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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA MARINHA
VARIABILIDADE INTRAESPECÍFICA NA PRODUÇÃO
DO SESQUITERPENO ELATOL EM Laurencia
dendroidea (CERAMIALES, RHODOPHYTA):
INFLUÊNCIA DE ASPECTOS AMBIENTAIS E
GENÉTICOS.
ALINE SANTOS DE OLIVEIRA
Niterói
Setembro, 2011
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ALINE SANTOS DE OLIVEIRA
VARIABILIDADE INTRAESPECÍFICA NA PRODUÇÃO
DO SESQUITERPENO ELATOL EM Laurencia
dendroidea (CERAMIALES, RHODOPHYTA):
INFLUÊNCIA DE ASPECTOS AMBIENTAIS E
GENÉTICOS.
Tese de Doutorado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Biologia Marinha do
Departamento de Biologia Marinha, Instituto de
Biologia, Universidade Federal Fluminense,
como requisito parcial para a obtenção do
Título de Doutor em Biologia Marinha.
Orientador:
Prof. Dr. Renato Crespo Pereira
Niterói
Setembro, 2011
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VARIABILIDADE INTRAESPECÍFICA NA PRODUÇÃO DO
SESQUITERPENO ELATOL EM Laurencia dendroidea (CERAMIALES,
RHODOPHYTA): INFLUÊNCIA DE ASPECTOS AMBIENTAIS E
GENÉTICOS.
ALINE SANTOS DE OLIVEIRA
Aprovada em 28/09/2011
BANCA EXAMINADORA
Dra Angélica Ribeiro Soares
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Dr. Gustavo Muniz Dias
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
Dra Maria Beatriz Barbosa de Barros Barreto
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
Dr. Erwan Plouguerné
Universidade Federal Fluminense
Dr. Ricardo Coutinho (Suplente)
Instituto de Estudos do Mar Almirante Paulo Moreira
Dr. Renato Crespo Pereira
Universidade Federal Fluminense
4
A minha tia-avó, Regina Lima, por todo carinho e
dedicação, e por sempre ter apostado em mim.
5
AGRADECIMENTOS
A Deus presente em todos os momentos, força suprema, meu guia e protetor.
A minha tia-avó Regina, meus pais Benedito e Maria Bernadete, minhas irmãs, Alane e
Alaize, por sempre me apoiarem, e por compreenderem minha ausência.
Ao meu amor maior Marcelo Augusto, por todo carinho, dedicação, companheirismo, e
por entender todos os momentos difíceis dessa jornada.
A Daniela Sudatti, pela imprescindível ajuda, por dividir muitos momentos
importantes: conversas acadêmicas ou não, gargalhadas, tensões, as nossas viagens a
São Paulo,..., ao final desse doutorado concretizamos uma amizade muito forte.
A grande família Sudatti (em especial Sra. Beth e Sr. João), por terem me recebido,
acolhido, e tratado maravilhosamente bem, e com tanto carinho.
A Frederico Sobrinho, por ter aberto as portas da sua casa para mim, pela amizade,
pelos anos de convivência feliz e momentos fantásticos compartilhados. Como esquecer
do ap. da Dr. Borman, rsrsrs
Ao meu orientador pelo incentivo, pela atenção, pela paciência e pela disponibilidade
sempre que necessário.
À Mutue Toyota Fujii, meu imenso agradecimento pela colaboração e pelo inestimável
auxílio em vários momentos, sem os quais este trabalho não teria sido realizado.
À Silvana Vianna Rodrigues pela colaboração, pela presteza em ajudar, contribuir
para o trabalho e sanar dúvidas.
As equipes dos Laboratórios: de Ressonância Magnética Nuclear (IQ-UFF), de
Cromatografia e Extração com Fluidos Supercríticos (IQ-UFF), de Cultura de Algas
da Seção de Ficologia (IBT-SP) por viabilizar e ajudar na realização de análises
importantes para o andamento deste trabalho.
Aos professores e funcionários do Programa de Pós-Graduação em Biologia Marinha
pelos ensinamentos transmitidos, e disposição no atendimento.
6
Aos companheiros do Laboratório de Cromatografia: Adriana Barreto, Eline Simões,
Gilmar dos Santos, Manuela, Roberta Motta, Carolina Oliveira, e todos os estagiários
que acompanharam essa jornada. Obrigado pela convivência, auxílio, e por todos os
momentos compartilhados.
Aos colegas do Laboratório de Produtos Naturais e Ecologia Química Marinha:
Cláudia Granja, Natália Saisse, Rodrigo Amaro, Wilton Ferreira, Fredy Ramirez,
Magui Vallim, Ecidine, Leonardo Lima, Rogers Paranhos, Glaucia Ank, Camilla Souza,
Louisi Oliveira, entre tantos outros, que de alguma forma contribuíram para este
trabalho.
Aos componentes da Secção de Ficologia do Instituto de Botânica de São Paulo pelos
ensinamentos e convívio, entre eles: Kenner Tesima, Jonatas Canuto, Renato Rocha
Jorge, Camila Malone, Kleber Santos, Sandra Chiracava, Érika Stein, Valéria
Cassano, Diógina Barata, Diclá Pupo, Nair Yokoya, Silvia Guimarães, Célia
Sant´Anna, Andréa Tucci, Luciana Retz, Aline Paternostro, Fernanda Ramlov, Ingrid
Balesteros, Júlio Avanzo, Elizete Mitsugui, José Domingos, Renata, Neide Pozo,
Dinorah (DA) e Neuzete Oliveira.
A minha família de amigos baianos, por sempre estarem tão próximos e cuidarem de
mim, mesmo com a distância, por me proporcionarem férias maravilhosas a cada
retorno, por torcerem pelo meu sucesso. Amo vocês para sempre, onde quer que eu
esteja!
Aos familiares cariocas e amigos, importantíssimos para os momentos de
descontração: Luciana, Ricardo, Marcella, Cabelinho (Marcelo), Tico (Cláudio),
Marcinho, Felipe, Aline, Beto, Mara, Lázaro, Anderson, Letícia, Edgard, Isabel, Nico,
Sissi, Carolzinha, ...
Às instituições que contribuíram para a realização deste trabalho, seja através de apoio
logístico ou financeiro: CAPES, FAPERJ, CNPq, Instituto de Botânica de São Paulo,
Departamentos de Biologia Marinha e de Química da UFF.
A todos que de alguma forma contribuíram e auxiliaram na elaboração deste trabalho.
7
ÍNDICE
LISTA DE TABELAS...................................................................................................viii
LISTA DE FIGURAS......................................................................................................ix
RESUMO.......................................................................................................................xiii
ABSTRACT...................................................................................................................xiv
INTRODUÇÃO GERAL................................................................................................16
CAPÍTULO 1. VARIABILIDADE INTER- E INTRAPOPULACIONAL NO TEOR
DE DEFESA QUÍMICA DA MACROALGA Laurencia dendroidea J. AGARDH
(CERAMIALES, RHODOPHYTA)...............................................................................24
1.1.Introdução..................................................................................................................24
1.2.Objetivos....................................................................................................................30
1.3.Hipóteses...................................................................................................................30
1.4.Material e métodos....................................................................................................31
1.4.1. Coleta da macroalga........................................................................................31
1.4.2. Extração dos metabolitos secundários totais...................................................36
1.4.3. Quantificação do sesquiterpeno elatol............................................................36
1.4.4. Análises estatísticas.........................................................................................40
1.5.Resultados..................................................................................................................41
1.6.Discussão...................................................................................................................48
CAPÍTULO 2. PLASTICIDADE FENOTÍPICA NO TEOR DE DEFESA QUÍMICA
DA
MACROALGA
Laurencia
dendroidea
J.
AGARDH
(CERAMIALES,
RHODOPHYTA)............................................................................................................57
2.1. Introdução.................................................................................................................57
2.2. Objetivos...................................................................................................................63
2.3. Hipóteses..................................................................................................................63
2.4. Material e métodos...................................................................................................64
2.4.1. Estabelecimento da cultura unialgal.................................................................64
2.4.2. Manutenção da cultura unialgal........................................................................64
2.4.3. Experimento de jardim comum.........................................................................67
8
2.4.4. Plasticidade fenotípica em resposta à temperatura...........................................68
2.4.5. Extração e quantificação do elatol....................................................................70
2.4.6. Análises estatísticas..........................................................................................71
2.5. Resultados.................................................................................................................73
2.5.1. Experimento de jardim comum.........................................................................72
2.5.2. Plasticidade fenotípica em resposta à temperatura...........................................74
2.5.2.1. Efeitos no crescimento.........................................................................74
2.5.2.2. Efeitos no teor de elatol........................................................................84
2.5.2.3. Efeitos do crescimento versus teor de elatol........................................86
2.6. Discussão..................................................................................................................88
CONSIDERAÇÕES FINAIS........................................................................................102
LITERATURA CITADA..............................................................................................104
9
LISTA DE TABELAS
Capítulo 1
Tabela 1.1. Variabilidade inter- e intrapopulacional na concentração de elatol na
macroalga L. dendroidea.................................................................................................45
Capítulo 2
Tabela 2.1. Composição química da solução de Provasoli, segundo Oliveira et al.
(1996), sem o tampão Tris (hidroximetil) aminometano.................................................65
Tabela 2.2. ANOVA multifatorial avaliando o efeito da temperatura, da localidade de
origem, do genótipo (localidade) e do tempo de experimento (semanas) no crescimento
(biomassa) de L. dendroidea...........................................................................................74
Tabela 2.3. ANOVA trifatorial avaliando o efeito da temperatura, da localidade de
origem e do genótipo (localidade) no teor de elatol dos clones de L. dendroidea..........84
10
LISTA DE FIGURAS
Introdução geral
Figura 1. Aspecto geral da fronde da macroalga Laurencia dendroidea proveniente do
campo...............................................................................................................................21
Figura 2. Molécula do sesquiterpeno halogenado elatol comum em espécies do gênero
Laurencia.........................................................................................................................22
Capítulo 1
Figura 1.1. Locais de coleta de L. dendroidea: A. Distribuição latitudinal dos sítios de
coleta ao longo do litoral brasileiro; B. Sítio 1 (Praia de Vilas do Atlântico); C. Sítio 2
(Praia de Castelhanos); D. Sítio 3 (Praia do Forno); E. Sítio 4 (Praia do Velho)...........32
Figura 1.2. Cromatografia em camada delgada (CCD), evidenciando o elatol, coloração
roxa..................................................................................................................................37
Figura 1.3. Cromatograma gasoso (CG-DCE) do padrão de elatol a 2,32 ppm eluído a
17,739 minutos................................................................................................................39
Figura 1.4. Perfil químico, através de Cromatografia em Camada Delgada, dos extratos
brutos de espécimes de diferentes populações de L. dendroidea: (1) Ilha de Cabo Frio –
população de referência; (2) Praia do Velho; (3) Praia de Vilas do Atlântico; (4) Praia
do Forno; (5) Praia de Castelhanos..................................................................................41
Figura 1.5. Cromatogramas gasosos (CG-DCE) de cada localidade: A. Sítio 1; B. Sítio
2; C. Sítio 3; D. Sítio 4....................................................................................................42
Figura 1.6. Valores médios de concentração de elatol (média ± desvio padrão) em cada
sítio de coleta: sítio 1 (Praia de Vilas do Atlântico); sítio 2 (Praia de Castelhanos); sítio
3 (Praia do Forno); sítio 4 (Praia do Velho). Valores expressos em mg de elatol /g de
peso seco da fronde de L. dendroidea. Sítios com letras iguais indicam tratamentos sem
diferença significativa. Os tratamentos foram considerados significativamente diferentes
quando p <0,05; ANOVA/Tukey HSD teste, n = 20......................................................44
11
Figura 1.7. Variabilidade intrapopulacional nas concentrações de elatol em cada sítio
de coleta: A. Sítio 1 (Praia de Vilas do Atlântico); B. Sítio 2 (Praia de Castelhanos); C.
Sítio 3 (Praia do Forno); D. Sítio 4 (Praia do Velho). Valores expressos em mg de
elatol/g de peso seco da fronde de L. dendroidea............................................................46
Figura 1.8. Análise de agrupamento interpopulacional (Método de Ward: ccc = 0.8345)
baseada na concentração individual de elatol nas quatro populações de L. dendroidea, n
= 20..................................................................................................................................47
Capítulo 2
Figura 2.1. Local de manutenção da cultura unialgal no Laboratório de Cultura de
Algas da Seção de Ficologia do Instituto de Botânica de São Paulo..............................66
Figura 2.2. Desenho experimental para avaliação da plasticidade fenotípica (em relação
ao crescimento e teor de elatol) em resposta à temperatura. Na figura, somente uma das
quatro populações avaliadas está representada................................................................69
Figura 2.3. Valores médios de concentração de elatol (média ± desvio padrão) em cada
sítio de coleta: A. após o experimento de jardim comum; B. os mesmos indivíduos do
campo antes do cultivo. Sítio 1 (Praia de Vilas do Atlântico-BA); Sítio 2 (Praia de
Castelhanos-ES); Sítio 3 (Praia do Forno-RJ); Sítio 4 (Praia do Velho-RJ). Valores
expressos em mg de elatol/g de peso seco da fronde de L. dendroidea. Sítios com letras
iguais indicam tratamentos sem diferença significativa. Os tratamentos foram
considerados significativamente diferentes quando p <0,05; ANOVA/ teste SNK, n =
4.......................................................................................................................................73
Figura 2.4. Efeito da temperatura e do tempo sobre o crescimento (biomassa) em L.
dendroidea em cada sítio, após um mês de experimento: A. Sob temperatura de 15⁰C.
B. Sob temperatura de 25⁰C. Sítio 1 (Praia de Vilas do Atlântico-BA); Sítio 2 (Praia de
Castelhanos-ES); Sítio 3 (Praia do Forno-RJ); Sítio 4 (Praia do Velho-RJ). As barras
representam as médias e os desvios-padrão. Barras com letras iguais são tratamentos
sem diferença significativa. Os tratamentos foram considerados significativamente
12
diferentes quando p < 0,05; ANOVA/teste SNK, n= 4. Condições de cultura: PES/2,
32±1‰, ciclo 14:10h claro/escuro, 60-80 μmol fótons m−2 s−1.......................................76
Figura 2.5. Efeito da temperatura (15⁰C) e do tempo (semanas) sobre o crescimento
médio de cada genótipo (G1-G4) de L. dendroidea, após um mês de experimento. A.
Sítio 1 (Praia de Vilas do Atlântico-BA). B. Sítio 2 (Praia de Castelhanos-ES). C. Sítio
3 (Praia do Forno-RJ). D. Sítio 4 (Praia do Velho-RJ). As barras representam as médias
e os desvios-padrão. Barras com letras iguais são tratamentos sem diferença
significativa. Os tratamentos foram considerados significativamente diferentes quando p
< 0,05; ANOVA/ teste SNK, n = 4. Condições de cultura: PES/2, 32±1‰, ciclo 14:10h
claro/escuro, 60-80 μmol fótons m−2 s−1..........................................................................78
Figura 2.6. Efeito da temperatura (25⁰C) e do tempo (semanas) sobre o crescimento
médio de cada genótipo (G1-G4) de L. dendroidea, após um mês de experimento. A.
Sítio 1 (Praia de Vilas do Atlântico-BA). B. Sítio 2 (Praia de Castelhanos-ES). C. Sítio
3 (Praia do Forno-RJ). D. Sítio 4 (Praia do Velho-RJ). As barras representam as médias
e os desvios-padrão. Barras com letras iguais são tratamentos sem diferença
significativa. Os tratamentos foram considerados significativamente diferentes quando p
< 0,05; ANOVA/ teste SNK, n = 4. Condições de cultura: PES/2, 32±1‰, ciclo 14:10h
claro/escuro, 60-80 μmol fótons m−2 s−1..........................................................................80
Figura 2.7. Morfologia dos clones de L. dendroidea cultivados após um mês sob
diferentes temperaturas: A. Sob temperatura de 15⁰C. B. Sob temperatura de 25⁰C. Sítio
1 (Praia de Vilas do Atlântico-BA), Sítio 2 (Praia de Castelhanos-ES), Sítio 3 (Praia do
Forno-RJ), Sítio 4 (Praia do Velho-RJ). As barras representam 1cm.............................82
Figura 2.8. Efeito da temperatura sobre o teor médio de elatol em cada genótipo (G1G4) de L. dendroidea, após um mês de experimento. A. Sítio 1 (Praia de Vilas do
Atlântico-BA). B. Sítio 2 (Praia de Castelhanos-ES). C. Sítio 3 (Praia do Forno-RJ). D.
Sítio 4 (Praia do Velho-RJ). As barras representam as médias e os desvios-padrão.
Barras com letras iguais são tratamentos sem diferença significativa. Valores expressos
em mg de elatol/g de peso úmido da fronde de L. dendroidea. Os tratamentos foram
considerados significativamente diferentes quando p < 0,05; ANOVA/ teste SNK, n= 4.
13
Condições de cultura: PES/2, 32±1‰, ciclo 14:10h claro/escuro, 60-80 μmol fótons m−2
s−1.....................................................................................................................................85
Figura 2.9. Crescimento versus produção de elatol nos genótipos de Laurencia
dendroidea. A. Sob temperatura de 15⁰C. B. Sob temperatura de 25⁰C. Os tratamentos
foram considerados significativos quando p < 0,05; Correlação de Spearman, n= 16.
Condições de cultura: PES/2, 32±1‰, ciclo 14:10h claro/escuro, 60-80 μmol fótons m−2
s−1.....................................................................................................................................86
Figura 2.10. Crescimento versus produção de elatol em espécimes de Laurencia
dendroidea provenientes do Sítio 4 (Praia do Velho-RJ). A. Sob temperatura de 15⁰C.
B. Sob temperatura de 25⁰C. Os tratamentos foram considerados significativos quando
p < 0,05; Correlação de Spearman, n= 4. Condições de cultura: PES/2, 32±1‰, ciclo
14:10h claro/escuro, 60-80 μmol fótons m−2 s−1..............................................................87
14
RESUMO
Os metabolitos secundários desempenham importantes papéis ecológicos no
ambiente marinho: defesa contra herbívoros e organismos incrustantes, combate a
infecção por microrganismos, sinalização química e interações competitivas. Destaca-se
também o amplo espectro de variabilidade na produção destas substâncias. Este trabalho
teve como objetivo avaliar a variabilidade inter- e intrapopulacional, nas concentrações
do sesquiterpeno elatol, em espécimes da macroalga Laurencia dendroidea, tanto em
condições naturais quanto sob cultivo. Além disso, foi examinada a plasticidade
fenotípica relacionada ao crescimento e teores de elatol em resposta as variações de
temperatura (15⁰C e 25⁰C). Os resultados mostraram a presença constante do elatol
como metabolito secundário halogenado de L. dendroidea, e confirmaram a expressiva
variabilidade em seus teores, tanto dentro como entre as quatro populações estudadas.
