, dermatites, tumores e até incorporação no tecido
adiposo, por bioacumulação (processo através do qual os seres vivos absorvem e
retêm substâncias químicas no seu organismo), em animais marinhos filtradores. Pode,
inclusive, contaminar o leite materno de mamíferos (DOMINGUES; BIDOIA, 2006,
p.71).
O consumo anual de óleo lubrificante no Brasil, é de cerca de 900.000 m³, o que
gera 250 a 300.000 m³ de óleo usado, sendo re-refinado apenas 110.000 m³. O
restante é geralmente despejado diretamente na natureza ou queimado (LOPES;
BIDOIA, 2005, p.47).
Embora o óleo lubrificante usado represente uma porcentagem ínfima do lixo, o
seu impacto no ambiente é muito grande, principalmente nos corpos d’água. Conforme
Bidoia e Domingues (2004, p.302) 1 litro de OLU polui 1 milhão de litros de água,
formando, em alguns dias, uma fina camada sobre a superfície de 1.000 m² que
bloqueia a passagem da luz e de ar, resultando no esgotamento do oxigênio na água,
devido a respiração dos microrganismos, dos animais e das plantas.
A poluição por OLU no solo também é muito grave, pois pode afetar diretamente
a comunidade dos organismos do solo devido ao efeito tóxico dessas substâncias, que
pode causar mudanças no metabolismo, crescimento, desenvolvimento, longevidade e
7
alterações genéticas. Podem ocorrer, também, alterações no equilíbrio ecológico do
solo, como mudanças nas relações entre presa e predador, modificando toda a teia
alimentar e impactando as funções dos ecossistemas terrestres (EDWARDS apud
MORAIS, 2005, p.7).
A presença do poluente no solo representa também, risco potencial para as
águas subterrâneas e superficiais, devido aos processos de erosão e lixiviação que os
solos estão sujeitos (MORAIS, 2005, p.7).
Muitas técnicas são usadas para remediar ambientes contaminados por óleos,
entre elas, métodos físicos e químicos, como barreiras de contenção, aparelhos de
sucção, absorventes e outros (CRAPEZ et al., 2002, p.34), todavia, a recuperação
mecânica do óleo por sorventes é uma das respostas ao derramamento mais utilizadas
(RIBEIRO; RUBIO, apud ANNUNCIADO, 2005, p.1).
Os materiais sorventes como a biomassa processada de algumas plantas
aquáticas, podem estar disponíveis na forma de particulados secos ou empacotados
em forma de barreiras, travesseiros, mantas e almofadas. O uso de cada formato
disponível para estes mesmos sorventes, varia conforme a situação do derramamento,
ou seja, sorventes na forma de almofadas e travesseiros são aplicados em
derramamentos terrestres, enquanto que os mesmos materiais sorventes em forma de
mantas e barreiras são recomendados para recuperação em corpos hídricos
(ANNUNCIADO, 2005, p.1).
A grande maioria dos sorventes comerciais industriais, atualmente disponíveis no
mercado,
são
importados
e
caros.
Vários
sistemas
comerciais
vêm
sendo
desenvolvidos para o controle desses derramamentos, incluindo o uso de fibras
vegetais como sorventes, como é o caso do uso da macrófita aquática Salvinia sp.
(ANNUNCIADO, 2005, p.3).
O problema de utilizar sorventes em locais contaminados por óleo é que esta
técnica é baseada na simples extração do contaminante do ambiente. O destino final do
resíduo óleo x sorvente, geralmente, é a inadequada disposição em aterros sanitários
ou a incineração que, segundo Ururahy et al. (apud MORAIS, 2005, p.2.), pode, além
de poluir o ar, possuir a ameaça da persistência de hidrocarbonetos poliaromáticos.
8
Camilo et al. (2003, p.6) afirmam que o processo de incineração, no Brasil, tem o
conceito de poluidor, prejudicial ao meio ambiente e nocivo à saúde, além disso, a
incineração possui um custo elevado, exige mão-de-obra qualificada e apresenta
problemas operacionais.
A solução proposta neste trabalho é dar um destino, ecologicamente correto,
para o resíduo resultante da aplicação da macrófita aquática Salvinia sp. em ambientes
contaminados por OLU. Para isso, desenvolveu-se uma metodologia, na qual, utilizouse um processo de biorremediação, ou seja, uma estimulação de processos naturais,
através do uso de microrganismos, com o objetivo de estimular a fixação do composto
OLU x Salvinia sp. no húmus.
Os microrganismos são os principais responsáveis pela conversão dos
elementos químicos carbono, nitrogênio, oxigênio, enxofre e fósforo em formas que
podem ser utilizadas pelas plantas e pelos animais, também, desempenham um papel
essencial no retorno do dióxido de carbono para a atmosfera quando decompõem
detritos orgânicos, plantas e animais mortos (TORTORA et al. 2000, p.16).
