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Contagem de Leucócitos Residuais pela
Câmara de Nageotte
SUMÁRIO
1. Objetivo
2. Responsabilidades
3. Definições
4. Siglas e Abreviaturas
5. Referências Bibliográficas
6. Condições Gerais ou Específicas
6.1. Produtos, Equipamentos e Utensílios
6.1.1. Produtos
6.1.2. Equipamentos
6.1.3. Utensílios
6.2. Considerações
6.2.1. Modelos de Câmara de Nageotte
6.2.2. Cuidados com a Câmara de Nageotte
6.3. Contagem de Leucócitos residuais em concentrado de hemácias desleucocitado
6.4. Contagem de Leucócitos residuais em concentrado de plaquetas desleucocitado
6.5. Uso da Câmara de Nageotte
7. Cálculos
8. Recomendações
9. Registros
ANEXOS:
Anexo 1: FLE 092 – Contagem de Leucócitos em câmara de Nageotte
REVISÃO
ANÁLISE CRÍTICA
APROVAÇÃO
Luiz Fernando
Marcio Biasoli
Marcio Biasoli
19/04/07
20/04/07
23/04/07
Revisão 00
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Contagem de Leucócitos Residuais pela
Câmara de Nageotte
Revisão 00
1. Objetivo
Esta instrução de trabalho tem por objetivo estabelecer a metodologia para contagem de leucócitos
residuais pela câmara de Nageotte nos concentrado de hemácias e plaquetas desleucocitados.
2.
Responsabilidades
•
Técnicos do laboratório de ensaios – Executar as tarefas descrita nesta IT, preencher devidamente os
registros, além de abrir RNC’s e RAP’s, quando necessário.
Gerente do laboratório de ensaios – supervisionar e orientar os técnicos do controle de qualidade no
cumprimento de todos os princípios descritos nesta IT, aprovar ou reprovar o produto de acordo com as
analises realizadas, acompanhar e fechar RNC’s e RAP’s, quando aplicável.
•
3. Definições
•
Homogeneidade- Distribuição uniforme.
4. Siglas e Abreviaturas
•
•
•
•
Coloração – Ação de corar
CHD – concentrado de hemácias desleucocidado
CPD – Concentrado de Plaquetas desleucocitado
AABB – American Association of Blood Banks
5. Referências Bibliográficas
•
•
•
•
•
•
RDC 153 de 14 de julho de 2004
Procedimentos da ControlLab e de Ensaio de Proficiência – REBLAS
DACIE, Sir. John; LEWIS, SM – Practical Hematology
Technical Mannual – AABB
CAP – College of American Pathologists
Sociedade Brasileira de Hematologia e Hemoterapia
6. Condições Gerais e Específicas
6.1. Produtos, Equipamentos e Utensílios
6.1.1. Produtos
•
Ácido Acético a 1% V/V (1mL de ácido acético glacial e completar a 100mL com água
reagente).
•
Corante Cristal Violeta ( Pesar 0,01g de cristal violeta e dissolver em 100mL de ácido acético a
1%).
•
Agente lisador de hemácias – LITIC DIF (solução do Coulter T890)
6.1.2. Equipamentos
• Relógio
• Microscópio com ocular de 10x e objetiva de 40X do microscópio invertido ou 40X com abertura
numérica < 0,65 ou objetiva de 20X
• Câmara de Nageotte
• Calculadora ou computador.
6.1.3. Utensílios
•
•
•
•
•
•
Micropipetas calibradas na faixa de 40 – 900µL
Ponteiras novas
Luvas sem talco
Tubos de ensaio de plástico e novos
Placa de Petri
Papel de filtro .
6.2. Considerações
É necessário utilizar uma câmara de grande volume 50 µL (µL = mm ). A Câmara de Nageotte deve
ser a espelhada, esta característica melhora muito a visualização para a contagem dos leucócitos.
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Nota: A Câmara de Neubauer é de 0,9µL, ou seja 56 vezes menor que a de Nageotte e não deve ser
usada neste procedimento por ser o volume muito pequeno.
6.2.1 – Modelos da Câmara de Nageotte
Existem modelos de câmara de Nageotte de 50µL (mais usual) e de 100µL.
Estas linhas paralelas horizontais delimitam 40 retângulos iguais,
cada um com um volume de 1,25µL (40 x 1,25µL = 50µL)
E as duas linhas verticais delimitam o espaço (volume) da câmara.
É preciso contar os leucócitos residuais em todos os 40 retângulos
6.2.2 – Cuidados com a Câmara de Nageotte
• Lavar a Câmara com água e detergente (utilizando bastante água para remover o detergente).
