FACULDADE DE FARMÁCIA
UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE
FARMÁCIA
Universidade de Lisboa
TOXICOLOGIA
LABORATÓRIO
Docentes
Ana Paula Marreilha dos Santos
Álvaro Teixeira Lopes
Cristina Carvalho
Ana Cristina Ribeiro
Nuno Oliveira
LISBOA
2012
Trabalhos Laboratoriais
Trabalho nº1
(A) Doseamento do Álcool etílico no sangue (método de Widmark)
(B) Doseamento do Álcool etílico no sangue (Cromatografia gás-líquido)
Trabalho nº2
(A) Doseamento do Monóxido de carbono no sangue
(B) Doseamento da Metahemoglobina no sangue
Trabalho nº3
(A) Determinação quantitativa do Ácido delta-aminolevulínico em urina (ALA-U)
(B) Determinação quantitativa de Coproporfirinas em urina (COPRO-U)
Trabalho nº4
(A) Pesquisa de insecticidas Organofosforados numa amostra de terra
(B) Determinação da actividade das Colinesterases em soro ou plasma
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Trabalho nº1 (A)
Doseamento do álcool etílico no sangue (método de Widmark)
Técnica Experimental
1. Na cápsula do matraz de Widmark colocar 0,2 ml da amostra (sangue).
2. No fundo do matraz, introduzir 2 ml da solução cromossulfúrica.
3. Fechar e colocar o matraz durante duas horas em um banho de águaa uma temperatura de 60ºC, (se
existir álcool na amostra de sangue este vai volatizar-se e reduzir parte do dicromato – que está em
excesso)
4. Paralelamente fazer um ensaio a branco.
5. Ao fim das 2 horas retirar as tampas e colocar no fundo de cada matraz 25 ml de água destilada e 0,5
ml de soluto de KI a 5%.
6. Após 1,5 minutos, titular o I2 libertado com tiossulfato de sódio 0,01N. (Mede-se o volume gasto na
titulação (VA) e o gasto na titulação do branco (VB). e é a partir da diferença (VB)-VA) que se
efectuam os cálculos).
Reacções
3 C2H5OH + 2 K2Cr2O7 + 8 H2SO4
(x2) K2Cr2O7 + 6 KI + 7 H2SO4
(x2) 3 I2 + 6 Na2S2O3
3 CH3COOH + 2 Cr2(SO4)3 + K2OH4 +11 H2O
Cr2(SO4)3 + 4 K2SO4 + 7 H2O + 3 I2
3 Na2S4O6 + NaI
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Apuramento de resultados
3 C2H5OH
12 Na2S2O3
C2H5OH
4 Na2S2O3
Na2S2O3
PM C2H5OH /4
PM (Etanol) = 46
+3
PM Etanol /4 = 46/4 = 11.5
+4
Solução de Hipossulfito 0.01 N:
0,01 eq. Na2S2O3
1000 mL
1 eq.
V mL
1 equivalente de Na2S2O3 em V = 105 mL
105mL Na2S2O3 (N/100)
V B - VA
11,5 g álcool
x
(VB mL – VA mL) Na2S2O3 ↔ x g/álcool em 0,2 ml de sangue
xg
y
_____________
______________
0,2 ml (toma de ensaio)
1000 ml
y = Quantidade de álcool em g/l
Trabalho nº1 (B)
Doseamento do álcool no sangue por cromatografia gás-liquído
Em cromatografia gás-líquido, a separação dos componentes de uma mistura é feita através de um
processo de partilha entre a fase estacionária e a fase móvel (gás de arraste). Para que um produto possa ser
analisado por este método, é necessário que ele seja volátil e estável á temperatura a que a análise é
realizada. A análise qualitativa é baseada na observação do tempo que medeia entre a injecção da amostra e
a eluição do composto (pico) em estudo – tempo de retenção. Na análise quantitativa é determinada a área do
pico. Em cromatografia gás líquido uma quantidade conhecida de um determinado composto (padrão interno
– PI) é muitas vezes adicionada no inicio do processo de tratamento da amostra . Este composto sofre
portanto o mesmo tratamento que os compostos em estudo. A determinação do tempo de retenção do PI
corrige determinados factores de variabilidade, como por exemplo a alteração do fluxo do gás de arraste
durante a análise. Mais importante ainda, determinação da relação entre a área do pico do composto em
análise e a área do pico do PI corrige variações resultantes do volume de amostra injectado.
