PESQUISAS DE MELHORAMENTO GENÉTICO DE
MICRORGANISMOS VISANDO A BIORREMEDIAÇÃO
DE EFLUENTES CONTAMINADOS POR METAIS
PESADOS
Convênio CVRD/CPB-NAP-USP
Dr. Ronaldo Biondo
2010
Consumo
74% setor agrícola
20% pela indústria
resíduos
6% consumo doméstico
2007 - 6 bilhões
2025 – 9,1 bilhões
Aumento
de
resíduos
Metais pesados
URSS (1957) – satélite Sputnik 1
USA (1958) – criação da Nasa – satélite Explorer 1
60 anos – 482 astronautas
Lixo Tecnológico
Falta Legislação!
http://tv.pucsp.br/colab/category/social/lixo/
CONTAMINANTES PERIGOSOS
Ohe et al., 2004.
Ohe et al., 2004.
Biorremediação
É um processo no qual organismos
vivos são utilizados
tecnologicamente para remover ou
reduzir poluentes no ambiente.
VANTAGENS DA BIORREMEDIAÇÃO
que
Investimento e custos de operação mais baixos
os métodos físico-químicos empregados
atualmente;
Aplicável in situ;
Aplica-se a uma grande variedade de poluentes;
Aplicável em grande escala;
Bem aceita socialmente.
Fernandes e Alcântara, 2008.
Biorremediação
Microrganismos
Fitorremediação
Plantas
Fitorremediação
Fitoextração: absorção de contaminantes pelas raízes – metais e compostos orgânicos.
Fitovolatização: íons são absorvidos pelas raízes e convertidas em formas não tóxicas e liberados na atmosfera - metais e
compostos orgânicos.
Fitodegradação: contaminantes orgânicos são degradados ou mineralizados dentro das células vegetais por enzimas específicas.
Fitoestimulação: raízes em crescimento promovem a proliferação de microrganismos associados à rizosfera que produzem
ensimas degratativas – compostos orgânicos.
Rizofiltração: uso de plantas para absorver, concentrar ou precipitar contaminantes de um meio aquoso - metais e compostos
orgânicos.
FITORREMEDIAÇÃO EM LAGOS
NÚMERO DE PLANTAS HIPERACUMULADORAS CONHECIDAS,
PARA OITO METAIS PESADOS, E FAMÍLIAS EM QUE SÃO MAIS
FREQÜENTEMENTE ENCONTRADAS
Elemento
Nº de
espécies
Cd
1
Brassicaceae
Co
26
Lamiaceae, Scrophulariaceae
Cu
24
Cyperaceae, Lamiaceae,
Poaceae, Scrophulariaceae
Mn
11
Apocynaceae, Cunoniaceae, Proteaceae
Ni
290
Brassicaceae, Cunioniaceae,
Flacourtiaceae, Violaceae, Euphorbiaceae,
Se
19
Fabaceae
Tl
1
Brassicaceae
Zn
16
Brassicaceae, Violaceae
Robinson et al., 1998.
Famílias
CONCENTRAÇÕES DE METAIS EM ALGUMAS PLANTAS
HIPERACUMULADORAS (Mg Kg-1 EM MASSA SECA)
Espécie Vegetal
Metal
Concentração na parte colhível
de plantas crescidas em solo
contaminado
Thlaspi caerulescens
Cd
1 800
Thlaspi rotundifolium
Pb
8 200
Haumaniastrum robertii
Co
10 200
Ipomea alpina
Cu
12 300
Psychotria douarrei
Ni
47 500
Thlaspi caerulescens
Zn
51 600
Macadamia neurophylla
Mn
51 800
Cr
35 000
Brassica juncea
Cunningham & Ow (1996); Brown (1995)
Suresh e Ravishankar, 2004
VANTAGENS DA FITORREMEDIAÇÃO
Investimento e custos de operação baixos;
Aplicável in situ;
Aplica-se a uma grande variedade de poluentes;
Aplicável em grande escala;
Bem aceita socialmente.
DESVANTAGENS DA FITORREMEDIAÇÃO
O crescimento das plantas depende: da estação,
clima e solo;
Resultados lentos;
A concentração de substâncias contaminantes pode
ser tóxica;
incapaz de reduzir 100% a concentração do poluente;
Aplica-se apenas à superfície do solo ou a águas
superficiais.
Biorremediação
PRINCIPAIS MECANISMOS DE RESISTÊNCIA A METAIS
PESADOS
Metabolização de xenobióticos
CO2 + CH4
CONTAMINANTES E ESPÉCIES DE MICRORGANISMOS
PARA A BIORREMEDIAÇÃO
Espécie Utilizada
Contaminantes
Anéis Aromáticos
Cádmio
Pseudomonas,Achromobact, Bacillus,
Arthrobacter, Penicillum, Aspergillus, Fusarium,
Phanerocheate.
Staphlococcus, Bacillus, Pseudomonas,
Citrobacter, Klebsiella, Rhodococcus
Cobre
Escherichia, Pseudomonas
Cromo
Alcaligenes, Pseudomonas
Enxofre
Petróleo
Thiobacillus
Pseudomonas, Proteus, Bacillus, Penicillum,
Cunninghamella
Tipos de biorremediação
Biorremediação in situ.
