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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
ROSENI BORTOLON GRASSI DE CARLI
DESENVOLVIMENTO DE FORMAS FARMACÊUTICAS SEMISÓLIDAS CONTENDO ÁCIDO CAURENÓICO E AVALIAÇÃO DA
ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA IN VIVO
Itajaí - 2007
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
ROSENI BORTOLON GRASSI DE CARLI
DESENVOLVIMENTO DE FORMAS FARMACÊUTICAS SEMISÓLIDAS CONTENDO ÁCIDO CAURENÓICO E AVALIAÇÃO DA
ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA IN VIVO
Dissertação submetida à Universidade do
Vale do Itajaí como parte dos requisitos
para a obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Profa. Dra. Ruth Meri Lucinda
Silva
Itajaí, novembro de 2007
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3
Dedico este trabalho ao meu esposo João Carlos e
aos meus amados filhos Felkpe, Tiago e Lucas
4
AGRADECIMENTOS
A Deus que sempre atendeu meus apelos e preces, mostrando!sempre um caminho
nos momentos mais difíceiq, mostrando que por mais difícil que pudesse parecer eu
tinha condições de vencer.
Ao meu querido e amado esposo, João Carlos, por ter cuidado de nossos filhos,
Felipe, Tiago e Lucas, sendo pai e mãe por 2 anos. Sei que houve muitos momentos
difíceis, principalmente quando nosso0filho Lucas adoeceu, mas você conseguiu
superar seus receios e d`r-me força para não desistir de nossos planos, sem você
não existiria a menor chance de ter iniciado e terminado mais esta etapa de nossas
vidas.
Aos meus amados filhos, que conseguiram superar a minha ausência. Sei que fiz
muita falta, que mesmo quando estava em casa não tinha tempo de ajudá-los com
seus deveres nem paciência de ouvir o que tinham para contar, mas toda esta
abdicação foi pensando no futuro de vocês.
A meus pais, Nelci e José Luiz, que mesmo distante, sempre se preocuparam e
rezaram muito pela minha saúde e para que tudo corresse bem nas viagens
intermináveis.
Aos meus sogros, Norma e Almerino, que ficaram ao lado de meu esposo cuidando
de nossos fihos.
Aos funcionários da farmácia que ficaram sobrecarregados de trabalho, mas
conseguiram se superar e dar conta de todo o trabalho.
Aos novos amigos que fiz durante esta jornada, Tereza, Fabiana, Luiz e Mário, muito
obrigado pelo carinho e amizade de vocês.
Ao amigo de infância que reencontrei, Beto e sua esposa Tânia, obrigada pelo
incentivo e amizade recebida.
5
A minha amiga e companheira de experimentos, Paula, a qual muito me ajudou, nos
momentos em que eu não podia estar presente.
A Roberta pela colaboração e paciência nas análises de CLAE.
Ao prof. Rilton que me orientou nos experimentos de irritação cutânea.
As minhas amigas Daiana e Lílian que me hospedaram em suas casas com todo
carinho.
A todas pessoas que direta ou indiretamente me auxiliaram a terminar mais esta
jornada da minha vida.
6
AGRADECIMENTO ESPECIAL
A minha querida orientadora Ruth, pela sua orientação, incentivo e carinho que sem
toda a sua paciência e compreensão jamais teria conseguido concluir esta etapa em
minha vida. Pela sua amizade e competência que muito contribuíram para meu
crescimento profissional. Por mais que o tempo passe, jamais poderei esquecer todo
o conhecimento que me passou e o carinho recebido, com certeza servirá muito em
minha vida pessoal e profissional.
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DESENVOLVIMENTO DE FORMAS FARMACÊUTICAS SEMI-SÓLIDAS
CONTENDO ÁCIDO CAURENÓICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
ANTIINFLAMATÓRIA IN VIVO
Roseni Bortolon Grassi de Carli
novembro, 2007
Orientadora: Profa. Ruth Meri Lucinda Silva, Dra.
Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Bioativas
Número de Páginas: 117
O ácido caurenóico (AC) é um diterpeno encontrado em diversas plantas como a
Sphagneticola trilobata, Annona glabra, Vigueira robusta, Copaifera langsdorffi,
Mikania glomerata e Mikania laevigata. O AC tem apresentado in vitro atividade
tripanosomicida, antimicrobiana e antiinflamatória entre outras, sendo um composto
com potencial aplicação no desenvolvimento de novos medicamentos. Este trabalho
teve por objetivo desenvolver cremes contendo AC e avaliar a atividade
antiinflamatória in vivo. O AC foi isolado do extrato acetônico da Sphagneticola
trilobata (caule e raiz) por maceração durante sete dias em temperatura ambiente
utilizando acetona como líquido extrator na proporção de 6:1. A pureza do AC foi
comprovada através de CCD, espectroscopia no IV e RMN 1H e 13C, perfil em CLAE e
ponto de fusão. O AC foi incorporado em cremes previamente preparados, após
dissolução em propilenoglicol. Foram preparadas cinco formulações com cera
aniônica (Lanette®) e cinco formulações com cera não iônica (Polawax®), ambas
contendo os promotores de absorção (uréia, alfa-bisabolol, oleato de isodecila,
miristato de isopropila, lecitina de soja). Estas formulações foram submetidas a estudo
prévio de estabilidade e estudo de estabilidade acelerado. Foram feitos testes de
permeação cutânea in vitro utilizando células tipo Franz adaptadas e avaliação da
atividade antiinflamatória in vivo, usando o método de edema de orelha induzido por
óleo de cróton. O AC foi isolado da planta S. trilobata com um rendimento de 0,14%.
Os cremes contendo AC e promotores de absorção apresentaram conformidade
quando analisados quanto a estabilidade física e química durante 90 dias em
temperatura ambiente e a 40 °C. Nos testes de perme ação in vitro foi observada baixa
permeação do fitofármaco em todas as formulações, porém as formulações contendo
miristato de isopropila e lecitina de soja apresentaram comportamento de permeação
mais uniforme do que as demais. Nos estudos da avaliação da atividade
antiinflamatória in vivo foi observado um efeito antiinflamatório comparado a
preparações comerciais contendo dexametasona ou óleo essencial de Cordia
verbenacea. Através deste estudo foram obtidas preparações farmacêuticas semisólidas contendo o AC e com atividade antiinflamatória tópica semelhante às
preparações comerciais.
Palavras-Chave: Ácido caurenóico. Atividade antiinflamatória tópica. Promotores de
absorção. Cremes.
8
DEVELOPMENT OF CREAMS CONTAINING KAURENOIC ACID AND
EVALUATION OF IN VIVO TOPICAL ANTIINFLAMATORY ACTIVITY
Roseni Bortolon Grassi de Carli
November, 2007
Supervisor: Dr. Ruth Meri Lucinda Silva
Area of concentration: Natural products and Bioactive substances
Number of pages: 117
Kaurenoic acid (KA) is a diterpene found in several plants such as Sphagneticola
trilobata, Annona glabra, Vigueira robusta, Copaifera langsdorffi, Mikania glomerata
and Mikania laevigata. This herbal drug presents trypanosomicidal, antimicrobial and
antiinflammatory in vitro activity, among others, with potential application as an herbal
drug in the development of new medications. The objective of this work is to develop
creams containing KC and evaluate their in vivo antiinflammatory activity. KA was
isolated from the acetonic extract of the S. trilobata (stem and root) by the maceration
method for seven days at room temperature, using acetone as extractor solvent at a
proportion of 6:1. The KA was characterized by chromatographic (TLC and HPLC) and
spectroscopic methods (IR and NMR 1H and 13C), HPLC profile and melting point. The
herbal drug was incorporated into the previously prepared cream formulations. After
dissolution in propylene glycol, five formulations with anionic wax (Lanette®) and five
formulations with non-ionic wax (Polawax®) were prepared, both containing the
permeation enhancers (urea, alpha bisabolol, isodecyl oleate, isopropyl myristate, soy
lecitin). The preparations were submitted to previous and accelerated stability studies.
in vitro skin permeation tests were carried out using adapted Franz cells, and the
antiinflammatory activity in vivo using the ear edema method, induced by croton oil.
KA was isolated from the plant S. trilobata with a yield of 0.14%. The creams
containing KA and permeation enhancers presented conformity when analyzed for
physical and chemical stability for 90 days at room temperature, and at 40 °C. In the in
vitro permeation tests low permeation of the herbal drug was observed in all the
formulations, but those containing isopropyl myristate and soy lecitin presented a more
uniform permeation profile than the others. In the studies to evaluate the
antiinflammatory activity in vivo, antiinflammatory activity was observed, compared
with commercial preparations containing dexamethasone or essential oil of Cordia
verbenacea. Through this study, semi-solid pharmaceutical preparations were
obtained containing KA, with topical antiinflammatory activity similar to that of
commercial preparations
Key words: Kaurenoic acid. Topical antiinflammatory activity. Permeation enhancers.
Creams.
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Estrutura da pele humana
20
6igura 2
Esquema da célula de Franz
40
Figura 3
Estrutura química do AC
42
Figura 4
Partes aéreas da planta Sphagneticola trilobata
43
Figura 5
Foto da célula de difusão utilizada no ensaio de liberação in
vitro
58
Figura 6
Medida basal da orelha direita de camundongos com auxílio de
micrômetro digital
60
Figura 7
AC na forma cristalina obtido após evaporação do solvente
(hexano)
64
Figura 8
Espectro de absorção do AC na região do infravermelho
65
Figura 9
Perfil do AC em cromatografia de camada delgada (CCD). L1A
– composto obtido na fração hexânica, L1B – composto obtido
na fração Hex:AcOEt 99:1; P – composto referência
66
Figura 10
Perfil cromatográfico do AC em CLAE
66
1
Figura 11
Espectro de RMN H do AC. Solvente clorofórmio deuterado.
Concentração: 30 mg/mL
67
Figura 12
Espectro de RMN 13C do AC. Solvente clorofórmio deuterado.
Concentração: 30 mg/mL
68
Figura 13
Solubilidade do AC em meio aquoso com diferentes valores de
pH, água e propilenoglicol
69
Figura 14
Titulação potenciométrica do AC
69
Figura 15
Curva analítica do AC em CLAE
71
Figura 16
Teste de estabilidade acelerado referente ao pH dos cremes
com base Lanette com os promotores de absorção em
temperatura ambiente.
79
Figura 17
Teste de estabilidade acelerado referente a espalhabilidade dos
cremes com os promotores de absorção em temperatura
ambiente
80
Figura 18
Teste de estabilidade acelerado referente à viscosidade dos
cremes com os promotores de absorção em temperatura
ambiente
81
Figura 19
Teste de estabilidade acelerado referente a tixotropia dos 82
cremes com os promotores de absorção em temperatura
ambiente
Figura 20
Teste de estabilidade acelerado referente ao pH dos cremes
com os promotores de absorção em temperatura 40°C.
84
Figura 21
Teste de estabilidade acelerado referente a espalhabilidade dos
85
10
cremes com os promotores de absorção em temperatura 40°C
Figura 22
Teste de estabilidade acelerado referente à viscosidade dos
cremes com os promotores de absorção em temperatura 40°C
86
Figura 23
Teste de estabilidade acelerado referente a tixotropia dos 87
cremes com os promotores de absorção em temperatura 40°C
Figura 24
Curvas de fluxo das formulações contendo ácido caurenóico
com ou sem promotores de absorção antes e após estudo
acelerado de estabilidade
91
Figura 25
Perfil qualitativo dos cremes contendo AC e oleato de decila
antes e após estudo de estabilidade acelerado na temperatura
de 40 °C
95
Figura 26
Perfil qualitativo dos cremes contendo AC e alfa-bisabolol, antes
e após estudo de estabilidade acelerado na temperatura de
40°C
96
Figura 27
Perfil qualitativo dos cremes contendo AC e uréia antes e após
estudo de estabilidade acelerado na temperatura de 40 °C
97
Figura 28
Perfil qualitativo dos cremes contendo AC e alfa-bisabolol e
uréia antes e após estudo de estabilidade acelerado na
temperatura de 40 °C
98
Figura 29
Perfil qualitativo dos cremes contendo AC e miristato de
isopropila e lecetina, antes e após estudo de estabilidade
acelerado na temperatura de 40 °C
99
Figura 30
Perfil de permeação in vitro de AC de formulações semi-sólidas
com base Polawax® contendo diferentes promotores de
permeação
101
Figura 31
Perfil de permeação in vitro de AC de formulações semi-sólidas 102
com base Lanette® ontendo diferentes promotores de
permeação
Figura 32
Atividade antiinflamatória dos cremes de AC pelo método de
edema de orelha
103
Figura 33
Placa de gel de agarose com creme contendo AC e controle
positivo (DSS)
107
Figura 34
Creme com (A) e sem AC (B), sem contraste de fases (400X)
108
Figura 35
Controle positivo sem contraste de fases (400X)
108
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Resultados da análise de precisão do método analítico para
quantificação do AC por CLAE
72
Tabela 2
Teor de ácido caurenóico por grama de creme antes e após
estudo de estabilidade acelerado, por CLAE
94
Tabela 3
Porcentagem de inibição da atividade antiinflamatória dos
cremes de AC pelo método de edema de orelha
104
Tabela 4
Resultados obtidos no teste de irritação cutânea nos cremes
contendo AC através do método de agarose overlay
107
12
LISTA DE QUADROS
Quadro 1
Formulações de base semi-sólida com cera Lanette® e
promotores de absorção
53
Quadro 2
Formulação de base semi-sólida com cera Polawax® e
promotores de absorção
54
Quadrg 3
Classificação do grau de irritação Cutânea
63
Quadro 4
Características das formulações com base Polawax® sem AC
no tempo zero e tempo 12 dias após estresse térmico (ciclo
gelo-degelo)
75
QuAdro 5
Características das formulações com base Lanette® sem AC
no tdmpo zero e no tempo12 dias após estresse térmIco (ciclo
gelo-degeln)
76
Quadro 6
CaRacterísticas dos cremes com áciDo caurenóico e
promotores de absorção no teste de estabilidade acelerado
em temperatura ambiente
'8
Quadro 7
Características dos cremes com ácido caurenóico e
promotores de absorção no teste de estabilidade acelerado
em temperatura 40 °C
83
13
LISTA DE ABREVIATURAS
AC
Ácido caurenóico
AM/CL
Amarelo/Claro
BR/OP
Branco/Opaco
L
Creme lanette® sem AC
LA
Creme lanette® contendo 0,1% de AC
LAA
Creme lanette® contendo 0,1% de AC mais alfa-bisabolol
LAML
Creme lanette®contendo 0,1% de AC mais miristato de
isopropila e lecitina de soja
LAO
Creme lanette® contendo 0,1% de AC mais oleato de isodecila
LAU
Creme lanette® contendo 0,1% de AC mais uréia
LAUA
Creme lanette® contendo 0,1% de AC mais uréia e alfabisabolol
LML
Creme lanette contendo miristato de isopropila e lecitina de soja
LO
Creme lanette contendo oleato de isodecila
LU
Creme lanette contendo uréia
LUA
Creme lanette contendo uréia e alfa-bisabolol
PA
Creme polawax contendo alfa-bisabolol
PML
Creme polawax contendo miristato de isopropila e lecitina de
soja
PO
Creme polawax contendo oleato de isodecila
PU
Creme polawax contendo uréia
PUA
Creme polawax contendo uréia e alfa-bisabolol
14
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 17
2 OBJETIVOS ......................................................................................................... 19
2.1 Objetivo Geral .................................................................................................. 19
2.2 Objetivos Específicos ..................................................................................... 19
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................ 20
3.1 Pele Humana .................................................................................................... 20
3.1.1 Anatomia e Fisiologia .................................................................................. 20
3.1.2 Funções da Pele ........................................................................................... 22
3.2 Absorção Cutânea ........................................................................................... 23
3.3 Promotores de Absorção ................................................................................ 26
3.3.1 Sulfóxidos ..................................................................................................... 29
3.3.2 Pirrolidonas .................................................................................................. 31
3.3.3 Ácidos e álcoois graxos .............................................................................. 31
3.3.3.1 ÁCIDO OLÉICO E MIRISTATO DE ISOPROPILA ............................................................. 32
3.3.4 Azone® .............................................................................................................................................................. 33
3.3.5 Uréia ............................................................................................................... 35
3.3.6 Tensoativos .................................................................................................. 35
3.3.7 Óleos essenciais .......................................................................................... 37
3.3.7.1 D-LIMONENO .................................................................................................. 37
3.4 Métodos de permeação cutânea in vitro ....................................................... 39
3.5 Ácido Caurenóico ............................................................................................ 42
4 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 47
4.1 Materiais ........................................................................................................... 47
4.1.1 Matérias primas e reagentes ....................................................................... 47
4.1.2 Equipamentos ............................................................................................... 48
4.2 Métodos ............................................................................................................ 49
4.2.1 Isolamento do AC ......................................................................................... 49
4.2.2 Caracterização do AC .................................................................................... 50
4.2.2.1 SOLUBILIDADE E PKA DO AC ............................................................................. 50
4.2.2.2 DETERMINAÇÃO DO COEFICIENTE DE PARTIÇÃO DO AC EM ÓLEO/TAMPÃO ............ 51
15
4.2.3 Quantificação do AC por CLAE ..................................................................... 51
4.2.4 Desenvolvimento e estudo da estabilidade das formulações .................... 52
4.2.4.1 PREPARAÇÃO DAS FORMULAÇÕES SEMI-SÓLIDAS ................................................ 52
4.2.4.2 ESTUDO PRÉVIO DE ESTABILIDADE ..................................................................... 54
4.2.4.2.1 CARACTERES ORGANOLÉPTICOS .................................................................... 54
4.2.4.2.2 DETERMINAÇÃO DO pH .................................................................................. 55
4.2.4.2.3 RESISTÊNCIA FÍSICA ...................................................................................... 55
4.2.4.2.4 ESPALHABILIDADE ......................................................................................... 55
4.2.4.3 PREPARAÇÃO DAS FORMULAÇÕES SEMI-SÓLIDAS CONTENDO AC ......................... 56
4.2.4.4 ESTUDO DE ESTABILIDADE ACELERADO DAS FORMULAÇÕES SEMI-SÓLIDAS ............ 56
4.2.4.4.1 VISCOSIDADE E TIXOTROPIA ........................................................................... 56
4.2.4.4.2 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) ............................................... 57
4.2.4.4.3 TEOR DE AC ................................................................................................. 57
4.2.5 Estudo de Permeação in vitro ....................................................................... 57
4.2.6 Avaliação da atividade antiinflamatória in vivo ........................................... 58
4.2.6.1 ANIMAIS .......................................................................................................... 59
4.2.6.2 MÉTODO DE EDEMA DE ORELHA INDUZIDO POR ÓLEO DE CRÓTON ....................... 59
4.2.6.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA ....................................................................................... 60
4.2.7 Teste de irritação cutânea ............................................................................. 60
4.2.7.1 TÉCNICA PARA O PREPARO DE MEIO DE CULTURA COM SORO FETAL BOVINO .......... 60
4.2.7.2 TÉCNICA PARA O PREPARO DE MEIO DE CULTURA COM SORO FETAL BOVINO
CONCENTRADO ............................................................................................................ 61
4.2.7.3 CONTROLE DE QUALIDADE MICROBIOLÓGICO DO MEIO DE CULTURA COM SORO FETAL
BOVINO ....................................................................................................................... 61
4.2.7.4 MANUTENÇÃO CELULAR E CRESCIMENTO............................................................ 61
4.2.7.5. ENSAIO AGAROSE OVERLAY ............................................................................. 62
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 64
5.1 Isolamento e Caracterização do AC ............................................................... 64
5.1.1 Solubilidade do AC........................................................................................ 68
5.1.2 Coeficiente de Partição ................................................................................. 69
5.2 Quantificação do AC por CLAE ........................................................................ 70
5.3 Desenvolvimento e estudo de estabilidade das formulações ....................... 72
5.3.1 Testes prévios de estabilidade ..................................................................... 72
16
5.3.2 Estudo de Estabilidade Acelerado das Formulações Semi-sólidas .......... 77
5.4 Estudo de permeação in vitro
100
5.5 Avaliação da atividade antiinflamatória in vivo
102
5.6 Avaliação da irritação cutânea
106
6 CONCLUSÕES ................................................................................................... 109
REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 111
17
1 INTRODUÇÃO
As plantas medicinais têm sido objeto de estudo na tentativa de descobrir
novas fontes de obtenção de princípios ativos. A partir do uso popular das plantas
medicinais, inicia-se a cadeia dos fitomedicamentos, que envolve conhecimentos
das áreas de botânica, agronomia, etnofarmacologia, etnobotânica, farmacologia,
fitoquímica, farmacognosia, médica e tecnologia farmacêutica, entre outras
(PETROVICK; MARQUES; DE PAULA, 1999). O estudo de fitomedicamentos é um
nicho estratégico para o desenvolvimento tecnológico nacional de novos
medicamentos (ALVES, 2005). Existe atualmente uma dependência dos laboratórios
farmacêuticos brasileiros na utilização de fármacos importados devido à existência
de poucas empresas produtoras de fármacos no País (em torno de 40). No ano de
2000 a dependência da importação foi de 80% da demanda, sendo necessário o
fortalecimento das indústrias para produzirem matérias -primas no território nacional
(BRASIL, 2003).
No Brasil, nos últimos anos, os fitomedicamentos apresentaram um
crescimento de 15% contra apenas 4% dos medicamentos sintéticos. Para registrálos são necessários estudos científicos que comprovem a qualidade, eficácia e
segurança de uso. O desenvolvimento desses medicamentos requer muito menos
recurso e menos tempo de pesquisa, comparado ao desenvolvimento de um novo
medicamento sintético (ACHE, 2005a).
Este trabalho tem a finalidade de desenvolver um fitomedicamento usando o
AC, um caureno, extraído da Sphagneticola trilobata, como fitofármaco. A S. trilobata
foi escolhida como fonte de obtenção da substância por ser uma planta estudada por
pesquisadores do Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR). Já
foram realizadas análises fitoquímicas (BRESCIANI et al., 2004), biológicas como
antiinfamatória, analgésica (BLOCK et al., 1998) e antimicrobiano (SARTORI et al.,
2003), assim como foram desenvolvidas formas farmacêuticas semi-sólidas
contendo o extrato bruto da mesma (CZEPULA, 2006). Esta planta encontra-se em
abundância no estado de Santa Catarina e é cultivada no horto medicinal da
UNIVALI em Itajaí- SC. O AC é um dos compostos majoritários e foi selecionado
como marcador para validação da metodologia analítica para controle de qualidade
do medicamento fitoterápico por CLAE (ZANELLA et al., 2006).
18
O AC está presente em grande quantidade nas raízes (6,65 mg/g de planta
seca) e nos caules (4,96 mg/g planta seca) desta planta (BRESCIANI et al., 2004).
A S. trilobata (Asteraceae) é conhecida como margaridão, pingo d’ouro,
pseudoarnica, entre outros. É largamente usada na medicina popular para diversas
desordens, incluindo infecções do trato respiratório, inflamações e afecções em
geral.
Possui
atividade
antimicrobiana,
antiparasiticida,
inseticida,
anti-HIV
(REZENDE et al., 2000), analgésica (BLOCK et al., 1998). Em estudos anteriores foi
demonstrada que estas atividades devem-se principalmente à presença do AC
(CECHINEL FILHO; YUNES, 1998).
Devido às importantes ações analgésicas e antiinflamatórias relatadas do AC
(BLOCK et al., 1998), este foi extraído da S. trilobata, isolado e incorporado em
formulações semi-sólidas usando bases emulsionadas com e sem promotores de
absorção a fim de verificar in vitro a permeação cutânea do AC e avaliar a atividade
antiinflamatória tópica in vivo.
Buscou-se com este trabalho o desenvolvimento de um novo fitomedicamento
para uso tópico com ação antiinflamatória, salientando-se a importância da busca
por novos fármacos a partir de plantas medicinais nativas, capazes de dar origem a
medicamentos seguros, eficazes e de fácil acesso à população por meio do
aproveitamento
racional
da
nossa
biodiversidade
desenvolvimento de laboratórios farmacêuticos nacionais.
e
contribuindo
para
o
19
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Desenvolver formas farmacêuticas semi-sólidas tópicas contendo AC e avaliar
a atividade antiinflamatória in vivo.
2.2 Objetivos Específicos
- Isolar e caracterizar o AC a partir das raízes da S. trilobata.
- Desenvolver cremes com diferentes bases e com diferentes promotores de
absorção.
- Incorporar o AC nas diferentes formulações semi-sólidas e verificar a sua
estabilidade.
- Analisar a permeação in vitro do AC a partir das formulações desenvolvidas
com diferentes promotores de absorção.
- Verificar a atividade antiinflamatória in vivo das formulações desenvolvidas
pelo modelo de edema de orelha.
- Verificar a irritação cutânea in vitro das formulações semi-sólidas através do
método de agarose overlay.
20
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Pele Humana
3.1.1 Anatomia e Fisiologia
A pele é o maior órgão do corpo humano e também um dos mais complexos
(HARDING, 2004). É composta de três camadas de tecidos: a epiderme, derme e
hipoderme (PRISTA; BAHIA; VILAR, 1992), conforme mostrado na figura 1.
Figura 1 - Estrutura da pele humana (BEAR; CONNORS; PARADISO, 2002).
A epiderme cobre totalmente o corpo humano, sendo a camada mais
superficial da pele. Sua principal função é proteger o organismo das agressões do
ambiente exterior. A epiderme está constantemente em renovação, onde as células
dividem-se, migram, diferenciam-se e morrem (PRUNIÉRAS, 1994; HARDING,
2004).