Este método permite detectar e determinar alcoóis como o etanol, metanol, 2-propanol e butanol no
sangue total, plasma/soro ou urina, em concentrações da ordem dos 0,04 g/l ou superiores. Na aula prática
iremos determinar a concentração de etanol numa amostra de sangue.
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Técnica Experimental
A 0,1 ml de amostra é adicionada uma solução do PI em solução de ácido clorídrico 0,01 mol/l, para
precipitar as proteínas . Depois de agitar no vortex e centrifugar, 1 µL do sobrenadante é analisado através
de cromatografia gás-líquido com detector de ionização de chama (GC-FID). É construída uma curva de
calibração com soluções padrão de etanol preparadas em água desionisada, com razões entre as áreas de
etanol e de PI contra as concentrações do primeiro.
Condições cromatográficas
Detector: Ionização de chama (FID)
Temperatura do forno: 40º
Temperatura do detector: 180º
Temperatura do injector: 160º
Fluxo de gás de arraste (azoto): 10 mL/min
Coluna: HP 20M (Carbowax 20M) comprimento 10m, Ø interno 530µm
Solução de padrão interno
Diluir 0,10 ml de n-butanol para 50 ml com ácido clorídrico 0,01 mol/l
Curva de calibração do etanol
• Diluir 0,10 ml de etanol absoluto para 100 ml com água desionisada (solução de etanol 0,80g/l).
• Retirar 0,1/0,2/0,4 e 0,6 ml da solução anterior para eppendorfs marcados
• Adicionar a cada tubo 0,1 ml da solução do PI
• Completar com água desionisada para 1 ml
Estas soluções correspondem a soluções padrão de etanol com concentrações compreendidas entre 0,08 e
0,48 g/l
Injectar no cromatografo 1 µl de cada solução
Análise da amostra
1.
•
•
•
•
•
•
•
Preparação da amostra
Retirar 0,1 ml da amostra (sangue total – homogenizar previamente) para eppendorf
Adicionar 0,1 ml da solução do PI
Completar com água desionisada para 1 ml
Agitar 5 segundos no vortex
Centrifigar a 4000 rpm, 4 minutos
Separar 500 µl de sobrenadante para um Eppendorf novo
Injectar no cromatografo 1 µl do sobrenadante
2. Identificar o(s) composto(s) presentes no cromatograma comparando-o com o cromatograma de uma
solução de etanol.
3. Se o etanol estiver presente preparar as soluções para a curva de calibração.
4. Analisar as soluções padrão e construir um gráfico com as razões entre áreas dos padrões e do PI contra a
concentração das soluções de etanol.
5. Calcular a concentração de etanol na amostra através da curva de calibração construída.
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Trabalho nº2 A
DOSEAMENTO DO MONÓXIDO DE CARBONO NO SANGUE
O método que utilizamos na aula prática baseia-se nas propriedades redutoras do monóxido de carbono ,
manifestadas através da reacção:
PdCl2 + CO + H2O → 2 HCl + Pd + CO2
Cloreto de paládio
H2SO 4
Amostra de sangue
O CO libertado da carboxihemoglobina por uma acidificação da amostra de sangue, difundindo-se no
interior de uma célula de Conway, vai reduzir uma solução de cloreto de paládio colocada no
compartimento, interior desta.
O método clássico de Conway consistia em determinar o ácido libertado, relacionando-se com a quantidade
de monóxido de carbono presente.
