RONALDO BIONDO
ENGENHARIA GENÉTICA DE
Cupriavidus metallidurans CH34 PARA A
BIORREMEDIAÇÃO DE EFLUENTES
CONTENDO METAIS PESADOS
RONALDO BIONDO
ENGENHARIA GENÉTICA DE
Cupriavidus metallidurans CH34 PARA A
BIORREMEDIAÇÃO DE EFLUENTES
CONTENDO METAIS PESADOS
Tese apresentada ao Programa de Pósgraduação Interunidades em Biotecnologia
EP/FMVZ/IPT/IB/ICB/Butantan da Universidade
de São Paulo para obtenção do título de Doutor
em Biotecnologia.
São Paulo
2008
RONALDO BIONDO
ENGENHARIA GENÉTICA DE
Cupriavidus metallidurans CH34 PARA A
BIORREMEDIAÇÃO DE EFLUENTES
CONTENDO METAIS PESADOS
Tese apresentada ao Programa de Pósgraduação Interunidades em Biotecnologia
EP/FMVZ/IPT/IB/ICB/Butantan da Universidade
de São Paulo para obtenção do título de Doutor
em Biotecnologia.
Área de Concentração: Biotecnologia
Orientadora: Profa Dra Ana Clara G. Schenberg
Co-orientadora: Profa Dra Elisabete José Vicente
São Paulo
2008
DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)
Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo
reprodução não autorizada pelo autor
Biondo, Ronaldo.
Engenharia genética de Cupriavidus metallidurans CH34 para
biorremediação de efluentes contendo metais pesados / Ronaldo
Biondo. -- São Paulo, 2008.
Orientadora: Ana Clara Guerrini Schenberg.
Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências
Biomédicas. Programa de Pós-Graduação Interunidades em
Biotecnologia EP/FMVZ/IPT/IB/ICB/Butantan. Área de concentração:
Biotecnologia. Linha de pesquisa: Genética de microrganismos e
Biorremediação.
Versão do título para o inglês: Genetic engineering of Cupriavidus
metallidurans CH34 for bioremediation of heavy metals in wastewater.
Descritores: 1. Engenharia genética 2. Efluentes 3. Metais pesados
4. Cupriavidus metallidurans CH34 I. Schenberg, Ana Clara Guerrini
II.Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas.
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. III. Título.
ICB/SBIB205/2007
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia
Universidade de São Paulo, Instituto Butantan, Instituto de Pesquisas Tecnológicas
_____________________________________________________________________________________________________
Candidato: Ronaldo Biondo
Título da Tese: Engenharia genética de Cupriavidus metallidurans CH34 para a
biorremediação de efluentes contendo metais pesados.
Orientadora: Ana Clara Guerrini Schenberg
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Doutorado, em sessão
pública realizada a ................./................./................., considerou
( ) Aprovado
( ) Reprovado
Examinador(a):
Assinatura: ....................................................................................
Nome: ............................................................................................
Instituição: .....................................................................................
Examinador(a):
Assinatura: ....................................................................................
Nome: ............................................................................................
Instituição: .....................................................................................
Examinador(a):
Assinatura: ....................................................................................
Nome: ............................................................................................
Instituição: .....................................................................................
Examinador(a):
Assinatura: ....................................................................................
Nome: ............................................................................................
Instituição: .....................................................................................
Presidente:
Assinatura: ....................................................................................
Nome: ............................................................................................
Instituição: .....................................................................................
Certificado da Comissão de Ética
À Maria de Nazaré, Mãe Santíssima
Pelo exemplo de sublime humildade
e devoção, dedico honrosamente!
AGRADECIMENTOS
A Deus pela misericórdia;
À Universidade de São Paulo pela oportunidade do exercício científico;
À Companhia Vale do Rio Doce por financiar e incentivar a realização desse trabalho;
À minha esposa Silvia que com companheirismo e luta passou por todos os
momentos da nossa vida com honra e dignidade;
Às professoras Dra Ana Clara Schenberg e Dra Elisabete José Vicente pela acolhida,
orientação e confiança;
À minha mãe Eunice pela luta da vida;
Aos meus irmãos Reinaldo e Lige pelo apoio;
Ao Dr. Victor de Lorenzo e ao Dr Luiz Angel Fernández, ambos do Centro Nacional de
Biotecnologia de Madri, pela colaboração essencial nesse trabalho;
Ao Prof. Dr. Robert Ivan Schumacker e à Adriana Matsuku, ambos do Instituto de
Química da Universidade de São Paulo, pela colaboração nos experimentos de
citometria de fluxo e análise dos dados;
Ao Dr. Jorge Eduardo de Souza Sarkis pelas análises de metais pesados por
espectrometria de plasma;
À Profª Drª Marta Maria Antoniazzi e ao técnico Alexsander Seixas de Souza, ambos
do Laboratório de Biologia Celular do Instituto Butantan, pela colaboração com o
experimento de Microscopia Eletrônica;
À Dra. Gabriela Ribeiro dos Santos pela colaboração na correção do texto e
participação neste trabalho;
À Dra. Andréa Balan e a doutoranda Cristiane de Souza pela colaboração nas análises
de expressão protéica;
Aos colegas do Laboratório de Genética de Microrganismos: Andréia, Claudionor,
Cleide, Jéssica, Kazui, Maria Helena, Normandia, Oeber e Tatiana pelos momentos de
descontração e companheirismo;
Aos mestres da Universidade de São Paulo que ensinaram com competência e
propriedade;
Aos colegas de pós-graduação que são companheiros da construção de uma nova
geração de pensadores e;
Aos amigos que me amparam na jornada da vida.
"O que hoje é provado não foi
outrora mais do que imaginado."
William Blake*
*
*
BLAKE, William. O casamento do céu e do inferno. Trad. José Antônio Arantes. São Paulo:
Iluminuras, 1987.
RESUMO
BIONDO, R. Engenharia genética de Cupriavidus metallidurans CH34 para
biorremediação de efluentes contendo metais pesados. 2007. Tese (Doutorado
em Biotecnologia) – Instituto de Ciências Biomédicas - Interunidades em
Biotecnologia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2007.
Este trabalho descreve a ancoragem de uma proteína sintética, quelante de metais,
na superfície externa da bactéria Cupriavidus metallidurans CH34. Esta bactéria é
altamente resistente e adaptada a ambientes contendo metais pesados e, por esse
motivo, é considerada um agente de interesse em biorremediação. No presente
trabalho, o gene da fitoquelatina sintética EC20sp, com estrutura análoga à
fitoquelatina natural (Glu-Cis)nGli com n=20, foi sintetizado in vitro e fusionado ao βdomínio do sistema de secreção da protease da imunoglobulina A (IgA) de Neisseria
gonorrhoeae, resultando numa proteína híbrida que foi capaz de se transportar à
membrana externa bacteriana com sucesso. A ancoragem e a funcionalidade da
proteína EC20sp-β-domínio foi demonstrada inicialmente em E. coli sob o controle
do promotor plac. Em C. metallidurans CH34, o cassete codificante da proteína
EC20sp-β-domínio foi colocado sob o comando de um novo promotor heterólogo
que, por sua vez, promoveu forte expressão basal, potencializada por íons metálicos
nesta bactéria. A linhagem recombinante, C. metallidurans/pCM2, apresentou
capacidade de imobilizar Cd+2, Co+2, Cu+2, Hg+2, Mn+2, Ni+2, Pb+2 e Zn+2 do meio
externo, em níveis significativamente superiores aos apresentados pela linhagem
selvagem.
Palavras-chave: Engenharia genética. Cupriavidus metallidurans
Biorremediação. Efluentes. Metais pesados. Fitoquelatina sintética.
CH34.
ABSTRACT
BIONDO, R. Genetic engineering of Cupriavidus metallidurans CH34 for
bioremediation of heavy metals in wastewater. 2007. Thesis (Biotechnology) Instituto de Ciências Biomédicas - Interunidades em Biotecnologia, Universidade de
São Paulo, São Paulo, 2007.
This work describes the targeting of a synthetic metal-chelating protein to the cell
surface of the heavy metal resistant Cupriavidus metallidurans CH34 bacterial strain.
This bacterium is adapted to thrive in soils highly polluted with metal ions and, thus,
has been considered a suitable candidate for bioremediation. For this purpose, an
analog gene of the natural phytochelatin (Glu-Cys)nGly with n=20, EC20sp, was
synthesized in vitro and fused to the autotransporter β-domain coding sequence of
the IgA protease of Neisseria gonorrhoeae, which successfully targeted the hybrid
protein towards the bacterial outer membrane. The translocation, surface display,
and functionality of the EC20sp-β-domain protein were initially demonstrated in
Escherichia coli upon insertion of the fused protein under control of the plac
promoter. As for the C. metallidurans CH34 strain, the EC20sp-β-domain gene fusion
was placed under the control of a new heterologous promoter which allowed strong
levels of basal expression, that were even stronger in the presence of metal ions.
The recombinant strain, C. metallidurans/pCM2, proved to have significantly
enhanced ability for immobilizing Cd+2, Co+2, Cu+2, Hg+2, Mn+2, Ni+2, Pb+2 and Zn+2
ions from the external media as compared to the wild type.
Key words: Genetic engineering. Cupriavidus metallidurans CH34. Bioremediation.
Wastewater. Heavy metals. Synthetic phytochelatin.
ABREVIATURAS
Ag+ - prata
ArsB – sistema de efluxo de arsenito
As+3 - arsênio
AsO4-3 - arsenito
ATCC - American Type Culture Collection
Au+3 - ouro
Bi+3 - bismuto
Cd+2 - cádmio
CDF -facilitador de difusão de cátion
CHR - sistema de efluxo de cromato
chr - operon de resistência a cromato
cnr - operon de resistência a níquel e cobalto
C. metallidurans CH34 - Cupriavidus metallidurans CH34
Co+2 - cobalto
cop - operon de resistência a cobre
CrO4-2 - cromato
ctxB - domínio B da toxina do cólera
Cu+2 - cobre
czc - operon de resistência a cádmio, zinco e cobalto
DOE-USA - Departamento de Energia dos Estados Unidos
DSMZ - Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen
EC - Fitoquelatina sintética
EC20sp – Gene da fitoquelatina sintética com 20 resíduos de cisteína
E. coli - Escherichia coli
E-tag - epítopo
Fe+2 - ferro
Gd+3 - gadolínio
GSH - glutationa
Hg+2 - mercúrio
HoxN - transporte específico de níquel
IgA protease - protease da imunoglobulina A
IPTG - isopropiltiogalactosídeo
IS - elemento transponível
Klenow - fragmento Klenow da DNA Polimerase I
mer - operon de resistência a mercúrio
MFS - superfamília de facilitadores de difusão de cátions
MIT - sistema de transporte de magnésio
Mn+2 - manganês
Mo+2 - molibdênio
MT - Metalotioneína
NCBI - National Center for Biotechnology Information
N. gonorrhoeae - Neisseria gonorrhoeae MS11
N. meningitidis - Neisseria meningitidis
Ni+2 - níquel
ONU - Organização das Nações Unidas
PC - Fitoquelatina natural
Pb+2 - chumbo
P. putida - Pseudomonas putida
pbr - operon de resistência a chumbo
PIT - transportador de fosfato inorgânico
pMOL28 - plasmídeo natural de C. metallidurans CH34
pMOL30 - plasmídeo natural de C. metallidurans CH34
RND - resistência, nodulação e divisão celular
S. typhimurium - Salmonella typhimurium
Sb+3 - antimônio
Se0 - selênio metálico
SeO4-3 - selenito
sil - operon de resistência a prata
SO4-2 - sulfato
SOD - superóxido dismutase
Tl+1 - tálio
U+2 - urânio
V+2 - vanádio
X-Gal - 5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-galactopiranosídeo
W+2 - tungstênio
Zn+2 - zinco
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Íons de metais pesados, suas principais fontes poluidoras, efeitos no homem e
potabilidade.....................................................................................................................................
27
Tabela 2: Principais classes de proteínas de transporte envolvidas na homeostase de metais
pesados em C. metallidurans CH34...............................................................................................
33
Tabela 3: Linhagens bacterianas e plasmídeos utilizados neste trabalho.....................................
61
Tabela 4: Iniciadores de PCR utilizados nesse trabalho................................................................
63
Tabela 5: Concentrações dos antibióticos utilizados para avaliação da MIC de
C. metallidurans CH34....................................................................................................................
70
Tabela 6: Resistência das linhagens de C. metallidurans CH34 provenientes das coleções
ATCC e DSMZ frente a antibióticos................................................................................................
87
Tabela 7: Comparação das resistências de C. metallidurans CH34 com os valores máximos de
íons em efluentes, segundo o CONAMA........................................................................................
88
Tabela 8: Proteínas escolhidas por análise proteômica por apresentarem forte intensidade na
análise proteômica de C. metallidurans CH34................................................................................
99
Tabela 9: Análise da clonagem dos diferentes promotores no vetor pCR-TOPO..........................
100
Tabela 10: Análise da clonagem dos diferentes promotores no vetor pBBEGFP..........................
102
Tabela 11: Mínima concentração Inibitória de C.metallidurans CH34 frente a íons de metais
pesados descrita na literatura desde o seu isolamento..................................................................
129
Tabela 12: Comparação da resistência de C. metallidurans CH34 a metais pesados com outros
microrganismos isolados de ambientes contendo metais pesados.................................................
130
Tabela 13: Comparação da capacidade biorremediadora das linhagens recombinantes
mostradas na literatura...................................................................................................................
145
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Resumo das interferências mais freqüentes de íons metais tóxicos na célula
microbiana.......................................................................................................................................
30
Figura 2: Desenho esquemático mostrando a célula bacteriana Gram-negativa e as diversas
famílias de proteínas envolvidas no transporte de metais pesados................................................
31
Figura 3: Inventário dos genes de resistência a metais pesados presentes nos quatro replicons
de C. metallidurans CH34...............................................................................................................
37
Figura 4: Representação esquemática do operon czc de C. metallidurans CH34.........................
38
+2
+2
Figura 5: Representação esquemática dos sistemas de resistência a Zn e Cd em
C. metallidurans CH34....................................................................................................................
41
Figura 6: Representação esquemática do operon cnr de C. metallidurans CH34.........................
41
+2
Figura 7: Representação esquemática dos sistemas de resistência a Ni
em
C. metallidurans CH34.....................................................................................................................
43
+2
em
Figura 8: Representação esquemática dos sistemas de resistência a Co
C. metallidurans CH34.....................................................................................................................
44
Figura 9: Representação esquemática do operon chr do pMOL28 de C. metallidurans CH34......
45
-2
Figura 10: Representação esquemática dos sistemas de resistência a CrO4
em
C. metallidurans CH34....................................................................................................................
46
Figura 11: Representação esquemática do operon pbr do pMOL30 de C. metallidurans CH34...
47
+2
Figura 12: Representação esquemática do sistema de resistência a Pb
em
C. metallidurans CH34....................................................................................................................
48
Figura 13: Representação esquemática do operon mer do pMOL30 e pMOL28 de
C. metallidurans CH34....................................................................................................................
49
+2
Figura 14: Representação esquemática do sistema de resistência a Hg
em
C. metallidurans CH34....................................................................................................................
50
Figura 15: Representação esquemática do operon cop do pMOL30 de C. metallidurans CH34...
51
+2
+1
Figura 16: Representação esquemática do sistema de resistência a Cu / Cu em
C. metallidurans CH34....................................................................................................................
52
Figura 17: A- Representação esquemática da secreção extracelular da IgA protease de
N. gonorrhoeae MS11. B- Esquema representativo da construção genética visando a
ancoragem da proteína CtxB utilizando o PS e β-domínio do sistema de secreção da IgA
protease. C- Esquema representativo da ancoragem da proteína CtxB na membrana externa de
Salmonella typhimurium..................................................................................................................
56
Figura 18: A - Via biossintética da fitoquelatina natural (PC); B – Estrutura química da
fitoquelatina sintética (EC)...............................................................................................................
58
Figura 19: Figura esquemática do plasmídeo pBBR1MCS............................................................
64
Figura 20: Figura esquemática do plasmídeo pHEβ......................................................................
65
Figura 21: Figura esquemática do plasmídeo pGEM-T Easy e do múltiplo sítio de clonagem......
66
Figura 22: Figura esquemática do plasmídeo pCR2.1-TOPO e do múltiplo sítio de clonagem.....
67
Figura 23: Figura esquemática do plasmídeo pLG com o gene da EGFP clonado.......................
68
Figura 24: Figura esquemática do plasmídeo pBBEGFP...............................................................
68
Figura 25: Figura esquemática do plasmídeo pBB-panEGFP........................................................
69
Figura 26: Curva de crescimento de C. metallidurans CH34 em meio TSM com diferentes pHs..
88
Figura 27: Seqüência de nucleotídeos do sistema de secreção da IgA protease de
N. gonorrhoeae presente no plasmídeo pHEβ................................................................................
90
Figura 28: A - Gene sintético da fitoquelatina (EC20sp) construído por Bae et al. (2000)
ladeados com sítios de BamH I e Hind III; B – Gene sintético EC20sp construído nesse trabalho
com sítios EcoR V e Sal I................................................................................................................
91
Figura 29: Perfil de migração de fragmentos de DNA após eletroforese em gel de agarose
0,7% corado com brometo de etídio. A- Gene sintético EC20sp amplificado por PCR; BPlasmídeo pGEMEC20sp digerido com EcoR V e Sal I..................................................................
92
Figura 30: Esquema representativo da construção do plasmídeo pCM1.......................................
93
Figura 31: Perfil de migração de fragmentos de DNA da digestão do plasmídeo pCM1 após
eletroforese em gel de agarose 0,7% corado com brometo de etídio.............................................
94
Figura 32: Seqüência de nucleotídeos e de aminoácidos da clonagem do gene EC20sp no
plasmídeo pHEβ..............................................................................................................................
95
Figura 33: Análise do perfil protéico por SDS-PAGE das linhagens de E. coli recombinantes......
96
Figura 34: A - Western-blotting das diferentes frações das células após incubação com
anticorpo anti-E-tag. B- Representação esquemática da ancoragem da EC20sp com a
exposição do epítopo e da proteína EC20sp no meio externo........................................................
96
Figura 35: Adsorção de íons cádmio pelas linhagens de E. coli utilizadas nesse trabalho, em
+2
solução de água contendo 1 mM de Cd .......................................................................................
97
Figura 36: Gel analítico 2-D de proteínas totais de C. metallidurans CH34 corado com
coomassie........................................................................................................................................
99
Figura 37: Perfil de migração de fragmentos de PCR dos promotores de
C. metallidurans CH34 após eletroforese em gel de agarose 0,7% corado com brometo de
etídio................................................................................................................................................
100
Figura 38: Perfil de migração de fragmentos de DNA referentes aos promotores de
C. metallidurans CH34 amplificados por PCR e clonados no vetor pCR2.1-TOPO após
eletroforese em gel de agarose 0,7% corado com brometo de etídio.............................................
101
Figura 39: Esquema representativo da construção do plasmídeo pCMP1....................................
102
Figura 40: Perfil de migração de fragmentos da digestão do plasmídeo pBBEGFP com os
diferentes promotores após eletroforese em gel de agarose 1,2% corado com brometo de
etídio................................................................................................................................................
103
Figura 41: Perfil de fragmentos de DNA do promotor czcIp após eletroforese em gel de agarose
0,7% corado com brometo de etídio................................................................................................
104
Figura 42: Esquema representativo da construção do plasmídeo pLEGFP...................................
105
Figura 43: Perfil de migração de fragmentos do plasmídeo pLEGFP digerido com VspI e XhoI
após eletroforese em gel de agarose 0,7% corado com brometo de etídio....................................
105
Figura 44: Visualização de células de C. metallidurans CH34 em microscópio de
epifluorescência com aumento de 1000 vezes...............................................................................
106
Figura 45: A e C- gráficos de intensidade de fluorescência relativa após análise de 30000
eventos
dos
clones
de
C.
metallidurans
CH34/pBBEGFP
(controle)
e
C. metallidurans CH34/pBB-panEGFP; B e D- distribuição celular característico de cada
amostra, indicando apenas um tipo celular e E- gráfico em 3D comparando as amostras A e C
quanto ao deslocamento de gráfico, indicando a intensidade de fluorescência..............................
108
Figura 46: A: intensidade de fluorescência relativa medida através de citometria de fluxo em
C. metallidurans CH34 carregando os diversos plasmídeos construídos nesse trabalho; B:
intensidade de fluorescência relativa medida através de citometria de fluxo em E. coli
carregando os diversos plasmídeos construídos nesse trabalho....................................................
109
Figura 47: Perfil de migração de fragmentos do plasmídeo pTOPOANC digerido com NdeI e
KpnI após eletroforese em gel de agarose 0,7% corado com brometo de etídio............................
111
Figura 48: Esquema representativo da construção do plasmídeo pCM2.......................................
112
Figura 49: A: Plasmídeo pCM2 e tamanho dos fragmentos do cassete expressão-ancoragem
da EC20sp; B: Perfil de migração de fragmentos da digestão do vetor pCM2 com diversas
enzimas após eletroforese em gel de agarose 0,7% corado com brometo de
etídio................................................................................................................................................
113
Figura 50: Seqüência de nucleotídeos e de aminoácidos do plasmídeo pCM2.............................
114
Figura 51: Análise do perfil protéico por SDS-PAGE das linhagens de C. metallidurans
recombinantes.................................................................................................................................
115
Figura 52: Western-blotting das diferentes frações das células de C. metallidurans após
incubação com anticorpo anti-E-tag................................................................................................
115
Figura 53: Porcentagem de cádmio residual em solução aquosa após incubação com as
diferentes linhagens de C. metallidurans utilizadas nesse trabalho................................................
116
Figura 54: Acúmulo de cádmio pelas linhagens de C.metallidurans utilizadas neste trabalho......
117
Figura 55: Acúmulo de cobalto pelas linhagens de C.metallidurans utilizadas neste trabalho......
118
Figura 56: Acúmulo de cobre pelas linhagens de C.metallidurans utilizadas neste trabalho.........
119
Figura 57: Acúmulo de mercúrio pelas linhagens de C.metallidurans utilizadas neste trabalho....
119
Figura 58: Acúmulo de manganês pelas linhagens de C.metallidurans utilizadas neste trabalho.
120
Figura 59: Acúmulo de níquel pelas linhagens de C.metallidurans utilizadas neste trabalho........
120
Figura 60: Acúmulo de zinco pelas linhagens de C.metallidurans utilizadas neste trabalho.........
121
Figura 61: Acúmulo de chumbo pelas linhagens de C.metallidurans utilizadas neste trabalho.....
122
Figura 62: Acúmulo de diferentes metais pela linhagem de C.metallidurans/pCM2 induzida........
122
Figura 63: Acúmulo de metais pelas linhagens de C.metallidurans em soluções contendo
múltiplos metais...............................................................................................................................
123
Figura 64: Eletromicrografia de transmissão de cortes histológicos de células de
C. metallidurans CH34.....................................................................................................................
125
Figura 65: Curva de crescimento das linhagens de C. metallidurans CH34 em meio TSM. .........
126
Figura 66: Estrutura do peptídeo sinal seqüenciado do plasmídeo pHEβ.....................................
131
Figura 67: Estrutura do epítopo E-tag seqüenciado do plasmídeo pHEβ......................................
132
Figura 68: Comparação da seqüência do promotores utilizados nesse estudo.............................
139
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.............................................................................................................................
22
1.1 Relevância do projeto.............................................................................................................
22
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.......................................................................................................
24
2.1 Importância da água...............................................................................................................
24
2.2 Poluição das águas por metais pesados..............................................................................
25
2.2.1 Metais pesados....................................................................................................................
26
2.3 Tratamento de efluentes contendo metais pesados...........................................................
28
2.3.1 Fitorremediação...................................................................................................................
28
2.3.2 Biorremediação com microrganismos...............................................................................
29
2.4 Cupriavidus metallidurans CH34...........................................................................................
32
2.4.1 Genômica de C. metallidurans CH34.................................................................................
32
2.4.2 Metabolismo de C. metallidurans CH34.............................................................................
34
2.4.3 Mecanismos de resistência de C. metallidurans CH34....................................................
35
2.4.4 Operon czc de C. metallidurans CH34...............................................................................
38
+2
+2
2.4.5 Resistência a cádmio (Cd ) e zinco (Zn ) em C. metallidurans CH34...........................
39
2.4.6 Operon cnr de C. metallidurans CH34...............................................................................
41
+2
2.4.7 Resistência a níquel (Ni ) em C. metallidurans CH34......................................................
+2
2.4.8 Resistência a cobalto (Co ) em C. metallidurans CH34..................................................
-2
2.4.9 Operon chr de resistência a cromato (CrO4 ) de C. metallidurans CH34.......................
+2
2.4.10 Operon pbr de resistência a chumbo (Pb ) de C. metallidurans CH34........................
+2
2.4.11 Operon mer de resistência a mercúrio (Hg ) de C. metallidurans CH34.....................
+2
+1
42
43
44
46
48
2.4.12 Operon cop de resistência a cobre (Cu /Cu ) de C. metallidurans CH34..................
50
2.4.13 Outras resistências a metais pesados em C. metallidurans CH34...............................
53
2.5 Ancoragem de peptídeos em membranas de bactérias Gram-negativas..........................
54
2.6 Peptídeos com afinidade a íons de metais pesados...........................................................
57
3 OBJETIVO...................................................................................................................................
59
4 MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................................................................
61
4.1 Linhagens bacterianas e plasmídeos utilizados neste trabalho........................................
61
4.2 Iniciadores de PCR utilizados nesse trabalho.....................................................................
63
4.3 Descrição dos Plasmídeos.....................................................................................................
64
4.3.1 pBBR1MCS...........................................................................................................................
64
4.3.2 pHEβ......................................................................................................................................
64
®
4.3.3 PGEM -T Easy System I......................................................................................................
®
®
65
4.3.4 pCR 2.1-TOPO ....................................................................................................................
66
4.3.5 pLG........................................................................................................................................
67
4.3.6 pBBEGFP..............................................................................................................................
68
4.3.7 pBB-panEGFP......................................................................................................................
69
4.4 Condições de cultivo das bactérias......................................................................................
69
4.5 Resistência de C. metallidurans CH34 a antibióticos..........................................................
70
4.6 Efeito do pH no crescimento de C. metallidurans CH34.....................................................
70
4.7 MIC de C. metallidurans CH34 frente a íons de metais pesados........................................
71
4.8 Extração de DNA genômico de C. metallidurans CH34.......................................................
71
4.9 Extração e purificação de plasmídeos..................................................................................
72
4.9.1 Máxi-preparação...................................................................................................................
72
4.9.2 Mini-preparação...................................................................................................................
73
4.10 Análise eletroforética de DNA em gel de agarose e purificação de
fragmentos.....................................................................................................................................
73
4.11 Clivagem dos plasmídeos e fragmentos de DNA com enzimas de restrição.................
74
4.12 Preparação de células eletrocompetentes.........................................................................
74
4.13 Transformação de bactérias por eletroporação.................................................................
74
4.14 Construção do gene sintético da Fitoquelatina (EC20sp) sem o códon de terminação
de síntese protéica........................................................................................................................
75
4.15 Construção do cassete de ancoragem da EC20sp............................................................
76
4.16 Análise da expressão do cassete de ancoragem da EC20sp...........................................
77
4.16.1 Caracterização do perfil protéico através de SDS-PAGE...............................................
77
4.16.2 Separação de membranas e Western-blotting................................................................
78
4.16.3 Bioacúmulo de íons de metais pesados pelas linhagens expressando o cassete de
ancoragem da EC20sp..................................................................................................................
79
4.17 Amplificação e clonagem de regiões promotoras a partir do DNA total de
C. metallidurans CH34..................................................................................................................
80
4.18 Construção do plasmídeo pLEGFP.....................................................................................
81
4.19 Quantificação da expressão da proteína verde fluorescente em E. coli e
C. metallidurans CH34 através de Citometria de Fluxo.............................................................
82
4.20 Construção do cassete de expressão-ancoragem da EC20sp.........................................
83
4.21 Análise das linhagens de C. metallidurans CH34 por Microscopia Eletrônica de
Transmissão..................................................................................................................................
84
5 RESULTADOS............................................................................................................................
86
5.1 Caracterização fisiológica de C. metallidurans CH34.........................................................
86
5.1.1 Resistência a antibióticos...................................................................................................
86
5.1.2 Efeito do pH no crescimento de C. metallidurans CH34..................................................
87
5.1.3 MIC de C. metallidurans CH34 frente a íons de metais pesados.....................................
88
5.2 Construção da bactéria C. metallidurans CH34 recombinante..........................................
89
5.2.1 Seqϋenciamento do plasmídeo pHEβ................................................................................
89
5.2.2 Construção do gene sintético da Fitoquelatina (EC20sp) sem o códon de
terminação de síntese protéica...................................................................................................
91
5.2.3 Clonagem do gene EC20sp no plasmídeo pHEβ..............................................................
92
5.3 Análise da expressão do cassete de ancoragem da EC20sp.............................................
95
5.3.1 Caracterização do perfil protéico através de SDS-PAGE e Western-blotting................
95
+2
5.3.2 Bioacúmulo de íons Cd por E. coli com a proteína EC20sp ancorada na membrana
externa............................................................................................................................................
97
5.4 Escolha de promotores com expressão constitutiva em C. metallidurans CH34 para
expressão do cassete de ancoragem da EC20sp......................................................................
97
5.4.1 Obtenção de seqüências promotoras de C. metallidurans CH34 através de análise
proteômica.....................................................................................................................................
98
5.4.2 Obtenção de seqüências promotoras conhecidas por expressar genes
constitutivamente em C. metallidurans CH34............................................................................
103
5.4.2.1 Obtenção do promotor czcIp...........................................................................................
103
5.4.2.2 Obtenção do promotor plac.............................................................................................
104
5.4.3 Obtenção do promotor pan de B. subtilis..........................................................................
106
5.5 Análise da expressão de EGFP pelos diferentes promotores............................................
106
5.6 Quantificação da expressão da proteína verde fluorescente através de citometria de
fluxo................................................................................................................................................
107
5.7 Construção do cassete de expressão-ancoragem da EC20sp...........................................
110
5.8 Análise da expressão do cassete de ancoragem da EC20sp em C. metallidurans CH34
114
5.8.1 Caracterização do perfil protéico através de SDS-PAGE e Western-blotting................
114
5.8.2 Bioacúmulo de íons de metais pesados por C. metallidurans CH34
recombinante.................................................................................................................................
115
5.9 Caracterização das linhagens de C. metallidurans CH34 por Microscopia Eletrônica
de Transmissão.............................................................................................................................
124
5.10 Avaliação do crescimento da linhagem C. metallidurans CH34 recombinante..............
126
6 DISCUSSÃO................................................................................................................................
127
6.1 Caracterização fisiológica de C. metallidurans CH34.........................................................
127
6.2 Construção da bactéria C. metallidurans CH34 recombinante..........................................
131
6.2.1 Construção do cassete de ancoragem da EC20sp...........................................................
131
6.2.2 Análise da expressão do cassete de ancoragem da EC20sp..........................................
133
6.2.3 Escolha de promotores com forte capacidade de expressão protéica em
C. metallidurans CH34..................................................................................................................
134
6.2.4 Análise da expressão de EGFP pelos diferentes promotores.........................................
135
6.2.5 Construção, análise do cassete de expressão-ancoragem da EC20sp em
C. metallidurans CH34 e sua capacidade de otimizar a adsorção de metais pesados..........
141
7 CONCLUSÕES............................................................................................................................
152
8 CONSIDERAÇÕES FINAIS.........................................................................................................
153
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................................................................................
155
ANEXO A – CONAMA – Das condições e padrões de lançamento de efluentes....................
166
Introdução 22
1 INTRODUÇÃO
Este trabalho faz parte de um projeto maior, que visa o desenvolvimento de
novas estratégias microbiológicas para tratamento de efluentes contendo metais
pesados, objeto de um convênio firmado entre a Vale (anteriormente Companhia
Vale do Rio Doce) e o Centro de Pesquisas em Biotecnologia da Universidade de
São Paulo.
O presente subprojeto “Engenharia genética de Cupriavidus metallidurans
CH34 para a biorremediação de efluentes contendo metais pesados” teve como
principal objetivo a construção de uma bactéria recombinante com capacidade
otimizada de biorremediação de metais, para ser utilizada em programas de
tratamento de efluentes. A bactéria C. metallidurans CH34 foi escolhida, como
material de partida, por possuir resistência natural a elevadas concentrações de
diversos íons de metais pesados. Entretanto, o mecanismo de resistência de
C. metallidurans consiste num sistema de efluxo dos cátions, que detoxifica o
citoplasma da bactéria e não o ambiente e, portanto, não pode servir para a
biorremediação. Assim, para que este microrganismo pudesse desenvolver
plenamente o seu potencial biotecnológico, seria necessário submetê-lo a
manipulações genéticas que lhe conferissem a capacidade de imobilizar íons de
metais pesados na sua superfície celular.
1.1 Relevância do Projeto
A água, como bem de consumo que tende a tornar-se escasso, tem papel
fundamental na vida do homem e no equilíbrio da biodiversidade. Assim sendo,
desenvolver metodologias para tratar efluentes contaminados é uma iniciativa
indispensável para a sustentabilidade do planeta. A contaminação de efluentes por
metais pesados é motivo de preocupação por promover severos distúrbios aos
organismos e ecossistemas. A poluição do meio ambiente por metais tóxicos é
decorrente, em sua maior parte, das atividades antropogênicas produtoras de
resíduos que, via de regra, são descartados diretamente em ambientes aquáticos ou
no solo, sem prévio tratamento, levando ao acúmulo de metais pesados e causando
perdas econômicas, de biodiversidade, além de sérios riscos à saúde pública.
Introdução 23
Portanto, a busca por processos remediadores que sejam economicamente
viáveis e ecologicamente corretos tem se intensificado nos últimos anos e o uso de
microrganismos para biorremediação se mostra vantajoso, principalmente pelos
baixos
custos,
quando
comparado
às
técnicas
físico-químicas
atualmente
empregadas no tratamento de efluentes contendo metais.
A proposta desse projeto foi de realizar a ancoragem de uma poderosa
fitoquelatina quelante de metais, na membrana externa de C. metallidurans CH34, a
fim de otimizar a sua capacidade de adsorver íons de metais pesados, com vistas à
utilização desta bactéria para a biorremediação de efluentes de mineração.
Revisão Bibliográfica 24
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Importância da água
“Há uma verdade fundamental que gostaria de enfatizar... o suprimento
de água não cessa quando ela provém do poço da sabedoria humana”.
Koichiro Matsuura
(Diretor-Geral da UNESCO, Dia Mundial da água, 2000)
“A água é o sangue do nosso planeta: ela é fundamental para a bioquímica
de todos os organismos vivos” (SELBORNE, 2001).
Popularmente existe uma falsa idéia de que os recursos hídricos são
infinitos. Realmente, há muita água no planeta, mas apenas 3% dessa água é doce,
dos quais 2% consistem de água congelada nas regiões polares e 1% distribuída
desigualmente pela terra (MORAES; JORDÃO, 2002).