Segundo Junqueira e Carneiro (2004) e Harding (2004), na epiderme há
quatro tipos de células, as células epiteliais, os melanócitos, as células de
Langerhans e as células de Merkel. Há quatro camadas de células epiteliais
distintas:
21
•
A camada basal (Stratum germinativum)
•
O corpo mucoso de Malpighi (Stratum spinosum)
•
A camada granulosa (Stratum granulosum)
•
A camada córnea (Stratum corneum)
As células da camada basal formam uma camada monocelular implantada
sobre as papilas da derme superficial, entre as quais elas enviam brotos epidérmicos
interpapilares. As células do Stratum spinosum formam três ou quatro camadas de
elementos poliédricos que tendem a alongar-se horizontalmente nas camadas
superficiais. O Stratum granulosum forma uma faixa escura de três camadas de
células granulosas, achatadas, fusiformes, situadas imediatamente sob a camada
córnea. O Stratum corneum é constituído pela superposição de células
completamente queratinizadas, anucleadas, formando lamelas muito alongadas de
0,5 a 0,8 µm de espessura e até 30 µm de comprimento. O número das camadas
celulares é muito variável, 15 a 20 na altura do abdômen e do dorso, várias centenas
de camadas na altura da região plantar. O Stratum lucidum, subcamada
intermediária inconstante, situada abaixo da camada granulosa, tem aspecto de uma
faixa hialina estreita que se observa na altura da pele da região palmoplantar
(PRUNIÉRAS, 1994; HARDING, 2004).
Os melanócitos são células existentes na camada basal e produzem a
melanina, pigmento que cora a pele e são excretados para as células vizinhas, os
queratinócitos. As células de langerhans aparecem nos estratos intermediários da
epiderme, junto aos queratinócitos e, são considerados como macrófagos. As
células de Merkel são células epiteliais modificadas com extremidade nervosa
sensitiva, localizam-se entre as células epidérmicas basais (PRISTA; BAHIA; VILAR,
1992).
A derme, cútis ou córion é formada por tecido conjuntivo denso, vasos e
nervos. O tecido conjuntivo é constituído por células e elementos extracelulares. As
células são residentes (fibroblastos, histiócitos, macrófagos e mastócitos) e
migratórias (leucócitos, eosinófilos e plasmócitos). Os elementos extracelulares são
fibras (colágenas, reticulares, elásticas, pré-elásticas, de ancoragem) e a substância
intersticial,
a
qual
é
amorfa
formada
principalmente
por
glicoproteínas
(mucopolissacarídeos, ácidos) (PRISTA; BAHIA; VILAR, 1992). Ela necessita de um
suprimento sangüíneo eficiente para transportar nutrientes, remover produtos de
degradação, regular a pressão e a temperatura, mobilizar forças de defesa e
22
contribuir para a coloração da pele. Ramificações do plexo arterial levam o sangue
para as glândulas sudoríparas, os folículos pilosos, a gordura subcutânea e a derme
(BARRY, 2005).
A espessura da derme, ou seja, a quantidade de colágeno depende do local
do tegumento. A derme do dorso é mais espessa que a dos membros e mais
espessa ainda que a das pálpebras. A espessura da derme varia com a idade, o
sexo e o estado nutricional. A espessura aumenta na infância e na adolescência,
atingindo sua espessura máxima na quarta década e diminui em seguida. A
espessura é maior nos homens do que nas mulheres e deficiências nutricionais
severas podem afinar a derme (PRUNIÉRAS, 1994).
A epiderme assenta sobre a derme, a qual se acomoda sobre uma camada
de tecido subcutâneo com células adiposas, a hipoderme. Na hipoderme nascem os
diversos apêndices cutâneos (folículos pilosos, glândulas sebáceas e glândulas
sudoríparas écrinas ou apócrinas) os quais atravessam a pele e surgem à sua
superfície ou para ela se canalizam através dos pêlos. Uma completa rede vascular
composta de arteríolas, vênulas e capilares, surgem na hipoderme e atinge o limiar
da camada basal epidérmica (PRISTA; BAHIA; VILAR, 1992).
A hipoderme funciona como amortecedor mecânico e barreira térmica, que
sintetiza e estoca rapidamente substâncias energéticas prontamente disponíveis
(BARRY, 2005).
3.1.2 Funções da Pele
A pele desempenha diversas funções, como, contenção de fluidos e tecidos,
proteção em relação ao exterior, recepção de estímulos externos e manutenção da
homeostasia (PRISTA; BAHIA; VILAR, 1992; HARDING, 2004). É resistente e
flexível devido à presença de proteínas fibrosas, como o colágeno e a elastina. O
caráter elástico da pele permite após uma extensão, que os contornos iniciais se
mantenham, esta extensibilidade atribui-se ao alinhamento rígido das fibras de
colágeno (PRISTA; BAHIA; VILAR, 1992).
Com a idade, a pele enruga e torna-se mais rígida. A fina camada córnea é
relativamente forte e sua maleabilidade depende de um equilíbrio de lipídeos e água.
O tecido requer de 10 a 20% de umidade para agir como plastificante e manter sua
flexibilidade (BARRY, 2005).
23
Quando a quantidade de água é inferior a 10% a pele fica com aspecto seco e
rugoso. A capacidade da pele em fixar água dos tecidos mais profundos depende
dos compostos nela dissolvidos e dos lipídeos teciduais. A hidratação cutânea
facilita a penetração das substâncias através da epiderme. Em seu estado normal a
pele atua como uma interface entre o meio interno e o ambiente, através do estrato
córneo e dos apêndices cutâneos. O estrato córneo é a camada mais externa da
pele e constitui uma barreira perfeita que controla a saída de compostos e água do
organismo, age contra a invasão microbiana, impedindo que bactérias e fungos
atinjam os tecidos viáveis da pele, dificultando o crescimento microbiano e atuando
como preventiva para as infecções (PRISTA; BAHIA; VILAR, 1992; HARDING,
2004).
Se os microorganismos penetrarem nas fendas superficiais e o estrato córneo
estiver danificado, pode permitir o acesso dos microorganismos a tecidos mais
profundos nos quais podem desenvolver-se. As glândulas da pele secretam ácidos
graxos de cadeia curta que inibem o crescimento de bactérias e fungos (BARRY,
2005).
3.2 Absorção Cutânea
A pele e as mucosas têm sido freqüentemente estudadas como via de
administração de fármacos sendo extremamente atrativa não apenas pelo seu efeito
cutâneo,
mas
transdérmica)
também
e
pela
pela
obtenção
ausência
do
de
efeito
metabolismo
sistêmico
(administração
hepático
(PRAUSNITZ;
MITRAGOTRI; LANGER, 2004; HENRIQUES; SIMÕES-PIRES; APEL, 2007).
Durante muito tempo a pele foi considerada como uma barreira impermeável.
Este conceito foi modificado e se reconheceram diferentes graus de permeabilidade
(PRISTA; BAHIA; VILAR, 1992). A velocidade de movimentação dos fármacos
através do estrato córneo depende da concentração destes no veículo, de sua
solubilidade, do coeficiente de partição óleo/água no estrato córneo e no veículo e
do massa molecular do fármaco (LUCINDA; EVANGELISTA, 1999; ALLEN Jr.;
POPOVICH; ANSEL, 2007). Independente do tipo de produto aplicado sobre a pele,
ele interfere com a biosfera cutânea e modifica em maior ou menor grau, a
bioquímica e a fisiologia cutânea (PRUNIÉRAS, 1994).
24
A pouca penetração dos fármacos na pele limita a eficácia das formulações
tópicas. Esta penetração pode ser potencializada pela difusão ou pela solubilidade
crescente do fármaco na pele ou aumentando o grau de saturação deste na
formulação (MOSER et al., 2001; KAKUBARI, et al., 2006).
A absorção cutânea de um fármaco em preparações dermatológicas
(pomadas, cremes) não depende apenas das propriedades físico-químicas deste,
mas também do seu comportamento junto ao veículo farmacêutico e da condição da
pele. Um veículo pode não penetrar muito na pele nem transportar o fármaco através
dela, mas influencia a velocidade e o grau de penetração, variando para diferentes
fármacos e veículos. Para cada fármaco deve ser feita uma escolha individual do
veículo quanto a sua absorção e eficácia (ALLEN Jr.; POPOVICH; ANSEL, 2007).
Os veículos naturalmente podem modificar as propriedades do estrato córneo, por
exemplo, aumentar a hidratação, a qual pode influenciar no perfil de penetração dos
compostos ativos (DUPUIS et al., 1986). São pouco os compostos de interesse
farmacológico que possuem propriedades físico-químicas necessárias para penetrar
rapidamente a epiderme, principalmente no estrato córneo (SHOKRI et al., 2001).
Em geral existem duas rotas de difusão para as moléculas penetrarem na
pele após aplicação tópica: através das paredes dos folículos pilosos, das glândulas
sudoríparas e sebáceas (transcelular) ou por entre as células da camada córnea
(intercelular), sendo a rota intercelular considerada como a principal rota para
permeação de fármaco (YAMASHITA; HASHIDA, 2003; ALLEN Jr.; POPOVICH;
ANSEL, 2007). Os apêndices representam 0,1 % da superfície cutânea, sendo
pequena a sua contribuição, desse modo é essencial a transposição do estrato
córneo para penetração de compostos na pele (MOSER et al., 2001; YAMASHITA;
HASHIDA, 2003).
A pele é um tecido multicamada heterogêneo, e na absorção percutânea, o
gradiente de concentração desenvolve-se ao longo de vários estratos. O extrato
córneo, que é uma das camadas da epiderme, exerce o maior controle sobre a
permeação na pele. A maioria dos não-eletrólitos pouco solúveis em água difunde
no sistema capilar mil vezes mais rapidamente quando a epiderme está ausente,
danificada ou doente. Na pele intacta, as substâncias penetram a velocidade que
podem diferir em 10 mil vezes (BARRY, 2005).
O estrato córneo é considerado heterogêneo, possui dois regimes físicoquímicos distintos, cada um capaz de apresentar o seu fluxo. Um deles, através da
25
matriz de queratina, é considerado polar e dispõe-se preferencialmente para a
transferência das substâncias polares. O outro caminho intercelular lipídico dá à pele
a qualidade de membrana lipóide (PRISTA; BAHIA; VILAR, 1992).
Como o estrato córneo é um tecido morto, não existem processos de
transporte ativo e nenhuma diferença fundamental entre processos de permeação in
vivo e in vitro. As camadas viáveis, principalmente a epiderme, podem metabolizar e
inativar um fármaco ou ativar um pró-fármaco. A camada papilar dérmica contém
tantos capilares que o tempo médio de residência de um fármaco na derme pode ser
de um minuto antes que seja absorvido. As camadas dérmicas mais profundas não
influenciam
a
absorção
transdérmica,
embora
fármacos
como
agentes
antiinflamatórios não-esteróides possam penetrar profundamente até atingir os
músculos (BARRY, 2005).
O estrato córneo apresenta uma considerável barreira lipofílica à permeação
de substâncias químicas. Por outro lado, a epiderme viável, a qual está
imediatamente abaixo do estrato córneo é hidrofílica e pode atuar como um passo
limitante na absorção de fármacos altamente lipofílicos. O resultado de uma
característica ótima de absorção percutânea é o permeante ser razoavelmente
solúvel em ambos os meios hidrofílicos e hidrofóbicos, o qual é intimamente ligado
com o coeficiente de partição O/A do permeante (ROBERTS, 1991).
Os principais fatores que influenciam a absorção percutânea segundo Barry
(2005) e Allen Jr., Popovich e Ansel (2007), são:
•
A quantidade absorvida por via percutânea aumenta à medida que a
concentração do fármaco no veículo aumenta.
•
O fármaco deve apresentar maior afinidade físico-química com a pele do que
com o veículo no qual é apresentado, para que migre do veículo em direção à
pele.
•
Certo grau de solubilidade do fármaco, tanto em lipídeos quanto em água, é
considerado essencial para absorção percutânea efetiva.
•
A absorção é aumentada usando veículos que se espalhem facilmente sobre
a superfície da pele.
•
Os veículos que aumentam a hidratação da pele geralmente favorecem a
absorção percutânea.
26
•
Os veículos oleosos e os curativos oclusivos agem como barreiras à umidade
levando ao aumento da hidratação cutânea.
•
Quanto maior o período e a intensidade da fricção, maior a absorção.
•
A absorção percutânea é maior quando o medicamento é aplicado na pele
que possui uma camada córnea fina.
•
Várias aplicações diárias podem aumentar a biodisponibilidade e a absorção
do fármaco.
3.3 Promotores de Absorção
A propriedade de barreira da pele é atribuída à camada córnea que é formada
por corneócitos, cuja bicamada lipídica aumenta a resistência ao transporte de íons
(KOST; LEVY; LANGER, 1989; MORIMOTO et al., 1994; SHOKRI et al., 2001). O
estrato córneo é uma barreira resistente à penetração e tem uma grande
variabilidade biológica na sua permeabilidade e a maioria dos fármacos penetra na
pele humana com pouca intensidade (SHOKRI et al., 2001; BARRY, 2005;
HENRIQUES; SIMÕES-PIRES; APEL, 2007). Assim, o fluxo através da pele
depende da natureza química da substância. Fármacos lipofílicos são absorvidos em
toda área lipídica do estrato córneo, com coeficientes de permeação variáveis,
enquanto que a absorção de fármacos hidrofílicos se dá quase que exclusivamente
por poros de passagem sendo que o coeficiente de permeação é quase constante
(MORIMOTO et al., 1994). Devido à dificuldade na penetração de fármacos pela
pele, agentes químicos e físicos vêm sendo pesquisados para que as barreiras da
pele sejam diminuídas e, assim, se acentue a penetração cutânea. Estes agentes
químicos e físicos agem como promotores de absorção (KOST; LEVY; LANGER,
1989; MOSER et al., 2001).
Os promotores de absorção podem interagir suficientemente com o fármaco e
o estrato córneo para aumentar a taxa de penetração de um fármaco através da
pele. Alguns destes agentes têm efeito direto na permeabilidade da pele, sendo que
outros promovem a absorção percutânea do fármaco através de alteração da
atividade termodinâmica e conseqüente aumento da concentração do gradiente
através da pele (ALLEN Jr., 2002).
27
Os promotores químicos de absorção são substâncias não-tóxicas que
diminuem temporariamente a impermeabilidade do estrato córneo, podem promover
a penetração de fármacos para efeitos locais ou sistêmicos. Estas substâncias
podem ser chamadas também de catalizadores, aceleradores ou adjuvantes. São
incluídos nos veículos como os demais adjuvantes (PRISTA; BAHIA; VILAR, 1992;
YAMANE et al., 1995).
Segundo Santos e Bahia (1995) e Barry (2005), os principais atributos que os
promotores de absorção devem ter para uma penetração ideal são:
•
Ser farmacologicamente inertes.
•
Não ser tóxico, irritante ou alergênico.
•
Ter ação imediata, efeito adequado e previsível.
•
Após a remoção do material, a pele deve recuperar imediata e totalmente
sua capacidade normal de barreira.
•
Não deve causar perda de fluídos corporais, eletrólitos ou outros materiais
endógenos.
•
Deve ser compatível com todos os fármacos e adjuvante.
•
Ser um bom solvente para os fármacos.
•
Ser cosmeticamente aceitável, ter uma boa espalhabilidade e sensação
sobre a pele.
•
Ser usado em todas as variedades de preparações tópicas.
•
Se possível, ser inodoro, insípido, incolor e barato.
Nenhum material isoladamente possui todas estas características, mas há
muitas substâncias que possuem várias destas propriedades. O mais seguro e
efetivo promotor de absorção é a água. A maioria das substâncias penetra melhor
pelo estrato córneo hidratado que seco (BARRY, 2005).
Há vários métodos físicos como iontoforese, sonoforese, eletroporação,
eletroosmose ou iontohidrocinese que são usados para melhorar a absorção dos
fármacos na pele, principalmente para substâncias de elevada massa molecular,
como peptídeos, aminoácidos, insulina, etc. Estes métodos agem alterando
momentaneamente a permeabilidade da pele, pela passagem de uma corrente
elétrica ou pela alteração da estrutura lipídica extracelular, formando verdadeiros
poros para a passagem do fármaco (LUCINDA; EVANGELISTA, 1999; KALIA et al.,
28
2004; KAKUBARI et al., 2006). Várias pesquisas têm sido desenvolvidas usando
ultra-som, agente físico, como promotor de penetração cutânea de fármacos. Em um
dos estudos, o efeito do ultra-som foi analisado através de permeação cutânea da
cafeína in vitro com células de difusão vertical utilizando pele de suínos machos
Landrace x Large White com 50 dias e os resultados obtidos demonstraram
acentuada permeação da cafeína quando associada ao ultra-som (CAMPOS, 2004).
Métodos químicos envolvem a incorporação específica de agentes químicos
em formulações tópicas. O aumento da penetração facilita a absorção do promotor
através da pele temporariamente (GRAFOURIAN et al., 2004; KAKUBARI et al.,
2006). Muitas vezes é difícil determinar se os materiais usados para aumentar a
absorção influenciam diretamente o estrato córneo ou aumentam a liberação do
fármaco na pele. Os mecanismos propostos para a ação dos intensificadores da
absorção percutânea são: redução da resistência do estrato córneo, devido à
alteração de suas propriedades físico-químicas; alteração da hidratação do estrato
córneo; alteração da estrutura lipídica e lipoprotéica dos canais intercelulares, pela
desnaturação ou ação dos solventes, e mecanismos de transporte dos fármacos
ionizáveis (ALLEN Jr.; POPOVICH; ANSEL, 2007).
Estudos estão sendo realizados para encontrar promotores de absorção
seguros que promovam a absorção de fármacos de diversas classes como
antiinflamatórios não-esteróides, corticosteróides, anestésicos locais, hormônios,
vasodilatadores, antimicrobianos e antivirais (HENRIQUES; SIMÕES-PIRES; APEL,
2007). Algumas das importantes substâncias que aumentam a penetração são: a
água, os terpenos, terpenóides, pirrolidonas, ácidos e ésteres oleosos, sulfóxidos,
álcoois e glicerídeos, ácidos oleosos poliinsaturados, misturas incluindo fosfolipídios,
complexos com ciclodextrina, derivados de aminoácidos, a inibição da síntese de
lipídeos, ésteres e amidas do ácido clofíbrico, acetato de n-dodecila, m-dimetilamino
e enzimas (GRAFOURIAN et al., 2004; KAKUBARI et al., 2006).
Os terpenos estão entre os grupos químicos mais estudados, demonstrando
menor irritação à pele e baixa toxicidade sistêmica. Podem ser associados com
propilenoglicol, aumentando significativamente a permeação transdérmica de
fármacos hidro e lipofílicos como a cafeína e hidrocortisona, respectivamente. Com
relação à estrutura química dos terpenos, percebe-se que os que contêm grupos
hidroxila ou cetona interagem fortemente com a estrutura lipídica do extrato córneo,
29
aumentando assim a difusão através da membrana (HENRIQUES; SIMÕES-PIRES;
APEL, 2007).
Um outro atributo dado aos promotores de absorção é a sua capacidade de
diminuir as propriedades de barreira do estrato córneo modificando sua estrutura
natural. Diversos solventes orgânicos como benzeno, álcool e éter têm se mostrado
como promotores de absorção de substâncias hidrossolúveis e lipossolúveis
removendo os lipídeos do estrato córneo (SARIGÜLLÜ et al., 2006). A acetona e o
álcool mostram ser os solventes menos efetivos, mas a sua mistura com éter ou
clorofórmio mostra-se mais eficaz. Alguns lipídeos são extraídos em 30 segundos
pela acetona (triglicerídeos, ceras, hidrocarbonetos), enquanto outros são só
retirados após contato por mais de 20 minutos (ácidos graxos, fosfatidilcolina,
colesterol e ceramidas) (PRISTA; BAHIA; VILAR, 1992; SARIGÜLLÜ et al., 2006).
A importância de usar solventes como etanol, propilenoglicol, ou N-metil-2pirrolidona na permeação de fármacos pela pele não é somente pela sua
solubilidade, mas também por reduzir a estrutura de barreira da pele. Prétratamentos com solventes confirmam que a ação direta do solvente no estrato
córneo intensifica a fluidificação de lipídeos através deste e reduz a resistência à
permeação de fármacos. Muitos destes solventes podem causar irritação na pele,
mas o miristato de isopropila tem se mostrado como um componente relativamente
seguro. O aumento da permeação na pele por fármacos lipofílicos como a
indometacina e cetoprofeno tem sido observado na presença de D-limoneno. O
diclofenaco sódico tem a permeação aumentada pelo L-mentol e DL-menteno
(KAKUBARI et al., 2006).
3.3.1 Sulfóxidos
O dimetilsulfóxido (DMSO) é um clássico promotor de absorção (ALLEN Jr.,
2002). O mecanismo de ação do DMSO é caracterizado pela polaridade e poder
dissolvente que altera a permeabilidade da membrana celular. Através de análise
espectral, foi verificado que misturando DMSO com ácido oléico e linoléico ocorre
mudança na configuração isomérica, convertendo os derivados cis em trans,
modificando a geometria molecular do conteúdo lipófilo da membrana celular. O
aumento da permeabilidade produzido pelo DMSO nas concentrações de (2-20%) é
30
reversível e desaparece ao fim de três horas, indicando que a desorganização da
integridade estrutural da pele não é definitiva (PRISTA; BAHIA; VILAR, 1992).
Muitas teorias diferentes a respeito do mecanismo de ação dos promotores
apareceram na literatura. Uma delas atribui os efeitos penetrantes de DMSO, de
dimetilformamida, e de dimetilacetamida à suas propriedades higroscópicas, que
aumentam o índice de água do estrato córneo, aumentando desse modo
extremamente sua permeabilidade (SARIGÜLLÜ et al., 2006).
A atividade do DMSO depende de sua concentração, uma resposta positiva
requer concentrações superiores a 60%. Em concentrações altas ocorrem
manifestações de toxicidade, como formação de eritemas, pápulas, lesões
irreversíveis na pele, alterações no estrato córneo e desnaturação das proteínas.
Devido aos efeitos tóxicos do DMSO, ele não é muito utilizado. As séries homólogas
de alquil-metilsulfóxidos são apontadas como potenciais promotores de absorção.
Ao que parece, o mais potente deles é o decil-metil-sulfóxido (DCMS), que promove
com êxito a penetração de substâncias e possui ação reversível. Possui bom efeito
de penetração para moléculas hidrofílicas e ionizadas, mas não ocorre o mesmo
efeito para moléculas lipofílicas (SANTOS; BAHIA, 1995).
Sarıgüllü et al. (2006), avaliaram e compararam a permeação transdérmica do
diclofenaco de sódio in vitro e in vivo. Foram preparadas microemulsões (O/A) e géis
de Carbopol 940 contendo diclofenaco sódico. Para estudar a permeação destas
formulações in vitro, foram usadas células de difusão tipo Franz usando a pele
dorsal de rato. Para investigar o desempenho in vivo foi usado como modelo, edema
de pata induzido por carragenina. Uma formulação comercial de diclofenaco de
sódio foi usada como referência. Estudos in vitro mostraram que a permeação da
microemulsão foi superior ao gel e a formulação de referência. Ao adicionar
dimetilsulfóxido (DMSO) 10% (p/p) na microemulsão a taxa de permeação
aumentou.
Os
coeficientes
de
permeabilidade
do
diclofenaco
sódico
em
microemulsão e do diclofenaco sódico + DMSO foram mais elevados (4,9 × 10−3 ±
3,6 × 10−4 cm/h e 5,3 × 10−3 ± 1,2 × 10−3 cm/h, respectivamente) do que o coeficiente
de permeação do diclofenaco sódico na formulação de referência (2,7 × 10−3 ± 7,3 ×
10−4 cm/h) e em gel de carbopol (4,5 × 10−3 ± 4,5 × 10−5 cm/h).
Nos testes in vivo, usando o modelo de edema de pata, a microemulsão que
apresentou melhor permeação demonstrou maior eficácia e a microemulsão +
DMSO mostrou quase a mesma eficácia da microemulsão. A taxa de permeação
31
mais elevada do diclofenaco sódico em microemulsões é provavelmente devido aos
tensoativos e a fase oleosa, que agem como promotores de absorção facilitando a
permeação do fármaco. Os estudos in vitro e in vivo mostraram que a microemulsão
pode ser uma alternativa eficaz de veículo (SARIGÜLLÜ et al., 2006).
3.3.2 Pirrolidonas
As pirrolidonas além de promover a penetração cutânea, auxiliam a
constituição de reservas de substâncias retidas na camada córnea e nas unhas.
Podem facilitar a penetração de componentes do veículo na pele para promover o
particionamento do fármaco no tecido de forma a criar o “efeito reservatório”.
Promovem a hidratação do estrato córneo, formando canais polares que facilitam a
difusão dos fármacos. Apesar destes solventes possuírem grande atividade
aceleradora da penetração, eles não são muito usados devido as suas capacidades
irritantes, tóxicas e ao odor (SANTOS; BAHIA, 1995).