Técnica Experimental
1. Aplique uma fina camada de silicone, ou outro produto similar , na tampa de uma célula de Conway.
2. Pipete 3 ml de solução de cloreto de paládio 0,005N para o compartimento central da célula.
3. Pipete 1,0 ml de H2SO4 3,6N no compartimento exterior da célula e coloque a tampa de modo a ficar
uma pequena abertura que permita a introdução de sangue.
4. Introduza rapidamente 0,5 ml da amostra de sangue. Tape a célula e misture o conteúdo do
compartimento exterior por agitação suave, que se prolongará por duas horas à temperatura ambiente.
*Neste ponto é possível apreciar semi-quantitativamente a carboxihemoglobina, observando a extensão da
redução ocorrida. A camada negra de paládio metálico que se forma, é função da quantidade de CO libertado
da amostra
5. Transfira o conteúdo do compartimento central para um balão de 50 ml, lavando-o por 3 vezes com HCl
0,1N (3 ml)
6. Dilua o conteúdo do balão para 50 ml com HCl 0,1N e misture bem.
7. Usando HCl 0,1N como referência, determine a absorvância, desta solução a 278nm.
8. Usando o mesmo HCl 0,1N como solução de referência, determine a absorvância de 3 ml de PdCl2
0,005N diluídos para 50 ml com HCl 0,1N.
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CURVA DE CALIBRAÇÃO
Enquanto aguarda o termo das duas horas, proceda ao estabelecimento de uma curva de calibração do
seguinte modo:
1. Dilua 0,5/1,0/1,5/2,0/2,5/3,0 ml de solução de PdCl2 0,005N para 50 ml, com HCl 0,1N e misture bem.
2. Determine a absorvância de cada uma das soluções a 278nm, utilizando como branco, HCl 0,1N.
3. Marque as absorvâncias obtidas em ordenadas, contra volumes de monóxido de carbono / 100 ml, em
abcissas. Os respectivos valores do monóxido de carbono são:
Volumes de cloreto de paládio
(mL/50 mL)
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
Volumes de monóxido de carbono
(mL/100 mL)
0
5,6
11,2
16,8
22,4
28,0
4. Determine os volumes de CO pela curva de calibração.
5. Faça a determinação da hemoglobina na amostra em causa e complete os cálculos como segue
Volumes de CO x 100
= % de carboxihemoglobina
Hemoglobina (g/dL) x 1,35
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Trabalho nº 2B
Doseamento da Metahemoglobina em uma amostra de sangue
Reagentes
.
.
Solução de dihidrogenofosfato de potássio (sol. I)
Solução de dihidrogenofosfato de sódio (sol. II)
KH2PO4
2,269 g
H2O dest. q.b. p. 1000 mL
Na2HPO4
2,969 g
H2O dest. q.b. p. 1000 mL
.
R1: Solução tampão-fosfato - extemporânea
•
Solução aquosa de ácido acético glacial a 12%
•
R2: Solução neutralizada de cianeto de potássio – extemporânea
Sol. I
6,3 mL
Sol. II
3,7 mL
A técnica indica para no momento de emprego, neutralizar um mínimo da solução de cianeto
a 10% com uma solução de ácido acético a 12% gota a gota (verificar se o pH está próximo
de 7) Proceder com cuidado a esta operação, dada a possibilidade de libertação de gás
cianídrico
NOTA: (dadas as características do padrão de KCN existente no laboratório pode bastar a
preparação de 1mL deste composto em água destilada, sem neutralização. Consulte o docente)
•
R3: Solução aquosa de ferricianeto de potássio a 5% - (extemporânea, mas já preparada)
Técnica Experimental
1. Introduzir 10 mL do reagente R1 num tubo de centrifuga e 0,2 mL da amostra de sangue (recolhida em
heparina ou EDTA) homogeneizada.
2. Agitar, deixar em contacto por 10 min. E em seguida centrifugar.
3. Distribuir por 2 tubos de ensaio 3 mL o líquido sobrenadante.
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a) Primeiro tubo: - Medir a absorvância a 630 nm. Seja o valor medido A
b) Segundo tubo: - Adicionar uma gota do reagente R2.