Os teores de elatol determinados variaram entre 0,001 a 1,24% peso seco da macroalga,
e foi observada uma variação na escala interpopulacional superior a intrapopulacional.
As quatro populações avaliadas apresentaram diferentes concentrações de elatol, as
quais aumentaram no sentido norte-sul, contrariando o padrão latitudinal esperado de
aumento de concentrações em direção a baixas latitudes. A variação intrapopulacional
nas concentrações de elatol foi de 2 a 10 vezes, demonstrando que a ampla
variabilidade, é um padrão consistente na espécie L. dendroidea ao longo da costa
brasileira. Mesmo após o cultivo durante oito meses em condições laboratoriais
controladas, os níveis de elatol convergiram para concentraçõe similares apenas em três
populações, uma delas manteve a concentração superior. A plasticidade fenotípica em
resposta à temperatura foi clara: sob 25⁰C foram detectados maior crescimento e teor de
elatol. Foi demonstrado que os níveis de elatol podem ser ajustados em resposta às
condições ambientais, mas a variação na concentração também é dependente do
genótipo. Esses dados apóiam a idéia de que as concentrações de elatol estão sujeitas ao
controle genético, e é o primeiro relato de variação genética na produção de elatol na
macroalga L. dendroidea. A temperatura influenciou positivamente tanto o crescimento
quanto a produção de elatol, excluindo a possibilidade desses dois atributos
representarem demandas conflitantes. Em laboratório, os resultados apoiaram o modelo
de estresse ambiental, pois a baixa temperatura esteve associada a uma diminuição nos
níveis de elatol. Conclui-se que a variabilidade intraespecífica sobre a produção de
elatol na macroalga L. dendroidea, nos níveis inter- e intrapopulacional, é decorrente da
interação entre fatores ambientais, através da plasticidade fenotípica o que pode permitir
respostas rápidas às mudanças nas condições ambientais, mas também é decorrente de
variabilidade genotípica, sugerindo adaptação local, afetando a resistência ou
palatabilidade aos herbívoros, além de interferir em outras funções deste metabolito.
Palavras-chaves: Laurencia, elatol, defesa química, fatores ambientais, plasticidade
fenotípica, variabilidade genotípica.
15
ABSTRACT
Secondary metabolites play important ecological roles in marine environment:
defenses against herbivores, fouling organisms and infection by microorganisms,
chemical signaling and competitive interactions. It is also remarkable the broad
spectrum of variability in the production of these substances. This work investigated the
occurrence and magnitude of inter- and intrapopulation variation on the concentration of
sesquiterpene elatol in Laurencia dendroidea, both in field and under culture conditions.
Additionally were examined phenotypic plasticity related to growth and levels of elatol
in response to temperature changes (15 and 25⁰C). The data demonstrated elatol as a
constant halogenated secondary metabolite of L. dendroidea and confirmed its wide
variability within and among four populations studied. Levels of elatol ranged from
0.001 to 1.24% dry weight of macroalgae, and it was observed a higher interpopulation
than intrapopulation variation. The four populations sampled had different elatol
concentrations, which enhanced from tropical toward subtropical region, contrary to the
latitudinal pattern expected of increasing concentrations toward the low latitudes.
Intrapopulational elatol levels ranged from 2 to 10 times, demonstrating that wide
variability is a consistent pattern for the L. dendroidea specie along the Brazilian coast.
Even after cultivation for eight months in the laboratory-controlled conditions, levels of
elatol converged to similar concentration only in three populations, one of them kept a
higher value. The phenotypic plasticity in response to temperature was clear: under
25⁰C were detected higher growth and elatol concentrations. We demonstrated that
elatol levels can be adjusted in response to environmental conditions, but the variation
in concentrations is also dependent on the genotype. These data support that the elatol
concentrations are subject to genetic control and it is the first report of genetic variation
in the production of elatol in macroalga L. dendroidea. Temperature positively
influenced both the growth and production elatol, excluding the possibility of tradeoffs
on these attributes. In laboratory, the results supported the model of environmental
stress, since the low temperature was associated with a decrease in the levels of elatol.
We concluded that intraspecific variability on the production of elatol in macroalgae L.
dendroidea, both within and among populations, result from interactions between
environmental factors, through phenotypic plasticity enabling rapid responses to
changing environmental conditions, but also is due to genotypic variability, suggesting
local adaptation, by affecting resistance to herbivores, as well as other functions of this
metabolite.
Key words: Laurencia, elatol, chemical defense, environmental factors, phenotypic
plasticity, genotypic variability.
16
INTRODUÇÃO GERAL
As substâncias responsáveis por interações ecológicas mediadas quimicamente
são designadas metabolitos secundários, termo utilizado para distingui-los dos produtos
originários do metabolismo primário. Tais substâncias são produzidas por vias
biossintéticas derivadas do metabolismo primário, desempenhando funções não
essenciais para a sobrevivência do organismo, mas que contribuem para o sucesso da
espécie que o produz, no ambiente em que vive (Paul et al., 2001; 2011). Assim,
quando se fala de um metabolito secundário ou um produto natural, refere-se a
substâncias que não estão envolvidas no desenvolvimento ou manutenção de um
organismo e, em geral, são limitados em sua distribuição biológica, muitas vezes
espécie-específicos, e produzidos por um organismo para atuação nas interações
ecológicas em seu ambiente (Williams et al., 1989; Harper et al., 2001; Maschek &
Baker, 2008).
De particular interesse da pesquisa em ecologia química marinha, os
metabolitos secundários têm importantes papéis ecológicos, na defesa contra a
herbivoria e incrustação, no combate a infecção por microrganismos, em interações
competitivas e na sinalização química (Amsler, 2008; Hay, 2009; Paul et al., 2011). As
macroalgas são responsáveis pela produção de quase 3.000 metabolitos secundários que
representam cerca de 20% do total relatado para o ambiente marinho (Maschek &
Baker, 2008; Blunt et al., 2011). Além da notável funcionalidade ecológica, destaca-se
o amplo espectro de variabilidade na produção dos metabolitos secundários, sendo
propostos padrões inter- e intraespecíficos para explicar tanto a distribuição quanto a
concentração variável dessas substâncias (Van Alstyne et al., 2001).
17
De uma forma geral, o padrão latitudinal pressupõe que macroalgas de
ambientes tropicais seriam mais defendidas frente a herbívoros como conseqüência de
uma maior pressão de herbivoria nas baixas latitudes (Gaines & Lubchenco, 1982;
Bolser & Hay, 1996) resultando em maior diversidade e concentração dos metabolitos
secundários (Hay & Steinberg, 1992; Targett et al., 1992). A alta diversidade de
estruturas químicas em macroalgas tropicais (principalmente nas divisões Chlorophyta e
Rhodophyta), bem como a produção acentuada de defesas químicas em populações de
macroalgas de ambientes recifais são, em geral, características incomuns em espécies de
regiões de clima temperado, e são exemplos que confirmam o padrão latitudinal (Gaines
& Lubchenco, 1982; Hay & Steinberg, 1992; Blunt et al., 2011). Contudo, outras
evidências parecem mostrar o inverso ou pelo menos contrariam este padrão. Por
exemplo, altas concentrações de polifenóis ocorrem nas macroalgas pardas tanto de
regiões temperadas quanto tropicais, indicando que apenas o fator latitude não é capaz
de explicar as variações detectadas (Targett et al., 1992; Amsler & Fairhead, 2006;
Jormalainen & Honkanen, 2008). Além disso, defesas químicas em organismos de
regiões polares não são tão incomuns, contrariando afirmações anteriores de um
decréscimo na prevalência de defesas químicas com o aumento da latitude (Amsler et
al., 2001; 2008).
Os casos de variabilidade dos metabolitos secundários marinhos, em uma
escala global, tendem a obscurecer a contribuição dos fatores locais, gerando elevados
níveis de variação e nenhum padrão óbvio (Pavia & Aberg, 1996). Em uma visão geral,
as concentrações de metabolitos secundários, em macroalgas marinhas, são
extremamente variáveis em uma ampla gama de escalas espaciais e temporais (Van
Alstyne et al., 2001). Mesmo espécies filogeneticamente relacionadas podem produzir
concentrações muito diferentes ou substâncias que não são estruturalmente relacionadas
18
(Van Alstyne et al., 2001). Tal variabilidade é associada aos vários microhabitats, com
forças seletivas particulares, levando a perfis químicos diversos e específicos nas
macroalgas marinhas (Pelletreau & Targett, 2008).
Os grupos dos terpenos e dos polifenóis (florotaninos) são as duas principais
classes estruturais de metabolitos secundários, particularmente importantes na mediação
de interações químicas entre macroalgas marinhas e herbívoros. Dentre os exemplos
melhor estudados de variação na concentração de metabolitos secundários estão aqueles
que envolvem os polifenóis. Os exemplos de variabilidade nos teores dos polifenóis têm
sido relatados em todas as escalas espaciais possíveis: intratalo (Tuomi et al., 1989; Van
Alstyne et al., 1999a), pequenas distâncias geográficas (poucos metros até centenas de
quilômetros) (Pavia & Aberg, 1996; Van Alstyne et al., 1999b) e biogeográficas
(Steinberg, 1989; 1992; Van Alstyne & Paul, 1990; Targett et al., 1992). A variação
temporal também tem sido detectada em escalas variando desde dias, semanas até meses
(Peckol et al., 1996; Hammerstrom et al., 1998). Contudo, os padrões de variabilidade
espacial e temporal em outras classes de metabolitos secundários, como os terpenos,
não são bem conhecidos, apesar de existirem relatos de variação (Van Alstyne et al.,
2001).
Quanto a esse aspecto uma questão essencial para a ecologia química marinha
é: Por que as macroalgas produzem concentrações particulares de metabolitos
secundários? Quais fatores são primordiais e como eles interagem? As respostas para
tais questões relacionam-se diretamente à compreensão do grau em que os fatores
ambientais e genéticos afetam os teores dos metabolitos secundários.
Uma vez que estas substâncias podem variar de maneira qualitativa e
quantitativa sob as mais variadas escalas, não podem ser consideradas como um caráter
absoluto dos organismos que as produzem. De fato, alguns trabalhos têm demonstrado
19
que existe um alto grau de especificidade nas respostas químicas das plantas,
confirmando a idéia de que estas são capazes de regular ativamente seu metabolismo
secundário frente às condições ambientais (Karban & Baldwin, 1997; Toth & Pavia,
2007).
Outra questão subjacente à observada variabilidade (quali- e quantitativa) dos
metabolitos secundários é: O que leva à seleção destas substâncias? Os metabolitos
secundários são derivados de uma combinação de fatores filogenéticos, como as
informações genéticas e potencial bioquímico (isto é, quais enzimas estão presentes) e
os fatores ambientais. Os estudos com plantas terrestres têm mostrado que esses fatores
interagem para moldar a evolução da produção e regulação de metabolitos secundários.
Vários modelos surgiram para prever as observadas diferenças fenotípicas, genotípicas e
geográficas nas defesas das plantas, avaliando demandas conflitantes (trade-offs) e
custos na produção dos metabolitos secundários (Bryant et al., 1983; Herms & Mattson,
1992; Cronin, 2001; Pavia & Toth, 2008). Sob um enfoque adaptativo da produção de
metabolitos secundários não há como descartar que a relativa disponibilidade de
recursos diferentes, ou as limitações fisiológicas e genéticas, sejam importantes na
determinação da produção (Ballhorn et al., 2011).
Nesse sentido, busca-se uma análise da produção de metabolitos secundários
com uma resolução mais fina para uma melhor compreensão dos fatores e forças
seletivas que atuam sobre a produção dessas substâncias (Pelletreau & Targett, 2008). O
estabelecimento de culturas unialgais, em condições laboratoriais controladas, pode
permitir a avaliação das concentrações de metabolitos secundários, dos custos e
benefícios de sua produção, e do grau em que as macroalgas são capazes de responder
às pressões seletivas por herbívoros e outros fatores ambientais (Koivikko et al., 2008;
Pelletreau & Targett, 2008). Os efeitos de sobreposição da plasticidade fenotípica
20
(variações dependentes de fatores externos), da variabilidade genética da planta (por
exemplo, variação genotípica) e da variabilidade ontogenética (variação dependente do
estágio de desenvolvimento e/ou órgãos específicos) são as principais fontes de variação
que devem ser consideradas em uma análise funcional (Ballhorn et al., 2011).
Dentre as algas marinhas, o grupo das rodofíceas (macroalgas vermelhas,
Rhodophyta), é o mais rico quanto à abundância e a diversidade na produção de
metabolitos secundários (Blunt et al., 2011). O maior destaque deste grupo é a
impressionante produção de metabolitos secundários halogenados, com mais de 90%
destes contendo bromo ou cloro (Erickson 1983; Carvalho & Roque, 2000; Maschek &
Baker, 2008; Cabrita et al., 2010). Em particular, o gênero Laurencia J. V. Lamouroux
(Ceramiales, Rhodomelaceae) destaca-se como o mais rico no mundo na produção
destes metabolitos, com uma grande variedade de tipos moleculares como terpenóides
(monoterpeno, C10, sesquiterpeno, C15 e diterpeno, C20) e acetogeninas (C15)
policíclicas com anéis espiralados atípicos conectados por um único átomo (Fenical,
1975; Maschek & Baker, 2008; Blunt et al., 2011 e outras revisões deste autor).
Além da prolífica produção de química secundária, o gênero Laurencia
também se caracteriza por uma ampla distribuição nos mares de regiões tropicais e
subtropicais (Luning, 1990). Nesse gênero muitas espécies demonstram extensa
plasticidade morfológica e, o uso de marcadores moleculares tem sido fundamental para
delimitar os táxons e inferir suas relações filogenéticas (Cassano, 2009; Fujii et al.,
2011). Neste contexto, destaca-se a espécie Laurencia dendroidea J. Agardh,
mencionada anteriormente como L. obtusa (Hudson) J.V. Lamouroux (Pereira et al.,
2003; Sudatti et al., 2006; 2008; Paradas et al., 2010). Por exemplo, através de técnicas
moleculares foi constatado que as espécies nomeadas como L. arbuscula, L. filiformis,
L. majuscula e L. obtusa encontradas no Brasil pertenciam a uma mesma entidade
21
taxonômica e os exames dos materiais de referência permitiram identificá-los como L.
dendroidea (Figura 1), cuja localidade tipo é o Brasil (Cassano, 2009; Fujii et al., 2011).
A espécie L. dendroidea tem extensa distribuição na costa brasileira, desde o
Ceará (Pinheiro-Joventino et al., 1998) até o Rio Grande do Sul (Baptista, 1977),
constituindo um elemento importante da flora ficológica brasileira (Oliveira Filho,
1977). Ao longo dessa ampla distribuição, as populações de L. dendroidea crescem em
habitats bastante distintos, desde locais protegidos, como enseadas e baías de águas
calmas, até aqueles moderadamente expostos ou expostos à forte arrebentação das
ondas, e também vivencia grande amplitude de fatores abióticos e bióticos, exibindo
uma considerável plasticidade morfológica (Fujii & Sentíes, 2005; Cassano, 2009).
Figura 1. Aspecto geral da fronde da macroalga Laurencia dendroidea proveniente do
campo.
22
Dentre os inúmeros metabolitos encontrados em espécies de Laurencia, o
sesquiterpeno elatol (Figura 2) destaca-se como o principal metabolito secundário na
macroalga L. dendroidea, mas também pode ser encontrado em outras espécies do
gênero (Hay et al., 1988; de Nys et al., 1996). O sesquiterpeno elatol possui amplo
espectro de ação evidenciado tanto por seu papel ecológico no ambiente marinho (Hay
et al., 1987; 1988; Granado & Caballero, 1995; Da Gama et al., 2002, 2003; Pereira et
al., 2003) quanto por seu potencial para fins industriais e farmacêuticos (Da Gama et
al., 2003; Vairappan et al., 2001, 2003; Veiga-Santos et al., 2008; Machado et al., 2010,
2011; Santos et al., 2010).
Figura 2. Molécula do sesquiterpeno halogenado elatol comum em espécies do gênero
Laurencia.
23
Diante do relatado, conclui-se que a macroalga L. dendroidea reúne um vasto
histórico de estudos taxonômicos, ecológicos, e de desenvolvimento de fármacos
potenciais. No entanto, a ocorrência de variabilidade na produção de metabolitos
secundários nesta espécie ainda permanece como uma lacuna, e da mesma forma, os
fatores responsáveis por esta variação. O presente trabalho se insere neste contexto ao
avaliar a ocorrência e magnitude de variabilidade, inter- e intrapopulacional, nas
concentrações do sesquiterpeno elatol na macroalga Laurencia dendroidea, buscando
uma melhor compreensão da contribuição dos fatores ambientais e genéticos. Mais
especificamente
serão
investigados
os
padrões
de
variabilidade
(inter-
e
intrapopulacional) dos teores do sesquiterpeno elatol na macroalga L. dendroidea sob
condições naturais (Capítulo 1), e através de cultura unialgal, avaliando os efeitos da
plasticidade fenotípica, variação genotípica (Capítulo 2) como fontes de variação das
concentrações deste metabolito.
24
CAPÍTULO 1
VARIABILIDADE INTER- E INTRAPOPULACIONAL NO TEOR DO
SESQUITERPENO ELATOL NA MACROALGA Laurencia dendroidea J.
AGARDH (CERAMIALES, RHODOPHYTA).
1.1. Introdução
A produção de metabolitos secundários nas macroalgas marinhas é bastante
diversificada, bem como a sua funcionalidade seja em interações biológicas (ações antiherbivoria, anti-incrustante, sinalização química) ou em aplicações farmacêuticas e
industriais (tintas anti-incrustantes e outras atividades biológicas) (Bhadury & Wright,
2004; Pereira & Da Gama, 2008; Hay, 2009; Blunt et al., 2011; Paul et al., 2011). Outra
característica bem particular destes metabolitos secundários é a expressiva variabilidade
na sua produção em uma ampla gama de escalas, desde aquelas relacionadas a aspectos
taxonômicos e biogeográficos, até diferenças entre partes distintas de um mesmo
indivíduo (Van Alstyne et al., 2001).