Utiliza a microflora original do ambiente - adaptados.
BIOESTIMULAÇÃO: realizada através da adição de
nutrientes e/ou surfactantes diretamente no local
contaminado com o objetivo de aumentar a atividade de
populações presentes.
BIOAUMENTAÇÃO ou BIOAUMENTO: consiste na
introdução de microrganismos degradadores nos locais
contaminados.
Tipos de biorremediação
Biorremediação ex situ.
COMPOSTAGEM: processo biológico, através do qual os
microrganismos convertem a porção orgânica dos resíduos
material estável tipo húmus, conhecido como composto.
LANDFARMING: utilizado para a disposição e degradação de
resíduos oleosos resultante de operações de refino de petróleo. Os
resíduos são misturados ao solo e submetidos a uma
biorremediação in situ (bioestimulação).
REATORES: são reatores adaptados para o tratamento de solo ou
água contendo altos níveis de contaminantes. O principal objetivo
do uso dos reatores é o controle das condições ambientais durante
o processo visando a formação do biofilme responsável pela
biodegradação.
Desenvolvimento de Microrganismos
para Biorremediação de Metais
Pesados
BIOTECNOLOGIA APLICADA
LINHAS DE PESQUISA:
• DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSORES BACTERIANOS
PARA DETECÇÃO DE METAIS PESADOS.
• DESENVOLVIMENTO
DE
MICRORGANISMOS
BIORREMEDIADORES DE EFLUENTES CONTAMINADOS
POR METAIS PESADOS.
Laboratório de Genética de Microrganismos
CONSTRUÇÃO DO BIOSSENSOR PARA DETECÇÃO DE
MERCÚRIO EM AMOSTRAS AMBIENTAIS
Faixa de detecção: 0,15 µM – 2,5 µM
VANTAGENS:
•Testes rápidos e de baixo custo;
• Fácil análise dos resultados;
• Não necessita de substrato.
(Quadros, 2007)
DESENVOLVIMENTO DE MICRORGANISMOS PARA
BIORREMEDIAÇÃO DE AMBIENTES CONTAMINADOS
POR METAIS PESADOS:
BACTÉRIAS Gram-negativas;
LEVEDURAS
Cell surface
display
Gramnegativas
BACTÉRIA Gram-negativa
Resistência
Ag+2, Bi+2, Cd+2, Co+2, CrO4-2,
Cu+2, Hg+2, Mn+2, Ni+2, Pb+2,
SeO4-3, Tl+1 e Zn+2
Cupriavidus metallidurans CH34
150 genes
Tabela: Comparação das resistências de C. metallidurans CH34 com
os valores máximos de íons em efluentes, segundo o CONAMA.
Íon de metal pesado
MIC CH34
(mM)
Conama
(mM)
Razão
MIC/Conama
Cd+2
3,0
0,002
1500
Cu+2
0,8
0,016
50
CrO-24
0,2
0,01
20
Hg+2
0,006
0,00005
120
Mn+2
60,0
0,03
2000
Ni+2
3,5
0,034
103
Pb+2
3,0
0,002
1500
SeO-23
1,0
0,004
250
Zn+2
15,0
0,08
187
Mecanismos de Homeostase Celular
íon
Biorremediação com
C. metallidurans CH34
Melhoramento Genético
Expressão do promotor pan em C. metallidurans CH34
pan
=
derivado
do
promotor do gene mrgA
(metal regulated gene A)
de Bacillus subtilis com
modificações.
Figura esquemática do plasmídeo pBB-panEGFP.
B
Visualização de células de C. metallidurans CH34/pBB-panEGFP em
microscópio de epifluorêscencia com aumento de 1000 vezes.
Medida da Fluorescência por Citometria de Fluxo (FACS) em
C. metallidurans
Estratégia
Ancorar proteínas quelantes de metal na superfície bacteriana
Sistema de secreção da protease da Imunoglobulina A
(IgA) de Neisseria gonorrhoeae
Fitoquelatina sintética EC20
• Expressão de um único gene
• Alto conteúdo de cisteína
• Maior capacidade de adsorção de metais
Capacidade de Biossorção de metais
Espectrometria de massas de alta resolução com fonte de plasma indutivamente ativado (ICP-MS),
realizada no Laboratório de Caracterização Química e Isotópica do IPEN.
Figura: Eletromicrografia de transmissão
de cortes histológicos de células de
C. metallidurans CH34.
A
- C. metallidurans CH34 cultivada em
meio TSM e incubada com água MilliQ;
B
- C. metallidurans CH34 cultivada em
meio TSM e incubada com água MilliQ
contendo Pb+2;
C - C. metallidurans CH34/pCM2 cultivada
em meio TSM e incubada com água MilliQ
e;
D
- C. metallidurans CH34/pCM2
cultivada em meio TSM contendo Pb+2 e
incubada com água MilliQ contendo Pb+2.
A visualização das células foi realizada
com aumento foi de 46.000 vezes. Setas
indicam a presença de agregados do
elemento Pb+2 ligados na membrana
externa bacteriana.
Representação esquemática do aparato de biorremediação usado neste trabalho.
Reator Air-lift