Os organismos escolhidos para a investigação foram fungos filamentosos de
podridão branca, pois, a função destes organismos na natureza é o decaimento das
fibras vegetais ricas em lignina, o que justifica o grande uso deles em estudos de
biorremediação de águas e solos contaminados por substâncias xenobióticas com
estrutura semelhante à dos lignocompostos.
Uma vez que se sabe, através de literatura, o poder de degradação da matéria
orgânica vegetal e de derivados do petróleo por fungos filamentosos de podridão
branca, pode ser montada a hipótese de que a mistura destes dois elementos, também
pode ser degradada de maneira eficiente por estes microrganismos.
9
2 BIORREMEDIAÇÃO
O tratamento de efluentes fenólicos por meios físicos e químicos convencionais
é, geralmente, inviável pelo alto custo (BOMAN et al. apud PIVA, 2005, p.252). A
detoxificação destes efluentes produzidos pelas indústrias de conversão de carvão, de
corantes e têxtil, de polpa e papel e petroquímica, entre outras, é necessária devido à
toxidez para mamíferos, aves e peixes. Métodos biológicos têm sido considerados
como alternativa (BOLLAG et al. apud PIVA, 2005, p.252).
Alguns microrganismos têm a capacidade de metabolizar ou processar
quimicamente substâncias como: metais pesados, enxofre, gás nitrogênio, petróleo,
mercúrio, etc, pois eles são capazes de utilizar poluentes como fonte de energia, ou
podem produzir enzimas que convertem toxinas em substâncias menos nocivas. A
utilização deste processo é conhecida como biorremediação (TORTORA, 2000, p.17).
A transformação de um composto orgânico em outro composto com estrutura
molecular diferente, ocorrendo a perda de alguma propriedade característica da
substância inicial, se denomina biotransformação (MORAIS, 2005, p.8).
A tecnologia de biorremediação usa, com o intuito de remover poluentes, o
potencial fisiológico de microrganismos, pois eles são capazes de transformar petróleo
e seus derivados em biomassa, água, dióxido de carbono e outros compostos.
(CRAPEZ et al., 2002, p. 36).
O processo de biorremediação é uma metodologia atrativa e confiável para o
tratamento de solos e cursos d´água contaminados, considerada muito eficiente, além
de econômica, versátil e principalmente por causar uma menor perturbação ao
10
ambiente, já que é um sistema de estimulação de processos naturais de remediação
(CORSEUIL et al., 1997, p.51).
A biorremediação ocorre naturalmente, até certo ponto, se as condições forem
aeróbicas. Porém, os microrganismos geralmente obtêm seus nutrientes em solução
aquosa, e produtos à base de óleo são relativamente insolúveis, o que dificulta o
processo natural. Além disso, hidrocarbonetos de petróleo são deficientes em
elementos essenciais como nitrogênio e fósforo. A aplicação desses elementos em uma
biorremediação de derramamentos de óleo melhora bastante a camada subsuperficial,
porém, sob as camadas superficiais, onde as condições são anaeróbicas, o óleo
freqüentemente permanece por períodos mais longos (TORTORA, 2000, p.772).
A aplicação de biorremediação em ambientes contaminados multiplica a
capacidade de depuração do ambiente, além de permitir o restabelecimento da vida
animal e vegetal e o mapeamento de áreas de risco. (CRAPEZ et al., 2002 p.37).
Em um processo de biorremediação podem ser utilizados microrganismos
nativos ao ambiente ou pode ser feita a introdução de novos organismos que foram
selecionados para se desenvolverem em certos poluentes. A adição desses micróbios
especializados é denominada bioaumento (TORTORA, 2000, p.772).
No presente trabalho são realizados experimentos de biorremediação com
técnicas de bioenriquecimento para investigar se a hipótese levantada é viável.
2.1 Bioenriquecimento
Em ambientes contaminados, os micróbios degradadores do poluente e os não
degradadores convivem juntos, de uma forma em que a depuração natural se mantém
lenta demais. Bioenriquecimento (ou bioaumento) é a inoculação de microrganismos
exógenos (de outro ecossistema) com o objetivo de acabar com o equilíbrio
(homeostase) entre as colônias nativas (FURTADO, 2001, p.3). O bioenriquecimento é
o processo responsável pela multiplicação dos microrganismos em laboratório, visando
incrementar a capacidade biodegradadora quando aplicados nas áreas poluídas. Após
serem multiplicados, microrganismos específicos com habilidades catalíticas desejáveis
para a degradação do poluente, são introduzidos no meio para competir por energia e
11
alimento com as colônias não degradadoras e para ajudar as efetivas na
metabolização, causando assim o desequilíbrio do ambiente natural. (FURTADO, 2001,
p. 3); (BALBA et al. apud MORAIS, 2002, p.15).