Dentro deste contexto, pouco se sabe a respeito dos padrões de variação entre
populações de uma mesma espécie, distantes entre si por alguns metros ou mesmo por
centenas de quilômetros (e. g. Pereira et al., 2004). A maioria dos trabalhos sobre
variação intraespecífica envolveu a quantificação de polifenóis (florotaninos),
metabolitos secundários hidrossolúveis, presentes somente em macroalgas pardas (Pavia
& Aberg, 1996; Van Alstyne et al., 1999a,b, 2001; Pavia et al., 2003), sendo mais
escassas as evidências em outros tipos ou classes de metabolitos secundários.
25
Paul & Fenical (1986) investigando 40 espécies de macroalgas marinhas
verdes, pertencentes a ordem Caulerpales, encontraram variação intraespecífica
qualitativa e quantitativa na produção de sesqui- e diterpenos. Estes autores concluíram
que os extratos brutos destas macroalgas de áreas com alta intensidade de herbivoria
produziram as maiores concentrações e variedades de metabolitos secundários. Já a
comparação entre extratos brutos provenientes de indivíduos de diferentes populações
da macroalga verde Halimeda opuntia na região do Pacífico não revelou variação
qualitativa, entretanto, as maiores concentrações dos metabolitos estiveram, mais uma
vez, associadas à elevada densidade de herbívoros (Paul & Van Alstyne, 1988). Em
outra espécie de macroalga verde, Caulerpa taxifolia, também foi detectada uma
variação espacial nas concentrações do sesquiterpeno caulerpenina, atribuída
principalmente a diferenciações genéticas entre as populações desta macroalga vivendo
em localidades distintas (Amade & Lemée, 1998).
Na macroalga parda Stypopodium zonale, apesar da semelhança nos perfis dos
metabolitos secundários, foi detectada variação quantitativa entre populações de regiões
de águas rasas do Caribe. Já populações desta mesma espécie, coletadas em uma escala
geográfica maior possuíam, comparativamente, distintos perfis qualitativos e
quantitativos (Gerwick et al., 1985). Em macroalgas pardas das ordens Fucales e
Laminariales, uma alta variação intraespecífica nas concentrações de compostos
fenólicos foi detectada entre espécimes coletados em diferentes localidades ao longo da
costa oeste da América do Norte (Van Alstyne et al., 1999b). Ainda sobre polifenóis,
Pavia e colaboradores (2003) detectaram uma ampla variação intraespecífica no teor
médio destas substâncias na alga parda Ascophyllum nodosum de diferentes localidades.
26
Na costa brasileira, comparações entre populações da macroalga parda
Stypopodium zonale apontaram diferentes metabolitos secundários majoritários (Soares
et al., 2003; Pereira et al., 2004), atuantes como defesas contra o consumo por
caranguejos Pachygrapsus transversus e por ouriços-do-mar Lytechinus variegatus, no
entanto, com eficácia diferenciada (Pereira et al., 2004).
Análises químicas por cromatografia líquida de alta eficiência em extratos
brutos da macroalga vermelha Portieria hornemannii provenientes de seis localidades
em Guam (Pacífico) indicaram a ocorrência de variação quantitativa na produção de
monoterpenos, entre os locais de coleta (Puglisi & Paul, 1997). Outro estudo com esta
mesma espécie reafirmou a existência de variação quantitativa em teores de
monoterpenos em espécimes de P. hornemannii coletados em outras localidades
(Matlock et al., 1999). Já na macroalga vermelha Delisea pulchra, as concentrações de
seus principais metabólitos secundários halogenados (furanonas) foram variáveis em 15
populações estudadas ao longo da costa sudeste da Austrália (Wright et al., 2000a).
É comum também a avaliação sobre a existência de variação intraespecífica de
forma indireta, por análise da suscetibilidade à herbivoria (Paul & Van Alstyne, 1988;
Hay, 1996; Taylor et al., 2003) fornecendo indicação de que os teores dos metabólitos
secundários não são constantes para uma determinada espécie.
A partir dos relatos acima, conclui-se que a ocorrência de variabilidade
intraespecífica na produção de metabolitos secundários é um aspecto notável.
Entretanto, cabe ressaltar que os estudos, em sua maioria, refletem análises de extratos
brutos de vários indivíduos extraídos conjuntamente e/ou estão relacionados com a
avaliação da suscetibilidade a herbivoria, mascarando a ocorrência e a importância da
variação intrapopulacional.
27
A avaliação da variação intrapopulacional em teores de defesas químicas em
macroalgas marinhas, em caráter qualitativo ou quantitativo, é um aspecto pouco
documentado e, portanto, a sua ocorrência em populações de macroalgas marinhas
ainda é subestimada (Hay, 1996; Wright et al., 2000a; Pereira & Da Gama, 2008).
Dessa forma, faz-se necessário determinar quais processos causam variabilidade
interpopulacional ao longo de um gradiente ambiental ou geográfico, e se a variação na
produção de metabolitos secundários também ocorre entre indivíduos de uma mesma
população (Van Alstyne et al., 2001).
Por exemplo, existe pouca variação nas concentrações de florotaninos em
populações de A. nodosum distantes cerca de 1.000 km, mas uma significativa
variabilidade pode ocorrer em distâncias de pouco metros a até 1 km (Pavia & Aberg,
1996; Pavia et al., 2003). Em D. pulchra também foi encontrada expressiva
variabilidade nas concentrações dos metabolitos secundários entre indivíduos de uma
mesma população, muitas vezes variando em cerca de uma ordem de magnitude ou mais
(Wright et al., 2000a). O único estudo de variação intrapopulacional na costa brasileira
foi realizado em a macroalga vermelha Laurencia dendroidea da região de Cabo Frio,
Rio de Janeiro. Foi detectado que a concentração do sesquiterpeno elatol é muito
variável dentro de uma mesma população, tanto para os teores presentes na superfície
quanto para aqueles armazenados no interior do talo desta macroalga (Sudatti et al.,
2006).
Apesar
de
pouco
estudada,
a
variação
quantitativa
intraespecífica,
principalmente a intrapopulacional, pode ter conseqüências importantes, já que a
química defensiva, em resposta a herbivoria e epifitismo, é geralmente dependente da
concentração dos metabolitos secundários (Hay et al., 1987; Steinberg, 1988; Van
Alstyne et al., 1994; de Nys et al., 1995; Schmitt et al., 1995; Taylor et al., 2003;
28
Sudatti et al., 2008). Isso significa que a sobrevivência diferencial de indivíduos dentro
de uma população também pode estar diretamente relacionada a este tipo de
variabilidade. Além disso, existem os mesoherbívoros, pequenos herbívoros que vivem
e consomem macroalgas quimicamente defendidas, sobre os quais, a variabilidade
quantitativa pode ser importante nos contextos ecológico e evolutivo: (a) exercendo
impactos significativos na estrutura das comunidades bentônicas; (b) atuando em níveis
tróficos superiores, produzindo efeitos em cascata; (c) fornecendo material para a
seleção natural de contra-adaptação destes mesoherbívoros simpátricos (Pereira & da
Gama, 2008).
Vale ressaltar também que alguns metabolitos secundários de macroalgas
marinhas, com conhecida função anti-herbivoria, também expressam outras funções
ecológicas, aumentando o valor adaptativo destas substâncias (de Nys et al., 1995,
1998; Schmitt et al., 1995; Da Gama et al., 2008; Pereira & Da Gama, 2008). Dessa
forma, em função dos múltiplos papéis dos metabólitos secundários no ambiente
marinho, variações intraespecíficas nos teores das defesas químicas podem ter efeitos
ecológicos (Paul et al., 2001) de significativa importância e/ou repercussão em termos
de aptidão e na estrutura da comunidade (Pereira et al., 2004; Pereira & Da Gama,
2008). De fato, entender a variação intraespecífica na química defensiva é um aspecto
essencial, pois é sobre tal variação que a evolução ocorre; além disso, este aspecto pode
ter implicações sobre a dinâmica populacional e impacto sobre o desenvolvimento de
aspectos aplicados e também pode contribuir para a compreensão dos componentes
genéticos e fenotípicos da biodiversidade marinha (Hay, 1996; Hay & Fenical, 1996).
Dentro desse contexto, a espécie Laurencia dendroidea J. Agardh vem sendo
utilizada como modelo em estudos de ecologia química marinha no Brasil. Estudos
prévios em uma população desta espécie, da Ilha de Cabo Frio, ao norte do Estado do
29
Rio de Janeiro, constataram a atividade defensiva do sesquiterpeno elatol frente a
herbívoros (Pereira et al., 2003), organismos incrustantes (Da Gama et al., 2002, 2003),
bem como suas propriedades biológicas ou potencialmente farmacológicas (Vairappan
et al., 2001, 2003; Veiga-Santos et al., 2008; Machado et al., 2010; 2011; Santos et al.,
2010). Foi demonstrado também que os indivíduos de L. dendroidea desta população
produziram quantidades variáveis (de 0,1 até 2,2% do peso seco da alga) deste
metabolito (Sudatti et al., 2006). Para uma melhor compreensão do padrão de
variabilidade do teor de elatol na macroalga L. dendroidea em diferentes populações ao
longo da costa brasileira, o presente estudo buscou investigar a ocorrência e magnitude
de variabilidade inter- e intrapopulacional na produção deste metabolito, e uma possível
relação com o padrão latitudinal.
30
1.2. Objetivos

Avaliar a existência de variabilidade interpopulacional na concentração do
sesquiterpeno elatol na macroalga Laurencia dendroidea;

Verificar a ocorrência de um padrão latitudinal nos teores do sesquiterpeno
elatol entre as populações de L. dendroidea estudadas;

Avaliar a existência de variabilidade intrapopulacional na concentração do
sesquiterpeno elatol na macroalga L. dendroidea.
1.3. Hipóteses
H
(1,1)
As populações de L. dendroidea de localidades distintas produzem
concentrações de elatol diferentes entre si.
H
(1,2)
Existe um padrão latitudinal na produção de elatol em diferentes
populações de L. dendroidea.
H
(1,3)
Os indivíduos de uma mesma população de L. dendroidea produzem
concentrações distintas de elatol.
31
1.4. Material e métodos
1.4.1. Coleta da macroalga
Os espécimes de Laurencia dendroidea utilizados neste trabalho foram
coletados durante os meses de janeiro a março de 2008, em quatro localidades ao longo
do litoral brasileiro (Figura 1.1A): na Praia de Vilas do Atlântico (Figura 1.1B), sítio 1
(12⁰53’83’’S, 38⁰17’01’’W), localizado no município de Lauro de Freitas, Estado da
Bahia; na Praia de Castelhanos (Figura 1.1C), sítio 2 (20⁰50’99”S, 40⁰37’55”W), no
município de Anchieta, Estado do Espírito Santo; e em duas localidades no Estado do
Rio de Janeiro: na Praia do Forno (Figura 1.1D), sítio 3 (22⁰45’54”S, 41⁰52’21”W), no
município de Armação de Búzios e na Praia do Velho (Figura 1.1E), sítio 4
(23⁰01’35’’S, 44⁰26’07’’W), no município de Angra dos Reis.
Todos os indivíduos sempre fixos a substratos rochosos foram coletados
manualmente, por meio de mergulho livre a uma profundidade de dois metros. Os
espécimes coletados (n = 20, para cada localidade) foram mantidos individualizados e
transportados até o laboratório envoltos em papéis toalhas umedecidos com água do
mar. Em seguida, foram separados dos sedimentos e organismos associados, e com
auxílio do microscópio estereoscópico foi confirmado que todos os espécimes coletados
se tratavam de plantas esporofíticas, uma vez que apresentavam as estruturas
reprodutivas correspondentes (Fujii & Sentíes, 2005). Estas frondes coletadas foram
secas sob temperatura ambiente e ao abrigo da luz.
32
Figura 1.1. Locais de coleta de L. dendroidea: A. Distribuição latitudinal dos sítios de
coleta ao longo do litoral brasileiro; B. Sítio 1 (Praia de Vilas do Atlântico); C. Sítio 2
(Praia de Castelhanos); D. Sítio 3 (Praia do Forno); E. Sítio 4 (Praia do Velho).
33
Alguns exemplares de L. dendroidea foram fixados em formol a 4% em água
do mar e, posteriormente, depositados no Herbário “Maria Eneyda P. Kauffmann
Fidalgo” do Instituto de Botânica de São Paulo (SP399.790, Praia do Forno; SP399.792,
Praia do Velho; SP399.793, Praia de Vilas do Atlântico; SP400.151, Praia de
Castelhanos). Além disso, este material também foi submetido a um estudo molecular,
com comparação de sequências de DNA de diferentes regiões genômicas, onde foi
confirmado que se tratava da mesma espécie (Cassano, 2009).
Os locais de coleta foram escolhidos considerando-se que tais áreas
expressariam mudanças latitudinais em fatores, abióticos e bióticos, no litoral brasileiro.
A distribuição da flora de macroalgas marinhas na costa brasileira é dividida em duas
zonas principais: a província tropical e a temperada quente, separadas por uma zona de
transição representada pelo estado do Espírito Santo (Horta et al., 2001). Essas regiões
são representadas por áreas extensas, com ampla diversidade de ambientes, e
posicionadas ao longo de uma gradiente latitudinal de temperatura (Horta et al., 2001).
A Praia de Vilas do Atlântico (sítio 1, Figura 1.1B) está localizada na região
tropical da costa brasileira, que é caracterizada por apresentar uma flora relativamente
rica, estabelecida principalmente sobre recifes de arenito incrustados por algas calcárias
e corais, e por possuir águas oligotróficas (Horta et al.
varia entre 20-27°C, e a salinidade entre 36,5 a 37,7 ups (Maida & Ferreira, 1997). A
praia de Vilas do Atlântico apresenta turbulência e batimento de ondas moderados, com
bancos
34
aixas (Nunes, 2005). As macroalgas geralmente crescem na matriz
epilítica na região frontal ou na região protegida do recife (Nunes, 2005).
A Praia de Castelhanos (sítio 2, Figura 1.1C) está localizada em uma região de
transição do litoral brasileiro, que se caracteriza por uma elevada riqueza da flora
marinha, que tem sido atribuída às condições especiais de temperatura da água do mar, a
heterogeneidade do meio ambiente e à presença de grande quantidade de substrato
rochoso (Horta et al., 2001; Guimarães, 2003). A Corrente do Brasil atinge o litoral do
Espírito Santo, com águas quentes, salinas e com baixos níveis de produtividade
(Oliveira Filho, 1977). Contudo, pulsos das Águas Centrais do Atlântico Sul (ACAS),
caracterizada por águas frias e ricas em nutrientes, também podem alcançar o litoral do
Espírito Santo durante o verão, propiciando condições apropriadas para a presença tanto
de espécies euritérmicas como estenotérmicas (Valentin & Moreira, 1978, Guimarães,
2003). Esta área de coleta caracteriza-se pelo clima quente e úmido, com máximos
pluviométricos no verão e mínimos no inverno (Guimarães, 1990). No litoral central do
Espírito Santo, o substrato predominante é constituído por rochas do tipo granitognaisse, correspondentes ao afloramento do Pré-Cambriano, o que possibilita a
existência de gradações quanto ao tipo de hidrodinamismo, desde locais extremamente
batidos, até locais protegidos da arrebentação (Guimarães, 1990).
Os sítios de coleta 3 e 4 estão localizados na zona temperada quente da costa
brasileira, que possui flora marinha com maior riqueza do que aquela encontrada na
região tropical (Horta et al., 2001). A Praia do Forno (sítio 3, Figura 1.1D) localiza-se
no município de Armação de Búzios, no litoral norte do estado do Rio de Janeiro, ao
fundo de uma longa e estreita enseada voltada para sudoeste, o Saco do Forno,
possuindo uma profundidade máxima de 12 m. É formada por costões rochosos em
ambos os lados e uma pequena faixa de areia de aproximadamente 150 m, caracterizada
35
pela alta energia das ondas (Yoneshigue, 1985). Esta área é influenciada pela penetração
esporádica de águas de ressurgência, principalmente entre os meses de outubro a abril
(Guimarães & Coutinho, 1996). Fora o período da ressurgência, as águas superficiais
são caracterizadas por temperaturas acima de 21°C, salinidade entre 35 e 36 ups, e
baixas concentrações de nutrientes (Guimarães & Coutinho, 1996). As condições de
ressurgência são bem caracterizadas pelos valores de temperatura por vezes abaixo de
18°C, e altas concentrações de nitrato (Guimarães & Coutinho, 1996). Na Praia do
Forno, espécies com afinidades temperadas quentes e elementos com afinidades
tropicais foram registrados, caracterizando uma flora mista (Guimarães & Coutinho,
1996).
A Praia do Velho (sítio 4, Figura 1.1E) está localizada na Baía da Ribeira, um
sistema costeiro situado dentro da Baía da Ilha Grande, no litoral sul do Rio de Janeiro.
A Baía da Ilha Grande apresenta vários complexos estuarinos, nos quais a circulação
interna resulta da interação das correntes de maré, ventos, gradiente de densidade,
dentre outros fatores (Dias & Bonecker, 2008), sendo em geral classificada como um
ecossistema oligotrófico, com baixa biomassa fitoplanctônica (Creed, 2007). A Baía da
Ribeira tem profundidade média de 8m, apresentando diversas ilhas, uma linha costeira
irregular, sendo bastante afetada pela contribuição da precipitação local (Dias et al.,
1999). Ao longo da costa, a temperatura das águas de superfície varia entre 24-28°C no
verão e 24-26°C no inverno, e a salinidade das águas de superfície varia de 27-37 ups
(Creed, 2007). A Praia do Velho é dissipativa, caracterizada por águas calmas, com
inclinação gradual em direção à areia. Costões rochosos cobertos por pedras de granito e
um fundo de areia caracterizam a área de coleta, que apresenta uma estrutura de habitat
complexo, formado pela cobertura de vários tipos de algas Phaeophyta, principalmente
bancos de Sargassum, além de algas calcárias incrustantes (Vilanova et al., 2004;.
36
Teixeira et al., 2009). Além disso, a área de coleta está próxima da zona de descarga
térmica da CNAAA (Central Nuclear Almirante Álvaro Alberto), podendo sofrer um
impacto térmico, principalmente em águas superficiais (Vilanova et al., 2004; Dias &
Bonecker, 2008; Teixeira et al., 2009).