A água é indispensável às atividades humanas, dentre as quais, o
abastecimento doméstico e público, o uso agrícola e industrial e a produção de
energia elétrica. Tais atividades, estreitamente associadas à elevação do nível de
vida e ao crescimento populacional, passaram a exigir quantidades crescentes
desse recurso natural. Se, por um lado, o desenvolvimento prescinde da
disponibilidade de água, por outro lado, defronta-se com a limitação desse recurso,
tornando-se relevante um planejamento racional de utilização e a sua integração na
política de desenvolvimento econômico-social (VÖRÖSMARTY et al., 2000).
O mundo tem testemunhado um crescimento demográfico sem precedentes;
estima-se que a população mundial, que em 1999 era de 6 bilhões, chegue a 9,1
bilhões de pessoas em 2025, aumentando exponencialmente as projeções de
demanda dos recursos hídricos (SELBORNE, 2001). Hoje, aproximadamente 74%
da água doce é consumida pelo setor agrícola, 20% pela indústria e 6% pelo
consumo doméstico. À medida que as populações e as atividades econômicas
crescem, muitos países atingem rapidamente condições de escassez de água ou se
defrontam com limites para o desenvolvimento. Ao mesmo tempo, crescem também
os focos de deteriorização das águas pelo lançamento de esgotos, efluentes
industriais e insumos agrícolas, que podem trazer graves conseqüências ambientais
(MORAES; JORDÃO, 2002).
O consumo da água é considerado seguro quando não causa prejuízo à
saúde humana, estando livre de organismos patogênicos, assim como de
substâncias potencialmente tóxicas. Estimativas da Organização das Nações Unidas
Revisão Bibliográfica 25
(ONU) mostram que mais de 5 milhões de pessoas morrem anualmente com
doenças causadas por água contaminada, incluindo 6000 crianças por dia; isto leva
à ocupação de metade dos leitos hospitalares em todo o mundo (SELBORNE,
2001).
Neste cenário, a necessidade de se tratar a água é premente e constitui
uma grave questão de saúde pública, devido principalmente, à toxicidade dos
compostos descartados, risco de acúmulo na cadeia alimentar e persistência na
natureza (GAVRILESCU, 2004).
2.2 Poluição das águas por metais pesados
Atividades industriais, de agricultura e esgotos domésticos são os principais
responsáveis pela poluição do meio ambiente por metais tóxicos, mesmo levando-se
em conta todos os outros tipos de contaminações juntas (NRIAGU; PACYNA, 1988).
Além disso, os resíduos de metais pesados produzidos por esses segmentos têm
sido indiscriminadamente descartados em corpos d`água ou dispostos no solo sem
prévio tratamento (NIES, 1992). Exemplo disso são os sítios contaminados com
metais pesados identificados pelo Departamento de Energia dos Estados Unidos
(DOE-USA), com volume estimado de 200 milhões de metros cúbicos, dispostos
sem tratamento em solos e efluentes, e com projeção de crescimento (PETERS,
1999).
Especialmente
preocupante
é
o
fato
de
que,
diferentemente
de
contaminantes orgânicos, que podem ser convertidos em derivados não-tóxicos por
ação microbiana, os contaminantes metálicos persistem indefinidamente no meio
ambiente.
Na União Européia, a preocupação com os níveis de contaminação aliada à
escassez de recursos hídricos forçou o aperfeiçoamento da legislação ambiental,
limitando a descarga de contaminantes tóxicos de águas residuais, incluindo metais
pesados, obrigando os diversos segmentos produtivos a aplicarem tecnologias de
tratamento (REMOUDAKI et al., 2003).
No Brasil, a legislação ambiental estabelece parâmetros físicos, químicos e
microbiológicos de qualidade da água, a fim de regular o lançamento de efluentes
Revisão Bibliográfica 26
em corpos receptores (Anexo A). No entanto, muitos cursos d’água desse país
apresentam alto potencial mutagênico devido à presença de contaminantes tóxicos
como metais pesados, descartados inadvertidamente (OHE et al., 2004).
No âmbito global, não se tem o dimensionamento do total de descartes de
metais pesados. No entanto, têm se verificado, cada vez mais, casos de perda de
biodiversidade e contaminação de populações por metais pesados (LORENZO;
KUENEN, 1999; ROANE; PEPPER, 2000a; ROUX et al., 2001). Além disso,
atualmente, cresce assustadoramente o chamado “lixo tecnológico”, tais como
televisores, celulares, pilhas e componentes de informática que acabam sendo
descartados, como resultado da troca por modelos mais novos e sofisticados. O
problema é que tais equipamentos contêm muitas substâncias perigosas e tóxicas,
principalmente metais pesados, que, via de regra, atingem lençóis freáticos e solos,
contaminando o ambiente e suscitando sérias preocupações sobre o manejo desta
nova forma de lixo (BABU et al., 2007).
2.2.1 Metais pesados
Várias definições de metais pesados podem ser encontradas na literatura;
no entanto, há um consenso de que metais pesados sejam elementos químicos com
densidade igual ou maior a 5 g/cm3 (NIES, 1999; PIVELI; KATO, 2005; ROANE;
PEPPER, 2000a). Considerando-se essa definição, dos 92 elementos químicos de
ocorrência natural, 21 são não metais, 16 são metais leves e o restante são metais
pesados, dos quais, apenas 17 apresentam algum significado biológico para as
células: ferro (Fe), molibdênio (Mo) e manganês (Mn) são importantes elementostraço com baixa toxicidade, enquanto zinco (Zn), níquel (Ni), cobre (Cu), vanádio (V),
cobalto (Co), tungstênio (W) e crômio (Cr) são de moderada importância como
elementos-traço, e apresentam toxicidade em concentrações pouco acima das
fisiológicas. Por fim, arsênio (As), prata (Ag), antimônio (Sb), cádmio (Cd), mercúrio
(Hg), chumbo (Pb) e urânio (U) devem ser considerados como elementos tóxicos
(NIES, 1999).
O potencial tóxico dos metais pesados ao organismo humano é diverso e
está resumido na Tabela 1, que mostra as principais fontes poluidoras e os efeitos
na saúde do homem. Devido à sua toxicidade e persistência na natureza, os níveis
Revisão Bibliográfica 27
de metais pesados são controlados em efluentes, obrigando as fontes produtoras a
tratar seus resíduos, o que abre perspectivas de desenvolvimento de novas
tecnologias de tratamento.
Tabela 1: Íons de metais pesados, principais fontes poluidoras, efeitos no homem e potabilidade*.
Íon
Principais Fontes Poluidoras
Efeitos no homem
Potabilidade
Arsênio
(As)
Herbicidas, Inseticidas, Fungicidas,
Mineração, Indústria de vidros,
tintas e corantes.
Câncer, Intoxicação e Morte (130
mg).
0,01 mg/L
**
Efluentes
industriais,
Galvanoplastia,
Produção
de
Pigmentos,
Equipamentos
eletrônicos,
Lubrificantes,
Acessórios fotográficos, Inseticidas
e Combustíveis fósseis.
Anemia,
Retardamento
do
crescimento, Morte (9 gramas),
Disfunção
renal,
Hipertensão,
Arteriosclerose, Câncer e Doenças
crônicas.
0,005 mg/L
Chumbo
(Pb)
Efluentes
industriais,
Tabaco,
Tintas, Tubulações, Metalurgia e
Indústria de Eletrodeposição.
Saturnismo, Tontura, Irritabilidade,
Dor de cabeça, Perda de memória,
Deficiências
musculares,
Inflamação gastrintestinal, Vômitos
e Diarréias.
0,01 mg/L
Cobalto
(Co)
Indústrias
Química,
Metalúrgica e de Óleo.
Doenças
pulmonares,
Bócio,
colapso cardíaco e hipotireoidismo.
0,05 mg/L
Lesões no fígado e Intoxicação.
2,0 mg/L
Efluentes industriais, Produção de
alumínio e aço, Tintas, Pigmentos,
Explosivos, Papel e Fotografia.
Alergias, Câncer e Intoxicação.
0,05 mg/L
Garimpos, Praguicidas, Produção
de cloro, Desinfetantes, Pigmentos,
Mineração,
Esgotos,
Produtos
odontológicos, Farmacêuticos e
Tintas.
Morte (3-30 gramas), Vômitos,
Dores
abdominais,
Diarréia,
Osteoporose, Lesões cerebrais e
renais, Alterações psicológicas e
psicomotoras.
0,001mg/L
Cádmio
(Cd)
Cobre
(Cu)
Crômio
(Cr)
Mercúrio
(Pb)
Níquel
(Ni)
Zinco
(Zn)
Cerâmica,
Corrosão de tubulações, Esgotos
domésticos, Algicidas, Fungicidas,
Pesticidas, Mineração, Fundição e
Refinamento de metais.
Galvanoplastias,
Mineração,
Queima de combustíveis fósseis,
Fundição de metal, Produção de
ligas metálica e Fabricação de
alimentos.
Galvanoplastias,
Mineração,
Combustão
de
madeira,
Incineração de resíduos, Esgotos
domésticos e Produção de ferro e
aço.
Câncer, Dermatites, Alterações
cardíacas e respiratórias.
0,025 mg/L
Alterações respiratórias, gástricas e
cardíacas.
5,0 mg/L
*Baseado em Nies (1999) e Piveli e Kato (2005).
**Ministério da Saúde - Portaria n. 518, de 25 de março de 2004.
Revisão Bibliográfica 28
2.3 Tratamento de efluentes contendo metais pesados
A busca por processos que utilizem “tecnologias limpas” vem crescendo nas
últimas décadas devido, principalmente, ao aprimoramento de regras legislativas,
que
incentivam
o
desenvolvimento
de
procedimentos
físico-químicos
e
biotecnológicos que contribuam para a minimização dos impactos causados pela
liberação de metais pesados, uma vez que estes elementos contaminantes não são
biodegradados na água ou solo.
O tratamento clássico de efluentes contendo metais pesados envolve
processos físico-químicos de precipitação, troca iônica, adsorção e extração por
solventes. Geralmente processos subseqüentes, como sedimentação e filtração, são
necessários para que a água tratada seja recuperada. Contudo, essas técnicas
tradicionais são inadequadas para a descontaminação de grandes volumes de
efluentes,
devido
à
baixa
eficiência
operacional
e
aos
elevados
custos
(GAVRILESCU, 2004; LLOYD; LOVLEY, 2001, REMOUDAKI et al., 2003).
Métodos alternativos, como o emprego de microrganismos e plantas para a
retirada de metais de águas de rios e aterros, apresentam baixos custos e alta
eficiência e, portanto, são mais atrativos do que métodos físico-químicos (GADD,
1992; MACASKIE; DEAN, 1990; WATANABLE, 1997). O processo pelo qual
organismos vivos, normalmente plantas e microrganismos, são utilizados para
remover ou reduzir poluentes no ambiente é conhecido como biorremediação
(GAYLARDE et al., 2005).
2.3.1 Fitorremediação
A fitorremediação é definida como o uso de plantas para remover poluentes
ambientais ou detoxificá-los a subprodutos menos perigosos. Esta técnica envolve o
uso de plantas tolerantes ao poluente alvo e, no caso de metais pesados, aproveita
a habilidade natural destas plantas em absorver e concentrar estes elementos em
seus tecidos, especialmente raízes, a partir de ambientes aquáticos ou solos,
imobilizando-os e, conseqüentemente, limitando a sua difusão no ambiente
(DUSHENKOV et al., 1999; KRÄMER, 2005).
Apesar dessa técnica apresentar baixos custos, apresenta limitações como:
(i) baixos níveis de contaminantes não podem ser extraídos pelas plantas, (ii)
Revisão Bibliográfica 29
plantas não crescem em ambientes com altos níveis de contaminação, (iii) é um
processo remediador de longo prazo e (iv) há risco da planta entrar na cadeia
alimentar (DINARDI et al., 2003; SURESH; RAVISHANKAR, 2004).
Devido a essas limitações, o estudo de processos mais eficientes tem
focado o uso de microrganismos que podem ser altamente resistentes aos
contaminantes e realizar a biorremediação de forma viável e em curto prazo.
2.3.2 Biorremediação com microrganismos
A biorremediação pode se dar através de microrganismos capazes de
imobilizar metais pesados, por simples adsorção em sua superfície celular,
promovendo sua precipitação, ou por processos de formação de complexos
intracelulares (DIELS et al., 2002; VALLS; LORENZO, 2002). Uma considerável
variedade de fungos, algas e bactérias tem sido estudada e utilizada como
biosorvente para biorremediação de efluentes contendo metais pesados (GADD,
1992; MACASKIE; DEAN, 1990). Um exemplo disto é o biorreator denominado
“Sistema Meander”, capaz de remover íons Pb+2, Cu+2, Zn+2, Mn+2, Ni+2, Fe+2 e Cd+2
de efluentes contaminados, com o uso de cianobactérias e algas, com alta eficiência
(GADD; WHITE, 1993).
A interação entre microrganismos e metais pesados vem ocorrendo desde o
início da vida no planeta, há 4 bilhões de anos, o que permitiu a evolução de
sistemas biológicos de resistência permitindo a sobrevivência em ambientes
contendo elevadas concentrações de metais (SILVER; PHUNG, 2005; VALLS;
LORENZO, 2002).
Para apresentar toxicidade, os metais pesados precisam primeiramente
entrar na célula microbiana. Para tanto, duas vias de entrada existem, uma
inespecífica e outra de grande especificidade. A primeira ocorre através de um
gradiente quimiosmótico da membrana citoplasmática (transporte passivo), e a
segunda envolve hidrólise de ATP (transporte ativo) (NIES; SILVER, 1995). De
maneira geral, as proteínas envolvidas no transporte passivo de íons são expressas
constitutivamente pelas células, enquanto a expressão das proteínas de transporte
ativo é regulada.
Cátions de metais pesados divalentes, como Mn+2, Fe+2, Co+2, Ni+2, Cu+2 e
Zn+2, são estruturalmente muito similares ao Mg+2, adentrando a célula
Revisão Bibliográfica 30
passivamente, em bactérias Gram-negativas, pelo sistema de incorporação de
magnésio (MIT). Ânions como cromato (CrO4-2), se assemelham ao sulfato (SO4-2),
entrando na célula pela via de assimilação passiva de sulfato. O mesmo é válido
para os ânions arsenito (AsO4-3), que são transportados passivamente pelo sistema
de transporte de fosfato inorgânico (PIT) (NIES, 1999).
A captação de íons pela célula microbiana através do transporte ativo é
realizada principalmente por ATPases, no entanto, sistemas de transporte
específicos como HoxN, para Ni+2 e Co+2, e MerT-MerP, do operon de resistência a
mercúrio, também são utilizados pela célula (NIES, 1999).
Uma vez dentro das células, os íons de metais pesados, em concentrações
acima dos limites fisiológicos, causam diversos danos tais como, inibição da
transcrição, da tradução, da divisão celular e da atividade enzimática (Figura 1).
Lise da membrana celular
Hg+2, Pb+2, Zn+2, Ni+2, Cu+2, Cd+2
Inibição da transcrição
Hg+2
• DNA
Danos ao DNA
Hg+2, Pb+2, As+2, Cd+2
mRNA
Inibição da atividade
enzimática
Hg+2, Pb+2, Cd+2, Cu+2, Cd+2
Proteína
Inibição da tradução
Hg+2, Pb+2, Cd+2
Inibição da divisão
celular
Hg+2, Pb+2, Ni+2, Cd+2
Figura 1: Resumo das interferências mais freqüentes de íons de metais tóxicos na célula
microbiana; divisão celular e metabolismo são geralmente inibidos por metais pesados.
Modificado de Roane e Pepper (2000a).
A toxicidade dos metais pesados aliada à captação constante desses íons
pelas células, forçou o desenvolvimento de sistemas de homeostase para proteção
contra danos e manutenção da sobrevivência. Como os metais pesados não podem
ser degradados, três mecanismos de resistência se estruturaram ao longo da
evolução:
Revisão Bibliográfica 31
(i) bombas de efluxo - segundo Silver e Phung (2005) sete tipos de bombas
de efluxo são conhecidas: dois tipos de ATPases (P e ABC), três tipos de bombas
quimiosmóticas (MFS - “major facilitator superfamily”, CDF - “cátion diffusion
facilitator” e RND - “resistance-nodulation-cell division”) e 2 tipos de sistemas de
transporte quimiosmótico específicos (CHR - “cromate efflux system” e ArsB “arsenite efflux system”) (Figura 2).
Influxo
Efluxo
Figura 2: Desenho esquemático mostrando a célula bacteriana Gram-negativa e as diversas
famílias de proteínas envolvidas no transporte de metais pesados. Influxo: MIT- sistema
de transporte de metal, ATPase e ABC- transportadores dependentes de ATP, PIT+2
+2
transporte de fosfato inorgânico, HoxN- transporte específico de Ni
e Co
e
+2
MerT/MerP- transporte específico de Hg . Efluxo: RND- resistência, nodulação e divisão
celular, ATPase e ABC- transportadores dependentes de ATP, CDF- facilitador de
difusão de cátion, MFS- superfamília de facilitadores de difusão de cátion, CHR- sistema
de efluxo de cromato e ArsB- sistema de efluxo de arsenito. Basedo em Nies (1999) e
Silver e Phung (2005).
(ii) biossorção em moléculas ricas em grupamentos tióis (SH) – por este
mecanismo, ocorre a imobilização do metal, prevenindo sua toxicidade. Essas
moléculas podem ocorrer na superfície celular, como exopolímeros, ou ainda, como
moléculas semelhantes à glutationa, presentes no interior da célula (ROANE;
PEPPER, 2000a).
(iii) mudança do estado de oxidação do íon - a alteração para um estado
oxidativo menos tóxico pode ocorrer por redução, por metilação ou por formação de
complexos que resultem na precipitação de sais de metais insolúveis.
Revisão Bibliográfica 32
Devido a essa multiplicidade de mecanismos de resistência a íons de metais
pesados, tornou-se possível a utilização desses microrganismos em estratégias de
biorremediação de ambientes contendo metais pesados, pois possuem capacidade
de colonizar tais ambientes e atuarem como poderosas ferramentas biotecnológicas
em projetos de biorremediação.
2.4 Cupriavidus metallidurans CH34
Cupriavidus metallidurans CH34 é uma bactéria adaptada a ambientes
contendo altas concentrações de metais e, de fato, viceja nesse tipo de ambiente
(DIELS; MERGEAY, 1990). C. metallidurans CH34 (VANDAMME; COENYE, 2004)
[anteriormente denominada Wautersia metallidurans CH34 (VANEECHOUTTE et al.,
2004), Ralstonia metallidurans CH34 (GORIS et al., 2001), Ralstonia eutropha CH34
(YABUCCHI et al., 1995) e Alcaligenes eutrophus CH34 (MERGEAY et al., 1978)] é
uma β-proteobactéria, Gram-negativa, não patogênica, capaz de crescer em
elevadas concentrações de, pelo menos, treze diferentes íons de metais pesados
(MONCHY et al., 2006a). Esta linhagem bacteriana foi isolada em sedimentos de
tanques de decantação de zinco em Liège, Bélgica (MERGEAY et al., 1978;
MERGEAY et al., 2003) e possui alta resistência a Ag+2, Bi+3, Cd+2, Co+2, CrO4-2,
Cu+2, Hg+2, Mn+2, Ni+2, Pb+2, SeO4-3, Tl+1 e Zn+2, conferida por pelo menos 150 genes
de resistência, presentes em seus quatro replicons: o cromossomo (3,9 Mb), o
megaplasmídeo (2,6 Mb) e os dois plasmídeos pMOL30 (234 Kb) e pMOL28
(171Kb) (MERGEAY et al., 2003; MONCHY et al., 2006a; TAGHAVI et al., 1997).
O genoma deste microrganismo foi inteiramente seqüenciado pelo Joint
Genome Institute, Califórnia-USA, e os resultados estão disponíveis no banco de
dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI).
2.4.1 Genômica de C. metallidurans CH34
A análise genômica de C. metallidurans CH34 permitiu a identificação dos
genes que codificam o seu repertório protéico. Foram identificadas 6985 proteínas,
das quais, 4072 foram consideradas citoplasmáticas e 2913 transmembranares.
Comparada a outros procariotos, C. metallidurans CH34 apresenta grande
Revisão Bibliográfica 33
proporção de proteínas de membrana de todos os tipos topológicos (PAULSEN et
al., 2000; VON ROZYCKI et al., 2005).
Nesse microrganismo, foram identificadas 932 proteínas relacionadas ao
transporte, sendo que 300 estão envolvidas no transporte de compostos inorgânicos,
400 no transporte de compostos orgânicos, 102 no transporte de macromoléculas e
130 no transporte de diversos compostos (VON ROZYCKI et al., 2005).
O resumo das principais classes de proteínas de transporte envolvidas na
homeostase de metais pesados em C. metallidurans CH34 é apresentado na Tabela
2, indicando que 94 proteínas interagem com especificidade a íons de metais;
quantidade essa também, muito superior a de outros microrganismos em geral (VON
ROZYCKI et al., 2005).
Tabela 2: Principais classes de proteínas de transporte envolvidas na homeostase de metais pesados
em C. metallidurans CH34*.
Classe de
proteínas
Canais
Iônicos
Transportadores
Secundários
Transportadores
primários
Transportador
auxiliar
Transportadores
específicos
Total
Transportador**
substrato
MIT
OMF
CDF
ZIP
RND
PIT
ArsB
CHR
ABC
ATPases
MFP
Mg, Mn, Co, Ni, Fe, Al, Na
Cátions de metais pesados
Cd, Co, Zn
Zn, Fe
Íons de metais pesados
Fosfato
Arsenito
Cromato
Íons
Mg, Co, Ni, Na, H, K, Ca, Cd,
Cu, Zn, Ag
Íons de metais pesados
MerTP
PbrT
Hg
Pb
o
n de membros
em CH34
4
28
3
1
12
1
1
4
2
8
25
3
2
94
*Baseado em Von Rozycki et al. (2005) e Nies et al., (2006).
**MIT – Transporte de íon metálico, OMF – Fator de membrana externa (porina), CDF- facilitador de difusão de cátion,
ZIP – permease de zinco, RND – resistência, nodulação e divisão celular, PIT – transportador de fosfato inorgânico,
ArsB – transportador de arsenito e antimônio, CHR – transportador de cromato, ABC e ATPase – transportadores
dependentes de ATP, MFP – proteína de fusão em membrana e MerTP e PbrT – transportadores específicos de Hg+2
e Pb+2.
A estruturação da rede de detoxificação que permitiu a alta resistência a
íons metálicos em C. metallidurans CH34, deveu-se à transferência gênica
horizontal e à atividade de elementos transponíveis (ISs) (TAGHAVI et al., 1997,
Revisão Bibliográfica 34
VON ROZYCKI et al., 2005). O genoma da C. metallidurans CH34 é rico em ISs (48
ISs identificados), assim como em transposons da família Tn3 e Tn21 (DONG et al.,
1992; MERGEAY et al., 2003; TAGHAVI et al., 1997; MONCHY et al., 2004).
Outro sistema, que conferiu uma vantagem evolutiva a C. metallidurans
CH34, é a existência do mecanismo parA e parB, pelo qual essa bactéria conserva
os dois plasmídeos ricos em genes de resistência, pMOL30 e pMOL28, garantindo
estabilidade segregacional e a sobrevivência em ambientes contendo metais
(TAGHAVI et al., 1996; VON ROZYCKI et al., 2005).
Por fim, a análise genômica permitiu a identificação de 17 possíveis
proteínas com similaridade a fatores sigma. Em Escherichia coli, por exemplo,
apenas sete fatores sigma estão disponíveis para a ligação com o núcleo da RNApolimerase e controle do início da transcrição nas diferentes fases da vida da célula.
O alto número de fatores sigma indica que C. metallidurans CH34 deva possuir uma
grande complexidade na regulação da expressão de suas proteínas (NIES, 2004).
2.4.2 Metabolismo de C. metallidurans CH34
C. metallidurans CH34 é uma bactéria mesofílica, quimiolitotrófica
facultativa, capaz de crescer autotroficamente em meio mineral e em diferentes
concentrações de H2, O2 e CO2. Apresenta crescimento heterotrófico em uma
variedade de compostos orgânicos como gluconato, succinato, malato, lactato,
piruvato, acetato, hexanoato, benzoato, formato, glicerol, n-butanol, n-propanol,
fenol, histidina, treonina, triptofano, prolina, glicina, entre outros. No entanto, não é
capaz de assimilar CO, CH4, glicose, frutose e outros açúcares; além disso, sob
restrição de N2, acumula mais de 15% do seu peso em poli-3-hidroxibutanoato (PHB)
(MERGEAY et al., 1985; STEINBǛCHEL et al., 1983).
Análises genômicas mostraram que essa bactéria possui 41 sistemas de
transporte específicos para carboidratos e 110 sistemas de transporte específicos
para aminoácidos, sugerindo que o metabolismo de aminoácidos pode ser mais
importante do que o de carboidratos para o crescimento heterotrófico (VON
ROZYCKI et al., 2005).
Revisão Bibliográfica 35
2.4.3 Mecanismos de resistência de C. metallidurans CH34
As
concentrações
de
metais
pesados
no
ambiente
natural
de
C. metallidurans CH34 excedem em muito os valores considerados letais para a
maioria dos microrganismos (VON ROZYCKI et al., 2005). Por exemplo, o tanque de
decantação de zinco, onde esta bactéria foi isolada, continha 70 mM de Zn+2, 0,3
mM de Cd+2 e 1,5 mM de Cu+2 (MERGEAY et al., 1978).
O fato dos sistemas de transporte de vários metais pesados serem mais
estudados e caracterizados nessa bactéria do que em qualquer outra, confere a
C. metallidurans CH34 a condição de organismo modelo para pesquisas de
resistência a metais e homeostase (VON ROZYCKI et al., 2005; NIES et al., 2006).
O inventário dos genes de resistência a metais pesados em C. metallidurans
CH34 está resumido na Figura 3.
O plasmídeo pMOL30 possui 5 operons de resistência a metais: (i) czc relacionado à resistência a Cd+2, Zn+2 e Co+2, (ii) pbr - relacionado à resistência a
Pb+2, (iii) cop - relacionado à resistência a Cu+2, (iv) mer - relacionado à resistência
a Hg+2, (v) sil - relacionado à resistência a Ag+. Além desses operons, este
plasmídeo contém o gene de uma ATPase (czcP) e dois agrupamentos não
funcionais (merRTP e cnrCBnccAnreB).
O plasmídeo pMOL28 possui 3 operons de resistência a metais: (i) cnr relacionado à resistência a Co+2 e Ni+2, (ii) mer - relacionado à resistência a Hg+2 e
(iii) chr - relacionado à resistência a CrO4-2.
O megaplasmídeo, por sua vez, possui o gene de uma ATPase - zntA relacionada à resistência a Cd+2, Zn+2, Bi+2 e Tl+, um sistema RND de resistência a
Ag+ e Cu+2, além de parte do operon cop de resistência a Cu+2.
O cromossomo possui uma multiplicidade de genes de resistência a metais,
tais como ATPases (CadA, CupA, ArsBC), sistemas RND (CzcCBA), CDF (DmeF e
FieF), CHR e redutase de mercúrio.
Até recentemente, se sabia que os operons de resistência a metais se
expressavam devido à indução específica por determinado íon. No entanto, Monchy
et al. (2007) sugeriram que em C. metallidurans CH34, além dessa resposta
específica, há uma resposta múltipla dos vários operons, mesmo quando apenas um
íon está presente, o que permite uma defesa celular mais ampla. Segundo
Zoropogui et al. (2008), este tipo de resposta em C. metallidurans CH34 pode estar
Revisão Bibliográfica 36
relacionada às condições ambientais onde um tipo de íon está associado a outro em
ambientes contendo múltiplos metais.
Além desses sistemas, podem existir em C. metallidurans CH34 outras
formas de resistência, relacionadas com moléculas quelantes de metais como a
glutationa e sideróforos que, no entanto, não estão exploradas (GILIS et al., 1998).
Nos próximos itens deste trabalho, serão realizadas as descrições de cada
operon de resistência a metais e, em seguida, o “estado da arte” dos mecanismos
de resistência para cada íon de metal pesado em C. metallidurans CH34.
Revisão Bibliográfica 37
Figura 3: Inventário dos genes de resistência a metais pesados presentes nos quatro replicons de
C. metallidurans CH34. Coluna 1: localização do agrupamento gênico: pMOL30, pMOL28,
cromossomo e megaplasmídeo; Coluna 2: genes envolvidos na resistência a íons de metais
pesados: flechas verdes – RND, flechas laranjas – ATPases, flechas azuis – genes regulatórios,
flechas brancas- genes desconhecidos, flechas marrom – CDF, flechas vermelhas: oxidase, flechas
amarelas: redutase (merA) e transporte de cromato (ChrA); Coluna 3: Resistência aos íons de
metais pesados codificados por cada grupamento gênico e Coluna 4: Família das proteínas
envolvidas no efluxo de íons de metais pesados. Flechas indicam a direção da transcrição dos
+2
+2
+2
+2
+2
+2
genes. *Genes que mostraram expressão quando induzidos por Ag , Cd , Co , Cu , Ni e Zn .
Baseado em Borremans et al., 2001; Mergeay et al., 2003; Legatzki et al., 2003a; Munkelt et al.,
2004; Von Rozycki et al., 2005; Nies et al., 2006; Monchy et al., 2006 a,b.
Revisão Bibliográfica 38
2.4.4 Operon czc de C. metallidurans CH34
No plasmídeo pMOL30 de C. metallidurans CH34, há uma cópia do operon
czc. Além disso, sete diferentes arranjos gênicos desse operon são encontrados no
cromossomo, mas, apenas três mostraram ser funcionais (NIES et al., 2006)
(Figura 3).
Este operon é constituído pelos genes estruturais czcC, czcB e czcA, cujos
produtos protéicos formam uma bomba de efluxo que transporta os íons Co+2, Zn+2 e
Cd+2 para o exterior da célula. A montante dos genes czcCBA, encontram-se os
genes czcN e czcI, que codificam proteínas com funções desconhecidas e, a
jusante, uma região composta pelos genes czcD, czcR, czcS e czcE, que estão
envolvidos na regulação do operon (Figura 4) (GROßE et al., 1999, 2004; NIES;
BROWN, 1997). A jusante das regiões czcCBA e czcDRS, há um terminador de
transcrição intrínseco (alça) envolvido no mecanismo de controle da expressão
gênica desse operon (GROßE et al., 1999, 2004; VAN DER LELIE et al., 1997).
Figura 4: Representação esquemática do operon czc de C. metallidurans CH34. Os promotores
do operon são indicados por .
A transcrição do operon czc está sob o comando das regiões promotoras
czcNp, czcIp, czcCp, czcDp e czcEp. Em baixas concentrações de íons de metais, o
promotor czcNp está inativo e ocorre um nível basal de expressão de czcCBA e
czcDRSE, sob o comando dos promotores czcIp, czcCp, czcDp e czcEp (GROßE et
al., 2004). Quando as concentrações de Co+2, Zn+2 ou Cd+2 atingem limites tóxicos à
célula, a expressão da bomba de efluxo czcCBA é induzida a partir do promotor
czcNp e, nesse caso, os promotores czcIp, czcCp e czcDp estão inativos.
A indução da expressão de czcCBA por Co+2, Zn+2 e Cd+2 deve-se à
atuação da proteína CzcR, que funciona como um ativador de transcrição, atuando
unicamente na região promotora czcNp (GROßE et al., 2004). A atuação de CzcR é
controlada pela histidina quinase CzcS e pela proteína CzcE, que, juntas, detectam
metal no espaço periplasmático de C. metallidurans CH34. A função de CzcE é
Revisão Bibliográfica 39
controlar a fosforilação de CzcS somente quando os níveis de metais atingem um
limite crítico, dessa forma, permitindo que concentrações basais de íons essenciais
sejam mantidas na célula e, acima desses limites a proteína sensora CzcS altera a
conformação da proteína CzcR, induzindo a expressão da bomba de efluxo (ANTON
et al., 1999; GROßE et al., 1999, 2004).
Segundo Legatzki et al. (2003b), a bactéria C. metallidurans CH34 cultivada
na ausência de metais mantêm 2.300 moléculas da proteína CzcA por célula. O
cultivo desta bactéria na presença de Co+2 mostrou que o número de moléculas de
CzcA passou para 5.700 moléculas por célula; quando o Zn+2 foi utilizado, a célula
chegou a apresentar 23.400 moléculas da proteína CzcA e na presença de Cd+2 a
célula apresentou 14.500 moléculas da proteína CzcA.
A transcrição dos genes czcDRS está sob o comando do promotor czcDp, o
qual está localizado a montante da alça de terminação e, devido a esse fato, quando
os genes czcCBA estão sendo fortemente transcritos, a seqüência promotora czcDp
está bloqueada, impedindo a expressão de czcDRS (VAN DER LELIE et al., 1997;
NIES; BROWN, 1997).
2.4.5 Resistência a cádmio (Cd+2) e zinco (Zn+2) em C. metallidurans CH34
O Zn+2 é um elemento essencial tanto para células eucarióticas, quanto para
as procarióticas, sendo um co-fator de muitas DNA e RNA polimerases; é essencial
para atividade enzimática de muitas proteínas e, embora seja essencial em
concentrações nanomolares, é tóxico em altas concentrações. O metal pesado Cd+2
não é um elemento essencial para células microbianas e, de fato, apresenta alta
toxicidade em bactérias (NIES, 1992). C. metallidurans CH34 apresenta alta
resistência a esses dois metais tóxicos devido à atuação de vários sistemas de
efluxo, que garantem que a concentração citoplasmática não atinja valores que
causem danos à célula (GROßE et al., 2004).
Até o momento, sabe-se que há sete diferentes bombas de efluxo de Cd+2 e
Zn+2 em C. metallidurans CH34: (i) uma CzcCBA, (ii) três facilitadores de difusão de
cátion (CDF): CzcD, DmeF e FieF e (iii) três ATPases: CzcP, CadA e ZntA.
Revisão Bibliográfica 40
Em C. metallidurans CH34, a bomba de efluxo CzcCBA e a proteína CzcD
apresentam expressão constitutiva basal quando em baixa concentração de íons, no
entanto, CzcCBA é fortemente expressa na presença de indutores. As proteínas
DmeF e FieF, cujos genes estão localizados no cromossomo, são expressas
constitutivamente nessa bactéria e realizam efluxo de um amplo espectro de íons
divalentes, inclusive Cd+2 e Zn+2 (MUNKELT et al., 2004).
A expressão dos genes das ATPases CadA e ZntA é controlada por
repressores específicos, que, na presença de Zn+2 ou Cd+2, são deslocados do
promotor permitindo que as ATPases sejam expressas, realizando o efluxo desses
íons para o periplasma da célula (LEGATZKI et al., 2003a). O gene da ATPase czcP
também tem como substratos os íons Zn+2 e Cd+2, no entanto ainda não se sabe o
mecanismo de regulação, o qual pode estar envolvido com czcRS (MONCHY et al.,
2006a).
Dessa forma, quando a concentração de íons de metais pesados aumenta o
suficiente para escapar dos sistemas de efluxo constitutivos, ocorre a indução da
expressão de CzcCBA e das ATPases que bombeiam os íons do citoplasma e do
periplasma para o meio exterior.
