Técnicas de preparação e estudo de
lâminas citológicas
• Métodos de ensino em Biologia Celular e dos Tecidos:
estudo das estruturas e processos celulares;
• Microscopias de luz (ML) e eletrônica (ME) – permitem o
reconhecimento da célula como um componente dinâmico e
participante do metabolismo corporal;
• Ferramentas utilizadas:
• lâminas com colorações histológicas e histoquímicas ML;
• Telas de cobre contrastadas por metais pesados - ME
(de transmissão, de varredura, etc.)
Técnicas de preparação e estudo de
lâminas citológicas
Microscópio de
Transmissão
Luz
e
Microscópio
Eletrônico
de
Unidades de medida usadas:
O aumento total do objeto observado é calculado
multiplicando-se os valores do aumento da objetiva e da ocular.
Portanto:
 Preparo de lâminas ----- líquidos de montagem;
 Geralmente contêm elementos ou substâncias que conferem
as propriedades de:
- Colorir esporos e outras estruturas do patógeno e/ou células
e estruturas do tecido do hospedeiro = melhor clareza na
visualização ao microscópio.
- Fixar a peça ou estrutura a ser observada.
- Impedir o dessecamento da preparação e preservar
integridade estrutural, por tempo mais ou menos longo.
Preparação Tecidual
1. Coleta do tecido
do animal
2. Corte do tecido
em pedaços
3. Fixação
4. Desidratação
7. Montagem
a. em lâminas de vidro para MO.
b. em grades metálicas para MET.
6. Obtenção de cortes
a. com navalha metálica para MO.
b. com
lâmina de vidro ou de
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diamante para MET.
5. Inclusão
a. em parafina para
Microscopia Óptica (MO).
b. em resinas para
Microscopia Eletrônica de
Transmissão (MET).
Técnicas de Preparação de Lâminas
Preparação do material que se deseja observar à microscopia =
etapas de confecção:
1º - Coleta do Material
-Partes dos órgãos ou tecidos são retiradas – bisturi, pinça ou
lâmina de barbear – extremamente finos (máx. 4 mm)
2º - Fixação
• objetivo: insolubilizar as proteínas dos tecidos;
• procedimentos físicos (congelamento) ou químicos (+
utilizados)
• agentes fixadores + comuns:
• formol 10%
• líquido de Bouin: formaldeído, ácido acético, ácido
pícrico)
• ambos fixam as proteínas evitando sua degradação
1. Coleta do espécime
2. Fixação:
• Evita a destruição
das células por suas
próprias enzimas,
ou por bactérias.
• Insolubiliza as
proteínas dos
tecidos.
• Formaldeído 4-10%
em solução
tamponada (pH 7,4).
2. Fixação:
• Fragmentos com 5 mm
de espessura
• Tempo de fixação
variável dependendo do
tamanho do fragmento
e do fixador.
Técnicas de Preparação de Lâminas
3º - Processamento
• objetivo: preparar o material para ser analisado em microscópio
ótico.
• etapas rigorosamente seqüenciais e obrigatórias, na grande maioria
das técnicas, e uma etapa mal executada acarretará em material de
má qualidade para análise.
3.1 - Desidratação
• Objetivo: retirada de água da peça --- substâncias inclusoras são
insolúveis em água;
• Utilização de alcoóis etílicos graduados em tempos adequados:
• (70 - 80 - 90 - 100%) - evitar a retração pronunciada do tecido
ocasionando lesões estruturais da célula de caráter irreversível. O
volume de álcool deverá ser 10 a 20 vezes maior que o volume da peça.
• 2 min em cada graduação.
3. Desidratação
• Tem como
finalidade retirar
água dos tecidos.
• Consiste em
banhos de
concentrações
crescentes de
etanol: 70%, 80%,
90%, 2x 100%.
4. Diafanização ou Clareamento
• Objetivo: retirada do álcool da
peça
(as
substâncias
inclusoras dissolvem-se mal
no
álcool)
--torná-la
transparente;
• O etanol é substituído por um
líquido miscível com o meio
de inclusão (xilol).
• Os tecidos embebidos em
xilol tornam-se translúcidos,
razão porque essa etapa é
denominada diafanização ou
clareamento.
• 3.3 - Inclusão (Impregnação)
•
Objetivo: eliminar completamente o xilol contido no material e a total
penetração da parafina nos vazios deixados pela água e gordura, antes
existentes no tecido.
• preparar o material para os cortes, removendo o clarificante (xilol) e
endurecendo-o suficientemente e dando-lhe a consistência adequada
para que possa ser cortado.