1.4.2. Extração dos metabolitos secundários totais
Após a secagem das frondes de L. dendroidea, estes espécimes coletados foram
pesados, com a massa variando entre 0,1 a 0,9 g de peso seco. A extração dos
metabolitos secundários totais foi realizada em hexano (grau HPLC, TEDIA Company,
Inc.). Foram feitas quatro extrações em 20 ml de solvente, com intervalos de quinze dias
cada. O volume de solvente adicionado e o tempo de duração do processo de extração
foram similares em todas as populações coletadas.
1.4.3. Quantificação do sesquiterpeno elatol
Uma comparação preliminar dos metabolitos secundários presentes em cada
população de L. dendroidea coletada foi feita a partir de extratos brutos em hexano,
obtidos através de uma pequena amostra de cada população. O perfil químico
qualitativo foi feito através de Cromatografia em Camada Delgada (CCD), utilizando-se
placas de folhas de alumínio 20 x 20cm com gel de sílica 60 F254 (Merck) e eluentes
hexano:acetato de etila, na proporção de 8:2. Após a corrida, as placas foram
inspecionadas sob luz ultravioleta (254 e 365nm) e reveladas com uma solução de
sulfato cérico (CeSO4) a 2% em ácido sulfúrico (H2SO4) seguido de aquecimento.
37
O padrão de elatol foi obtido através da purificação do extrato bruto da alga,
após a secagem de frondes diversas e extração em hexano. A purificação do elatol foi
feita através de Cromatografia em Camada Preparativa (sílica gel 60 F254 Merck),
usando hexano:acetato de etila na proporção 8:2 como sistema eluente. Na faixa de
sílica onde o elatol se encontrava a placa preparativa foi removida por raspagem e
filtrada em hexano para a extração do elatol. A certificação da presença do elatol
(Figura 1.2) e sua pureza foram avaliadas com o auxílio de duas técnicas: a CCD e a
Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H). O perfil do padrão foi,
então, comparado com dados da literatura (König & Wright, 1997; Da Gama, 2001). Os
espectros de RMN 1H foram feitos em aparelho Varian-Unity Plus 300, utilizando-se a
freqüência de 300 MHz, tendo o tetrametilsilano (TMS) como referenciador interno e
clorofórmio deuterado (CDCl3) como solvente. Os espectros foram feitos no
Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear do Departamento de Química Orgânica
da Universidade Federal Fluminense.
Figura 1.2. Cromatografia em camada delgada (CCD), evidenciando o elatol, coloração
roxa.
38
O método utilizado na quantificação do elatol foi a Cromatografia Gasosa
associada a um Detector de Captura de Elétrons (CG-DCE), através de padronização
externa (Sudatti et al., 2006). Apenas o elatol foi quantificado, previamente conhecido
como metabolito majoritário de L. dendroidea em outra localidade, o qual se constitui
em defesa química desta macroalga frente a consumidores (Pereira et al., 2003).
Nas análises de CG-DCE foi utilizado um cromatógrafo modelo Chrompack
CP 900X e os cromatogramas foram processados através do software Star
Chromatography Workstation versão 6.0. As condições cromatográficas utilizaram o
nitrogênio (N2) 99,99% (White Martins) como gás de arraste, make-up e purga. A vazão
de make-up foi de 35 ml.s-1 e de purga 15 ml.s-1. Como gás de controle do injetor
pneumático foi usado ar comprimido comercial (White Martins). Coluna capilar Restek
RTX-5 (95% dimetilpolisiloxano, 5% fenil), 0,25 µm de fase estacionária, 30 m de
comprimento e 0,25 mm de diâmetro interno. A programação de temperatura foi
iniciada a 80°C, com manutenção durante 0,5 min, seguida de rampa de 12°C min -1 até
250°C, com manutenção durante 5 min, e outra rampa de 12°C min-1 até 270°C, com
manutenção durante 5 min, seguida de redução da temperatura de 25°C min -1 até 80°C.
A rampa de 270°C foi programada para garantir a limpeza da coluna entre as injeções
das amostras. A injeção foi realizada, manualmente, a frio on column com volume de
0,5 μl (seringa Hamilton, capacidade 0,5 μl), com pressão de injeção de 90 kPa e a
velocidade do gás de arraste: 28 cm s-1. A temperatura do detector foi fixada em 320°C.
O elatol purificado foi utilizado como padrão externo nas análises de CG-DCE,
através da confecção de curvas analíticas baseadas em cinco valores de concentrações,
que variavam entre 0,38 a 3,10 ppm. A cada série de injeções de amostras, a
confiabilidade da análise foi verificada, injetando-se novamente um ponto da curva. O
limite de erro para esta injeção foi de 15%. Nos casos em que o limite de erro foi
39
ultrapassado, uma nova curva padrão foi construída. As amostras foram avolumadas a
5ml de hexano, e a solução obtida foi diluída, dependendo da amostra, de 10 a 4000
vezes para que as áreas obtidas estivessem dentro do intervalo da curva analítica,
possibilitando a quantificação. Os limites de detecção e quantificação do método foram
de 0,048 ppm e 0,112 ppm, respectivamente, segundo método proposto por USEPA
(1995). A temperatura de eluição para o elatol foi de 250°C e tempo médio de retenção
deste metabólito foi de 17,74 minutos (Figura 1.3). Os valores de concentração de elatol
obtidos nas quantificações foram obtidos através da relação entre a massa de elatol e a
massa seca de cada indivíduo (mg.g-1).
Todas as análises cromatográficas foram realizadas no Instituto de Química da
Universidade Federal Fluminense sob a supervisão da Profa. Dra. Silvana Vianna
Rodrigues.
mVolts
minutos
Figura 1.3. Cromatograma gasoso (CG-DCE) do padrão de elatol a 2,32 ppm eluído a
17,739 minutos.
40
1.4.4. Análises estatísticas
Para aceitar as premissas de normalidade e homogeneidade, os valores de
concentração de elatol foram transformados, quando necessários, usando-se a conversão
X’ = log (X + 1). Em seguida, as premissas acima descritas foram testadas e sendo
aceitas foram utilizados os testes paramétricos correspondentes (Zar, 1999).
A análise de variância (ANOVA unifatorial) foi usada para avaliar a
variabilidade nas concentrações de elatol entre as populações (programa estatístico
Gmav5) e as diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05 (α = 5%).
Quando apropriado, foram realizados testes a posteriori (teste de Student Newman
Keuls - SNK) usando o mesmo nível de significância (α = 5%) para verificar diferenças
par a par nas comparações pertinentes.
A extensão da variabilidade intrapopulacional das concentrações de elatol foi
avaliada de forma descritiva, através de histogramas de freqüência.
Predições acerca da relação entre as concentrações elatol e a latitude foram
avaliadas através da correlação de Spearman. Adicionalmente, uma análise de
agrupamento (programa Past, versão 2.09) permitiu avaliar a similaridade entre os
indivíduos amostrados baseada no teor de elatol de acordo com os sítios de coleta.
41
1.5. Resultados
A análise qualitativa dos extratos brutos dos indivíduos das populações de L.
dendroidea, feita por CCD, revelou um perfil distinto de substâncias (Figura 1.4). Na
placa comparativa do perfil químico dos extratos brutos das quatro populações
estudadas observou-se claramente a mancha de coloração roxa azulada correspondente
ao sesquiterpeno elatol. Também foi possível verificar que outros metabolitos, além do
elatol, estão presentes nos extratos de indivíduos de L. dendroidea coletados, revelando
a existência de uma variabilidade geográfica qualitativa nos metabolitos secundários
produzidos por esta espécie.
Figura 1.4. Perfil químico, através de Cromatografia em Camada Delgada, dos extratos
brutos de espécimes de diferentes populações de L. dendroidea: (1) Ilha de Cabo Frio –
população de referência; (2) Praia do Velho; (3) Praia de Vilas do Atlântico; (4) Praia
do Forno; (5) Praia de Castelhanos.
42
O uso da técnica de Cromatografia Gasosa acoplada a um Detector de Captura
de Elétrons permitiu a detecção do elatol como metabolito secundário halogenado, com
presença constante na macroalga L. dendroidea.
A
mVolts
Sítio 1
minutos
B
mVolts
Sítio 2
minutos
43
PF
C
mVolts
Sítio 3
minutos
D
mVolts
Sítio 4
minutos
Figura 1.5. Cromatogramas gasosos (CG-DCE) de cada localidade: A. sítio 1; B. sítio
2; C. sítio 3; D. sítio 4.
44
As quantificações de elatol por CG-DCE revelaram uma expressiva
variabilidade interpopulacional (geográfica) na produção deste metabolito. Os valores
médios de concentração de elatol em cada população de L. dendroidea foram
significativamente diferentes (F = 108,11(3,76), p < 0,001). No sítio 1, o teor médio de
elatol foi o mais baixo (0,05 mg de elatol /g de L. dendroidea) quando comparado as
demais localidades, ao passo que no sítio 4, a concentração média foi a mais alta (8,94
mg.g-1). Já no sítio 2 (3,12 mg.g-1) e no sítio 3 (3,17 mg.g-1), os valores médios de
concentração de elatol foram similares (Teste SNK, p < 0,05; Figura 1.6).
Figura 1.6. Valores médios de concentração de elatol (média ± desvio padrão) em cada
sítio de coleta: Sítio 1 (Praia de Vilas do Atlântico); Sítio 2 (Praia de Castelhanos); Sítio
3 (Praia do Forno); Sítio 4 (Praia do Velho). Valores expressos em mg de elatol /g de
peso seco da fronde de L. dendroidea. Sítios com letras iguais indicam tratamentos sem
diferença significativa. Os tratamentos foram considerados significativamente diferentes
quando p <0,05; ANOVA/SNK teste, n = 20.
45
A variabilidade interpopulacional também permitiu caracterizar um aumento
dos valores dos teores de elatol conforme o aumento da latitude, ou seja, em direção à
região subtropical (Correlação de Spearman, rs = 0,84; p<0,05).
Com relação à variabilidade intrapopulacional, também foi observado que os
indivíduos de L. dendroidea, em cada população, possuíam uma ampla variação na
concentração deste metabolito (Figura 1.7). Nos sítios 1 e 2, os teores de elatol variaram
entre 0,01 a 0,10 mg.g-1 (correspondente a 0,001 – 0,01% em peso seco, p.s.) e 1,56 a
4,73 mg.g-1 (0,15 – 0,47% p.s.) da macroalga, respectivamente. No sítio 3, os níveis de
elatol variaram de 0,80 a 8,04 mg.g-1 (0,08 – 0,80% p.s.), e no sítio 4, entre 5,81 a 12,40
mg.g-1 (0,58 – 1,24% p.s.).
De acordo com a análise de agrupamento, apesar desta variabilidade
intrapopulacional, os teores de elatol nos indivíduos de uma mesma localidade foram
mais semelhantes entre si do que com os dos outros locais (Método Wards: ccc =
0,8345; Figura 1.8), destacando as diferenças entre as populações (Tabela 1.1)
Tabela 1.1. Variabilidade inter- e intrapopulacional na concentração de elatol na
macroalga L. dendroidea.
Sítios de coleta
Variabilidade (% peso seco)
% de Variabilidade
1
0,001 – 0,01
10
2
0,15 – 0,47
3,13
3
0,08 – 0,80
10
4
0,58 – 1,24
2,13
Total
0,001 – 1,24
1240
46
Figura 1.7. Variabilidade intrapopulacional nas concentrações de elatol em
cada sítio de coleta: A. Sítio 1 (Praia de Vilas do Atlântico); B. Sítio 2 (Praia de
Castelhanos); C. Sítio 3 (Praia do Forno); D. Sítio 4 (Praia do Velho). Valores
expressos em mg de elatol/g de peso seco da fronde de L. dendroidea.
47
Figura 1.8. Análise de agrupamento interpopulacional (Método de Ward: ccc = 0.8345)
baseada na concentração individual de elatol nas quatro populações de L. dendroidea, n
= 20.
48
Discussão
O uso da técnica de Cromatografia Gasosa associada a um Detector de Captura
de Elétrons (CG-DCE) permitiu a quantificação dos teores de elatol em indivíduos de
quatro populações da macroalga L. dendroidea, revelando uma expressiva variabilidade
inter- e intrapopulacional. Foi possível confirmar a presença constante do elatol como
metabolito secundário halogenado na macroalga L. dendroidea. Este trabalho se
constitui na primeira avaliação acerca da variação na produção do sesquiterpeno elatol
entre populações de L. dendroidea ao longo da costa brasileira, ficando caracterizado
que cada população apresenta teores bastante particulares e variáveis desta substância.
Em Rhodophyta, as informações a respeito da variação quantitativa na
produção de metabolitos secundários halogenados, com propriedades defensivas ainda
são incipientes. No presente trabalho, verificou-se que as concentrações de elatol
variaram tanto dentro como entre as populações da macroalga L. dendroidea, em cerca
de uma a três ordens de magnitude, respectivamente. Os teores de elatol determinados
nas populações de L. dendroidea variaram entre 0,001 a 1,24% de peso seco da
macroalga, e foi observada uma variação na escala interpopulacional superior à
intrapopulacional. Em geral, os teores dos metabolitos secundários variam entre 0,2 a
2,0% do peso seco de uma macroalga, principalmente no caso de moléculas de
acetogeninas e terpenos (Hay & Steinberg 1992). Na população de L. dendroidea,
proveniente de Arraial do Cabo, os teores de elatol também foram bastante variáveis de
0.1 até 2.2% do peso seco da alga (Sudatti et al., 2006).
Alguns relatos confirmaram a comum ocorrência da variabilidade nos teores de
monoterpenos e sesquiterpenos tanto entre populações (Puglisi & Paul, 1997; Wright et
al., 2000a), quanto entre indivíduos de uma mesma localidade, nesse último caso, as
vezes em mais de uma ordem de grandeza (Matlock et al., 1999; Wright et al., 2000a;
49
Sudatti et al., 2006). Os exemplos de variação dos metabolitos secundários em
macroalgas sugerem que os teores daqueles, que atuam como química defensiva não são
absolutos e invariáveis, podendo representar especializações ecológicas a ambientes
particulares (Pereira et al., 2004).
Nesse contexto de variabilidade na produção de metabolitos secundários, com
conhecidas funções ecológicas, surgem dois questionamentos importantes: Por que
ocorre uma produção tão variável? Se as interações ecológicas mediadas por essas
substâncias são geralmente dependentes de altas concentrações nas macroalgas, por que
motivos nem todas o fazem? As respostas para isso podem residir no entendimento do
papel do ambiente e/ou da genética, e se existe algum balanço ou interação entre tais
fatores (Hay, 1996; Wright et al., 2004). A diversidade de fenótipos químicos em
plantas tem sido explicada por uma combinação de fontes de variação: genéticas
(Berenbaum & Zangerl, 1992), de desenvolvimento (Bowers & Stamp, 1993) e
ambientais (Agrell et al., 2000). No entanto, para macroalgas marinhas, também
podemos incluir como fonte de variação, a coexistência de diferentes ciclos de vida
(gametófitos masculino e feminino, n, e esporófito, 2n) como possíveis quimiotipos
distintos. Pode-se pressupor que a heterogeneidade ambiental, a limitação no fluxo
gênico, as diferenças nas fases do ciclo de vida e a estrutura etária entre as populações
de macroalgas podem determinar a observada variabilidade da química secundária.
Já se sabe que a concentração de metabolitos secundários em macroalgas pode
ser alterada em resposta a diversos fatores ambientais, em condições naturais ou em
laboratório, seja por influência da temperatura (Amade & Lemée, 1998, Palma et al.,
2004; Sudatti et al., 2011), do regime de nutrientes (Yates & Peckol, 1993; Arnold et
al., 1995; Cronin & Hay, 1996a,b; Puglisi & Paul, 1997; Pavia & Toth, 2000a), da luz
ou radiação UV (Cronin & Hay, 1996a; Pavia et al., 1997; Pavia & Brock, 2000; Pavia
50
& Toth, 2000a), da salinidade (Pedersen, 1984; Sudatti et al., 2011), pelo grau de
indução da herbivoria real ou simulada e epibiose (Van Alstyne, 1988; Cronin & Hay,
1996c, Yates & Peckol, 1993; Peckol et al., 1996; Hammerström et al., 1998; Pavia &
Toth, 2000b; Weidner et al., 2004; Da Gama et al., 2008; Sudatti, 2010). Considerando
que os fatores abióticos podem estar sujeitos a flutuações ao longo do ano, em
diferentes regiões, pode-se especular que alterações nestes fatores explicam, em parte,
as diferenças quali- e quantitativas dos metabolitos secundários em muitas espécies e
populações de macroalgas marinhas (Van Alstyne et al., 2001).
Horta et al. (2001) sugeriram que a distribuição das macroalgas ao longo da
costa brasileira se faz em duas regiões principais: a tropical (norte/nordeste), a
temperada quente (sul/sudeste), com uma zona de transição no Estado do Espírito
Santo, de acordo com a heterogeneidade de ambientes e temperatura. As áreas de coleta
escolhidas separam-se claramente entre tais zonas, como habitats de características
próprias, relativamente isolados uns dos outros. As populações de L. dendroidea
avaliadas são oriundas de localidades cujas águas apresentam temperaturas diversas ao
longo do ano, desde valores altos e quase que constantes (litoral da Bahia), a variações
sazonais associadas a correntes (litoral do Espírito Santo e norte fluminense), até
valores artificialmente altos (sul fluminense) em decorrência da proximidade da com
uma área de descarga de água aquecida (Guimarães & Coutinho, 1996; Teixeira et al.,
1999; Guimarães, 2003; Vilanova et al., 2004; Nunes, 2005). Especialmente para L.
dendroidea, experimentos em condições de laboratório indicaram que alterações nos
fatores abióticos temperatura e salinidade são mais influentes na variação dos níveis de
elatol do que outros fatores como irradiância e nutrientes (Sudatti et al., 2011).
51
As diferenças morfológicas observadas entre os indivíduos de cada população
de L. dendroidea reforçam a idéia da heterogeneidade ambiental entre as localidades de
coleta. De forma similar, Cassano (2009) verificou que no norte do estado do Rio de
Janeiro, espécimes de L. dendroidea coletados em áreas voltadas para mar aberto,
expostos à forte arrebentação das ondas ou em áreas moderadamente expostas, têm talos
de porte menor, entre 4 e 7 cm de altura, ao passo que espécimes coletados no sul do
estado em locais calmos de baías e enseadas, possuem talos maiores, com até 20 cm de
altura. Tais aspectos expressam uma clara plasticidade morfológica de L. dendroidea
em resposta a diferentes condições de hidrodinamismo. Na macroalga L. nipponica
proveniente do Japão, as diferenças morfológicas nas frondes também são resultantes de
condições ambientais particulares (Masuda et al., 1992). Uma vez que os locais de
coleta, no presente trabalho, não são semelhantes em termos de seus fatores abióticos,
os resultados encontrados, com expressiva variação interpopulacional, corroboram a
idéia de que diferentes regimes de campo contribuem em grande parte para a
variabilidade intraespecífica no teor de elatol entre populações da macroalga L.
dendroidea.