Portanto, em baixas concentrações de íons Zn+2 e Cd+2, C. metallidurans
CH34 regula sua homeostase com CzcCBA, CzcD, DmeF e FieF e, em altas
concentrações, pelo aumento da expressão de CzcCBA, por CzcD, DmeF, FieF,
CadA, ZntA e CzcP, que, juntos formam um eficaz sistema de efluxo desses íons
(Figura 5).
Apesar de CzcD ser uma bomba de efluxo com amplo espectro de íons, não
promove o efluxo do íon Cd+2 (ANTON et al., 2004) que, por sua vez, é transportado
com grande especificidade pela ATPase CadA.
Além desses sistemas, também se tem relatado a capacidade de sideróforos
em interagir com íons Cd+2, afetando a biodisponibilidade desse íon e protegendo a
célula de sua toxicidade (GILIS et al., 1998).
Revisão Bibliográfica 41
+2
+2
Figura 5: Representação esquemática dos sistemas de resistência a Zn e Cd em
C. metallidurans CH34. A parte inferior da figura mostra os genes do operon czc, das
ATPases, proteínas CDF e suas regiões promotoras (►). A localização desses genes
nos replicons está indicada. A parte superior da figura mostra a possível localização
das proteínas na parede celular. Íons de metal pesado (•) são transportados para
dentro da célula pelos sistemas de transporte passivo e ativo. O bombeamento para o
exterior da célula é feito pelo sistema de efluxo CzcCBA, por ATPases e pelas
proteínas CDF. Ilustração baseada em Nies (2000), GroBe et al. (2004) e Silver e
Phung, (2005).
2.4.6 Operon cnr de C. metallidurans CH34
O operon cnr de C. metallidurans CH34 está presente no plasmídeo
pMOL28 e é constituído pelos genes estruturais cnrC, cnrB e cnrA, codificando
proteínas que formam uma bomba de efluxo que transporta íons Co+2 e Ni+2 para o
exterior da célula, apresentando alta homologia ao operon czc. A montante da região
estrutural encontram-se os genes reguladores cnrY, cnrX e cnrH (GRASS et al.,
2000; TIBAZARWA et al., 2000) (Figura 6).
Figura 6: Representação esquemática do operon cnr de C. metallidurans CH34. Os promotores do
operon são indicados por .
Esse operon é expresso somente em altas concentrações de níquel e a
transcrição é iniciada em duas regiões promotoras, cnrYp e cnrCp, resultando em
Revisão Bibliográfica 42
dois transcritos tricistrônicos (cnrYXH, cnrCBA) e, talvez em um hexacistrônico
(cnrYXHCBA) (GRASS et al., 2000; GRASS et al., 2005).
A proteína CnrH é um fator sigma que confere especificidade à
RNApolimerase em reconhecer as regiões promotoras cnrYp e cnrCp. A
disponibilidade de CnrH na célula é controlada pelas proteínas CnrX e CnrY, que,
juntas, formam um complexo que regula a expressão de cnrCBA. A proteína CnrX é
um sensor periplasmático de Ni+2 que interage com a proteína de membrana CnrY,
que é um fator anti-sigma de CnrH (GRASS et al., 2000; GRASS et al., 2005; NIES,
2004; TIBAZARWA et al., 2000).
2.4.7 Resistência a níquel (Ni+2) em C. metallidurans CH34
O Ni+2 é um elemento essencial para células em baixas concentrações,
sendo co-fator de muitas enzimas como as hidrogenases, chaperonas, ureases e
desidrogenases, no entanto, apresenta toxicidade em concentrações altas (NIES,
1999). C. metallidurans CH34 apresenta alta resistência a esse metal graças às
bombas de efluxo CzcD, DmeF e FieF e CnrCBA (Figura 7).
Em baixas concentrações de Ni+2, C. metallidurans CH34 realiza sua
homeostase através das bombas CzcD, DmeF e FieF, de expressão constitutiva. Por
outro lado, altas concentrações de Ni+2 são detectadas no espaço periplasmático
pela proteína sensora de Ni+2 CnrX, fato este que altera a conformação do complexo
protéico
CnrX-CnrY,
causando
a
liberação
do
fator
sigma
CnrH
e,
conseqüentemente, a indução da expressão da bomba de efluxo CnrCBA, que é
capaz de realizar o efluxo desse íon tanto do citoplasma quanto do periplasma
(GRASS et al., 2005).
Revisão Bibliográfica 43
+2
Figura 7: Representação esquemática dos sistemas de resistência a Ni em C. metallidurans CH34.
A parte inferior da figura mostra os genes do operon cnr, das proteínas CDF e suas regiões
promotoras (►). A localização desses genes nos replicons está indicada. A parte superior
da figura mostra a possível localização das proteínas codificadas pelo operon cnr na
parede celular. Íons de metal pesado (•) são transportados para dentro da célula pelos
sistemas de transporte passivo e ativo. O bombeamento para o exterior da célula é feito
pelo sistema de efluxo CnrCBA e pelas proteínas CDF. Ilustração baseada em Nies (2000),
GroBe et al. (2004) e Silver e Phung, (2005).
2.4.8 Resistência a cobalto (Co+2) em C. metallidurans CH34
O Co+2 é um elemento essencial para células em baixas concentrações,
sendo co-fator da vitamina B12 e hidratases, apresentando, no entanto, toxicidade
quando presente em altas concentrações (NIES, 1999). Assim como para os íons
Ni+2, Zn+2 e Cd+2, a resistência ao Co+2 em C. metallidurans CH34 também se deve
ao efluxo realizado pelas bombas cnrCBA, czcCBA, CzcD, DmeF e FieF (Figura 8).
As bombas de efluxo CzcD, DmeF e FieF desempenham um papel
fundamental na homeostase desse íon em C. metallidurans CH34. Segundo Munkelt
et al. (2004), a proteína DmeF é essencial para o efluxo de íons Co+2
citoplasmáticos, uma vez que as bombas CnrCBA e CzcCBA são capazes de
realizar o efluxo desse íon apenas a partir do periplasma.
Dessa forma, a concentração citoplasmática de íons Co+2 é regulada, por
DmeF e, em menor proporção, por Fief e CzcD e, a partir do periplasma para o meio
exterior através das bombas de efluxo codificadas nos operons czc e cnr.
Revisão Bibliográfica 44
+2
Figura 8: Representação esquemática dos sistemas de resistência a Co em C. metallidurans
CH34. A parte inferior da figura mostra os genes dos operons cnr (pMOL28) e czc
(pMOL30 e cromossomo), das proteínas CDF e suas regiões promotoras (►). A parte
superior da figura mostra a possível localização das proteínas na parede celular. Íons de
metal pesado (•) são transportados para dentro da célula pelos sistemas de transporte
passivo e ativo. O bombeamento periplasmático para o exterior da célula é feito pelas
bombas de efluxo CnrCBA e CnrCBA. O bombeamento do citoplasma para o periplasma
da célula é feito pelas proteínas CzcD, DmeF e FieF. Ilustração baseada em Nies
(2000), GroBe et al. (2004) e Silver e Phung, (2005).
2.4.9 Operon chr de resistência a cromato (CrO4-2) em C. metallidurans CH34
Em microrganismos, o cromato é um elemento tóxico, pois induz a formação
de radicais livres que interferem no metabolismo celular (NIES, 1999).
A bactéria C. metallidurans CH34 apresenta resistência a cromato devido à
atuação do operon chr. O cromato entra na célula pela via de assimilação de sulfato
devido à semelhança entre os ânions SO4-2 e CrO4-2. Em altas concentrações de
SO4-2, a entrada de cromato na célula é inibida, no entanto, quando existe restrição
de sulfato e presença de cromato, a bactéria tende a aumentar o mecanismo de
captação de sulfato, causando o aumento dos níveis de cromato no citoplasma.
O operon chr está no plasmídeo pMOL28 de C. metallidurans CH34 e é
constituído por seis genes de resistência. Além disso, no cromossomo da bactéria,
encontram-se também os genes chrB2, chrA2 e chrF2 com grande homologia aos
correlatos plasmidiais (Figura 9) (JUHNKE et al., 2002).
Revisão Bibliográfica 45
Figura 9: Representação esquemática do operon chr do pMOL28 de C. metallidurans CH34. Os
promotores do operon são indicados por .
A regulação desse operon ainda não está totalmente elucidada e, pelo que
se sabe, a transcrição se inicia em quatro regiões promotoras: chrIp, chrBp, chrAp e
chrCp (Figura 9), sendo que o promotor chrAp é considerado constitutivo (JUHNKE
et al., 2002).
As proteínas de membrana interna ChrA e ChrB são, respectivamente, uma
bomba de efluxo de cromato e um ativador de transcrição do operon chr plasmidial.
Por sua vez, as proteínas ChrF e ChrI constituem repressores do operon chr,
ligando-se na região operadora-promotora de chrBp. A proteína ChrC é uma
superóxido dismutase (SOD), que protege as células da atividade de peróxido de
hidrogênio e radicais aniônicos (O2-) gerados pelo cromato. ChrE é uma enzima que
tem como função romper interações entre cromato e glutationa, permitindo o efluxo
do íon para fora do citoplasma (JUHNKE et al., 2002; MERGEAY et al., 2003;
ROUX; COVÉS, 2002).
Em baixas concentrações de cromato, somente os genes cromossomais
são expressos, embora não se conheça ainda o mecanismo de regulação. Nessa
situação, o efluxo de CrO4-2 é realizado pela bomba ChrA2 e, em menor proporção,
por ChrA1 expressa constitutivamente.
Em altas concentrações de cromato, a proteína ChrB2 ativa o promotor
chrBp do operon chr do pMOL28, liberando o repressor ChrF e ChrI, permitindo a
expressão da bomba de efluxo ChrA1 e das proteínas ChrC e ChrE (Figura 10)
(JUHNKE et al., 2002). Nessa situação, as proteínas ChrF1 e ChrI também são
expressas e, no momento em que o citoplasma esteja detoxificado, se ligam
novamente em chrBp, travando a expressão do operon chr plasmidial.
Revisão Bibliográfica 46
-2
Figura 10: Representação esquemática dos sistemas de resistência a CrO4 em C. metallidurans
CH34. A parte inferior da figura mostra os genes cromossomais e plasmidiais do
operon chr e suas regiões promotoras (►). A parte superior da figura mostra a possível
localização das proteínas na parede celular. Íons de metal pesado (•) são
transportados para dentro da célula pelos sistemas de transporte passivo e ativo. O
bombeamento citoplasmático para o exterior da célula é feito por ChrA, no entanto, não
se sabe qual o mecanismo é responsável por transportar o íons para o exterior da
célula. Ilustração baseada em Juhnke et al. (2002) e Nies e Silver, (1995).
2.4.10 Operon pbr de resistência a chumbo (Pb+2) de C. metallidurans CH34
O elemento chumbo não é essencial aos organismos vivos, sendo tóxico
mesmo em baixas concentrações (NIES, 1999). Geralmente, a resistência
bacteriana a esse íon é devida à atuação de ATPases, no entanto, em
C. metallidurans CH34, foi encontrado o primeiro operon de resistência bacteriano
específico para Pb+2 (BORREMANS et al., 2001; RENSING et al., 1998).
Em C. metallidurans CH34, o operon pbr está presente no plasmídeo
pMOL30 e é constituído por seis genes que promovem a resistência a chumbo
(Figura 11).
Revisão Bibliográfica 47
Figura 11: Representação esquemática do operon pbr do pMOL30 de C. metallidurans CH34. O
promotor do operon é indicado por .
A expressão desse operon é induzida na presença de Pb+2 a partir de um
promotor-operador divergente, localizado entre os genes pbrA e pbrR.
A proteína PbrT apresenta alta especificidade por Pb+2 e é responsável pela
captura desse íon no espaço periplasmático e transporte para o citoplasma da
bactéria. Essa captação específica está relacionada à redução de íons livre de Pb+2
no periplasma, os quais podem interagir com componentes de membrana e
proteínas periplasmáticas causando danos celulares. A proteína PbrR é um
repressor do operon pbr, controlando a expressão do operon a partir da região
promotora-operadora divergente (BORREMANS et al., 2001; DIELS et al., 1989;
NIES, 1999).
A resistência a Pb+2 deve-se ao efluxo desse íon pela ATPase PbrA; no
entanto, íons que escapam desse efluxo se ligam à proteína PbrD que funciona
como uma chaperona para Pb+2. A proteína PbrB, que pertence a uma nova família
de proteínas auxiliares de transporte de íons, promove a transferência de íon Pb+2
do periplasma para o exterior da bactéria, no entanto, é dependente da proteína
PbrC, que realiza o processamento de PbrB, permitindo sua passagem ao espaço
periplasmático (BORREMANS et al., 2001) (Figura 12).
Portanto, na presença de íons Pb+2, o repressor PbrR é deslocado do
promotor-operador, permitindo a expressão do operon pbr e conferindo a
C. metallidurans CH34 alta resistência a esse íon tóxico.
Revisão Bibliográfica 48
+2
Figura 12: Representação esquemática do sistema de resistência a Pb em C. metallidurans CH34.
A parte inferior da figura mostra os genes do operon pbr, a região promotor-operador no
pMOL30. As flechas indicam o sentido de transcrição dos genes. A parte superior da
figura mostra a possível localização das proteínas na parede celular. Íons de metal
pesado (•) são transportados para dentro da célula pela proteína PbrT. O bombeamento
citoplasmático para o exterior da célula é feito por PbrA. Ilustração modificada de
Borremans et al. (2001).
2.4.11 Operon mer de resistência a mercúrio (Hg+2) de C. metallidurans CH34
Assim como o chumbo, o mercúrio é um metal pesado altamente tóxico para
os organismos em geral, e operons de resistência a Hg+2 são freqüentemente
encontrados nos genomas microbianos (NIES, 1999; SILVER; PHUNG, 2005).
O operon mer de C. metallidurans CH34 está presente no cromossomo e
nos plasmídeos pMOL28 e pMOL30 (Figura 13). No plasmídeo pMOL30, o operon
mer é composto pelos genes merR, merT, merP, merA, merD e merE;
adicionalmente esse plasmídeo carrega também uma região com genes merPTR,
que não são funcionais (MERGEAY et al., 2003). O operon mer do plasmídeo
pMOL28 apresenta grande homologia e a mesma disposição dos genes do operon
mer do plasmídeo pMOL30 (CHAMPIER et al., 2004; DIELS et al., 1985).
cromossomo, o operon é composto pelos genes merR, merT, merP e merA.
No
Revisão Bibliográfica 49
Figura 13: Representação esquemática do operon mer do pMOL30 e pMOL28 de C. metallidurans
CH34. O promotor do operon é indicado por .
O mecanismo de resistência bacteriano a mercúrio resulta da redução de
Hg+2 a mercúrio metálico (Hg0), que é um elemento volátil, capaz de se difundir
passivamente para o exterior da célula (SILVER, PHUNG, 2005).
O gene merP codifica uma proteína periplasmática (MerP), capaz de se ligar
especificamente a íons Hg+2 e transportá-los à proteína de membrana MerT, que,
por sua vez, transfere o íon Hg+2 diretamente à redutase de mercúrio MerA (Figura
14) (CHAMPIER et al., 2004; ROSSY et al., 2004).
A regulação da expressão desse operon é realizada pelas proteínas MerR e
MerD. MerD não se liga a DNA, mas interage com o complexo MerR-promotoroperador, sendo um co-regulador da indução do operon. Na falta de íons Hg+2,
forma-se um complexo ternário entre MerR, MerD e a região do promotor-operador,
reprimindo a expressão dos genes do operon. Na presença de Hg+2, MerR liga-se a
esse íon e é deslocado da região do promotor-operador pela ação de MerD, o que
permite a expressão dos genes do operon. No entanto, a falta do gene merD não
impede a expressão dos genes de resistência desse operon (CHAMPIER et al.,
2004). A proteína MerE, por sua vez, não tem função conhecida (SILVER, PHUNG,
2005).
Revisão Bibliográfica 50
+2
Figura 14: Representação esquemática do sistema de resistência a Hg em C. metallidurans
CH34. A parte inferior da figura mostra os genes do operon mer, a região promotoroperador (O/P) (pMOL28, pMOL30) e o operon da região cromossomal. As flechas em
sentido contrário indicam o sentido de transcrição dos genes. A parte superior da figura
mostra a possível localização das proteínas na parede celular. Íons de metal pesado (•)
são transportados para dentro da célula pelas proteínas MerP/MerT. MerA reduz íons de
+2
0
0
Hg a Hg utilizando NADPH. Hg é volátil e difunde-se para o meio exterior da célula.
Ilustração baseada em Silver e Phung, (2005).
2.4.12 Operon cop de resistência a cobre (Cu+1/Cu+2) de C. metallidurans CH34
O cobre é um elemento essencial à vida em baixas concentrações e muito
tóxico em altas concentrações (NIES, 1999; MONCHY et al., 2006b). Altas
concentrações de cobre são freqüentemente encontradas em áreas industriais e em
resíduos
de
mineração,
ambientes
esses
comumente
colonizados
por
C. metallidurans CH34 (DIELS; MERGEAY, 1990).
Em C. metallidurans CH34, genes que codificam proteínas de resistência a
íons cobre estão presentes no plasmídeo pMOL30, no cromossomo e no
megaplasmídeo. O mecanismo exato da resistência ainda não é conhecido em sua
Revisão Bibliográfica 51
integralidade, mas parte do mecanismo já foi elucidada (MERGEAY et al., 2003;
MONCHY et al., 2006b; RENSING; GRASS, 2003).
O operon cop presente no plasmídeo pMOL30 é composto por 19 genes
altamente especializados na resposta a altas concentrações de cobre, possuindo
genes envolvidos na detoxificação tanto periplasmática, quanto citoplasmática
(Figura 15) (MONCHY et al., 2006b).
Figura 15: Representação esquemática do operon cop do pMOL30 de C. metallidurans CH34. Os
promotores do operon são indicados por .
As proteínas codificadas pelos genes copV, copM, copN, copQ e copE não
apresentam equivalentes nos bancos de dados existentes e nenhuma função
possível pôde ser designada a elas. O gene copT apresenta grande homologia com
o gene pbrT (do operon de Pb+2) e, provavelmente, está envolvido no transporte dos
íons Cu+2/Cu+1 do periplasma para o citoplasma da bactéria (MONCHY et al.,
2006b).
O mecanismo básico de resistência a cobre, comum a várias bactérias, é
composto pelos genes copSRcopABCD; os genes copS e copR codificam uma
histidina quinase e um regulador de resposta, respectivamente, que controlam a
expressão dos genes copABCD. A proteína periplasmática CopA tem como função
oxidar íons Cu+1 para a espécie menos reativa, Cu+2. As proteínas CopB e CopC
estão envolvidas na ligação de íons livres Cu+1/Cu+2 no periplasma. CopD forma um
canal na membrana interna, permitindo o transporte de íons Cu+2 para o citoplasma
(MONCHY et al., 2006b; RENSING; GRASS, 2003).
As proteínas CopH, CopI, CopK, CopG e CopJ apresentam sítios de ligação
de íons cobre e, provavelmente, ligam-se a íons livres no periplasma (CopH, CopK,
CopI) e no citoplasma (CopG, CopJ), prevenindo a sua toxicidade.
O principal mecanismo de detoxificação citoplasmática do operon cop é feito
pela ATPase CopF, que é responsável pelo efluxo de íons Cu+1 para o periplasma e
Revisão Bibliográfica 52
sua expressão é controlada por CopL, que é um repressor do tipo merR (MONCHY
et al., 2006b).
Além do operon cop, C. metallidurans CH34 apresenta o gene de uma
ATPase de cobre no cromossomo (cupA), cuja expressão é regulada pela proteína
repressora CupR, além disso, há também os genes da bomba de efluxo de cobre
CusCBA, que realiza o efluxo dos íons periplasmáticos para o exterior da célula
(Figura 16) (MERGEAY et al., 2003; RENSING; GRASS, 2003).
O sistema de dois componentes CopRS monitora a concentração
periplasmática dos íons cobre e controla a transcrição dos genes copABCD. Em
altas concentrações citoplasmáticas, os íons de cobre se ligam aos repressores
CopL e CupR, permitindo a expressão das ATPases CopF e CupA, que realizam o
efluxo do cobre (MERGEAY et al., 2003).
Figura
16:
+2
+1
Representação esquemática do sistema de resistência a Cu /Cu
em
C. metallidurans CH34. A parte inferior da figura mostra os genes do operon cop
(pMOL30, megaplasmídeo), da APTase cupA (cromossomo), do cusCBA
(megaplasmídeo) e a região do promotor (►) conhecidos. A parte superior da figura
mostra a possível localização das proteínas na parede celular. Íons de metal pesado
(•) são transportados para dentro da célula pela proteína CopT. CopABCD formam o
sistema de proteção periplasmática a íons cobre, cuja expressão é regulada por
CopRS. CopJ e CopG pretejem o citoplasma do excesso de íons cobre. CopF e CupA
realizam o efluxo de íons citoplasmáticos com gasto de ATP e são regulados por CopL
e CupR, respectivamente. copV, copM, copN, copQ, copE, copK e copH ainda não
apresentam função definida. Ilustração baseada em Monchy et al. (2006) e Rensing;
Grass, (2003).
Revisão Bibliográfica 53
2.4.13 Outras resistências a metais pesados em C. metallidurans CH34
Estão relatadas na literatura resistências de C. metallidurans CH34 a
arsenito (AsO4-3), bismuto (Bi+3), gadolínio (Gd+3), ouro (Au+), prata (Ag+), selenito
(SeO3-2), tálio (Tl+) e urânio (U+2), no entanto, a maioria dos mecanismos ainda não
está totalmente elucidado.
O que se sabe até o momento é que a resistência dessa bactéria ao íon Bi+3
está relacionada com o efluxo realizado pela ATPase ZntA (MONCHY et al., 2006a);
quanto ao íon Ag+, a resistência é devida ao efluxo das bombas CzcCsilBC e
CusCBA, e através da ATPase CupA (MERGEAY et al., 2003; LEDRICH et al.,
2005). A resistência ao íon Tl+1, está relacionada com as ATPases CadA, ZntA e
PbrA (MONCHY et al., 2006a; SILVER; PHUNG, 2005) e a resistência ao íon AsO4-3,
apesar de não comprovada, é sugerida devido à presença do operon ars no
cromossomo (MERGEAY et al., 2003).
No caso dos íons Gd+3 e Au+, ambos de alto valor comercial,
C. metallidurans CH34 é capaz de resistir a altas concentrações devido à
precipitação intracelular desses íons, o que previne a sua toxicidade (ANDRÉS et
al., 2000; REITH et al., 2006). Cabe ressaltar ainda que C. metallidurans CH34 foi
capaz de precipitar 6 µM de Au+ por bactéria, mostrando ser uma boa lixiviadora
para esse metal precioso, no entanto, essa capacidade ainda não está explorada em
toda a sua extensão (REITH et al., 2006).
Para o íon SeO3-2 o mecanismo de resistência foi elucidado e é realizado
através da redução de SeO3-2 ao elemento selênio (Se0), altamente insolúvel e não
tóxico, e a posterior ligação desse Se0 a uma L-metionina que se acumula no interior
da célula (AVOSCAN et al., 2006; ROUX et al., 2001; SARRET et al., 2005).
Devido a essa capacidade de bioacúmulo de Au+, Gd+3 e SeO3-2,
C. metallidurans CH34 também é uma boa candidata em processos de recuperação
desses elementos seja para fins de biorremediação, seja para projetos que visem
recuperar esses elementos diretamente do seus locais de ocorrência.
Recentemente, foi relatada também alta resistência de C. metallidurans
CH34 a urânio, trazendo perspectivas de utilização dessa bactéria em projetos de
remediação de radionuclídeos (AVOSCAN et al., 2007).
Revisão Bibliográfica 54
Com exceção dos íons Au+, Gd+3 e SeO3-2, que são precipitados
intracelularmente, a fantástica rede de proteção celular apresentada pela bactéria
C. metallidurans CH34, detoxifica o seu citoplasma, mas não o ambiente (NIES,
2000). Portanto, essa bactéria naturalmente não está pronta para ser empregada em
estratégias de biorremediação de ambientes contendo íons de metais pesados e
precisou ser melhorada para este fim.
Até o momento, a maior parte dos trabalhos de biorremediação de
ambientes contaminados por metais pesados envolveu a manipulação genética de
bactérias não adaptadas a locais que apresentam altas concentrações de metais
pesados tóxicos. Há, portanto, um caminho não explorado para busca e
melhoramento genético de agentes biológicos satisfatórios para biorremediação, que
sejam resistentes a essas contaminações como é o caso de C. metallidurans CH34.
Considerando que C. metallidurans CH34 coloniza ambientes contendo
metais pesados, decidimos nesse trabalho, manipulá-la geneticamente com o
objetivo de enriquecer sua superfície com peptídeos com grande capacidade de
quelar metais, dando à linhagem recombinante dupla vantagem: se reproduzir
nesses ambientes e ser um agente de biorremediação.
2.5 Ancoragem de peptídeos na superfície de bactérias Gram-negativas
O uso de proteínas naturais de superfície como uma ferramenta para
ancoragem de proteínas heterólogas (“cell surface display”) vem apresentando
ampla aplicação nas diferentes áreas da ciência. Por meio desta estratégia, diversos
peptídeos foram ancorados na superfície de diferentes bactérias com variadas
finalidades como a produção de anticorpos, biocatalizadores, biorremediadores,
entre outros (WERNÉRUS; STÅHL, 2004).
No caso da biorremediação, recentemente a literatura tem mostrado que
microrganismos recombinantes, cuja superfície celular foi enriquecida com proteínas
quelantes de metais, apresentaram capacidade superior de adsorção de íons
metálicos, quando comparados com as linhagens não recombinantes, constituindo,
portanto, uma estratégia biotecnológica para desenvolvimento de agentes
Revisão Bibliográfica 55
biorremediadores de grande potencial (BAE et al., 2000; BAE et al., 2001; KOTRBA
et al., 1999; SOUSA et al., 1998; VALLS et al., 2000 a, b).
Várias estratégias podem ser utilizadas para ancorar peptídeos na
membrana externa de bactérias Gram-negativas: inserções de genes nas
seqüências de subunidades celulares como flagelos e pili, assim como em
seqüências codificadoras de proteínas de membrana externa ou, ainda, utilizando o
mecanismo de secreção de proteínas autotransportadoras, como é o caso do
sistema de secreção da protease da imunoglobulina A (IgA) da bactéria Neisseria
gonorrhoeae (WERNÉRUS; STÅHL, 2004).
O sistema natural de secreção da IgA protease de N. gonorrhoeae está
representado na Figura 17A, e é composto de quatro domínios: (i) PS: peptídeo
sinal, capaz de ser reconhecido pela maquinaria Sec (secreção), que realiza o
transporte da proteína para o periplasma. Uma vez que a proteína esteja no
periplasma, o peptídeo sinal sofre uma clivagem, liberando a pré-proteína; (ii)
domínio da protease propriamente dita, uma das responsáveis pela patogênese de
N. gonorrhoeae, (iii) domínio rico em α-hélices de função desconhecida e (iv)
β-domínio capaz de formar um poro na membrana externa em forma de β-barril,
responsável pela passagem e secreção da protease através da membrana externa
(VEIGA et al., 2002). Uma vez na superfície bacteriana, a protease ganha a sua
conformação ativa, clivando-se nos sítios a, b e c e se liberando do β-domínio.
Os autores Klauser et al. (1990) foram os primeiros a adaptar o sistema
natural de secreção da IgA protease de N. gonorrhoeae para a ancoragem de
peptídeos na superfície de outras bactérias. Esses pesquisadores utilizaram partes
do sistema de secreção da IgA protease para a ancoragem do domínio B da toxina
da cólera (ctxB) na superfície celular de Salmonella typhimurium (CtxB). Para tanto,
a seqüência gênica correspondente ao domínio ctxB foi clonada entre as seqüências
codificadoras do peptídeo sinal (PS) e a do β-domínio do sistema de secreção da
IgA protease de N. gonorrhoeae e, após a expressão da construção, estes autores
verificaram que o peptídeo CtxB estava exposto na superfície celular do
microrganismo (Figura 17 B e C). A partir de então, diferentes peptídeos foram
ancorados na membrana externa de bactérias Gram-negativas (E. coli, C.
metallidurans CH34, N. gonorrhoeae, N. meningitidis, S. typhimurium e P. putida) por
intermédio desse sistema (WERNÉRUS; STÅHL, 2004).
Revisão Bibliográfica 56
Considerando que Valls et al. (2000a) conseguiram realizar a ancoragem da
metalotioneína de camundongo na membrana externa de C. metallidurans CH34,
utilizando o sistema de secreção da IgA protease de N. gonorrhoeae, essa
estratégia foi adotada no presente trabalho, como meio de enriquecer a superfície de
C. metallidurans CH34 com peptídeos com superior capacidade de adsorver íons de
metais pesados.
A
C
B
Figura 17: A- Representação esquemática do sistema de secreção da IgA protease de
N. gonorrhoeae MS11. B- Esquema representativo da construção genética visando a
ancoragem da proteína CtxB utilizando o PS e β-domínio do sistema de secreção da
IgA protease. C- Esquema representativo da ancoragem da proteína CtxB na
membrana externa de Salmonella typhimurium. Modificado de Pohlner et al. (1987) e
Henderson et al. (1998).
Revisão Bibliográfica 57
2.6 Peptídeos com afinidade por íons de metais pesados
Os organismos, de modo geral, defendem-se da presença de íons de metais
pesados através da síntese de peptídeos ricos em cisteína, tais como a glutationa
(GSH), fitoquelatinas (PCs) ou de metalotioneínas (MTs). Esses peptídeos se ligam
aos íons metálicos, seqüestrando-os sob uma forma biologicamente inativa (BAE et
al., 2000; MEJÀRE; BÜLOW, 2001; RAUSER, 1995).
Os aminoácidos constituintes desses peptídeos interagem com os íons
através das suas extremidades carboxil e amino e dos diversos grupamentos
laterais. Proteínas ou peptídeos ricos em cisteína e histidina apresentam forte
interação com íons devido aos grupamentos tióis (SH) e amida (SÓVÁGÓ; İSZ,
2006). Diversos peptídeos com estas propriedades têm sido utilizados como
adsorventes de íons de metais pesados em estratégias de biorremediação
(KOTRBA et al., 1999; MEJÀRE; BÜLOW, 2001; SOUSA et al., 1998).
Uma nova classe de peptídeos que adsorvem íons de metais foi proposta por
Bae et al. (2000), cuja estratégia foi obter uma proteína análoga à fitoquelatina
natural, ou seja, com a mesma seqüência de aminoácidos, no entanto, sem a
utilização de rotas enzimáticas ou moléculas precursoras para sua expressão, como
é o caso das PCs, mas sim, pela expressão de um único gene codificador da
seqüência de interesse (Figura 18) (BAE; MEHRA, 1997; BAE et al.; 2001; MEJÁRE
et al., 1998). Desta forma, Bae et al. (2000) construíram genes codificadores de
seqüências protéicas que continham 8, 11 e 20 repetições de ácido glutâmico e
cisteína, que denominaram de fitoquelatinas sintéticas (ECs).
A proteína EC com 20 repetições de ácido glutâmico e cisteína na cadeia
peptídica (EC20) apresentou afinidade por íons de metais pesados de forma análoga
às PCs naturais e muito superior às metalotioneínas e outros peptídeos já descritos
na literatura. A grande habilidade das ECs em ligar metal deve-se ao alto conteúdo
de cisteína na cadeia polipeptídica.
Revisão Bibliográfica 58
Tendo em vista estes resultados, optou-se no presente trabalho em ancorar a
fitoquelatina sintética EC20 na membrana externa de C. metallidurans CH34.
A
B
Figura 18: A - Via biossintética da fitoquelatina natural (PC): 1) ácido glutâmico e cisteína são
ligados pela γ-glutamilcisteína sintetase (γ-ECS) no carboxi-terminal do radical; 2) Glicina
é incorporada na porção carboxi-terminal da cisteína através da glutationa sintase (GS) e
3) através da fitoquelatina sintase (PC sintase) ocorre a elongação da cadeia onde n = 211, dependendo do organismo. B – Estrutura química da fitoquelatina sintética (EC) onde
a ligação peptídica entre o ácido glutâmico e a cisteína é feita entre o carboxi e o aminoterminal do carbono assimétrico (n= número de repetições de ácido glutâmico e cisteína).
O carbono assimétrico está assinalado em vermelho. Modificado de Bae et al., (2000) e
Mejàre; Bülow, (2001).
Objetivo 59
3 OBJETIVO
Realizar o melhoramento genético da bactéria Cupriavidus metallidurans
CH34 no sentido de otimizar sua capacidade de adsorver íons de metais pesados na
sua superfície. Para tanto, a fitoquelatina sintética (EC20sp) será expressa e
ancorada na superfície dessa bactéria, utilizando o peptídeo sinal e o domínio de
ancoragem do sistema de secreção da IgA protease de N. gonorrhoeae.
Para atingir o objetivo geral deste trabalho, foram realizadas as seguintes
etapas:
1. Construção in vitro do gene sintético da fitoquelatina EC20 destituído do
códon de terminação de tradução, originando o gene EC20sp;
2. Fusão do gene EC20sp entre as seqüências codificadoras do peptídeo sinal e
do domínio de ancoragem do sistema de secreção da IgA protease de
N. gonorrhoeae (cassete de ancoragem da EC20sp); originando o plasmídeo
pECβ;
3. Remoção do fragmento 6His do plasmídeo pECβ, originando o plasmídeo
pCM1;
4. Expressão (sob o comando do promotor plac) e ancoragem da EC20sp na
membrana externa de E. coli. Comparação entre a bactéria recombinante e a
bactéria original quanto à capacidade de adsorver íons cádmio (Cd+2);
5. Seleção
de
um
promotor
de
expressão
forte
e
constitutiva
em
C. metallidurans CH34, utilizando o gene repórter da proteína verde fluorescente
(EGFP).
6. Clonagem do promotor pan a montante do cassete de ancoragem da EC20sp
(cassete de expressão-ancoragem da EC20sp), originando o plasmídeo pCM2;
Objetivo 60
7. Análise da expressão (sob o comando do promotor pan) e ancoragem da
EC20sp na membrana externa de C. metallidurans CH34 portadora do plasmídeo
pCM2;
8. Avaliação da capacidade de C. metallidurans/pCM2 em adsorver Cd+2, Co+2,
Cu+2, Hg+2, Mn+2, Ni+2, Pb+2 e Zn+2, em comparação à linhagem original;
9. Avaliação do crescimento das diferentes linhagens.
Materiais e Métodos 61
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Linhagens bacterianas e plasmídeos utilizados nesse trabalho
Tabela 3: Linhagens bacterianas e plasmídeos utilizados neste trabalho.