- Medir a absorvância a 630 nm. Seja o valor medido B
c) Terceiro tubo: - Adicionar uma gota de reagente R3
- Medir a absorvância a 630 nm. Seja o valor medido de C
- Juntar em seguida na própria tina espectrofotómetro, uma gota do reagente R2
-Medir novamente a absorvância. Seja o valor D.
A
11
A diferença de absorvâncias (A-B) é
proporcional à meta-Hb existente na
amostra (homolizado)
2
B
630
c.d.o.
A diferença de absorvâncias (C-D) é
proporcional à -Hb total
C
3
D
630
c.d.o.
Cálculos
% de Metahemoglobina no sangue = 100 x (A – B)
(C – B)
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Trabalho nº 3 A
Doseamento do ácido δ-aminolevulínico na urina (ALA-U)
Reagentes:
•
Solução mãe de ALA (50mg/L)
•
Acetato de Etilo
•
Acetoacetato de Etilo
•
Tampão acetato pH 4,6
•
Reagente de Ehrlich modificado
Técnica Experimental
1. Preparar para balões de 10 mL as soluções padrão de concentração 2,5 mg/L, 5,0 mg/L, 7,5
mg/L 10 mg/L, 15 mg/L a partir da solução mãe de ALA (50 mg/L)
2. Para tubos de centrifuga pipetar rigorosamente 1 mL de cada solução padrão
3. Pipetar para um tubo de centrífuga 1 mL de água destilada que servirá de branco
4. Pipetar 1 mL de amostra (urina) para tubos de centrífuga
5. A cada tubo adicionar 1 mL de tampão acetato pH 4,6
6. Adicionar a cada tubo 0,2 mL de acetoacetato de etilo e agitar durante 5 segundos
7. Colocar em banho de água (100ºC) durante 10 minutos
8. Deixar arrefecer e juntar 3 mL de acetato de etilo agitar 50 x
9. Centrifugar 3 minutos a 2000 rpm
10. Transferir 2 mL da fase orgânica para tubos de vidro
11. Juntar 2 mL de reagente de Ehrlich
12. Agitar no vortex e ler ler a 553 nm após 10 minutos contra o branco
13. Fazer a curva de calibração e calcular a concentração em ácido δ-aminonolevulinico em mg/L
ALA-U (mg/L)
Normal
<6
Valores de ALA na urina
Aceitável
Excessivo
6-20
20-40
11/18
Perigoso
>40
Trabalho 3 (B)
Determinação quantitativa de Coproporfirinas em urina (COPRO-U)
AMOSTRAS E REAGENTES
• Amostra(s) de urina
• Solução clorídrica de iodo
(1mL de solução etanólica de iodo a 1% em 200mL de HCl a 5%)
• Ácido acético glacial
• Éter etílico
TÉCNICA
1. Em um tubo de ensaio colocar 2mL da amostra (urina), 0,2mL de ácido acético e 5mL de éter etílico.
2. Agitar por 15”, aguardar a separação de fases e remover a fase aquosa, desprezando-a.
3. Adicionar 5mL da solução clorídrica de iodo à fase etérea, agitar e remover a fase orgânica
rejeitando-a.
4. Colocar os tubos em um banho de água a 37ºC durante 5’.
5. Medir a absorvância a 380nm, 430nm e no máximo da banda de Soret (em torno de 401nm) usando
como referência a solução de ácido clorídrico.
CÁLCULOS
As concentrações de coproporfirina, expressas em µg/L, são obtidas através da fórmula:
[ 2 x Amáx – (A430 + A380) ] x 2,093 x 1,064 x 1000 = x µg/L COPRO
Amáx
A430, A380
1,064
2,093
Absorvância máxima de coproporfirina na banda de Soret
Absorvâncias referentes a impurezas
Factor de correcção proposto por Soulsby e Smith
Factor proposto por Rimington utilizando o coeficiente de extinção da COPRO
e o factor de diluição usado no método
Soulsby J, Smith RL, Brit. J.Ind. Med., 31, 72-74, 1974
Rimington C, Biochem.J., 75, 620-3, 1960
Copro-U
(µg/L)
Valores de coproporfirinas totais na urina
Normal
Aceitável
Excessivo
<150
150-500
500-1500
12/18
Perigoso
>1500
Trabalho nº4
Insecticidas Organofosforados
Propriedades e Mecanismos de Acção
Os organofosforados são, salvo raras excepções, líquidos muito lipossolúveis; a sua tensão de vapor é
elevada mesmo a temperaturas normais, facilitando assim uma penetração rápida por todas as vias; digestiva
e respiratória.