De acordo com o padrão latitudinal de produção de defesas químicas, as
maiores concentrações de metabolitos secundários seriam produzidas por macroalgas de
ambientes tropicais em função de uma maior pressão de herbivoria nestas regiões
(Gaines & Lubchenco, 1982; Hay & Fenical, 1988; Bolser & Hay, 1996; Pereira & Da
Gama, 2008). Entretanto, os resultados encontrados contrariaram o padrão latitudinal de
aumento de concentrações em direção a baixas latitudes, desde que o sítio 1, localizado
no nordeste da costa brasileira, com características tropicais, apresentou os mais baixos
valores de concentração de elatol, ao passo que o sítio 4, localizado em uma região
subtropical, apresentou os valores mais altos. Outros estudos também mostraram que as
52
concentrações de outros metabolitos secundários não variam de forma previsível com o
padrão latitudinal de variação de defesas químicas proposto na literatura. A comparação
entre os teores de florotaninos entre regiões temperadas e tropicais (Iken et al., 2007), e
ao longo da costa nordeste do Pacífico (Van Alstyne et al., 1999b), a variação nas
concentrações de furanonas em D. pulchra ao longo da costa sudeste da Austrália
(Wright et al., 2000a), bem como a variação geográfica em terpenos de S. zonale no
litoral brasileiro (Soares et al., 2003; Pereira et al., 2004) também não corresponderam
ao padrão latitudinal proposto.
O conhecimento acerca do grau de controle genético sobre o teor de
metabolitos secundários em macroalgas marinhas ainda é inicial. Foi determinada a
herança qualitativa dos metabolitos secundários halogenados na macroalga vermelha L.
nipponica (Masuda et al., 1997; Abe et al., 1999), bem como foi documentada a
ocorrência de variação genética no teor de florotaninos da macroalga parda F.
vesiculosus (Jormalainen et al., 2003; Jormalainen & Honkanen, 2004; Koivikko et al.,
2008) e a herdabilidade na produção de furanonas em D. pulchra (Wright et al., 2004).
Consequentemente, a variação intraespecífica pode estar relacionada a diferenciação
genética entre populações de macroalgas, seja por isolamento reprodutivo e/ou deriva
genética (Van Alstyne et al., 2001; Hemmi & Jormalainen, 2004). Quanto a esse
aspecto, as características dos ciclos de vida e as distâncias de dispersão são primordiais
(Hunt, 1993; Doherty et al., 1995; Ayre et al., 1997). Por exemplo, a diferenciação
genética em populações F. serratus, que apresenta propágulos com estruturas de
flutuação, ocorre em escalas espaciais de superiores a 2,0 km (Coyer et al., 2003). Já em
Delisea pulchra, que produz esporos sem flagelos, a estruturação genética é notável em
distâncias inferiores a 2,0 Km, com grande diferenciação entre indivíduos vivendo
distantes apenas 0,5 m (Wright et al., 2000b).
53
Acredita-se que a dispersão de macroalgas marinhas seja bastante restrita,
principalmente em Rhodophyta, com esporos sem flagelos (Santelices, 1990), limitando
o fluxo gênico (Wright et al., 2000b; Jormalainen & Honkanen, 2004). Um estudo com
a espécie L. nipponica do Japão indicou que a maioria dos esporos liberados fixa-se ao
substrato próximo às plantas-parentais, contribuindo para a existência de raças
químicas, mantidas pela segregação de habitats (Abe et al., 1999). Dessa forma, existe
potencial para a ação de seleção local ou deriva genética na produção de diferentes
concentrações de metabolitos secundários, caso seja geneticamente determinado,
contribuindo para a variação geográfica intraespecífica (Van Alstyne et al., 2001).
A análise de agrupamento baseada nas concentrações de elatol detectadas pode
refletir como as populações de L. dendroidea estão estruturadas, e poder-se-ia supor que
a variação quantitativa encontrada reflete a distância geográfica entre as populações
estudadas e seu reduzido fluxo gênico. Cassano (2009) avaliando a divergência genética
entre espécies do complexo Laurencia encontrou as maiores porcentagens de
divergência
genética
intraespecífica
entre
amostras
provenientes
de
áreas
geograficamente mais distantes, o que também já havia sido verificado por outros
autores. Entretanto, nas análises de agrupamento baseadas nos teores de elatol, o sítio 1,
a área mais distante, foi agrupada com os sítios 2 e 3 ao passo que o sítio 4 formou um
ramo distinto, mostrando que apenas a distância geográfica não é capaz de explicar as
diferenças encontradas, indicando que outros fatores devem receber mais atenção. Por
exemplo, algumas populações de L. nipponica da costa do Japão apresentam-se como
raças químicas distintas, onde a raça produtora de terpenóides ocorre principalmente sob
a influência de uma corrente fria, ao passo que a raça produtora de bromoéteres
distribui-se principalmente nas regiões sob influência de uma corrente quente (Masuda
et al., 1997). A variação intraespecífica na produção de florotaninos em F. vesiculosus
54
ocorreu entre localidades naturalmente fragmentadas, separadas por ilhas e diferentes
profundidades, com correntes pelágicas formando barreiras à dispersão (Hemmi &
Jormalainen, 2004).
Ainda assim, mesmo na presença de fluxo gênico, é possível ocorrer uma forte
estruturação genética. Por exemplo, se a resistência a herbivoria (como a presença de
metabolitos secundários) tem base genética, a estrutura genética das populações de
macroalgas pode ser influenciada pela seleção local daquelas com maior resistência
(Wright et al., 2000b). Em ambientes fragmentados, as interações planta-herbívoro
podem formar um mosaico geográfico no qual os traços de defesa nas várias porções
podem desenvolver-se de forma distinta dependendo do ambiente seletivo local (Wright
et al., 2000b). Apesar do efeito da herbivoria sobre a produção de elatol não ter sido
abordado neste trabalho, estudos anteriores já o revelaram como principal metabolito
secundário em L. dendroidea, com ação defensiva eficaz perante herbívoros e
organismos incrustantes (Da Gama et al., 2002; 2003; Pereira et al., 2003). Tal
propriedade defensiva do elatol se constitui em um possível fator de influência na
variabilidade quantitativa intraespecífica. No entanto, cabe ressaltar que a herbivoria
não é a única função dos metabolitos secundários de macroalgas marinhas, uma vez que
eles podem desempenhar múltiplos papéis (Schimitt et al., 1995). Conseqüentemente, o
aumento na concentração de um metabolito que afeta positivamente uma função poderia
gerar resultados positivos e/ou negativos em outra, contribuindo significativamente para
a ampla variabilidade quantitativa.
Uma expressiva variação intrapopulacional nas concentrações de elatol foi
detectada nas quatro populações estudadas, com uma faixa de variação de 2 a 10 vezes.
Como em cada localidade, todos os indivíduos desta macroalga foram coletados ao
mesmo tempo, os resultados reforçam a idéia de que a variabilidade intrapopulacional
55
nas concentrações de elatol em L. dendroidea é considerável. Fica constatado que a
variação intrapopulacional nas concentrações de elatol, ao longo da costa brasileira, é
um padrão consistente para a macroalga L. dendroidea.
As causas da ocorrência de variação quantitativa intrapopulacional de
metabolitos com propriedades defensivas ainda não são claras. Por exemplo, Matlock e
colaboradores (1999) relacionaram a variabilidade nos teores de apakaochtodenos em P.
hornemannii aos ciclos sazonais de crescimento dos indivíduos desta alga e à relação
entre o tamanho dos indivíduos e a produção de metabolitos secundários. Por outro
lado, Sudatti (2004) não constatou qualquer correlação entre as características físicas
(peso, volume, altura e grau de epibiose) das frondes de L. dendroidea e as
concentrações de elatol detectadas na superfície ou no talo desta alga, sugerindo que
variações no ambiente, causadas por fatores bióticos ou abióticos, podem também
ocorrer numa escala individual e não apenas populacional.
A variação quantitativa intrapopulacional de defesas químicas em macroalgas
marinhas também foi relacionada com as diferenças na idade ou à coexistência de
diferentes fases do ciclo de vida (Puglisi & Paul, 1997; Wright et al., 2000a). No
presente trabalho, não foi possível controlar o fator idade, porém, todos os indivíduos
coletados em campo se encontravam férteis e apresentavam a mesma fase do ciclo de
vida e ploidia (tetraspórico, 2n). Se a fase do ciclo de vida ou ploidia podem influenciar
na variabilidade da química defensiva, os resultados deste trabalho demonstram que esta
já existe, mesmo em um único estágio reprodutivo.
Mas como as condições ambientais locais podem ser importantes na produção
de elatol? Um estudo recente demonstrou que L. dendroidea possui um processo
específico de transporte de substâncias para a superfície do talo através de estruturas
celulares (corps en cerise ou corpos em cereja) de armazenamento (Salgado et al.,
56
2008). Também foi sugerido que tal transporte vesicular à superfície da célula estaria
relacionado com a exsudação de metabolitos halogenados, criando um contexto
dinâmico na interação com consumidores e epibiontes (Sudatti et al., 2008; Paradas et
al., 2010). Além disso, foi detectado que o transporte de corpos em cereja é
intensificado devido às mudanças de temperatura, irradiância e presença de epibiontes
(Paradas et al., 2010). Tais aspectos podem influenciar no padrão temporal e espacial
dos teores de elatol, evidenciando que esta produção dinâmica pode ser um aspecto
essencial na compreensão dos padrões de variabilidade na macroalga L. dendroidea.
Apesar do caráter descritivo, abordagens como a do presente estudo são necessárias ao
entendimento da real variabilidade dos teores de metabolitos secundários dentro e entre
populações de uma mesma espécie, contribuindo para a compreensão do papel funcional
destas substâncias tanto em um contexto ecológico quanto evolutivo.
57
CAPÍTULO 2
PLASTICIDADE FENOTÍPICA NO TEOR DE DEFESA QUÍMICA DA
MACROALGA Laurencia dendroidea J. AGARDH (CERAMIALES,
RHODOPHYTA).
2.1. Introdução
Os metabolitos secundários são bastante conhecidos por exercerem funções
como defesa frente a herbívoros (Hay & Steinberg, 1992; Paul, 1992; Schmitt et al.,
1995; Hay, 1996; Paul & Puglisi, 2004; Paul et al., 2001; 2011; Pereira & Da Gama,
2008). Além disso, casos de variação intraespecífica no teor dessas substâncias também
são relatados, mesmo que para um número reduzido de espécies (Paul & Fenical 1986;
Hay & Fenical 1988; Paul & Van Alstyne, 1988; Puglisi & Paul, 1997; Matlock et al.,
1999; Wright et al., 2000a; Van Alstyne et al., 2001; Pereira et al., 2004; Sudatti et al.,
2006). Acredita-se que tal variação intraespecífica, na concentração dos metabolitos
secundários, pode ser decorrente tanto de fatores ambientais quanto genéticos (Hay,
1996; Wright et al., 2000a).
Os fatores ambientais afetam a síntese de metabolitos secundários quali- e
quantitativamente e podem gerar as variações químicas observadas no ambiente natural
(Wright et al., 2000a; Van Alstyne et al., 2001). Já foram estudados os efeitos de
gradientes de temperatura (Amade & Lemée, 1998; Martí et al., 2004; Palma et al.,
2004; Oliveira, 2009; Sudatti et al., 2011); concentração de nutrientes (Yates & Peckol,
1993; Arnold et al., 1995; Cronin & Hay, 1996a,b; Peckol et al., 1996; Puglisi & Paul,
1997; Oliveira, 2009; Sudatti et al., 2011); luz (Cronin & Hay, 1996a; Pavia et al.,
1997; Pavia & Brock, 2000; Pavia & Toth, 2000a; Oliveira, 2009; Sudatti et al., 2011);
58
salinidade (Pedersen, 1984; Kamiya et al., 2010; Sudatti et al., 2011); dessecação
(Cronin & Hay, 1996b) ou pressão de herbivoria (Van Alstyne, 1988; Cronin & Hay,
1996a; Peckol et al., 1996; Weidner et al., 2004; Sudatti, 2010).
Nesse sentido, as diferenças nos teores dos metabolitos secundários entre
populações de macroalgas podem ser causadas primariamente por efeitos ambientais,
mediados pela plasticidade fenotípica (Van Alstyne et al., 2001). A plasticidade
fenotípica consiste na capacidade dos organismos de alterar a sua fisiologia ou
morfologia de acordo com as condições do ambiente. Sendo assim, a plasticidade
fenotípica também pode ter um papel importante na variação geográfica, com
implicações para processos adaptativos e evolutivos (Trussel & Etter, 2001). Alguns
trabalhos, no âmbito da ecologia sugerem que a seleção natural favoreceu a evolução da
plasticidade fenotípica em resposta a ambientes heterogêneos minimizando os seus
efeitos (Appleton & Palmer, 1988; Etter, 1988; Trussel, 1996, 2000a,b). Paralelamente,
para muitos organismos da região entre-marés (sujeitos à variação de temperatura,
salinidade, à ação de ondas, entre outros), a plasticidade pode ser um fator crítico,
essencial para a persistência em um ambiente altamente variável (Toth & Pavia, 2000;
Trussel & Etter, 2001).
Importantes processos inerentes à vida incluindo: crescimento, manutenção,
reprodução, aquisição de recursos adicionais e defesas contra inimigos naturais
requerem energia e recursos que são finitos (Cronin, 2001; Pavia & Toth, 2008). Tais
processos ocorrem simultaneamente dentro dos organismos e se inter-relacionam de
maneiras complexas (Cronin, 2001; Pavia & Toth, 2008). Sabe-se que o metabolismo
secundário compartilha precursores químicos com o metabolismo primário (por
exemplo, acetil-CoA, o ácido chiquímico e mevalônico) o que indica que as vias
metabólicas secundárias e primárias podem competir por substratos e cofatores,
59
sugerindo que demandas conflitantes (trade-offs) entre o crescimento e produção de
metabolitos secundários também podem influenciar na variação das concentrações
dessas substâncias (Cronin, 2001).
Além disso, assume-se que um recurso alocado em um processo incorre em um
custo para os processos restantes, já que parte do recurso é desviado, perdido em outro
uso (Herms & Mattson, 1992). A associação entre a produção de metabolitos
secundários e um possível custo metabólico, com conseqüente redução dos
investimentos em outros processos, como crescimento e reprodução, seria plausível.
Embora existam várias razões teóricas para acreditar que as defesas são custosas, tal
suposição é apoiada por poucas evidências diretas (Rausher, 1996). Os custos
metabólicos raramente foram demonstrados em macroalgas marinhas, e os dados não
são conclusivos (Arnold & Targett, 2003; Dworjanyn et al., 2006).
Apesar da plasticidade fenotípica ambiental e da possível ocorrência de tradeoffs, os efeitos genéticos sobre a variação podem ser predominantes, seja por adaptação
local ou por deriva genética (Wright et al., 2000a; Van Alstyne et al., 2001). Os casos
de variação na produção de metabolitos secundários associados a aspectos genéticos são
bem relatados para o ambiente terrestre (Berenbaum & Zangerl, 1992; O'Reilly-Wapstra
et al., 2002; Siemens et al., 2003; Hartmann, 2007; Andrew et al., 2010; Ballhorn et al.,
2011), mas ainda incipientes para macroalgas marinhas.
Wright e colaboradores (2004) investigaram a relação entre o perfil genético da
macroalga vermelha D. pulchra e a variabilidade nos seus compostos químicos de
defesa (furanonas). Foi avaliado se tal variabilidade era herdável (ou seja,
correlacionada ao genótipo), e se esta herdabilidade poderia responder à pressão seletiva
de herbivoria. Foi determinada uma relação significativa entre o genótipo e as
concentrações de furanonas, apoiando a idéia de uma base genética para a variação
60
observada. Entretanto, os valores calculados para herdabilidade indicaram que o
ambiente desempenhava um papel mais forte na variação (Wright et al., 2004). De
forma similar, na alga parda Fucus vesiculosus, tanto a concentração de florotaninos
(Jormalainen & Honkanen, 2004; Koivikko et al., 2008) quanto a resistência à
organismos incrustantes (Honkanen & Jormalainen, 2005; Jormalainen et al., 2003,
2008), bem como à herbívoros (Jormalainen et al., 2008) apresentaram considerável
variação de origem genética.
A ocorrência de variação genética nas concentrações de metabolitos
secundários, com característica defensiva, é um pré-requisito para a evolução das
defesas químicas em resposta à seleção por herbivoria (Jormalainen & Ramsay, 2009).
De fato, se uma característica de defesa está sob algum grau de controle genético, e
também se está relacionada ao ataque de herbívoros e a aptidão da macroalga, então a
herbivoria pode agir como uma força seletiva sobre tal característica (Mauricio &
Rausher, 1997).
Como
a
variação
na
produção
metabólica
secundária
(inter-
e
intrapopulacional) observada no ambiente natural pode surgir tanto de divergências
genéticas entre as populações quanto das respostas plásticas à variação ambiental, faz
necessário a realização de experimentos controlados para mensurar o papel destes
fatores. Nesse sentido, é fundamental a realização de experimentos de jardim comum,
ou seja, manutenção de organismos de habitats diferentes em um ambiente comum para
revelar diferenças genéticas na ausência de influências ambientais distintas (Ricklefs,
2003). Assim, somente a partir de pesquisas que considerem a variabilidade de defesas
químicas sendo influenciada, e até mesmo moldada, por fatores genéticos e ambientais,
será possível um melhor entendimento dos padrões de abundância de metabolitos
secundários. Por exemplo, através de experimentos de cruzamentos em laboratório, Abe
61
e colaboradores (1999) verificaram que a variação qualitativa de metabolitos
secundários halogenados em Laurencia nipponica é determinada por herdabilidade.
Embora seja reconhecido que ambos os fatores (plasticidade fenotípica e
controle genético) são importantes no estudo da variabilidade das concentrações de
metabolitos secundários, ainda faz-se necessário o conhecimento acerca da possível
interação entre eles (Koivikko et al., 2008; Andrew et al., 2010; Ballhorn et al., 2011).