Linhagens
Genótipo
Referência
Escherichia coli DH5∝
F`/endA1 hsdR17(rK mK ) glnV44 thi-1 recA1 gyrA
r
(Nal ) relA1 ∆ (lacIZYA-argF) U169 deoR
(φ80dlac∆(lacZ) M15
Escherichia coli UT5600
∆ ompT proC leu-6 trpE38 entA
C. metallidurans CH34
Selvagem, pMOL28, pMOL30
ATTC -43123
C. metallidurans CH34
Selvagem, pMOL28, pMOL30
DSMZ-2839
Plasmídeos
Características
Referência
pBBR1MCS
Amplo espectro para Gram-negativas, Cm , Mob ,
®
múltiplo sítio de clonagem do pBluescript II KS-lacZ
Kovach et al.,
(1994)
Cm , seqüência sinal e β-domínio do sistema de
secreção da protease de imunoglobulina A (IgA) de
N. gonorrhoeae
Veiga et al.,
(2002)
-
+
Sambrook e
Russell (2001)
Veiga et al.,
(1999)
®
R
+
TM
R
pHEβ
®
pGEM -T Easy System I
®
pCR 2.1-TOPO
®
R
Vetor de clonagem comercial, lacZ, Ap
R
Promega
R
Vetor de clonagem comercial, lacZ, Ap , Kan
TM
Invitrogen
pLG
Gene da proteína verde fluorescente
®
clonado no vetor pGEM -T Easy
pBBEGFP
Gene EGFP clonado no vetor pBBR1MCS
Quadros (2007)
pBB-panEGFP
Seqüência do promotor pan clonada no vetor
pBBEGFP
Ribeiro-dosSantos (Pedido
de Patente n°
018080019207)
pLEGFP
(EGFP)
Fragmento plac-EGFP do plasmídeo pLG clonado no
vetor pBBR1MCS
Quadros (2007)
Este trabalho
pTOPOP1
Seqüência do promotor do gene de proteína
transmembrana de C. metallidurans CH34 clonado
®
®
no vetor pCR 2.1-TOPO
Este trabalho
pTOPOP2
Seqüência do promotor do gene de citocromo D1 de
®
C. metallidurans CH34 clonado no vetor pCR 2.1®
TOPO
Este trabalho
pTOPOP3
Seqüência do promotor do gene da óxido nítrico
redutase de C. metallidurans CH34 clonado no vetor
®
®
pCR 2.1-TOPO
Este trabalho
Materiais e Métodos 62
Plasmídeos
Características
Referência
pTOPOP4
Seqüência do promotor do gene de proteína
transmembrana de C. metallidurans CH34 clonado
®
®
no vetor pCR 2.1-TOPO
Este trabalho
pTOPOP5
Seqüência do promotor do gene da subunidade 50S
de proteína ribossomal L6 de C. metallidurans CH34
®
®
clonado no vetor pCR 2.1-TOPO
Este trabalho
pTOPOP6
Seqüência do promotor do gene da subunidade 50S
de proteína ribossomal L10 de C. metallidurans
®
®
CH34 clonado no vetor pCR 2.1-TOPO
Este trabalho
pTOPOP7
Seqüência do promotor do gene czcI de C.
®
metallidurans CH34 clonado no vetor pCR 2.1®
TOPO
Este trabalho
pCMP1
Seqüência do promotor do gene de proteína
transmembrana
de
C.
metallidurans
CH34
subclonado no vetor pBBEGFP
Este trabalho
pCMP2
Seqüência do promotor do gene de citocromo D1 de
C. metallidurans CH34 subclonado no vetor
pBBEGFP
Este trabalho
pCMP3
Seqüência do promotor do gene da óxido nítrico
redutase de C. metallidurans CH34 subclonado no
vetor pBBEGFP
Este trabalho
pCMP4
Seqüência do promotor do gene proteína
transmembrana
de
C.
metallidurans
CH34
subclonado no vetor pBBEGFP
Este trabalho
pCMP5
Seqüência do promotor do gene da subunidade 50S
de proteína ribossomal L6 de C. metallidurans CH34
subclonado no vetor pBBEGFP
Este trabalho
pCMP6
Seqüência do promotor do gene da subunidade 50S
de proteína ribossomal L10 de C. metallidurans
CH34 subclonado no vetor pBBEGFP
Este trabalho
pCMP7
Seqüência do promotor do gene czcI de C.
metallidurans CH34 subclonado no vetor pBBEGFP
Este trabalho
pGEMEC20sp
Gene da fitoquelatina sintética (EC20sp) clonado no
®
vetor pGEM -T Easy
Este trabalho
pECβ
Gene EC20sp clonado no vetor pHEβ
Este trabalho
pCM1
Plasmídeo pECβ com alterações
Este trabalho
pTOPOANC
Cassete de ancoragem da EC20sp amplificado por
®
PCR do vetor pCM1 e clonado no vetor pCR 2.1®
TOPO
Este trabalho
pCM2
Continuação da Tabela 3.
Subclonagem do cassete de ancoragem da EC20sp
do vetor pTOPOANC no plasmídeo pan-EGFP
Este trabalho
Materiais e Métodos 63
4.2 Iniciadores de PCR utilizados nesse trabalho
Tabela 4: Iniciadores de PCR utilizados nesse trabalho*.
Nome
ec-a
ec-b
Seqüência
5`tttgatatctaatggaatgtgaatgtgaatgtgaatgtgaat
gtgaatgtgaatgtgagtgtgaatgtgagtgcgaatgcgaa
3`
Anelamento
(°C)
72
Finalidade
Construção do gene sintético
EC20sp.
5`tttgtcgacaccacattcacattcacattcacattcacattc
acattcgcattcacattcgcattcgcattcgcactc3`
Seqüenciamento de insertos
clonados
nos
vetores
®
®
pGEM -T Easy e pCR 2.1®
TOPO .
T7
5’taatacgactcactataggg3’
55
Pbeta
5`cattctaggtattacacgagc 3`
46
PmrgA
5`ccgcggttcggtatcgaaagc3`
60
Seqüenciamento do promotor
pan clonado no plasmídeo
pBBEGFP.
P1F
P1R
5`cggagctcctgaatgaactcgacgaag3`
5` tcccatatggacatctccagcgcggc3`
70
Amplificação de promotor do
gene
de
proteína
transmembrana.
P2F
P2R
5`ttccatatgccatgatttcgctttc3`
5`cgagctcgtgtgggtcctgttgcc3`
65
P3F
P3R
5`ttccatatgggtcaaaacaacctag3`
5`cgagctcgaaaggtgaccgccagca3`
63
Amplificação de promotor do
gene
da
óxido
nítrico
redutase.
P4F
P4R
5`cggagctcatcggcaacgtggaattc3`
5`tcccatatgcaaacaaatcctctgtg3`
65
Amplificação de promotor do
gene
de
proteína
transmembrana.
P5F
P5R
5`ttccatatgggtgttatcttcccaac3`
5`cgagctcgaaggtcgagatccaggaaaccc3`
63
Amplificação de promotor do
gene da proteína ribossomal
L6.
P6F
P6R
5`ttccatatgggttaagctccaaaacg3`
5`cgagctcgtgacggcaatcacttgaccg3`
65
Amplificação de promotor do
gene de proteína ribossomal
L10.
P7F
P7R
5`ttccatatgtccttgggagactgtgcgg3`
5`cggagctctgcgggcaactccgcatac3`
70
PancF
PancR
5’cccatatgaaatacctattgcc3’
5’ccaagcttttagaaacgaatctg3’
50
Seqüenciamento
plasmídeo pHEβ.
do
Amplificação de promotor do
gene de citocromo D1.
Amplificação de promotor do
gene da proteína CzcI.
Amplificação do cassete de
ancoragem da EC20sp do
vetor pCM1
* Todos os iniciadores de PCR foram desenhados nesse trabalho, exceto T7 que é um iniciador comercial.
Materiais e Métodos 64
4.3 Descrição dos Plasmídeos
4.3.1 pBBR1MCS
O plasmídeo pBBR1MCS foi construído por Kovach et al. (1994), através da
subclonagem do múltiplo sítio de clonagem do vetor pBluescript® II KS (Stratagene),
no vetor pBBR1CM isolado de Bordetella bronchiseptica (Figura 19). Trata-se de um
plasmídeo de amplo espectro de hospedeiros para bactérias Gram-negativas, de
tamanho pequeno (4,7 Kb), médio número de cópias, mobilizável e que permite a
seleção
de
células
recombinantes
usando
5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-
galactopiranosídeo (X-Gal) e isopropiltiogalactosídeo (IPTG). A sua seqüência está
disponível nos bancos de dados do NCBI e apresenta grande estabilidade em
C. metallidurans CH34 (SCHNEIDER et al., 2000; SZPIRER et al., 2001). Cedido
pelo Prof. Dr. José Gregório C. Gómez (ICB/USP).
Figura 19: Figura esquemática do plasmídeo pBBR1MCS. CM: gene de resistência a cloranfenicol;
MOB: gene de mobilização; REP: origem de replicação, MCS: múltiplo sítio de
clonagem e plac: promotor do operon de lactose.
4.3.2 pHEβ
O plasmídeo pHEβ foi construído por Veiga et al (2002) (Figura 20). A
construção foi realizada utilizando a seqüência codificadora do peptídeo sinal (PS)
da IgA protease de N. gonorrhoeae, uma seqüência codificando seis resíduos de
Materiais e Métodos 65
histidina, a seqüência de um epítopo (E-tag) e a seqüência do β-domínio da IgA
protease de N. gonorrhoeae, capaz de ancorar-se na membrana externa de
bactérias Gram-negativas. O cassete de ancoragem encontra-se sob o comando do
promotor plac de E. coli. Cedido pelo Dr. Luis Angel Fernández Herrero do Centro
Nacional de Biotecnologia de Madri, Espanha.
Figura 20: Figura esquemática do plasmídeo pHEβ. CM: gene de resistência a cloranfenicol; lacI:
gene codificador do repressor do promotor plac; plac: promotor do operon da lactose; PS:
seqüência do peptídeo sinal do sistema de secreção da IgA protease de N. gonorrhoeae;
6His: seqüência codificadora de seis resíduos de histidina; E-tag: epítopo e IgAβ:
seqüência do β-domínio da via de secreção da IgA protease de N. gonorrhoeae.
A seqüência completa desse plasmídeo não está disponível nos bancos de
dados do NCBI, conhecendo-se apenas a seqüência da âncora IgAβ; portanto, foi
necessário seqüênciar parte da construção utilizando o iniciador de PCR Pbeta.
4.3.3 pGEM®-T Easy System I
O vetor comercial pGEM®-T Easy System I (Promega) (Figura 21) é um
sistema conveniente para clonagem de produtos de PCR, apresentando alto número
de cópias, múltiplos sítios de clonagem e permite rápida seleção de recombinantes
usando X-Gal e IPTG.
Materiais e Métodos 66
r
Figura 21: Figura esquemática do plasmídeo pGEM-T Easy e do múltiplo sítio de clonagem. Amp :
gene de resistência a ampicilina; ori: origem de replicação; T7: sítio de início de
transcrição da T7 RNA polimerase; SP6: sítio de início de transcrição da SP6 RNA
polimerase. Figura extraída do catálogo do produto.
4.3.4 pCR®2.1-TOPO®
O vetor comercial pCR®2.1-TOPO® (InvitrogenTM) (Figura 22) é um sistema
rápido de clonagem de produtos de PCR que evita a recircularização do vetor pela
atividade da topoisomerase I, apresenta múltiplos sítios de clonagem e permite
rápida seleção de recombinantes usando X-gal e IPTG.
Materiais e Métodos 67
r
Figura 22: Figura esquemática do plasmídeo pCR2.1-TOPO e do múltiplo sítio de clonagem. Amp :
r
gene de resistência a ampicilina; Kan : gene de resistência a canamicina; Puc ori: origem
de replicação do plasmídeo PUC; f1 ori: origem de replicação de fago; plac: promotor do
operon da lactose, T7: sítio de início de transcrição da T7 RNA polimerase. Figura
extraída do catálogo do produto.
4.3.5 pLG
A construção desse plasmídeo foi realizada em nosso laboratório através da
amplificação do gene repórter da proteína verde fluorescente (EGFP), utilizando
como molde o vetor comercial pEGFP-N1 (CLONTECH), e a subseqüente clonagem
do gene no plasmídeo pGEM®-T Easy. Para que o gene EGFP fosse expresso pelo
promotor plac, esse plasmídeo foi digerido com as enzimas de restrição NdeI, SacI e
com a enzima Klenow (fragmento Klenow da DNA Polimerase I, Biolabs®) e
recircularizado (Figura 23) (QUADROS, 2007). A observação da fluorescência da
EGFP foi realizada em microscópio de epifluorescência Leica DMLB.
Materiais e Métodos 68
r
Figura 23: Figura esquemática do plasmídeo pLG com o gene da EGFP clonado. Amp : gene de
resistência a ampicilina; ori: origem de replicação; T7: sítio de início de transcrição da T7
RNA polimerase; SP6: sítio de início de transcrição da SP6 RNA polimerase.
4.3.6 pBBEGFP
A construção desse plasmídeo foi realizada em nosso laboratório através da
subclonagem do gene da EGFP no vetor pBBR1MCS (Figura 24) (QUADROS,
2007).
Este vetor permite analisar a expressão da EGFP sob o controle de
seqüências promotoras variadas, permitindo a quantificação do repórter e avaliação
da força de expressão dos promotores.
Figura 24: Figura esquemática do plasmídeo pBBEGFP. CM: gene de resistência a cloranfenicol;
MOB: gene de mobilização; REP: origem de replicação; MCS: múltiplo sítio de
clonagem e EGFP: gene da proteína verde fluorescente.
Materiais e Métodos 69
4.3.7 pBB-panEGFP
A construção desse plasmídeo foi realizada em nosso laboratório através da
amplificação por PCR da seqüência promotora do gene mrgA de Bacillus subitilis
com modificações (pan), a partir do DNA genômico dessa bactéria, e sua posterior
clonagem no plasmídeo pBBEGFP (Figura 25) (Ribeiro-dos-Santos, Pedido de
Patente n° 018080019207). A seqüência do promotor f oi confirmada por
seqüenciamento e a observação da fluorescência foi realizada em microscópio de
epifluorescência Leica DMLB.
Figura 25: Figura esquemática do plasmídeo pBB-panEGFP. CM: gene de resistência a cloranfenicol;
MOB: gene de mobilização; REP: origem de replicação; EGFP: gene da proteína verde
fluorescente e pan: promotor do gene mrgA de Bacillus subtilis modificado.
4.4 Condições de cultivo das bactérias
As linhagens de C. metallidurans CH34 foram cultivadas sob condições
aeróbias em caldo nutriente (CN) a 28 ºC, conforme especificado pela coleção de
culturas, ou em meio mínimo TSM (6.06 g/L de Tris, 4.68 g/L de NaCl, 1.49 g/L de
KCI, 1.07 g/L de NH4Cl, 0.43 g/L de Na2SO4, 0.2 g/L de MgCl2 x 6H20, 0.03 g/L de
CaC12 x 2H20, 0.23 g/L de Na2HPO4 x 12H20, 0.005 g/L de Fe(III)(NH4) citrato, 2%
de gluconato de sódio (SIGMA), 1 mL de solução de elementos traço SL7, segundo
Mergeay et al. (1985).
Materiais e Métodos 70
As linhagens de E. coli foram cultivadas sob condições aeróbias em meio
LB (triptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, NaCl 10 g/L) a 37 ºC. A seleção de
transformantes foi realizada com meios suplementados com 25 µg/mL de
cloranfenicol (pBBR1MCS e derivados), 40 µg/mL de cloranfenicol (pHEβ e
derivados) ou 100 µg/mL de ampicilina (pGEM-T Easy, pCR-TOPO e derivados).
Todos os meios sólidos continham 2% de ágar e foram esterilizados por
autoclavagem a 121 ºC, 1 atm por 15 min.
4.5 Resistência de C. metallidurans CH34 a antibióticos
A Mínima Concentração Inibitória (MIC) de C. metallidurans CH34 (DSMZ e
ATCC) frente a diferentes antibióticos foi realizada utilizando meio CN contendo
concentrações crescentes dos antibióticos ampicilina, canamicina, tetraciclina,
neomicina e cloranfenicol (Tabela 5). Os experimentos foram realizados em triplicata
a 28 °C, 180 rpm por 24 horas.
Tabela 5: Concentrações dos antibióticos utilizados para avaliação da MIC de C. metallidurans CH34.
Antibióticos
Concentrações (µg/mL)
Ampicilina
100 a 6000
Canamicina
100 a 20000
Cloranfenicol
100 a 230
Neomicina
100 a 5000
Tetraciclina
100 a 200
4.6 Efeito do pH no crescimento de C. metallidurans CH34
Um pré-inóculo de 50 mL de C. metallidurans CH34 em meio TSM (pH 6,0)
foi cultivado a 28 °C, 180 rpm até DO 600nm = 0,6. Um volume de 1 mL dessa cultura
foi utilizado para inocular 100 mL de meio TSM com diferentes pHs (3.0 a 10.0) e
cultivado a 28 °C, 180 rpm por 80 horas. A cada 4 h , uma amostra de 1 mL foi
retirada e medida em espectrofotômetro (Micronal B582). O pH do meio foi calibrado
Materiais e Métodos 71
utilizando pHmetro (Denver-Instrument) e soluções de NaOH 1 M ou HCl 1M. O
experimento foi realizado em triplicata.
4.7 MIC de C. metallidurans CH34 frente a íons de metais pesados
A MIC das linhagens de C. metallidurans CH34 e recombinantes frente a
íons de metais pesados foi realizada segundo Monchy et al. (2006b) com alterações.
Uma cultura de C. metallidurans CH34 crescida por 32 h, 28 °C, 180 rpm em 50 mL
de meio TSM (pH 5,0) foi diluída 5 x 104 vezes e 20 µL dessa diluição foram
semeados no mesmo meio contendo diferentes concentrações de sais de metais
pesados. A contagem de células viáveis foi determinada após 4 dias de crescimento
a 28 °C. O experimento foi realizado em triplicata. Todas as soluções de sais de
metais foram preparadas em uma concentração de 1 M e esterilizadas por filtração
em membrana com poros 0,22 µm (Sartorius).
4.8 Extração de DNA genômico de C. metallidurans CH34
O DNA total de C. metallidurans CH34 foi isolado conforme descrito por
Kieser et al. (2000) com modificações. Um pré-inoculo da bactéria C. metallidurans
CH34 foi cultivado por 18 h, 28 °C, 200 rpm em 5 mL de caldo nutriente. Essa
cultura foi centrifugada por 10min, 4 °C , 8000 g e o sedimento foi ressuspendido em
5 mL de TS (Sacarose 25% e Tris-HCl pH 8.0 50mM) e novamente centrifugado por
10 min, 4 °C, 8000 g. O sedimento foi novamente res suspendido em 1 mL de TS e
dispensado em 10 tubos eppendorf com 100 µL/tubo. Adicionaram-se em cada tubo
50 µL de TE (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 20 mM EDTA pH 8,0), 50 µL de lisozima (50
mg/mL), 36 µL de EDTA 0.5 M e 10 µL de RNAse (10 mg/mL) e incubou-se a 37 °C
por 1 hora. Em seguida adicionaram-se 500 µL de TE e 28 µL de SDS (20 %) por
tubo, agitando-se suavemente por inversão até a obtenção de um lisado claro. Um
volume de 0,8 mL de fenol:clorofórmio (1:1, v/v) foi adicionado à solução agitando-se
suavemente e em seguida centrifugou-se por 10 min, 4 °C, 8000 g. A solução
aquosa foi separada e submetida novamente à extração por fenol:clorofórmio. O
mesmo procedimento foi realizado com clorofórmio: isoamílico (24:1) por 2 vezes. O
DNA total foi precipitado por 1 h a -20 °C pela adi ção de 50 µL de acetato de amônia
3M pH 5,0 e 1,1 mL de etanol absoluto gelado. A solução foi centrifugada por 15
Materiais e Métodos 72
min, 10000 g, 4 °C e o precipitado foi lavado com e tanol (70 %) por 3 vezes e
ressuspendido em água MQ.
4.9 Extração e purificação de plasmídeos
A extração e a purificação de plasmídeos foram realizadas de acordo com
Sambrook e Russell (2001). Para o isolamento de grandes quantidades de DNA
para manipulação genética, foi utilizado o protocolo de máxi-preparação e, para
análise em pequena escala, foi utilizado o protocolo de mini-preparação.
4.9.1 Máxi-preparação
Um pré-inóculo bacteriano em 2 mL de meio de cultura, suplementado com
o antibiótico adequado, foi crescido por 16 horas, 37°C e 180 rpm e em seguida
vertido em 200 mL do mesmo meio e cultivado por 16 horas nas mesmas condições.
A cultura foi centrifugada por 10 min a 4 °C e 6000 g. O precipitado foi
ressuspendido em 4 mL de solução 1 (EDTA 0,5 M pH 8.0, Tris-HCl 0,5 M pH
8.0,dextrose 0,5 M) e mantido por 15 min em gelo. Em seguida 8,0 mL de solução 2
(NaOH 1,0 M, SDS 1 %) foram adicionados, e a mistura foi mantida por 10 min a
temperatura ambiente. Adicionaram-se então, 6,0 mL de solução 3 (11,5 % de ácido
acético glacial, 60 % acetato de potássio 5 M), agitando levemente e mantendo por
10 min em gelo. O material foi centrifugado por 15 min a 4 °C e 8000 g. O
sobrenadante foi recuperado e o precipitado descartado. Adicionaram-se 12 mL de
isopropanol, e manteve-se a solução por 10 min à temperatura ambiente.
Novamente o material foi centrifugado por 15 min a 4 °C e 8000 g. O precipitado foi
ressuspendido em 1 mL de água Milli-Q e tratado com 10 µL de RNAse (10 mg/mL)
por 30 min a 37 °C. Adicionaram-se em seguida 500 µL de fenol tamponado e
centrifugou-se por 5 min a 4 °C e 10000 g. Transferiu-se a porção aquosa para outro
tubo e adicionaram-se 500 µL de fenol:clorofórmio (24:1, v/v) e novamente
centrifugou-se por 5 min a 4 °C e 10000 g. Porções de 500 µL da fase superior
foram transferidas para novos tubos e o DNA das amostras foi
precipitado
adicionando-se 50 µL de acetato de amônia e 1100 µL de etanol absoluto gelado
(precipitação com etanol). Os tubos foram mantidos por 1 h a 4 °C e então
Materiais e Métodos 73
centrifugados por 10 min a 4 °C e 10000 g. O precipitado foi recuperado e lavado
com etanol (70 %) e em seguida ressuspendido em água Milli-Q.
4.9.2 Mini-preparação
Um inóculo bacteriano em 4 mL de meio de cultura, suplementado com o
antibiótico adequado, foi crescido por 16 horas, 37 °C e 180 rpm. Um volume de 2
mL dessa cultura foi centrifugado por 2 min a 8000 g. O precipitado foi
ressuspendido em 300 µL de solução 1 (EDTA 0,5 M pH 8.0, Tris-HCl 0,5 M pH
8.0,dextrose 0,5 M) e em seguida 300 µL de solução 2 (NaOH 1,0 M, SDS 1 %)
foram adicionados, e a mistura foi mantida por 5 min à temperatura ambiente.
Adicionaram-se então, 300 µL de solução 3 (11,5 % de ácido acético glacial, 60 %
acetato de potássio 5 M), agitando levemente e mantendo por 10 min em gelo. O
material foi centrifugado por 15 min a 4 °C e 10000 g. O sobrenadante foi
recuperado e o precipitado descartado. Adicionaram-se 10 µL de RNAse (10 mg/mL)
e incubou-se por 30 min a 37 °C. Em seguida adicionaram-se 750 µL de
clorofórmio:álcool isoamílico (24:1, v/v) e novamente centrifugou-se por 2 min a 4°C
e 10000 g. A fase aquosa foi recuperada e adicionaram-se 600 µL de isopropanol
incubando por 30 min à temperatura ambiente e então centrifugou-se por 15 min a
4°C e 10000 g.
O precipitado foi lavado com etanol (70%) e em seguida
ressuspendido em água Milli-Q.
4.10 Análise eletroforética de DNA em gel de agarose e purificação de
fragmentos
A análise e a separação de fragmentos de DNA foi realizada em géis de
agarose 0,7 % ou 1,0% contendo 0,5 µg/mL de brometo de etídio, submetido a 80 V
por 2 horas em tampão de corrida TBE (Tris 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 20
mM pH 8,0). A quantificação do DNA presente nas amostras foi realizada por
comparação por intensidade da fluorescência da amostra com aquela exibida por
λDNA de concentração conhecida e marcador molecular DNA Ladder 100 pb e 1000
pb (Fermentas®).
Para isolar um fragmento de DNA a partir do gel de agarose, após a
eletroforese, cortou-se diretamente desse gel a banda referente ao fragmento alvo
Materiais e Métodos 74
sob visualização de luz ultravioleta (UV) e o DNA foi isolado utilizando Kit de eluição
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega).
4.11 Clivagem dos plasmídeos e fragmentos de DNA com enzimas de restrição
A digestão dos plasmídeos com enzimas de restrição foi realizada seguindo
as instruções do fabricante. Todas as enzimas de restrição utilizadas foram da
marca Fermentas®.
4.12 Preparação de células eletrocompetentes
Células eletrocompetentes de C. metallidurans CH34 foram preparadas
conforme Taghavi et al. (1994). Células de C. metallidurans CH34 foram cultivadas
por 16 horas, a 30 ºC e 180 rpm em 5mL de SOB (triptona 20 g/L, extrato de
levedura 5 g/L, NaCl 0,5 g/L, 10 mL KCl 250 mM). Em seguida essa cultura foi
vertida em 500 mL de meio SOB e cultivada a 30ºC sob agitação (180 rpm) até uma
DO600ηm de 0,8. As células foram coletadas e lavadas duas vezes com água gelada
Milli-Q contendo 10 % (v/v) de glicerol. Em seguida as células foram concentradas
em 1 mL de glicerol a 10% (v/v), aliquotadas em 40µL e estocadas a -70 ºC.
Células eletrocompetentes de E.coli DH5α foram preparadas conforme
Sambrook e Russell (2001). Células de E.coli DH5α ou E. coli UT5600 foram
cultivadas por 16 horas, a 37 ºC e 180 rpm em 5 mL de LB. Em seguida a cultura foi
vertida em 500 mL de meio LB e cultivada a 37ºC sob agitação (180 rpm) até uma
DO600ηm de 0,5. As células foram coletadas por centrifugação e lavadas duas vezes
com água gelada Milli-Q contendo 10% (v/v) de glicerol. Em seguida as células
foram concentradas em 1 mL de glicerol a 10% (v/v), aliquotadas em 40 µL e
estocadas a -70 ºC.
4.13 Transformação de bactérias por eletroporação
A eletroporação das linhagens de E.coli e de C. metallidurans CH34 foi
realizada utilizando cubetas de 1,0 mL e Bio-Rad Gene Pulser com os seguintes
ajustes: voltagem de 2500 V, 2000 ohms de resistência e 25 µF de capacitância.
Foram utilizados 100 ηg de vetor ou 2 µL de cada mistura de ligação para cada 40
Materiais e Métodos 75
µL de células competentes. Após a eletroporação, as células foram ressuspendidas
em 1mL de meio SOC, incubadas por 1 h, 180 rpm a 28 ºC, se C. metallidurans
CH34 e a 37 ºC, se E. coli. Em seguida as células foram semeadas em meios
seletivos, que permitissem a identificação dos clones transformantes.
4.14 Construção do gene sintético da Fitoquelatina sem o códon de terminação
de síntese protéica (EC20sp)
O gene sintético codificando a EC20sp foi preparado baseado em Bae et al.
(2000) com modificações. Dois oligonucleotídeos, ec-a e ec-b, foram misturados e
submetidos a uma reação de PCR. O PCR foi realizado com 2 µL de ec-a (10pM), 2
µL de ec-b (10 pM), 0,4µL de dNTPs (25 mM cada), 1,5 µL de MgCl2 (50 mM), 5 µL
tampão Taq 10X e 2 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen®) em um volume final de
50 µL. A reação foi transferida para um Termociclador (MJ-Research PTC-200) e a
amplificação foi realizada com 30 ciclos de 96 ºC por 90 segundos, 72 ºC por 120
segundos, seguido por um período de extensão de 10 min a 72 ºC.
A reação foi analisada em gel de agarose submetido à eletroforese e o
fragmento amplificado foi quantificado através de comparação com marcador de
DNA 100 pb e λDNA (100 ηg). Esse fragmento foi clonado no vetor pGEM®-T Easy.
A quantidade de produto de PCR utilizada nesta clonagem foi calculada pela
Equação I. A mistura de ligação foi realizada com 50 ηg de produto amplificado, 50
ηg de vetor pGEM®-T Easy, 5 µL de tampão da T4 DNA ligase, 3 U de T4 DNA
ligase para um volume final de 10 µL. As reações foram mantidas por 16 horas a
4 ºC e 2 µL foram utilizados para eletroporar células eletrocompetentes de E. coli
DH5α.
Eq I: ηg vetor x tamanho do inserto (Kb) x 3 inserto = ηg de inserto
Tamanho do vetor (Kb)
vetor
Os transformantes foram selecionados em meio LB suplementado com
100 µg/mL de ampicilina, 0,2 mg/mL de X-Gal e 0,08 mg/mL de IPTG. Colônias
brancas tiveram o DNA plasmidial isolado e clivados com as enzimas EcoRV e SalI.
Após eletroforese, os perfis de migração dos fragmentos foram analisados e aqueles
clones que apresentaram insertos foram seqüenciados utilizando o iniciador de PCR
Materiais e Métodos 76
T7 (Promega). Todas as reações de seqüenciamento foram realizadas no
Departamento de Genoma Humano do Instituto de Biociências da USP.
4.15 Construção do cassete de ancoragem da EC20sp
A construção do cassete de ancoragem da EC20sp foi realizada utilizando o
plasmídeo pHEβ. Este plasmídeo foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI e
SalI por 16 h a 37 °C e o DNA recuperado por precipita ção com etanol. O plasmídeo
pGEMEC20sp foi submetido a uma digestão dupla com as mesmas enzimas de
restrição, EcoRI e Sal I, por 16 horas a 37 °C e o fragmento corresponden te ao gene
EC20sp recuperado por eluição de gel de agarose.
O plasmídeo digerido e o fragmento EC20sp foram quantificados em gel de
agarose e usados em uma mistura de ligação. Foram utilizados 50 ηg do gene
EC20sp e 100 ηg do vetor pHEβ, 1 µL tampão da T4 DNA ligase, 3 U de T4 DNA
ligase em um volume final de 10 µL. Células eletrocompetentes de E. coli foram
eletroporadas com 2 µL da mistura de ligação e plaqueadas em meio seletivo.
O DNA plasmidial de 50 transformantes obtidos foi isolado e submetido à
análise de restrição, utilizando as enzimas BglI, EcoRI, EcoRV, SalI e SpeI. A
análise dos perfis de migração dos fragmentos em gel de agarose foi realizada e o
vetor construído foi chamado pECβ.
O plasmídeo pECβ foi digerido com a enzima BglI e o DNA recuperado por
precipitação por etanol. Em seguida esse DNA foi tratado com a enzima Klenow,
para produzir extremidades abruptas, e novamente precipitado com etanol. O DNA
foi digerido com a enzima de restrição EcoRV por 16 h a 37 °C e o fragmento
referente ao plasmídeo foi isolado por eluição de gel de agarose. A recircularização
do plasmídeo foi realizada utilizando 200 ηg de plasmídeo, 1 µL de tampão da T4
DNA ligase, 3 U de T4 DNA ligase em um volume final de 10 µL. A reação foi
mantida por 16 horas a 4 ºC e 2 µL foram utilizados para eletroporar células de E.
coli DH5α eletrocompetentes. Para confirmar a seqüência correta, o cassete de
ancoragem foi seqüenciado utilizando o oligonucleotídeo Pbeta.
Materiais e Métodos 77
4.16 Análise da expressão do cassete de ancoragem da EC20sp
4.16.1 Caracterização do perfil protéico através de SDS-PAGE
A caracterização do perfil protéico das células foi realizada por eletroforese
em gel de poliacrilamida na presença de duodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), em
sistema descontínuo, a partir do protocolo descrito por Studier (1973) com
alterações.
As linhagens de E. coli foram cultivadas em 5 mL de meio LB a 37°C, 180
rpm até DO600nm de 0,5 e em seguida induzidas com 0,08 mg/mL de IPTG por 3 h
nas mesmas condições, e por fim centrifugadas a 10000 g, 4 °C por 10 min. As
linhagens de C. metallidurans CH34 foram cultivadas em 5 mL de meio CN a 28 °C,
180 rpm até DO600nm de 1,0 e em seguida centrifugadas a 10000 g, 4 °C por 10 min.
O sedimento de cada amostra foi diluído em tampão de amostra (240 mM TRIS pH
6.8, 0,8% SDS, 200 mM 2-mercaptoetanol, 40% glicerol, 0,02% azul de bromofenol)
e fervido por 7 min a 100 °C, para a desnaturação d as proteínas.
As soluções utilizadas na preparação do gel de poliacrilamida foram:
•
Solução A: 30% de acrilamida (p/v) e 0,5% de bisacrilamida (p/v) em água
destilada, armazenada a 4°C em frasco âmbar.
•
Solução B: Tris-HCl 1,5 M pH 8.8
•
Solução C: 28,5% de acrilamida (p/v) e 1,5% de bisacrilamida (p/v) em
água destilada, armazenada a 4°C em frasco âmbar.
•
Solução D: Tris-HCl 0,5 M pH 6.8
O gel de separação (12,5%) foi preparado com 3,12 mL de solução A, 2,0
mL de solução B, 2,28 mL de H2O, 74 µL SDS 10%, 74 µL persulfato de amônio
10% (PSA) e 5 µL de TEMED e o gel de empilhamento com 0,58 mL de solução C,
0,44 mL de solução D, 2,28 mL de H2O, 34 µL SDS 10%, 34 µL PSA 10% e 5 µL de
TEMED.
A eletroforese foi realizada a 120 mA até que as proteínas atingissem o final
do gel de separação. Após a corrida eletroforética, o gel foi imerso em corante para
proteínas por 1 h (1 mg/mL de Comassie Blue em etanol, 10% de ácido acético) e
em seguida descorado em água fervente.
Materiais e Métodos 78
4.16.2 Separação de membranas e Western –blotting
A separação de membranas foi realizada conforme Veiga et al. (1999) com
modificações. As linhagens de E. coli foram cultivadas em 10 mL de meio LB
contendo 2% de glicose a 30ºC, 180 rpm até atingir uma DO600 igual a 0,5. As
células foram coletadas por centrifugação a 5000 g por 5 min e ressuspendidas em
10 mL de meio LB contendo 0,08 mg/mL de IPTG e cultivadas por 3 h a 30ºC e 180
rpm. As linhagens de C. metallidurans CH34 foram cultivadas em CN até DO600 igual
a 1,0. As células de cada experimento foram coletadas por centrifugação a 5000 g
por 5 min e o sedimento ressuspendido em 5 mL de tampão fosfato de sódio pH 6,8
(NaH2PO4 x H2O) e lisadas por sonicação utilizando seis pulsos de 30 s. Células não
rompidas foram removidas por centrifugação a 5000 g por 5 min e o sobrenadante
foi centrifugado por 1 h, 30000rpm, 4°C para recupe rar a fração de proteínas de
membrana. Esse sobrenadante foi considerado a fração solúvel. O sedimento foi
ressuspendido em 1 mL de tampão fosfato de sódio contendo 1,5% de Triton X-100
e incubado por 30 min a 4°C. A solução foi centrifu gada por 30 min em 55000rpm,
4°C e o sobrenadante foi considerado a fração de me mbrana interna e o sedimento
a fração de membrana externa. 50 µL de tampão de amostra foi adicionado nas
diferentes frações e fervidas por 7 min a 100 °C, p ara a desnaturação das proteínas
e em seguida submetidas a eletroforese em gel de poliacrilamida.
