Centro Universitário Fundação Santo André
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras
CURSO: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
MICROBIOLOGIA
Atividades Práticas
4º ANO
NOME:
Nº:
Profa. Dra. Márcia Zorello Laporta
2007
4º
Sumário
Parte A
Normas de segurança no laboratório de Microbiologia ...................................................................... 2
Atividade 1 – Técnica da Coloração de Gram ................................................................................... 3
Atividade 2 – Coloração de Cápsula ................................................................................................ 6
Atividade 3 – Coloração de Esporos ................................................................................................ 8
Atividade 4 – Coloração de BAAR (Método de Zielh-Neelsen) ............................................................ 10
Atividade 5 – Coloração de Espiroqueta........................................................................................... 12
Atividade 6 – Estudo de microrganismos ......................................................................................... 15
1
NORMAS DE SEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
As aulas práticas no laboratório de microbiologia têm como objetivos possibilitar ao aluno
a aprendizagem das técnicas comumente utilizadas, o desenvolvimento da capacidade de
formular hipóteses e interpretar resultados e possibilitar o conhecimento e a utilização de normas
de segurança exigidas neste tipo de laboratório.
Nessas aulas, são utilizadas uma grande variedade de bactérias, algumas potencialmente
patogênicas para o homem, principalmente quando em meios de cultura. Portanto, é essencial
seguir as normas de segurança estabelecidas para um laboratório de microbiologia, a fim de se
evitar contaminação dos estudantes, professores e funcionários.
1. Use sempre avental dentro do laboratório. Não o utilize fora do laboratório.
2. Mantenha cabelos longos sempre presos.
3. Desinfete a bancada de trabalho no início e término de cada aula prática.
Para essa finalidade, utiliza-se álcool 70%. Com este procedimento, os microrganismos
que poderiam contaminar a área de trabalho são removidos.
4. Lava as mãos ao entrar e sair do laboratório e sempre que suspeitar de contaminação.
5. Não coma, beba, fume, aplique cosméticos, mexa em lentes de contato ou coloque
objetos (lápis, dedo etc) na boca, procedimentos eficientes de autocontaminação.
6. Tenha cuidado ao utilizar o bico de gás. Ao acender, verifique se não existem
substâncias inflamáveis por perto. Ao término da aula, desligue corretamente o gás.
7. Flambe alças, agulhas e pinças antes e após o uso. A correta flambagem dos materiais
evita a formação de aerossóis, um dos meios mais eficientes de contaminação.
8. Não utilize pipeta sem a devida proteção de algodão. Isso evita que você seja
contaminado se estiver pipetando uma cultura bacteriana em meio líquido.
9. Não coloque materiais contaminados (pipetas, lâminas etc.) sobre a bancada.
Estes materiais devem ser colocados em recipientes apropriados que serão dispostos em
cada bancada.
10. Siga as normas de uso dos aparelhos. O microscópio é um instrumento de trabalho
valioso e deve ser manipulado cuidadosamente.
11. Avise ao professor, imediatamente, caso ocorra qualquer tipo de contaminação ou
outro tipo de acidente.
12. Lembre-se que você é responsável pelo material que receber.
2
ATIVIDADE 1
TÉCNICA DA COLORAÇÃO DE GRAM
INTRODUÇÃO
A coloração de Gram é uma das principais técnicas utilizadas para a visualização microscópica da
forma e dos arranjos dos diferentes tipos de bactérias. Considerado um método diferencial,
permite classificar as bactérias em Gram positivas ou Gram negativas, de acordo com as
propriedades tintoriais da célula bacteriana.
OBJETIVOS
Aprender a realizar a coloração de Gram e compreender porque determinadas bactérias se
comportam como Gram positivas ou Gram negativas.
MATERIAL
• material retirado da boca
• iogurte
• fermento
Fleischmann
(fermento
biológico) ou fungo Saccharomyces
cerevisiae
• culturas bacterianas em caldo e em ágar
nutriente
• lâminas de vidro
• alça de inoculação
• cotonetes
• reagentes para a coloração de Gram
(violeta de genciana, lugol, álcool 95°,
fucsina ou safranina)
• recipiente para a coloração de Gram
PROCEDIMENTO
1 Preparo dos esfregaços
Para material em meio líquido (iogurte, fermento em água, cultura bacteriana em
caldo).
• Com auxílio da alça de inoculação previamente esterilizada, colocar 2 - 3 alíquotas da amostra
em uma lâmina de vidro.
• Espalhar bem sobre a superfície da lâmina, fazendo movimentos circulares. Deixar secar ao ar.
• Flambar a alça na chama do bico de gás antes de recolocá-la em seu lugar.
Para material em meio sólido (culturas bacterianas em placa)
• Com auxílio da alça de inoculação, previamente esterilizada, colocar uma gota de solução
salina na superfície de uma lâmina de vidro.