Os seus metabolitos são excretados, quase exclusivamente, numa forma degradada pela urina, decorrendo
obviamente um certo tempo entre a absorção e a excreção, variável consoante a afinidade química do
produto ou seus metabolitos, para os tecidos.
O despiste de uma intoxicação por organofosforados pode assim ser executada nos meios biológicos, por
intermédio de diversas técnicas analíticas, desde as mais simples até às mais elaboradas: reacções cromáticas
em cromatografia em camada fina, cromatografia fase gasosa, cromatografia líquida de alta pressão,
espectrofotometria de absorção de ultravioletas e de infravermelhos, espectrometria de massa, etc… Pode
ainda ser executada em materiais tão diversos como alimentos, água, solos, quando haja suspeita de
contaminação.
Um dos obstáculos iniciais de qualquer análise toxicológica, reside no método de extracção a adoptar. Quase
sempre as substâncias a analisar se encontram envolvidas numa “matriz” que pode comprometer a sua
correcta determinação, pelo que se deve escolher criteriosamente a metodologia de extracção.
A análise de substâncias em teores residuais obriga igualmente á selecção de métodos contínuos de
extracção, como os que envolvem a extractor de refluxo de SOXHLET.
A acção insecticida destes compostos foi descoberta na Alemanha, durante a 2ª Guerra Mundial. Estes
insecticidas são geralmente muito mais tóxicos para os insectos e vertebrados do que os organoclorados, e
são instáveis quimicamente. Esta última propriedade confere aos organofosforados vantagem no seu uso
como substitutos dos persistentes organoclorados, especialmente do DDT.
Todos os compostos organofosforados são derivados do ácido fosfórico. Aliás, organofosforados é um termo
genérico que inclui todos os insecticidas que contêm fósforo,. Atribui-se-lhes a seguinte estrutura geral.
S (O)
R
P
R'
O (S)
X
Fig. 4 - R e R' grupo amino ou alcoxi;
X - grupo aromático, alifático ou oheterocíclico.
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Mencionam-se seguidamente alguns compostos organofosforados mais comuns
Paratião
O Paratião foi descoberto em 1944. Este composto e o seu homólogo, metil-paratião, têm sido
os insecticidas organofosforados mais utilizados. Deve, porém salientar-se que a sua
toxicidade para os mamíferos é tão elevada que alguns países têm proibido o seu uso. Este as
pecto é, aliás, um factor limitante na sua aplicação
Atenção ao esquema
S
(RO)2
Fig. 5 Paratião ou etil-paratião R
Metil-paratião
R
O
P
NO2
C 2H 5
o,o-dietil-o,p-nitrofenilfosforotioato
C 2H 3
o,o-dimetil-o,nitrofenilfosforotioato
Azinfos ou azinfos-metilo
Estes compostos e o seu homólogo, azinfos-etilo, são bastante eficazes contra as pragas que se
alimentam das folhas das plantas cultivadas. Ambos os compostos são bastante tóxicos para os
mamíferos
S
(RO)2
P
O
S
CH3 N 3
N
Fig. 6 -Azinfos-metilo
Azinfos-etilo
4
2 1
N
o,o-dimetil-s-{4-oxo-1,2,3-benzotriazino-3(4H)-ilmetil}-fosforoditioato
o,o-dietil-s-{4-oxo-1,23-benzotriazino-3(4H)-ilmetil}-fosforoditioato
Malatião
Devido à sua baixa toxicidade para os mamíferos e à sua alta actividade insecticida, o malatião é talvez o
organofosforado mais usado. Tem sido utilizado em larga escala pela Organização Mundial de Saúde no
combate dos mosquitos transmissores da malária. É ainda um insecticida doméstico muito divulgado
para combate de pulgas, moscas e mosquitos.