Outro processo compartilha este objetivo, a bioestimulação, porém consiste no
controle de fatores abióticos para que ocorra o aumento da taxa de biodegradação do
poluente por microrganismos endógenos, seja adição de nutrientes inorgânicos
(normalmente nitrogênio e fósforo), aceptores de elétrons (oxigênio) ou substratos
orgânicos (BALBA et al., apud MORAIS, 2002, p.16).
Esta técnica foi escolhida, pois a hipótese é utilizar (adicionar) fungos
filamentosos de podridão branca no poluente, isto porque, segundo Piva (2005, p.251)
estes fungos são grandes produtores de lacase, uma enzima da classe das
fenoloxidases, cuja função é degradar a lignina, polímero complexo de compostos
aromáticos muito resistente a degradação encontrado na madeira. Compostos
semelhantes aos resultantes da quebra da lignina são encontrados em alguns efluentes
industriais.
12
3 FUNGOS
Os fungos obtêm sua alimentação a partir da matéria orgânica inanimada ou
nutrindo-se como parasitas de hospedeiros vivos. São importantes na cadeia alimentar
porque atuam como saprófitas, decompõem resíduos complexos de plantas e animais,
transformando-os em formas químicas mais simples, que retornam ao solo, reciclando
desta forma elementos vitais. Tais substâncias são, então, absorvidas por vegetais.
Desse modo, a atividade fúngica é amplamente responsável pela fertilidade do solo
(PELCZAR et al., 1980 p.61).
Através da parede celular é que todos os nutrientes são absorvidos e todos os
produtos em excesso ou residuais são excretados. Os substratos devem primeiro ser
degradados a uma forma na qual possam ser absorvidos através da parede celular. É
através da ação de suas enzimas que os fungos decompõem as partes duras das
plantas e algumas destas enzimas são produzidas em quantidades consideráveis
extracelularmente (NOBLE; NAIDOO, 1981, p.1).
3.1 Fungos Filamentosos
Quando cultivados em meios adequados, ou seja, com condições e nutrientes
necessários para o crescimento desses, muitos fungos produzem longos filamentos
ramificados. Estes fungos são comumente denominados filamentosos, cada filamento é
uma hifa (JAWETZ et al., 1984, p.270).
As hifas crescem por alongamento das extremidades. Cada parte de uma hifa é
capaz de crescer, e quando um fragmento é quebrado, esse pode se alongar para
13
formar uma nova hifa. Em laboratório, os fungos geralmente crescem a partir de
fragmentos obtidos de um talo do fungo (TORTORA et al., 2000, p.335).
Quando as condições ambientais são favoráveis, as hifas crescem formando
uma massa filamentosa chamada de micélio (visível a olho nu) (TORTORA et al., 2000,
p.336).
O micélio fica imerso em matéria orgânica em decomposição, no solo ou nos
tecidos de organismos vivos, suas células liberam enzimas que digerem o substrato e
absorvem pequenas moléculas que servem como nutrientes (BLACK, 2002, p.256).
Este tipo de fungo, há muito tempo, vem sendo utilizado em biotecnologia,
engenharia genética e no controle biológico de pragas (TORTORA et al., 2000, p.335) e
segundo RISER-ROBERTS (apud KATAOKA, 2000, p.64) fungos filamentosos são
mais hábeis em degradar ou transformar hidrocarbonetos de estrutura complexa e de
cadeia longa do que bactérias.
3.2 Fungos de Podridão Branca
Os fungos responsáveis pela decomposição da lignina, chamados fungos de
podridão branca devido à cor que a madeira adquire após sua atuação (PIVA, 2005,
p.251), são os que apresentam um maior potencial de aplicação biotecnológica. A
podridão branca resulta numa madeira que pode se desintegrar até uma consistência
fibrosa, devido ao ataque da lignina e celulose (NOBLE; NAIDOO, 1981, p.35).
Conforme Yateem et al. (apud MORAIS, 2002, p.10) fungos de podridão branca
podem ser utilizados nos processos de biorremediação devido a sua capacidade em
degradar compostos que não são facilmente utilizados por bactérias, isto é devido à
produção de enzimas extracelulares conhecidas como peroxidases e lacases, que são
responsáveis pela quebra da lignina.