3.3.3 Ácidos e álcoois graxos
Os ácidos graxos e seus ésteres são bons promotores de absorção, atuando
em dois níveis, provocando dano às membranas e aumentando a solubilidade das
substâncias no veículo. Os ácidos e álcoois graxos de cadeia longa promovem a
absorção de compostos lipofílicos. A utilização de misturas binárias de ácidos ou
álcoois graxos com propilenoglicol apresenta um efeito sinérgico acentuado. Através
de técnicas colorimétricas, foi demonstrado que sistemas binários fluidificam os
lipídeos do estrato córneo, permitindo a difusão mais rápida das substâncias.
Considerando o comprimento, ramificação, grau de saturação das cadeias, foi
verificado que o ácido láurico (C12) possui maior efeito promotor do que os demais
ácidos graxos, concluindo-se que a presença de ligações duplas em cis nas cadeias
alquílicas potencializa a atividade aceleradora do ácido graxo (SANTOS; BAHIA,
1995).
3.3.3.1 ÁCIDO OLÉICO E MIRISTATO DE ISOPROPILA
32
Chorilli
et
al.
(2004)
desenvolveram
uma
emulsão
com
diferentes
concentrações de extrato seco de guaraná, rico em cafeína, a qual é utilizada em
formulações tópicas para prevenção e tratamento da lipodistrofia ginóide, usando
como promotores químicos de permeação cutânea o ácido oléico (1%), que fluidifica
os lipídeos do estrato córneo, permitindo a difusão mais rápida das substâncias e o
miristato de isopropila (5%), éster de ácido graxo, que pode aumentar a solubilidade
das substâncias no veículo. Foram utilizados dois grupos experimentais com cinco
ratos machos wistar nos quais foram delimitados quatro áreas de tratamento de 1
cm² no dorso, os promotores foram usados separadamente sobre os vasos
sanguíneos da derme papilar dos ratos. O extrato seco de guaraná foi incorporado
nas formulações de tal forma que contivesse 2% e 5% de cafeína, sendo adicionado,
respectivamente, 20 e 50% de extrato seco de guaraná. Os resultados obtidos
mostraram que usando extrato seco de guaraná a 20% (cafeína a 2%), com ou sem
promotores, não mostrou diferenças estatísticas em relação ao grupo controle (área
da derme que não recebeu formulação). Entretanto quando foi usado extrato seco
de guaraná a 50% (5% de cafeína) foi obtido um aumento de 439,22% na
vascularização da derme papilar. Todavia a presença de promotores de absorção
não alterou estatisticamente o efeito do extrato seco de guaraná nos vasos
sanguíneos da derme (aumento do número de vasos sanguíneos de 500% com
ácido oléico e 460% com o miristato de isopropila) mostrando deste modo que os
promotores de absorção usados não potencializaram o efeito do extrato seco de
guaraná.
Para verificar a permeação do fumarato de formoterol in vitro, Kakubari et al.
(2006), usaram pele de rato wistar, montadas em células de Franz modificada. Como
promotores de absorção foram empregados vários compostos químicos, como
cineol, acetato linoléico, mentona, linolato de etila, dietil sebacate, miristato de
isopropila entre outros. A melhor permeação foi observada com cineol, mentona,
acetato linoléico, obtendo-se após oito horas 34,5, 28,6 e 23,5 µg/cm²
respectivamente; os valores encontrados foram cem vezes maiores do que com a
salina. Com relação ao linolato de etila, dietilsebacato, miristato de isopropila a
concentração
observada
após
oito
horas
foi
de
8,8,
8,1,
7,8
µg/cm²,
respectivamente. Usando uma mistura de solventes como cineol/N-metil-2pirrolidona,
l-mentol/N-metil-2-pirrolidona,
miristato
de
isopropila/N-metil-2-
pirrolidona, contendo 400 µg/mL do fármaco, foi observado um grande aumento da
33
permeação de fumarato de formoterol comparado a permeação isolada de cada
promotor.
Para o desenvolvimento de um sistema transdérmico onde foram avaliadas a
permeabilidade intrínseca do flurbiprofeno e a influência de promotores de absorção
na penetração cutânea, Cornélio (2003) utilizou as células de difusão do tipo Franz,
usando a pele de orelha de porco como modelo de pele. Para aumentar o fluxo do
flurbiprofeno através da pele foram utilizados como veículos, éster decílico de ácido
oléico (Cetiol V®), 2-octildodecanol (Eutanol G®), Mygliol, miristato de isopropila,
palmitato de isopropila, álcool oleílico, propilenoglicol e poligol. Os resultados obtidos
demonstraram que o miristato de isopropila, por ser uma substância lipofílica,
aumentou o fluxo e as substâncias mais hidrofílicas reduziram o fluxo de penetração
do fármaco.
3.3.4 Azone®
O Azone® ou laurocapramo (1-dodecil-aza-ciclo-heptano-2-ona) foi a
primeira molécula classificada como promotora de penetração na pele. Tem sido
usado como promotor tanto para fármacos hidro quanto lipofílicos, como esteróides,
antimicrobianos e antivirais. Embora esta substância esteja sendo estudada por mais
de 25 anos, seu mecanismo ainda é desconhecido. Provavelmente seu efeito
promotor seja resultante de sua interação com lipídios do extrato córneo. As
moléculas podem estar dispersas na barreira lipídica ou como reservatório na
bicamada lipídica. Estudos usando lipídios isolados do extrato córneo humano
trazem evidência que o Azone encontra-se total ou parcialmente como uma fase
distinta no extrato córneo (LUCINDA; EVANGELISTA, 1999, ALLEN Jr., 2002;
WILLIAMS; BARRY, 2004).
O Azone® é levemente irritante, mas ativo em pequenas concentrações
(0,1-5%). Solventes polares, como o propilenoglicol, apresentam sinergismo de ação
com o Azone®. A sua capacidade promotora depende da concentração.
Concentrações de Azone® superiores a 10% diminuem acentuadamente a absorção.
Compostos derivados do Azone® com cadeia terpênica de 10 carbonos e grupo
carbonila no anel azaciclo apresentam efeito mais pronunciado na absorção. Os
derivados com 20 carbonos na cadeia lateral terpênica diminuem a atividade
aceleradora. As cadeias alquílicas induzem mais irritação primária do que as
34
alquilênicas. Analisando a ação promotora e o poder irritante deve-se preferir os
derivados com 2, 3 e 10 carbonos. O Azone® já foi usado como promotor em
formulações contendo antifúngicos, antivirais, antibacterianos, esteróides e prófármacos (SANTOS; BAHIA, 1995).
Em estudos realizados para melhorar a permeação cutânea da furosemida in
vitro, observou-se que usando o Azone® entre 5 e 6,5% (v/v) e álcool oléico 7,5 a 9%
(v/v) em gel, ocorreu um aumento da permeação cutânea. Estas formulações
mostraram-se adequadas para possíveis sistemas transdérmicos de furosemida para
uso pediátrico com a liberação de 1 mg/kg, para o tratamento de doenças cardíacas
e pulmonares em bebês prematuros e neonatos (AGYRALIDES; DALLAS; REKKAS,
2004).
Duncan et al. (1990) demonstraram que a utilização do Azone® em
associação com o propilenoglicol em uma preparação tópica de ciclosporina
promoveu aumento significativo da penetração do mesmo na pele. Testes em
camundongos demonstraram a eficácia da preparação em atenuar a infiltração de
linfócitos.
O efeito de ionização do transporte transdérmico do 5-fluoracil através da pele
humana foi estudada em 3 diferentes valores de pH, 5,0, 7,4 e 8,0, a 37 ± 0,5 °C, em
meio aquoso. Para melhorar a penetração do 5-fluoracil na pele foi estudado alguns
promotores de absorção, como o Azone, álcool laurílico e miristato de isopropila.
As concentrações desses promotores na solução doadora foram 3% (p/v), 5% (p/v),
e 5% (p/p), respectivamente. No estudo com Azone, a solução foi emulsionada com
0,11% (p/v) de polissorbato 20. A permeação in vitro do 5-fluoracil na ausência de
promotores foi muito pequena (0,82 ± 0,06 x 104 cm/h) e na presença dos
promotores foi aproximadamente de 3, 4 e 24 vezes mais para miristato de
isopropila, álcool laurílico e Azone, respectivamente, quando estes foram
incorporados na solução doadora com pH 7,4 (SINGH; SINGH; SINGH, 2005).
Em estudos anteriores foi analisado o efeito dos promotores de absorção na
penetração da pele de fármacos com diferentes lipofilia. Um dos derivados
azacicloalcano, o 1-geranilazacicloheptano-2-ona (GACH), possui estrutura química
similar ao Azone, mas um aumento na permeação cutânea e menor toxicidade em
relação ao Azone. O aumento do efeito do GACH varia de acordo com o fármaco.
O maior efeito foi observado com fármacos de média lipofilia. Com fármacos
35
altamente hidrofílicos ele demonstra ser ineficaz desde que eles penetrem
principalmente através de canais polares, também são ineficazes para fármacos
lipofílicos, desde que eles penetrem principalmente através de canais apolares
(YAMASHITA; HASHIDA, 2003).
3.3.5 Uréia
A uréia tem sido utilizada como agente hidratante no tratamento da ictiose,
psoríase e outros estados de hiperqueratose. É usado também como queratolítico,
especialmente após contato prolongado e em concentração superior a 7%. Alguns
fármacos, como a hidrocortisona e a indometacina, em presença da uréia têm sua
atividade aumentada, mas sobre outros fármacos como a naloxona e nicotinato de
benzila não promove aumento da permeação. Análogos da uréia, cíclicos e não
saturados, com radicais arila ou radicais alquila substituídos em C12 têm sido
sintetizados para serem utilizados como promotores de absorção. Estes compostos
em associação com o propilenoglicol, ao contrário da uréia, mostraram efetivo poder
acelerador da permeação in vitro através da pele humana para fármacos hidrofílicos
(SANTOS; BAHIA, 1995).
3.3.6 Tensoativos
O tratamento da epiderme com tensoativos aumenta a penetração de
moléculas polares as quais necessitam de um sistema anfótero de solvente polar e
lipídico para promover a mesma penetração de moléculas apolares (LUCINDA;
EVANGELISTA, 1999).
Os tensoativos podem promover a absorção cutânea por baixarem a tensão
interfacial. Os tensoativos aniônicos reduzem particularmente a resistência da
camada córnea por alteração das hélices da queratina e reagem com os locais de
ligação. O aumento de permeabilidade do laurilsulfato de sódio e do laurato de sódio
foi comparado a partir de soluções com pH e força iônica conhecidas. O aníon
laurato foi encontrado na epiderme e na derme e o laurilsulfato de sódio não foi
encontrado no tecido dérmico. Conclui-se que o laurato de sódio se converte em
ácido láurico, solúvel nos lipídeos cutâneos e o laurilsulfato de sódio encontra-se
36
muito dissociado e que só a parte não-ionizada (ácido láurico) possa atravessar a
pele (PRISTA; BAHIA; VILAR, 1992).
A atividade catalizadora dos tensoativos iônicos depende fundamentalmente
da destruição das membranas a que dão origem, pois tendo afinidade com as αproteínas, como a queratina, ao se complexarem com elas provocam a
desnaturação reversível e a distensão dos filamentos. A expansão da membrana
causa a formação de cavidades e a perda da capacidade de ligação à água, que
resulta da conversão da α em β-queratina (SANTOS; BAHIA, 1995).
A configuração da molécula do tensoativo contribui para a sua ação como
promotor de absorção. A atividade aceleradora de penetração é maior se a cadeia
hidrófila for composta por mais de cinco unidades de óxido de etileno. Os
tensoativos aumentam principalmente o transporte de moléculas polares ou formas
ionizadas e secundariamente influem na absorção de moléculas lipófilas ou formas
não dissociadas. Um método com resultados bastante positivos consiste na adição
de pequenas quantidades de lipídeos (ácidos ou álcoois graxos) a uma base
contendo propilenoglicol (PRISTA; BAHIA; VILAR, 1992).
Tensoativos
catiônicos
e
aniônicos,
como
o
laurilsulfato
de
sódio,
proporcionam aumento da penetração, mas são altamente irritantes para a pele
(SANTOS; BAHIA, 1995, ALLEN Jr., 2002), causando edemas e alterações na
queratina. O dano provocado por dois agentes iônicos bivalentes pode ser reduzido
se for associado em concentrações equimolares com um agente não-iônico. Os
tensoativos não-iônicos aparentemente não apresentam efeitos lesivos à pele
(SANTOS; BAHIA, 1995).
Em estudos desenvolvidos com lapachol (substância com atividade
antiinflamatória) em formulações semi-sólidas, usou-se o Carbopol® (934 P, 940 e
941) como substâncias geleificantes e como promotor de absorção o polissorbato
80. A permeação cutânea foi verificada in vitro através de células de difusão tipo
Franz, usando membrana sintética Durapore® e pele de rato albino tipo Wistar. Os
resultados demonstraram que a presença do polissorbato 80 na formulação
promoveu um aumento da absorção do princípio ativo. Os melhores valores de
absorção foram observado em formulações com pH 8,0, na concentração de 0,5%,
não havendo variações significativas em relação aos diferentes tipos de Carbopol®
(LIRA et al., 2004).
37
3.3.7 Óleos essenciais
Os óleos essenciais são alternativas promissoras, para potencializar e
veicular fármaco através da pele. Os óleos essenciais alteram a estrutura do estrato
córneo, tornando-o mais permeável. Estes compostos atuam, reduzindo a barreira
do estrato córneo transitoriamente e de modo reversível sem danificar a pele (REIS;
CAVALCANTI, 2005).
3.3.7.1 D-LIMONENO
Escribano et al. (2003) verificaram a permeação in vitro de formulações
contendo diclofenaco sódico 1 % (p/p), usando pele humana, obtida de cirurgia
plástica, como membrana (0,4 mm de espessura). Nestas preparações foram
avaliados parâmetros de permeação como: coeficiente de permeabilidade, fluxo,
permeação e retenção do fármaco na pele em 24 horas. A formulação contendo
Transcutol 59,2%, ácido oléico 14,9% e d-limoneno 5% (p/p) apresentou melhor
poder de absorção. A atividade antiinflamatória desta fórmula foi comparada com
uma preparação comercial semi-sólida de diclofenaco sódico através do método do
edema de pata em ratos induzido pela carragenina. Os resultados demonstraram
que a formulação apresentou maior atividade do que a preparação semi-sólida
comercial e, nenhum dos dois tratamentos irritou a pele quando testados em coelhos
durante 72 horas de tratamento.
O efeito de promoção da absorção transdérmica do succinato de sumatriptano
foram investigados em estudos de permeação in vitro usando células de Franz
horizontal. A pele de porco foi pré-tratada com etanol (veículo), sem e com
promotores (Span 20, R (+) limoneno (-), α bisabolol, 1,8 cineol, polietilenoglicol
600 e ácido oléico) na proporção de 5% em etanol p/p. Em todos os casos houve um
aumento do fluxo do succinato de sumatriptano. Foi observado um aumento da
permeação do fármaco através da pele pré-tratada com etanol em relação a
permeação na pele pré-tratada com tampão fosfato, porém este aumento foi
consideravelmente menor do que o apresentado pela pele pré-tratada com etanol
contendo os promotores, exceto o alfa bisabolol que apresentou um menor efeito
como promotor para o fármaco. A formulação com R (+) limoneno apresentou um
fluxo 22 vezes mais alto do que o controle (tampão pH 7,4), indicando que este
38
componente pode ser um ótimo candidato para ser usado para melhorar a
permeação cutânea (FONT et al., 2005).
Os resultados obtidos por Font e colab. (2005), confirmaram a capacidade do
etanol em permear através do estrato córneo e alterar a organização dos lipídeos
intercelulares, por isso, intensifica a permeabilidade da pele. No entanto têm sido
descritos que concentrações altas de etanol podem reduzir o fluxo transdérmico de
algumas substâncias, devido à capacidade de desidratar a pele.
A permeação transdérmica do metotrexato através da pele de ratos usando
sistemas adesivos de policrilamida e base de hidrogel foi estudada in vitro usando
células de Franz modificada após pré-tratamento com terpenos (limoneno, cineol e
mentol) e etanol, sozinho ou em combinação com iontoforese. Dos terpenos usados
o mentol puro mostrou maior permeação (38%) e limoneno puro apresentou 9,9%. O
limoneno mostrou menor permeação provavelmente por ter ligações duplas em sua
cadeia possuindo melhor afinidade com substâncias hidrofóbicas. O grupo hidroxila
do mentol aceita e doa ligações de hidrogênio e o cineol apenas aceita ligações de
hidrogênio, conseqüentemente a permeação é menor do que com mentol. A
combinação entre o mentol e o etanol aumentou a permeação para 54,9% e quando
usados com iontoforese aumentou para 117% com um fluxo de 32,1 ± 1,45
µg/(cm2h). Foi usado etanol nas concentrações de 50 a 100%, sendo que o etanol a
75% demonstrou a melhor permeação (PRASAD et al., 2006). O cineol e
propilenoglicol foram empregados como promotores químicos para melhorar a
penetração transdérmica do cloridrato de propranolol e promoveram uma alta
permeação com um fluxo de 54,51 ± 0,52 µg/(cm2 h) e 93,81 ± 11,56 µg/(cm2 h),
respectivamente (AMNUAIKIT et al., 2004).
Em outro estudo, foram escolhidos quatro tipos de fármacos baseadas em
suas
propriedades
lipofílicas
(cloridrato
de
nicardipina,
hidrocortisona,
carbamazepina e tamoxifeno) e quatro terpenos foram usados como promotores de
absorção (fenchona, timol, d-limoneno e nerolidol). Os testes foram realizados in
vitro usando células de difusão tipo Franz. As formulações foram preparadas em
géis de hidroxipropilcelulose, um polímero hidrofóbico não iônico. Os promotores
apresentaram maior atividade para as substâncias hidrofílicas (cloridrato de
nicardipina seguido de hidrocortisona e carbamazepina) a menor atividade dos
promotores foi registrada com o componente mais lipofílico, o tamoxifeno. Entre os
39
promotores, o maior fluxo de permeação foi encontrado respectivamente com
nerolidol, limoneno, timol e fenchona (EL-KATTAN, et al., 2001).
3.4 Métodos de permeação cutânea in vitro
As técnicas de permeação in vitro utilizam células de difusão, as quais
consistem de um líquido receptor e uma fase doadora separadas por membrana
sintética ou pele (figura 2). Quando solutos lipofílicos são investigados,
modificadores de solubilidade são utilizados com o fluido receptor para promover
uma adequada solubilidade e garantir as condições de penetração (SARVEIJA;
RISK; BENSON, 2004).
Há vários tipos de células de difusão, como células de Franz, bloco de duas
células perfurado em perspex, célula de vidro de difusão simples adequada para
pele humana, célula de vidro com circulação contínua das soluções doadora e
receptora, célula de vidro usada para determinação do vapor de difusão pela pele.
Em células de difusão projetadas para examinar o fluxo no estado estacionário e
deduzir parâmetros fundamentais, uma solução doadora mantém a concentração e
agitação constante, libera o penetrante pela membrana dentro de um líquido
receptor em condições sink, que simula o suprimento sanguíneo (BARRY, 2005).
40
Figura 2 - Esquema da célula de Franz (adaptado de Youngin, 2006).
Como a pele humana é variável e de difícil obtenção, podem ser usadas
membranas artificiais como a de acetato de celulose, borracha de silicone ou
miristato de isopropila ou sistemas lamelares projetados para mimetizar os lipídeos
intercelulares do estrato córneo (LIRA, et al., 2004; BARRY, 2005; LONGO, 2006).
A pele humana é usualmente a membrana preferida para usar no estudo de
absorção in vitro. Nenhum modelo animal apresenta valor de absorção idêntico
aquele obtido com a pele humana. A pele de animal é geralmente mais permeável
que a pele humana, mas é usada para estudos preliminares (BRONAUGH;
YOURICK, 2000).
Os estudos de permeação cutânea in vitro podem ser realizados com peles
dissecadas de ratos, camundongos, e cobaias (normais e sem pêlos), coelhos,
hamsters, porcos, cães sem pêlos, cobras, macacos, etc. montadas em células de
difusão (BARRY, 2005).
41
A pele de mamíferos varia consideravelmente em relação às propriedades do
estrato córneo e o número e densidade de apêndices (BARRY, 2005). A pele de rato
e camundongo difere da pele humana em numerosos pontos, sendo pouco favorável
para a objetivação das propriedades cosméticas. A pele de rato é recoberta por uma
pelagem espessa, uma epiderme fina, uma camada de Malpighi limitada a uma ou
duas fileiras celulares e uma camada córnea muito fina. Estas espécies animais
possuem um sebo muito diferente da emulsão epicutânea. Estas diferenças podem
ser exploradas para o estudo de propriedades específicas ou em controle
toxicológico. A pequena espessura da camada córnea associada ao grande número
de oríficios foliculares ocasiona cinética e taxas de absorção cutânea dos produtos
aplicados muito mais elevados do que no homem, podendo causar eventuais efeitos
tóxicos em nível sistêmico e cutâneo (PRUNIÉRAS, 1994).
A pele de porco não é igual à pele humana, mas as duas espécies possuem
particularidades estruturais e metabólicas muito próximas, tem uma pelagem
relativamente esparsa. Como a pele humana, a do porco apresenta dermatóglifos, a
derme é um pouco diferente, o tecido conjuntivo é mais rico em fibras elásticas, mas
a epiderme viva e a camada córnea apresentam numerosas “similitudes”
(PRUNIÉRAS, 1994). Devido à semelhança com a pele humana em termos de
densidade de folículos pilosos, a pele de orelha de porco, principalmente quando
jovem, tem sido usada como modelo de membrana para estudos de permeação
cutânea in vitro e in vivo (LOPES; KANEKO, 2000).
Os modelos animais permitem o estudo da inocuidade e do efeito dos
produtos cosméticos na pele, com mais facilidade do que no homem. Pode-se
controlar a penetração cutânea de substâncias no organismo, efetuarem diferentes
experiências de farmacocinética e acompanhar a influência dos produtos sobre a
bioquímica da pele (PRUNIÉRAS, 1994).
Quando possível o melhor é obter pele humana a partir de autópsias,
amputações e cirurgia estética. Utiliza-se estrato córneo, epiderme, pele sem a
derme ou a pele íntegra fixada em uma célula de difusão, e mede-se a passagem da
substância de um lado do estrato córneo por um banho de fluído (BARRY, 2005).
42
3.5 Ácido Caurenóico
O AC (figura 3) é um caureno (ácido ent-caur-16-en-19-oico) e é considerado
um intermediário na biogênese da giberelinas, que são hormônios de crescimento e
defesa da planta. Este composto é um diterpeno que demonstra in vitro ter
atividades antiparasiticidas e antibacteriana, ação antiproliferativa em culturas de
células tumorais, efeito hemolítico em eritrócitos humanos e de camundongos e, em
esperma humano, reduz a motilidade, mas é um espermicida fraco. Está presente
em plantas como Sphagneticola trilobata, Copaifera langsdorffii, Annona glabra,
Mikania laevigata, Mikania glomerata e Xylopia frutescen (CAVALCANTI et al., 2006;
SILVA et al., 2002).
Análises farmacológicas revelaram que o AC possui efeito inibitório nas
contrações abdominais de rato induzidas por ácido acético (87% inibição) maior que
o efeito do ácido acetilsalicílico (83% inibição), dipirona (54% inibição), indometacina
(79% inibição), em relação ao acetominofeno (88% inibição) A DI50 obtida no estudo
foi de 43, 133, 125, 162, 76 (µmol/kg) para o AC, o AAS, acetominofen, dipirona,
indometacina, respectivamente (BLOCK et al., 1998).
O AC possui atividade antibacteriana para bactérias gram positivas. É
bactericida para Baccilus cereus. O AC foi isolado e purificado como o maior
componente de exsudatos das partes aéreas da planta Pseudognaphalium vira vira
(Asteraceae) (WILKENS et al., 2002).
O AC além de todas as propriedades descritas anteriormente é um potente
relaxante das contrações uterinas (PAGE; BALZA; NISHIDAT, 1992).
Tirapelli et al. (2002), demonstraram que o AC inibe contrações vasculares e
não-vasculares do músculo liso com diversos agonistas. O efeito inibitório do AC foi
totalmente suprimido após 90 minutos, indicando que o seu efeito é reversível.
COOH
Figura 3 - Estrutura química do AC (BLOCK et al., 1998;
BRESCIANI et al., 2004).
43
A Sphagneticola trilobata (L.) Pruski, 1986 (Wedelia Paludosa, Acmela
brasiliensis) (figura 4) é uma planta medicinal nativa a qual cresce em várias regiões
do Brasil, é conhecida popularmente por margaridão, pingo de ouro, pseudoarnica
ou vedélia. Todas as partes da planta são usadas na medicina popular para diversas
desordens, incluindo infecções do trato respiratório, inflamações e afecções em
geral. Possui também atividade antimicrobiana, antiparasiticida, inseticida, anti-HIV
(REZENDE et al., 2000), analgésica (BLOCK et al., 1998), suave efeito músculorelaxante (DE ALENCAR CUNHA et al., 2003) e hipoglicemiante oral (BRESCIANI,
2004). Considerando seus componentes químicos, foi demonstrada a presença de
vários constituintes como o AC, terpenos, lactonas eudesmanolide e flavonóides.
Extratos testados possuíram atividade contra leveduras de Candida albicans, C.
tropicalis, Cryptococcus neoformans e Saccharomyces cerevisiae ou contra fungos
filamentosos: A. fumigatus, A. flavus, A. niger ou Microsporum gypseum. As flores da
S. trilobata possuem atividade antifúngica contra dermatófitos, entretanto não exerce
atividade contra micoses sistêmicas. Das diferentes frações do extrato da planta
(hexano, diclorometano, acetato de etila e butanol), a concentração inibitória mínima
(CIM) foi maior que 1000 µg/mL. Os compostos isolados, o AC e luteolina,
apresentaram CIM maior que 250 µg/mL (SARTORI et al., 2003).