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S
(CH3O)2 P S
O
CH
C O CH2H5
CH2 C O CH2H5
O
Fig.7 – Malatião:
O,O-dimetilfosforoditioato de dietilmercaptosuccinato
TOXICOLOGIA DOS INSECTICIDAS ORGANOFOSFORADOS
Inibição das Colinesterases
É quase universalmente aceite que os insecticidas organofosforados e carbamatos são letais para os insectos
e vertebrados porque inibem a enzima acetilcolinesterase. Esta enzima está localizada na membrana póssináptica, junto aos receptores sinápticos.
O conhecimento do mecanismo molecular de catálise, operando no local activo da enzima é fundamental
para a compreensão da inibição causada pelos agentes anticolinesterásicos.
A reacção de hidrólise da acetilcolina no local activo da enzima acetilcolinesterase compreende 3 fases
fundamentais:
a) A molécula de substrato liga-se ao local activo da enzima. Esta ligação é de natureza iónica
envolvendo um resíduo aniónico da enzima e o amónio quaternário do substrato.
Esta região tem polaridade de dimensões consentâneas com a introdução de um grupo amónio quaternário,
pois os substratos e inibidores competitivos da enzima têm invariavelmente um grupo idêntico.
CH3
CH3 N
+
CH2
CH2 O
C
CH3
Acetilcolina (substrato)
CH3
CH3
CH3 N
+
O
CH2
CH2 O
C
(CH2)2
CH3
Butirilcolina (substrato)
CH3
CH3
CH3 N
+
CH2
O
CH3
Muscarina (inibidor competitivo)
CH3
OH
Fig. 12.
15/18
b) O substrato reage com uma parte da enzima designada por local esteárico. É quase certo que este local
é um resíduo de serina. Este resíduo proporciona um mecanismo de reacção tipo ácido-base. Devido à
proximidade da ligação éster da acetilcolina e ao carácter nucleofilico do oxigénio da serina, o protão
do hidroxilo é rapidamente transferido para a ligação éster que se desfaz ficando o acetato com
deficiência de electrões . Gera-se colina que se separa e o acetato que, na condição de electrofilico (tem
falta de electrões), reage rapidamente com o oxigénio nucleofilico da serina (tem abundância de
electrões) formando-se uma ligação covalente por acetilação da serina.
Deve notar-se que o importante no processo da catálise é a colocação táctica da ligação susceptível (éster)
em frente do hidrxilo da serina. Assim, é importante que o substrato possua colina, mas não interessa muito
o comprimento da cadeia para além da ligação éster, porque substratos como propionilcolina e butirilcolina
são perfeitamente adequados, resultando a formação dos respectivos produtos. Moléculas muito parecidas
mas sem resíduo colina são próprias como substratos, sendo no entanto, inibidores competitivos
Os insecticidas organofosforados e carbamatos inibem a enzima acetilcolinesterase de modo diferente dos
inibidores competitivos mencionados. Os insecticidas não são posicionados no local activo como substrato e
os inibidores competitivos. O seu posicionamento no local activo é motivado por interacções não iónicas,
uma vez que os insecticidas não têm grupos carregados.
Todos os venenos insecticidas anticolinesterases têm em comum um grupo em que há assimetria de
distribuição electrónica. Os organofosforados têm um grupo fosfato em que P é electrofilico porque há
deslocamento de electrões na direcção do oxigénio, P=O. É facto estabelecido que os compostos
organofosforados têm efeito inibidor apenas na forma oxão (P=O) e não na forma de fosforotioato (P=S). A
diferença fundamental é que o P das formas oxão é muito mais electrofilico do que o das formas P=S que
não são reactivas.