A lignina não tem definição de estrutura química, apresentando muitos anéis
aromáticos. A variação da estrutura química da lignina se modifica devido a espécie
vegetal e as mudanças ambientais, o que provoca também, mudanças de vários tipos
nas próprias madeiras. Desse modo, as enzimas ligninolíticas não apresentam
especificidade de substrato para poderem decompor a molécula de lignina. Sendo
14
assim, podem atacar compostos orgânicos poluentes que apresentam estrutura química
semelhante a da lignina, graças a essa inespecificidade. Na natureza os fungos
degradam a lignina para alcançarem a celulose, sua principal fonte de alimento
(HIGUCHI, Apud FASANELLA, 2005, p.41).
Em processos de oxidação de muitos compostos (principalmente de compostos
fenólicos) a lacase apresenta uma grande especificidade para um grande número de
efluentes industriais (PIVA, 2005, p.251). Alguns fungos de podridão branca como:
Trametes versicolor (Linnaeus ex Fries) Pilát e Pycnoporus sanguineus (Linnaeus ex
Fries) Murrill, espécies comuns no Rio Grande do Sul, são conhecidos por degradar
vários tipos de corantes têxteis. Estes fungos possuem a capacidade de mineralizar
(transformar até água e CO2), uma variedade de poluentes resistentes à degradação
(ESPOSITO et al, 2004, p.341).
3.3 Exigências nutricionais
Os fungos são organismos que usam moléculas orgânicas como fonte de
carbono e energia e assim como as bactérias, absorvem nutrientes ao invés de ingerilos, como fazem os animais (TORTORA et al., 2000, p.338). A absorção é auxiliada por
enzimas secretadas no meio, que quebram as moléculas orgânicas em porções
menores que podem ser transportadas mais facilmente para dentro da célula.
(PELCZAR et al., 1996, p.153). Essas características permitem que os fungos se
desenvolvam em diversos substratos.
A determinação da fonte de nitrogênio é essencial para o processo de
biorremediação, pois o nitrogênio está intimamente relacionado ao metabolismo dos
microrganismos. Além disso, para que 100 unidades de carbono sejam degradadas,
são necessárias em média, de 3 a 4 unidades de nitrogênio (PUTZLE, 2002, p.630).
O carbono, também, é um dos elementos mais importantes para o crescimento
microbiano. Ele é essencial para a síntese de todos os compostos orgânicos
necessários para a viabilidade celular, sendo considerado o elemento estrutural básico
para os seres vivos (TORTORA et al., 2000, p.159).
15
O oxigênio é um fator decisivo para se iniciar e se sustentar uma biorremediação
(CRAPEZ et al., 2002, p.34), além disso, há outros elementos que são essenciais para
o crescimento celular, como o enxofre e o fósforo. (TORTORA et al., 2000, p.159).
Os fungos de podridão branca não são exigentes quanto ao meio de cultura,
podendo ser cultivados em rejeitos industriais que apresentem os nutrientes
necessários (PIVA, 2005, p.251). Piva (1994, p.59) demonstrou ser viável a utilização
do soro de queijo como meio de cultivo para fungos de podridão branca, tendo como
resultados ganhos de biomassa superior aos meios de culturas usualmente utilizados
em estudos de biorremediação. O soro de queijo possui de 4 a 5% de lactose, além de
proteínas, ácidos orgânicos, vitaminas e sais minerais (K, P, Ca, Mg e Na) (NITSCHKE
apud PIVA, 1994, p.17). A lactose serve como fonte de carbono na produção de
fenoloxidases por fungos de podridão branca (SANDHU; ARORA apud PIVA, 1994,
p.17). A grande vantagem na utilização do meio de cultura contendo soro de queijo é o
baixo custo e por ser um resíduo industrial, torna-se saudável ao ambiente reutilizá-lo.
16
4 SUBSTÂNCIAS HÚMICAS
Caracteristicamente, a matéria orgânica do solo é de origem vegetal, contendo
lignina, celulose, carboidratos e substâncias húmicas (PIVA, 1994, p.4). As substâncias
húmicas são formadas pela decomposição microbiana de plantas e substâncias
animais, transformando a matéria orgânica em substâncias quimicamente estáveis
(LARCHER, 2000, p.9; EMBRAPA, 2004). Segundo Rocha et al. (2004, p.125) as
substâncias húmicas possuem estrutura química complexa, compondo um grupo de
compostos heterogêneos. Elas representam a principal forma de matéria orgânica
distribuída no planeta. São encontradas em solo, águas naturais, pântanos, turfas,
sedimentos aquáticos e marinhos.
A fase de transformação da matéria orgânica em substâncias húmicas é
denominada fase de humificação (Ambiente Brasil, 2006). Segundo Larcher (2000, p.9),
onde a matéria orgânica e o húmus se decompõem mais lentamente a planta se adapta
para um crescimento mais lento. A transformação da matéria orgânica do solo em
substâncias húmicas permite que os microrganismos liberem, lentamente, os nutrientes
do húmus que são utilizados pelas raízes das plantas, pois o húmus é um tipo de
matéria orgânica mais resistente à decomposição pelos microorganismos (AMBIENTE
BRASIL, 2006).