Figura 4 – Parte aéreas da planta S. trilobata (BRITTRICH; AMARAL, 2007)
44
Bresciani et al. (2004) demonstraram a variação da concentração de AC nas
folhas, flores, caules e raízes da S. trilobata nas diferentes estações do ano, através
do método de cromatografia gasosa. Constataram que o outono é a estação que
apresenta maior quantidade de AC, e está presente em maior quantidade nas raízes
(0,66% de planta seca) e nos caules (0,5% de planta seca) e em menor quantidade
nas folhas (0,1% de planta seca) e nas flores (0,1% de planta seca). Nas demais
estações a concentração do AC é bastante reduzida.
Manczak e colab. (1996), mostraram em estudos preliminares que o extrato
hidroalcoólico de diferentes partes da S. trilobata exerce ação antinociceptiva em
diferentes modelos de dor em ratos.
Para isolar os componentes ativos presentes na S. trilobata, Cechinel Filho e
Yunes (1998) prepararam extrato hidroalcoólico com toda a planta e particionaram
sucessivamente com solventes de polaridade crescente, hexano, diclorometano,
acetato de etila e butanol (CECHINEL FILHO; YUNES, 1998). Foi investigado nestas
frações o efeito inibitório das contrações abdominais em rato induzidas com ácido
acético. As frações foram administradas intraperitonialmente (3 mg/kg), reduzindo
significativamente o número de contrações abdominais em ratos, induzido pelo ácido
acético em relação ao grupo controle. Os resultados indicaram que a atividade
antinociceptiva da planta é tanto para componentes apolares como polares, mas é
mais pronunciado nas frações n-hexano (55% inibição) e diclorometano (72%
inibição).
Dutra e colab. (2005), demonstraram que o extrato hidroalcoólico da S.
trilobata especialmente a fração hexânica, exibiu pronunciada propriedade
hipoglicemiante (redução de 26,47%) na dose de 50 mg/kg por via oral, indicando
que componentes apolares podem ter ação na glicemia. O composto majoritário
presente na fração hexânica que estaria exercendo efeito anti-hiperglicemiante seria
o AC. Dentre os animais que foram submetidos ao tratamento com as frações semipurificadas de S. trilobata, os grupos que receberam as frações hexano e
diclorometano (50 mg/kg, v.o.) apresentaram um aumento significativo da
colesterolemia quando comparados com o grupo controle (salina), indicando que,
embora a fração hexânica possa ter compostos que atuem reduzindo a
hiperglicemia, estes podem ao mesmo tempo estar, alterando o metabolismo de
lipídeos, principalmente aumentando a síntese de colesterol. Bresciani e colab.
(2004), induziram a diabete em ratos usando aloxano e demonstraram que o AC na
45
concentração
de
10
mg/kg
por
via
oral
apresenta
considerável
efeito
hipoglicemiante, sendo mais eficaz que o extrato hidroalcoólico e fração hexânica
estudados anteriormente por Dutra e colab. (2005).
O AC foi isolado da Copaifera langsdorffii (Leguminosae), sendo o diterpeno
encontrado em maior quantidade. A Copaifera langsdorffii é popularmente conhecida
como óleo de copaíba, considerado como um remédio natural para o tratamento de
dores de garganta, infecções urinárias, pulmonares e ulcerativas. Apesar do
potencial efeito terapêutico em estudos pré-clínicos, poucos estudos foram
realizados a respeito dos prováveis efeitos de genotoxicidade nesta substância
bioativa. Em estudos realizados in vitro, foi avaliado a genotoxicidade do AC em
células de pulmão de hamster chinês. Os resultados obtidos revelaram que o AC em
baixas concentrações (2,5-10 µg/mL), não apresenta potencial genotoxicidade, mas
em altas concentrações (30 e 60 µg/mL), manifesta significativa genotoxicidade
(CAVALCANTI et al., 2006).
As folhas de Annona glabra L., conhecida popularmente por araticum do
brejo, araticum cortiça, araticum da praia, araticum jangada, entre outros,
apresentam atividade anti-helmínticas e anti-reumáticas (CORRÊA, 1984).
Estudos fitoquímicos da Annona glabra determinaram a presença de diversos
alcalóides. Através do fracionamento do extrato etanólico das cascas das árvores,
isolou-se o AC em grandes concentrações. O AC encontra-se em maior quantidade
nas cascas e em pouca concentração nas folhas. A produção do AC varia totalmente
durante o ano, no outono há uma maior quantidade nas cascas (0,53% de peso
seco) e nas folhas (0,03% de peso seco), na primavera a concentração do AC
diminui nas cascas (0,4% de peso seco) e no inverno diminui nas folhas (0,01% de
peso seco). Popularmente a Annona glabra possui efeito antiinflamatório, entre
outros. Provavelmente este efeito antiinflamatório, seja devido à presença do AC em
sua composição (OLIVEIRA; SANT’ANA; BASTOS, 2002).
A planta do gênero Mikania (Asteracea), conhecida popularmente como
guaco,
possui
múltiplas
propriedades
farmacológicas,
especialmente
antiinflamatórias, antialérgica, analgésica e atividades antimicrobianas. As espécies
mais estudadas são M. laevigata e M. glomerata, nas quais os maiores componentes
encontrados são cumarina, ácido cumárico, sesquiterpenos e diterpenos (como o
AC). Os componentes identificados nos extratos etanólicos da M. laevigata são
qualitativamente semelhantes aos da M. glomerata, entre os componentes mais
46
encontrados está o AC com 17,64% e 17,94% na M. laevigata e M. glomerata
respectivamente (YATSUDA et al., 2005).
As sementes de Xylopia frutescens são usadas popularmente no Brasil como
agente antimicrobiano e antireumático. Estas espécies são conhecidas por conter
diversos diterpenos caurenos, entre eles o AC, presente abundantemente nas
sementes de Xylopia frutescens. O AC tem demonstrado atividade in vitro para o
protozoário Trypanosoma cruzi, agente causador da doença de chagas, na dose de
0,68 mg/mL. Altas doses de AC promovem lise total das formas tripomastigotas do
Trypanosoma cruzi, mas também total lise dos eritrócitos. Por esta razão, o AC tem
sido submetido a diversas transformações, para obter novos componentes que não
apresentem este efeito indesejável (DE MELO et al., 2001).
Constituintes de própolis foram isolados a partir de uma amostra coletada de
abelhas nativas brasileiras, Melipona quadrifasciata anthidioides, sendo um desses
constituintes o AC. A própolis de abelhas nativas brasileiras mostrou moderada
atividade antimicrobiana com Staphylococcus aureus e Escherichia coli. O AC foi
ativo somente contra o S. aureus, sendo a mesma atividade encontrada no extrato
total (VELIKOVA et al., 2002).
47
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Materiais
4.1.1 Matérias primas e reagentes
- Acetato de etila (Biotec, lote 24275);
- Acetona (Vetec, lote 0504655);
- Acetonitrila grau HPLC (Tedia, lote 601154R);
- Acheflan® (lote L 0700467);
- Ácido caurenóico (substância referência isolada e caracterizada por pesquisadores
do NIQFAR);
- Agarose (Invitrogen, lote - 1106405);
- Água purificada por osmose reversa;
- Água ultrapura tipo I (obtida em ultrapurificador);
- Alfa-bisabolol (All Chemistry, lote All 18110);
- Butil-hidroxi-tolueno (BHT) (Pharmaspecial, lote – 75M2212K);
- Bicarbonato de sódio (Sigma, lote - 1368681);
- Células de fibroblasto L- 929 (Banco de células do Rio de Janeiro CR- 020)
- Cera aniônica (Cera Lanette® - All Chemistry, lote - All 09279);
- Cera não iônica (Cera Polawax® - All Chemistry, lote - All 18423);
- Clorofórmio (Lafan, lote 2494);
- Clorofórmio deuterado 99,8% (Cambridge isotrope laboratories - CIL, lote - 6C 874);
- Dexametasona (Galena, lote DAC 041006);
- EDTA (Dinâmica, lote – 5796);
- Éter etílico (Isofar, lote 061216);
- Fetal Bovine serum (Soralid, lote - 903-7);
- Hexano grau PA (Quimex, lote 31271);
- Lecitina de soja (All Chemistry, lote 1-13301);
- Meio MEM (Gibico, lote 1336818);
- Metanol (Dinâmica, lote 19520);
- Metilparabeno (Nipagin® – All Chemistry, lote – 16217);
48
- Miristato de isopropila (Vital, lote P2B060);
- Mistura de antibiótico e antifúngico (Gibco);
- Neutral red (Sigma, lote - 113k0792);
- Oleato de isodecila (All Chemistry, lote All 20733);
- Óleo de cróton (2,5%) (Fornecido pelo laboratório de Farmacologia/UNIVALI);
- Propilenoglicol (Isofar, lote – 051209);
- Propilparabeno (Nipazol® – Embrafarma, lote – DC 0111);
- TGM- Tioglicolato sódico USP (Difco , lote - 3114900);
- TSB- Triptone Soya Broth (Merck, lote - 3114900);
- Tripsina (Gibico, lote - 1368681);
- Uréia (Dinâmica, lote 21523).
4.1.2 Equipamentos
- Agitador magnético (Marte®, mod. Mag-multi);
- Agitador mecânico (Fisatom®, mod. 752 A);
- Autoclave (Quimius®, mod. 190.22);
- Balança digital (Bioprecisa®, mod. FA 2104 N);
- Banho-maria com circulação de água (Marconi®, mod. MA-159);
- Célula de Franz adaptada;
- Centrífuga (Sanyo®, mod. Harrier 18/80);
- Chapa de aquecimento (Quimius®);
- Coluna (Phenomenex®, mod. 00F-4375-E0 Synergy 4 µm hydro-RP 80Ǻ, dimensão
150X4,6 mm);
- Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (CLAE), Shimadzu®, equipado com
detector (Shimadzu®, mod. SPD-M10A), forno (Shimadzu®, mod. CTO 10), sistema
de bomba (Shimadzu®, mod. LC-10AD), software (Shimadzu® Class – VP, versão
6.14 SP2), sistema de injeção manual (looping de 20 µL);
- Espectroscópio de Ressonância Magnética Nuclear (RMN), (Brucker®, mod. AC
300);
- Espectrofotômetro de infra-vermelho (IV) (Bomem Hartmann & Braun®, mod. MBseries);
- Estufa (Fanem®, mod. 502C);
49
- Estufa com 5% de CO2, 85% de umidade relativa e 37± 1°C (Ultrasafe ®, mod. HF
212UV);
- Estufa de cultura (Quimius®, mod. 316.22);
- Filtro (Milipore® de 0,45 µm com membrana PTFE modificada para filtração de
solventes orgânicos e aquosos);
- Fluxo laminar (Veco®, mod. VLFS-12 série 8195);
- Microcentrífuga (Fanem®, mod. 243);
- Micrômetro digital (Mitutoyo®, mod. APB-2D);
- Microscópio (Olympus®, mod. CKX41 c/ sistema digital de imagem Q colors 3 Olympus);
- Microseringa Hamilton® com capacidade de 50 µL;
- Moinho martelo (Cemar®, mod. F56H0996);
- Osmose reversa (Gehaka®, mod. osmose 10L TH farma);
- Ponto de Fusão (MQAPF®, mod. 302);
- Potenciômetro (Digimed®, mod. DM-20);
- Rotaevaporador (Quimis®, mod. 344B2);
- Sistema de filtração esterilizante (Millipore®);
- Ultrapurificador de água com membrana 0,2 µm de poro (Barnstead®, mod. – easy
pure LF);
- Ultrasom (Unique®, mod. USC 5000);
- Viscosímetro rotacional (HAAKE®, mod. VT 550 tipo cilindro-coaxial e cone placa);
4.2 Métodos
4.2.1 Isolamento do AC
O processo de isolamento do AC foi realizado pelas alunas de iniciação
científica do curso de Farmácia da UNIVALI vinculadas ao programa de bolsas PIPG
(Programa Integrado de Pós-graduação e Graduação) – ProPPEC/UNIVALI, Paula
Regina Alves de Siqueira e Marina Ledra Kaiser.
O AC foi isolado do caule e raiz da planta S. trilobata, a qual foi coletada no
horto medicinal da UNIVALI em Itajaí-SC, no mês de março de 2006, a planta foi
50
lavada em água corrente, seca à temperatura ambiente e pulverizada em moinho
martelo (partículas < 10 mm).
O extrato obtido dos caules e raízes da S. trilobata foi preparado pelo método
de maceração durante sete dias em temperatura ambiente utilizando acetona como
líquido extrator na proporção de 6:1 (v/p). Após a maceração, o líquido extraído foi
filtrado, concentrado em rotaevaporador eliminando a acetona e particionado com
hexano para separação da água residual da planta.. O composto foi isolado usando
cromatografia líquida de sílica gel 60 (0,063-0,2 mm) e hexano:acetato de etila como
fase móvel em diferentes proporções com aumento da polaridade. As frações
coletadas foram monitoradas por cromatografia de camada delgada (CCD), usando
como fase móvel hexano:acetato de etila (95:5) e anisaldeído sulfúrico como
revelador. Como referência foi usada solução padrão de AC (100 µg/mL), disponível
no NIQFAR (Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas).
4.2.2 Caracterização e identificação do AC
A pureza do AC, previamente isolado e caracterizado, foi comprovada através
de CCD, espectroscopia no infra vermelho (IV), usando pastilha de KBr, perfil em
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), Espectroscopia de Ressonância
Magnética Nuclear de 1H e
13
C, usando solução na concentração de 30 mg/mL em
clorofórmio deuterado, e foi determinado seu ponto de fusão, comparando-se com o
composto referência isolado anteriormente e com a literatura (BOECK et al., 2005).
4.2.2.1 SOLUBILIDADE E PKA DO AC
A solubilidade do AC em água, em meio aquoso com diferentes valores de pH
e em propilenoglicol foi verificada.
Para verificar a solubilidade em água foram testadas proporções AC:água 1:1
até 1:10.000. Para determinar a solubilidade em relação ao pH, em meio aquoso, foi
usada uma solução a 100 µg/mL e o pH foi alterado com ácido clorídrico ou
hidróxido de sódio para valores entre 1 e 11. As soluções obtidas foram
quantificadas por CLAE.
A solubilidade do AC em propilenoglicol foi verificada através da preparação
de solução a 0,5 mg/mL e 1 mg/mL.
51
Para a determinação do pKa foi utilizado uma solução ácido caurenóico:água
(0,1g:10000 mL). Foram realizadas três titulações variando o pH de 1 – 10, conforme
tabelas abaixo:
4.2.2.2 DETERMINAÇÃO DO COEFICIENTE DE PARTIÇÃO DO AC EM ÓLEO/TAMPÃO
O coeficiente de partilha do AC foi determinado baseando-se no método
proposto por Wells (1988).
Anteriormente à partição, o octanol foi saturado com uma quantidade idêntica
de água. Para obter a saturação, a mistura foi agitada por um período de
aproximadamente 12 horas, em agitador magnético a 400 rpm. A fase aquosa foi
separada em funil de separação e centrifugada a 1400 g por 10 min.
Após a saturação das fases, foi adicionado 10 mL de uma solução aquosa pH
11 contendo AC (100 µg/mL) em 10 mL do octanol saturado. Esta mistura foi agitada
por 30 min, em temperatura controlada em banho termostatizado a 37 ± 0,5 °C,
sendo posteriormente transferida para um funil de separação e mantida em repouso
por 5 min. Após este período, a fase aquosa foi retirada e centrifugada por 5 min, à
2500 rpm. As amostras, em triplicata, foram quantificadas por CLAE.
4.2.3 Quantificação do AC em CLAE
Para realização destas análises foi usado o cromatógrafo líquido de alta
eficiência (CLAE) o qual foi equipado com uma coluna tipo Synergy 4 µm hydro-RP
80Ǻ (Phenomenex) com 150 X 4,6 mm. O tempo de corrida foi de 18 minutos, na
temperatura de 35 °C. Usou-se detector tipo arranjo de diodos e software Class-VP
versão 6.14 SP2, com fluxo de 1 mL/min, usando método isocrático.
A fase móvel usada foi acetonitrila, metanol e água acidificada com ácido
fosfórico (pH 3,5) na proporção 40:45:15 (v/v), respectivamente (ZANELA et al.,
2006). A fase móvel foi filtrada com um filtro de celulose regenerada, com
porosidade de 0,45 µm, sob vácuo. A análise foi monitorada em 210 nm.
A linearidade foi determinada através da construção da curva analítica. Foi
preparada uma solução estoque de AC, pesando-se exatamente cerca de 10 mg de
AC e dissolvendo em fase móvel (acetonitrila:metanol:água acidificada com ácido
fosfórico (pH 3,5) na proporção 40:45:15 (v/v)), em um balão volumétrico de 100 mL.
52
A solução foi sonicada por 8 minutos e completado o volume com a fase móvel e
homogeneizado, obtendo-se uma solução padrão com concentração final de 100
µg/mL. A partir desta solução foram feitas diluições para obter soluções com
diferentes concentrações: 4; 10; 20; 30; 50 e 80 µg/mL. As diluições foram feitas em
triplicata.
Cada solução, previamente filtrada com filtro de 0,45 µm, foi injetada (20 µL)
em 3 replicatas no cromatógrafo CLAE.
Os valores de área obtidos foram plotados contra as respectivas
concentrações e foi calculada a equação da reta através da análise de regressão
linear da reta.
A precisão do presente método foi avaliada através da repetibilidade, usando
três diferentes concentrações de AC (4, 30 e 50 µg/mL). As análises foram feitas
com 6 replicatas, sendo cada concentração analisada em duplicada em três
diferentes períodos do dia.
4.2.4 Desenvolvimento e estudo da estabilidade das formulações
4.2.4.1 PREPARAÇÃO DAS FORMULAÇÕES SEMI-SÓLIDAS
As formulações foram desenvolvidas a partir dos excipientes clássicos, cera
Lanette N® (cera auto-emulsionante aniônica composta por alquil sulfato e álcool
cetearílico) e cera Polawax® (cera autoemulsionante não iônica composta por álcool
cetearílico e éster de sorbitan (PEG-20)). As bases foram preparadas seguindo
técnica usual de preparo. Os componentes da fase oleosa (fase A) e os
componentes da fase aquosa (fase B) foram aquecidos separadamente em um
béquer até a temperatura de 75 °C. Quando ambas as fases atingiram a temperatura
de 75 °C a fase aquosa foi vertida lentamente sob a fase oleosa, permanecendo sob
agitação e aquecimento por 5 minutos. Em seguida foi retirada do aquecimento
mantendo-se a agitação até a temperatura de 40 °C. Foram adicionados promotores
de absorção nas bases semi-sólidas emulsivas. Os promotores de absorção (alfa
bisabolol, oleato de isodecila, uréia) foram incorporados na fase B das respectivas
formulações descritas no quadro 1 e 2. Em uma das formulações foi incorporada na
fase C, lecitina de soja previamente dissolvida em miristato de isopropila, como
promotores de absorção.
53
Quadro 1 - Formulações de base semi-sólida com cera Lanette® e promotores de absorção
Fase
Componentes
Fórmula
LO*
LA*
LU*
LUA*
LML*
A
Cera Lanette®
15%
15%
15%
15%
15%
A
Nipazol®
0,1%
0,1%
0,1%
0,1%
0,1%
B
Propilenoglicol
5,0%
5,0%
5,0%
5,0%
5,0%
B
Nipagin®
0,1%
0,1%
0,1%
0,1%
0,1%
B
EDTA
0,1%
0,1%
0,1%
0,1%
0,1%
B
BHT
0,01%
0,01%
0,01%
0,01%
0,01%
B
Água destilada
qsp 100 mL
qsp 100 mL
Qsp 100 mL
qsp 100 mL
qsp 100 mL
B
Alfa-bisabolol
-
1,0%
-
1,0%
B
Oleato de
5,0%
-
-
isodecila
B
Uréia
-
-
10%
10%
C
Miristato de
-
-
-
-
1,0%
-
-
-
0,5%
isopropila
C
Lecitina de soja
*LO - creme lanette contendo oleato de isodecila como promotor; LA – creme lanette
contendo alfa-bisabolol como promotor; LU - creme lanette contendo uréia como promotor;
LUA – creme lanette contendo uréia e alfa-bisabolol como promotores; LML – creme lanette
contendo miristato de isopropila e lecitina de soja como promotores.
54
Quadro 2 - Formulação de base semi-sólida com cera Polawax® e promotores de absorção
Fase
A
Componentes
Cera
Fórmula
PO*
PA*
PU*
PUA*
PML*
15%
15%
15%
15%
15%
Polawax®
A
Nipazol®
0,02%
0,02%
0,02%
0,02%
0,02%
B
Propilenoglicol
5,0%
5,0%
5,0%
5,0%
5,0%
B
Nipagin®
0,18%
0,18%
0,18%
0,18%
0,18%
B
EDTA
0,1%
0,1%
0,1%
0,1%
0,1%
B
BHT
0,01%
0,01%
0,01%
0,01%
0,01%
B
Água destilada
qsp 100ml
qsp 100ml
qsp 100ml
qsp 100ml
qsp 100ml
B
Alfa-bisabolol
-
1,0%
-
1,0%
-
B
Oleato de
5,0%
-
-
-
-
isodecila
B
Uréia
-
-
10%
10%
-
C
Miristato de
-
-
-
-
1,0%
-
-
-
-
0,5%
isopropila
C
Lecitina de soja
* PO - creme polawax contendo oleato de isodecila como promotor; PA – creme polawax
contendo alfa-bisabolol como promotor; PU - creme polawax contendo uréia como promotor;
PUA – creme polawax contendo uréia e alfa-bisabolol como promotores; PML – creme
polawax contendo miristato de isopropila e lecitina de soja como promotores.
4.2.4.2 ESTUDO PRÉVIO DE ESTABILIDADE
As formulações desenvolvidas foram submetidas a testes prévios de
estabilidade. Foram empregadas condições extremas de temperatura com o objetivo
de acelerar possíveis reações de degradação.
As amostras, em triplicata, sem a presença de AC, foram acondicionadas em
pote plástico de parede simples com tampa e submetidas a ciclos alternados de
resfriamento e aquecimento (BRASIL, 2004). Ciclos de 24 horas em estufa a 50 ± 2
°C e ciclos de 24 horas em freezer a – 5 ± 2 °C dur ante 12 dias. As amostras foram
avaliadas no tempo zero e no tempo 12 dias, sendo analisadas as seguintes
características:
55
4.2.4.2.1 CARACTERES ORGANOLÉPTICOS:
Os caracteres organolépticos avaliados foram homogeneidade, cor, odor,
brilho, ausência de grumos e precipitados. Estes testes foram realizados visualmente
e pela percepção direta.
4.2.4.2.2 DETERMINAÇÃO DO PH:
A determinação do pH foi realizada pelo método potenciométrico. Preparou-se
uma solução aquosa das amostras em estudo a 10% (p/v) e procedeu-se à medida
do pH em triplicata para cada amostra (MONTAGNER; CORRÊA, 2004,
BORGHETTI; KNORST, 2006). O potenciômetro digital foi previamente calibrado
com soluções tampão de acetato pH 4,0 e tampão fosfato pH 7,0.
4.2.4.2.3 RESISTÊNCIA FÍSICA:
As amostras, em triplicatas, foram colocadas em tubos do tipo eppendorf e
submetidas às condições de estresse mecânico, através da centrifugação em uma
velocidade de 1370 g, por 15 minutos. As amostras foram avaliadas visualmente
quanto à presença de precipitação, coalescência e separação ou não de fases das
preparações semi-sólidas (MONTAGNER; CORRÊA, 2004).
4.2.4.2.4 ESPALHABILIDADE
Para realização dos testes de espalhabilidade foi usado uma placa-molde
circular de vidro com 20 cm de diâmetro e 0,2 cm de espessura, com orifício central
de 1,2 cm de diâmetro, a qual foi colocada sobre uma placa-suporte de vidro (20 cm
x 20 cm) posicionada sobre uma folha de papel milimetrado. A amostra foi
introduzida no orifício da placa-molde e a superfície foi nivelada com uma espátula,
esta placa foi cuidadosamente retirada e sobre a amostra foi colocada uma placa de
vidro (placa de petri) de peso conhecido. Após um minuto, foi realizada a leitura dos
diâmetros abrangidos pela amostra, em duas posições opostas, com auxílio da
escala do papel milimetrado. Posteriormente, foi calculado o diâmetro médio. Este
56
procedimento foi repetido acrescentando-se sucessivamente outras placas, em
intervalos de um minuto. Os resultados foram expressos em espalhabilidade da
amostra em função do peso aplicado, de acordo com a equação 1, sendo que os
mesmos correspondem à média de três determinações. A determinação da
espalhabilidade foi realizada de acordo com metodologia previamente descrita na
literatura por Knorst (1991) e citada por Borghetti e Knorst (2006).
π 
Ei = d 2  
4
eq.1
Onde:
Ei = espalhabilidade da amostra para um determinado peso i (mm²)
d² = diâmetro médio ao quadrado (mm)
π = 3,14
4.2.4.3 PREPARAÇÃO DAS FORMULAÇÕES SEMI-SÓLIDAS CONTENDO AC:
O AC foi incorporado nas formulações descritas nos quadros 1 e 2 na
concentração de 100 µg/g de creme, após prévia dissolução em propilenoglicol (1
mg/mL). As formulações foram armazenadas em bisnagas de alumínio.