• Procedimento para Inclusão
– Tecido: passado em duas trocas de parafina para assegurar a
substituição de todo o agente clarificador pela parafina;
– Parafina: temperatura de 56 a 60º C (parafina fundida) --- bloco de
tecido: imerso na parafina fundida (em estufa) durante o tempo
necessário para a completa impregnação.
– Blocos retirados da estufa e deixados à temperatura ambiente --parafina endureça;
– Bloco de parafina com o tecido: retirado da fôrma e conduzido ao
corte.
5. Inclusão ou Impregnação:
• Estufa a 60ºC:
parafina ocupa os
espaços antes
ocupados pelo xilol.
• Obtenção dos blocos
de parafina.
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4º - Microtomia
• obtenção de cortes de material incluído em parafina o mais
delgado possível --- observação aos microscópios óticos;
• Utiliza-se o micrótomo: aparelho cuja regulagem medida em
micrômetros (MO) --- obtenção do corte na espessura desejada;
• duas peças principais: o suporte ou mandril (onde é fixada a peça a
cortar) e a navalha;
• espessura mais utilizada em microscopia óptica é de 4 a 6
micrômetros
• Após esta etapa = cortes coletados em lâminas de vidro.
6. Microtomia:
• Cortes de 5 m de
espessura.
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Micrótomo
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Cortes Histológicos
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5º - Colagem do Corte à Lâmina
• Na superfície de uma lâmina --- um ponto de aderência
(normalmente com albumina de ovo) --- corte parafinado se
adere;
• Antes --- corte colocado em banho-maria --- dobras provocadas
pelo corte no tecido desapareçam
Cortes em Banho-Maria:
• Colocação dos
cortes em
lâminas de
vidro.
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Lâmina contendo cortes sem
coloração:
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7. Coloração:
•
•
•
•
Coloração rotineira H-E.
Hematoxilina (básica).
Eosina (ácida).
Núcleo é ácido e o
citoplasma relativamente
básico.
• Hidratação, Coloração,
Desidratação e
Clarificação.
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Colorações
As colorações foram desenvolvidas para visualizar componentes
das células e dos tecidos que na maioria são incolores
• Corantes que diferenciam ácidos de bases.
- formam ligações salinas com radicais ionizáveis presentes nos tecidos.
• Corantes que diferenciam componentes
fibrosos da matriz extracelular.
• Sais metálicos que precipitam nos tecidos
formando depósitos de metal (ex: tecido
nervoso).
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Colorações
• Baseadas no princípio ácido-base
– A hematoxilina é uma base, cora
componentes ácidos da célula em uma cor
azulada – núcleo (DNA e RNA)
– A eosina é um ácido que cora
componentes básicos (proteínas
citoplasmáticas) da célula em róseo.
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Reação e corantes histológicos comuns
C
O
L
O
R
A
Ç
Õ
E
S
REAGENTES
RESULTADOS
Hematoxilina (base)
Azul: núcleo; regiões ácidas do citoplasma:
matriz da cartilagem.
Eosina (ácido)
Rosa: regiões básicas do citoplasma; fibras de
colágeno.
Tricrômico de Masson
Azul-escuro: núcleos.
Vermelho: músculo; queratina; citoplasma.
Azul-claro: mucinógeno, colágeno.
Orceína, corante para fibras elásticas
Castanho: fibras elásticas.
Weigert, corante para fibras elásticas
Azul: fibras elásticas.
Coloração com prata
Preto: fibras reticulares.
Hematoxilina férrica
Preto: estrias dos músculos, núcleos e hemácias.
Ácido periódico de Schiff
Magenta: glicogênio e moléculas ricas em
carboidratos.
Corantes Wright e Giemsa
Usados para a coloração diferencial das células
do sangue.
Rosa: hemácias, grânulos dos eosinófilos.
Púrpura: núcleos dos leucócitos, grânulos dos
basófilos.
Azul: citoplasma dos monócitos e linfócitos.
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Hematoxilina-Eosina
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Tricrômico de Masson
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Resorcina-Fucsina de Weigert
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8. Montagem:
• Uso de lamínulas.
• Meio de montagem:
resinas (Entellan) ou
bálsamo do Canadá.
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7º - Montagem
• Após corte corado ---- novamente desidratado (a retirada da água
objetiva aumentar a sobrevida do preparado);
• concentrações crescentes de álcool etílico.
• Corte é banhado em xilol;
• Montado em um meio solúvel em xilol = meio de montagem ((para
os cortes de parafina é usado o Bálsamo de Canadá)
• Coloca-se uma gota do meio de montagem em cima do corte já
fixado;
• coloca-se a lamínula sobre o corte imerso no meio de montagem --comprime-se com firmeza evitando formação de bolhas de ar;
• Lâmina Pronta para observação!!!!!