Piva (1994, p.56) cita diversos autores que descreveram a estabilização de
fenóis tóxicos mediada pela lacase através da ligação a ácidos húmicos, determinando
assim, a importância que os fungos de podridão branca têm na formação da parte
orgânica do solo.
17
5 METODOLOGIA
A coleta de corpos frutificativos de fungos macroscópicos, juntamente com
amostras de micélio e a observação de seus comportamentos no ambiente natural para
o registro de dados, com fins de coleção, foi realizada na Quinta São José, propriedade
lassalista localizada em Nova Santa Rita/RS. A coleta do corpo frutificativo juntamente
com a amostra do micélio é fundamental, pois é principalmente nele que está baseada
a taxonomia dos fungos macroscópicos. A coleta e a classificação taxonômica seguiram
conforme recomendado por (GUERRERO; HOMRICH, 1983, p.19).
A coleção de culturas foi realizada com o meio BDA (Batata-Dextrose, Ágar –
Apêndice A), onde foram inoculados os micélios fúngicos coletados. Após sete dias de
cultivo, as culturas foram repicadas para meio BDAR (Apêndice B) contendo resorcinol
a 5% (indutor de fenoloxidases).
Antes de ser incorporado à coleção, cada corpo frutificativo passou por um
processo de secagem em estufa a temperatura de 40°C durante 3-5 dias dependendo
das condições.
Uma vez identificados os fungos, preparadas e armazenadas as culturas e
frutificações, foram incorporadas à coleção científica de fungos macroscópicos, que se
encontra no Museu de Ciências Naturais do Unilasalle, juntamente com seus dados de
coleta.
5.1 Escolha das espécies
Depois de sete dias de cultivo, foram realizadas observações e a verificação do
18
crescimento das culturas com o objetivo de concluirmos quais as espécies com maior
potencial na produção de fenoloxidases. Esta seleção foi feita qualitativamente de
acordo com o teste de Bavendamm, com modificações (PIVA, 1994, p.29).
O teste de Bavendamm consiste na alteração de cor do meio de cultura, esta
troca de cor demonstra que no meio há fenoloxidases ativas, através dele foram
classificados qualitativamente os produtores de fenoloxidases, assim como proposto por
Silveira e Guerrero (apud PIVA, 1994, p.37). Os melhores produtores foram
selecionados pela avaliação da intensidade da cor âmbar, característica da reação,
assim como realizado por Conceição et al. (2005, p.103), as espécies selecionadas
foram cultivadas em meio PD (Peptona Dextrose – Apêndice C) para comparação do
ganho de biomassa.
Para iniciar o cultivo líquido foram inoculados discos de 1cm de diâmetro de
cultura em meio BDA em Frascos de Erlenmeyer de 500 ml de capacidade, contendo
250 ml de meio PD. As culturas foram incubadas durante 21 dias a 28°C com
amostragens a cada 7 dias. As amostragens consistiram na filtragem em filtro para café
no 102, marca Mellita, para obtenção do micélio fresco. Para a pesagem e cálculo do
crescimento micelial, o micélio foi seco por 24 h em estufa marca De Leo a 40°C.
Após a escolha da espécie, a mesma foi cultivada em meio soro de queijo (MSQ
– Apêndce D) para ser aplicada ao composto OLU x Salvinia sp.
5.1.1 Análise estatística
Os resultados do experimento comparativo entre ganhos de biomassa entre
diferentes espécies, foram submetidos á análise de variância ANOVA para fator único,
com grau de significância de 5%, com auxílio do software Microsoft Excel.
5.2 Ensaio com o composto OLU
O composto OLU x Salvinia sp. foi recebido dos experimentos com adsorção
deste tipo de óleo por Salvinia sp. realizado pela colega Karina Minozzo em seu
trabalho de conclusão de curso. Foram recebidas amostras de 10 g de pó de Salvinia
19
sp. lavada secada e moída contendo 10 e 50 g de óleo cada amostra para ensaio,
foram adicionadas em garrafas PET de 2 L, as culturas fúngicas em 240 g de solo
(cinzas, turfa, húmus de minhoca) e amostra de composto OLU x Salvinia. Os
experimentos foram realizados com controle sem inóculo.
Após 30 dias de tratamento, as garrafas foram mantidas invertidas em suporte
universal, com a tampa aberta, para escoamento da parte líquida.