A ocorrência de interações genótipo x ambiente (G x A) pode permitir que uma resposta
plástica específica para as mudanças ambientais varie entre as populações, também por
efeito de seus distintos genótipos. Nesse sentido, avaliações sobre a ocorrência de
interações genótipo x ambiente são importantes, pois contribuem no entendimento sobre
as causas da variação geográfica, e geram conhecimento a respeito de alguns parâmetros
genéticos, tanto intra quanto inter-populacionais (Andrew et al., 2010).
A espécie L. dendroidea, distribui-se ao longo do litoral brasileiro, com
populações
exibindo
uma
considerável
plasticidade
fenotípica
em
aspectos
morfológicos, anatômicos e citológicos em resposta às condições ambientais (Fujii,
1998; Cassano, 2009), compartilhando a produção do sesquiterpeno elatol como
principal metabolito secundário, constituindo até 2% de seu peso seco (Pereira &
Teixeira, 1999; Pereira et al., 2003, Sudatti et al., 2006; ver Capítulo 1). Este metabolito
apresenta potente atividade anti-herbivoria frente a peixes, ouriços-do-mar, gastrópodes
e crustáceos (Pereira et al., 2003), embora a concentração efetiva para a inibição de
herbivoria seja variável (Sudatti et al., 2008). Além disso, o elatol possui outras funções
adaptativas, como a ação anti-incrustante verificada em laboratório (Da Gama et al.,
2002) e no ambiente natural (Da Gama et al., 2003) e atividades biológicas importantes
(Vairappan et al., 2001, 2003; Veiga-Santos et al., 2008; Machado et al., 2010; 2011;
Santos et al., 2010).
62
Além disso, a produção do elatol na macroalga L. dendroidea apresenta
algumas particularidades, como a expressiva variabilidade geográfica nas suas
concentrações tanto em diferentes populações, quanto entre os indivíduos de uma
mesma população (Sudatti et al., 2006; ver Capítulo 1), e uma alta plasticidade
fenotípica em resposta a uma variedade de fatores abióticos e bióticos (Oliveira, 2009;
Sudatti, 2010; Sudatti et al., 2011).
Apesar do atual conhecimento sobre a dinâmica de produção de elatol em L.
dendroidea, os dados ainda não são conclusivos, pois ainda não se conhece o quanto
que o ambiente é importante para a produção e diferenciação dos teores de elatol dentro
e entre as populações. Faz-se necessário investigar a ocorrência de plasticidade
fenotípica e/ou variação genética com relação à produção de elatol, bem como, seus
papéis na determinação da variabilidade dos teores de elatol, em distintas populações de
L. dendroidea ao longo do litoral brasileiro.
63
2.2. Objetivos

Avaliar a variabilidade na concentração do sesquiterpeno elatol em populações
da macroalga Laurencia dendroidea de diferentes localidades, após a
manutenção no cultivo.

Examinar a plasticidade fenotípica para o crescimento e teores do elatol em
resposta à temperatura, em indivíduos de diferentes populações de L.
dendroidea, mantidas sob cultivo.
2.3. Hipóteses
H
1,1
As concentrações de elatol são diferentes entre as populações de L.
dendroidea após a manutenção no cultivo, ou seja, não há convergência na
produção de metabolitos secundários.
H 1,2 A temperatura tem efeitos diferentes sobre o crescimento e teores de elatol
nas diferentes populações de L. dendroidea.
H 1,3 A temperatura tem efeitos diferentes sobre o crescimento e teores de elatol
nos diferentes indivíduos de L. dendroidea.
64
2.4. Material e métodos
2.4.1. Estabelecimento da cultura unialgal
No laboratório, a partir de indivíduos (n=4) provenientes de cada uma das
quatro populações de L. dendroidea (sítios 1, 2, 3, 4) descritas no Capítulo 1 (ver secção
1.4.1), foi iniciada uma cultura unialgal, através de propagação clonal, usando
segmentos apicais (5-10 mm) excisados de cada indivíduo. Diferentes espécimes
tiveram seus ápices cortados, limpos com auxílio de pincel, papel absorvente e com
várias lavagens em água do mar esterilizada para remover os contaminantes epifíticos.
Estes ramos foram transferidos para frascos de vidro esterilizados (80 ml de capacidade)
com água do mar estéril enriquecida a 25% de solução de Provasoli (PES/4, preparado
segundo Oliveira et al., 1996; Tabela 2.1).
O isolamento dos contaminantes foi realizado através de crescimento e podas
consecutivas. Desta forma, macro e microalgas de diferentes espécies provenientes do
campo foram paulatinamente eliminadas. Quando necessário utilizou-se dióxido de
germânio a 1mg.L-1 para supressão do crescimento de diatomáceas (Kawai et al., 2005).
Após a transferência para o laboratório de cultura, com a eliminação das
diferenças ambientais, cada indivíduo de L. dendroidea passou a ser definido como um
genótipo distinto. O termo genótipo foi utilizado em referência a todas as partes algais
recortadas de um indivíduo.
2.4.2. Manutenção da cultura unialgal
A cultura unialgal foi mantida no Laboratório de Cultura de Algas da Seção de
Ficologia do Instituto de Botânica de São Paulo em câmaras de cultura sob as seguintes
condições (Figura 2.1):
65

água do mar esterilizada e enriquecida com solução de Provasoli a 25% (Tabela
2.1),

temperatura de 22±2°C,

salinidade de 32±1‰,

fotoperíodo de 14h claro:10h escuro,

densidade de fluxo fotônico de 60-80 μmol fótons m−2 s−1, fornecidos por
lâmpadas fluorescentes. A irradiância foi mensurada por um quantum
photometer (LI-250A; Li-Cor) acoplado a um sensor de quantum submerso (LI192 SA; Li-Cor).
Tabela 2.1. Composição química da solução de Provasoli, segundo Oliveira e
colaboradores (1996), sem o tampão Tris (hidroximetil) aminometano.
Reagentes
Concentração (para preparo de 1L)
NaNO3
56,00 mg
Na2-glicerofosfato. 5H2O
8,00 mg
Na2EDTA
4,00 mg
H3BO3
4,48 mg
FeCl3.6H2O
0,19 mg
MnSO4.H2O
0,48 mg
FeEDTA: Na2EDTA
2,64 mg
+ Fe(NH4)2.6H2O
2,80 mg
ZnSO4.7H2O
88,00 µg
CoSO4.7H2O
19,00 µg
Tiamina. HCl
80,00 µg
Biotina
0,80 µg
Cianocobalamina
1,60 µg
66
A água do mar utilizada no cultivo foi coletada na Base Norte do Instituto
Oceanográfico de São Paulo (23°29’S, 45°04’W), Praia do Lamberto, município de
Ubatuba, SP. Neste local, a salinidade média é de 32 ups e o pH varia de 8,0 a 8,3.
No laboratório, a água do mar foi filtrada em membrana Millipore AP 20
(retenção de partículas maiores de 1,0 μm) e aquecida em banho-maria durante 1 hora,
contados após o início da fervura. Após, o resfriamento da água à temperatura ambiente,
a mesma amostra de água foi reaquecida em banho-maria por mais 1 hora. A água do
mar submetida a tal processo passou a ser denominada como estéril.
A vidraria utilizada no cultivo foi autoclavada a 121°C durante 1 hora e os
instrumentos utilizados no manuseio das macroalgas foram esterilizados em etanol a
70% e flambados.
Figura 2.1. Local de manutenção da cultura unialgal no Laboratório de Cultura de
Algas da Seção de Ficologia do Instituto de Botânica de São Paulo.
67
2.4.3. Experimento de jardim comum
A fim de avaliar a manutenção da variação quantitativa na produção do
sesquiterpeno elatol foi realizada uma comparação da produção deste metabolito entre
as populações de L. dendroidea, descritas no Capítulo 1, após um período de oito meses
de cultivo em um ambiente comum.
Indivíduos (genótipos, n = 4 para cada praia) de L. dendroidea provenientes do
material coletado no campo foram propagados como clones, e avaliados quanto à
variabilidade interpopulacional na produção de elatol em resposta à padronização das
condições abióticas.
Os clones de quatro genótipos de cada sítio de coleta (em um total de três
réplicas para cada genótipo), totalizando 16 genótipos, com massas equivalentes (6,0
mg) foram incubados em frascos de vidro transparentes esterilizados contendo 60 ml de
água do mar esterilizada e enriquecida com PES/2, e distribuídos aleatoriamente na
prateleira de cultivo, sob as condições de cultivo descritas no item 2.4.2. As trocas de
meio de cultura, bem como a alteração da posição dos clones para evitar efeito de
posição, foram realizadas semanalmente, durante um mês. Ao final deste período, os
clones foram pesados e submetidos à extração exaustiva em hexano (grau HPLC,
TEDIA Company, Inc.).
68
2.4.4. Plasticidade fenotípica em resposta à temperatura
Para cada tratamento, clones de L. dendroidea com massas equivalentes (6,0
mg) foram incubados em frascos de vidro transparentes esterilizados contendo 60 ml de
água do mar esterilizada e enriquecida com PES/2, distribuídos aleatoriamente na
prateleira de cultivo. A troca do meio de cultura e as medidas de biomassa (peso úmido)
foram feitas semanalmente, durante um mês. Dessa forma, as medidas de biomassa
foram tomadas no tempo inicial (semana 0) e nas semanas seguintes (semanas 1, 2, 3 e
4). As medidas de biomassa foram interpretadas como crescimento da macroalga. Ao
final do experimento (semana 4), os clones de todos os tratamentos foram pesados
(Balança Sartorius), e submetidos à extração exaustiva em hexano (grau HPLC, TEDIA
Company, Inc.).
Em cada condição experimental (15 e 250C) foram selecionados quatro
genótipos distintos, na fase do ciclo de vida esporofítica e não-fértil, mantidos em
triplicata (clones), para cada população estudada, totalizando 48 réplicas para cada
temperatura testada (Figura 2.2).
A temperatura, foi alterada experimentalmente em câmaras incubadoras de
crescimento, para avaliar o seu impacto (inter- e intrapopulacional), tanto sobre o
crescimento quanto sobre as concentrações de elatol. Este fator abiótico foi escolhido
por ser capaz de promover mudanças no crescimento e nos teores de elatol em L.
dendroidea, além de ser bastante variável nos quatro sítios de coleta (Guimarães &
Coutinho, 1996; Nunes, 2005; Teixeira et al., 1999; Horta et al., 2001, Sudatti et al.,
2011). Na escolha das temperaturas a serem testadas foram estabelecidos dois valores:
um referente a uma condição ideal de desenvolvimento (25⁰C) e outro valor (15⁰C)
capaz de promover um estresse fisiológico, porém sem comprometer a sobrevivência
desta macroalga (Sudatti et al., 2011). As respostas fisiológicas do metabolismo
69
primário (biomassa) e secundário (teor de elatol) entre as populações e entre os
genótipos de cada população foram mensuradas e comparadas.
A manutenção e o estabelecimento da cultura unialgal, bem como os
experimentos descritos nas secções 2.4.3. e 2.4.4. foram realizados no Laboratório de
Cultura de Algas da Seção de Ficologia do Instituto de Botânica de São Paulo, sob a
supervisão da Profa. Dra. Mutue Toyota Fujii.
Figura 2.2. Desenho experimental para avaliação da plasticidade fenotípica (em relação
ao crescimento e teor de elatol) em resposta à temperatura. Na figura, apenas uma das
quatro populações avaliadas está representada.
70
2.4.5. Extração e quantificação do elatol
Ao término de cada experimento descrito nesta secção, os clones de L.
dendroidea foram submetidos à extração em hexano. Foram realizadas duas extrações
em 20 ml de solvente, com intervalo de uma semana.
A partir dos extratos brutos gerados, foi realizada a quantificação do elatol nos
clones através da técnica de CG-DCE descrita no Capítulo 1 (ver secção 1.4.3).
Com relação ao experimento de jardim comum, os valores de concentração de
elatol foram expressos em termos de mg de elatol/ g de peso seco da macroalga, a fim
de facilitar a comparação com os dados de campo (ver Capítulo 1). A relação peso
úmido/ peso seco foi estabelecida através da pesagem de indivíduos (n=6) obtendo-se
seguinte equação: y = 0,054x + 0,0003, r2= 0.99, onde o valor de y é correspondente ao
peso seco e o valor de x ao peso úmido.
No experimento de plasticidade fenotípica, os valores de concentração de elatol
foram expressos em termos de mg de elatol/ g de peso úmido da macroalga, já que todas
as comparações e testes foram realizados entre amostras que passaram apenas por
extração úmida.
71
2.4.6. Análises estatísticas
No experimento de jardim comum, as variações nas concentrações de elatol
entre as populações foram avaliadas através de ANOVA unifatorial.
No experimento de plasticidade fenotípica frente à temperatura, as variações no
crescimento foram avaliadas através de ANOVA multifatorial considerando-se os
efeitos da temperatura, localidade de origem e semanas de experimento (variáveis fixas)
e do genótipo (variável aleatória), bem como as interações entre esses fatores. As
variações nas concentrações de elatol foram avaliadas através de ANOVA trifatorial
considerando-se os efeitos da temperatura, da localidade de origem e do genótipo, e as
interações entre esses fatores.
Para todas as análises acima descritas, foi utilizado o programa estatístico
Gmav5, e as diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05 (α = 5%).
Quando apropriado, foram realizados testes a posteriori (teste de Student Newman
Keuls - SNK) usando o mesmo nível de significância (α = 5%) para verificar diferenças
par a par nas comparações pertinentes.
A ocorrência de demandas conflitantes entre o crescimento e a produção de
elatol foi avaliada através do teste de correlação linear (correlação de Spearman),
através do programa Statistica versão 8.0, usando como nível de significância, α = 5%.
72
2.5. Resultados
2.5.1. Experimento de jardim comum
Após oito meses de cultivo em um ambiente comum, as populações dos sítios
1, 2 e 3 apresentaram teores médios de elatol similares, e inferiores àquele detectado na
população do sítio 4, isto é, sítio 1 (10,51 mg de elatol/g de L. dendroidea) = sítio 2
(9,44 mg.g-1) = sítio 3 (8,80 mg.g-1) < sítio 4 (18,39 mg.g-1) (ANOVA unifatorial / teste
SNK: F = 6.32(3,12), p =0.008; Figura 2.3 A).
Tal perfil de variação interpopulacional na produção de elatol, após a
manutenção em um ambiente comum, foi distinto daquele observado para o ambiente
natural. Entretanto, cabe ressaltar que, com relação à produção de elatol, os quatro
indivíduos escolhidos, mesmo antes da manutenção no cultivo, refletiam a variabilidade
geográfica entre as populações relatada no Capítulo 1 (ANOVA unifatorial / teste SNK:
F = 35.40(3,12), p < 0.001; Figura 2.3 B).
73
Figura 2.3. Valores médios de concentração de elatol (média ± desvio padrão) em cada
sítio de coleta para os mesmos genótipos: A. após o experimento de jardim comum; B.
recém-coletados, isto é, antes do experimento de jardim comum. Sítio 1 (Praia de Vilas
do Atlântico-BA); Sítio 2 (Praia de Castelhanos-ES); Sítio 3 (Praia do Forno-RJ); Sítio
4 (Praia do Velho-RJ). Valores expressos em mg de elatol/g de peso seco da fronde de
L. dendroidea. Sítios com letras iguais indicam tratamentos sem diferença significativa.
Os tratamentos foram considerados significativamente diferentes quando p <0,05;
ANOVA/ teste SNK, n = 4.
74
2.5.2. Plasticidade fenotípica em resposta à temperatura
2.5.2.1. Efeitos no crescimento
O crescimento dos clones de L. dendroidea foi significativamente influenciado
pelo período do experimento (semanas) e pelas temperaturas avaliadas (15⁰C e 25⁰C). O
fator genótipo também afetou o crescimento dos clones. A análise de variância indicou
uma forte interação entre a temperatura e o tempo decorrido do experimento, afetando a
biomassa algal de diferentes maneiras e em diferentes momentos (ANOVA
multifatorial, Tabela 2.2).
Tabela 2.2. ANOVA multifatorial avaliando o efeito da temperatura, da localidade de
origem, do genótipo (localidade) e do tempo de experimento (semanas) no crescimento
(biomassa) de L. dendroidea.
Crescimento
Biomassa
Fonte de variação
g.l.
F
p
Temperatura
1
426,36
< 0,001
Semanas
4
981,16
< 0,001
Localidade
3
3,53
0,048
Genótipo (localidade)
12
9,29
< 0,001
Temperatura x Semanas
4
406,84
< 0,001
Temperatura x Localidade
3
0,92
0,462
Temperatura x Genótipo (localidade)
12
10,70
< 0,001
Semanas x Localidade
12
3,05
0,003
Semanas x Genótipo (localidade)
48
2,40
< 0,001
Temperatura x Semanas x Localidade
12
1,07
0,402
Temperatura x Semanas x Genótipo (localidade)
48
2,98
< 0,001
75
O crescimento médio das populações, ao longo das semanas de experimento,
demonstrou a influência de cada temperatura testada. No início do experimento e na
primeira semana não houve diferenças entre as populações, e também não houve
diferença entre as temperaturas testadas. A partir da segunda semana de experimento, a
influência das diferentes temperaturas testadas (15⁰C e 25⁰C) no crescimento de L.
dendroidea tornou-se significativa, com maior crescimento em temperatura mais alta
(ANOVA multifatorial / teste SNK; Figura 2.4 A e B).
Ocorreram diferenças entre as médias de crescimento das localidades a partir
da terceira semana de experimento. Sob 15⁰C, na quarta semana, os sítios 2 (0,013g) e 3
(0,014g) obtiveram crescimentos médios similares e maiores que os sítios 1 (0,010g) e 4
(0,011g), ambos também similares, sítio 3 = sítio 2 > sítio 4 = sítio 1 (ANOVA
multifatorial / teste SNK; Figura 2.4 A). Sob 25⁰C, desde a terceira semana de
experimento ocorreram diferenças entre as localidades, e na quarta semana o
crescimento médio final foi distinto com maior valor no sítio 3 (0,043g) do que no sítio
4 (0,036g) (sítio 3 > sítio 4), enquanto que o crescimento médio dos demais sítios foi
similar (ANOVA multifatorial / teste SNK; Figura 2.4 B).
76
Figura 2.4. Efeito da temperatura e do tempo sobre o crescimento (biomassa) em L.
dendroidea em cada sítio, após um mês de experimento: A. Sob temperatura de 15⁰C.