4.2.4.4 ESTUDO DE ESTABILIDADE ACELERADO DAS FORMULAÇÕES SEMI-SÓLIDAS
O estudo de estabilidade acelerado foi feito com as preparações semi-sólidas
com base aniônica (Lanette®). As amostras em triplicatas foram submetidas à
avaliação por um período de 90 dias, nos tempos 0, 30, 60 e 90 dias. O estudo foi
realizado nas seguintes condições de temperatura e umidade: 25 °C/ 60% UR; 40
°C/ 90% UR.
Durante estes estudos as formulações foram avaliadas pelos mesmos
parâmetros usados no estudo prévio de estabilidade, como, características
organolépticas,
pH,
resistência
física
(centrifugação),
espalhabilidade
e
complementados com análise reológica, perfil em CCD e CLAE e quantificação do
AC em CLAE.
57
4.2.4.4.1 VISCOSIDADE E TIXOTROPIA:
As propriedades reológicas das formulações foram avaliadas com o auxílio de
um viscosímetro rotacional tipo cilindro-coaxial e cone placa a 25 °C acoplado a um
banho de água termostatizado circulante para controle da temperatura em 25 ± 1ºC.
A análise foi realizada em três etapas: 1 - velocidade de rotação crescente de 0-80
s-1, por 180 s; 2 - velocidade constante de rotação (80 s-1) por 30 segundos; 3 velocidade de rotação decrescente de 80-0 s-1 por 180 s. Em cada etapa foram
coletados 100 pontos e a viscosidade média foi calculada a partir dos dados
coletados na etapa 2. Os resultados correspondem à média de três determinações.
4.2.4.4.2 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)
Foram feitas cromatografias em camada delgada das preparações semisólidas durante o estudo de estabilidade acelerada, nos tempos zero (24 horas), 90
dias. Para a extração do AC nos cremes, foi realizado 3 sucessivas extrações com
hexano, sob agitação mecânica, durante 15 minutos. Após a extração, as frações
concentradas foram aplicadas na placa cromatográfica, usando AC como substância
referência e hexano:acetato de etila na proporção de 80:20 (v/v) como fase móvel.
4.2.4.4.3 TEOR DE AC
O teor de ativo nos cremes foi quantificado pelo método da padronização
externa por CLAE, após extração do composto da base semi-sólida, conforme
método descrito no item 4.2.4.4.2.
Após a identificação do AC por CCD, realizou-se a evaporação do solvente. O
precipitado foi dissolvido com 2 mL de metanol. As soluções obtidas foram diluídas
1:1 com fase móvel (acetonitrila, metanol e água acidificada (pH 3,5) na proporção
40:45:15 (v/v)), respectivamente filtradas e injetadas em duplicata no cromatógrafo.
As amostras foram comparadas com uma solução padrão de AC.
58
4.2.5 Estudo de Permeação in vitro
Todas as formulações foram testadas através do estudo de permeação in
vitro, usando célula de Franz (Fig. 5) adaptada e membrana de acetato de celulose
com retenção de moléculas com massa molecular maior que 12400..
Figura 5 - Célula de difusão utilizada no ensaio de liberação in vitro.
A célula de Franz foi preenchida com tampão fosfato pH 11 (solução
receptora, selecionada no teste de solubilidade) no compartimento receptor cuja
capacidade média é de aproximadamente 12 mL. Em seguida foi colocada a
membrana previamente hidratada sobre a célula e no compartimento superior foi
colocada 1 mL das diferentes formulações (fase doadora) com auxílio de uma
seringa de 3 mL. O conjunto foi firmado com uma pinça e o compartimento recoberto
com filme de PVC (cloreto de polivinila) a fim de que as formulações não sofressem
ação da umidade relativa do ar. A célula foi mantida a 37 °C através de um banho
termostatizado com água destilada circulante. Esta célula possui uma barra
magnética e o seu conteúdo foi agitado pelo agitador magnético a 3000 rpm no qual
a células se assentaram. As análises foram realizadas em 5 replicatas de cada
formulação. As amostras da solução receptora foram coletadas nos intervalos de
tempo de 2, 4, 8 e 12 horas repondo o volume total retirado imediatamente com o
líquido receptor e o AC quantificado por CLAE.
59
4.2.6 Avaliação da atividade antiinflamatória in vivo
As formulações semi-sólidas contendo AC (100 µg/g) e os promotores de
absorção foram avaliadas quanto à ação antiinflamatória em camundongos através
do edema de orelha induzido por óleo de cróton (CALIXTO et al., 1991; ZANINI et
al., 1992; OTUKI et al., 2005).
O trabalho foi submetido ao comitê de ética em pesquisa da UNIVALI e
aprovado conforme parecer n° 130/07 (Anexo A) e des envolvido no Laboratório de
Farmacologia in vivo, sob orientação da Profª. Drª. Márcia M. de Souza.
4.2.6.1 ANIMAIS
Foram usados camundongos machos pesando de 25 a 35 g, provindos do
Biotério Central da UNIVALI. Os camundongos foram alojados em gaiolas plásticas e
permaneceram em sala com temperatura de 21 ± 1 °C c om ciclo de luz 12/12 horas
controlados, recebendo água e ração ad libtum, exceto durante a vigência dos
experimentos.
4.2.6.2 MÉTODO DE EDEMA DE ORELHA INDUZIDO POR ÓLEO DE CRÓTON
Os animais foram divididos em oito grupos diferentes (n=6), anestesiados com
éter. O experimento foi realizado de acordo com a metodologia descrita por Calixto
et al. (1991), Zanini et al. (1992) e Otuki et al. (2005). A orelha direita dos animais
foram medidas com o auxílio de um micrômetro digital (medida basal) (figura 7). A
cada grupo de seis animais foi aplicado na superfície interna da orelha direita 100
mg das preparações semi-sólidas: creme lanette (controle negativo), dexametasona
0,5 % (p/p) (controle positivo), Acheflan® (controle positivo), creme lanette com alfa
bisabolol, creme lanette com uréia, creme lanette com uréia e alfa bisabolol, creme
lanette com oleato de isodecila, creme lanette com miristato de isopropila e lecitina
de soja. Após trinta minutos da aplicação dos respectivos cremes, foi aplicado o óleo
de cróton 2,5% (v/v) dissolvido em acetona, como agente irritante, na superfície
externa da orelha direita. Seis horas após a aplicação do óleo de cróton, as orelhas
foram medidas novamente e o edema de orelha foi avaliado através da diferença
60
entre a medida basal e a medida realizada após aplicação do óleo de cróton. A
medida do edema foi expressa em mm.
Figura 6 - Medida basal da orelha direita de camundongos com
auxílio de micrômetro digital.
4.2.6.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e o teste de
múltipla comparação utilizando o método de Dunnet, considerando o valor de p<
0,05 como indicativo de significância. Os dados foram analisados utilizando o
programa Graph-3®.
4.2.7 Teste de irritação cutânea
Foi realizado teste de irritação cutânea nas preparações semi-sólidas (creme
Lanette®) contendo solução de ácido caurenóico em uma concentração de 100 µg/g
(p/v) com e sem promotores através do teste de agarose overlay (INVITOX, 1991).
Este teste foi desenvolvido no Laboratório de Farmacologia in vitro, sob a orientação
do Prof. Rilton A. de Freitas.
61
4.2.7.1 TÉCNICA PARA O PREPARO DE MEIO DE CULTURA COM SORO FETAL BOVINO
Foi pesado exatamente 4,803 g de meio MEM (minimum essential medium)
contendo L- glutamina (2 mM) e aminoácidos não essenciais (1%) e em seguida
exatamente 1,85 g de bicarbonato de sódio, ambos foram transferidos para um
erlenmeyer de 1000 mL. Adicionado 445 ml de água purificada sob agitação
constante. O pH foi corrigido para 7,3 -7,4 com solução de HCl 0,1 M/L e o volume
foi completado com 50 mL de soro fetal bovino estéril, inativado e isento de
micoplasma. Foi também adicionado 5 mL de mistura de antibiótico (PSN) e
antifúngico (fungizona), ambos em fluxo laminar, em seguida foi mantido sob
agitação por meia hora. Após a agitação foi feita nova leitura de pH e corrigido
novamente para 7,3 -7,4. O meio de cultura foi filtrado em sistema MILLIPORE® com
filtração seqüencial em membranas de 0,45 µm e 0,22 µm em fluxo laminar. O meio
foi transferido para frasco schott estéril e mantido sob refrigeração por até 30 dias.
4.2.7.2 TÉCNICA
PARA O PREPARO DE MEIO DE CULTURA COM SORO FETAL BOVINO
2X
CONCENTRADO
O procedimento para o preparo do meio de cultura com soro fetal bovino 2 X
concentrado, segue a mesma técnica descrita no item 4.6.1, concentrando em 2X
todas as quantidades dos sais usados anteriormente. Foi preparado 200 mL deste
meio de cultura.
4.2.7.3 CONTROLE DE QUALIDADE MICROBIOLÓGICO DO MEIO DE CULTURA COM SORO FETAL
BOVINO
Para realização dos testes de controle de qualidade microbiológico dos meios
de cultura com soro fetal bovino e soro fetal bovino 2X concentrado, foi retirado 1 mL
de cada meio e transferido para um tubo de ensaio contendo 15 mL de TSB e 1 mL
para um tubo de ensaio contendo 15 mL de TGM. Todos os tubos de ensaios foram
mantidos em estufa a 37 °C durante 48 horas a 14 di as, sendo analisado
visualmente a cada 24 horas, a presença ou não de turbidez, ou seja, o crescimento
ou não de bactérias e fungos.
62
4.2.7.4 MANUTENÇÃO CELULAR E CRESCIMENTO
Foi acrescentado meio de cultura a uma garrafa contendo células de
fibroblasto L929, previamente descongeladas. O conteúdo desta garrafa foi
visualizado ao microscópio, para verificação do crescimento das células. Após ter
sido observado o crescimento das células com 80-90 % de confluência o meio de
cultura foi retirado, a monocamada lavada 3X com tampão salino fosfato pH 7,4
(PBS) e acrescentado 1,5 mL de tripsina (250 mg%), mantidas em agitação com
posterior incubação a 37 °C/5% CO 2 até descolamento da placa. Posteriormente, a
suspensão celular foi diluída com meio MEM e centrifugada a 1000xg por 10 min a
10 °C. Após a centrifugação o sobrenadante foi desp rezado, as células foram
ressuspendidas em meio de cultura, e transferidas para garrafas T25 (25 cm2). As
garrafas foram colocadas em estufa a 37 °C/5%CO 2 sendo observada no
microscópio a cada 24 horas, e o meio de cultura substituído a cada 48 horas.
4.2.7.5. ENSAIO AGAROSE OVERLAY
Foram tripsinizadas e transferidas 3 mL/poço de uma suspensão celular
(L929) a 300.000 células/mL em placas de 6 poços. Após 24 horas, o meio de
cultura foi substituído por MEM contendo 0,01% de vermelho neutro como corante
vital por 15 min no escuro. Posteriormente o excesso de corante vital foi removido e
adicionado em cada poço 3 mL de meio MEM, e incubado por 1 h até aparecimento
de coloração vermelha celular. O meio de cultura foi novamente removido e
substituído por uma mistura de 1:1,2 de meio agarose:meio MEM (mistura overlay),
mantidas em aquecimento (45 °C) a fim de evitar a s olidificação dos meios. Foram
transferidos 3 mL/poço de mistura overlay, e as placas mantidas em estufa a 37 °C
/5% CO2 por duas horas.
As amostras foram incorporadas em discos de papel (0,54 cm), previamente
lavados com PBS e secos, com posterior autoclavação (121 °C/20 min). Como
controle positivo foi utilizado uma solução de dodecilsulfato de sódio (DSS) a 1% em
água e como controle negativo solução salina. As placas foram incubadas por 24
horas em estufa a 37 °C /5% CO 2. O grau de irritação foi avaliado pela zona de lise
(ausência de incorporação do corante vital) através do uso de paquímetro e
63
avaliação microscópica segundo a classificação descrita pela Farmacopéia
Americana (United States Pharmacopeia, 2006) (quadro 3).
Quadro 3: Classificação do grau de irritação cutânea.
Classificação Reatividade Descrição da zona de reatividade
0
Nenhum
Nenhuma reatividade ao redor da amostra
1
Leve
Alguma má – formação ou degeneração ao redor da
amostra
2
Médio
Zona limitou a área ao redor da amostra
3
Moderado
Zona estende 0,5 a 1,0 cm além da amostra
4
Severo
Zona estende maior que 1,0 cm além da amostra
64
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Isolamento e Caracterização do AC
Em 3,335 kg de caule e raiz de S. trilobata, coletada em março de 2006,
foram isolados 4,669 g de AC, representando um rendimento de 0,14%. Boeck et al.
(2005) isolaram o AC usando metodologia semelhante e obtiveram 0,2% e Bresciani
et al. (2004) obtiveram 0,66% de rendimento. A diferença de rendimento nos
trabalhos citados pode estar relacionado com a época de coleta da planta, pois
sabe-se que a planta apresenta maior quantidade de AC no outono. O composto
isolado apresentou-se na forma de cristais do tipo aciculares e hexagonais (Fig. 7),
de cor branca.
Figura 7 – AC na forma cristalina obtido após evaporação do
solvente (hexano).
A temperatura de fusão encontrada foi de 176,3 – 180,2 ºC, resultado este
semelhante ao obtido por Boeck e colab. (2005) que foi de 179-180 °C.
A figura 8 apresenta a espectroscopia do AC na região do infravermelho (IV).
O ácido carboxílico presente na estrutura do composto apresenta absorção de
deformação axial de O-H intensa e muito larga na região de 3300-2500 cm-1. A
absorção na região 1710-1680 cm-1 é resultante da deformação axial de C=O dos
ácidos carboxílicos conjugados a insaturações C=C. Uma banda mais intensa,
65
próxima a 1320-1210 cm-1, é geralmente associada à deformação axial de C-O.
(SILVERSTEIN; BASSLER; MORRIL, 1994). Os resultados obtidos estão de acordo
com os dados descritos na literatura (BOECK et al., 2005).
Figura 8 - Espectro de absorção do AC na região do infravermelho.
O perfil cromatográfico do composto isolado foi comparado com o perfil do
padrão do AC em cromatografia de camada delgada. Conforme apresentado na
figura 9 o perfil do AC isolado apresentou valor de Rf de 0,53, valor este semelhante
ao do padrão.
66
Figura 9 - Perfil do AC em cromatografia de camada delgada (CCD).
L1A – composto obtido na fração hexânica, L1B – composto obtido na
fração Hex:AcOEt 99:1; P – composto referência. Eluente: Hex:AcOEt
80:20. Revelador: anisaldeído sulfúrico.
Para verificação do perfil por CLAE do composto isolado, foi preparada uma
solução
deste
na
acetonitrila:metanol:água
concentração
acidificada
de
(pH
100
3,5)
µg/mL
na
em
fase
proporção
móvel
40:45:15,
respectivamente. O AC apresentou um tempo de retenção de aproximadamente 12
minutos. O perfil cromatográfico obtido foi semelhante à amostra referência do AC e
pode ser observado na figura10, destacando o perfil de absorção da substância no
ultravioleta (210 nm).
Figura 10 – Perfil cromatográfico do AC em CLAE, em 210 nm.
67
1
O espectro de RMN H do AC (Fig. 11) apresenta como principais informações:
dois simpletos em 0,9 e 1,20 ppm referentes as duas metilas e dois simpletos em
4,74 e 4,80 ppm referentes aos hidrogênios olefínicos. Os sinais entre 0,6 e 2,8 ppm
são referentes aos metilenos e metinos. Os dados estão de acordo com os descritos
na literatura (BOECK et al., 2005).
Figura 11 - Espectro de RMN 1H do AC. Solvente clorofórmio deuterado. Concentração: 30
mg/mL.
A Fig. 12 apresenta o espectro de RMN
13
C do AC. São observados os sinais
em 184,2 ppm referente a carbonila e em 155,8 e 102,9 ppm referentes aos
carbonos olefínicos. Os demais sinais entre 60 e 15 ppm são referentes aos
carbonos metilenos, metílicos e metinos. O espectro obtido está de acordo com os
dados descritos na literatura (BOECK et al., 2005).
68
Figura 12 - Espectro de RMN 13C do AC. Solvente clorofórmio deuterado. Concentração: 30
mg/mL.
5.1.1 Solubilidade do AC
Foi verificada a solubilidade do AC em água, em meio aquoso em diferentes
valores de pH e em propilenoglicol. A substância não dissolveu em proporções entre
1:1 (AC:água) a 1:10.000, podendo ser considerada insolúvel em água.
Para verificar a solubilidade em meio aquoso em difentes valores de pH, foi
adicionado ácido ou base à solução contendo 100 µg/mL de AC e foram retiradas
alíquotas da solução em pH 1 ao 11 e quantificado em CLAE. Conforme
apresentado na figura 13, o AC possui solubilidade pH-dependente sendo que a
partir do pH 8 observou-se um aumento de solubilidade e em pH 10 foi observado o
máximo de solubilidade (187 µg/mL).
Em
propilenoglicol
foi
verificada
a
solubilidade
do
composto
nas
concentrações de 0,5 e 1 mg/mL. O composto dissolveu-se totalmente. Com isso, é
69
possível classificar este como levemente solúvel em propilenoglicol (AULTON,
2005), como mostra a Fig. 13.
Água
pH 11
pH 10
pH 9
Solvente
pH 8
pH 7
pH 6
pH 5
pH 4
pH 3
pH 2
pH 1
Propilenoglicol
0
200
400
600
800
1000
1200
Solubilidade do AC (µ
µg/mL)
Figura 13- Solubilidade do AC em meio aquoso com diferentes valores de pH,
água e propilenoglicol.
A partir dos dados da curva potenciométrica do AC em meio aquoso (figura 14) foi
determinado o pKa do ácido caurenóico sendo 5,88.
4
10
8
2
pH
∆pH/∆V
6
4
0
2
0
-10
0
10
20
30
40
50
Volume NaOH (mL)
60
70
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
Volume NaOH (mL)
Figura 14- Titulação potenciométrica do AC e derivado da titulação potenciométrica.
70
5.1.2 Coeficiente de Partição
O coeficiente de partição do AC no sistema tampão/octanol foi verificado
através da adição da solução tampão contendo AC em contato com octanol
previamente saturado com água. Através da quantificação do AC remanescente na
solução aquosa, foi verificado que 95,99 ± 2,26% particionou para a fase oleosa, ou
seja, octanol. A partir destes resultados o AC pode ser considerado um fitocomposto
com alto coeficiente de partição água/óleo.
5.2 Quantificação do AC em CLAE
Para quantificação do ácido caurenóico nos ensaios de caracterização deste
e nas formulações foi usado o método analítico por CLAE desenvolvido por Zanella
e colab. (2006). A linearidade e a precisão do método foram determinadas.
A linearidade é a capacidade da metodologia analítica demonstrar que os
resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na
amostra, em um intervalo especificado (BRASIL, 2003).
Para obtenção da curva analítica do AC, foi preparada uma solução padrão
com concentração de 100 µg/mL, em fase móvel acetonitrila:metanol:água
acidificada (pH 3,5) na proporção 40:45:15. A partir desta solução foram feitas
diluições em triplicata nas concentrações de: 4; 10; 20; 30; 50 e 80 µg/mL. Neste
experimento o tempo de retenção do AC foi de 11,55 minutos.
Os valores da área obtidos foram plotados com as respectivas concentrações
e foi calculada a equação da reta através de análise de regressão linear. Foram
obtidos a equação da reta e o coeficiente de regressão (R2) mostrados na Figura 15
O método apresenta linearidade de 4 a 50 µg/mL com coeficiente de regressão de
0,9991, atendendo as especificação da RE 899 (BRASIL, 2003) que recomenda um
coeficiente de no mínimo 0,99. Zanella et al. (2006) validaram a metodologia
analítica para quantificação do AC por CLAE e, nos testes de linearidade obtiveram
um coeficiente de correlação de 0,9996 na faixa de 10 a 80 µg/mL.
71
1,2e+6
Equação da reta:
y = 20494x + 137,29
R2 = 0,9991
1,0e+6
Área
8,0e+5
6,0e+5
4,0e+5
2,0e+5
0,0
0
10
20
30
40
50
60
Ácido Caurenóico (µg/mL)
Figura 15- Curva analítica do AC em CLAE. Fase móvel - acetonitrila:metanol:água
acidificada (pH 3,5) (40:45:15).
A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série
de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. Esta é
considerada em três níveis: repetibilidade, precisão intermediária ou reprodutividade
(POLESELLO, 1997). A repetibilidade constitui a precisão estudada no mesmo
laboratório, em pequeno intervalo de tempo. A precisão intermediária é expressa
pela variação entre resultados obtidos em dias diferentes pelo mesmo laboratório. A
reprodutividade é estudada entre diferentes laboratórios, em diversas localidades do
mundo, utilizando o mesmo conjunto de amostras (AMARANTE et al., 2001).
Sendo a repetibilidade a análise do grau de concordância entre os resultados
obtidos, sob as mesmas condições de medição, o ensaio deve ser procedido
mantendo inalterado o procedimento de medição, o analista, o equipamento usado,
as condições e o local de análise, com repetições em curto espaço de tempo.
A
partir
de
uma
solução
padrão
(100
µg/mL)
em
fase
móvel
acetonitrila:metanol:água acidificada (pH 3,5) na proporção 40:45:15 foram
preparadas três soluções nas concentrações de 4, 30 e 50 µg/mL. As análises foram
feitas com 6 replicatas, sendo cada concentração analisada em duplicada em três
diferentes períodos do dia.
72
A Tabela 1 apresenta a repetibilidade do método quando analisado em três
diferentes concentrações em 6 replicatas. O DPR para as concentrações de 4, 30 e
50 µg/mL foi de 4,78, 1,28 e 3,78 %, respectivamente. Portanto, o método analisado
apresenta precisão em nível de repetibilidade dentro dos limites recomendados pela
RE 899 (BRASIL, 2003), que é de no máximo 5%.
Tabela 1 – Resultados da análise de precisão do método
analítico para quantificação do AC por CLAE
AC (µg/mL)
4
Média*
Desvio Padrão
30
50
63604
525482
88387,3
3040,10
6733,23
33438,24
4,78
1,28
3,78
DPR (%)
* n=6
5.3 Desenvolvimento e estudo de estabilidade das formulações
Para o desenvolvimento das formulações semi-sólidas (cremes), foram
escolhidas duas bases clássicas, uma com características aniônicas (Lanette®) e
outra não-iônica (Polawax®), estas bases são preferidas pela boa estabilidade que
apresentam (ZANIN et al., 2001). Em ambas as bases foram adicionados diferentes
promotores de absorção como: miristrato de isopropila e lecitina de soja, alfa
bisabolol, oleato de isodecila, uréia. O AC foi adicionado, previamente dissolvido em
propilenoglicol, nas formulações na concentração de 100 µg/g de creme.
5.3.1 Testes prévios de estabilidade
As amostras em triplicata submetidas aos testes prévios de estabilidade,
creme Lanette®, creme Polawax® com adição dos promotores de absorção, foram
avaliadas quanto à estabilidade física no tempo zero (24 horas) e com 12 dias, após
estresse térmico (ciclo gelo-degelo). Os parâmetros analisados foram quanto à cor,
odor, homogeneidade, brilho, pH, espalhabilidade (mm²) e homogeneidade após
73
estresse mecânico (centrifugação) (MAIA, 2001; ZANIN et al., 2001; CZEPULA,
2006; PROENÇA et al., 2006).
A estabilidade física faz com que os produtos permaneçam de forma
inalterada após sua fabricação. As propriedades físicas são avaliadas pela
manutenção
da
aparência,
palatabilidade,
uniformidade,
dissolução
e
suspentabilidade. Numerosos fatores podem afetar a estabilidade de um fármaco em
uma forma farmacêutica, incluindo pH, temperatura, solvente, luz, hidrólise,
oxidação, tamanho de partículas, entre outros (ALLEN Jr., 2002).
Através da centrifugação, consegue-se observar quando há separação da
fase interna (MONTAGNER; CORRÊA, 2004), avaliando a coalescência ou a
cremeação, podendo prever se o produto irá separar em função do tempo, avaliando
em curto espaço de tempo possíveis instabilidades físico-químicas (MORAES,
2006). A estabilidade física da emulsão é fundamental, pois a ocorrência de
separação de fases pode afetar todas as demais especificações de uma emulsão
(ALLEN Jr., 2002).
A determinação do pH é um dos fatores mais importantes, pois proporciona
informações que podem refletir a estabilidade química da preparação, principalmente
quanto a reações de degradação do princípio ativo ou adjuvantes da formulação
(MORAES, 2006).
Com o teste de espalhabilidade pode ser observado se as formulações
mantêm estáveis as características físicas e físico-químicas relacionadas à reologia
e conseqüente espalhabilidade do produto, que podem estar relacionadas à perda
ou ganho de umidade, à separação de fases e precipitação de adjuvantes, após
terem sido submetidas a diversas condições de armazenamento (CZEPULA, 2005).
Os resultados obtidos no teste prévio de estabilidade do tempo zero (24
horas) e tempo doze dias estão demonstrados nos quadros 4 e 5.