• Flambar a alça, deixar esfriar e coletar uma alíquota da cultura bacteriana.
• Misturar na gota de solução salina, fazendo uma suspensão homogênea. Deixar secar ao ar.
• Flambar a alça na chama do bico de gás antes de recolocá-la em seu lugar.
Para material retirado da boca
• Friccionar a superfície da mucosa oral com um cotonete estéril. Fazer um esfregaço com o
material coletado, na superfície de uma lâmina de vidro, com movimentos circulares. Deixar
secar ao ar.
2 Fixação dos Esfregaços
• Após a secagem, fixar os esfregaços, passando as lâminas cerca de 3 vezes sobre a chama do
bico de gás.
• Deixar esfriar e corar.
3 Coloração de Gram
3
• Colocar a lâmina no recipiente para a coloração de Gram.
• Cobrir o esfregaço com solução de violeta de genciana. Aguardar 1 minuto e desprezar o
corante no recipiente.
• Cobrir com lugol, aguardar 1 minuto, e desprezar o corante no recipiente.
• Inclinar a lâmina, gotejar álcool etílico a 95% até que não haja desprendimento de corante.
Lavar a lâmina rapidamente em água corrente.
• Cobrir com fucsina ou safranina. Aguardar 30 segundos e lavar a lâmina. Secar com papel
toalha sem esfregar a lâmina.
• Observar ao microscópio em menor aumento e, a seguir, colocar 1 gota de óleo mineral na
lâmina e focalizar com objetiva de imersão.
• Desenhar as bactérias observadas considerando o tipo de coloração (Gram + ou -), a forma e
o arranjo das células.
• Após o uso, a objetiva de imersão deve ser limpa com papel absorvente.
RESULTADOS
• Desenhe o que você observou
iogurte
cultura bacteriana em placa
fermento
cultura bacteriana em caldo
material retirado da boca
• Complete o quadro a seguir.
Material
iogurte
Morfologia
Arranjo
Gram
fermento
cultura em caldo
cultura em placa
material da boca
4
DISCUSSÃO
1. Complete o quadro a seguir, descrevendo o que ocorre na coloração de Gram.
Bacté ria
Solução
cristal violeta
Gram +
Gram -
lugol
álcool
fucsina
2. Como você explica o comportamento das bactérias G + e G - na coloração de Gram?
3. As bactérias do gênero Mycobacterium não se coram pelo método de Gram. Qual seria uma
explicação para esse fato?
4. Sabe-se que se ocorrer um aquecimento exagerado no momento da fixação do material, as
bactérias G+ passam a se comportar como G-. Qual seria uma explicação para esse fato?
5. Em geral, os corantes básicos como violeta de genciana, safranina e fucsina, não penetram em
células vivas. Qual a relação entre esta informação e as etapas que você seguiu para realizar a
coloração de Gram?
6. Sabe-se que quando em culturas velhas, bactérias G+ podem se comportar como G –. Você
acha que bactérias G – na mesma situação poderiam se comportar como G+? Justifique.
5
ATIVIDADE 2
COLORAÇÃO DE CÁPSULA
INTRODUÇÃO
Certas bactérias Gram + e Gram - produzem cápsula, camada viscosa, externa à parede
celular. Essa estrutura não constitui caráter morfológico permanente, aparecendo somente sob
certas condições de cultura. A cápsula constitui um dos antígenos de superfície das bactérias e é
geralmente formada por polissacarídeos e mais raramente por proteínas. A cápsula pode ser
visualizada por coloração negativa onde estruturas que não são coradas, são visualizadas contra
um fundo escuro.
OBJETIVOS
Aprender a realizar a coloração para cápsula e compreender o princípio dessa técnica.
MATERIAL
•
•
•
•
•
•
culturas recentes de bactérias
vermelho congo 25 mg/mL
ácido hidroclorídrico 0,15 mol/L-1
fucsina de Ziehl-Neelsen
lâminas de vidro
alça de inoculação
PROCEDIMENTO (Método de White modificado)
• Colocar 1 a 2 gotas de vermelho congo na extremidade de uma lâmina de vidro.
• Coletar uma alçada da cultura bacteriana e misturar no vermelho congo.
• Com auxílio de outra lâmina de vidro, espalhar a mistura por toda a lâmina, formando uma
película fina.
• Aquecer à chama fracamente para secar.
• Cobrir o material com ácido hidroclorídrico.
• Retirar o excesso do ácido, e aquecer rapidamente, passando a lâmina sobre a chama.
• Cobrir o material com fucsina de Ziehl-Neelsen por 10 a 15 segundos.
• Retirar o excesso de corante e secar delicadamente com papel toalha.
• Observar ao microscópio.
RESULTADO
Desenhe o observado e coloque legendas.