Os fragmentos protéicos do gel foram transferidos para uma membrana de
nitrocelulose (HybondTM-C Extra -Amersham Biosciences) usando sistema de
transferência molhada (Bio-Rad). A membrana foi incubada por 16 h e 4°C com
solução bloqueadora (PBS; 0,05% Tween 20; 5% leite em pó) e submetida a três
lavagens de 5 min cada, com 50 mL de PBS contendo 0,05% Tween 20. Para
detecção da proteína foi utilizado 1µg/mL de anticorpo anti-E-tag (Amersham
Biosciences) em solução bloqueadora (PBS; 0,05% Tween 20; 5% leite em pó) por
90 min à temperatura ambiente, sob moderada agitação. Novamente a membrana
foi submetida a três lavagens de 5 min cada, com 50 mL de PBS contendo 0,05%
Tween 20. Adicionou-se o anticorpo secundário anti-mouse IgG peroxidase (Sigma)
na concentração de 0,03 U/mL incubando a membrana por 90 min. O excesso de
anticorpo foi retirado com novo ciclo de lavagens com PBS contendo 0,05% Tween.
Um filme (Kodak-RX) foi utilizado para evidenciar as proteínas que interagiram com
o anticorpo, e submetido à lavagem com solução cromógena à temperatura
Materiais e Métodos 79
ambiente. A revelação foi interrompida quando apareceram as bandas e o filme
lavado com água destilada.
4.16.3 Bioacúmulo de íons de metais pesados pelas linhagens expressando o
cassete de ancoragem da EC20sp
A determinação do acúmulo de metal pelas linhagens bacterianas foi
realizada de acordo com Hernández et al. (1998) com algumas modificações. As
linhagens de E. coli foram cultivadas em 20 mL de meio LB suplementado com 2%
glicose até atingir DO600 igual a 0,5. As células foram coletadas por centrifugação e
ressuspendidas no mesmo meio contendo 0,08 mg/mL de IPTG e cultivadas a 28°C
e 180 rpm até atingir DO600 1,5. As linhagens de C. metallidurans foram cultivadas
em 200 mL de meio TSM contendo ou não Cd+2 (50 µM), a 28 °C e 180 rpm até
atingir DO600 igual a 1,0. As células de cada experimento foram centrifugadas a
10.000 g, 4 °C por 10 min. O sedimento foi ressuspe ndido em 2 mL de solução
salina e dividido em duas alíquotas de 1 mL em tubo eppendorf. O material celular
foi novamente centrifugado a 10000 g, 4 °C por 10 m in. O sedimento de um tubo foi
seco em centrífuga do tipo “Speed Vac” (Savant SVC-100H) e pesado enquanto o
sedimento do outro tubo foi ressuspendido em 10 mL de água Milli-Q contendo Cd+2
(100 µM e 1000 µM). As linhagens de E. coli foram incubadas por 2 h enquanto as
linhagens de C. metallidurans foram incubadas por 2, 6, 12 ou 24 h, todas sob
agitação de 180 rpm a 28 °C. Após o tempo de incuba ção, as células foram
coletadas por centrifugação e a quantidade de metal pesado no sobrenadante foi
medida através de espectrofotometria de emissão atômica (ICP-AES) no Instituto de
Química da Universidade de São Paulo. Todos os experimentos foram realizados
em duplicata.
Após definido o melhor tempo de incubação em solução contendo metal
pesado, as linhagens de C. metallidurans CH34 foram cultivadas nas mesmas
condições anteriores na presença ou ausência de metais pesados. Em cada cultura
foi adicionado apenas uma espécie de metal na concentração de 300 µM para Cd+2,
Co+2, Mn+2 e Zn+2, 128 µM para Ni+2, 1 µM para Hg+2 e 100 µM para Cu+2 e Pb+2. Em
uma cultura foi adicionado todos os íons de metais na concentração de 10 µM. Após
atingir DO600 igual a 1,0, o sedimento dessas culturas foi coletado por centrifugação
e incubado com soluções aquosas dos metais por 24 h na concentração de 1000 µM
Materiais e Métodos 80
para Cd+2, Co+2, Cu+2, Mn+2, Ni+2 e Zn+2 e Pb+2 e 50 µM para Hg+2. Células advindas
de cada experimento foram semeadas em ágar nutriente antes e depois do
tratamento com metais para avaliação da viabilidade celular. O sedimento advindo
da cultura contendo todos os íons de metais foi incubado em solução contendo Cd+2,
Co+2, Mn+2, Zn+2, Ni+2, Hg+2, Cu+2 e Pb+2 na concentração de 100 µM. Após 24 h de
incubação, as células foram coletadas por centrifugação e a quantidade de metal foi
medida na massa microbiana (digerida com ácido nítrico 70% (v,v), por 16 h) através
de espectrometria de massas de alta resolução com fonte de plasma indutivamente
ativado (ICP-MS) no Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN). Todos
os experimentos foram realizados em duplicata.
4.17 Amplificação e clonagem de regiões promotoras a partir do DNA total de
C. metallidurans CH34
A amplificação por PCR das regiões promotoras de C. metallidurans CH34
foi realizada utilizando DNA total dessa bactéria (item 4.8). O PCR foi realizado com
150 ηg de DNA genômico, 2µL de cada primer (10pM), 0,4µL de dNTPs (25mM
cada), 1,5µL de MgCl2 (50mM), 5 µL tampão Taq 10X e 2 U de Taq DNA polimerase
(Invitrogen®) em um volume final de 50µL. A reação foi transferida para um
Termociclador (MJ-Research PTC-200) e a amplificação foi realizada com 30 ciclos
de 96 ºC por 90 segundos, 2 min na temperatura de anelamento de cada par de
iniciadores (Tabela 4) e 90 segundos a 72 ºC, seguido por um período de extensão
de 10 min a 72 ºC.
Os produtos de PCR foram analisados em gel de agarose submetido à
eletroforese e os fragmentos amplificados foram quantificados através de
comparação com marcador de DNA 100pb e λDNA (100 ηg). Esses fragmentos
foram clonados no vetor pCR®2.1-TOPO® conforme catálogo do produto. A mistura
de ligação foi realizada com 50 ηg de produto amplificado, 10 ηg de vetor pCR®2.1TOPO®, 50 mM de NaCl e 2,5 mM de MgCl2 para um volume final de 6 µL. As
reações foram mantidas por 5 min à temperatura ambiente e 2 µL foram utilizados
para transformar células eletrocompetentes de E. coli DH5α.
Os transformantes foram selecionados em meio LB suplementado com 100
µg/mL de ampicilina, 0,2 mg/mL de X-Gal e 0,08 mg/mL de IPTG. Cinco colônias
brancas obtidas em cada transformação tiveram o DNA plasmidial isolado e clivado
Materiais e Métodos 81
com as enzimas NdeI e SacI. O perfil de migração dos fragmentos foi analisado em
gel de agarose submetido à eletroforese.
As
regiões
promotoras
clonadas
no
vetor
pCR®2.1-TOPO® foram
subclonadas no plasmídeo pBBEGFP. Para tanto, o isolamento de cada promotor foi
realizado através da digestão dos plasmídeos pTOPOP1 a pTOPOP7 com as
enzimas de restrição NdeI e SacI e, após corrida eletroforética em gel de agarose,
os fragmentos referentes a cada promotor foram eluídos do gel. O vetor pBBEGFP
também foi digerido com as mesmas enzimas, NdeI e SacI, e utilizado para ligar a
cada promotor. A mistura de ligação foi realizada com 50 ηg de DNA de cada
promotor, 100 ηg de vetor pBBEGFP digerido, 1 µL tampão da T4 DNA ligase, 3 U
de T4 DNA ligase em um volume final de 10 µL. Células eletrocompetentes de E. coli
foram eletroporadas com 2 µL da mistura de ligação e plaqueadas em meio seletivo.
Cinco colônias resistentes a cloranfenicol em cada transformação tiveram o
DNA plasmidial isolado e digerido com as enzimas NdeI e SacI. O perfil de migração
dos fragmentos em gel de agarose submetido à eletroforese foi analisado.
4.18 Construção do plasmídeo pLEGFP
A construção do plasmídeo pLEGFP foi realizada através da digestão do
plasmídeo pLG com as enzimas de restrição VspI e XhoI, que liberou um fragmento
de 950 pb referente ao plac-EGFP, o qual foi eluído de gel de agarose após corrida
eletroforética. O vetor pBBR1MCS também foi digerido com as mesmas enzimas,
VspI e XhoI, e utilizado em uma mistura de ligação com o fragmento plac-EGFP. A
mistura de ligação foi realizada com 50 ηg de DNA de cada promotor, 100 ηg de
vetor pBBR1MCS, 1 µL tampão da T4 DNA ligase, 3 U de T4 DNA ligase em um
volume final de 10 µL. Células eletrocompetentes de E. coli foram eletroporadas com
2 µL da mistura de ligação e plaqueadas em meio seletivo.
Cinco colônias resistentes a cloranfenicol tiveram o DNA plasmidial isolado
e digerido com as enzimas VspI e XhoI. O perfil de migração dos fragmentos em gel
de agarose submetido à eletroforese foi analisado.
Materiais e Métodos 82
4.19 Quantificação da expressão da proteína verde fluorescente em E. coli e
C. metallidurans CH34 através de citometria de fluxo
Os plasmídeos pBBR1MCS, pBBEGFP, pCMP1, pCMP2, pCMP3, pCMP4,
pCMP5, pCMP6, pCMP7, pLEGFP e pBB-panEGFP foram utilizados para
transformar células de C. metallidurans CH34 por eletroporação. Foram utilizados
100 ηg de cada plasmídeo em cada transformação.
A expressão da EGFP sob o controle de cada região promotora foi
primeiramente observada em lâmina em microscópio de epifluorescência Leica
DMLB e, posteriormente, quantificada em citômetro de fluxo (Citômetro Beckman
Coulter Cytomics FC500MPL) em células recombinantes de E. coli e C.
metallidurans CH34 na fase exponencial de crescimento (DO600 = 1,2) na presença
ou ausência de íons de metais pesados. Células de E. coli e C. metallidurans CH34
carregando os plasmídeos pBBR1MCS, pBBEGFP foram utilizadas como controle
do experimento.
Células de C. metallidurans CH34 carregando as construções pCMP1 a
pCMP7 foram cultivadas em meio TSM até DO=1,2 e em seguida, foram
adicionados às culturas íons Ni+2 (1 mM), Zn+2 (1 mM) ou Cu+2 (0,5 mM) e incubadas
por 3 h a 28 °C e 180 rpm.
Células de C. metallidurans CH34 carregando a construção pBB-panEGFP
foram cultivadas na presença ou ausência de apenas um tipo de íon de metal
pesado na concentração de 1mM de Co+2, Zn+2, Ni+2, Fe+2, Cd+2, Cu+2, Mn+2 ou Pb+2.
Para Hg+2 a concentração utilizada foi de 1 µM. Células de E. coli carregando a
construção pBB-panEGFP foram cultivadas em meio LB contendo 1 mM de Fe+2 ou
1 mM de Mn+2.
Células de E. coli e C. metallidurans CH34 carregando o vetor pLEGFP
foram cultivadas em meio LB contendo 1% de glicose ou 0,08 mg/mL de IPTG.
Um volume de 1 mL de células foi coletado em cada tratamento e
centrifugado por 2 min a 10000 g. O sedimento foi lavado com tampão PBS (9
mg/mL de NaCl, 0,32 mg/mL de NaH2PO4, 1,09 mg/mL de Na2HPO4, pH 7.0,) e após
nova centrifugação foi ressuspendido em 1 mL de solução de PBS contendo 3,7%
de paraformaldeído.
Foram analisados 30 000 eventos para células de E. coli e 50 000 eventos
para células de C. metallidurans CH34. A leitura da fluorescência da EGFP foi
Materiais e Métodos 83
realizada com feixe de laser em 489 ηm de comprimento de onda e a leitura da
emissão foi realizada a 509 ηm. A quantificação foi estimada pela intensidade média
de fluorescência por célula em cada linhagem.
4.20 Construção do cassete de expressão-ancoragem da EC20sp
A construção do cassete de expressão-ancoragem da EC20sp foi realizada
utilizando o plasmídeo pCM1 como molde para amplificação do cassete de
ancoragem. O PCR foi realizado utilizando 150 ηg do plasmídeo pCM1, 2 µL de
PancR (10 pM), 2 µL de PancF (10 pM), 0,4 µL de dNTPs (25 mM cada), 1,5 µL de
MgCl2 (50 mM), 5 µL tampão Taq 10X e 2 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen®)
em um volume final de 50 µL. A reação foi transferida para um Termociclador (MJResearch PTC-200) e a amplificação foi realizada com 30 ciclos de 96 ºC por 90
segundos, 2 min na temperatura de anelamento e 90 segundos a 72 ºC, seguido por
um período de extensão de 10 min a 72 ºC.
O produto de PCR foi analisado em gel de agarose submetido à eletroforese
e quantificado através de comparação com marcador de DNA 100pb e λDNA (100
ηg). Esse fragmento foi clonado no vetor pCR®2.1-TOPO® conforme catálogo do
produto. A mistura de ligação foi realizada com 50 ηg de produto amplificado, 10 ηg
de vetor pCR®2.1-TOPO®, 50 mM de NaCl e 2,5 mM de MgCl2 para um volume final
de 6 µL. As reações foram mantidas por 5 min à temperatura ambiente e 2 µL foram
utilizados para transformar células eletrocompetentes de E. coli DH5α.
Os transformantes foram selecionados em meio LB suplementado com
100 µg/mL de ampicilina, 0,2 mg/mL de X-Gal e 0,08 mg/mL de IPTG. Cinco
colônias brancas tiveram o DNA plasmidial isolado e clivado com a enzima EcoRI. O
perfil de migração dos fragmentos no gel foi analisado após eletroforese. O vetor
construído foi chamado pTOPOANC.
O isolamento do cassete de ancoragem foi realizado através da digestão do
vetor pTOPOANC com as enzimas de restrição NdeI e KpnI e subseqüente eluição
desse fragmento do gel de agarose após eletroforese. O vetor pan-EGFP também
foi digerido com as mesmas enzimas, NdeI e KpnI, para a retirada do gene EGFP e
isolado por eluição.
A mistura de ligação foi realizada com 50 ηg de DNA do vetor pan-EGFP,
100 ηg do cassete de ancoragem, 1 µL tampão da T4 DNA ligase, 3 U de T4 DNA
Materiais e Métodos 84
ligase em um volume final de 10 µL. Células eletrocompetentes de E. coli foram
eletroporadas com 2 µL da mistura de ligação e plaqueadas em meio seletivo.
Cinco transformantes resistentes a cloranfenicol tiveram o DNA plasmidial
isolado e clivado com a enzimas SacI, NdeI, SalI, HindIII e KpnI. Duplas digestões
foram realizadas com NdeI e HindIII, SacI e SalI e também uma digestão tripla com
SacI, NdeI e HindIII. O perfil de migração dos fragmentos no gel após eletroforese. O
vetor construído foi chamado pCM2.
4.21 Análise das linhagens de C. metallidurans CH34 por Microscopia
Eletrônica de Transmissão
Células de C. metallidurans CH34 e C. metallidurans CH34/pCM2 foram
cultivadas em meio TSM contendo ou não 100 µM de Pb+2, até atingir DO600nm 1.0 e,
em seguida, centrifugadas a 6000 g por 2 min. O sedimento bacteriano de cada
linhagem foi incubado em 2 mL de água MilliQ contendo 1 mM de Hg+2 durante 24 h,
a 28 °C e 180 rpm. Novamente, a solução foi centrif ugada a 6000 g por 2 min e o
sedimento bacteriano foi submetido a procedimentos para preparo de cortes
histológicos, seguindo as seguintes etapas:
• Fixação: o sedimento bacteriano de cada cultura foi incubado por 2 h em
glutaraldeído 2% em solução tampão cacodilato de sódio. Em seguida, o sedimento
foi incubado com tetraóxido de ósmio (OsO4) 2% em solução tampão cacodilato de
sódio. Por fim, o sedimento foi incubado em solução aquosa contendo 0,5% de
uranila e 10,56% de sacarose por 16 h.
• Desidratação: o sedimento bacteriano foi desidratado por meio de sucessivas
lavagens com álcool. A primeira lavagem foi realizada por 2 vezes em álcool 70%
por 10 min; a segunda lavagem foi realizada por 2 vezes em álcool 95% por 10 min;
a terceira lavagem foi realizada por 4 vezes em álcool absoluto por 10 min. Por fim,
o sedimento foi tratado por 2 vezes com óxido de propileno por 10 min.
• Inclusão: uma mistura de resina de inclusão e óxido de propileno 1:1 (v,v) foi
incubada por 16 h e, em seguida, foi adicionada uma porção de resina de inclusão
pura e a mistura final foi incubada durante 6 h. O sedimento bacteriano foi
homogeneizado com esta resina e incubado por 48 h a 72 ºC para polimerização.
Os blocos de resina contendo os sedimentos bacterianos foram submetidos
a cortes histológicos em ultramicrotomo (Leica Ultracut R) com espessura de 70 ηm.
Materiais e Métodos 85
Os cortes histológicos foram fixados em grides de ouro de 200 mesh. A contrastação
das estruturas celulares foi realizada pela incubação dos grides contendo os cortes
histológicos por 5 min em solução de citrato de chumbo, seguida de nova incubação
por 5 min em solução de acetato de uranila. Uma duplicata de cada amostra foi
fixada em grides de cobre sem o tratamento de contrastação.
A observação dos cortes histológicos foi realizada em Microscópio Eletrônico
de Transmissão (LEO 906E) no Laboratório de Biologia Celular do Instituto
Butantan.
Resultados 86
5 RESULTADOS
5.1 Caracterização fisiológica de C. metallidurans CH34
5.1.1 Resistência a antibióticos
Para realizar a manipulação genética em C. metallidurans CH34, foi
necessário inicialmente conhecer a sua resistência a antibióticos. Foram avaliadas
duas linhagens de C. metallidurans CH34, adquiridas das coleções de cultura DSMZ
e ATCC.
Como se pode observar pelos resultados da Tabela 6, houve uma grande
discrepância entre as resistências das duas linhagens. As duas linhagens cresceram
em meio de cultura contendo 5000 µg/mL de neomicina e concentrações maiores
não foram avaliadas por não permitir a seleção de transformantes nessa
concentração. Quando o antibiótico utilizado foi canamicina, a linhagem DSMZ
cresceu em meio contendo 20.000 µg/mL, no entanto, a linhagem ATCC apresentou
MIC em meio contendo 1500 µg/mL desse antibiótico. Para o antibiótico ampicilina,
verificou-se que a linhagem ATCC apresentou MIC de 1000 µg/mL enquanto a
linhagem DSMZ apresentou MIC de 6000 µg/mL. Por fim, foram examinadas as
resistências aos antibióticos tetraciclina e cloranfenicol. Os resultados mostraram
que a MIC para tetraciclina da linhagem ATCC foi de 100 µg/mL e de 200 µg/mL
para da linhagem DSMZ. Para cloranfenicol, os valores das MICs foram 230 µg/mL
para a linhagem ATCC e 170 µg/mL para a linhagem DSMZ.
Devido à maior sensibilidade aos antibióticos mostrada pela linhagem
C. metallidurans CH34 da coleção ATCC, os experimentos subseqüentes desse
trabalho utilizaram esta linhagem.
Resultados 87
Tabela 6: Resistência das linhagens de C. metallidurans CH34 provenientes das coleções ATCC e
DSMZ frente a diferentes antibióticos.
Antibiótico
C. metallidurans CH34- MIC (µg/mL)
ATCC
DSMZ
Ampicilina
1000
6000
Canamicina
1500
>20000
Tetraciclina
100
200
Neomicina
>5000
>5000
Cloranfenicol
230
170
5.1.2 Efeito do pH no crescimento de C. metallidurans CH34
C. metallidurans CH34 foi cultivada em meio TSM com pH entre 3.0 e 10.0,
a fim de estabelecer o pH ótimo de crescimento dessa bactéria. Na Figura 26, podese observar que o crescimento da massa microbiana de C. metallidurans CH34 em
meio TSM com pH 4.0, 5.0 e 6.0 apresentou menores fases lag em comparação aos
outros pHs e, com fase exponencial de crescimento se iniciando em 20 h de cultivo e
se estendo até 32 h em pH 5.0 e até 36 h em pH 4.0 e 6.0.
O crescimento ótimo dessa bactéria ocorreu em meio com pH 5.0, atingindo
máximo valor de densidade ótica (DO), ou seja, máximo número de células em
suspensão (1,4 x 109/mL), com tempo de geração (g) de 6,8 h e com velocidade
máxima de crescimento (µmáx) de 0,45 h-1.
O cultivo de C. metallidurans CH34 em meio com pHs 3.0, 7.0 e 8.0 mostrou
uma maior fase lag e diminuição na concentração final da massa bacteriana. Nos
meio com pHs 9.0 e 10.0 não se detectou crescimento bacteriano.
Devido a esses resultados, todos os experimentos subseqüentes foram
realizados em meio TSM com pH 5,0.
Resultados 88
1,8
1,2
pH 3,0
DO600 nm
pH 4,0
pH 5,0
pH 6,0
pH 7,0
pH 8,0
0,6
pH 9,0
pH 10,0
0,0
0
4
8
12
16
20
24
28
32
36
40
44
48
52
56
72
76
80
Tempo (h)
Figura 26: Curva de crescimento de C. metallidurans CH34 em meio TSM com diferentes pHs.
DO600 nm: densidade ótica medida em comprimento de onda de 600 nanômetros. Cada
ponto representa a média de uma triplicata e seu desvio padrão.
5.1.3 MIC de C. metallidurans CH34 frente a íons de metais pesados
Para estabelecer um perfil de resistência numa mesma condição de cultivo,
foi avaliada a mínima concentração inibitória de C. metallidurans CH34 frente a
diferentes metais pesados e os resultados estão apresentados na Tabela 7, em
comparação com os valores máximos permitidos pelo Conama.
Tabela 7: Comparação das resistências de C. metallidurans CH34 com os valores máximos de íons
em efluentes, segundo o CONAMA.
Íon de metal pesado
MIC CH34
Conama (Anexo A)
Razão
MIC/Conama
(mM)
(mM)
+2
3,0
0,002
1500
+2
0,8
0,016
50
Cd
Cu
-2
CrO 4
0,2
0,01
20
+2
0,006
0,00005
120
+2
Hg
Mn
60,0
0,03
2000
+2
3,5
0,034
103
+2
3,0
0,002
1500
Ni
Pb
-2
SeO 3
1,0
0,004
250
+2
15,0
0,08
187
+2
9,0
-
-
Zn
Co
Resultados 89
Os resultados desse experimento mostraram, de fato, altas resistências
dessa linhagem a Cd+2, Co+2, Cu+2, CrO-24, Hg+2, Mn+2, Ni+2, Pb+2, SeO-23 e Zn+2.
Quando se compara a resistência dessa bactéria com os níveis máximos de metais
permitidos em efluentes, segundo o Conama, verifica-se que ela é muito superior
para todos os metais, chegando a ser até 2000 vezes mais resistente, no caso do
Mn+2.
5.2 Construção da bactéria C. metallidurans CH34 recombinante
5.2.1 Seqüenciamento do plasmídeo pHEβ
O
primeiro
passo
para
a
construção
do
clone
recombinante
de
C. metallidurans CH34 com a fitoquelatina ancorada na sua superfície, foi conhecer
a seqüência exata do sistema de secreção da IgA protease, codificada no plasmídeo
pHEβ. A seqüência completa desse fragmento está apresentada na Figura 27.
Analisando os dados de seqüenciamento, logo após o sítio de restrição da
enzima XbaI, identificamos a seqüência gênica do peptídeo sinal, constituída por 51
nucleotídeos. Identificamos também uma região, entre os sítios BglI e SalI, que tem
sido utilizada para a clonagem de genes codificadores de proteínas que se desejam
ancorar e, a jusante dessa região, foi identificada a seqüência codificadora do
epítopo E-tag, constituída por 36 nucleotídeos. Por fim, a seqüência codificadora da
região do β-domínio do sistema de secreção da IgA protease foi identificada e
conferiu com aquela obtida por Pohlner (1987) e Klauser et al., (1990).
Uma vez conhecida a seqüência gênica, o mapa de restrição foi estudado, o
que permitiu iniciar a construção do gene codificador da fitoquelatina sintética a ser
clonado nesse fragmento gênico.
Resultados 90
Figura 27: Seqüência de nucleotídeos do sistema de secreção da IgA protease de N. gonorrhoeae
presente no plasmídeo pHEβ. Sítios de clivagem das enzimas de restrição XbaI, BglI,
EcoRI e SalI e o códon de início de tradução (atg) estão em negrito. Seqüência de
aminoácidos são referentes a: peptídeo sinal (vermelho); epítopo E-tag (azul) e βdomínio da IgA protease (preto).
Resultados 91
5.2.2 Construção in vitro do gene sintético da Fitoquelatina destituído do
códon de terminação de tradução (EC20sp)
Uma vez que o gene sintético EC20sp deveria ser clonado sob a forma de
uma fusão gênica, entre a seqüência codificadora do peptídeo sinal e a do domínio
de ancoragem da IgA protease (β-domínio), foi necessário construí-lo sem o códon
de terminação de síntese protéica.
Esse gene sintético foi obtido a partir de uma reação de PCR com dois
oligonucleotídeos que se hibridizam (Figura 28).
Figura 28: A - Gene sintético da fitoquelatina (EC20) construído por Bae et al. (2000) ladeados com
sítios de BamH I e Hind III. Retângulos mostram o códon de início de tradução (ATG) e
término de tradução (TAA) codificados em cada oligonucleotídeo; B – Gene sintético
EC20sp construído nesse trabalho com sítios EcoR V e Sal I (143 pb). Dois nucleotídeos
(TA) foram adicionados para que o fragmento estivesse em fase de leitura nas
subseqüentes etapas de clonagens. Seqüência de aminoácidos codificados pelo gene
construído é mostrada. GAA e GAG = ácido glutâmico (E). TGT e TGC = Cisteína (C).
O produto de PCR foi analisado por eletroforese em gel de agarose e
mostrou um fragmento de DNA entre 100 e 200 pb, correspondendo ao tamanho
esperado para o gene EC20sp (143 pb) (Figura 29A).
O gene EC20sp foi clonado no vetor pGEM-T Easy e o plasmídeo resultante
foi empregado para transformar células de E. coli DH5α e os clones transformantes
foram analisados. Foram obtidas 21 colônias brancas resistentes a ampicilina. O
DNA plasmidial desses transformantes foi isolado e analisado quanto à presença do
gene EC20sp. Os plasmídeos transformantes foram analisados através de
eletroforese em gel de agarose, após a digestão com as enzimas de restrição
EcoRV e SalI. Dos 21 transformantes analisados, 15 apresentaram um fragmento de
Resultados 92
3018 pb, correspondente ao tamanho do vetor original e outro fragmento com um
tamanho de 143 pb, correspondente ao gene EC20sp, confirmando a clonagem
(Figura 29B). O plasmídeo com o inserto foi chamado pGEMEC20sp.
A
B
Figura 29: Perfil de migração de fragmentos de DNA após eletroforese em gel de agarose 0,7%
corado com brometo de etídio. A- Gene sintético EC20sp amplificado por PCR, 1Marcador molecular de 100 pb e 2- gene EC20sp (143pb) e B- 1- Marcador molecular de
1Kb, 2- Marcador molecular de 100 pb e 3- Plasmídeo pGEMEC20sp digerido com
EcoR V e Sal I.
Para verificar se a seqüência clonada no vetor pGEM-T Easy não continha
mutações, alterações na seqüência ou anelamento incorreto, o vetor construído,
pGEMEC20sp, foi seqüenciado utilizando o iniciador T7. Sete clones foram
seqüenciados e três deles apresentaram a seqüência correta do gene EC20sp.
Uma vez obtido o gene EC20sp, iniciou-se a sua clonagem no vetor pHEβ.
5.2.3 Clonagem do gene EC20sp no plasmídeo pHEβ
O gene sintético EC20sp foi isolado do plasmídeo pGEMEC20sp através de
digestão com as enzimas EcoRI e SalI e, a seguir, clonado no plasmídeo pHEβ
digerido com as mesmas enzimas (Figura 30).
Resultados 93
EcoRI
SalI
EcoRI
SalI
BglI
Klenow
EcoRV
Figura 30: Esquema representativo da construção do plasmídeo pCM1.
Resultados 94
A mistura de ligação desses fragmentos resultou, após a transformação em
células de E. coli DH5α, em 295 transformantes, dos quais 50 foram analisados. O
plasmídeo pHEβ não possui sítio de restrição EcoRV, enquanto o gene EC20sp
possui, fato esse que permitiu a distinção de dois clones recombinantes que foram
digeridos por essa enzima, confirmando a presença do inserto. Esse novo vetor foi
chamado pECβ.
Para remover a região 6His do plasmídeo pECβ e manter a fase de leitura
da construção, este plasmídeo foi digerido com a enzima BglI, tratado com Klenow,
digerido com a enzima EcoRV e recircularizado utilizando DNA ligase. Após a
transformação em células de E. coli DH5α, foram obtidos 816 transformantes, dos
quais 20 foram analisados. O DNA plasmidial de cada transformante foi submetido à
clivagem com as enzimas BglI, EcoRI, SpeI, EcoRV e mostrou não apresentar
nenhum desses sítios de restrição, sendo no entanto, digerido com as enzimas
SalI/XbaI, o que liberou um fragmento de aproximadamente 200 pb correspondente
à fusão do peptídeo sinal com o gene EC20sp (Figura 31)
Esse vetor foi chamado de pCM1 e a seqüência peptídeo sinal-EC20sp-Etag-β-domínio foi chamada de cassete de ancoragem. A seqüência nucleotídica
dessa construção foi confirmada por seqüenciamento (Figura 32).
Figura 31: Perfil de migração de fragmentos de DNA da digestão do plasmídeo pCM1 após
eletroforese em gel de agarose 0,7% corado com brometo de etídio. 1- Marcador
molecular de 1Kb, 2-Marcador molecular de 100 pb, 3- pHEβ não digerido, 4- pCM1/BglI,
5- pCM1/EcoRI, 6- pCM1/SpeI, 7- pCM1/EcoRV e 8- pCM1/SalI/XbaI.
Resultados 95
Figura 32: Seqüência de nucleotídeos e de aminoácidos da clonagem do gene EC20sp no
plasmídeo pHEβ. Em amarelo está indicada a seqüência da proteína EC20sp.
C – ácido glutâmico e E – cisteína.
5.3 Análise da expressão do cassete de ancoragem da EC20sp
5.3.1 Caracterização do perfil protéico através de SDS-PAGE e Westernblotting
A expressão do cassete de ancoragem da EC20sp foi examinada através da
indução do promotor plac. Para tanto, foi utilizada a linhagem de E. coli UT5600 não
transformada e transformada com os plasmídeos pHEβ e pCM1, comparando-se o
perfil protéico de cada linhagem por SDS-PAGE.
Pela análise do perfil de proteínas totais, foi possível verificar que as
linhagens E. coli UT5600/pHEβ e E. coli UT5600/pCM1 apresentaram uma banda
adicional, de aproximadamente 50 KDa, quando comparadas à linhagem não
transformada, comprovando a expressão do cassete de ancoragem construído
anteriormente (Figura 33).
Resultados 96
Figura 33: Análise do perfil protéico por SDS-PAGE. 1- marcador, 2- E. coli UT5600, 3- E. coli
UT5600/pHEβ e 4 E. coli UT5600/pCM1.
Com o intuito de investigar a ancoragem da EC20sp na membrana externa
da bactéria, as células foram separadas em fração solúvel, membrana interna e
membrana externa e verificada a presença da proteína heteróloga, utilizando como
repórter a seqüência peptídica do epítopo E-tag, o qual é reconhecido pelo anticorpo
anti-E-tag.
Pode-se observar na Figura 34A, que somente na fração de membrana
externa das linhagens UT5600/pHEβ e UT5600/pCM1, detectou-se a presença do Etag, enquanto a fração solúvel e a fração de membrana interna não apresentaram
nenhuma banda reconhecida pelo anticorpo.
A
B
Figura 34: A - Western-blotting das diferentes frações das células após incubação com anticorpo
anti-E-tag. 1- UT5600, 2- UT5600/pHEβ, 3- UT5600/pCM1, Fr- fração solúvel, MI membrana interna e ME- membrana externa. B- Representação esquemática da
ancoragem da EC20sp com a exposição do epítopo e da proteína EC20sp no meio
externo. Baseado em Veiga et al. (1999).
Resultados 97
5.3.2 Bioacúmulo de Cd+2 por E. coli com a proteína EC20sp ancorada na
membrana externa
O estudo de bioacúmulo de íons Cd+2, pelas linhagens de E. coli, mostrou
que a presença da EC20sp ancorada na membrana externa da bactéria foi capaz de
aumentar a capacidade de adsorção desse íon em comparação com as outras
linhagens (Figura 35). Enquanto a linhagem de E coli UT5600 adsorveu 17% do
cádmio da solução, a linhagem UT5600/pCM1 adsorveu 32%, ou seja, 89% a mais
que a primeira, em 2 h de incubação das células com a solução contendo 1 mM de
CdCl2. Em termos de peso seco de células, a linhagem com a EC20sp ancorada na
membrana foi capaz de adsorver 5 µg de Cd+2/mg de peso seco, enquanto a mesma
linhagem sem plasmídeo adsorveu apenas 2,5 µg de Cd+2/mg de peso seco, ou
seja, a proteína EC20sp aumentou em 100% a capacidade da célula em se ligar a
Cd+2.
Figura 35: Adsorção de cádmio pelas linhagens de E. coli utilizadas nesse trabalho, em solução de
+2
água contendo 1 mM de Cd .
5.4 Escolha de promotores com expressão constitutiva em C. metallidurans
CH34 para a expressão do cassete de ancoragem da EC20sp
A expressão constitutiva do cassete de ancoragem da EC20sp em
C. metallidurans CH34 é um elemento crucial da estratégia para a utilização dessa
bactéria como agente biorremediador em larga escala, em que não haja
necessidade do uso de indutores.
Resultados 98
Para avaliar a capacidade de expressão gênica promovida por cada
seqüência promotora utilizada nesse trabalho, utilizou-se o plasmídeo pBBEGFP,
construído no nosso laboratório, o qual apresenta o gene repórter da proteína verde
fluorescente (EGFP).