5.3 Avaliação da toxicidade do solo com sementes de Lactuca sativa
O método empregado baseou-se em bioensaios conforme descrito em Duka
(apud MONTEIRO et al., 2002, p. 05). Após o tratamento de 30 dias, foi adicionada
água mineral a cada garrafa plástica contendo solo, na proporção 4:1 de água mineral e
solo. O material foi deixado para sedimentar por 24 horas, ao final das quais, foi retirado
o sobrenadante. Essa solução foi utilizada sem diluição para regar as sementes de
Lactuca sativa. Placas de Petri contendo papel filtro receberam 5 ml desta solução e 10
sementes de L. sativa. Para cada solução foram utilizadas seringas distintas para evitar
a contaminação de uma amostra na outra. Foram feitas duas réplicas, inclusive para o
controle. Em seguida, as placas foram envoltas com folha de alumínio e incubadas para
exposição de 120 horas. Terminado o teste, as plântulas foram medidas com auxílio de
régua.
5.3.1 Análise estatística
Os resultados do experimento de toxicidade foram submetidos á análise de
variância ANOVA para fator único, com grau de significância de 5%, com auxílio do
software Microsoft Excel.
20
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1 Seleção das cepas fúngicas
Foram coletados fungos de diferentes espécies como Geastrum sp., Picnoporus
sanguineus, Lentinus crinitus, Coprinus sp.,Macrolepiota bonaerensis, Marasmius spp.,
Polyporus sp., Cymatoderma caperatum, Pisolithus tinctorius, Ganoderma applanatum,
Trametes versicolor, Trametes villosa, Gymnopilus pampeanus, Amanita muscaria,
Schizophyllum commune, Auricularia fuscosuccinea e outras. Todas passaram pela
reação de Bavendamm, porém as que apresentaram resultados mais atraentes foram
Picnoporus sanguineus e Pisolithus tinctorius, pois foram as culturas que apresentaram
uma maior alteração de cor depois da aplicação de indutor para fenoloxidases na
cultura.
6.1.1 Análise estatística da comparação de ganho de biomassa
As tabelas 1, 3 e 5 fornecem o peso seco obtido de cada amostragem nos
seguintes períodos: 7, 14 e 21 dias, respectivamente. As tabelas foram submetidas a
análise de variância ANOVA determinando que a variação dentro de cada amostragem
ocorreu devido à fatores aleatórios.
Os dados da tabela 2 indicam que na amostragem de 7 dias o ganho de
biomassa entre as duas espécies apresentaram médias equivalentes, para significância
de 5%. O mesmo não ocorreu nas amostragens de 14 e 21 dias, onde Pisolithus
21
tinctorius apresentou um ganho de biomassa superior a significância de 5%, conforme
mostra as tabelas 4 e 6.
Tabela 1 - Comparação do ganho de biomassa após 7 dias, em meio PD líquido.
Peso seco em gramas.
P. sanguineus P. tinctorius
7 dias
0,35
0,61
0,42
0,68
0,33
MÉDIA
0,37
0,65
Tabela 2 – Análise ANOVA para um fator das amostras P. tinctorius e P. sanguineus
após 7 dias.
Fonte da
variação
Entre grupos
Dentro dos
grupos
Total
SQ
0,062016667
gl
0,00405
0,066066667
MQ
F
valor-P
F crítico
1 0,062016667 15,3127572 0,159278387 161,4476387
1
2
0,00405
Tabela 3 - Comparação do ganho de biomassa após 14 dias, em meio PD líquido.
Peso seco em gramas.
P. sanguineus P. tinctorius
14 dias
0,68
1,43
0,45
1,12
0,52
1,11
MÉDIA
0,55
1,22
Fonte: Autoria própria
Tabela 4 – Análise ANOVA para um fator das amostras P. tinctorius e P. sanguineus
após 14 dias.
Fonte da
SQ
variação
Entre grupos
0,3969
Dentro dos
grupos
0,0025
Total
0,3994
Fonte: Autoria própria
gl
1
MQ
0,3969
2 0,00125
3
F
valor-P
F crítico
317,52 0,003134607 18,51282051
22
Tabela 5 - Comparação do ganho de biomassa após 21 dias, em meio PD líquido.
Peso seco em gramas.
P. sanguineus P. tinctorius
21 dias
0,60
1,26
0,57
1,18
0,54
1,39
0,57
1,28
MÉDIA
Fonte: Autoria própria
Tabela 6 – Análise ANOVA para um fator das amostras P. tinctorius e P. sanguineus
após 21 dias.
Fonte da
variação
SQ
Entre grupos
0,5329
Dentro dos
grupos
0,0225
Total
0,5554
Fonte: Autoria própria
gl
1
MQ
F
valor-P
F crítico
0,5329 47,36888889 0,020465081 18,51282051
2 0,01125
3
Este resultado motivou a escolha da espécie P. tinctorius a ser aplicada ao
composto OLU x Salvinia sp.