Todas as formulações em ambas as bases apresentaram-se estáveis durante a
análise inicial quanto aos caracteres organolépticos, homogêneas após estresse
mecânico (C-conforme) e permanecendo com a mesma consistência inicial (Cconforme). As formulações LML e PML, contendo lecitina de soja e miristato de
isopropila apresentaram consistência inadequada e separação de fases, em
concentrações maiores, mantendo-se estáveis apenas nas concentrações descritas
no quadro 1 e 2. As formulações LU, LUA, PU e PUA apresentaram os maiores
valores de pH, provavelmente provocado pela presença da uréia como promotor.
74
Todas as formulações (base Lanette® e base Polawax®) apresentaram-se
estáveis após o estresse térmico quanto aos caracteres organolépticos. As
formulações LU, LUA, PU e PUA apresentaram os maiores valores de pH,
provocado pela presença da uréia como promotor, como observado no tempo zero.
A espalhabilidade dos cremes com base Lanette®, apresentou uma pequena
variação e, os cremes com base Polawax®, apresentaram uma redução na
espalhabilidade, podendo tal alteração estar associada à perda de água durante o
estresse térmico, podendo ser uma característica da base, já que todas as
formulações apresentaram o mesmo comportamento independente do promotor
utilizado.
As preparações semi-sólidas descritas nos quadros 1 e 2, sem a presença do
AC, foram aprovadas para a continuidade dos estudos, pois não houve variações
significativas de pH e os caracteres organolépticos mantiveram-se estáveis
indicando que provavelmente não houve degradação das matérias-primas utilizadas.
75
Quadro 4: Características das formulações com base Polawax® sem AC no tempo zero e tempo 12 dias após estresse térmico (ciclo gelodegelo).
Formulações*
PO
Parâmetros
PA
PU
PUA
PML
t0
t
12d
t0
t
12d
t0
t
12d
t0
t
12d
t0
t
12d
BR/OP
BR/OP
BR/OP
BR/OP
BR/OP
BR/OP
BR/OP
BR/OP
BR/OP
BR/OP
Odor
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
Homogeneidade
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
Brilho
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
4,44
4,10
4,56
4,07
6,28
7,36
6,12
7,58
5,63
4,26
1542,92 ±
812,28 ±
1440,23 ±
795,53 ±
1531,34 ±
820,72 ±
1417,90 ±
754,38 ±
1440,23 ±
660,32 ±
20,05
14,62
19,38
14,39
20,05
14,62
0
0
19,37
22,76
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
Cor
pH
Espalhabilidade (mm²)
Homogeneidade após
estresse mecânico
Consistência
Legenda: AM/CL: Amarelo/Claro; BR/OP: Branco/Opaco;C: Conforme; NC: Não Conforme; PO - creme polawax contendo oleato de isodecila
como promotor; PA – creme polawax contendo alfa-bisabolol como promotor; PU - creme polawax contendo uréia como promotor; PUA –
creme polawax contendo uréia e alfa-bisabolol como promotores; PML – creme polawax contendo miristato de isopropila e lecitina de soja
como promotores; t = tempo; d = dias
*n=3
76
Quadro 5: Características das formulações com base Lanette® sem AC no tempo zero e no tempo 12 dias após
estresse térmico (ciclo gelo-degelo).
Formulações*
LO
Parâmetros
LA
t0
t
12d
BR/OP
Odor
LU
t0
t
12d
BR/OP
BR/OP
C
C
Homogeneidade
C
Brilho
Cor
pH
Espalhabilidade (mm²)
Homogeneidade após
LUA
t0
t
12d
BR/OP
BR/OP
C
C
C
C
C
C
4,85
LML
t0
t
12d
t0
t
12d
BR/OP
BR/OP
BR/OP
BR/OP
BR/OP
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
6,95
5,01
6,97
6,20
7,75
6,33
7,83
5,75
6,73
1330,38
1173,71
1235,20
1373,82
1395,80
1395,80
1395,80
1341,17
1277,06
1373,82
± 18,70
± 17,56
± 18,01
± 18,92
± 19,15
± 19,15
± 19,15
± 18,69
± 18,24
±18,92
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
estresse mecânico
Consistência
Legenda: AM/CL: Amarelo/Claro; BR/OP: Branco/Opaco; C: Conforme; NC: Não Conforme; LO – creme lanette
contendo oleato de
isodecila como promotor; LA – creme lanette contendo alfa-bisabolol como promotor; LU – creme
lanette contendo uréia como
promotor; LUA – creme lanette contendo uréia e alfa-bisabolol como promotores; LML – creme lanette contendo miristato de isopropila
e lecitina de soja como promotores; t = tempo; d = dias.
*n=3
77
5.3.2 Estudo de Estabilidade Acelerado das Formulações Semi-sólidas
Para que a estabilidade química seja mantida, cada componente ativo deve
reter sua integridade química e manter-se potente dentro dos limites especificados e
dentro do período de armazenagem e de uso, preservando as propriedades e
características que possuía quando foram manipulados (MONTAGNER; CORRÊA,
2004).
Para os estudos de estabilidade acelerado optou-se em realizar apenas as
formulações
semi-sólidas
aniônicas
(creme
Lanette®),
por ser
uma
base
tecnologicamente mais fácil de preparar e por ser uma base usual em preparações
de formulações semi-sólidas.
Nestas formulações semi-sólidas foi incorporada a solução de AC em
propilenoglicol na concentração de 100 µg/g de creme e os diferentes promotores de
absorção (oleato de isodecila, alfa bisabolol, uréia, miristato de isopropila e lecitina
de soja). O estudo de estabilidade acelerado destas preparações foi realizado em
triplicata durante 90 dias, avaliando-se nos tempos zero (24 horas), 30, 60 e 90 dias
em temperatura ambiente e nos tempos 30, 60 e 90 dias em estufa 40 °C. Foi
verificada
a
estabilidade
física
e
físico-química
através
dos
caracteres
organolépticos, pH, centrifugação (estresse mecânico), espalhabilidade, viscosidade,
tixotropia, CCD e CLAE.
Os caracteres organolépticos avaliados foram, homogeneidade, cor, odor,
brilho, ausência de grumos e precipitados. Estes testes foram realizados visualmente
e pela percepção direta. Em todos os tempos de análise e nas temperaturas usadas
às preparações mostraram-se estáveis com relação aos caracteres organolépticos e
após estresse mecânico. A determinação do pH e os testes de espalhabilidade,
viscosidade e tixotropia foi realizada em triplicata (quadros 6 e 7, figuras 16 a 23 ).
78
Quadro 6: Características dos cremes com ácido caurenóico e promotores de absorção no teste de estabilidade acelerado em temperatura ambiente.
Formulações
Parâmetros (média ± desvio-padrão)*
L
LA
LAO
LAA
LAU
LAUA
LAML
Espalhabilidade (mm2)
pH
Tixotropia (Pa-1)
Viscosidade (mPa.s)
t
0
t
30d
t
60d
t
90d
t
0
t
30d
t
60d
t
90d
t
0
t
30d
t
60d
t
90d
t
0
t
30d
5,73
± 0,04
5,87
± 0,06
5,84
± 0,01
5,76
± 0,01
6,57
± 0,05
6,61
± 0,01
5,83
± 0,02
6,18
±0,36
5,88
±0,02
5,93
±0,01
5,88
±0,13
7,40
±0,09
7,24
±0,07
5,90
±0,16
5,96
± 0,04
6,09
± 0,21
5,78
± 0,01
6,25
± 0,24
7,55
± 0,15
7,62
± 0,08
5,99
± 0,02
5,91
± 0,09
5,87
± 0,04
5,98
± 0,01
5,84
± 0,12
7,38
± 0,06
7,40
± 0,05
5,75
± 0,06
970,85
± 15,98
998,65
± 16,21
1113,78
± 17,11
1084,41
± 16,88
1153,56
± 17,33
1055,43
± 16,65
889,80
± 15,30
1055,43
± 16,65
1153,56
± 17,34
1298,26
±18,47
1214,53
± 17,78
1153,56
± 17,33
1143,55
± 17,33
1008,00
± 16,20
1330,38
± 18,70
1277,06
± 18,24
1395,80
± 19,15
1531,34
± 20,05
1373,82
± 18,92
1330,38
± 18,69
1143,55
± 17,33
1341,17
± 18,70
1277,06
± 18,24
1153,56
± 17,33
1277,06
± 18,24
1094,16
± 16,88
1266,53
± 18,24
1026,84
± 16,43
2753,33
± 628,52
3573,33
± 371,66
2520
± 223,38
2700
± 208,09
2383,33
± 275,38
2520
± 166,43
3086,67
± 310,05
2396,67
± 151,44
2673,33
± 142,94
2173,33
± 104,08
2043,33
± 11,55
2676,67
± 66,58
2043,33
± 167,43
2696,67
± 201,08
2226,67
± 77,67
2616,67
± 97,12
2210
± 55,68
2076,67
± 100,17
2580
± 121,65
1886,67
± 81,44
2660
± 141,07
2766,67
± 223,68
2723,33
± 77,67
2536,67
± 444,67
2346,67
± 135,77
2870
± 272,21
2400
± 304,14
2956,67
± 168,03
3430,67
±1097,8
3386,33
± 562,22
1725,33
± 469,52
1968,33
± 72,40
1736
± 99,45
2093,33
± 252,84
2028
± 132,52
1596
± 246,31
2254
± 239,27
917,56
± 267,72
1492,57
± 469,40
2210,67
± 336,00
1392,67
± 104,74
2517,67
± 433,06
t
60d
t
90d
1586,33
± 355,78
2417
± 36,30
983,43
± 44,07
1671,33
± 48,84
2310,67
± 149,43
928,17
± 451,01
2713
± 372,76
2429,67
± 396,40
2792,33
± 241,55
823,00
± 845,88
1724,67
± 63,26
1859
± 523,14
1290,67
± 266,49
3386
± 439,12
Legenda: L - creme sem AC; LA – creme contendo 0,1% de AC; LAO - contendo 0,1% de AC mais oleato de isodecila como promotor; LAA –
contendo 0,1% de AC mais alfa-bisabolol como promotor; LAU - contendo 0,1% de AC mais uréia como promotor; LAUA - contendo 0,1% de
AC mais uréia e alfa-bisabolol como promotores; LAML – creme contendo 0,1% de AC mais miristato de isopropila e lecitina de soja como
promotores; t = tempo; d = dias
*n=3
79
10
pH
8
6
L
LA
LAC
LAA
LAU
LAUA
4
LAML
0
T0
T 30
T 60
T 90
Tempo (dias)
Figura 16- Teste de estabilidade acelerado referente ao pH dos cremes com base Lanette
com os promotores de absorção em temperatura ambiente. L - creme sem AC; LA
®
– creme contendo 0,1% de AC; LAC -creme contendo 0,1% de AC mais cetiol V
como promotor; LAA -creme contendo 0,1% de AC mais alfa-bisabolol como
promotor ; LAU -creme contendo 0,1% de AC mais uréia como promotor; LAUA
creme- contendo 0,1% de AC mais uréia e alfa-bisabolol como promotores; LAML
– creme contendo 0,1% de AC mais miristato de isopropila e lecitina de soja como
promotores.
80
1600
Espalhabilidade (mm)
1500
1400
L
LA
LAC
LAA
LAU
LAUA
LAML
1300
1200
1100
1000
900
800
T0
T 30
T 60
T 90
Tempo (dias)
Figura 17- Teste de estabilidade acelerado referente a espalhabilidade dos cremes com os
promotores de absorção em temperatura ambiente. L - creme sem AC; LA – creme
®
contendo 0,1% de AC; LAC - creme contendo 0,1% de AC mais cetiol V como
promotor; LAA creme- contendo 0,1% de AC mais alfa-bisabolol como promotor; LAU
- creme contendo 0,1% de AC mais uréia como promotor; LAUA – creme contendo
0,1% de AC mais uréia e alfa-bisabolol como promotores; LAML – creme contendo
0,1% de AC mais miristato de isopropila e lecitina de soja como promotores.
81
3800
3600
Viscosidade (mPa.s)
3400
3200
L
LA
LAC
LAA
LAU
LAUA
LAML
3000
2800
2600
2400
2200
2000
1800
T0
T 30
T 60
T 90
Tempo (dias)
Figura 18- Teste de estabilidade acelerado referente à viscosidade dos cremes com os promotores
de absorção em temperatura ambiente. L - creme sem AC; LA – creme contendo 0,1% de AC; LAC –
®
creme contendo 0,1% de AC mais cetiol V como promotor; LAA - creme contendo 0,1% de AC mais
alfa-bisabolol como promotor; LAU – creme contendo 0,1% de AC mais uréia como promotor; LAUA creme contendo 0,1% de AC mais uréia e alfa-bisabolol como promotores; LAML – creme contendo
0,1% de AC mais miristato de isopropila e lecitina de soja como promotores.
82
4000
3500
Tixotropia Pa-1
3000
L
LA
LAC
LAA
LAU
LAUA
LAML
2500
2000
1500
1000
500
T0
T 30
T 60
T 90
Tempo (dias)
Figura 19- Teste de estabilidade acelerado referente a tixotropia dos cremes com os promotores de
absorção em temperatura ambiente. L - creme sem AC; LA – creme contendo 0,1% de AC; LAC ®
contendo 0,1% de AC mais cetiol V como promotor; LAA - creme contendo 0,1% de AC mais alfabisabolol como promotor; LAU – creme contendo 0,1% de AC mais uréia como promotor; LAUA –
creme contendo 0,1% de AC mais uréia e alfa-bisabolol como promotores; LAML – creme contendo
0,1% de AC mais miristato de isopropila e lecitina de soja como promotores.
83
Quadro 7: Características dos cremes com ácido caurenóico e promotores de absorção no teste de estabilidade acelerado em temperatura
40 °C.
Formulações
Parâmetros (média ± desvio-padrão)*
L
LA
LAO
LAA
LAU
LAUA
LAML
Espalhabilidade (mm2)
pH
Tixotropia (Pa-1)
Viscosidade (mPa.s)
t
0
t
30d
t
60d
t
90d
t
0
t
30d
t
60d
t
90d
t
0
t
30d
t
60d
t
90d
t
0
t
30d
t
60d
t
90d
5,73
±0,04
5,87
±0,06
5,84
±0,01
5,76
±0,01
6,57
±0,05
6,61
±0,01
5,83
±0,02
5,79
±0,15
5,84
±0,83
6,14
±0,25
5,85
±0,13
7,95
±0,04
8,14
±0,05
5,86
±0,12
6,26
±0,14
6,02
±0,83
6,20
±0,19
6,10
±0,06
8,26
±0,18
8,64
±0,23
5,87
±0,03
5,94
±0,18
5,94
±0,14
5,85
±0,08
5,91
±0,14
8,37
±0,04
8,55
±0,14
5,71
±0,06
970,85
± 15,98
998,65
± 16,21
1113,78
± 17,11
1084,41
± 16,88
1153,56
± 17,33
1055,43
± 16,65
889,80
± 15,30
1183,85
± 17,56
1008,00
± 16,20
980,07
± 15,97
889,80
± 15,30
1094,16
± 16,88
1204,25
± 17,78
980,07
± 15,97
1173,71
± 17,56
1173,71
± 17,56
1245,60
± 18,02
1542,92
± 20,05
1065,05
± 16,65
1214,52
± 17,78
1113,78
± 17,11
1113,78
± 17,11
952,53
± 15,75
1298,26
± 18,47
1074,66
±0
1214,52
± 17,79
1055,43
± 16,65
952,53
± 15,75
2753,33
±628,52
3573,33
±371,66
2520
±223,38
2700
±208,09
2383,33
± 75,38
2520
± 66,43
3086,67
± 10,05
2863,33
±201,08
3326,67
±308,92
2826,67
± 55,07
2846,67
± 86,22
3110
± 55,67
2840
± 51,33
2990
±306,43
2953,33
±308,92
3103,33
± 75,05
2743,33
± 58,59
2833,33
±136,14
2813,33
±170,10
2400
±101,49
2896,67
±327,19
3226,67
±122,20
3520
±140
2740
±17,32
2783,33
±145,72
2956,67
± 98,15
2493,33
±273,01
3176,67
±195,53
3430,67
±1097,08
3386,33
±562,22
1725,33
±469,52
1968,33
± 72,40
1736
± 99,45
2093,33
±252,84
2028
±132,52
3885,67
±1212,64
2948,33
± 715,94
1427,33
± 163,02
2268,67
± 92,12
3322
± 156,14
1986
± 258,37
4504,33
± 726,49
2156
± 642,86
2560,33
± 313,86
1612
± 191,44
2415,67
± 448,08
2924,33
±224,42
1364,67±
131,23
3392
± 18,05
2392
±210,41
2710
± 69,11
1689,67
±172,32
2635,67
±290,66
3063
± 75,03
1578,33
± 23,43
3703,33
± 61,33
Legenda: L - creme sem AC; LA – creme contendo 0,1% de AC; LAO - contendo 0,1% de AC mais oleato de isodecila como promotor; LAA contendo 0,1% de AC mais alfa-bisabolol como promotor ; LAU - contendo 0,1% de AC mais uréia como promotor; LAUA - contendo 0,1% de
AC mais uréia e alfa-bisabolol como promotores; LAML – creme contendo 0,1% de AC mais miristato de isopropila e lecitina de soja como
promotores; t = tempo; d = dias
*n=3
84
10
8
pH
L
LA
LAC
LAA
LAU
LAUA
LAML
6
4
0
T 30
T 60
T 90
Tempo (dias)
Figura 20- Teste de estabilidade acelerado referente ao pH dos cremes com os promotores
de absorção em temperatura 40°C. L - creme sem AC; LA – creme contendo
®
0,1% de AC; LAC -creme- contendo 0,1% de AC mais cetiol V como promotor;
LAA – creme contendo 0,1% de AC mais alfa-bisabolol como promotor; LAU creme contendo 0,1% de AC mais uréia como promotor; LAUA - creme contendo
0,1% de AC mais uréia e alfa-bisabolol como promotores; LAML – creme
contendo 0,1% de AC mais miristato de isopropila e lecitina de soja como
promotores.
85
1600
Espallhabilidade (mm)
1500
1400
1300
L
LA
LAC
LAA
LAU
LAUA
LAML
1200
1100
1000
900
800
T 30
T 60
T 90
Tempo (dias)
Figura 21- Teste de estabilidade acelerado referente a espalhabilidade dos cremes com os
promotores de absorção em temperatura 40°C. L - cre me sem AC; LA – creme
®
contendo 0,1% de AC; LAC - creme contendo 0,1% de AC mais cetiol V como
promotor; LAA - creme contendo 0,1% de AC mais alfa-bisabolol como promotor; LAU
- creme contendo 0,1% de AC mais uréia como promotor; LAUA – creme contendo
0,1% de AC mais uréia e alfa-bisabolol como promotores; LAML – creme contendo
0,1% de AC mais miristato de isopropila e lecitina de soja como promotores.
86
3600
Viscosidade (mPa.s) 40c
3400
3200
L
LA
LAC
LAA
LAU
LAUA
LAML
3000
2800
2600
2400
2200
T 30
T 60
T 90
Tempo (Dias)
Figura 22- Teste de estabilidade acelerado referente à viscosidade dos cremes com os promotores
de absorção em temperatura 40°C. L - creme sem AC; LA – creme contendo 0,1% de AC; LAC ®
creme contendo 0,1% de AC mais cetiol V como promotor; LAA – creme contendo 0,1% de AC mais
alfa-bisabolol como promotor; LAU – creme contendo 0,1% de AC mais uréia como promotor; LAUA –
creme contendo 0,1% de AC mais uréia e alfa-bisabolol como promotores; LAML – creme contendo
0,1% de AC mais miristato de isopropila e lecitina de soja como promotores.
87
5000
4500
Tixotropia Pa-1
4000
L
LA
LAC
LAA
LAU
LAUA
LAML
3500
3000
2500
2000
1500
1000
T 30
T 60
T 90
Tempo (dias)
Figura 23-Teste de estabilidade acelerado referente a tixotropia dos cremes com os promotores de
absorção em temperatura 40°C. L - creme sem AC; LA – creme contendo 0,1% de AC; LAC ®
contendo 0,1% de AC mais cetiol V como promotor; LAA -creme contendo 0,1% de AC mais alfabisabolol como promotor; LAU - creme contendo 0,1% de AC mais uréia como promotor; LAUA –
creme contendo 0,1% de AC mais uréia e alfa-bisabolol como promotores; LAML – creme contendo
0,1% de AC mais miristato de isopropila e lecitina de soja como promotores.
A maioria das formulações apresentou pouca variação de pH, em ambas as
temperaturas, durante o período de estudo, apresentando valores de pH levemente
ácidos, sendo esta faixa de pH considerada como ideal para as finalidades
propostas. As formulações LAU e LAUA apresentaram maior variação de pH em
ambas as temperaturas, provavelmente devido à presença de uréia nestas
formulações.
Em estudos anteriores de permeação cutânea in vitro do piroxicam com
formulações semi-sólidas (Lanette® + uréia e Net Fs® + uréia) estas também
apresentaram variação de pH. Para tentar estabilizar o caráter fortemente básico da
uréia, foram testados dois sistemas de tampão, tampão fosfato pH 6,5 e tampão Tris
pH 7, 0, sendo que a formulação com tampão Tris apresentou menor variação de pH
(BORTOLON, 2006).
Testes de avaliação da estabilidade com cremes contendo uréia em
diferentes valores de pH foram realizados por Montagner e Corrêa (2004), estas
88
avaliações foram realizadas com pH 4, 6 e 8, armazenadas em diferentes locais,
prateleira (25 °C), geladeira (5 °C) e estufa (45 ° C) durante 90 dias. As formulações
com pH 4 e 6 tiveram seu pH aumentado quando armazenados na prateleira e
geladeira, os cremes com pH 8 tiveram seu pH diminuído no decorrer dos testes
armazenados na prateleira e geladeira. Todos os cremes armazenados em estufa
tiveram seus valores de pH alterados, os cremes com pH 4 e 6 tiveram seus valores
de pH alterados para 7 chegando até 8 com o decorrer do tempo, e no creme com
pH inicial 8, chegou em pH 9. Os autores atribuíram este aumento no pH ao
aumento da velocidade de reação, provocando instabilidade dos cremes com uréia.
As formulações foram aprovadas no teste de resistência física através da
verificação da homogeneidade após estresse mecânico (centrifugação) realizados
em triplicatas numa rotação de 1370 g por 15 minutos. Os cremes não apresentaram
precipitados, coalescência ou separação de fases durante o estudo, demonstrando
estabilidade com relação ao teste de estresse mecânico.
A espalhabilidade é a expansão de uma formulação semi-sólida sobre uma
superfície após um determinado período de tempo sendo uma das principais
características das formas farmacêuticas de uso tópico, pois está relacionada com a
aplicação destas formulações em seu local de ação (BORGHETTI; KNORST, 2006).
Através dos resultados apresentados nos Quadros 6 e 7, figuras 16 a 23 foi
observado que a as formulações semi-sólidas apresentaram uma espalhabilidade
menor no tempo zero, aumentando um pouco no tempo 30 dias, com exceção da
formulação LAU que se manteve estável. As formulações apresentaram um aumento
razoável na espalhabilidade com 60 dias, com exceção da formulação LAA, que teve
um aumento maior neste intervalo de tempo. Com 90 dias de estudo as formulações
L, LA, mantiveram-se com a mesma espalhabilidade do tempo 60 dias, as demais
formulações apresentaram uma redução na espalhabilidade. Este comportamento
das formulações provavelmente deve-se à perda de umidade durante o
acondicionamento ou pela presença dos promotores de absorção, pois as
formulações que se mantiveram mais estáveis (L, LA), foram as formulações que
não possuiam promotores de absorção na sua composição.
Em relação à avaliação da espalhabilidade das formulações armazenadas a
temperatura de 40 °C (Quadro 7), pode-se observar q ue as formulações L, LA, LAU
e LAUA, apresentaram uma maior espalhabilidade no tempo 30 dias em relação às
demais. As formulações L e LA não possuem promotores de absorção e as
89
formulações LAU e LAUA possuem uréia como promotor de absorção, podendo este
comportamento estar relacionado à presença deste promotor. As formulações
quando avaliadas no tempo 60 dias apresentaram um aumento da espalhabilidade,
com exceção da L, LAU que tiveram uma pequena redução e a preparação LAA teve
o mesmo comportamento avaliado na temperatura ambiente, aumentando
siginificativamente a sua espalhabilidade. No tempo 90 dias as formulações
mostraram uma pequena redução na espalhabilidade, com exceção da LAA que
teve uma redução maior da estabilidade tendo este mesmo comportamento em
temperatura ambiente, mas mais acentuado a 40 °C. A s preparações LAO e LAU
mostraram um pequeno aumento da espalhabilidade, o mesmo não ocorrendo na
temperatura ambiente.
A determinação da viscosidade em emulsões é um critério adequado para
estimar a sua qualidade, mas não é realizado com valores absolutos de viscosidade
e sim com alterações desta durante o armazenamento (MONTAGNER; CORRÊA,
2004).
O comportamento reológico é utilizado para caracterizar o espalhamento de
um creme ou loção sobre a pele. O estudo da reologia abrange a viscosidade, tipo
de fluxo, valor de rendimento e tixotropia do produto (LONGO, 2006):.
Quando um corpo sólido ou líquido é aquecido, a viscosidade (η) diminui e a
fluidez aumenta. Esta relação é análoga à equação de Arrhenius da cinética
química.