Essencialmente, a interação dos insecticidas anticolinesterases com o local activo da enzima faz-se segundo
mecanismos ácido-base, em que grupos nucleofilicos e electrofilicos do substrato e enzima estão implicados.
Determinação da actividade da Colinesterase
Dois tipos básicos de actividade colinesterásica são encontrados nos tecidos de todos os animais: a
colinesterase “verdadeira” ou eritrocitária, detectada nos eritrócitos e tecido nervoso, exibe uma preferência
de substrato para a acetilcolina. A pseudocolinesterase encontrada principalmente no plasma, hidrolisa
preferencialmente a butirilcolina e também a acetilcolina, esta ultima a velocidade menor. De um modo geral
todos os insecticidas organofosforados e carbamatos, são potenciais inibidores da colinesterase, inibindo a
maior parte deles, ambos os tipos de enzima.
A determinação quantitativa da actividade colinesterásica, constitui assim, um meio de diagnóstico clínico
da intoxicação por organofosforados,
A actividade da pseudocolinesterase é normalmente, mas não invariavelmente inibida mais rapidamente do
que a da colinesterase eritrocitária. Dada a grande amplitude de valores considerados “normais” em
actividade colinesterásica, é desejável que quando se pretenda controlar indivíduos expostos a inibidores
desta enzima, se determinem previamente os seus teores normais individuais. Em regra deve-se considerar
significativo e indicador de uma exposição tóxica, quando a actividade descer para valores abaixo de 80%,
relativos ao valor médio normal (inibição ≥ 20%).Contudo, pode existir uma acentuada inibição destas duas
enzimas , sem a sintomatologia de intoxicação(!)
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Trabalho 4 (A)
Pesquisa de insecticidas organofosforados numa amostra de terra
Técnica Experimental
O trabalho da aula prática vai consistir na extracção de eventuais resíduos de insecticidas
organofosforados a partir de um material sólido, e sua identificação por cromatografia de camada
fina.
1. – Introduzir a amostra num cartucho contentor (completar cerca de 2/3);
2. Extrair em Soxhlet durante 90 min, com a mistura: n-hexano/acetona (9:1) (150 mL);
A mistura entra em ebulição e vaporiza. Após a condensação dissolve os organofosforados no
cartuxo e depois volta para o balão pelo sistema de sifão. Começa assim um novo ciclo e,
dependendo do objectivo da análise (análise qualitativa ou quantitativa) e da quantidade de
contaminante, assim continuamos ou não a extracção até se verficarem no mínimo 3 ciclos.
Após extracção procedemos à concentração da amostra em rota-vapor a pressão reduzida.
3. Analisar o resíduo por cromatografia em camada fina com o sistema: n-hexano/acetona
(4:1) usando os seguintes padrões: paratião, malatião e gusatião
4. Detecção:
Observação em UV (254nm/366nm)
Revelação química com PdCl2 (0,5%)
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Trabalho nº 4 (B)
Determinação da actividade da (pseudo)colinesterase em soro ou plasma
Técnica Experimental
O objectivo é determinar se o indivíduo esteve ou não em contacto com organofosforados ou anticolinesterásicos . Os valores normais têm uma variação muito grande, portanto para comparar correctamente
teria de se comparar com a actividade com valores previamente determinada (valor de referência) desse
mesmo indivíduo.
A actividade da colinesterase é determinada a partir da velocidade do aparecimento de tiocolina provocada
por esta reacção.
Amostra: Soro ou plasma recolhido em heparina ou EDTA.
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Procedimento:
1) Na tina do espectrofotómetro juntar:
R1 = 350 µL + 350 µL de água destilada
Amostra = 40 µL
R2 = 560 µL
2) Homogeneizar rapidamente
3) Registar os valores de absorvância em intervalos de 30” (0”,30”,60”,90”) e calcular
a média da variação (∆A). Aplicar factor
Ou
3’) Calcular o tempo (t) de variação de absorvância de 0,1. Aplicar factor
4) Registar o valor de actividade obtido e proceder a estudo comparativo
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