Como o presente trabalho constituiu-se de biorremediação de solos, um fator que
pesou na decisão de qual espécie a ser utilizada, foi o fato de Pisolithus tinctorius ser
uma espécie encontrada no solo, geralmente associada a vegetais superiores em forma
de micorriza, conforme (KRÜGNER; TOMAZELLO FILHO, 1980, p.42). É provável que
ela tenha mais afinidade com o solo do que Picnoporus sanguineus, pois, segundo
(GUERRERO; HOMRICH, 1983, p.51) é uma espécie comumente encontrada em
troncos de árvores, com frutificação em formato de “orelha-de-pau”.
6.2 Aplicação no composto Salvinia X Óleo lubrificante usado
O fungo escolhido foi, então, cultivado em MSQ durante 14 dias, antes da
aplicação no composto Salvinia X OLU. Após os sete primeiros dias da inoculação do
fungo no composto, observou-se uma grande massa micelial que envolveu todas as
amostras. Uma amostra desta massa micelial foi cultivada em meio BDA (Batata,
Dextrose, Ágar). Ao mesmo tempo, uma cultura de P. tinctorius foi repicada também
23
para meio BDA. Após cinco dias, observaram-se os cultivos e se verificou visualmente
que se tratava da mesma espécie, o que demonstra que quem atuou no composto foi P.
tinctorius realmente. Assim, se pode descartar a hipótese de uma contaminação por
outra espécie que pudesse ter inibido a ação da espécie investigada.
6.3 Teste de Toxicidade
6.3.1 Análise estatística do teste de toxicidade
A tabela 7 fornece as medidas obtidas nas amostras Controle, e adicionadas de
10 g e 50 g de OLU. A tabela foi submetida a análise de variância ANOVA
determinando que a variação dentro de cada amostragem ocorreu devido à fatores
aleatórios.
Os dados da tabela 8 indicam que a amostra com concentração de 10 g de OLU
apresentou médias de crescimento equivalente, para significância de 5%. Pôde-se
observar que as médias de crescimento mantiveram-se semelhante ao controle. O
mesmo não ocorre quando o controle é comparado a amostra com concentração de 50
g de OLU, conforme tabela 9.
Tabela 7 – Tamanho em cm das plântulas de alface (L. sativa) regadas com água
mineral após contato de 24 horas aos compostos.
Amostra
Controle
10 g
50 g
1
3,4
5,9
7,4
5,4
5,7
5,7
5,2
5,8
6,2
4,9
5,7
6,9
4,7
5,8
5,4
5,7
5,9
4,9
5,6
5,4
5,4
5,7
5,5
5,8
5,1
5,4
3,7
4,1
4,4
2,8
3,7
4,2
2,9
4,1
4,1
2,5
3,8
4,3
4,3
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
24
5,4
6,8
5,2
5,7
6,8
4,9
9,3
5,6
5,0
5,7
6,4
5,3
3,4
6,3
2,2
4,4
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
5,7
4,9
5,2
5,8
5,3
4,8
4,9
4,9
3,9
5,5
5,4
3,9
5,5
5,4
5,3
30
5,56
MÉDIA
Fonte: Autoria própria
5,29
3,7
4,1
3,7
3,5
4,8
3,8
3,6
4,8
4,1
4,0
4,2
4,4
4,1
3,9
4,6
3,5
3,6
3,91
Tabela 8 – Análise ANOVA para um fator da amostra Controle comparada com amostra
com 10 g de OLU.
Fonte da
SQ
variação
Entre grupos
1,908487013
Dentro dos
grupos
50,04678571
Total
51,95527273
Fonte: Autoria própria
gl
MQ
F
valor-P
F crítico
1 1,908487013 2,021105057 0,160984266 4,023016811
53 0,944278976
54
Tabela 9 – Análise ANOVA para um fator da amostra Controle comparada com amostra
com 50 g de OLU.
Fonte da
SQ
variação
Entre grupos
42,24446655
Dentro dos
grupos
51,76816502
Total
94,01263158
Fonte: Autoria própria
gl
MQ
F
valor-P
F crítico
1 42,24446655 44,88174652 1,17139E-08 4,016195438
55 0,941239364
56
25
A diminuição da toxicidade ocorreu, possivelmente, porque as enzimas fúngicas
agiram sobre o óleo, isto se deve ao fato do óleo possuir, em sua composição,
substâncias aromáticas semelhantes ao da lignina encontrada nas paredes das células
vegetais.