Cultura A
Cultura B
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DISCUSSÃO
1. Por que a técnica é denominada coloração negativa?
2. Qual a forma das bactérias em A? E em B?
3. Se eu fizer coloração para cápsula o que posso dizer sobre o Gram da bactéria?
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ATIVIDADE 3
COLORAÇÃO DE ESPOROS (COLORAÇÃO DE SCHAEFFER-FULTON)
INTRODUÇÃO
O esporo ou endósporo bacteriano é uma célula de parede espessa formada no interior de
algumas bactérias. É muito resistente ao calor, à dessecação e outros agentes químicos e físicos,
sendo capaz de permanecer em estado latente por longos períodos e, em seguida, germinar,
dando origem a uma nova célula vegetativa. O esporo é formado por vários envoltórios. O
primeiro, mais externo, fino, formado por proteínas, é denominado exospório. Abaixo do
exospório fica a capa do esporo, formada por várias camadas de proteínas ricas em ligações de
dissulfetos, resposáveis pela resistência do esporo a agentes químicos e físicos. Mais
internamente fica o córtex do esporo, formado por camadas de peptidioglicano. Abaixo do córtex
localiza-se o protoplasto ou núcleo do esporo formado pela parede celular, citoplasma, material
genético etc, provenientes da célula vegetativa.
Os esporos são difíceis de serem corados pois os corantes geralmente não atravessam a
parede do esporo a não ser que seja utilizado o calor, como na coloração de Schaeffer-Fulton.
OBJETIVOS
Aprender a realizar a coloração de esporos e compreender o princípio dessa técnica.
MATERIAL
•
•
•
•
•
•
cultura bacteriana em meio sólido
cultura de solo em meio líquido e sólido
verde malaquita
safranina
lâminas de vidro
alça de inoculação
PROCEDIMENTO (método de Wirtz-Conklin)
• Preparar esfregaços em lâmina das culturas bacterianas.
• Secar ao ar e fixar pelo calor.
• Corar a quente, com solução aquosa de verde malaquita, aquecendo até a emissão de
vapores, durante 6 minutos.
• Lavar suavemente em água corrente.
• Corar com safranina, por 30 segundos.
• Lavar suavemente em água corrente.
• Secar ao ar e observar ao microscópio.
RESULTADO
Desenhe o observado com legendas.
Cultura bacteriana em meio sólido
Cultura de solo
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DISCUSSÃO
1. Em qual cor é visto o esporo? E a célula vegetativa? Explique como isso ocorre.
2. Por que essa coloração é feita a quente?
3. A célula vegetativa retém o verde malaquita após a 1ª lavagem com água? E o esporo?
4. Qual a função da safranina?
5. Qual a razão de utilizarmos cultura de solo?
6. Qual a diferença básica entre uma célula vegetativa e um endósporo?
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ATIVIDADE 4
COLORAÇÃO DE BACTÉRIAS ÁLCOOL ÁCIDO RESISTENTES (MÉTODO DE ZIEHLNEELSEN)
INTRODUÇÃO
Esta coloração permite a visualização de um grupo restrito de bactérias que possuem uma
parede celular constituída de lipídeos complexos (ácidos graxos – ácidos micólicos - e ceras) em
grande concentração, provavelmente responsáveis pela propriedade de resistência ao álcool –
ácido. Quando os lipídeos são removidos pelo éter, perde-se esta propriedade. Assim, durante a
coloração, a fucsina se fixa firmemente a esses lipídeos, não sendo removida durante a lavagem
com álcool – ácido.
OBJETIVOS
Aprender a realizar a coloração de esporos e compreender o princípio dessa técnica
MATERIAL
•
•
•
•
•
•
•
•
BCG (bacilo de Calmette e Guerin) Mycobacterium bovis
material retirado da boca
fucsina de Ziehl-Neelsen
álcool-ácido clorídrico
azul de metileno
lâminas de vidro
alça de inoculação
cotonete estéril
PROCEDIMENTO
•
•
•
•
•
•
•
Preparar esfregaços dos materiais em lâmina de vidro, secar ao ar e fixar pelo calor.
Cobrir o esfregaço com fucsina de Ziehl-Neelsen e aquecer em chama até a emissão de
vapores. O aquecimento não deve ser muito drástico, a ponto de ferver o corante, mas
apenas até ligeira emissão de vapores. A partir disto, iniciar a contagem de cinco minutos.
Lavar a lâmina em água, suavemente.
Cobrir com álcool-ácido clorídrico, por um minuto.
Lavar a lâmina com água.
Cobrir o esfregaço com azul-de-metileno, durante um minuto.
Lavar a lâmina com água, secar e observar ao microscópio com a objetiva de imersão.
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RESULTADO
Desenhe o observado e coloque legendas.