A escolha de seqüências promotoras para a expressão do gene repórter foi
realizada de três modos: (i) utilizando os dados da análise proteômica de
C. metallidurans CH34, realizada por Noël-Georis et al. (2004); (ii) utilizando
seqüências promotoras conhecidas por expressar genes constitutivamente em
C. metallidurans CH34 e (iii) utilizando do promotor pan.
5.4.1 Obtenção de seqüências promotoras de C. metallidurans CH34 através de
análise proteômica
O estudo proteômico de C. metallidurans CH34 cultivada em meio TSM
contendo íons de metais pesados permitiu a identificação de proteínas com grande
expressão (NOËL-GEORIS et al., 2004) (Figura 36), das quais 6 foram eleitas como
canditadas a possuírem promotores com forte expressão. As proteínas escolhidas
foram : P1 - proteína de membrana 1; P2 - citocromo D1; P3 óxido nítrico redutase;
P4 - proteína de membrana 2; P5 - proteína ribossomal L6 e P6 – proteína
ribossomal L10 (Tabela 8).
Resultados 99
Figura 36: Gel analítico 2-D de proteínas totais de C. metallidurans CH34 corado com coomassie. As
flechas em vermelho indicam as proteínas escolhidas com altos níveis de expressão.
Figura modificada a partir de Noël-Georis et al, (2004).
Tabela 8: Proteínas escolhidas por análise proteômica por apresentarem forte intensidade na análise
proteômica de C. metallidurans CH34.
Nome
proteína
tamanho
intensidade
Homologia
categoria
(KDa)
P1
S31
26,3
+++
Proteína transmembrana
Degradação protéica
P2
S193
9,7
++++++
Citocromo
Transporte de elétrons
P3
S265
18,2
++++
óxido nítrico redutase
Proteção celular
P4
S271
11,5
+++++
Proteína transmembrana
Função desconhecida
P5
S315
18,9
++++++
Síntese protéica
P6
S322
17,1
+++++
subunidade 50S da
proteína ribossomal L6
subunidade 50S da
proteína ribossomal L10
Síntese protéica
Resultados 100
Após a escolha dessas proteínas, as seqüências de DNA que as codificam
foram localizadas no genoma de C. metallidurans CH34 e as suas regiões
promotoras foram identificadas. Para obter os promotores, foram desenhados
iniciadores de PCR com sítio de restrição que permitiu a fusão exata da seqüência
do promotor com o códon ATG do gene da EGFP. Os iniciadores de PCR foram
desenhados com os sítios de restrição SacI e NdeI.
Esses iniciadores foram utilizados para amplificar as seis diferentes regiões
promotoras a partir do DNA total de C. metallidurans CH34 (Figura 37A).
Figura 37: Perfil de migração de fragmentos de PCR dos promotores de C. metallidurans CH34 após
eletroforese em gel de agarose 0,7% corado com brometo de etídio. 1- marcador
molecular de 100 pb; 2- PCR do promotor P1; 3 - PCR do promotor P2; 4- PCR do
promotor P3, 5- PCR do promotor P4; 6- PCR do promotor P5 e 7- PCR do promotor P6.
Os produtos de PCR de cada promotor foram clonados no vetor de
clonagem pCR2.1-TOPO. O número de transformantes de cada clonagem é
mostrado na Tabela 9.
Tabela 9: Análise da clonagem dos diferentes promotores no vetor pCR-TOPO.
P1
P2
P3
P4
P5
P6
n° transformantes
143
93
95
81
113
133
n° colônias brancas
10
83
44
35
99
38
n° transformantes analisados
5
5
5
5
5
5
n° clones
5
4
5
3
5
5
Resultados 101
Foram analisados cinco transformantes de cada clonagem e a presença do
inserto foi confirmada após a digestão com enzimas de restrição NdeI e SacI. Na
Figura 38, é possível observar um fragmento de 4,2 Kb, referente ao vetor pCRTOPO e, outro fragmento referente a cada seqüência promotora, confirmando a
clonagem. Os plasmídeos construídos foram chamados pTOPOP1 a pTOPOP6.
Figura 38: Perfil de migração de fragmentos de DNA referentes aos promotores de C. metallidurans
CH34 amplificados por PCR e clonados no vetor pCR2.1-TOPO após eletroforese em gel
de agarose 0,7% corado com brometo de etídio. 1- marcador molecular de 1 Kb; 2marcador molecular de 100 pb; 3- plasmídeo pTOPOP1; 4- plasmídeo pTOPOP2, 5plasmídeo pTOPOP3; 6- plasmídeo pTOPOP4; 7- plasmídeo pTOPOP5 e 8- plasmídeo
pTOPOP6. Todos os plasmídeos construídos foram digeridos com NdeI e SacI.
Todas as seis seqüências promotoras clonadas no vetor pCR2.1-TOPO
foram subclonadas no vetor pBBEGFP, para que a expressão da EGFP pudesse ser
medida, permitindo a escolha de um promotor que estivesse expressando o gene
repórter. Para tanto, os seis plasmídeos construídos (pTOPOP1 a pTOPOP6) foram
digeridos com as enzimas NdeI e SacI e os fragmentos correspondentes às
seqüências promotoras foram isolados. O vetor pBBEGFP também foi digerido com
as mesmas enzimas e ligado a cada um dos promotores (Figura 39).
Resultados 102
NdeI
SacI
NdeI
SacI
Figura 39: Esquema representativo da construção do plasmídeo pCMP1. Os plasmídeos pCMP2 a
pCMP6 foram construídos da mesma maneira.
A transformação de células de E. coli com as misturas de ligação dos seis
promotores com o vetor pBBEGFP permitiu a obtenção de transformantes
resistentes a cloranfenicol em todas as transformações (Tabela 10).
Tabela 10: Análise da clonagem dos diferentes promotores no vetor pBBEGFP.
P1
P2
P3
P4
P5
P6
n° transformantes
10
24
36
28
8
17
n° transformantes analisados
5
5
5
5
5
5
n° clones
1
2
5
3
2
5
Resultados 103
O DNA plasmidial de cinco transformantes de cada construção foi extraído
e, após digestão com enzimas NdeI e SacI, foi possível observar plasmídeos
apresentando duas bandas em gel de agarose submetido a eletroforese, uma
referente ao tamanho do plasmídeo original (5,5 Kb) e outra referente a cada
promotor, confirmando a clonagem (Figura 40). Os vetores construídos foram
chamados pCMP1 a pCMP6.
Figura 40: Perfil de fragmentos da digestão do plasmídeo pBBEGFP com os diferentes promotores
após eletroforese em gel de agarose 1,2% corado com brometo de etídio. 1- Marcador
molecular de 1 Kb; 2- Marcador molecular de 100 pb; 3- plasmídeo pCMP1; 4plasmídeo pCMP2, 5- plasmídeo pCMP3; 6- plasmídeo pCMP4; 7- plasmídeo pCMP5 e
8- plasmídeo pCMP6. Todos os plasmídeos construídos foram digeridos com NdeI e
SacI.
5.4.2 Obtenção das seqüências promotoras conhecidas por expressar genes
constitutivamente em C. metallidurans CH34
5.4.2.1 Obtenção do promotor czcIp
A seqüência promotora czcIp foi amplificada a partir do DNA total de
C. metallidurans CH34 e chamada de promotor P7 (Figura 41A). Esta seqüência
promotora foi clonada no vetor pCR-TOPO que foi usado para transformar células de
E. coli DH5α. Foram obtidos 85 transformantes resistentes a ampicilina, dos quais
cinco tiveram seu DNA plasmidial analisado. O DNA plasmidial de todos os
transformantes analisados apresentaram duas bandas, uma referente ao vetor
Resultados 104
original (3900 pb) e outra referente ao promotor (314 pb) (Figura 41B). O novo
plasmídeo foi chamado pTOPOP7.
Esse promotor foi isolado do vetor pTOPOP7 através de digestão com
enzimas de restrição NdeI e BamHI e subclonado no plasmídeo pBBEGFP para
avaliar a capacidade de expressar o gene EGFP. Foram obtidos 19 transformantes
resistentes a cloranfenicol. O DNA plasmidial de oito transformantes mostrou duas
bandas quando digeridos com as enzimas NdeI e BamHI, uma referente ao
plasmídeo original (5,5 Kb) e outra referente ao inserto (314 pb), confirmando a
construção do plasmídeo pCMP7 (Figura 41C).
A
B
C
314 pb
Figura 41: Perfil de migração de fragmentos de DNA do promotor czcIp após eletroforese em gel de
agarose 0,7% corado com brometo de etídio. A- Marcador molecular de 100 pb e P7promotor P7 amplificado por PCR a partir do DNA total de C. metallidurans CH34; B- 1Marcador molecular de 1 Kb; 2- Marcador molecular de 100 pb; 3- plasmídeo pTOPOP7
digerido com NdeI e BamHI; C- Marcador molecular de 1 Kb; 2- Marcador molecular de
100 pb, 3- plasmídeo pCMP7 digerido com NdeI e BamHI.
5.4.2.2 Obtenção do promotor plac
O plasmídeo pLG, construído no nosso laboratório, expressa o gene da
proteína verde fluorescente (EGFP) sob o controle do promotor plac. O fragmento de
DNA contendo o promotor plac e o gene da EGFP foi isolado do plasmídeo pLG
através de digestão com as enzimas VspI e XhoI e clonado no vetor pBBR1MCS,
também digerido com as mesmas enzimas (Figura 42). Após eletroporação em
células de E. coli, foram obtidos 11 transformantes resistentes a cloranfenicol, dos
quais 5 foram analisados. Após a digestão do DNA plasmidial desses transformantes
com VspI e XhoI, observou-se que quatro deles apresentaram duas bandas: uma
referente ao tamanho do vetor original (4700 pb) e, outra referente ao tamanho do
Resultados 105
inserto (950 pb), confirmando a clonagem (Figura 43). Esse vetor foi chamado
pLEGFP.
VspI
XhoI
VspI
XhoI
Figura 42: Esquema representativo da construção do plasmídeo pLEGFP.
Figura 43: Perfil de migração de fragmentos do plasmídeo pLEGFP digerido com VspI e XhoI após
eletroforese em gel de agarose 0,7% corado com brometo de etídio. 1- Marcador
molecular de 1 Kb; 2- plasmídeo pLEGFP digerido com VspI e XhoI.
Resultados 106
5.4.3 Obtenção da seqüência do promotor pan de B. subtilis
O plasmídeo pBB-panEGFP, construído no nosso laboratório, possui a
seqüência promotora do gene mrgA de B. subtilis modificada, controlando a
expressão do gene EGFP, e foi avaliado quanto à sua expressão em
C. metallidurans CH34.
5.5 Análise da expressão de EGFP pelos diferentes promotores
Após a construção dos nove plasmídeos portadores de diferentes
seqüências promotoras a montante do gene da EGFP em E. coli, células de
C. metallidurans CH34 foram utilizadas como hospedeiras para cada um dos
plasmídeos construídos. Tanto C. metallidurans CH34, quanto E. coli carregando
esses vetores, foram analisadas em microscópio de epifluorescência, o que permitiu
observar células com fluorescência verde das duas bactérias, portadoras de
algumas das construções (Figura 44).
A
B
Figura 44: Visualização de células de C. metallidurans CH34 em microscópio de epifluorêscencia
com aumento de 1000 vezes. A - Células de C. metallidurans CH34/pBBR1MCS e B –
Células de C. metallidurans CH34/pBB-panEGFP
No entanto, não foi possível detectar, por esse método, a expressão da
EGFP para todas as construções e, portanto, a detecção e quantificação foram
realizadas por um método mais sensível: a citometria de fluxo.
Resultados 107
5.6 Quantificação da expressão da proteína verde fluorescente através de
citometria de fluxo
Todas as construções tanto em E. coli, quanto em C. metallidurans CH34,
foram analisadas por citometria de fluxo. Amostras de culturas de cada bactéria
foram retiradas na fase exponencial de crescimento e a intensidade de fluorescência
para cada construção foi calculada pela mediana da intensidade relativa de cada
população celular.
Na Figura 45 (A e C), pode-se observar que a mediana da intensidade de
fluorescência relativa em C. metallidurans CH34/pBBEGFP (controle) foi de 50,48
para a população de células analisadas enquanto esse valor foi de 3586,64 em
C. metallidurans CH34/pBB-panEGFP cultivada na presença de Cd+2. O valor do
controle foi considerado como basal e foi subtraído de todos os experimentos.
Ainda na Figura 45 (B e D), podemos observar o gráfico de distribuição
celular que avalia o tamanho das células (FS) versus a complexidade celular (SS).
Esses gráficos revelam que a expressão do gene da EGFP não alterou o tamanho
celular da população analisada, nem tampouco modificou a complexidade das
células, pois ambas apresentaram a mesma distribuição celular. A Figura 44E
mostra
comparativamente
o
deslocamento
do
gráfico
de
intensidade
de
fluorescência obtida nas células sem expressão da EGFP (controle) em relação às
células expressando EGFP (C. metallidurans CH34/pBB-panEGFP).
A quantificação da expressão da EGFP sob o controle de cada um dos nove
diferentes promotores, para as duas bactérias, foi realizada e os valores foram
plotados em gráficos para comparação da capacidade de cada promotor (Figura 46).
Resultados 108
A
B
3586,64
D
C
E
Figura 45: A e C- gráficos de intensidade de fluorescência relativa após análise de 30000 eventos
dos clones de C. metallidurans/pBBEGFP (controle) e C. metallidurans/pBB-panEGFP; B
e D- distribuição celular característico de cada amostra, indicando apenas um tipo celular
e E- gráfico em 3D comparando as amostras A e C quanto ao deslocamento da
intensidade de fluorescência. FL1- fluorescência, SS- “side scatter” e FS- “forward
scatter”.
Resultados 109
A
B
Figura 46: A: intensidade de fluorescência relativa medida através de citometria de fluxo em
C. metallidurans CH34 carregando os diversos plasmídeos construídos nesse trabalho.
Foram empregados meios com e sem metais pesados; B: intensidade de fluorescência
relativa medida através de citometria de fluxo em E. coli carregando os diversos plasmídeos
construídos nesse trabalho.
Resultados 110
Em C. metallidurans CH34 a expressão do gene repórter pelos promotores
P1 a P7 foi medida em células cultivadas em meio contendo ou não metais pesados.
Entretanto, baixas intensidades de fluorescência foram detectadas nessa bactéria
quando esses promotores foram avaliados, mesmo na presença de íons de metais.
Na bactéria E. coli esses promotores não mostraram nenhuma indução da
expressão da EGFP.
A expressão do gene da EGFP pelo promotor plac em C. metallidurans
CH34 também mostrou níveis baixos de intensidade de fluorescência (61,9), além
disso, se mostrou inalterada tanto na presença de glicose, quanto na de IPTG. Em
E. coli, o promotor plac produziu o maior nível de expressão da EGFP nessa
bactéria. Na presença de IPTG, a expressão da EGFP foi de aproximadamente 6,5
vezes maior àquela obtida na presença de glicose (1%) e 14 vezes superior à
expressão desse mesmo gene em C. metallidurans CH34.
A expressão do gene da EGFP pelo promotor pan se mostrou muito forte
em C. metallidurans CH34, além disso, a presença de íons de metais pesados
aumentou os níveis de expressão, chegando ao máximo de intensidade de
fluorescência relativa quando a bactéria C. metallidurans CH34 foi cultivada em
presença de Cd+2 (3536,16).
A expressão heteróloga da EGFP pelo promotor pan em C. metallidurans
CH34 cultivada sem metais, mostrou ser 24 vezes maior quando comparada ao plac
e, na presença de Cd+2 no meio de cultivo, a intensidade de fluorescência foi
aproximadamente 55 vezes superior ao plac nessa bactéria.
Em E. coli, a expressão da EGFP pelo promotor pan foi muito menor do que
aquela observada em C. metallidurans CH34. A média da intensidade de
fluorescência em E. coli, mesmo na presença de íons metálicos, foi 3 vezes ou 7,5
vezes menor que em C. metallidurans CH34 cultivada na ausência ou presença de
Cd+2, respectivamente.
Com base nestes resultados, decidimos empregar o promotor pan para a
expressão do cassete de ancoragem em C. metallidurans CH34.
5.7 Construção do cassete de expressão-ancoragem da EC20sp
Para expressar o cassete de ancoragem da EC20sp em C. metallidurans
CH34 utilizando o promotor pan, primeiramente foi necessário realizar uma
Resultados 111
amplificação por PCR desse cassete. O PCR foi realizado utilizando o plasmídeo
pCM1 como DNA molde e o produto amplificado foi clonado no vetor pCR 2.1TOPO. A mistura de ligação do produto de PCR com o vetor foi utilizada para
transformar células de E. coli DH5α, produzindo 17 colônias resistentes a ampicilina,
sendo 10 colônias brancas e 7 azuis. O DNA plasmidial de cada uma das 10
colônias brancas foi extraído e a presença do inserto foi confirmada após análise de
restrição com as enzimas NdeI e KpnI. Na Figura 47, observa-se a presença de uma
banda correspondente ao tamanho do vetor original (3900 pb) e outra ao cassete de
ancoragem (1580 pb), confirmando a clonagem. Este novo plasmídeo foi chamado
pTOPOANC.
Figura 47: Perfil de migração de fragmentos do plasmídeo pTOPOANC digerido com NdeI e KpnI
após eletroforese em gel de agarose 0,7% corado com brometo de etídio. 1- Marcador
molecular de 1 Kb; 2- plasmídeo TOPOANC digerido com NdeI e KpnI.
No passo seguinte, o cassete de ancoragem foi isolado do vetor
pTOPOANC através de digestão com as enzimas de restrição NdeI e KpnI e,
subclonado no vetor pBB-panEGFP, também digerido com as mesmas enzimas
(Figura 48).
Resultados 112
PCR
*
NdeI
KpnI
NdeI
KpnI
Figura 48: Esquema representativo da construção do plasmídeo pCM2.
A mistura de ligação do cassete de ancoragem com o plasmídeo
pBB-panEGFP foi utilizada para transformar células de E. coli DH5α. Foram obtidos
12 transformantes resistentes a cloranfenicol, dos quais cinco foram analisados. A
clonagem do cassete de ancoragem a jusante do promotor pan, foi confirmada pela
Resultados 113
análise de restrição (Figura 49B). O novo plasmídeo construído foi chamado pCM2 e
o
fragmento
pan-PS-EC20sp-E-tag-β-domínio
foi
chamado
de
cassete
de
expressão-ancoragem da EC20sp.
Os sítios únicos de restrição das enzimas NdeI, SalI, HindIII e KpnI foram
confirmados, produzindo somente uma banda de 6,7 Kb referente ao tamanho do
plasmídeo pCM2.
A digestão de pCM2 com SacI permite que o cassete de
expressão-ancoragem da EC20sp seja liberado, o que foi confirmado pela análise
eletroforética em gel de agarose. Digestões duplas de pCM2 com SalI/HindIII;
SalI/SacI e NdeI/HindIII e uma tripla digestão com NdeI/HindIII/ SacI permitiram
confirmar a presença de cada fragmento na construção realizada (Figura 49).
A
B
Figura 49: A: Plasmídeo pCM2 e tamanho dos fragmentos do cassete expressão-ancoragem da
EC20sp; B: Perfil de migração de fragmentos da digestão do vetor pCM2 com
diversas enzimas após eletroforese em gel de agarose 0,7% corado com brometo de
etídio. 1- marcador molecular de 1 Kb; 2- pCM2/NdeI; 3- pCM2/SalI; 4- pCM2/SacI; 5pCM2/HindIII; 6- pCM2/KpnI; 7- pCM2/SalI/HindIII; 8- pCM2/SalI/SacI; 9pCM2/NdeI/HindIII e 10- pCM2/ NdeI/HindIII/ SacI.
Por fim, a construção gênica foi confirmada por seqüenciamento como se
pode observar na Figura 50.
Resultados 114
Figura 50: Seqüência de nucleotídeos e de aminoácidos do plasmídeo pCM2. As regiões
operador/-35/-10/rbs do promotor pan estão destacadas nos retângulos amarelos. As
seqüências nucleotídicas e de aminoácidos do peptídeo sinal, do gene EC20sp, do Etag e início do β-domínio são mostradas.
5.8 Análise da expressão do cassete de ancoragem da EC20sp em
C. metallidurans CH34
5.8.1 Caracterização do perfil protéico através de SDS-PAGE e Westernblotting
A expressão do cassete de ancoragem da EC20sp sob o comando do
promotor pan foi avaliada nas linhagens de C. metallidurans CH34 não transformada
e transformada com os plasmídeos pBBR1MCS e pCM2, através da comparação do
perfil protéico de cada linhagem por SDS-PAGE.
Pela análise do perfil de proteínas totais, foi possível verificar que a
linhagem
C.
metallidurans/pCM2
apresentou
uma
banda
adicional,
de
aproximadamente 50 KDa, quando comparadas às linhagens não transformada e
C. metallidurans/pBBR1MCS, comprovando a expressão do cassete de ancoragem
(Figura 51).
Para avaliar se a proteína estava, de fato, sendo ancorada na
membrana externa de C. metallidurans CH34, as frações de membrana das
linhagens transformada e não transformada foram isoladas e a presença da proteína
de fusão foi verificada através de Western-blotting contra o epítopo E-tag. Os
resultados mostraram que apenas na fração de membrana externa foi detectada a
presença do E-tag, indicando que, de fato, a proteína estava ligada na membrana
externa da bactéria (Figura 52).
Resultados 115
Figura 51: Análise do perfil protéico por SDS-PAGE. 1- marcador, 2- C. metallidurans CH34, 3C. metallidurans/pBBR1MCS e 4- C. metallidurans/pCM2.
Figura 52: Western-blotting das diferentes frações das células após incubação com anticorpo anti-Etag. 1- C. metallidurans CH34, 2- C. metallidurans CH34/pBBR1MCS, 3- C. metallidurans
CH34/pCM2, Fr- fração solúvel, MI - membrana interna e ME- membrana externa.
5.8.2 Bioacúmulo de íons de metais pesados por C. metallidurans CH34
recombinante
Para verificar a funcionalidade da ancoragem da EC20sp na superfície de
C. metallidurans CH34, foram realizados inicialmente experimentos para avaliar a
adsorção de Cd+2 e o melhor tempo de incubação para otimizar a ligação do metal à
Resultados 116
bactéria. Para tanto, 10 mL de água MilliQ contendo diferentes concentrações do
metal foram incubadas com uma mesma massa microbiana pré-cultivada e alíquotas
foram retiradas em diferentes tempos.
Os resultados mostraram que, quando se utilizou 100 µM de Cd+2 em
solução, a remoção deste íon na presença de C. metallidurans/pCM2 (26 mg de
peso seco) foi de, aproximadamente, 80% em 24 h de incubação, mostrando a
superior capacidade de tirar o metal de solução em comparação às linhagens
controle do experimento (Figura 53A). Na presença de 1000 µM de Cd+2, a linhagem
recombinante também apresentou melhor desempenho em comparação às outras
linhagens.
Além
disso,
nesse
experimento
verificamos
que
células
de
C. metallidurans/pCM2 pré-cultivadas na presença de cádmio apresentaram um
aumento na capacidade de remoção de metal, devido à indução da expressão do
cassete de ancoragem da EC20sp pelo promotor pan, como já verificado nos
experimentos de citometria (Figura 53B).
Figura 53: Porcentagem de cádmio residual em solução aquosa ao longo da incubação com as
+2
diferentes linhagens de C. metallidurans utilizadas nesse trabalho. A- 100 µM de Cd e B:
+2
1000 µM de Cd .
Resultados 117
A partir deste experimento, foi possível definir o melhor tempo de incubação
da bactéria com a solução contendo o metal pesado. No entanto, por esse método,
apesar de se verificar a diminuição da concentração do cádmio na solução ao longo
do tempo de incubação com a massa microbiana, a quantificação do cádmio
adsorvido pela massa microbiana estava sendo estimada apenas indiretamente.
Para vencer essa limitação, os experimentos seguintes foram realizados de
forma a quantificar o metal diretamente na massa microbiana de cada linhagem
após 24 de incubação em solução contendo 1000 µM de cada metal isoladamente e,
no caso do Hg+2, o experimento foi realizado com 50 µM. Verificou-se também a
viabilidade celular depois de 24 h de incubação com água contendo cada metal e,
em todos os casos, a viabilidade foi de 100%.
Os resultados da quantificação do cádmio na massa microbiana da
linhagem de C. metallidurans/pCM2 pré-cultivada na presença de Cd+2 mostraram
que esta ligou 17,6 µM de Cd+2/mg de peso seco de célula em 24 h de incubação,
59% superior em relação à linhagem selvagem e 40% superior em relação à mesma
linhagem sem indução (Figura 54). Além disso, verificou-se que as células induzidas
com Cd+2 foram capazes de adsorver esse metal enquanto cresciam (controle
induzido, tempo 0).
Figura 54: Adsorção de cádmio pelas diferentes linhagens de C.metallidurans. A quantidade de
+2
cádmio ligada às células é indicada em micromoles de Cd por miligrama de peso seco
de células.
Resultados 118
A partir desses resultados, outros metais foram empregados nas mesmas
condições para avaliar o perfil de adsorção das diferentes linhagens de
C. metallidurans.
A quantificação do cobalto na massa microbiana mostrou que a linhagem de
C. metallidurans/pCM2 induzida apresentou 5,1 µM de Co+2/mg de peso seco de
célula, não diferindo significativamente da mesma linhagem sem indução, sendo no
entanto, 13% superior à linhagem controle (Figura 55).
Figura 55: Adsorção de cobalto pelas diferentes linhagens de C.metallidurans. A quantidade de
+2
cobalto ligada às células é indicada em micromoles de Co por miligrama de peso seco
de células.
Quando o cobre foi quantificado na massa microbiana, verificou-se que a
linhagem de C. metallidurans/pCM2 induzida apresentou maior capacidade de
ligação ao metal em relação às outras, assim como para Cd+2 e Co+2. Enquanto a
linhagem de C. metallidurans/pCM2 induzida ligou 42,65 µM de Cu+2/mg de peso
seco de célula, a linhagem controle ligou 24,29 µM de Cu+2/mg de peso seco de
célula, sendo a primeira 76% superior à segunda (Figura 56). Além disso,
observamos que as células de C. metallidurans/pCM2 pré-cultivadas na presença de
Cu+2 ligaram uma quantidade significativa desse metal enquanto cresciam e que isso
não impediu que a massa microbiana fosse capaz de ligar mais metal a partir de
uma solução mais concentrada durante o período de incubação.
Resultados 119
Figura 56: Adsorção de cobre pelas diferentes linhagens de C. metallidurans.. A quantidade de cobre
+2
ligada às células é indicada em micromoles de Cu por miligrama de peso seco de
células.
Para o Hg+2, cuja concentração utilizada neste experimento foi de 50 µM,
os resultados mostraram que, após 24 h, a linhagem C. metallidurans/pCM2
cultivada sem indução ligou 0,1 µM de Hg+2/mg de peso seco de célula, sendo este
resultado 100% superior em relação às linhagens controle ou induzida (Figura 57).
Figura 57: Adsorção de mercúrio pelas diferentes linhagens de C.metallidurans. A quantidade de
+2
mercúrio ligada às células é indicada em micromoles de Hg por miligrama de peso seco
de células.
Resultados 120
Quando a quantificação foi realizada na massa microbiana incubada com
+2
Mn , verificou-se que a linhagem C. metallidurans/pCM2 induzida apresentou 31%
de aumento na capacidade de ligação desse íon em relação à linhagem controle,
chegando a ligar 6,2 µM de Mn+2/mg de peso seco de célula (Figura 58).
Figura 58: Adsorção de manganês pelas diferentes linhagens de C.metallidurans. A quantidade de
+2
manganês ligada às células é indicada em micromoles de Mn por miligrama de peso
seco de células.
A quantificação de Ni+2 na massa microbiana mostrou que a linhagem
C. metallidurans/pCM2 induzida foi 45% superior à linhagem controle e 31% superior
à mesma linhagem sem indução (Figura 59).
Figura 59: Adsorção de níquel pelas diferentes linhagens de C.metallidurans. A quantidade de níquel
+2
ligada às células é indicada em micromoles de Ni por miligrama de peso seco de
células.
Resultados 121
Para o zinco, verificou-se que a massa microbiana da linhagem
C. metallidurans/pCM2 pré-cultivada na presença desse metal foi capaz de ligar
51,07 µM de Zn+2/mg de peso seco de célula após 24 h de incubação com água
contendo 1000 µM de Zn+2. Neste caso, foi verificado também que as células préinduzidas já haviam ligado uma grande quantidade desse íon durante o crescimento
celular. Este resultado é 219% superior à linhagem controle.
Figura 60: Adsorção de zinco pelas diferentes linhagens de C.metallidurans. A quantidade de zinco
+2
ligada às células é indicada em micromoles de Zn por miligrama de peso seco de
células.
Com
o
Pb+2,
os
resultados
mostraram
que
a
linhagem
C. metallidurans/pCM2 induzida foi capaz de ligar 54,75 µM de Pb+2/mg de peso
seco de célula,ou seja, 210% superior à capacidade de ligação desse metal
observada na linhagem controle. Também neste caso, verificamos que a quantidade
desse metal adsorvido na massa das células pré-cultivadas foi grande, o que indica
a afinidade desse íon pela bactéria contendo a EC20sp (Figura 61).
Resultados 122
Figura 61: Adsorção de chumbo pelas diferentes linhagens de C.metallidurans. A quantidade de
+2
chumbo ligada às células é indicada em micromoles de Pb por miligrama de peso seco
de células.
Exceto para o Hg+2, a linhagem que apresentou melhor desempenho na
ligação a todos os metais analisados foi a C. metallidurans/pCM2 pré-cultivada na
presença dos respectivos íons metálicos. No entanto, a capacidade de ligação dessa
linhagem variou para cada metal, em termos de quantidade de metal e, para uma
comparação mais exata, colocamos no mesmo gráfico apenas o valor de adsorção
de C. metallidurans/pCM2 induzido (Figura 62). Nota-se que há uma preferência de
ligação por alguns metais, indicando que há uma escala de afinidade da EC20sp.
Figura 62: Adsorção de diferentes metais pela linhagem de C.metallidurans/pCM2 induzida. A
quantidade de metal ligada às células é indicada em micromoles de metal por miligrama
de peso seco de células.
Resultados 123
Por fim, foi avaliada também a capacidade das linhagens em ligar metais a
partir de soluções aquosas contendo misturas de metais. Para tanto, todos os metais
utilizados nesse trabalho foram adicionados na mesma concentração (100 µM) em
solução aquosa e incubados por 24 h com a massa microbiana de cada linhagem
sendo a seguir medida a quantidade de metal ligado à célula. Os resultados
comprovaram que o perfil de ligação a metais foi alterado pela presença da EC20sp
na superfície de C. metallidurans comparada à linhagem controle. A linhagem
controle C. metallidurans/pBBR1MCS apresentou a seguinte afinidade pelos metais:
Cu>Cd>Pb>Zn>Ni>Co>Mn>Hg e a linhagem C. metallidurans/pCM2 induzida
mostrou ligar íons com a afinidade: Zn>Pb>Cd>Cu>Ni>Mn>Co>Hg (Figura 63). Além
disso, nota-se que a escala de afinidade da linhagem C. metallidurans/pCM2 sem
indução manteve-se a mesma que a mesma linhagem induzida, mostrando a
consistência do resultado, com a exceção do Zn. Estes resultados também
apresentaram concordância com aqueles onde só um tipo de metal foi avaliado por
vez, ou seja, a preferência de ligação tanto em misturas quanto na presença de
apenas um tipo de metal manteve-se nas linhagens de C. metallidurans, com
exceção do Zn+2 e Pb+2.
Figura 63: Adsorção de metais pelas linhagens de C.metallidurans em solução contendo múltiplos
metais A quantidade de metal ligada às células é indicada em micromoles de metal por
miligrama de peso seco de células.
Resultados 124
5.9 Caracterização das linhagens de C. metallidurans CH34 por Microscopia
Eletrônica de Transmissão
Para determinar a presença e a localização do metal ligado à célula
bacteriana utilizou-se a técnica de Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET).
Para tanto, as linhagens de C. metallidurans CH34 e C. metallidurans CH34/pCM2,
cultivadas na presença ou ausência de Pb+2, foram incubadas em água MilliQ
contendo Pb+2.
Para visualização das estruturas celulares da bactéria por MET, geralmente
há necessidade de tratamento de contrastação com citrato de chumbo e acetato de
uranila. Neste experimento utilizamos células com este tratamento e células sem
contrastação, uma vez que o Pb+2 já deveria estar ligado na massa microbiana
incubada com água MilliQ contendo este metal. Os resultados mostraram que nas
células com tratamento de contrastação não foi possível distinguir o Pb+2 advindo do
tratamento inicial daquele advindo da solução aquosa. No entanto, nas células sem
o tratamento de contrastação, foi possível distinguir agregados de partículas de Pb+2
ligados na superfície da bactéria.
A análise por microscopia mostrou que a linhagem selvagem de
C. metallidurans CH34 foi capaz de ligar Pb+2 de uma solução aquosa (Figura 64 A e
B), o que está em concordância com os resultados obtidos por ICP-MS, que
detectou a presença de Pb+2 ligada na massa bacteriana. Além disso, através da
MET, observamos com clareza que o Pb+2 ligou-se, principalmente, na membrana
externa da bactéria. Ao compararmos este resultado com aquele obtido com a
linhagem recombinante C. metallidurans CH34/pCM2 (Figura 64 C e D), fica
evidente que há um aumento significante na concentração do Pb+2 ligado na
membrana externa da bactéria, mostrando que, de fato, a presença da EC20sp
otimizou a capacidade biorremediadora da linhagem recombinante, reafirmando os
resultados obtidos por ICP-MS.
Resultados 125
A
C
Figura
64:
B
D
Eletromicrografia de transmissão de cortes histológicos de células de
C. metallidurans CH34. A - C. metallidurans CH34 cultivada em meio TSM e
incubada com água MilliQ; B - C. metallidurans CH34 cultivada em meio TSM e
+2
incubada com água MilliQ contendo Pb ; C - C. metallidurans CH34/pCM2 cultivada
em meio TSM e incubada com água MilliQ e D - C. metallidurans CH34/pCM2
+2
+2
cultivada em meio TSM contendo Pb e incubada com água MilliQ contendo Pb . A
visualização das células foi realizada com aumento de 46.000 vezes. Setas indicam a
+2
presença de agregados do elemento Pb ligados na membrana externa bacteriana.
Resultados 126
5.10 Avaliação
recombinante
do
crescimento
da
linhagem
C.
metallidurans
CH34
Para verificar o comportamento da linhagem C. metallidurans CH34/pCM2
em relação à linhagem selvagem, foram realizadas curvas de crescimento em meio
TSM (Figura 65).
Figura 65: Curvas de crescimento das linhagens de C. metallidurans CH34 em meio TSM. DO600:
densidade ótica medida em comprimento de onda de 600 nanômetros. Cada ponto
representa a média de uma triplicata e seu desvio padrão.
Como se pode observar na Figura 65, a linhagem C. metallidurans
CH34/pCM2 apresentou uma ligeira diminuição na velocidade de crescimento em
relação à não recombinante durante a fase logarítmica, com µmáx a 0,41 h-1,
enquanto a linhagem selvagem apresentou µmáx de 0,49 h-1. Entretanto, em 36 horas
de cultivo, a massa microbiana final das linhagens atingiu os mesmos valores. Cabe
ressaltar que as linhagens recombinantes foram cultivadas na presença de
antibiótico, o que representa um gasto energético maior para o crescimento em
relação à linhagem não recombinante.