B. Sob temperatura de 25⁰C. Sítio 1 (Praia de Vilas do Atlântico-BA); Sítio 2 (Praia de
Castelhanos-ES); Sítio 3 (Praia do Forno-RJ); Sítio 4 (Praia do Velho-RJ). As barras
representam as médias e os desvios-padrão. Barras com letras iguais são tratamentos
sem diferença significativa. Os tratamentos foram considerados significativamente
diferentes quando p < 0,05; ANOVA/teste SNK, n= 4. Condições de cultura: PES/2,
32±1‰, ciclo 14:10h claro/escuro, 60-80 μmol fótons m−2 s−1.
77
O efeito de cada genótipo também foi importante para o crescimento dos
clones de L. dendroidea, apresentando interações com o tempo de experimento e com a
temperatura (ANOVA multifatorial, Tabela 2.2).
Inicialmente, todos os genótipos de um mesmo sítio, mesmo aqueles
submetidos a diferentes temperaturas, eram iguais entre si. A partir da segunda semana
de experimento (semana 2), apenas o efeito das diferentes temperaturas testadas (15⁰C
ou 25⁰C) tornou-se significativo em todos os genótipos avaliados (ANOVA
multifatorial / teste SNK; Figuras 2.5 e 2.6).
Sob a temperatura de 15⁰C, o crescimento teve um ritmo lento, com pouco
aumento de biomassa, e para todos os sítios de coleta, não ocorreram diferenças entre os
genótipos dentro cada localidade, ao longo de todo o experimento (ANOVA
multifatorial / teste SNK; Figura 2.5 A-D). Sob a temperatura de 25⁰C, crescimento
médio dos genótipos foi contínuo e significativo quando comparado àquele obtido sob a
temperatura de 15⁰C. Ao final do experimento (quarta semana) existiram diferenças no
crescimento médio dos genótipos dentro de cada localidade. No sítio 1, não ocorreu
diferença alguma entre a resposta de crescimento dos genótipos, ao passo que, nos
demais sítios existiram diferenças significativas entre os genótipos (ANOVA
multifatorial / teste SNK; Figura 2.6 A-D).
78
79
Figura 2.5. Efeito da temperatura (15⁰C) e do tempo (semanas) sobre o crescimento
médio de cada genótipo (G1-G4) de L. dendroidea, após um mês de experimento. A.
Sítio 1 (Praia de Vilas do Atlântico-BA). B. Sítio 2 (Praia de Castelhanos-ES). C. Sítio
3 (Praia do Forno-RJ). D. Sítio 4 (Praia do Velho-RJ). As barras representam as médias
e os desvios-padrão. Barras com letras iguais são tratamentos sem diferença
significativa. Os tratamentos foram considerados significativamente diferentes quando p
< 0,05; ANOVA/ teste SNK, n= 4. Condições de cultura: PES/2, 32±1‰, ciclo 14:10h
claro/escuro, 60-80 μmol fótons m−2 s−1.
80
81
Figura 2.6. Efeito da temperatura (25⁰C) e do tempo (semanas) sobre o crescimento
médio de cada genótipo (G1-G4) de L. dendroidea, após um mês de experimento. A.
Sítio 1 (Praia de Vilas do Atlântico-BA). B. Sítio 2 (Praia de Castelhanos-ES). C. Sítio
3 (Praia do Forno-RJ). D. Sítio 4 (Praia do Velho-RJ). As barras representam as médias
e os desvios-padrão. Barras com letras iguais são tratamentos sem diferença
significativa. Os tratamentos foram considerados significativamente diferentes quando p
< 0,05; ANOVA/ teste SNK, n= 4. Condições de cultura: PES/2, 32±1‰, ciclo 14:10h
claro/escuro, 60-80 μmol fótons m−2 s−1.
82
As diferenças morfológicas entre os clones mantidos sob diferentes
temperaturas podem ser observadas na Figura 2.7. Em geral, na temperatura de 15°C, as
plantas apresentavam coloração verde-amarelado e poucas ramificações. Os espécimes
desenvolvidos na temperatura de 25°C apresentavam coloração em tom avermelhado e
muitas ramificações.
A.
83
B.
Figura 2.7. Morfologia dos clones de L. dendroidea cultivados após um mês sob
diferentes temperaturas: A. Sob temperatura de 15⁰C. B. Sob temperatura de 25⁰C. Sítio
1 (Praia de Vilas do Atlântico-BA), Sítio 2 (Praia de Castelhanos-ES), Sítio 3 (Praia do
Forno-RJ), Sítio 4 (Praia do Velho-RJ). As barras representam 1cm.
84
2.5.2.2. Efeitos no teor de elatol
O teor de elatol nos clones de L. dendroidea foi significativamente
influenciado pelas temperaturas avaliadas (15⁰C e 25⁰C), pela localidade de origem, e
também pelo genótipo. A análise de variância indicou que existiu interação significativa
entre a temperatura e o genótipo, afetando os níveis de elatol determinados (ANOVA
trifatorial, Tabela 2.3).
Tabela 2.3. ANOVA trifatorial avaliando o efeito da temperatura, da localidade de
origem e do genótipo (localidade) no teor de elatol dos clones de L. dendroidea.
Elatol
Fator de variação
Gl
F
p
Temperatura
1
43,06
< 0,001
Localidade
3
8,42
0,003
Genótipo (localidade)
12
205,02
< 0,001
Temperatura x Localidade
3
2,80
0,085
Temperatura x Genótipo (localidade)
12
146,69
< 0,001
Analisando a variação genotípica na produção de elatol, foi observado que
todos os genótipos apresentaram uma concentração maior de elatol sob temperatura de
25⁰C do que quando cultivados a 15⁰C (ANOVA trifatorial / teste SNK; Figura 2.8, AD). Além disso, a comparação entre os diferentes genótipos provenientes de um mesmo
sítio revelou uma variação genotípica na produção de elatol, em resposta à variação de
temperatura, mesmo sob condições igualitárias. A maior variabilidade na produção de
elatol é encontrada sob 25⁰C, enquanto que a 15⁰C existe uma maior uniformidade nos
teores entre os genótipos (ANOVA trifatorial / teste SNK; Figura 2.8, A-D).
85
Figura 2.8. Efeito da temperatura sobre o teor médio de elatol em cada genótipo (G1G4) de L. dendroidea, após um mês de experimento. A. Sítio 1 (Praia de Vilas do
Atlântico-BA). B. Sítio 2 (Praia de Castelhanos-ES). C. Sítio 3 (Praia do Forno-RJ). D.
Sítio 4 (Praia do Velho-RJ). As barras representam as médias e os desvios-padrão.
Barras com letras iguais são tratamentos sem diferença significativa. Valores expressos
em mg de elatol/g de peso úmido da fronde de L. dendroidea. Os tratamentos foram
considerados significativamente diferentes quando p < 0,05; ANOVA/ teste SNK, n= 4.
Condições de cultura: PES/2, 32±1‰, ciclo 14:10h claro/escuro, 60-80 μmol fótons m−2
s−1.
86
2.5.2.3. Efeitos do crescimento versus teor de elatol
A análise conjunta das respostas de todos os genótipos do cultivo não revelou a
ocorrência de qualquer demanda conflitante entre o crescimento e a produção de elatol,
para as temperaturas testadas (Correlação de Spearman, n=16, p<0,05; Figura 2.9, A-B).
Figura 2.9. Crescimento versus produção de elatol nos genótipos de Laurencia
dendroidea. A. Sob temperatura de 15⁰C. B. Sob temperatura de 25⁰C. Os tratamentos
foram considerados significativos quando p < 0,05; Correlação de Spearman, n= 16.
Condições de cultura: PES/2, 32±1‰, ciclo 14:10h claro/escuro, 60-80 μmol fótons m−2
s−1.
87
A avaliação entre os genótipos dentro de cada sítio também não revelou a
ocorrência de demanda conflitante entre o crescimento e a produção de elatol. Apenas, o
sítio 4 apresentou uma correlação significativa, com a maior produção de elatol
associada a um maior crescimento, em ambas as temperaturas (Correlação de Spearman,
p<0,05; Figura 2.10).
Figura 2.10. Crescimento versus produção de elatol em espécimes de Laurencia
dendroidea provenientes do Sítio 4 (Praia do Velho-RJ). A. Sob temperatura de 15⁰C.
B. Sob temperatura de 25⁰C. Os tratamentos foram considerados significativos quando
p < 0,05; Correlação de Spearman, n= 12. Condições de cultura: PES/2, 32±1‰, ciclo
14:10h claro/escuro, 60-80 μmol fótons m−2 s−1.
88
2.6. Discussão
O experimento de jardim comum permitiu a avaliação do efeito dos fatores
ambiental e genético sobre os teores de elatol, nas populações de Laurencia dendroidea.
O experimento de plasticidade fenotípica permitiu a avaliação das respostas desta
macroalga à temperatura em nível inter- e intrapopulacional. Além disso, a utilização de
quatro genótipos distintos, provenientes de material coletado no campo (ou seja,
exibindo a variabilidade genética natural), permitiu também explorar a variação
genotípica em cada população.
Após oito meses de cultivo em ambiente comum ficou constatado, do ponto de
vista quantitativo da produção de elatol, que apesar das populações terem suas
diferenças minimizadas, ainda houve uma pequena divergência com relação ao teor
médio deste metabolito. Após o cultivo, com as condições ambientais similares, os
teores de elatol foram iguais para três dos sítios estudados, com uma maior
concentração deste metabolito observada apenas em uma localidade. Já no ambiente
natural, os teores de elatol em L. dendroidea foram significativamente distintos para três
sítios, e maiores em direção a região sul do país. A comparação por cromatografia
gasosa entre extratos de populações naturais e cultivadas da macroalga L. subopposita,
proveniente da Califórnia, mostrou que apesar de não ocorrer variação qualitativa na
produção, existe expressiva variação quantitativa, com os extratos do cultivo
produzindo as maiores concentrações (Howard et al., 1980). Já para a macroalga L.
pacifica, apesar da variação entre populações da Califórnia e do México no ambiente
natural, após cultivo em jardim comum, não existiu variação qualitativa e, de forma
similar ao presente trabalho, a variação quantitativa ocorreu em algumas populações
(Howard et al., 1980). Em geral, nota-se que no gênero Laurencia, a síntese qualitativa
dos haloterpenos é um processo conservativo, pouco afetado por fatores ambientais
89
(Howard et al., 1980). No entanto, em termos quantitativos, as diferenças entre
populações, tanto em ambiente natural quanto em cultivo, podem ser marcantes
(Howard et al., 1980; Masuda et al., 1997).
Os experimentos de jardim comum, como o que foi realizado neste trabalho,
permitem avaliar a variabilidade entre populações, eliminando os efeitos das diferenças
entre as localidades de coleta (O'Reilly-Wapstra et al., 2002; Koivikko et al., 2008). Os
resultados apontaram para o efeito do ambiente comum sobre a produção de elatol, já
que três populações tornaram-se iguais, com a redução das suas expressivas diferenças,
anteriormente detectadas. Além disso, a significativa diferenciação da população do
sítio 4 também indicou que a variação quantitativa no teor de elatol apresenta uma base
genética. Na macroalga parda F. vesiculosus, a comparação do teor de florotaninos em
três populações mantidas sob cultivo, mostrou que as diferenças quantitativas
encontradas no ambiente natural eram mantidas, sugerindo um forte controle genético
na produção quantitativa destes metabolitos (Koivikko et al., 2008).
A plasticidade fenotípica no crescimento e na produção de elatol em L.
dendroidea em resposta à temperatura foi clara. Sob 25⁰C foram detectados maiores
valores médios de crescimento e teor de elatol do que àqueles determinados sob 15⁰C.
A plasticidade fenotípica relacionada ao metabolismo primário já havia sido relatada
para algumas espécies de macroalgas vermelhas (Kuwano et al., 1998; Nishihara et al.,
2004; Tsai et al., 2005, Padilla-Gamiño & Carpenter, 2007). Já a plasticidade fenotípica
associada à atividade do metabolismo secundário, essencialmente na produção de
metabolitos halogenados de macroalgas, trata-se de uma lacuna na literatura.
Com relação apenas ao crescimento, outras espécies do gênero apresentaram
respostas similares à temperatura de cultivo. Na macroalga L. okamurae (Japão) sob
25⁰C o crescimento foi rápido e intenso, ao passo que a 15⁰C, foi lento, quase
90
inexpressivo (Kuwano et al., 1998). Em L. papillosa (Taiwan) os máximos foram
alcançados entre 25-35⁰C (Tsai et al., 2005), ao passo que em L. brongniartii (Japão) as
maiores taxas ocorreram entre 24-28⁰C e as mais baixas sob 16⁰C (Nishihara et al.,
2004).
A influência das temperaturas testadas no crescimento de L. dendroidea
tornou-se significativa a partir da semana 2, ou seja, a partir desse momento, a espécie
começa a responder à condição ambiental diferencial, ocorrendo maior crescimento a
25⁰C do que a 15⁰C. Padilla-Gamiño & Carpenter (2007) constataram diferenças nas
respostas de aclimatação de L. pacifica e L. nidifica em função da oscilação de
temperatura do ambiente, confirmando que o grau de flexibilidade de respostas
fisiológicas dentro de gênero é variável, assim como para Plocamium cartilagineum
(Palma et al., 2004).
Apesar da escassez de informações a respeito do efeito de fatores ambientais na
produção metabólica secundária sob condições de cultura foi encontrada uma curva
parabólica na produção de elatol em L. dendroidea em resposta a temperaturas de 15,
20, 25 e 30⁰C (Sudatti et al., 2011), e a alteração no teor em apenas um metabolito
secundário em P. cartilagineum sob temperaturas entre 11-18⁰C (Palma et al., 2004).
Contrariamente, a temperatura de cultivo não resultou em diferenças nas concentrações
dos metabolitos secundários das macroalgas marinhas L. okamurae (Kuwano et al.,
1998), L. synderae (Howard et al., 1980) sob variação entre 15-25°C.
Sabe-se que a temperatura é um importante fator para a sobrevivência,
distribuição e reprodução de macroalgas (Yokoya & Oliveira, 1993; Lüning, 1990;
Padilla-Gamiño & Carpenter, 2007). A relação positiva com o aumento da biomassa se
justifica porque as temperaturas mais elevadas aceleram os processos metabólicos
(Padilla-Gamiño & Carpenter, 2007). Connam e colaboradores (2007) indicaram que a
91
temperatura também estaria diretamente relacionada com respostas fisiológicas do
metabolismo secundário, podendo resultar em variações nas concentrações dos
metabolitos secundários. As alterações de temperatura também podem promover
respostas crônicas devido ao seu efeito sobre a taxa de fotossíntese (Nishihara et al.,
2004; Palma et al., 2004; Padilla-Gamiño & Carpenter, 2007), crescimento (Nishihara
et al., 2004; Palma et al., 2004; Nash et al., 2005; Padilla-Gamiño & Carpenter, 2007;
Sudatti et al., 2011) e taxa de absorção de nutrientes (Nishihara et al., 2005; Tsai et al.,
2005). Acima do limite de tolerância, a temperatura também pode causar danos às
enzimas e membranas (Fitter & Hay, 1981; Lobban & Harrison, 1994), comprometendo
a viabilidade celular.
A mudança de coloração nos talos dos clones de L. dendroidea também esteve
diretamente associada à temperatura. Assim como foi observado para L. okamurae
(Kuwano et al., 1998) com tons avermelhados, sob 25⁰C, e tons verde-amarelados, sob
15⁰C. O aumento de temperatura conduz a uma resposta de fotoaclimatação diretamente
associada com uma mudança no número e tipo de pigmentos fotossintéticos (PadillaGamiño & Carpenter, 2007). Na kelp Laminaria, tais mudanças no contéudo de
pigmentos também têm sido associadas com alterações na eficiência fotossintética
(Davison et al., 1991). Contrariamente, em Hypnea musciformis esta é uma
característica estável, não resultante de processos de fotoaclimatação (Yokoya et al.,
2006).
A avaliação interpopulacional apontou para respostas diferentes à temperatura
tanto com relação ao crescimento quanto ao teor de elatol. Com relação ao crescimento
médio, ao final do experimento (semana quatro) notou-se que cada sítio estudado
apresentou alguma particularidade. Em geral, houve uma maior ou menor aptidão em
suportar e responder às diferentes temperaturas, o que pode refletir especificidades
92
ambientais do local de origem. Em geral, os representantes de diferentes populações de
uma mesma espécie podem ter respostas fisiologicamente distintas quanto à temperatura
ótima de fotossíntese (Davison, 1991) e crescimento (Breeman, 1988). Isso se deve ao
fato de que, a habilidade de aclimatação a flutuações de temperatura pode depender de
adaptação genética (Kübler et al., 1991).
As condições de temperatura locais podem ter forte influência na temperatura
de tolerância de uma determinada espécie de macroalga. Por exemplo, indivíduos
expostos a amplas diferenças de temperaturas sazonais geralmente tem grande
tolerância térmica (Padilla-Gamiño & Carpenter, 2007). De fato, observando as médias
populacionais de crescimento, notou-se que o sítio 3 (litoral norte do Rio de Janeiro),
submetido a condições de temperatura especialmente heterogêneas e sazonais,
principalmente por efeito do fenômeno da ressurgência (Guimarães & Coutinho, 1996;
Horta et al., 2001), foi aquele que melhor respondeu a variação de temperatura,
crescendo mais que os demais em ambas temperaturas testadas. Por outro lado, no sítio
1 (litoral da Bahia) onde a temperatura da água do mar varia entre 20-27⁰C (Nunes,
2005), a melhor performance ocorreu apenas sob temperatura alta. Já no sítio 4 (litoral
sul do Rio de Janeiro) onde não ocorreu um crescimento expressivo em nenhuma das
duas temperaturas escolhidas, a temperatura da água do mar varia entre 24,4-28,4⁰C no
verão, podendo alcançar máximos de 36,5⁰C, em decorrência da sua proximidade com
uma área de descarga de água aquecida proveniente da Central Nuclear Almirante
Álvaro Alberto, CNAAA (Teixeira et al., 1999; Vilanova et al., 2004). Dessa forma, os
resultados encontrados mostraram que as temperaturas ótimas para o crescimento de
cada população de L. dendroidea podem estar associadas às especificidades ambientais.
93
Com relação à variação genotípica foi observado que as diferenças no
crescimento médio dos genótipos, dentro de uma mesma localidade, ocorreram apenas
sob a temperatura de 25⁰C. Já a variação genotípica na produção de elatol foi verificada
em espécimes de L. dendroidea mantidos sob ambas as temperaturas testadas. Contudo,
a maior variabilidade na produção de elatol foi encontrada naqueles sob 25⁰C, enquanto
que sob 15⁰C foi constatada maior uniformidade nos teores deste metabolito entre os
genótipos.