A técnica de bioaumento utilizada neste trabalho foi fundamental, pois trouxe
resultados mais positivos do que trabalhos semelhantes sem a utilização da técnica,
como nos trabalhos de Domingues et al. (2006, p.71) que ao investigar a
biodegradabilidade de OLU, sem bioenriquecimento, somente bioestimulação, obteve
como resultado a diminuição da toxicidade do solo somente após 60 dias de tratamento
e Lopes et al. (2005, p.47) utilizando meio aquoso, também sem bioenriquecimento,
obtiveram resultados semelhantes ao de Domingues et al.
O fato do teste de toxicidade mostrar que no ensaio 1, as mudas de alface se
desenvolveram como no solo sem poluente, não quer dizer que o mesmo tenha sido
totalmente degradado, o mais provável é que o poluente tenha se fixado no húmus,
passando para uma forma menos tóxica, pela a ação das fenoloxidases.
Segundo Aust (apud BALLAMINUT, 2007, p.10), a degradação da lignina por
fungos de podridão branca ocorre até sua concentração ser reduzida a níveis não
detectáveis, onde o produto final é CO2. Sendo este, o tipo de processo desejável para
os compostos xenobióticos.
A água mineral que permaneceu 24 horas no ensaio 2 demonstrou grande
quantidade de gotículas de óleo na superfície (Figura 1), o que corrobora com os
resultados do teste de toxicidade.
Figura 1: água que permaneceu 24 horas no
composto com 50g de óleo.
Fonte: Autoria própria
26
7 CONCLUSÕES
Com base nos resultados deste trabalho conclui-se que:
a) O meio soro de queijo se apresentou um meio de cultura eficiente;
b) A espécie Pisolithus tinctorius apresentou mais rendimento na produção de
biomassa do que Picnoporus sanguineus e secreção de fenoloxidases
semelhante, o que faz ela ter um maior potencial para aplicações em
biorremediação;
c) A espécie inoculada foi dominante e a responsável pela detoxificação do ensaio
1;
d) Utilizando a metodologia descrita é possível diminuir a toxicidade de 10 g de óleo
para 10 g de Salvinia sp. adicionado de 240 g de solo e 250 g de cultivo de
Pisolithus tinctorius;
e) Outros trabalhos são necessários para avaliação da quantidade exata de OLU
que pode ser estabilizado utilizando-se esta metodologia.
f) Também aconselha-se para próximos estudos, a investigação da composição
dos gases emitidos durante a biodegradação deste óleo e até que ponto esta
liberação é prejudicial ao ambiente.
27
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TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R.;CASE, Christine. Microbiologia. 6ª ed. Porto
Alegre: Artemed, 2000.
30
APÊNDICE A – Meio de cultura batata dextrose ágar (BDA)
Ingredientes
batata
dextrose
ágar
água destilada
Concentração (g/l)
200,0 g
20,0 g
1,5 g
1000,0 ml
pH=5,5 ± 0,2. Utilizar o caldo da fervura da batata em água. Autoclavar durante 15
minutos à 121°C.
31
APÊNDICE B – Meio de cultura batata dextrose ágar resorcinol (BDAR)
Ingredientes
batata
Concentração (g/l)
200,0 g
dextrose
20,0 g
resorcinol
0,5 g
ágar
água destilada
15,0 g
1000,0 ml
pH=5,5 ± 0,2. Utilizar o caldo da fervura da batata em água. Autoclavar durante 15
minutos à 121°C.
32
APÊNDICE C – Meio de cultura peptona dextrose (PD)
Ingredientes
Concentração (g/l)
Peptona
5,0 g
dextrose
20,0 g
água destilada
1000,0 ml
Autoclavar durante 15 minutos à 121°C.
33
APÊNDICE D - Meio de cultura soro de queijo (MSQ)
Meio de cultura soro de leite (MSL)
Ingredientes
Concentração (g/l)
soro de queijo
500,0 ml
água destilada
500,0 ml
pH=5,5 ± 0,2. Para utilizar como meio sólido, adicionar 15 g/l de ágar. O soro de queijo
foi esterilizado (pH 5,5) em três estágios sucessivos de aquecimento à 95°C e repouso
de 24 horas.
O soro de queijo foi obtido no processo de confecção de queijo frescal utilizandose leite Nutrilat tipo C. Adicionou-se 1,5 ml de solução de coalho Top Therm por litro de
leite, previamente aquecido à 35 °C. Após agitar por dois minutos a solução com auxílio
de uma espátula esta permaneceu em repouso por 1 hora. Com auxílio de espátula,
cortou-se a massa resultante aguardou-se por 40 minutos para separar melhor o soro.
O soro de queijo foi extraído da massa com auxílio de peneira. A proteína restante foi
removida filtrando-se o soro após aquecê-lo por 15 minutos à 95°C em pH 4,8 e no pH
de cultivo.