• É obrigatório o uso da luva.
• Não passe papel toalha, use lenço de papel comprimindo para secá-la e não esfregando. Ao
esfregar retiramos o espelho e riscamos a Câmara.
6.3. Contagem de Leucócitos residuais em concentrado de hemácias desleucocitado (CHD).
•
Pipetar 40µL da solução para lisar as hemácias num tubo de ensaio.
•
Homogeneizar o tubo contendo a amostra CHD.
•
Pipetar 100µL da amostra (CHD) no tubo que já contenha os 40µL da solução para lisar as
hemácias, rinsando a ponteira do pipetador várias vezes para misturar as amostras com a solução.
É importante ter certeza de que as hemácias foram todas lisadas.
•
Pipetar 860µL do corante cristal violeta dentro do tubo com a amostra já hemolisada, rinsando a
ponteira várias vezes para que os núcleos dos leucócitos se corem, facilitando a sua visualização.
•
Volume final é de 1000µL, ou seja, a amostra foi diluída 1:10.
Nota: Na ausência do agente lisador das hemácias pode-se utilizar a seguinte técnica alternativa:
• Acido acético a 1,5% V/V (1,5mL de acido acético glacial para 98,5mL de água reagente)
• Pesar 0,01 g de cristal violeta em 100mL de solução de ácido acético a 1,5% e rotular como
solução de cristal violeta
• Pipetar 900µL do corante cristal violeta em 100µL da amostra (CHD), rinsando com a ponteira
várias vezes para homogenizar os dois líquidos
6.4. Contagem de Leucócitos residuais em concentrado de plaquetas desleucocitado (CPD).
•
Pipetar 900µL do corante cristal violeta num tubo de ensaio.
•
Homogeneizar o tubo contendo a amostra CPD.
•
Pipetar em cima deste corante 100µL da amostra (CPD), rinsando com a ponteira várias vezes para
que os núcleos dos leucócitos se corem, facilitando assim sua visualização.
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•
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Volume final é de 1000µL, ou seja, a amostra foi diluída 1:10 (100µL para 1000µL).
6.5. Uso da Câmara de Nageotte:
• Ajustar a lamínula na câmara.
• Homogeneizar bem o tubo com a amostra diluída.
• Preencher a câmara de Nageotte sem excesso ou falta do material a ser examinado (área a ser
examinada).
• Colocar a câmara dentro da placa de Petri com papel de filtro umedecido, para não evaporar o
líquido na câmara.
• Deixar em repouso por 10 a 15 minutos para a sedimentação dos leucócitos.
• Remover a tampa da placa de Petri e colocar a câmara de Nageotte no microscópio.
• Contar os leucócitos nos 40 retângulos da câmara e preencher o anexo 1 desta instrução de
trabalho que corresponde ao FLE-092 (Contagem de Leucócito em câmara de Nageotte).
Nota: É preciso que o profissional possua experiência em identificar leucócitos para não confundir com
hemácias, aglomerados de plaquetas e artefatos.
7. Cálculos
Leucócitos por µL = nº de leucócitos contados
5
Nota: Divide-se por 5 pois contamos os leucócitos em 50µL, mas fizemos uma diluição 1:10, 50/10 = 5µL,
logo dividindo por 5, teremos em 1µL.
Leucócitos por µL x 1000µL = Leucócitos / mL
Leucócitos / mL x mL do CHD (ou do CPD)= Leucócitos / unidade.
8. Recomendações
•
Estocar a amostra, na temperatura correta para evitar a não deteriorar o material.
•
Não utilizar luvas com talco pois algumas partículas podem confundir com os leucócitos na câmara de
contagem.
•
Para obter experiência na contagem de leucócitos corados pelo cristal violeta devemos fazer as
experiências com sangue total.
•
Validar a exatidão deste método com uma amostra de referência com contagem alta de leucócitos
quantificada por outro método. Estas amostras de referência podem ser obtidas por diluições em série
com sangue ou componentes do sangue que tenham sido reduzido por 2 passagens em filtros de
redução. As contagens obtidas das amostras diluídas em série podem ser comparadas com os valores
teóricos esperados por cálculo .
•
Esta técnica não possui exatidão para concentrações em torno de 1 leucócito/µL.
9. Registros
Arquivamento
Nome do Registro
(N.º do Anexo)
FLE092 – Contagem de Leucócito
em Câmara de Nageotte
(Anexo 01)
Arquivo morto
Indexação
Tempo
Local
Tempo
Produto/ Lote/
Data
Enquanto
durar o
estoque
LAB
2 anos