BCG
Material retirado da boca
DISCUSSÃO
1. Complete os espaços no quadro a seguir.
Soluções em ordem de
aplicação
1 Fucsina de Ziehl
2 Álcool - ácido clorídrico
Reação e aspectos da bactéria
BAAR
BNAAR
Bactérias coradas em _______
Bactérias coradas em _______
A fucsina ______________
nos componentes da parede
celular e o álcoolácido____________________
A fucsina ______________
nos componentes da parede
celular e o álcoolácido____________________
A célula fica_______________
A célula fica_______________
3 Azul de metileno
A célula é visualizada
em__________porque______
A célula é visualizada
em_________porque______
2. As colorações podem ser classificadas em:
a) Simples, qundo ocorre a aplicação de um único corante que cora a célula inteira;
b) Diferencial, quando utiliza uma combinação de corantes, o que permite observar
diferenças químicas entre as bactérias;
c) Estrutural, quando cora apenas uma parte da célula, o que possibilita diferenciá-la das
demais.
Como você classificaria a coloração de Ziehl-Neelsen de acordo com as informações acima?
Justifique.
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ATIVIDADE 5
OBSERVAÇÃO DE ESPIROQUETAS
INTRODUÇÃO
As espiroquetas são bactérias espiraladas, delgadas e flexíveis. Amplamente distribuídas
na natureza, muitas são encontradas na cavidade oral humana e algumas podem causar doenças
como a sífilis, a leptospirose e a doença de Lyme. Esses microrganismos podem ser observados
ao microscópio em preparações a fresco ou pela técnica de Fontana-Tribondeaux, em que sais de
prata impregnam a superfície da bactéria tornando-a mais espessa. Espirilos e espiroquetas tem
pouca afinidade pelos corantes comumente empregados e coram-se fracamente. Quando
tratados com sais de prata, as espiroquetas podem ser visualizadas em marrom-escuro ou negro
contra um fundo castanho-amarelado.
MATERIAL
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
material retirado da boca
material retirado do aquário
cultura em ágar semi-sólido (Proteus sp.)
solução fixadora
álcool absoluto
mordente (solução de tanino)
solução de nitrato de prata amoniacal
água destilada
lâminas de vidro
cotonete estéril
alça de inoculação
PROCEDIMENTO
1. Coloração pela técnica de Fontana-Tribondeaux
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Fazer um esfregaço com material retirado da mucosa bucal em uma lâmina e secar ao ar
(não fixar pelo calor ).
Com auxílio da alça de inoculação, preparar um esfregaço da cultura bacteriana em meio
semi-sólido.
Cobrir o material com solução fixadora, durante 30 seguntos. Desprezar, cobrir novamente
com a solução fixadora, durante 30 segundos.
Cobrir o material com álcool absoluto, desprezar o excesso e deixar evaporar.
Cobrir o material com solução de tanino (mordente) e aquecer a lâmina até a emissão de
vapores, durante 30 segundos.
Lavar em água destilada.
Cobrir o material com solução de nitrato de prata amoniacal, durante 10 a 15 segundos. A
seguir, aquecer ligeiramente a lâmina, até o desprendimento de vapores, por 30 segundos (a
preparação deve adquire a cor marrom).
Lavar em água destilada.
Secar delicadamente com papel-filtro.
Observar com objetiva de imersão.
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2. Preparação a fresco
•
•
Colocar 1 a 2 gotas de água de aquário em uma lâmina e cubrir com lamínula.
Observar com objetiva de imersão.
RESULTADO
•
Desenhar o observado com legendas.
Material da boca
Material retirado de aquário
Cultura bacteriana em
meio semi-sólido
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DISCUSSÃO
1. Qual o princípio da coloração para espiroquetas?
2. Qual o objetivo da preparação à fresco de espirilos?
3. Após ter realizado as atividades de coloração das bactérias, monte uma tabela com os
seguintes dados:
- nome da coloração;
- microorganismo utilizado;
- corantes utilizados;
- tipo de coloração (considere as informações da atividade 4).
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ATIVIDADE 6
ESTUDO DOS MICRORGANISMOS
INTRODUÇÃO
Microrganismos podem ser encontrados no solo, água, no interior e nas superfícies dos seres
vivos. Nesta atividade, você deverá elaborar um procedimento que permita pesquisar
microrganismos presentes em diversos hábitats microbianos.
OBJETIVO
Possibilitar ao aluno a oprtunidade de elaborar um procedimento que permita estudar
microrganismos presentes em diversos materiais.
MATERIAL
4 placas com ágar nutriente
1 frasco com 100mL de solução salina
30g de terra de jardim
1 cotonete estéril
PROCEDIMENTO
(Considere o material disponível e o que foi abordado nas aulas anteriores para detalhar o
procedimento a ser seguido nessa aula)
RESULTADOS
Anote os resultados obtidos e explique-os.
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