Discussão 127
6 DISCUSSÃO
6.1 Caracterização fisiológica de C. metallidurans CH34
Os experimentos de resistência de C. metallidurans CH34 frente a
antibióticos foram realizados com ampicilina, canamicina, cloranfenicol, neomicina e
tetraciclina, uma vez que os vetores disponíveis no laboratório para a transformação
genética dessa bactéria apresentavam genes de resistência a esses agentes
antimicrobianos.
Inicialmente, tínhamos no laboratório duas linhagens de C. metallidurans
CH34 em princípio iguais, uma proveniente da coleção de cultura alemã DSMZ
(Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen) e outra, da coleção de
cultura americana ATCC (American Type Culture Collection). No entanto, apesar de
ambas terem apresentado altas resistências aos antibióticos, verificaram-se grandes
diferenças entre elas. A literatura mostra que C. metallidurans CH34 possui
resistência a vários antibióticos, no entanto, os valores que encontramos não
apresentaram concordância (SIDDIQUI et al., 1988).
Nesse trabalho, constatou-se que as duas linhagens de C. metallidurans
CH34 resistiram a altas concentrações de ampicilina, canamicina e neomicina. A
análise genômica dessa bactéria identificou 91 proteínas relacionadas à resistência
a drogas e compostos tóxicos, que podem ter afinidade por esses antibióticos,
inibindo sua ação (D`COSTA et al., 2006; NIKAIDO; ZGURSKAYA, 1999; VON
ROZICKI et al., 2005).
Para os antibióticos tetraciclina e cloranfenicol, a bactéria mostrou maior
sensibilidade, o que permitiu a escolha de um vetor adequado à seleção de
transformantes.
Novamente,
recorrendo
ao
estudo
genômico
de
C. metallidurans CH34, verificamos que apenas duas proteínas são relacionadas à
resistência a cloranfenicol nesta bactéria, o que pode explicar a menor resistência a
esse antibiótico em relação àqueles analisados anteriormente (VON ROZICKI et al.,
2005).
A diferença de resistência das duas linhagens pode estar relacionada a
fatores que reconhecidamente ocorrem em C. metallidurans CH34, como a ativação
de transposons em temperaturas maiores de 37 °C, qu e pode ter disseminado genes
de resistência no genoma da bactéria da coleção DSMZ, ou ainda pela obtenção de
Discussão 128
novos genes no ambiente, pois essa bactéria é reconhecidamente uma boa aceptora
de genes exógenos (TAGHAVI et al., 1997). Por apresentar maior sensibilidade à
maioria dos antibióticos, a linhagem ATCC foi aquela utilizada nos experimentos
subseqüentes desse trabalho.
O segundo passo da caracterização fisiológica de C. metallidurans CH34 foi
verificar o pH ótimo de crescimento dessa bactéria, uma vez que esse dado não
estava disponível na literatura.
O meio de cultura indicado para avaliar o crescimento de C. metallidurans
CH34 é o meio TSM, que tem sido usado extensivamente para avaliar a resistência
dessa bactéria frente a íons de metais pesados, pois não complexa e não promove a
precipitação desses íons, como ocorre geralmente com os meios ricos. Entretanto,
nem todos os experimentos com TSM foram realizados contemplando o pH ótimo de
crescimento de C. metallidurans CH34, o que resultou em grandes variações nos
valores de resistência citados na literatura até hoje (Tabela 11). Dessa forma, o
meio TSM foi utilizado em diferentes valores de pH para cultivar C. metallidurans
CH34.
Verificamos que o crescimento ótimo dessa bactéria ocorreu em meio de
pH 5.0, atingindo máxima densidade celular no menor tempo de cultivo, parâmetro
esse extremamente importante para utilização em processos de biorremediação,
pois permite obter a maior massa microbiana para remoção de íons de metais em
efluentes. Os ambientes naturais de ocorrência de C. metallidurans CH34
apresentam valores de pH entre 5.0 e 6.0 (DIELS; MERGEAY, 1990) e os resultados
obtidos nesse trabalho mostram que nesses pHs essa bactéria apresentou, de fato,
os maiores níveis de crescimento.
Discussão 129
Tabela 11: Mínima concentração inibitória de C.metallidurans CH34 frente a íons de metais pesados
em meio TSM, descritos na literatura desde o seu isolamento.
Íon
1978
1985
2
1987
3
1989
4
1990
5
1991
6
2001
7
2002
8
2004
Cd
+2
6,0
2,5
5,0
2,5
4,0
1,5
Co
+2
5,0
20,0
25,0
20,0
10,0
6,0
Cu
+2
5,0
2,0
3,0
-2
CrO
Hg
Ni
0,6
4
+2
Mn
5,0
0,7
2005
10
2006
11
3,2
1,2
0,5
SeO
+2
2008
12
3,0
9,0
0,35
0,8
0,2
0,05
0,006
60,0
2,5
2,5
+2
-2
Zn
0,2
9
+2
+2
Pb
1
1
6,0
2,5
8,0
4,0
3,5
0,4
1
6,0
3
20,0
12,0
2
25,0
12,0
1,0
14,0
3
4,5
4
3,0
5
6,4
15,0
6
Mergeay et al., 1978; Mergeay et al., 1985; Nies et al., 1987; Diels et al., 1989; Nies et al., 1990; Dressler et al., 1991 e
Mergeay, 1991; 7Roux et al., 2001 e Borremans et al., 2001; 8Juhnke et al., 2002; 9 Munkelt et al. 2004; 10Ledrich et al., 2005 e
Grass et al., 2005; 11Monchy et al., 2006a e 12Este trabalho.
Dentre os vários fatores envolvidos na disponibilidade de metais em
solução, o pH é provavelmente o mais importante, pois determina a sua solubilidade,
bem como os processos de adsorção e, conseqüentemente, a capacidade de
biorremediação de um sistema. Além disso, a adsorção de metais pesados por
superfícies bacterianas, é geralmente regulada pelo pH do meio (BOEKHOLD et al.,
1993; BRALLIER et al., 1996; FEIN et al., 2001; JOHN; LEVENTHAL, 1995).
Cada íon de metal pesado apresenta uma particular cinética de adsorção
em determinados valores de pH; enquanto íons de zinco e cádmio são abundantes
em meios com pH entre 5.0 e 6.5, baixas concentrações desses íons são
encontrados em meio com pH 8.0, além disso, precipitação em sólidos insolúveis
ocorre em meio com pH maior que 6.0 para os íons Pb+2, Zn+2, Cd+2 e Cu+2 (FEIN et
al., 2001; JOHN; LEVENTHAL, 1995). Portanto, o cultivo de C. metallidurans CH34
em TSM com pH 5,0 contendo íons de metais pesados, além de permitir o maior
crescimento da bactéria, também permite a maior disponibilidade desses íons em
solução e, por esse motivo, a caracterização da resistência de C. metallidurans
CH34 frente a íons de metais pesados foi realizada nessa condição de cultivo.
Os resultados mostraram que C. metallidurans CH34 é altamente resistente
a uma ampla gama de metais pesados, mesmo quando o meio apresenta uma maior
disponibilidade de íons como ocorreu na condição de cultivo realizada.
Quando se compara a resistência de C. metallidurans CH34 com a de
outras bactérias isoladas de ambientes contendo metais pesados, verifica-se que, de
Discussão 130
fato, essa bactéria apresenta um amplo espectro de resistências, muitas vezes
superior àquelas bactérias que possuem resistências específicas (Tabela 12).
Tabela 12: Comparação da resistência de C. metallidurans CH34 a metais pesados com outros
microrganismos isolados de ambientes contendo metais pesados.
+2
C. metallidurans CH34
Pseudomonas H1
Bacillus H9
MIC Cd
3,0 mM
2,0 mM
2,5 mM
Proveniência
ATCC
Solo contendo metais
pesados
Solo contendo metais
pesados
Referência
Este trabalho
Roane et al., 2001.
ATCC
Efluente contendo metais
pesados
Efluente contendo metais
pesados
Este trabalho
Hassen et al, 1998
ATCC
Efluente contendo metais
pesados
DSM
Este trabalho
Hassen et al, 1998
Roane et al., 2001.
+2
C. metallidurans CH34
Pseudomonas
aeruginosa
Bacillus thuringiensis
MIC Co
9,0 mM
0,4 mM
0,05 mM
Hassen et al, 1998
+2
C. metallidurans CH34
Bacillus thuringiensis
Thiobacillus ferrooxidans
C. metallidurans CH34
Pseudomonas
aeruginosa
Bacillus thuringiensis
MIC Cu
0,8 mM
0,5 mM
0,6 mM
-2
MIC CrO 4
0,2 mM
1,2 mM
1,0 mM
Boyer et al., 1998
ATCC
Efluente contendo metais
pesados
Efluente contendo metais
pesados
Este trabalho
Hassen et al, 1998
ATCC
Efluente contendo metais
pesados
Efluente contendo metais
pesados
Este trabalho
Hassen et al, 1998
Hassen et al, 1998
+2
C. metallidurans CH34
Pseudomonas
aeruginosa
Bacillus thuringiensis
MIC Hg
0,006 mM
0,08 mM
0,06 mM
Hassen et al, 1998
+2
C. metallidurans CH34
E. coli
C. metallidurans CH34
Aspergillus niger
MIC Mn
60,0 mM
20 mM
+2
MIC Ni
3,5 mM
6,0 mM
ATCC
não informado
ATCC
Solo contendo metais
pesados
Este trabalho
Nies, 1999
Este trabalho
Magyarosy et al., 2002
+2
C. metallidurans CH34
Pseudomonas
aeruginosa
MIC Pb
3,0 mM
2,4 mM
ATCC
Efluente hospitalar
Este trabalho
Chang et al., 1997
-3
C. metallidurans CH34
Pseudoalteromonas
C. metallidurans CH34
Pseudomonas
aeruginosa
Bacillus thuringiensis
MIC SeO 4
1,0 mM
0,085 mM
+2
MIC Zn
15,0 mM
1,5 mM
0,5 mM
ATCC
Fonte termal oceânica
ATCC
Efluente contendo metais
pesados
Efluente contendo metais
pesados
Este trabalho
Rathgeber et al., 2002
Este trabalho
Hassen et al, 1998
Hassen et al, 1998
Discussão 131
Esses resultados permitiram avaliar a real capacidade de C. metallidurans
CH34 em resistir a diferentes íons de metais numa mesma condição de cultivo,
demonstrando que, de fato, essa bactéria é uma excelente candidata para ser
empregada em processos de biorremediação de efluentes que contenham metais
pesados, como aqueles produzidos por vários segmentos da indústria e mineração,
desde que ela possa adsorver íons eficientemente, capacidade essa que lhe foi
conferida através de manipulação genética realizada neste trabalho.
6.2 Construção da bactéria C. metallidurans CH34 recombinante
6.2.1 Construção do cassete de ancoragem da EC20sp
O seqüenciamento do plasmídeo pHEβ permitiu identificar os componentes
do sistema de secreção da IgA protease, assim como estabelecer os sítios de
clivagem de enzimas de restrição mais adequados para a sua manipulação genética.
A primeira seqüência identificada foi a seqüência codificadora do peptídeo
sinal, constituída por 51 nucleotídeos, a qual codifica uma seqüência de
aminoácidos com estrutura típica de reconhecimento pela maquinaria de secreção
(Sec) de bactérias Gram-negativas.
Essa seqüência peptídica apresenta uma região amino-terminal (N)
composta por resíduos de aminoácidos polares (N), uma região central (H),
contendo predominantemente resíduos de aminoácidos hidrofóbicos e alanina e uma
região carboxi-terminal polar, que codifica o sinal de reconhecimento de peptidases
no espaço periplasmático (C) (Figura 66) (PALMER et al., 2005; PUGSLEY, 1993).
Esse peptídeo tem como função sinalizar o transporte da proteína através da
membrana citoplasmática.
Figura 66: Estrutura do peptídeo sinal seqüenciado do plasmídeo pHEβ. N – aminoácidos polares, H
– aminoácidos hidrofóbicos e alanina e C – sítio de clivagem por peptidases.
Discussão 132
Outra seqüência identificada foi aquela que codifica o epítopo E-tag,
constituída de 36 nucleotídeos (Figura 67); esta seqüência codifica um peptídeo
de12 aminoácidos que é reconhecido pelo anticorpo anti-E-tag e funciona como
repórter da ancoragem na membrana externa (VALLS et al., 2000 a,b; VEIGA et al.,
1999).
Figura 67: Estrutura do epítopo E-tag seqüenciado do plasmídeo pHEβ.
A construção genética para a ancoragem de uma proteína na membrana,
utilizando o sistema de secreção codificado no vetor pHEβ, requer que o gene dessa
proteína, fusionado entre o peptídeo sinal e o domínio de ancoragem, não contenha
códons de parada de leitura, a fim de que a fusão gênica seja traduzida com todos
os componentes em uma única fusão protéica.
Para tanto, foram desenhados dois oligonucleotídeos que se hibridizam,
formando a seqüência gênica EC20sp e, além disso, para preservar a fase de leitura
do sistema de secreção, adicionaram-se dois nucleotídeos na extremidade 3` do
gene. O gene foi amplificado por PCR e, para que pudesse ser manipulado, foi
clonado no vetor pGEM-T Easy.
Uma vez que o gene EC20sp apresenta grande repetição de códons
codificadores de cisteína-ácido glutâmico na sua seqüência, existia a possibilidade
de anelamento dos oligonucleotídeos em diferentes regiões durante a reação de
PCR. Para verificar se a seqüência clonada não continha mutações, alterações na
seqüência ou anelamento incorreto, o plasmídeo construído foi seqüenciado e
clones com a seqüência correta do gene foram identificados. Uma vez obtido o
gene EC20sp, iniciou-se a sua clonagem no vetor pHEβ.
O gene sintético EC20sp foi clonado no plasmídeo pHEβ, e a região 6His foi
retirada do plasmídeo para não interferir na capacidade de ligação da EC20sp, pois
resíduos de histidina também são utilizados para ligar metais. Novamente, a
construção foi seqüenciada e verificamos que o cassete de ancoragem apresentou a
seqüência correta, conforme a estratégia inicialmente traçada. Esse novo plasmídeo
foi denominado pCM1.
Discussão 133
6.2.2 Análise da expressão do cassete de ancoragem da EC20sp
Uma vez construído o plasmídeo pCM1, foi possível analisar a expressão do
cassete de ancoragem da EC20sp, sob o controle do promotor plac, para verificar a
funcionalidade da construção. Para tanto, a linhagem utilizada nesse experimento foi
E. coli UT5600, que é recomendada por Veiga et al. (1999) por apresentar reduzida
quebra proteolítica de proteínas heterólogas.
A seqüência do β-domínio do sistema de secreção da IgA protease codifica
uma proteína de 45,2 KDa (VEIGA et al., 2002) e o gene EC20sp codifica uma
proteína
de
4,5
KDa,
que,
fundidas,
formam
uma
proteína
híbrida
de
aproximadamente 50 KDa. A comparação do perfil protéico, por SDS-PAGE, da
linhagem não transformada e da linhagem transformada com o plasmídeo pCM1,
permitiu verificar a presença de uma banda adicional exatamente desse tamanho,
confirmando que a expressão do cassete de ancoragem estava correta e funcional.
O passo seguinte consistiu em verificar se, de fato, a proteína expressa
estaria sendo direcionada para a membrana externa. Para tanto, foi realizado um
experimento de Western-blotting contra o epítopo E-tag, nas diferentes frações de
membrana da bactéria. Verificamos que, somente na fração de membrana externa,
pôde ser detectada a proteína expressa, demonstrando que a proteína heteróloga
está sendo produzida e que o sistema de secreção está sendo funcional,
possibilitando a ancoragem da proteína EC20sp na membrana externa da bactéria.
Esse resultado está de acordo com aqueles obtidos por Veiga et al. (2002), ao
utilizar essa via de secreção para ancoragem de peptídeos ricos em histidina.
Uma vez que a EC20sp estava sendo produzida e ligada na membrana
externa da bactéria, analisamos indiretamente a sua capacidade de ligar metais
através da diminuição da concentração de Cd+2 em solução na presença da bactéria.
Os resultados mostraram que a linhagem com a EC20sp ancorada na sua superfície
diminuiu 89% a mais a concentração do Cd+2 em solução em relação à linhagem
sem EC20sp, confirmando que a ancoragem dessa proteína ligadora de metal é uma
estratégia eficaz para melhorar a capacidade da célula em ligar íons de metais
pesados.
Roane e Pepper (2000b) mostraram que a bactéria Arthrobacter D9, isolada
de solo contendo metal pesado, foi capaz de remover 22% do cádmio de uma
solução após 48 h de incubação. Se compararmos estes resultados àqueles que
Discussão 134
obtivemos com a linhagem UT5600/pCM1, fica clara a superior capacidade da
linhagem recombinante construída nesse trabalho, mesmo considerando que a
expressão do cassete de ancoragem foi realizada através da indução do promotor
plac. Uma vez verificada a funcionalidade da construção em E. coli, buscou-se então
um promotor que apresentasse uma forte expressão do cassete de ancoragem da
EC20sp em C. metallidurans CH34 sem a necessidade de uso de indutores de modo
a permitir um aumento na capacidade de remoção do metal.
6.2.3 Escolha de promotores com forte capacidade de expressão protéica em
C. metallidurans CH34
A busca por promotores que expressem altos níveis de proteínas em
microrganismos sem a necessidade do uso de indutores é de grande interesse para
sua utilização em grande escala, pois evita a necessidade de adição de substâncias,
como o IPTG, que poderiam inviabilizar economicamente o processo, além de ser
mais amigável ao meio ambiente por não liberar produtos sintéticos (SRINIVASAN et
al., 2002). Para ultrapassar essa limitação, buscou-se por promotores que fossem
capazes de expressar fortemente o cassete de ancoragem da EC20sp em
C. metallidurans CH34 sem nenhum tipo de indução exógena.
O plasmídeo utilizado nessa etapa do trabalho foi o pBBEGFP, construído
no nosso laboratório, porque permite a clonagem de seqüências promotoras a
montante do gene repórter EGFP, que codifica uma proteína com grande
estabilidade, de pequeno tamanho e de fácil detecção, além de não requerer
substrato exógeno (ERRAMPALLI et al., 1999). Este plasmídeo é derivado do vetor
pBBR1MCS, que é de amplo espectro para bactérias Gram-negativas, com grande
estabilidade em C. metallidurans CH34, e, além disso, permite seleção por
cloranfenicol, antibiótico ao qual C. metallidurans CH34 é sensível.
Optou-se por três diferentes estratégias para a obtenção do promotor. A
primeira foi utilizar a análise proteômica de C. metallidurans CH34, recentemente
realizada por Noël-Georis et al. (2004), na qual se identificaram proteínas fortemente
expressa. A partir desse estudo proteômico, foi possível identificar as seqüências de
DNA codificadoras destas proteínas e, conseqüentemente, as suas regiões
promotoras.
Discussão 135
Seis seqüências promotoras foram escolhidas e amplificadas a partir do
DNA total de C. metallidurans CH34 e clonadas com sucesso a montante do gene
da EGFP no vetor pBBEGFP, para que a expressão do gene repórter pudesse ser
medida.
A segunda estratégia foi avaliar a expressão de promotores conhecidos por
expressar genes constitutivamente em C. metallidurans CH34. Nesse caso, dois
promotores foram escolhidos: czcI e plac.
Segundo Große et al. (2004), o promotor do gene czcI, presente no operon
czc de C. metallidurans CH34, deve ser o responsável pela expressão constitutiva
da bomba de efluxo CzcCBA, e por esta razão esse promotor foi escolhido no
presente trabalho. Por sua vez, o promotor plac, do operon da lactose de E.coli, é
reconhecidamente constitutivo em C. metallidurans CH34 (NIES; SILVER, 1989;
NIES et al., 1989; LEGATZKI et al., 2003a) e, conseqüentemente, esse promotor
também foi escolhido como alvo do estudo.
No primeiro caso, a seqüência promotora czcIp foi amplificada a partir do
DNA total de C. metallidurans CH34 e clonada a montante do gene da EGFP no
plasmídeo pBBEGFP. No segundo caso, o fragmento plac-EGFP do plasmídeo pLG,
foi clonado no vetor pBBR1MCS para transformar células de C. metallidurans CH34.
A terceira estratégia foi verificar a expressão do gene da EGFP sob o
controle do promotor pan de B. subtilis, uma vez que já se havia detectado forte
expressão em E.coli, em outro trabalho do nosso laboratório. Em B. subtilis, esse
promotor é reprimido pelos íons Mn+2 ou Fe+2, através da atuação do repressor
PerR, que se liga na região operadora do promotor, inibindo a expressão do gene
mrgA. A proteína codificada por mrgA está relacionada ao regulon de resposta de
estresse oxidativo e de limitação de íons nessa bactéria (BSAT et al., 1998;
FUANGTHONG et al., 2002).
6.2.4 Análise da expressão de EGFP pelos diferentes promotores
A detecção de fluorescência nas bactérias C. metallidurans CH34 e E. coli,
portadoras das diferentes construções, foi primeiramente realizada em microscópio
de epifluorescência e possibilitou observar células com fluorescência verde nas duas
bactérias em algumas construções; no entanto, em outras não se observou
fluorescência. Segundo Patterson et al. (1997), pelo menos 10 000 moléculas de
Discussão 136
GFP são necessárias no citoplasma da célula para detecção por microscopia de
fluorescência e, conseqüentemente, sua detecção e quantificação devem ser
realizadas por métodos mais sensíveis, como a citometria de fluxo, que permite
detectar fluorescência abaixo dos limites da microscopia.
A citometria de fluxo é uma técnica que mede e analisa simultânea e
individualmente, as múltiplas características de uma partícula ou células suspensas,
nas quais incide um foco de luz (laser), permitindo a detecção das suas
características através de um leitor óptico ligado a um computador. Dentre os
parâmetros possíveis de serem medidos por citometria de fluxo, estão o tamanho, a
granulosidade, a complexidade interna e a fluorescência das células (RIESEBERG
et al., 2001).
Devido à necessidade de quantificar e comparar os níveis de fluorescência
nas diferentes construções, todas foram analisadas por essa técnica, tanto em
C. metallidurans CH34, quanto em E. coli. Dois parâmetros da análise por citometria
foram avaliados: a intensidade de fluorescência, que permitiu analisar a capacidade
de cada promotor em expressar o gene repórter, e a distribuição celular de cada
linhagem analisada, possibilitando avaliar se a presença da proteína heteróloga,
assim como a sua concentração, alteravam as características celulares.
Os resultados mostraram que a distribuição celular das diferentes
populações bacterianas foi homogênea, ou seja, não foi alterada pela presença da
EGFP, mesmo naquelas linhagens que superexpressaram essa proteína, indicando
que sua presença não ocasionou danos celulares que comprometessem a estrutura
celular microbiana. Da mesma forma, Tombolini et al. (1997) não constataram
alterações celulares em Pseudomonas fluorescens A506, quando mediram a
expressão da GFP por citometria, sugerindo que essa proteína não possui
propriedades tóxicas a essa bactéria.
Diferentemente dos resultados de distribuição celular, as medidas de
fluorescência nas células variaram consideravelmente, dependendo do promotor
utilizado. No caso dos promotores P1 a P6, escolhidos por análise proteômica, os
níveis de fluorescência mostraram-se baixos em C. metallidurans CH34, enquanto
em E. coli não se verificou nenhuma fluorescência, e por essa razão, esses
promotores foram considerados fracos para expressar o cassete de ancoragem da
EC20sp.
Discussão 137
A regulação da expressão de proteínas pelas células em geral, é controlada
por diversos fatores, podendo ocorrer em nível de transcrição e pós-transcricional,
tradução e pós-traducional, assim como dependente de estímulos ambientais
(NOËL-GEORIS et al., 2004). Apesar de termos identificado proteínas com forte
expressão em C. metallidurans CH34, não se conhecia em que nível de regulação
celular aquelas proteínas eram produzidas, nem a sua estabilidade, nem tampouco
em qual concentração eram necessárias à célula. Assim, por exemplo, o promotor
P6, responsável pela expressão do gene da proteína ribossomal L10, não
comprovou ser um promotor forte nas nossas condições, muito embora devido à
estabilidade do RNAmensageiro, à estabilidade protéica ou ainda à eficiência de
tradução,
a
expressão
da
proteína
ribossomal
L10
seja
alta
em
C. metallidurans CH34. Como foram escolhidos promotores que controlam genes
relacionados a proteínas essenciais à célula, de fato, deve haver algum nível de
controle de expressão protéica, não dependente apenas da força de expressão dos
promotores analisados.
Quanto aos promotores constitutivos em C. metallidurans CH34, czcIp (P7)
e plac, foi possível detectar a expressão da EGFP, porém, em pequenas
intensidades e, por isso, também os consideramos promotores fracos para nossa
finalidade.
O promotor do gene czcI do operon czc de C. metallidurans CH34 mostrou
uma intensidade de fluorescência de 21,86, quando a bactéria foi cultivada na
presença de íons metálicos. Große et al. (2004) presumiram que esse promotor
fosse o responsável pela expressão constitutiva da bomba de efluxo CzcCBA. No
entanto, nossos resultados mostram que esse promotor é induzido por metais e não
constitutivo, pois o cultivo da bactéria sem metais não mostrou nenhuma expressão
da EGFP. Esse resultado indica que, provavelmente, outro promotor do operon czc
deva ser o responsável pela manutenção basal da expressão da bomba de efluxo
CzcCBA e não czcIp. Em E coli, não se verificou a expressão de EGFP por esse
promotor.
O promotor plac mostrou expressar EGFP nas duas bactérias analisadas.
Em C. metallidurans CH34, a média da intensidade de fluorescência relativa foi de
61,9, tanto na presença de glicose quanto na de IPTG no meio de cultivo. Esse
resultado reafirma a expressão constitutiva relatada na literatura em C. metallidurans
CH34 (NIES; SILVER, 1989; NIES et al., 1989; LEGATZKI et al., 2003a). O genoma
Discussão 138
dessa bactéria mostra que existem quatro reguladores do tipo-lacI, no entanto, não
se verificou atuação no plac nesse trabalho. O componente central da regulação
transcricional em bactéria é a RNApolimerase, que ganha especificidade por
seqüências promotoras ao se ligar a determinados fatores sigma (σ). Segundo NIES
(2004), muitos σ de C. metallidurans CH34 são similares aos σ de E. coli, o que
pode explicar a capacidade de reconhecimento da seqüência consenso do promotor
do plac, expressando o gene repórter.
Como esperado, em E. coli, a expressão da EGFP sob o controle do plac foi
reprimida na presença de glicose e induzida na presença de IPTG. Na presença do
indutor, o repressor do plac (lacI), é convertido em uma forma inativa, o que permite
a ligação da RNApolimerase na região promotora/operadora do promotor, iniciando
o processo de transcrição gênica do gene repórter. Dessa forma, na presença de
IPTG, a expressão da EGFP foi 6,5 vezes maior àquela medida na presença de
glicose. Comparando a força de expressão do plac em E. coli e em C. metallidurans
CH34, verifica-se que, a primeira, é 14 vezes superior à segunda, na presença de
IPTG.
Contrastando com os resultados anteriores, o promotor pan promoveu forte
expressão basal do gene da EGFP em C. metallidurans CH34 e, além disso, na
presença de íons metálicos esta expressão foi ainda aumentada.
A expressão heteróloga da EGFP pelo promotor pan em C. metallidurans
CH34 cultivada sem metais, mostrou ser 24 vezes maior quando comparada ao plac
nessa bactéria. Na presença de íons Cd+2, a intensidade de fluorescência foi de,
aproximadamente, 55 vezes superior ao promotor plac. A presença dos diferentes
íons de metais no meio de cultivo de C. metallidurans CH34 aumentou os níveis de
expressão da EGFP, indicando que algum mecanismo de indução deve estar
ocorrendo.
O alinhamento das seqüências dos promotores induzidos por metais em
C. metallidurans CH34 com o promotor pan permitiu verificar que a região -10 desse
promotor tem grande similaridade com a mesma região dos promotores czcN e cnrY
(Figura 68). Quanto ao plac e pbrA, nota-se que há duas bases de discrepância
nessa região e três bases quando se compara com o promotor merR.
Discussão 139
Figura 68: Comparação da seqüência do promotores utilizados nesse estudo. pan, promotor do
gene mrgA de B. subtilis; czcN, promotor do operon czc de C. metallidurans CH34;
cnrY, promotor do operon cnr de C. metallidurans CH34; plac, promotor do operon de
lactose de E. coli; pbrA, promotor do operon pbr de C. metallidurans CH34 e merR,
promotor do operon mer de C. metallidurans CH34. Em vermelho estão representados
os nucleotídeos idênticos ao promotor pan e, em preto, aqueles discrepantes.
As regiões -35 desses promotores, entretanto, apresentam maiores
discrepâncias. É possível que o aumento da expressão da EGFP pelo pan em
C. metallidurans CH34 na presença de metais seja devido à afinidade dos indutores
dos operons dessa bactéria, pela seqüência consenso de pan.
Segundo Lewin et al. (2001), a região -35 de um promotor tem como função
servir como sinal de reconhecimento para a ligação da RNA-polimerase, enquanto a
região -10 permite o desenrolamento da fita de DNA para o início de transcrição.
Além disso, a distância entre essas regiões é crucial para a adequada ligação da
RNA-polimerase.
O promotor czcN do operon de resistência a Cd+2, Co+2 e Zn+2 apresentou
grande homologia com o promotor pan nas regiões -10 e -35 e, além disso, a
mesmo número de bases entre elas. Na presença desses mesmos íons, foram
detectados os maiores níveis de fluorescência em C. metallidurans CH34, sugerindo
que o ativador transcricional do operon czc, que age no promotor czcN na presença
de íons, também deve reconheçer o promotor pan, induzindo a expressão da EGFP.
No caso do promotor cnrY, do operon de resistência a Ni+2 e Co+2, apesar
de haver também uma grande homologia nas regiões -10 e -35, há uma maior
distância entre essas regiões (LIESEGANG et al., 1993). Esse promotor é
reconhecido pela holoenzima, devido à especificidade do fator sigma CnrH, que
deve estar atuando em pan, aumentando a expressão da EGFP. Os resultados
Discussão 140
mostraram que, na presença de Ni+2, a expressão não aumentou como no caso do
czc, provavelmente em decorrência da maior discrepância na seqüência promotora.
O promotor pbrA do operon de resistência a chumbo de C. metallidurans
CH34 também apresentou similaridade ao promotor pan, fato este que sugere que a
presença de chumbo favoreceu o aumento da expressão da EGFP. Quanto ao
promotor de mercúrio, verifica-se grande discrepância na seqüência do promotor, e,
provavelmente devido a isto não ocorreu nenhuma indução da expressão dos níveis
basais da EGFP pelo pan.
Na presença de Fe+2 e Mn+2, também se verificou aumento na expressão da
EGFP. Em B. subtilis, esses íons se ligam na proteína repressora PerR, reprimindo a
expressão do gene mrgA. Contrariamente, neste trabalho verificou-se que não
ocorreu repressão na presença desses íons em C. metallidurans CH34, apesar
dessa bactéria apresentar em seu genoma proteínas homólogas da família PerR.
Em E. coli, o promotor pan se mostrou constitutivo e, além disso, não
ocorreu a regulação do promotor na presença de Mn+2, apesar dessa bactéria
apresentar também no seu genoma proteínas da família PerR. Na presença de Fe+2,
ocorreu uma pequena diminuição nos níveis de expressão da EGFP, indicando que
pode haver algum regulador com baixa especificidade por pan. Esse resultado
permitiu também a obtenção de um promotor forte com expressão constitutiva nessa
bactéria, abrindo perspectivas inéditas de utilização para expressão de genes
heterólogos em E. coli. Por outro lado, os resultados mostram que a força de
expressão do promotor pan é quatro vezes superior em C. metallidurans CH34, na
presença de Cd+2, em comparação com o mesmo promotor em E. coli sob indução.
A expressão da EGFP nas bactérias Burkholderia cepacia e Bartonella
henselae, sob o controle do promotor induzido por arabinose e de outro, constitutivo,
respectivamente, foi medida por citometria de fluxo e a intensidade máxima de
fluorescência medida nesses trabalhos (LEFEBRE; VALVANO, 2002; LEE;
FALKOW, 1998), atingiu a metade daquela observada em C. metallidurans/panEGFP cultivada em meio contendo Cd+2. A comparação com os dados de literatura
nos leva a considerar o promotor pan como um promotor extremamente forte em
C. metallidurans CH34 e, conseqüentemente, esse promotor foi eleito para a
expressão do cassete de ancoragem nessa bactéria, sendo o primeiro promotor
heterólogo de forte expressão a ser utilizado em C. metallidurans CH34. Além disso,
esses resultados abrem um caminho de investigação científica no sentido de testar
Discussão 141
promotores que são regulados em uma determinada espécie, para avaliação em
outra espécie, com o objetivo de buscar promotores de interesse biotecnológico.
6.2.5 Construção, análise do cassete de expressão-ancoragem da EC20sp em
C. metallidurans CH34 e sua capacidade de otimizar a adsorção de metais
pesados
O primeiro passo para a construção genética com o objetivo de expressar o
cassete de ancoragem da EC20sp em C. metallidurans CH34, sob o comando do
promotor pan, foi amplificar esse cassete de ancoragem a partir do plasmídeo
pCM1, que se mostrou funcional em E. coli sob o comando do promotor plac. Foram
desenhados iniciadores de PCR que permitiram a amplificação do fragmento gênico
correspondente à fusão gênica “peptídeo sinal-EC20sp-E-tag-β-domínio”, de tal
forma que este cassete fosse fusionado de forma precisa a jusante do promotor pan,
presente no vetor pBB-panEGFP. Assim, a ligação entre o cassete de ancoragem e
o promotor pôde ser realizada com sucesso e a nova construção, chamada cassete
de expressão-ancoragem da EC20sp, foi confirmada por seqüenciamento.
Uma vez construído o plasmídeo pCM2, foi possível analisar a expressão do
cassete de ancoragem da EC20sp, sob o controle do promotor pan em
C. metallidurans CH34. Dessa forma, células dessa bactéria foram transformadas
com o plasmídeo pCM2 e a primeira análise consistiu em verificar a expressão do
cassete de ancoragem por meio de SDS-PAGE.
Como já mencionado anteriormente, a proteína codificada pela fusão da
EC20sp com o β-domínio tem o tamanho de 50 KDa e, quando foi comparado o
perfil protéico da linhagem não transformada com a linhagem portadora do
plasmídeo pCM2, verificou-se a presença de uma banda adicional com exatamente
este tamanho na linhagem transformante, confirmando que a expressão do cassete
de ancoragem estava ocorrendo.
Para verificar se, de fato, a proteína expressa estaria sendo direcionada para a
membrana externa, foi realizado um Western-blotting contra o epítopo E-tag, nas
diferentes frações de membrana da bactéria. Somente na fração de membrana
externa foi detectada a proteína de interesse, demonstração cabal de que a proteína
heteróloga estava sendo produzida e que o sistema de secreção estava funcional,
possibilitando a ancoragem da proteína EC20sp na superfície de C. metallidurans
CH34. Cabe ressaltar que em outro projeto do nosso grupo de pesquisa foram
Discussão 142
produzidos anticorpos específicos contra EC20sp, que também reconheceram a
proteína EC20sp na membrana externa de C. metallidurans CH34/pCM2 em
experimentos de Western-blotting (Carolina Parada, comunicação pessoal).