η = Ae Eν / RT
Eq. 2
onde, A é uma cosntante depedente da massa molecular e do volume molar do
líquido, Ev
é a energia de ativação requerida para iniciar o fluxo entre camadas
moleculares, R é a constante universal dos gases (0,082 atm L K-1 mol -1) e T é a
temperatura expressa em Kelvin (NETZ; ORTEGA, 2002).
Os
líquidos
complexos
e
as
preparações
semi-sólidas
apresentam
comportamento não-newtoniano, que se caracteriza por variações da viscosidade
aparente em função do gradiente de cisalhamento aplicado a amostra. Esses tipos
de fluídos podem ainda ser classificados quanto ao tipo de escoamento em
plásticos, pseudoplásticos ou dilatantes (ALMEIDA; BAHIA, 2003).
90
Para as formulações dermocosméticas, o fluxo pseudoplástico é o mais
comum. Esses materiais têm sua viscosidade aparente diminuida gradualmente, à
medida que aumenta a tensão de cisalhamento podendo ou não se reestruturar
rapidamente. Se a recuperação é imediata, as curvas ascendentes e descendentes
do reograma são sobrepostas e a deformação é chamada tempo-independente, mas
se a estrutura não se recupera imediatamente e a curva ascendente indicar maior
viscosidade que a descendente, o material é chamado tixotrópico, quando ocorre o
contrário, o material é dito reopético (ALMEIDA; BAHIA, 2003; LONGO, 2006).
É interessante para as formulações de uso tópico possuir caráter tixotrópico, o
que as torna mais fluídas facilitando assim o espalhamento, mas o valor de tixotropia
não pode ser muito elevado para que o produto não escorra sobre a pele após
aplicação, possuindo uma recuperação muito lenta da sua estrutura e também não
pode ser um valor muito baixo, o que acarretaria em baixa espalhabilidade do
produto não permitindo uma distribuição uniforme sobre a pele (CORRÊA et al.,
2005).
O comportamento reológico dos cremes com e sem ácido caurenóico e
promotores de absorção antes e após estudo de estabilidade acelerado são
apresentados na figura 24.
91
t
0 (TA)
L
t
90d
t
0
(40°C)
(TA)
t
90d
(40°C)
LA
LAO
LAA
LAU
LAUA
LAML
Figura 24 – Curvas de fluxo das formulações contendo ácido caurenóico com ou sem promotores de absorção antes e após estudo acelerado de
estabilidade.
92
Os cremes L, LA, LAUA, LAML, submetidos a estudo de estabilidade em
temperatura ambiente, apresentaram uma redução na viscosidade no decorrer dos
60 dias, retornando praticamente ao valor de viscosidade inicial ao final dos 90 dias,
com exceção da formulação LA que apresentou um valor de viscosidade menor do
que o apresentado no tempo zero. O creme LAO sofreu redução na viscosidade no
tempo 30 dias e aumento progressivo a partir dos 60 dias retornando ao valor inicial
ao final dos 90 dias. O creme LAA sofreu redução na viscosidade no tempo 30 dias
e aumento progressivo a partir dos 60 dias e ao final dos 90 dias apresentou um
valor de viscosidade menor do que o apresentado no tempo zero. O creme LAU
apresentou aumento na viscosidade no tempo com 30 dias, redução no tempo 60
dias e aumento no tempo 90 dias maior que o valor de viscosidade no tempo zero.
O comportamento viscosimétrico das formulações apresenta relação inversa
com o comportamento de espalhabilidade ao longo do estudo de estabilidade. Foi
observada redução da viscosidade média com posterior aumento da viscosidade,
enquanto a espalhabilidade foi aumentada e posteriormente reduzida, o que
confirma a relação existente entre os dois parâmetros analisados em preparações
semi-sólidas.
Os resultados de tixotropia apresentados no quadro 6 mostram que os
cremes L e LAUA apresentaram redução no valor de tixotropia nos tempos 30 e 60
dias e aumento no tempo 90 dias, mas não retornando ao valor do tempo zero. Os
cremes LA e LAA apresentaram também redução no valor de tixotropia no tempo 30
dias, mas aumento progressivo no tempo 60 e 90 dias, porém não retornando ao
valor inicial. O creme LAO apresentou redução no valor de tixotropia no tempo 30
dias, aumento no tempo 60 dias e redução no tempo 90 dias, contudo não
retornando ao valor inicial. O creme LAU mostrou aumento progressivo no valor de
tixotropia no tempo 30 e 60 dias e redução no tempo 90 dias sem retornar ao valor
inicial do tempo zero e o creme LAML apresentou perfil semelhante ao creme LAU,
porém no tempo 90 dias mostrou aumento do valor de tixotropia acima do valor do
tempo zero.
Analisando os resultados de comportamento viscosimétrico dos cremes
submetidos a estudo de estabilidade em estufa (40 °C) (quadro 7) foi observado que
houve variação em todos os cremes com exceção dos cremes LAO e LAA que
mostraram ser os mais estáveis, mostrando discreta redução no tempo 60 dias e
permanecendo praticamente estáveis até o final do estudo. Os cremes LAU e LAML
93
apresentaram perfis semelhantes, mostrando redução no valor da viscosidade com
60 dias e aumento com 90 dias sem retornar ao valor inicial de 30 dias, porém o
creme LAU mostrou aumento menor do que com 30 dias e o creme LAML, ao
contrário, um discreto aumento em relação ao valor de 30 dias. O creme L
apresentou aumento progressivo de viscosidade até o final dos 90 dias. O creme LA
mostrou redução no valor da viscosidade no tempo 60 dias e aumento no tempo 90
dias superior ao tempo 30 dias. O creme LAUA mostrou redução significativa em sua
espalhabilidade no tempo 60 dias permanecendo praticamente este valor ao final
dos 90 dias.
Analisando os resultados do comportamento reológico das preparações
submetidas a teste de estabilidade em temperatura ambiente, apresentados na
figura 24 e quadro 6, mostram que os cremes L e LAUA apresentaram uma redução
no valor de tixotropia nos tempos 30 e 60 dias e um aumento no tempo 90 dias, mas
não retornando ao valor do tempo zero. Os cremes LA e LAA apresentaram também
uma redução no valor de tixotropia no tempo 30 dias, mas um aumento progressivo
no tempo 60 e 90 dias, porém não retornando ao valor inicial. O creme LAO
apresentou uma redução no valor de tixotropia no tempo 30 dias, um aumento no
tempo 60 dias e uma redução no tempo 90 dias, contudo não retornando ao valor
inicial. O creme LAU mostrou um aumento progressivo no valor de tixotropia no
tempo 30 e 60 dias e uma redução no tempo 90 dias sem retornar ao valor inicial do
tempo zero e o creme LAML apresentou um perfil semelhante ao creme LAU, porém
no tempo 90 dias mostrou um aumento do valor de tixotropia acima do valor do
tempo zero.
As preparações submetidas a teste de estabilidade em ambiente de estufa
(40 °C), figura 24 e quadro 7, apresentaram perfi semel hantes de tixotropia. Os
cremes L, LA, LAU, LAUA e LAML mostraram uma redução do valor da tixotropia no
tempo 60 dias e um aumento no tempo 90 dias sem retornar ao valor incial do tempo
30 dias. Os cremes LAO e LAA mostraram ter um perfil semelhante entre si,
apresentando um aumento progressivo da tixotropia até o tempo 90 dias,
permanecendo um valor superior ao valor inicial do tempo 30 dias.
As figuras 25 a 29 apresentam o perfil cromatográfico qualitativo por CLAE
dos cremes contendo AC e promotores de absorção, antes (tempo zero) e após
(tempo
90
dias)
oestudo
de
estabilidade
acelerado.
Embora
os
perfis
cromatográficos dos cremes com a incorporação de diferentes promotores sejam
94
diferentes em todos eles foi observado no tempo zero e no tempo 90 dias a
presença do pico correspondente ao AC, indicando a estabilidade do fitofármaco.
A quantidade de AC nos cremes foi quantificada por CLAE no tempo zero e
no tempo 90 dias (Tabela 2). Foi observado redução da quantidade de ácido
caurenóico, porém esta redução foi variável nas diferentes formulações. A diferença
de quantidade de AC antes e após estudo de estabilidade e nas formulações
estudadas pode estar relacionada com a dificuldade de extração do ácido do creme,
sendo necessária uma validação da extração do AC, pois no presente trabalho a
extração foi realizada usando diferentes métodos, não se obtendo recuperação
adequada para um método analítico devido a variabilidade nas diferentes
concentrações analisadas.
Tabela 2 – Teor de ácido caurenóico por grama de creme antes e após estudo de
estabilidade acelerado, por CLAE.
Formulações
Ácido caurenóico (µg/g de creme)
∆C/Ct0
t0
t90
LAO
131,98
117,72
0,108
LAA
79,64
58,35
0,267
LAU
52,32
35,12
0,329
LAAU
172,55
112,53
0,348
LAML
210,23
91,72
0,564
mAU
95
minutos
mAU
A
minutos
B
Figura 25 - Perfil qualitativo dos cremes contendo AC e oleato de decila antes e após
estudo de estabilidade acelerado na temperatura de 40 °C. A – tempo zero; B – tempo 90
dias.
mAU
96
minutos
mAU
A
minutos
B
Figura 26- Perfil qualitativo dos cremes contendo AC e alfa-bisabolol, antes e após estudo
de estabilidade acelerado na temperatura de 40 °C. A – tempo zero; B – tempo 90 dias.
mAU
97
minutos
mAU
A
minutos
B
Figura 27 - Perfil qualitativo dos cremes contendo AC e uréia antes e após estudo de
estabilidade acelerado na temperatura de 40 °C. A – tempo zero; B – tempo 90 dias.
mAU
98
minutos
mAU
A
minutos
B
Figura 28 - Perfil qualitativo dos cremes contendo AC e alfa-bisabolol e uréia antes e após
estudo de estabilidade acelerado na temperatura de 40 °C. A – tempo zero; B – tempo 90
dias.
mAU
99
minutos
mAU
A
minutos
B
Figura 29 - Perfil qualitativo dos cremes contendo AC e miristato de isopropila e lecitina,
antes e após estudo de estabilidade acelerado na temperatura de 40 °C. A – tempo zero; B
– tempo 90 dias.
100
5.4 Estudo de permeação in vitro
Os estudos de permeação in vitro são importantes para a triagem de
formulações propostas no desenvolvimento de medicamentos para uso tópico, seja
para efeito local ou sistêmico. Estes estudos envolvem o uso de células de difusão
projetadas para examinar o fluxo no estado estacionário e a partição do princípio
ativo para a solução receptora em condição sink. O penetrante, princípio ativo, deve
particionar através de uma membrana (El- KATTAN at al., 2001; BARRY, 2005;
AMNUAIKIT et al., 2005). Uma vez que a pele humana e de animais é variável e de
difícil obtenção, membranas artificiais como acetato de celulose e borracha de
silicone têm sido empregadas (LIRA at al., 2004; BARRY, 2005; LONGO, 2006). A
membrana de acetato de celulose é considerada uma membrana não limitante,
portanto não controla o transporte de compostos através dela (LOPES, 2005). No
presente trabalho esta foi empregada, pois o objetivo do estudo de permeação foi
verificar a cedência do AC de cremes preparados com diferentes bases, aniônica e
não-iônica (Lanette® e Polawax®, respectivamente) e diferentes promotores de
absorção e não a permeação do AC através da pele, dado este explorado no estudo
de atividade antiinflamatória in vivo. A solução tampão com pH 11 foi escolhida como
solução receptora devido a solubilidade do AC ser maior em pH alcalino.
A figura 30 apresenta o perfil de permeação in vitro do AC incorporado em
cremes não-iônicos com diferentes promotores de absorção. De acordo com os
resultados a quantidade de AC liberado em 12 horas de análise variou de 0,8 a 1,4
µg/cm2 nas formulações contendo diferentes promotores. O creme contendo uréia
apresentou maior quantidade de princípio ativo liberado enquanto o creme contendo
oleato de isodecila apresentou a menor quantidade de AC liberado.
Observando o perfil de liberação, foi observado variações anômalas na
quantidade de AC permeado com o tempo. Praticamente todos as formulações
apresentam redução da permeação do AC após 12 horas de liberação. Cremes
contendo miristato de isopropila e oleato de isodecila apresentaram perfil mais
regular, ou seja, com a liberação crescente de AC ao longo do estudo.
101
2
Ácido Caurenóico (µ
µg/cm )
5
LAU
LAAU
LAO
LAML
LAA
4
3
2
1
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Tempo (horas)
Figura 30 – Perfil de permeação in vitro de AC de formulações semi-sólidas com
base Polawax® contendo diferentes promotores de permeação.
Os perfis de permeação do AC incorporado nas formulações com base
Lanette são apresentados na figura 31. A quantidade de AC que sofreu permeação
ao final de 12 horas de permeação variou de 0,5 a pouco mais do que 1 µg/cm2.
Embora a quantidade de ácido permeada das formulações com base aniônica tenha
sido menor do que a observado com as formulações com base não-iônica
(Polawax®), estas apresentaram perfil de permeação mais regular. As formulações
contendo uréia como promotor de permeação apresentaram maior permeação do
AC, seguido pela formulação contendo miristato, porém esta influência pode não
estar relacionada diretamente, em princípio, aos promotores devido a membrana
usada como barreira.
Como observado com as formulações com base não-iônica, o creme
contendo miristato como promotor apresentou perfil de liberação mais regular e
crescente com o tempo de análise.
102
2
Ácido Caurenóico (µ
µg/cm )
5
LAU
LAUA
LAO
LAML
LAA
4
3
2
1
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Tempo (horas)
Figura 31 – Perfil de permeação in vitro de AC de formulações semi-sólidas com
base Lanette® contendo diferentes promotores de permeação.
5.5 Avaliação da atividade antiinflamatória in vivo
Através de testes in vivo utilizando o organismo animal como um todo, é
possível observar a influência de outros parâmetros na absorção de fármacos, tais
como o metabolismo cutâneo e a presença da circulação sanguínea, que
influenciam muito o transporte de fármacos, principalmente os lipofílicos, até a
derme (MOSER et al., 2001). Estes ensaios reforçam os resultados obtidos através
de metodologias in vitro.
103
Espessura da orelha (mm)
250
200
150
**
**
100
**
**
**
**
**
**
50
LA
U
A
L
LA
M
LA
U
LA
O
LA
A
LA
on
a
as
am
et
D
ex
Ac
he
f
la
n
L
0
Formulações
Figura 32 – Atividade antiinflamatória dos cremes de AC pelo método de edema de orelha. L – controle
®
negativo (creme sem AC); Acheflan – controle positivo (creme contendo 0,5% de óleo essencial de Cordia
verbenacea); Dexa – controle positivo (creme contendo 0,5% de dexametasona); LA – creme contendo 0,1%
de AC; LAML – creme contendo 0,1% de AC mais miristato de isopropila e lecitina de soja como promotores;
LAUA - contendo 0,1% de AC mais uréia e alfa-bisabolol como promotores; LAA - contendo 0,1% de AC mais
alfa-bisabolol como promotor; LAO - contendo 0,1% de AC mais oleato de isodecila como promotor; LAU contendo 0,1% de AC mais uréia como promotor. ** - diferença significativa do controle negativo com p <
0,01.
104
Tabela 3: Porcentagem de inibição da atividade antiinflamatória dos cremes de AC pelo
método de edema de orelha.
Creme
Inibição(%)
Desvio padrão
0,0
121,62
Acheflan®
54,89
13,78
Dexa
64,45
13,41
LA
61,73
23,23
LAML
71,71
15,77
LAUA
60,28
13,35
LAA
40,90
16,35
LAO
59,69
6,31
LAU
44,28
18,92
L
®
Legenda: L – controle negativo (creme sem AC); Acheflan – controle positivo (creme
contendo 0,5% de óleo essencial de Cordia verbenacea); Dexa – controle positivo (creme
contendo 0,5% de dexametasona); LA – creme contendo 0,1% de AC; LAML – creme
contendo 0,1% de AC mais miristato de isopropila e lecitina de soja como promotores; LAUA
- contendo 0,1% de AC mais uréia e alfa-bisabolol como promotores; LAA - contendo 0,1%
de AC mais alfa-bisabolol como promotor; LAO - contendo 0,1% de AC mais oleato de
isodecila como promotor; LAU - contendo 0,1% de AC mais uréia como promotor.
Através dos resultados obtidos no teste de edema de orelha induzido por óleo
de cróton, foi constatada a atividade antiinflamatória do AC quando comparados com
os controles positivos (creme com dexametasona 0,5% e Acheflan®). Ao comparar
os resultados do creme com AC (100 µg/g) e com o creme com dexametasona 0,5%
não foi observada diferença significativa (p>0,05 e q>2,696) entre eles e quando
comparados os cremes com os diferentes promotores de absorção (oleato de
isodecila, miristato de isopropila+lecitina de soja, uréia+alfa bisabolol) não se
observou também diferença significativa em relação ao creme com dexametasona
0,5% (p>0,05) com exceção dos cremes com os promotores de absorção uréia e alfa
bisabolol,
pois
ambos
apresentaram
menor
efeito
antiinflamatório
quando
comparados com a dexametasona 0,5% (p<0,01). Quando comparados os cremes
com AC (100 µg/g) sem promotores e com promotores (oleato de isodecila, miristato
de isopropila+lecitina de soja, uréia+alfa bisabolol) percebeu-se que não houve
diferença significativa entre eles (p>0,05 e q>2,656) com exceção dos cremes com
os promotores uréia (p<0,05) e alfa bisabolol (p<0,01) que apresentaram menor
absorção do AC. Quando os cremes com AC (100 µg/g) sem promotores e com
promotores foram comparados com o controle positivo Acheflan®, observou-se
105
diferença significativa apenas na presença dos promotores de absorção miristato de
isopropila+lecitina de soja (p<0,05 e q> 2,696), onde os mesmos apresentaram
maior efeito antiinflamatório.
Após ter sido analisado os resultados acima pode-se observar que os cremes
com AC (100 µg/g) com os promotores uréia e alfa bisabolol não demonstraram
potencializar o efeito do AC, apresentando uma menor absorção do mesmo, quando
comparado ao creme sem promotor, mas quando os dois promotores (uréia+ alfa
bisabolol) são associados percebeu-se um aumento na permeação.
Em estudo anterior (CZEPULA, 2006), foi demonstrada a atividade
antiinflamatória do extrato de S. trilobata em preparações semi-sólidas (cremes),
usando o edema de orelha em camundongo, induzido com óleo de cróton, como
modelo farmacológico. O extrato de S. trilobata foi incorporado em diferentes
concentrações nas preparações semi-sólidas e comparado com creme de
dexametasona 0,1%, como controle positivo. A atividade antiinflamatória do creme
com a menor concentração de extrato comparado ao creme controle-negativo, não
foi significativo. Entretanto, comparando-se o creme contendo maior concentração
de extrato com o controle positivo, obteve-se 59,84% e 63,76% respectivamente de
percentual de inibição do edema, constatando-se que o extrato de S. trilobata possui
atividade anti-endematogênica de forma significativa e dose dependente e
possivelmente um dos principais componentes responsáveis pelo efeito é o AC.
Para avaliação dos efeitos antiinflamatórios do Acheflan® (Cordia verbenacea)
foram preparados diferentes extratos a partir das folhas da Cordia verbenacea para
serem avaliados em modelos farmacológicos in vitro e in vivo. Para avaliação do
edema de orelha em camundongos, os extratos etanólico a quente e metanólico,
aplicados topicamente na forma de creme na orelha de camundongo, apresentaram
marcada atividade antiinflamatória quando avaliados nos modelos inflamatórios
causados pela aplicação de ácido araquidônico, óleo de cróton ou capsaicina. Em
termos de eficácia, os extratos da Cordia verbenacea, produziram efeitos
antiinflamatórios semelhantes aos causados pela dexametasona. As ações
antiinflamatórias tópicas foram observadas tanto quando aplicadas previamente
como também após o estabelecimento do processo inflamatório (ACHE, 2005 b).
Em um estudo onde se avaliou a atividade antidermatogênica tópica das
frações etanólicas e diclorometano da espécie Leonurus sibiricus, usando o óleo de
cróton, como agente irritante, dexametasona 1%, como controle positivo, extrato
106
bruto diclorometano (0,2 - 2,0 mg/kg orelha), extrato bruto etanólico (0,2 mg/kg
orelha), houve inibição do edema com as três doses utilizadas, mas o efeito máximo
semelhante ao da dexametasona foi atingido com extrato bruto diclorometano nas
duas doses (0,2 - 2,0 mg/kg orelha), confirmando que tal atividade deve-se a
presença de compostos com perfil lipofílico (SILVA, 2006).
5.6 Avaliação da irritação cutânea
O teste de irritação cutânea em gel de agarose foi utilizado para verificar o
potencial de irritação em emulsões e géis (BRASIL, 2003).
As amostras de cremes com ácido caurenóico com e sem promotores foram
incorporadas em discos de papel e aplicadas em placas sobre uma superfície de gel
de agarose em contato com as células L929, a citotoxicidade foi avaliada pela zona
de lise (ausência do corante vital). Como controle negativo foi usada solução salina e
como controle positivo uma solução aquosa de DSS a 1%. O halo de irritação foi
medido com o paquímetro e confirmado através de avaliação microscópica. Os
resultados obtidos no trabalho estão demonstrados na tabela 4.
Tabela 4: Resultados obtidos no teste de irritação cutânea nos
cremes contendo AC através do método de agarose overlay.
Amostras
Formação do halo
Controle Positivo¹
Presença
Controle Negativo²
Ausência
L
Ausência
LA
Ausência
LAO
Ausência
LAA
Ausência
LAU
Ausência
LAUA
Ausência
¹ Solução de DSS 1%
² Solução salina
Todas as amostras testadas apresentaram ausência de halo de irritação
(Figura 33), ou seja, as preparações semi-sólidas com e sem AC e na presença dos
diferentes tipos de promotores de absorção não apresentaram nenhum grau de
107
irritação cutânea quando comparado ao controle positivo que apresentou um halo de
1,341 cm ± 0,06 (Figura 33) sendo classificado como 4 ou reatividade severa,
conforme demonstrado na tabela 4.
LA
DSS
Figura 33- Placa de gel de agarose com creme contendo AC (LA) e controle positivo (DSS).
A figura 33 mostra poços à esquerda contendo creme com AC representando
todas as demais formulações as quais não apresentaram halo de inibição (irritação
cutânea ou de conjuntiva) e ao lado direito, poços contendo (DSS 1%) como controle
positivo e apresentando halo de inibição.
A figura 34 mostra a presença de células viáveis (coradas com vermelho
neutro - corante vital) em creme com AC e sem AC, respectivamente demonstrando
a presença de células viáveis, comprovando que os cremes não possuem irritação
cutânea. A figura 35 mostra a ausência de células viáveis (ausência de corante
vermelho neutro) nas amostras contendo o controle positvo (DSS) demonstrando o
potencial citotóxico do DSS, e sua irritação severa.
108
A
B
Figura 34- Creme com (A) e sem AC (B), sem contraste de fases (400X).
Figura 35- Controle positivo sem contraste de fases (400X).
109
6 CONCLUSÕES
- O AC foi isolado do caule e raiz da planta S. trilobata com rendimento de 0,14%.
Os resultados obtidos nos ensaios de identificação mostraram que a substância
possui alto teor de pureza e estão de acordo com os dados descritos na literatura.
- O AC é insolúvel em água, possui solubilidade pH dependente, apresentado maior
solubilidade em pH 10. Em propilenoglicol, a substância pode ser considerada
levemente solúvel.
- O coeficiente de partição do AC no sistema tampão/octanol é de 95,99 ± 2,265%
para a fase oleosa.
- Todas as formulações desenvolvidas com bases aniônica e não-iônica (Lanette® e
Polawax®, respectivamente) com os diferentes promotores de absorção (uréia, alfabisabolol, oleato de isodecila, miristato de isopropila+lecitina de soja) apresentaramse estáveis fisicamente nos testes prévios de estabilidade. As formulações contendo
AC apresentaram conformes quanto às características físicas, porém.foi verificada a
redução do teor de AC ao final de 90 dias do teste de estabilidade acelerado.
- No teste de permeação in vitro usando célula de Franz adaptada e membrana de
acetato de celulose, o AC liberado nas 12 horas do experimento foi de 0,8 a 1,4
µg/cm2 nas formulações não iônicas contendo diferentes promotores. O creme
contendo uréia apresentou maior quantidade de princípio ativo liberado e o creme
com oleato de isodecila apresentou a menor quantidade de AC liberado. A
permeação do AC nos cremes aniônicos ao final de 12 horas variou de 0,5 a pouco
mais do que 1 µg/cm2.
- Os resultados da avaliação farmacológica obtidos nas formulações desenvolvidas
com base aniônica (Lanette®) no teste de edema de orelha induzido por óleo de
cróton, demonstraram que o AC possui atividade antiinflamatória semelhante à
apresentada pelo creme com 0,5% de dexametasona. Os promotores que
apresentaram melhor permeação do AC foi o miristato de isopropila+lecitina de soja,
obtendo-se 71,71% de inibição do edema e o creme com 0,5% de dexametasona
apresentou 64,45% de inibição do edema, não havendo diferença significativa entre
eles (p>0,05 e q>2,696), os promotores de absorção uréia e alfa bisabolol ambos
apresentaram menor permeação do AC diminuindo seu efeito antiinflamatório (44,28
e 40,9%). Em relação ao Acheflan®, que apresentou 54,89% de inibição de edema,
110
os cremes com AC apresentaram uma maior porcentagem de inibição do edema
(61,73%) e na presença dos promotores de absorção todos apresentaram inibição
de edema superior ao valor obtido pelo Acheflan® com exceção dos promotores alfabisabolol e uréia que apresentaram 40,9 e 44,28% de inibição do edema,
respectivamente.