A comparação entre os genótipos de uma mesma localidade permitiu observar
uma reduzida variabilidade no crescimento médio aliada a marcantes diferenças com
relação à produção de elatol, principalmente sob 25⁰C. Isto pode indicar uma
uniformidade na resposta de L. dendroidea com relação ao crescimento (metabolismo
primário) para indivíduos de uma mesma população-fonte. De forma similar,
Jormalainen & Honkanen (2004) mostraram que a variação genética na produção de
metabolitos secundários é claramente maior do que a encontrada em outros aspectos do
metabolismo primário, como por exemplo, o crescimento.
As respostas obtidas no presente trabalho, a partir de diferentes genótipos de
localidades distintas, foram consistentes com as relatadas por Sudatti et al. (2011) com
o mesmo padrão de resposta de crescimento e produção de elatol às temperaturas
testadas, embora os referidos autores tenham trabalhado com um único indivíduo
clonado de L. dendroidea da localidade de Arraial do Cabo, no litoral norte do Rio de
Janeiro. Tal similaridade de resultados sinaliza que a extensa variação individual nos
níveis de elatol, tanto no ambiente natural (ver Capítulo 1; Sudatti et al., 2006) quanto
no laboratório, é uma das principais características da macrolaga L. dendroidea presente
no litoral brasileiro.
94
A variabilidade intrapopulacional entre os genótipos indica que a variação
quantitativa no teor de elatol tem base genética, ou seja, está sujeita ao controle
genético, e reforça o que foi encontrado no experimento de jardim comum. Dessa
forma, conclui-se que as concentrações de elatol podem ser reguladas, em resposta às
condições ambientais, contudo, a variação nas concentrações também se deve ao
genótipo. Este resultado se constitui no primeiro relato de variação genética na
produção de elatol na macroalga L. dendroidea, indicando que as concentrações de
elatol também estão sujeitas ao controle genético.
Jormalainen & Honkanen (2004) avaliando o papel do genótipo em F.
vesiculosus na resistência à incrustação biológica concluíram que o genótipo tem um
papel importante na produção de florotaninos. Posteriormente, foi descoberto que
genótipos de F. vesiculosus originários de populações distintas mostraram tendências
diferentes para a resistência (ou seja, defesa química) ou tolerância a organismos
incrustantes (Honkanen & Jormalainen, 2005). Os resultados apontaram que as
respostas de resistência a organismos incrustantes são afetados por tanto um
componente genético quanto pelo microhabitat, e que a variabilidade não parece ser
uniforme em diferentes populações (Jormalainen & Honkanen, 2004; Honkanen &
Jormalainen, 2005).
Os estudos recentes no ambiente marinho têm avaliado os papéis da filogenia
versus ecologia na produção de metabolitos secundários investigando o perfil genético
(genótipo) de algas, juntamente com fatores bióticos ou abióticos (Jormalainen et al.,
2003; Jormalainen & Honkanen, 2004; Wright et al., 2004; Honkanen & Jormalainen,
2005; Dworjanyn et al., 2006). A variabilidade genética dos herbívoros e sua resposta
às defesas químicas também têm sido investigados (Sotka, 2003). Estudos como estes
95
têm ampliado a compreensão do papel da variação genética em defesas químicas
(Pelletreau & Targett, 2008).
Os resultados deste trabalho atestam o importante papel da variação genética
na produção de elatol, sugerindo que a variação entre os genótipos no nível constitutivo,
e possivelmente em indutibilidade, pode desempenhar um papel importante nas
interações ecológicas de L. dendroidea. Um exemplo ocorre na macroalga F.
vesiculosus, na qual a variação genética em características de defesa, tanto em nível
constitutivo quanto indutivo, permite adaptação a diferentes ambientes seletivos
(Jormalainen & Ramsay, 2009; Haavisto et al., 2010).
As características dos metabolitos secundários biossintetizados por um
organismo qualquer tem origem em seu material genético, pois sua formação é
dependente de atividade enzimática, e tais enzimas envolvidas são produtos de
transcrição do genoma (Carvalho & Roque, 2000; Hartmann, 2007). Por exemplo, na
síntese de terpenos halogenados do gênero Laurencia atuam conjuntos diferentes de
enzimas, com destaque para as bromoperoxidases (Neumann et al., 2008; Suzuki et al.,
2009). Os resultados encontrados mostram que a variabilidade genotípica na produção
de elatol pode refletir uma diferenciação evolutiva tanto entre os indivíduos quanto
entre as populações. Os motivos para tal diferenciação podem estar associados com a
atuação da seleção natural sobre os indivíduos nos diferentes ambientes, sob condições
abióticas e bióticas diversificadas (Jormalainen & Honkanen, 2004). Além disso, se
existe variação genética intraespecífica em determinada característica que confere
resistência à herbivoria (por exemplo, a produção de elatol), então é possível que a
pressão dos herbívoros também atue como força seletiva sobre tal característica, e seja
diferente entre as localidades (Mauricio & Rausher, 1997; Hemmi & Jormalainen, 2004;
O'Reilly-Wapstra et al., 2004; Jormalainen & Ramsay, 2009).
96
Em geral, os recursos disponíveis para um organismo são limitados, sendo
alocados simultaneamente em vários processos inerentes à vida, incluindo crescimento,
reprodução, manutenção, defesa e aquisição de recursos adicionais (Cronin, 2001). Por
conseqüência, assume-se que um recurso alocado em um processo incorre em um custo
para os processos restantes, já que parte do recurso é desviado em outro uso (Herms &
Mattson, 1992). Dos vários modelos utilizados para explicar a distribuição e
variabilidade dos metabolitos secundários descritos na literatura, os resultados deste
trabalho apoiam-se no modelo de estresse ambiental, já que a baixa temperatura (que
claramente reduziu o desempenho fisiológico) esteve associada a uma diminuição nos
níveis de elatol. Este modelo atesta que um organismo sob condições de estresse alocará
a maior proporção dos recursos à manutenção, em comparação com um organismo nãoestressado. Em conseqüência, a produção de metabolitos secundários seria favorecida
em organismos não-estressados em relação aos estressados, influenciando a
suscetibilidade a inimigos naturais (Cronin, 2001).
A produção de elatol foi mantida, mesmo na ausência de herbívoros,
contrariando a Teoria de Defesa Ótima (TDO), e sugerindo que esta produção pode
estar associada a outras funções. A TDO pressupõe que na ausência de organismos
competidores, incrustantes e consumidores este benefício pode se tornar prejudicial,
pois a alga investe menos em crescimento e reprodução em função da produção de
defesas (Cronin, 2001; Dworjanyn et al., 2006).
A produção de metabolitos secundários tem como precursores alguns
intermediários de vias metabólicas primárias (Maschek & Baker, 2008). O fato de o
metabolismo secundário compartilhar precursores químicos com o metabolismo
primário significa que as vias metabólicas secundárias e primárias podem competir por
97
substratos e cofatores, sugerindo fortemente a ocorrência de demandas conflitantes entre
o metabolismo primário e o secundário (Maschek & Baker, 2008).
A ocorrência de tais demandas conflitantes é prevista por outro modelo de
defesa, a hipótese do balanço entre o crescimento e a diferenciação (GDBH), a qual
assume que taxas de crescimento reduzidas são compensadas pelo aumento das defesas
químicas (Herms & Mattson, 1992). Contudo, no presente trabalho não houve nenhuma
demanda conflitante entre o crescimento e a produção de elatol. Entretanto, no sítio 4
ocorreram correlações significativas positivas entre o crescimento e a produção de
elatol, em ambas as temperaturas testadas, o que não foi consistente para os demais
sítios estudados. Tal resultado contraria a GDBH, pois o crescimento foi acompanhado
de um aumento na produção de elatol. Segundo Arnold & Targett (1998) para que as
concentrações de metabolitos secundários sejam continuamente mantidas, a produção
metabólica secundária deve acompanhar o crescimento (de modo que o aumento da
biomassa não “dilua” os metabolitos).
As demandas conflitantes podem condicionar a evolução das características de
defesa, embora as evidências para os custos de defesa sejam contraditórias (Koricheva,
2002). A correlação negativa entre crescimento e teor de florotaninos foi verificada nas
macroalgas pardas Alaria nana (Pfister, 1992), Ascophyllum nodosum (Pavia et al.,
1999). Na macroalga parda F. vesiculosus, a produção de florotaninos foi custosa com o
aumento da profundidade, tornando o crescimento lento (Jormalainen & Ramsay, 2009).
Contudo, para a vermelha D. pulchra, o teor de furanonas foi positivamente relacionado
com o crescimento (Dworjanyn et al., 2006). E em clones de L. dendroidea de uma
população de Cabo Frio, apesar do teor de elatol ter sido influenciado por fatores
abióticos, isto ocorreu de forma não associada ao crescimento (Sudatti et al., 2011).
98
Os resultados deste trabalho mostraram a ausência de um padrão único na
relação entre o crescimento e a produção de elatol para todos os sítios e genótipos
avaliados. Estudos prévios tanto sobre macroalgas (Pfister, 1992; Steinberg, 1995;
Jormalainen & Honkanen, 2004) quanto sobre plantas terrestres (Bergelson &
Purrington, 1996; Koricheva, 2002; Strauss et al., 2002) indicaram claramente que as
defesas químicas não são uniformemente custosas entre espécies, substâncias, fases do
ciclo de vida ou ambientes distintos (Dworjanyn et al., 2006). Os padrões de alocação
de recursos são complexos devido ao fato de que os organismos são confrontados com
múltiplos componentes variáveis do ambiente. Além disso, os vários processos que
recebem recursos estão interligados de forma complexa e em mudança. Um padrão de
alocação ótima é um alvo em movimento, e a plasticidade nos padrões de alocação é
comumente observada (Cronin, 2001). Nesse sentido, o custo fisiológico também é
dependente das condições ambientais (Siemens et al., 2003). Supõe-se também que a
seleção natural age de forma a otimizar a alocação de recursos para melhor atender às
demandas da história de vida e do ambiente de um organismo particular, dentro das
limitações ecológicas e evolutivas (Cronin, 2001). Assim como observado por Sudatti e
colaboradores (2011), nota-se que os regimes variáveis de condições abióticas são
importantes tanto para o crescimento quanto para a suscetibilidade das frondes de L.
dendroidea, já que os níveis de elatol flutuam em resposta a tais fatores.
A variação quantitativa na produção de elatol observada em cada genótipo de
cada população reflete o quanto deste caráter é moldado geneticamente e ressalta
também a participação dos fatores ambientais uma vez que, no campo, os teores de
elatol foram muito mais variáveis do que aqueles detectados em laboratório (ver
Capítulo 1). Diante dos resultados, sugere-se que tanto fatores ambientais (mediados
pelos experimentos de variação de temperatura) quanto os genéticos (variação
99
genotípica) contribuem para a variabilidade na produção de elatol, em nível inter- e
intrapopulacional. Além disso, o efeito diferencial da temperatura sobre os genótipos
(com alta variação genotípica sob 25⁰C e baixa sob 15⁰C) mostra a existência de uma
interação entre genótipo e ambiente com relação à produção de elatol.
Uma interação genótipo x ambiente (G x A) é aquela em que cada genótipo
responde diferentemente às condições ambientais. Como conseqüência, a aptidão
relativa de cada genótipo é dependente do ambiente em que ele ocorre (Hughes, 1992).
De fato, foi observado que os investimentos na produção de elatol foram regulados em
resposta às condições de temperatura. No entanto, a intensidade dessa produção entre os
genótipos dentro de cada população foi diferente.
Ainda é inicial o conhecimento a respeito da interação entre o controle genético
e a plasticidade fenotípica das características de defesa química, embora ambos os
fatores sejam importantes para as adaptações em curto prazo e para a evolução das
características defensivas (Jormalainen & Honkanen, 2004; Jormalainen & Ramsay,
2009; Andrew et al., 2010; Haavisto et al., 2010; Ballhorn et al., 2011). Andrew e
colaboradores (2010) avaliando as contribuições ambientais e genéticas para a variação
da química secundária entre populações de Eucalyptus tricarpa (espécie terrestre)
concluíram que diferenciação entre as médias populacionais, seja devido à seleção
natural ou deriva, também dependiam de outras características, como a plasticidade e
variação genética. Ballhorn e colaboradores (2011) avaliando interações entre fatores
ambientais e genéticos na determinação de características da química secundária
defensiva em plantas terrestres demonstraram que (a) as análises dos efeitos de fatores
abióticos requerem a separação entre a variabilidade genotípica e a plasticidade
fenotípica, (b) fatores abióticos distintos afetam o fenótipo químico, (c) alterações no
fenótipo químico podem ter fortes impactos sobre os herbívoros.
100
No ambiente marinho, os primeiros estudos sobre a contribuição das interações
entre ambiente x genótipo na produção metabólica secundária vêm sendo realizados
com a produção de florotaninos na macroalga parda F. vesiculosus (Jormalainen &
Honkanen, 2004; Jormalainen & Ramsay, 2009; Haavisto et al., 2010). Sugere-se que a
variação quantitativa na produção de florotaninos pode ser mantida por seleção natural
balanceadora, através de demandas conflitantes entre o crescimento e a produção
química secundária, decorrente da heterogeneidade na disponibilidade de recursos ou
pressões de herbivoria (Jormalainem & Honkanen, 2004; Jormalainen & Ramsay,
2009). Contudo, as demandas conflitantes apenas, não explicariam a manutenção da
variação, que dependeria também do fluxo de genes entre localidades juntamente com a
variação nos gradientes de seleção gerada por respostas plásticas a ambientes do
passado (Jormalainen & Honkanen, 2004). Por exemplo, em F. vesiculosus, o balanço
entre a produção dos metabolitos de defesa e o crescimento, a pressão de herbivoria
variável espacialmente, juntamente com o fluxo gênico contribuem para na manutenção
da variabilidade das características defensivas (Jormalainen & Ramsay, 2009; Haavisto
et al., 2010).
As investigações que incorporam a composição genética na sua abordagem
fornecem evidência adicional para a importância da variabilidade individual, para a
idéia que a variabilidade nas defesas químicas pode ser genética, assim como
ambientalmente baseada, e para a noção de que populações de uma mesma espécie
podem apresentar diferentes padrões de variabilidade geneticamente baseada (Pelletreau
& Targett, 2008). Nesse sentido, a realização de experimentos de jardim comum em
laboratório permitiu o controle da variação dos fatores abióticos, e aliado à manutenção
da variação genética (uso de indivíduos distintos) facilitou a interpretação dos processos
biológicos de crescimento e produção de metabolitos secundários. Tal abordagem
101
combinada permitiu relacionar os efeitos observados às diferentes fontes de variação, ou
seja, a plasticidade fenotípica (em resposta a temperaturas distintas) e a presença de
variabilidade genotípica.
Os resultados mostram que a variabilidade intraespecífica na produção de
elatol na macroalga L. dendroidea, nos níveis inter- e intrapopulacional, é decorrente da
interação entre fatores ambientais, através da plasticidade fenotípica, permitindo
respostas rápidas às mudanças nas condições ambientais, mas também é decorrente de
variabilidade genotípica, sugerindo adaptação local, afetando a resistência ou
palatabilidade aos herbívoros, além de interferir em outras funções deste metabolito.
102
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A pesquisa em ecologia química marinha tem se concentrado principalmente
em estudos com macroalgas, relevando uma enorme variação quali- e quantitativa dos
metabolitos secundários. Dentre os fatores que podem contribuir para tal variabilidade,
destacam-se os efeitos dos fatores ambientais na produção destas substâncias.
Neste trabalho foi avaliada a ocorrência e magnitude de variabilidade, inter- e
intrapopulacional, nas concentrações do sesquiterpeno elatol na macroalga Laurencia
dendroidea, tanto em condições naturais quanto sob cultivo. Tal abordagem buscou uma
melhor compreensão da contribuição dos fatores ambientais e genéticos para a
variabilidade quantitativa do elatol, atuante como defesa anti-herbivoria e antiincrustante. Foi confirmada a presença constante do elatol como metabolito secundário
halogenado na macroalga L. dendroidea, assim como a expressiva variabilidade
quantitativa, inter- e intrapopulacional. Os teores médios determinados foram
significativamente distintos para os quatro sítios avaliados, e maiores em direção a
região subtropical, contrariando o padrão latitudinal de aumento de concentrações em
direção a baixas latitudes. Ficou constatado também que a variação intrapopulacional
nas concentrações de elatol é um padrão consistente na macroalga L. dendroidea ao
longo da costa brasileira. Entretanto, a variação na escala interpopulacional foi superior
à intrapopulacional, sugerindo que processos em pequena escala, próprios de cada
população, são importantes no controle desta variabilidade.
A fim de avaliar o quanto que condições ambientais são importantes para a
produção e diferenciação dos teores de elatol, foi estabelecida uma cultura unialgal com
indivíduos das distintas populações de L. dendroidea estudadas. Investigou-se a
103
ocorrência de plasticidade fenotípica e/ou variação genotípica com relação à produção
de elatol, bem como, seus papéis na determinação da variabilidade dos teores de elatol.
Mesmo sob condições ambientais similares, ainda ocorreram divergências com
relação ao teor médio de elatol entre as populações da macroalga L. dendroidea. A
plasticidade fenotípica em resposta à temperatura foi clara: sob 25⁰C foram detectados
maior crescimento e teor de elatol. A avaliação entre os genótipos (intrapopulacional)
indicou uma reduzida variabilidade no crescimento médio aliada a marcantes diferenças
com relação à produção de elatol entre os genótipos, principalmente sob 25⁰C,
indicando que as concentrações de elatol também estão sujeitas ao controle genético.
Não foi detectado padrão algum para um possível balanço na alocação de recursos entre
o crescimento e a produção de elatol, mas foi verificado que a baixa temperatura esteve
associada a uma diminuição nos níveis de elatol, apoiando o modelo de estresse
ambiental.
Os resultados revelaram que as concentrações de elatol podem ser reguladas
em resposta às condições ambientais, mas a variação nas concentrações também é
dependente do genótipo. Dessa forma, conclui-se que a variabilidade intraespecífica na
produção de elatol na macroalga L. dendroidea, nos níveis inter- e intrapopulacional, é
decorrente da interação entre fatores ambientais, através da plasticidade fenotípica,
permitindo respostas rápidas às mudanças nas condições ambientais, mas também é
decorrente de variabilidade genotípica, sugerindo adaptação local, afetando a resistência
ou palatabilidade aos herbívoros, além de interferir em outras funções deste metabolito.
104
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