Uma vez que a EC20sp estava sendo produzida e ligada na membrana
externa da bactéria, foi possível analisar a capacidade da nova bactéria em ligar
metais. Para tanto, o primeiro experimento objetivou verificar o melhor tempo de
incubação entre uma determinada massa microbiana em uma solução contendo
uma concentração de Cd+2 conhecida, de forma a estabelecer uma cinética de
adsorção para esse íon.
Quando a concentração de Cd+2 utilizada no experimento foi de 100 µM, os
resultados
mostraram
que,
após
C. metallidurans/pCM2, a solução
a
incubação
com
a
linhagem
apresentava 50% menos Cd+2 quando
comparada à linhagem controle C. metallidurans/pBBR1MCS.
No experimento
seguinte, foi utilizada a mesma linhagem transgênica C. metallidurans/pCM2, porém
pré-cultivada na presença de Cd+2, para verificar se haveria aumento na capacidade
de ligação deste metal pesado. Novamente, observou-se que a linhagem C.
metallidurans/pCM2 apresentou melhor capacidade de ligação ao metal e, além
disso, quando induzida, a mesma linhagem mostrou-se capaz de adsorver maior
quantidade do metal.
Em suma, verificou-se que a presença da EC20sp na superfície bacteriana
diminui a concentração do cádmio residual em solução, comprovando ser, de fato,
uma proteína que liga este metal eficientemente. A linhagem C. metallidurans/pCM2
expressa altos níveis basais dessa proteína, fato este que representa um grande
avanço para uma linhagem biorremediadora, pois dispensa a necessidade de
indutores e constitui uma novidade biotecnológica na área. Além disso, a mesma
linhagem pré-cultivada na presença do próprio metal apresenta aumento da
capacidade de biorremediar a solução com cádmio devido ao acréscimo da
expressão do cassete de ancoragem que, conseqüentemente, aumentou a
quantidade de EC20sp disponível na superfície bacteriana.
O desaparecimento do cádmio em solução, após a incubação com a massa
microbiana, consiste apenas numa medida indireta de que as bactérias estão
adsorvendo o cádmio. Decidiu-se então, medir a quantidade de metal ligada
diretamente na massa microbiana por entender que, de fato, a capacidade de
biorremediação das linhagens é referente à quantidade de metal ligada às células e
Discussão 143
não aquela medida pela diminuição do metal em solução, devido às interferências
próprias do experimento como a ligação de metal às paredes dos tubos, diferenças
de pipetagem, entre outros artefatos experimentais (ROANE; PEPPER, 2000a).
Conseqüentemente,
os
experimentos
seguintes
do
trabalho
foram
realizados por incubação da linhagem transgênica C. metallidurans/pCM2 em
presença dos metais Cd+2, Co+2, Cu+2, Hg+2, Mn+2, Ni+2, Pb+2 e Zn+2, que foram
quantificados diretamente na massa microbiana ao final do período de incubação.
Para todos os metais analisados, com exceção do Hg+2, foi verificado que a
linhagem C. metallidurans/pCM2 cultivada na presença de metais apresentou maior
capacidade de ligar metal em relação à mesma linhagem cultivada na ausência de
metais, assim como também em relação à linhagem controle (sem EC20sp). O précultivo de C. metallidurans/pCM2 com os diversos metais, de fato, aumentou a
expressão do cassete de ancoragem e o potencial biorremediador da linhagem, fato
este que está de acordo com aqueles anteriormente observados nos experimentos
de citometria, onde a presença de metal aumentou a expressão da EGFP sob o
controle do promotor pan.
O metal pesado Cd+2 é considerado extremamente perigoso devido à sua
toxicidade e à grande utilização pela indústria, o que acarreta a produção de um
volume considerável de resíduos que são lançados no meio ambiente. Por estas
razões, a maioria dos estudos tem contemplado avaliar o potencial biorremediador
dos diversos sistemas frente a este metal em relação aos outros metais (Haq et al.,
1999).
Quando comparamos a capacidade da linhagem C. metallidurans/pCM2,
construída no nosso trabalho, com outros microrganismos recombinantes descritos
na literatura até agora, quanto à ligação ao Cd+2, verificamos que, o nosso resultado
foi muito superior aos demais (Tabela 13). No entanto, há pontos relevantes que
devem ser ressaltados: (i) os demais sistemas foram testados em meios de cultura,
o que não é adequado, pois geralmente quelam os metais da solução, ou ainda os
precipitam em forma de sais insolúveis indisponibilizando o íon para ligar na
superfície bacteriana, principalmente, em soluções cujo pH é maior que 6,0
(ROANE; PEPPER, 2000a); (ii) os demais sistemas, salvo os trabalhos de Valls et al.
(2000 a e b), utilizaram a bactéria E. coli que não é considerada um agente
Discussão 144
adequado de biorremediação pelas suas características de patogenicidade e baixa
resistência a metais; (iii) todos os sistemas construídos até agora foram expressos a
partir de promotores induzidos como o plac, T7 (promotor do fago T7) e Pm
(promotor do operon de metabolismo de tolueno de P. putida, induzido por 3-metilbenzoato), o que representa uma limitação ao uso em grande escala, enquanto a
linhagem C. metallidurans/pCM2 dispensa indução e, por fim, (iv) os diversos
trabalhos não foram conduzidos nas mesmas condições de cultivo, tais como
temperatura, agitação, tempo de incubação, número de cópias dos plasmídeos por
célula e concentração de metal, o que dificulta a comparação dos resultados,
mesmo quando a quantificação dos íons foi realizada diretamente na massa
microbiana.
Ressaltados esses pontos, é possível considerar que a linhagem
C. metallidurans/pCM2 construída neste trabalho é um excelente agente de
biorremediação para Cd+2, pois, além de ser altamente resistente e colonizar
ambientes contendo este metal, mostrou também acumular este íon durante o
crescimento da linhagem em presença deste íon (condições de indução do
promotor) (Figura 54). Este fato que abre perspectivas de utilizar o próprio efluente
contendo metal como meio de cultivo dessa bactéria, proporcionando uma
concomitante biorremediação durante o crescimento celular.
O conjunto dos nossos resultados, mostrados aqui, permite afirmar que a
expressão e ancoragem da EC20sp na superfície de C. metallidurans é uma
estratégia adequada para otimizar a capacidade desta bactéria em ligar Cd+2, o que
também abre oportunidades para uso deste sistema em outras bactérias Gramnegativas que tenham potencial biorremediador.
Discussão 145
Tabela 13: Comparação da capacidade biorremediadora de cádmio das linhagens recombinantes
descritas na literatura com a linhagem construída no presente trabalho.
*LamB: porina de maltose; OmpA: proteína A de membrana externa;
Bioacúmulo
+2
ηmol Cd
mg peso seco
Microrganismo
Promotor
Âncora*
E. coli
plac
LamB
E. coli
plac
LamB
Peptídeo
**
Meio de
cultivo,
[ ] inicial de
metal , e
tempo de
incubação
Ref
Recombinante
Controle
MT
30
2,0
MJS
20 µM
4h
Sousa et
al., 1998
6 His
8,0
2,5
MJS
30 µM
3,5 h
Kotrba et
al., 1999
4 Cis
9,5
E. coli
plac
OmpA
36 His
32
10,3
Sol. Salina
0,44 µM
24 h
Xu, Lee,
1999
E. coli
plac
OmpA
EC20
60
4
LB
100 µM
16 h
Bae et al.,
2000
Pm
IgA
Protease
MT
28
10
MJS
300 µM
-
Valls et al.,
2000b
MT
42
14
Pm
IgA
Protease
MJS
300 µM
18 h
Valls et al.,
2000a
T7
pili
6 His
656,25
276
LB
20 µM
2h
Saffar et
al., 2007
pan
IgA
Protease
EC20sp
17.600
11.100
H2O MilliQ
1000 µM
24 h
Este
trabalho
P. putida
C.
metallidurans
E. coli
C.
metallidurans
**MT: metalotioneína; His: resíduos de histidina; Cis: resíduos de cisteína
Por outro lado, este trabalho mostrou-se inovador quanto à investigação do
potencial de ligação do íon Co+2 a uma linhagem bacteriana contendo a EC20sp na
superfície, além disso, poucos trabalhos de biorremediação de Co+2 por bactérias
têm sido relatados na literatura. Em nenhum dos trabalhos citados na Tabela 13,
esse íon foi avaliado frente às linhagens recombinantes. No entanto, há relatos de
Discussão 146
que a bactéria Streptomyces noursei foi capaz de ligar 20,4 µM de Co+2/mg de peso
seco de células, ou seja, quatro vezes superior à linhagem C. metallidurans/pCM2
frente a este íon (MATTUSCHKA; STRAUBE, 1993).
Os resultados de ligação de Co+2 mostraram que a linhagem recombinante
C. metallidurans/pCM2 apresentou uma melhora de 13% na capacidade de ligar este
metal em relação à linhagem sem EC20sp, indicando que esse íon não deve
apresentar grande afinidade pela fitoquelatina.
Para o Cu+2, foi verificado que a presença da EC20sp na superfície da
linhagem C. metallidurans/pCM2 foi essencial para aumentar a sua capacidade
de
biorremediação
em
76%,
quando
comparado
ao
controle
(C. metallidurans/pBBR1MCS), chegando a ligar 42,65 µM de Cu+2/mg de peso seco
de células em 24 h. Hassen et al. (1998) mostraram que a bactéria P. aeruginosa
selvagem foi capaz de adsorver 28,35 µM de Cu+2/mg de peso seco de células após
três dias de cultivo em meio rico contendo 500 µM de Cu+2, ou seja, 50% menos que
a bactéria construída no presente trabalho. Diferentemente do Co+2, o Cu+2 tem sido
alvo de trabalhos de biorremediação, exemplo disso, é o trabalho de Souza et al.
(1998) no qual uma linhagem recombinante de E. coli com a metalotioneína
ancorada na sua superfície adsorveu Cu+2, chegando a ligar 6,5 ηM de Cu+2/mg de
peso seco de células contra 1,2 ηM de Cu+2/mg de peso seco de células na
linhagem selvagem. Portanto, esses resultados mostram que ainda há um grande
espaço para melhorar linhagens que possam biorremediar este íon. A grande
capacidade de C. metallidurans/pCM2 em ligar cobre a torna uma excelente
candidata a agente de biorremediação de ambientes contendo este metal.
O principal mecanismo de resistência a Hg+2 em C. metallidurans é a
produção da redutase MerA, a qual reduz Hg+2 a mercúrio metálico Hg0, que é volátil
e difunde-se para fora da célula. Desta forma, a bactéria se proteje dos efeitos
tóxicos desse íon, embora, não seja capaz de biorremediar o ambiente.
Quando se examinou a capacidade da linhagem C. metallidurans/pCM2 em
adsorver Hg+2, notou-se que a melhor situação ocorreu quando a massa microbiana
utilizada não foi cultivada na presença deste metal, e neste caso ligou 100% a mais
desse metal em relação às outras linhagens. O operon de mercúrio não é ativado
por sistemas de indução, o que ocorre é que a presença desse íon desloca o
repressor permitindo a expressão do operon mer. Além disso, como o promotor
desse operon não apresenta similaridade com o promotor pan, a linhagem
Discussão 147
C. metallidurans/pCM2 pré-cultivada na presença de Hg+2 não deveria mesmo
estimular a expressão do cassete de ancoragem da EC20sp. Por outro lado, o précultivo com Hg+2, estimula a forte expressão de MerA e, conseqüentemente, a maior
volatilização desse íon, protegendo a linhagem dos seus efeitos tóxicos. Por estas
razões, a capacidade de bioacúmulo da linhagem C. metallidurans/pCM2 cultivada
com Hg+2 permaneceu nos mesmos níveis em relação à linhagem controle.
Uma linhagem recombinante de E.coli com a EC20 ancorada na superfície
através da proteína OmpA mostrou ligar 19 ηM de Hg+2/mg de peso seco de células
(Bae et al., 2001) enquanto a linhagem C. metallidurans/pCM2 ligou 100 ηM de
Hg+2/mg de peso seco de células, ou seja, 5 vezes superior à primeira, mostrando
que apesar da ligação desse metal ter sido pequena, em termos de quantidade, a
linhagem construída neste trabalho ainda representa uma alternativa viável.
Outras bactérias não recombinantes, como B. thuringiensis e P. aeruginosa
mostraram adsorver Hg+2 em concentrações maiores que aquelas observadas em
C. metallidurans/pCM2 (HASSEN et al., 1998). No entanto, estas bactérias não
apresentam o espectro de resistências de C. metallidurans e, portanto, apresentam
limitações quando a biorremediação deve ser realizada em efluentes contendo
mistura de metais em níveis tóxicos.
O Mn+2 é o segundo metal mais abundante do planeta e, apesar de sua
baixa toxicidade, sua presença em efluentes é indesejável, pois altera o pH do
efluente (Mn+2 + 0,5 O2 + H2O → MnO2 + 2H+), dá o gosto metálico à água, além de
ser altamente oxidável, formando precipitados que escurecem as correntes de água
e entopem tubulações (HALLBERG; JOHNSON, 2005). Apesar disso, poucos
trabalhos de biorremediação tem enfocado o Mn+2.
Assim como para o Co+2, este trabalho é inovador no que se refere à
capacidade de uma linhagem recombinante em biorremediar Mn+2. Os resultados
obtidos neste trabalho mostraram que a linhagem C. metallidurans/pCM2 induzida
apresentou uma melhora de 31% em relação à linhagem sem EC20sp, mostrando
que esta proteína apresentou afinidade por este íon. O acúmulo de manganês por
C. metallidurans/pCM2, apesar de ser menor em termos de quantidade em relação
aos outros íons, mostra que esta linhagem apresenta potencial de recuperação
desse íon a partir de efluentes. O manganês existe naturalmente nos estados
oxidativos Mn+2 e Mn+4 e é reconhecidamente um bom aceptor de elétrons no
Discussão 148
metabolismo bacteriano (Nies, 1999), o que leva, em geral, à formação de
precipitados em solução. Desta forma, a recuperação deste íon ligado na biomassa
microbiana ainda não tem sido mostrada na literatura, mas somente através de
precipitação. Exemplo disso, é o uso de consórcios microbianos em reatores para a
remoção de Mn+2 por precipitação ((HALLBERG; JOHNSON, 2005), o que mostra
que a linhagem C. metallidurans/pCM2, de fato, é uma novidade no que se refere à
remoção desse íon diretamente pela massa microbiana.
O Ni+2, que é um elemento de grande interesse industrial, também foi
avaliado quanto à capacidade de se ligar nas linhagens construídas neste trabalho.
A linhagem C. metallidurans/pCM2 induzida aumentou em 45% a ligação a este
metal quando comparada ao controle. Muitas espécies de bactérias selvagens têm
sido avaliadas quanto à capacidade de adsorver Ni+2 na massa microbiana, no
entanto, nenhuma melhorada por engenharia genética. Exemplo disso é a bactéria
Streptomyces noursei que ligou 13,63 µM de Ni+2/mg de peso seco de células em
sua biomassa, contra 8,46 µM de Ni+2/mg de peso seco de células de
C. metallidurans recombinante (MATTUSCHKA; STRAUBE, 1993).
Para o Zn+2, a linhagem C. metallidurans/pCM2 induzida mostrou ser muito
superior ao controle. De fato, para este íon houve um aumento de 219% na
adsorção, chegando a ligar 51,07 µM de Zn+2/mg de peso seco de células.
Comparada à Streptomyces noursei, nossa linhagem foi duas vezes superior na
adsorção deste íon (MATTUSCHKA; STRAUBE, 1993). Quando se compara à
linhagem E. coli recombinante, que possui a metalotioneína na superfície, a qual
ligou 4 ηM de Zn+2/mg de peso seco de células contra 1,5 ηM de Zn+2/mg de peso
seco de células da mesma linhagem sem metalotioneína (SOUSA et al., 1998), notase que o resultado é muito inferior ao da linhagem construída no presente trabalho.
Fica evidente que a EC20sp apresentou grande afinidade por Zn+2 e, além
disso, os resultados mostraram que o crescimento da massa microbiana précultivada na presença de Zn+2 foi capaz de ligar grande quantidade desse metal,
abrindo perspectivas de biorremediar efluentes através do cultivo do agente
biorremediador no próprio efluente a ser tratado, o que confere grande vantagem ao
processo.
O
melhor
resultado
foi
obtido
frente
ao
Pb+2:
a
linhagem
C. metallidurans/pCM2 chegou a adsorver 54,75 µM de Pb+2/mg de peso seco de
Discussão 149
células, o que representa um aumento de 210% na capacidade de ligar íons Pb+2,
em relação ao controle.
O chumbo é um elemento extremamente tóxico e a busca por agentes
biorremediadores para este íon tem sido alvo de diversos estudos com linhagens
selvagens de bactérias como Pseudomonas e Streptomyces (CHANG et al., 1997;
MATTUSCHKA; STRAUBE, 1993), no entanto, faltam na literatura estudos mais
recentes e com linhagens melhoradas geneticamente.
Para cada metal testado isoladamente, verificamos que a linhagem
C. metallidurans/pCM2 induzida apresentou diferentes níveis de capacidade de
ligação. Isto se deve a vários motivos, a saber: (i) cada íon metálico proporciona um
determinado nível de indução do promotor pan e, conseqüentemente, interfere na
quantidade de EC20sp presente na superfície da bactéria; (ii) a própria EC20sp
apresenta diferentes afinidades pelos diferentes metais, o que também leva à
ligação a um determinado íon, em detrimento de outro.
Quando comparamos somente os resultados obtidos na melhor situação de
biorremediação, ou seja, quando a linhagem C. metallidurans/pCM2 induzida foi
utilizada (Figura 62), verificamos que houve, de fato, uma preferência de ligação aos
diferentes metais. Satofuka et al. (2001), mostraram que peptídeos de fitoquelatina
sintética contendo sete resíduos de cisteína (EC7) ligaram Cd+2, Cu+2, Hg+2, Ni+2,
Pb+2 e Zn+2 com diferentes afinidades, comprovando definitivamente que há uma
escala de afinidade pelos resíduos de cisteína.
Efluentes industriais e de mineração possuem comumente uma mistura de
metais, podendo haver a prevalência de um determinado metal. Como os primeiros
experimentos deste trabalho foram realizados para estabelecer a capacidade de
adsorção de cada metal isoladamente, realizou-se também a avaliação da
capacidade de ligação em soluções contendo misturas desses metais.
Os resultados mostraram que novamente a linhagem C. metallidurans/pCM2
cultivada na presença de metais foi capaz de atingir os maiores níveis de adsorção
de íons. Além disso, verificou-se que a capacidade de adsorção apresentou o
mesmo perfil de afinidade observado quando o metal foi usado isoladamente, exceto
para Zn+2 e Pb+2, quando houve inversão na afinidade de ligação à massa
microbiana. Assim, reforçaram-se os resultados de que a EC20sp apresentou a
seguinte espectro de afinidade: Zn~Pb>Cd>Cu>Ni>Mn>Co>Hg. Quando estes
resultados são comparados aos resultados obtidos com bactéria controle
Discussão 150
C. metallidurans/pBBR1MCS, fica patente que a presença da EC20sp alterou
completamente a capacidade de ligação a cada metal.
A fim de comprovar, definitivamente, a ligação do metal na célula
bacteriana, bem como, localizar onde estava ocorrendo esta ligação, decidimos
analisar as células por microscopia de transmissão eletrônica (MET). O emprego da
MET é bastante difundido no estudo de materiais biológicos, pois permite a definição
de imagens intracelulares, fornecendo informações sobre alterações de impossível
visualização
na
microscopia
de
luz.
Desta
forma,
pudemos
verificar
comparativamente que células incubadas com Pb+2 foram capazes de ligar este
metal, principalmente, na membrana externa da bactéria e, que a linhagem
transgênica C. metallidurans/pCM2 apresentou-se recoberta por uma densa camada
deste metal quando comparada à linhagem selvagem. Utilizando a mesma
metodologia, Liedrich et al. (2005) mostraram que C. metallidurans CH34 foi capaz
de ligar íons Ag+2 na membrana externa, comprovando o potencial biorremediador
deste microrganismo.
O
conjunto
desses
resultados
confirma
que
a
linhagem
C.
metallidurans/pCM2 construída neste trabalho apresenta, de fato, um aumento na
capacidade de biorremediar soluções contendo metais, seja a partir de efluentes
contendo apenas uma espécie de metal, seja em efluentes contendo vários metais.
Vale ressaltar ainda que, em todos os experimentos, a viabilidade celular não foi
alterada durante os experimentos de adsorção, comprovando que os mecanismos
de resistência de C. metallidurans CH34 estavam ativos, protegendo as células do
efeito tóxico dos metais. Além disso, o crescimento celular das linhagens
recombinantes não apresentou significativa diminuição que comprometesse a
produção de biomassa para biorremediação.
Assim, a linhagem transgênica C. metallidurans/pCM2 pode ser considerada
como um agente eficiente de biorremediação de ambientes contendo metais,
principalmente quando a biomassa é cultivada na presença de metais. Além disso, o
metal adsorvido pode ser recuperado, fato este que confere também a essa
linhagem a capacidade de ser uma lixiviadora de metais.
A partir desse trabalho, torna-se possível estabelecer uma cinética de
ligação
a
metais,
de
tal
forma
a
utilizar
um
volume
de
células
de
C. metallidurans/pCM2 conhecido para adsorver uma determinada quantidade de
Discussão 151
metal em solução, com o objetivo de limpar o efluente e enquadrá-lo nos padrões de
emissão de metais determinados pela legislação.
O objetivo principal do trabalho, qual seja de otimizar a capacidade de
biorremediação de C. metallidurans CH34, foi atingido, indicando que a estratégia de
ancorar proteínas quelantes de metais na superfície bacteriana é viável e contribui
para o desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas úteis para a preservação do
meio ambiente, em particular de um recurso natural tão precioso quanto a água
doce.
Conclusões 152
7 CONCLUSÕES
• C. metallidurans CH34 possui resistências a diversos antibióticos;
• C. metallidurans CH34 apresenta alta resistência a diversos metais pesados;
• Comprovada a construção do gene da fitoquelatina sintética com 20 resíduos de
cisteína, EC20sp;
• Comprovada a construção do cassete de ancoragem da EC20sp;
• Comprovada a ancoragem da EC20sp na membrana externa de E. coli;
• A bactéria E. coli expressando EC20sp na membrana externa apresentou
adsorção de Cd+2 superior à bactéria não recombinante;
• De todos os promotores analisados, o mais eficiente para C. metallidurans CH34
foi o promotor pan;
• Comprovada a construção do cassete de expressão-ancoragem da EC20sp;
• Comprovada a ancoragem da EC20sp na membrana externa de C. metallidurans
CH34;
• A bactéria C. metallidurans CH34 expressando EC20sp na membrana externa
mostrou ter superior capacidade de ligar Cd+2, Co+2, Cu+2, Hg+2, Mn+2, Ni+2, Pb+2 e
Zn+2 em relação à bactéria não recombinante;
• Comprovada a localização do metal pesado na membrana externa de
C. metallidurans CH34/pCM2;
• A bactéria C. metallidurans CH34 expressando EC20sp não apresentou alterações
quanto à capacidade de crescimento;
• C. metallidurans CH34 expressando EC20sp pode ser empregada em processos
de biorremediação de efluentes contendo metais pesados.
Considerações Finais 153
8 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Neste trabalho, foi construída por manipulação genética a bactéria
C. metallidurans/pCM2 com capacidade de biorremediar soluções contendo íons de
metais pesados devido à presença da proteína quelante de metais EC20sp,
ancorada na sua superfície celular. A expressão do cassete de ancoragem da
EC20sp em C. metallidurans foi realizada pelo promotor pan, que apresentou altos
níveis de expressão protéica nesta bactéria, o que é vantajoso para um agente de
biorremediação, pois não há necessidade de uso de indutores artificiais para o seu
funcionamento. No entanto, o plasmídeo contendo a construção gênica precisa ser
mantido sob pressão seletiva, o que representa uma limitação para uso em grande
escala. Portanto, há a necessidade de estabilizar essa informação genética no
cromossomo da bactéria, de tal forma que, possamos vencer essa limitação e, de
fato, empregá-la em processos de biorremediação em escala industrial. Para tanto,
enviamos uma proposta de continuidade deste trabalho à Vale com o objetivo de
estabilizar no genoma da bactéria C. metallidurans o sistema de expressãoancoragem da EC20sp e, posteriormente, utilizar essa linhagem estável para uso em
biorreatores, para os testes em escala piloto, tanto com efluentes artificiais, quanto
com aqueles reais, ou seja, produzidos pela atividade mineradora da Vale. A
proposta foi avaliada pela empresa e aprovada.
Outro aspecto a salientar diz respeito à contenção deste OGM na natureza.
Para tanto, há outro projeto nesse convênio, desenvolvendo sistemas suicidas que
poderão permitir que após realizar a sua incumbência biorremediadora, a bactéria no
final do processo se suicide devido à expressão de uma nuclease que destrói o DNA
microbiano, evitando a sua disseminação no meio ambiente.
Considerando-se todos estes aspectos, o presente trabalho traz uma
contribuição inovadora no Brasil, desenvolvendo geneticamente um microrganismo
com potencial de realizar biorremediação de metais em efluentes, engajando-se na
busca por processos eficientes e amigáveis ao meio ambiente, no sentido de buscar
a diminuição dos rejeitos de metais que são produzidos em milhões de toneladas
anualmente, e colaborar de forma objetiva na preservação dos recursos hídricos do
planeta.
Por fim, vale ressaltar que os resultados deste trabalho produziram dois
pedidos de patente protocolados no Instituto Nacional de Propriedade Industrial
Considerações Finais 154
(INPI): (i) uma patente referente à proteção e direito de uso, tanto das seqüências
gênicas
construídas
neste
trabalho,
quanto
da
linhagem
recombinante
biorremediadora (Biondo, R.; Ribeiro-dos-Santos, G.; Vicente, E.J.; Schenberg,
A.C.G. Pedido de Patente n° 018080019208); (ii) uma segunda patente, em
colaboração com outro projeto deste convênio USP-VALE, referente à proteção e
uso do promotor pan construído e testado com sucesso em C. metallidurans CH34 e
E. coli (Ribeiro-dos-Santos, G, Biondo, R.; Quadros, O.F.; Vicente, E.J.; Schenberg,
A.C.G. Pedido de Patente n° 018080019207).
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Anexo 166
Anexo A
CONSELHO NACIONAL DO MEIO AMBIENTE
RESOLUÇÃO N. 357, DE 17 DE MARÇO DE 2005
CAPÍTULO IV
DAS CONDIÇÕES E PADRÕES DE LANÇAMENTO DE EFLUENTES
Art. 24. Os efluentes de qualquer fonte poluidora somente poderão ser
lançados, direta ou indiretamente, nos corpos de água, após o devido tratamento e
desde que obedeçam às condições, padrões e exigências dispostos nesta
Resolução e em outras normas aplicáveis.
Parágrafo único. O órgão ambiental competente poderá, a qualquer momento:
I - acrescentar outras condições e padrões, ou torná-los mais restritivos, tendo
em vista as condições locais, mediante fundamentação técnica; e
II - exigir a melhor tecnologia disponível para o tratamento dos efluentes,
compatível com as condições do respectivo curso de água superficial, mediante
fundamentação técnica.
Art. 25. É vedado o lançamento e a autorização de lançamento de efluentes
em desacordo com as condições e padrões estabelecidos nesta Resolução.
Parágrafo único. O órgão ambiental competente poderá, excepcionalmente,
autorizar o lançamento de efluente acima das condições e padrões estabelecidos no
art. 34, desta Resolução, desde que observados os seguintes requisitos:
I - comprovação de relevante interesse público, devidamente motivado;
II - atendimento ao enquadramento e às metas intermediárias e finais,
progressivas e
obrigatórias;
III - realização de Estudo de Impacto Ambiental - EIA, às expensas do
empreendedor responsável pelo lançamento;
IV - estabelecimento de tratamento e exigências para este lançamento; e
V - fixação de prazo máximo para o lançamento excepcional.
Anexo 167
Art. 26. Os órgãos ambientais federal, estaduais e municipais, no âmbito de
sua competência, deverão, por meio de norma específica ou no licenciamento da
atividade ou empreendimento, estabelecer a carga poluidora máxima para o
lançamento de substâncias passíveis de estarem presentes ou serem formadas nos
processos produtivos, listadas ou não no art. 34, desta Resolução, de modo a não
comprometer
as
metas
progressivas
obrigatórias,
intermediárias
e
final,
estabelecidas pelo enquadramento para o corpo de água.
§ 1º No caso de empreendimento de significativo impacto, o órgão ambiental
competente exigirá, nos processos de licenciamento ou de sua renovação, a
apresentação de estudo de capacidade de suporte de carga do corpo de água
receptor.
§ 2º O estudo de capacidade de suporte deve considerar, no mínimo, a
diferença entre os padrões estabelecidos pela classe e as concentrações existentes
no trecho desde a montante, estimando a concentração após a zona de mistura.
§ 3º Sob pena de nulidade da licença expedida, o empreendedor, no processo
de licenciamento, informará ao órgão ambiental as substâncias, entre aquelas
previstas nesta Resolução para padrões de qualidade de água, que poderão estar
contidas no seu efluente.
§ 4º O disposto no § 1º aplica-se também às substâncias não contempladas
nesta Resolução, exceto se o empreendedor não tinha condições de saber de sua
existência nos seus efluentes.
Art. 27. É vedado, nos efluentes, o lançamento dos Poluentes Orgânicos
Persistentes-POPs mencionados na Convenção de Estocolmo, ratificada pelo
Decreto Legislativo n. 204, de 7 de maio de 2004.
Parágrafo único. Nos processos onde possa ocorrer a formação de dioxinas e
furanos deverá ser utilizada a melhor tecnologia disponível para a sua redução, até a
completa eliminação.
Art. 28. Os efluentes não poderão conferir ao corpo de água características
em desacordo com as metas obrigatórias progressivas, intermediárias e final, do seu
enquadramento.
§ 1º As metas obrigatórias serão estabelecidas mediante parâmetros.
Anexo 168
§ 2º Para os parâmetros não incluídos nas metas obrigatórias, os padrões de
qualidade a serem obedecidos são os que constam na classe na qual o corpo
receptor estiver enquadrado.
§ 3º Na ausência de metas intermediárias progressivas obrigatórias, devem
ser obedecidos os padrões de qualidade da classe em que o corpo receptor estiver
enquadrado.
Art. 29. A disposição de efluentes no solo, mesmo tratados, não poderá
causar poluição ou contaminação das águas.
Art. 30. No controle das condições de lançamento, é vedada, para fins de
diluição antes do seu lançamento, a mistura de efluentes com águas de melhor
qualidade, tais como as águas de abastecimento, do mar e de sistemas abertos de
refrigeração sem recirculação.
Art. 31. Na hipótese de fonte de poluição geradora de diferentes efluentes ou
lançamentos individualizados, os limites constantes desta Resolução aplicar-se-ão a
cada um deles ou ao conjunto após a mistura, a critério do órgão ambiental
competente.
Art. 32. Nas águas de classe especial é vedado o lançamento de efluentes ou
disposição de resíduos domésticos, agropecuários, de aqüicultura, industriais e de
quaisquer outras fontes poluentes, mesmo que tratados.
§ 1º Nas demais classes de água, o lançamento de efluentes deverá,
simultaneamente:
I - atender às condições e padrões de lançamento de efluentes;
II - não ocasionar a ultrapassagem das condições e padrões de qualidade de
água, estabelecidos para as respectivas classes, nas condições da vazão de
referência; e
III - atender a outras exigências aplicáveis.
§ 2º No corpo de água em processo de recuperação, o lançamento de
efluentes observará as metas progressivas obrigatórias, intermediárias e final.
Anexo 169
Art. 33. Na zona de mistura de efluentes, o órgão ambiental competente
poderá autorizar, levando em conta o tipo de substância, valores em desacordo com
os estabelecidos para a respectiva classe de enquadramento, desde que não
comprometam os usos previstos para o corpo de água.
Parágrafo único. A extensão e as concentrações de substâncias na zona de
mistura deverão ser objeto de estudo, nos termos determinados pelo órgão
ambiental competente, às expensas do empreendedor responsável pelo lançamento.
Art. 34. Os efluentes de qualquer fonte poluidora somente poderão ser
lançados, direta ou indiretamente, nos corpos de água desde que obedeçam as
condições e padrões previstos neste artigo, resguardadas outras exigências
cabíveis:
§ 1º O efluente não deverá causar ou possuir potencial para causar efeitos
tóxicos aos organismos aquáticos no corpo receptor, de acordo com os critérios de
toxicidade estabelecidos pelo órgão ambiental competente.
§ 2º Os critérios de toxicidade previstos no § 1º devem se basear em
resultados de ensaios ecotoxicológicos padronizados, utilizando organismos
aquáticos, e realizados no efluente.
§ 3º Nos corpos de água em que as condições e padrões de qualidade
previstos nesta Resolução não incluam restrições de toxicidade a organismos
aquáticos, não se aplicam os parágrafos anteriores.
§ 4º Condições de lançamento de efluentes:
I - pH entre 5 a 9;
II - temperatura: inferior a 40ºC, sendo que a variação de temperatura do
corpo receptor não deverá exceder a 3ºC na zona de mistura;
III - materiais sedimentáveis: até 1 mL/L em teste de 1 hora em cone Imhoff.
Para o lançamento em lagos e lagoas, cuja velocidade de circulação seja
praticamente nula, os materiais sedimentáveis deverão estar virtualmente ausentes;
IV - regime de lançamento com vazão máxima de até 1,5 vezes a vazão
média do período de atividade diária do agente poluidor, exceto nos casos
permitidos pela autoridade competente;
V - óleos e graxas:
1 - óleos minerais: até 20mg/L;
2- óleos vegetais e gorduras animais: até 50mg/L; e
Anexo 170
VI - ausência de materiais flutuantes.
§ 5º Padrões de lançamento de efluentes:
Art. 35. Sem prejuízo do disposto no inciso I, do § 1º do art. 24, desta
Resolução, o órgão ambiental competente poderá, quando a vazão do corpo de
água estiver abaixo da vazão de referência, estabelecer restrições e medidas
adicionais, de caráter excepcional e temporário, aos lançamentos de efluentes que
possam, dentre outras conseqüências:
I - acarretar efeitos tóxicos agudos em organismos aquáticos; ou
II - inviabilizar o abastecimento das populações.
Art. 36. Além dos requisitos previstos nesta Resolução e em outras normas
aplicáveis, os efluentes provenientes de serviços de saúde e estabelecimentos nos
quais haja despejos infectados com microorganismos patogênicos, só poderão ser
lançados após tratamento especial.
Art. 37. Para o lançamento de efluentes tratados no leito seco de corpos de
água intermitentes, o órgão ambiental competente definirá, ouvido o órgão gestor de
recursos hídricos, condições especiais.