- Todas as preparações semi-sólidas não apresentaram potencial de irritação
cutânea quando avaliadas pelo método de agarose overlay.
Podemos concluir com este trabalho que devido à facilidade de obtenção do
AC de diversas plantas, ele é um fitofármaco promissor como antiinflamatório de uso
tópico possuindo atividade antiinflamatória em pequenas dosagens (100 µg/g)
comparado com o creme de dexametasona (0,5%) e quando comparado ao
Acheflan®, fitoterápico obtido do óleo essencial da Cordia verbenacea (0,5%)
mostrou-se mais eficiente na presença de miristato de isopropila+lecitina de soja
como promotores de absorção.
Sugere-se a continuidade dos estudos de validação da metodologia para
extração e quantificação do ácido caurenóico incorporado nos cremes, assim como
estudos in vitro e in vivo para melhor entendimento da ação adjuvante dos diferentes
promotores na penetração do ácido caurenóico através da pele.
111
REFERÊNCIAS
ACHE. Fitomedicamentos têm notável expansão mercadológica. Jornal Phytociência, ano
1. n. 1. 2005 a. Disponível em:
<www.ache.com.br/arquivo/institucional/phytomedica_jornal/numero1.pdf>. Acesso em:
05/03/06.
ACHE. Acheflan creme® . Cordia verbenacea D. C. 5 mg alfa-humuleno. (Monografia). São
Paulo (São Paulo), 2005 b.
AGYRALIDES, G. G.; DALLAS, P. P.; REKKAS, D. M. Development and in vitro evaluation
of furosemide transdermal formulations using experimental design techniques. International
Journal of Pharmaceutics, v. 281, p. 35-43, 2004.
ALLEN Jr., L. V. The art, science and technology of pharmaceutical compounding. 2.
ed. Washington: American Pharmaceutical Association, 2002.
ALLEN Jr., L.V.; POPOVICK, N. G.; ANSEL, H. C. Formas farmacêuticas e sistemas de
liberação de fármacos. 8. ed. São Paulo: Artmed, 2007.
ALMEIDA, I. F.; BAHIA, M. F. Reologia: interesse e aplicações na área cosméticofarmacêutica. Cosmetics & Toiletries, v. 15, p. 96-100, 2003.
ALVES, F. N. Desafio para inovação em fitomedicamentos no contexto da indústria
farmacêutica nacioanal. Revista Fitos, v. 1, p. 18-28, 2005.
AMARANTE Jr., O.P. de; CALDAS, E. P. A.; BRITO, N. M.; SANTOS, T. C. R. dos; VALE,
M. L. B. F. Validação de métodos analíticos: uma breve revisão. Caderno de Pesquisa, v.
12, n. 1, p. 116-131, 2001.
AMNUAIKIT, C.; IKEUCHI,I.; OGAWARA, K.; HIGAKIA, K.; KIMURA, T. Skin permeation of
propranolol from polymeric film containing terpene enhancers for transdermal use.
International Journal of Pharmaceutics, v. 289, p. 167–178, 2005.
AULTON, M. Dissolução e solubilidade. In: AULTON, M. E. (Org.). Delineamento de formas
farmacêuticas. Porto Alegre: Artmed, 2005. p. 31-47.
BARRY, B. Liberação transdérmica de fármacos. In: AULTON, M. E. (Org.). Delineamento
de formas farmacêuticas. Porto Alegre: Artmed, 2005. p. 505-536.
BEAR, M. F.; CONNORS, B. W.; PARADISO, M. A. Neurociências: desvendando o sistema
nervoso. 2. ed. Porto Alegre: Artmed, 2002.
BLOCK, L. C.; SANTOS, A. R. S.; SOUZA, M. M.; SCHEIDT, C.; YUNES, R. A.; SANTOS,
M. A.; DELLE MANACHE, F.; CECHINEL FILHO, V. Chemical and pharmacological
examination of antinociceptive constituints of Wedelia paludosa. Journal of
Ethnopharmacology, v. 61, p. 85-89, 1998.
BOECK, P.; SÁ, M. M.; SOUZA, B. S.; CERCENÁ, R.; ESCALANTE, A. M.; ZACHINO, S. A.;
CECHINEL FILHO, V.; YUNES, R. A. A simple synthesis of kaurenoic esters and other
derivatives and evaluation of their antifungal activity. Journal Brazillian Chemical Society,
v. 16, n. 6B, p. 1360-1366, 2005.
112
BORGHETTI, G. S.; KNORST, M. T. Desenvolvimento e avaliação da estabilidade física de
loções O/A contendo filtros solares. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v.42,
n. 4, 2006.
BORTOLON, F. F., Permeação cutânea in vitro do piroxicam a partir de formulações
tópicas, 2006. Monografia de Conclusão de Curso (Graduação) – Curso de Farmácia,
Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí, 2006, p. 67.
BRASIL. ANVISA. Guia de Estabilidade de Produtos Cosméticos. Brasília. DF, 2004.
Disponível em: <www.anvisa.gov.br/divulga/noticias/2004/100504.htm>. Acesso em: 25 de
fev. de 2006.
BRASIL. ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. MS. Resolução n◦ 899 de 29 de
maio de 2003. Guia Para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos. Disponível
em <e-legis.bevs.br/leisref/public/showAct.php?id=15132&Word> Acesso em 10 de outubro
de 2006.
BRASIL. Projeto de Lei n° 752, de 2003, Altera a Le i n° 9.313, de 13 de novembro de 1996,
outorgando prioridades às indústrias que produzem fármacos de medicamentos utilizados
no cuidado aos doentes de AIDS e portadores de HIV. Disponível em:
< http://www.camara.gov.br/sileg/integras/218259.pdf > Acesso em 19 de agosto de 2007.
BRESCIANI, L. F. V.; YUNES, R. A.; BÜRGUER, C.; DE OLIVEIRA, L. E.; BOF, K. L.;
CECHINEL FILHO, V. Seasonal variation of kaurenoic acid, a hypoglycemic diterpene
present in Wedelia paludosa (Acmela brasiliensis) (Asteraceae). Z. Naturforsch, v. 59, p.
229-232, 2004.
BITTRICH, V; AMARAL, M. C. E. Sphagneticola trilobata. Disponível em:
http://www.ib.unicamp.br/plant-aq-SP/img/plantas/Spagneticola_trilobata.html. Acesso em:
28 de agosto de 2007.
BRONAUGH, R. L.; YOURICK, J. J. Role of skin absorption in cosmetic development.
Cosmetics & Toiletries, v. 115, n. 3, p. 47-52, 2000.
CAMPOS, M. S. M. P., Influência do ultra-som na permeação cutânea da cafeína:
Estudo em fragmentos de pele e em adipócitos isolados de suínos. 2004. Tese
(Doutorado) - Instituto de Biologia. Universidade Estadual de Campinas, 2004.
CALIXTO, J.B.; ZANINI, J. C.; CRUZ, A. B.; YUNES, R.A.; MEDEIROS, Y.S.; Extract and
compounds obtained from Mandevilla velutina inhibit arachidonic acid induced ear oedema in
mice, but not rat stomach contraction. Prostaglandins, n.41, p. 515-526, 1991.
CAVALCANTI, B. C.; COSTA-LOTUFO, L. V.; MORAES, M. O.; BURBANO, R. R.;
SILVEIRA, E. R.; CUNHA, K. M. A.; RAO, V. S. N.; MOURA, D. J.; ROSA, R. M.;
HENRIQUES, J. A. P.; PESSOA, C. Genotoxicity evalution of kaurenoic acid, a bioactive
diterpenoid present in Copaiba oil. Food and Chemical Toxicology, v. 44, p. 388-392,
2006.
CECHINEL FILHO, V.; YUNES, R. A. Estratégias para obtenção de compostos
farmacologicamente ativos a partir de plantas medicinais. Conceitos sobre modificação
estrutural para otimização da atividade. Química Nova, v. 21, p. 99-105, 1998.
CORNÉLIO, R. B., Desenvolvimento e otimização de um sistema transdérmico para a
administração de um antiinflamatório não esteróide, o flurbiprofeno. 2003. Dissertação
(Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2003.
113
CORRÊA, M. C.; CAMARGO JÚNIOR, F. B.; IGNÁCIO, R. F.; LEONARDI, G. R.; Avaliação
do comportamento reológico de diferentes géis hidrofílicos, Revista Brasileira de Ciências
Farmacêuticas,v. 41, n.1, p. 73-78, 2005.
CORRÊA, M. P. Dicionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas. Rio de
Janeiro: Imprensa Nacional, 1984. v. 5, p. 137.
CHORILLI, M.; RIBEIRO, M.C.A.P., PIRES-DE-CAMPOS, M.S.M., LEONARDI, G.R.,
POLACOW, M.L.O. Efeito de emulsão contendo extrato seco de guaraná sobre os vasos
sanguíneos da derme papilar de ratos. Saúde Rev., v. 6, n.14, p.7-12, 2004.
CZEPULA, A. I. S. Desenvolvimento de preparações semi-sólidas contendo extrato de
Spagneticola trilobata (L.) Pruski (Acmela brasiliensis, Wedelia paludosa)
(ASTERACEAE) e avaliação da atividade antiinflamatória tópica in vivo. 2006. 121 f.
Dissertação (Mestrado) - Centro de Ciências da Saúde, Universidade do Vale do Itajaí,
Itajaí, 2006.
DE ALENCAR CUNHA, K. M.; PAIVA, L. A.; SANTOS, F. A.; GRAMASA, N. V.; SILVEIRA,
E. R.; RAO, V. S. Smooth muscle relaxant effect of kaurenoic acid, a diterpene from
copaífera langs dorffii on the rat uterus in vitro. Phytother., v. 17, p. 320-324, 2003.
DE MELO, A. C; COTA, B. B; OLIVEIRA, A. B.; FRAGA, F. C. HPLC quantitation of kaurane
diterpenes in xylopia species. Fitoterapia, v. 72, n.1, p. 40-45, 2001.
DUNCAN, J.I.; PAYNE, S.N.; WINFIELD, A. J.; ORMEROD, A. D.; THOMSON, A. W.
Enhanced percutaneous absorption of a novel topical cyclosporine a formulation and
assessment of its imunosupressive activity. Br. J. Dermatol., v. 123, p. 631-640, 1990.
DUPUIS, D.; ROUGIER, A.; ROGUET, R.; LOTTE, C. The measurement of the SC reservoir:
A simple method to predict the influence of vehicles on in vivo percutaneous absorption. Br.
J. Dermatol., v. 115, p. 133-138, 1986.
DUTRA, D.; SOARES, M. R. S.; PASCUA, C. O.; BURGER, C.; CECHINEL FILHO, V.
Avaliação do efeito anti-hiperglicemiante das frações semi-purificadas de duas plantas
medicinais da flora catarinense: Marrubium vulgare e Wedelia paludosa. Disponível em:
<http://www.sbq.org.br/ranteriores/23/resumos/0985/index.html>. Acesso em: 19 de
setembro de 2005.
EL-KATTAN, A. F.; ASBILL, C. S.; KIM, N.; MICHNIAK, B.B. The effects of terpene
enhancers on the percutaneus permeation of drugs with different lipophilicities. International
Journal of Pharmaceutics, v. 289, p. 167–178, 2001.
ESCRIBANO, E.; CALPENA, A. C.; QUERALT, J.; OBACH, R.; DOMÉNECH, J. Assessment
of diclofenac permeation with different formulations: anti-inflamatory study of a selected
formula. European Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 19, p. 203-210, 2003.
FONT, A. F.; FERNÁNDEZ, C. B.; MERINO, V.; RODILLA, V.; CASTELLANO, A. L. Effect of
chemical enhancers on the in vitro percutaneous absorption of sumatriptan succinate.
European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 61, p. 50-55, 2005.
GRAFOURIAN, T.; ZANDASRAR, P.; HAMISHEKAR, H.; NOKHODCHI, A. The effect of
penetration enhancers on drug delivery through skin: a QSAR study. Journal of Controlled
Release, v. 99, p. 113-125, 2004.
114
HARDING, C. R., The stratum corneum: structure and function in health and disease.
Dermatol. Ther., v. 17, p. 6-15, 2004.
HENRIQUES, A. T.; PIRES-SIMÕES, C. A.; APEL, M. A. Óleos essenciais: Importância e
perspectivas terapêuticas. In: YUNES, R. A.; CECHINEL FILHO, V. (Org.) Química de
produtos naturais, novos fármacos e a moderna farmacognosia. Itajaí: Univali, 2007, p.
228-229.
INVITOX. Agarose Overlay Assay. Protocol 31, 1991.
JUNQUEIRA, L.C.; CARNEIRO, J., Histologia Básica. 10. ed. Rio de Janeiro:Guanabara
Koogan, 2004. p. 359-366.
KALIA, Y.N., NAIK, A., GARRISON, J., GUY, R. H., Iontophoretic drug delivery. Adv. Drug.
Deliv. Rev., v. 56, p. 619-658, 2004.
KAKUBARY, I; NAKAMURA, N.; TAKAYASU, T.; YAMAUCHI, H.; TAKAYAMA, S.;
TAKAYAMA, T., Effects of solvents on skin permeation of formoterol fumarate, Bio. Pharm.
Bull, v. 20, n. 1, p. 146-149, 2006.
KOST. J.; LEVY, D.; LANGER, R., Ultrasound as a transdermal enhancer. In: BROUNAGH,
H.I., MAIBACH, E. D., Percutaneous Absorption; Mechanism- Methodology- Drug
Delivery, 2sd ed. New York: Marcel Dekker, 1989.
LIRA, A. A. M.; SESTER, E. A.; ABREU, L. R.; SILVA, L. B. L.; WANDERLEY, A. G.;
SANTANA, D. P., Desenvolvimento preliminar de gel de lapachol: estudo de permeação in
vitro. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 40, p. 35- 41, 2004.
LONGO, D. P., Obtenção caracterização e estudos de liberação in vitro e permeação in
vivo de sistemas microestruturados contendo cafeína. 2006. 140 f. Dissertação
(Mestrado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista “Júlio
de Mesquita Filho”, Araraquara, 2006.
LOPES, P. S.; KANEKO, T. M., Membranas no estudo de permeação cutânea. Cosmetics
& Toiletries, v. 12, p.62-67, 2000.
LOPES, L. B., Estratégias para o aumento da penetração cutânea de fármacos
peptídicos: avaliação in vitro e in vivo de sistemas de liberação e moléculas
carreadoras. 2005. 198 f. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo Faculdade de
Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Ribeirão Preto, 2005.
LUCINDA, R. M.; EVANGELISTA, R. C. Sistemas transdérmicos para veiculação de
fármacos. Infarma, v. 10, n. 1/6, p. 54-56, 1999.
MAIA, A. M. Desenvolvimento e avaliação da estabilidade de formulações cosméticas
contendo ácido ascórbico. 2001. Dissertação (Mestrado), Faculdade de Ciências
Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, 2001.
MANCZAK, A.; FLORIANI, A. E.; BLOCK, L.C. Efeito antinociceptivo do extrato
hidroalcoólico obtido da Wedelia paludosa. In: SIMPÓSIO DE PLANTAS MEDICINAIS DO
BRASIL, 14., Florianópolis, 1996. Resumos... Florianópolis, 1996. p. 95.
115
MONTAGNER, D. ; CORRÊA, G. M. Avaliação da estabilidade de cremes com uréia em
diferentes pHs. Revista Brasileira Farmacêutica, v. 85, n. 3, p. 69-72, 2004.
MORAES, G. G., Desenvolvimento e avaliação da estabilidade de emulsões O/A com
cristais líquidos acrescidas de xantina para tratamento da hidrolipodistrofia ginóide (celulite).
2006. 181 f. Dissertação (Mestrado), Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão
Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006.
MORIMOTO, Y.; SUGIBAYASHI, K.; NATSUME, H.; The transdermal drug delivery system
and transcutaneous absorption. Acta Derm Venered Suppl (StocKh), v. 185. p. 15-17,
1994.
MOZER, K.; KRIWET, K; NAIK, A; KALIA, YN; GUY, RH., Passive skin penetration
enhancement and its quantification in vitro. European Journal of Pharmaceutics and
Biopharmaceutics, v.82, p. 103-112, 2001.
NETZ, P. A.; ORTEGA, G. G., Fundamentos de Físico-Química-Uma abordagem
conceitual para as ciências farmacêuticas, São Paulo: Artmed, 2002.
OLIVEIRA, B. H.; SANT’ANA, A. E .G.; BASTOS, D. Z. L. Determination of the diterpenoid,
kaurenoic acid, in Annona glabra by HPLC. Phytochemical Analysis, v.13, p. 368-371,
2002.
OTUKI, M.F.; VIEIRA-LIMA, F.; MALHEIROS, A,; YUNES, R. A.; CALIXTO, J. B. Topical
antiinflammatory effects of the ether extract from Protium kleinii and alpha-amyrin pentacyclic
triterpene. European Journal of Pharmacology, v. 507, p. 253-259, 2005.
PAGE, J. E.; BALZA, F.; NISHIDAT, T. G. H. Biologically active diterpenes from Aspilia
massambicensis, a chimpanzee medicinal plant. Phytochemistry, v.31, n. 10, p. 34373439, 1992.
PETROVICK, P. R.; MARQUES, L. C.; DE PAULA, I. C. New rules for phytopharmaceutical
drug registration in Brazil. Journal of Ethnopharmacology, v. 66, p. 51-55, 1999.
POLESELLO, S. How to present analytical method. Food Chem., v. 58, n. 1, p. 145147,1997.
PRASAD, R.; KOULA, V.; ANANDA,S.; KHAR, R.K., Effect of DC/mDC iontophoresis and
terpenes on transdermal permeation of methotrexate: In vitro study. International Journal
of Pharmaceutics, v. 333, p.70-78, 2006.
PRAUSNITZ, M. R., MITRAGOTRI, S., LANGER, R. Current status and future potential of
transdermal drug delivery. Nature Rev., v. 3, p. 115-124, 2004.
PRISTA, L. N.; BAHIA, M. F.; VILAR, E. Dermofarmácia e cosmética. Porto: Associação
Nacional de Farmácia, 1992.
PROENÇA, K. S.; ROMA, R. M.; OLIVEIRA, R. V. M.; GONÇALVES, M. M.; VILA, M. M. D.
C. Avaliação da estabilidade de cremes empregando diferentes agentes de consistência.
Revista Brasileira Farmacêutica, v. 87, n. 3, p. 74-77, 2006.
PRUNIERAS, M. Manual de cosmetologia dermatológica. 2. ed. São Paulo: Andrey,
1994.
116
REIS, S.; CAVALCANTI, O. A. Sistemas transdérmicos: perspectiva de aplicação dos óleos
essenciais como promotores de absorção de fármacos. CONGRESSO INTERNACIONAL
DE SAÚDE, 1., 2005, Maringá. Anais... Maringá: UEM, 2005. p. 1. 1 CD-ROM.
REZENDE, M. C.; URZUA, A.; BORTOLUZZI, A. J.; VÁSQUE, L. Variation of the
antimicrobial activity of Pseudognaphalium vira vira (ASTERACEAE): isolation and X-ray
structure of ent-3β-hidroxy-16-kauren-19-oic acid. Journal Ethnopharmacology, v. 72, p.
459-464, 2000.
ROBERTS, M. S., Structure-permeability considerations in percutaneous absorption. In
Prediction of Percutaneous Penetration. v. 2, IBC Technical Services, London, p. 210-228,
1991.
SANTOS, D.; BAHIA, M. F. G. Promotores de absorção e penetração. Cosmetics &
Toiletries (edição em português), v.7, n.5, p.42-51, 1995.
SARIGÜLLÜ, Ö. I.; YEŞIM, K. H.; KANTARCI, G.; SÖZER, S.; GÜNERI, T.; ERTAN, G.,
Transdermal delivery of diclofenac sodium through rat skin from various formulations.
AAPS PharmSciTech, p. n. 88, p. 4-7, 2006.
SARTORI, M. R. K.; PRETTO, J. B.; CRUZ, A. B.; BRESCIANI, R. A.; YUNES, R. A.;
SORTINO, M.; ZACCHINO, S. A. Antifungal activity of fractions and two pure compounds of
flowers from Wedelia paludosa (Acmela brasiliensis) (Asteraceae). Pharmazie, v. 58, p. 567569, 2003.
SARVEIYA, V.; RISK, S. BENSON, H. A. E.; Liquid chromatographic assay for common
sunscreen agents: application to in vivo assessment of skin penetration and systemic
absorption in human volunteers. Journal Chromat. B., v. 803, p. 225-231, 2004.
SHOKRI, J.; NOKHODCHI, A.; DASHBOLAGHI, A.; HASSAN-ZADEH, D.; GHAFOURIAN,
T.; JALALI, M.B., The effect of surfactants on the skin penetration of diazepam.
International Journal of Pharmaceutics, v. 228, p.99-107, 2001.
SILVA, R. F. R. Avaliação da atividade antiinflamatória de frações etanólicas e
diclorometano da espécie Leonurus Sibiricus. 2006. Disponível em:
<http://www2.unimep.br/mostraacademica4/trab/trabpdf/384.pdf>. Acesso em: 22 de junho
de 2007.
SILVA, R. Z.; RIOS, E. M.; SILVA, M. Z.; LEAL, L. F.; YUNES, R. A.; MIGUEL, O. G.;
CECHINEL FILHO, V. Investigação fitoquímica e avaliação da atividade antibacteriana da
Mikania lanuginosa DC (Asteraceae). Visão Acadêmica, v. 3, n. 2, p. 54-64, 2002.
SILVERSTEIN, R. M.; BASSLER, G. C.; MORRIL, T. C. Identificação espectrométrica de
compostos orgânicos. 5. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1994.
SINGH, B. N.; SINGH, R. B.; SINGH, J. Effects of ionization and penetration enhancers on
the transdermal delivery of 5-fluoracil through excised human stratum corneum.
International Journal of Pharmaceutics, v. 298, p. 98-107, 2005.
TIRAPELLI, C. R.; AMBROSIO, S. R.; DA COSTA, F. B.; DE OLIVEIRA, A. M. Inhibitory
action of kaurenoic acid from Viguiera robusta (Asteraceae) on phenylephrine-induced rat
carotid contraction. Fitoterapia, v. 73, p. 56-62, 2002.
USP 29, Biological Reactivity tests, in vitro, (87), p. 2525, 2006.
117
VELIKOVA, M.; BANKOVA, V.; TSVETKOVA, I.; KUJUMGIEV, A.; MARUCCI, M. C.
Antibacterial ent-kaurene from Brazilian. Fitoterapia, v. 71, p. 693-696, 2002.
WELLS, J. I. Solubility. In: ________. Pharmaceutical preformulation: the physicochemical
properties of drug substances. New York: John Wiley & Sons, 1988. p. 21-85.
WILKENS, M.; ALARCÓN, C.; URZUA, A.; MENDOZA, L. Characterization of the bactericidal
activity of the natural diterpene kaurenoic acid. Planta Med., v. 68, p. 452-454, 2002.
WILLIAMS, A. C.; BARRY, B. W. Penetration enhancers. Advanced Drug Delivery
Reviews, v. 56, p. 603– 618, 2004.
YAMANE, M.A.; WILLIAMS, A.C.; BARRY, B.W.; Effects of terpenes and oleic acid as skin
penetration enhancers towards 5-fluorouracil as assessed with time; permeation, partitioning
and differential scanning calorimetry. International Journal of Pharmaceutics, v.116,
p.237-251, 1995.
YAMASHITA, F.; HASHIDA, M. Mechanistic and empirical modeling of skin permeation of
drugs. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 55, p. 1185-1199, 2003.
YATSUDA, R.; ROSALEN, P. L.; CURY, J. A.; MURATA, R. M.; REHDER, V. L.; MELO, L.
V.; KOO, H. Effects of Mikania genus plants on growth and cell adherence of mutans
streptococci. Journal Etnopharmacology, v. 28, n. 97, p. 183-189, 2005.
ZANELLA, A. H.; BACCARIN, T.; CZEPULA, A.; BRESOLIN, T. M. B.; LUCINDA-SILVA, R.
M.; CECHINEL FILHO, V. Desenvolvimento e validação de método de determinação de
ácido caurenóico por CLAE em extrato das partes aéreas de Wedelia paludosa D.C.
Compositae e fitoterápico de uso tópico. In: SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA, 5.,
Itajaí, 2006. Anais... Itajaí: UNIVALI, 2006. 1 CD-rom.
ZANIN, S. M. W.; MIGUEL, M. D.; CHIMELLI, M.; DALMAZ, A. C. Parâmetros físicos no
estudo da estabilidade das emulsões. Revista Visão Acadêmica, v. 2, n. 2, p. 47-58, 2001.
ZANINI, J.C.; MEDEIROS, Y. S.; CRUZ, A. B.; YUNES, R. A.; CALIXTO, J. B. Actions of
compounds from Mandevilla velutina on croton oil-induced ear oedema in mice. A
comparative study with steroidal and monsteroidal antinflamatory drugs. Phytoterapy
Research, n. 6, p. 1-5, 1992.
Livros Grátis
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Milhares de Livros para Download:
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