Modelação Molecular Protocolo de TP Modelação comparativa da falcipaína‐2 Tarefas: 1. Obter a sequência de aminoácidos de uma proteína 2. Procurar moldes (templates) para realizar uma modelação comparativa 3. Submeter um pedido de modelação e examinar o resultado Tarefa 1: 1. Introduza a palavra‐chave falcipain‐2 no site http://www.ebi.uniprot.org/start/GettingStarted.shtml 2. Escolha a entrada Q9NBD4_PLAFA/ Q9NBD4 3. No fim da página E‐clique Pop‐up Fasta View 4. Copie o conteúdo da nova janela e guarde num ficheiro de texto com o nome fcpn2.txt Tarefa 2: 1. No programa SPDBV escolher Swiss Model > Load Raw Sequence. Carregar a sequência FASTA anteriormente guardada. A proteína aparecerá na janela principal como uma hélice muito comprida. 2. Em baixo aparece uma janela de alinhamento (senão ir a Window > Alignment) A seguir, temos que carregar um molde (template) sobre o qual construir o modelo. Pode ser obtido de muitas formas, mas vamos utilizar a ferramenta do SwissModel para seleccionar o molde nesta tarefa. 3. Para encontrar uma proteína molde apropriada da base de dados, escolher SwissModel>Find Appropriate ExPDB Templates. Abre‐se automaticamente uma página web “Find appropriate SWISS‐MODEL templates”. E‐clique “Submit”. Depois de alguns segundos abre‐se outra página web com os resultados da pesquisa (candidatos a moldes). É muito informativo examinar esses resultados (E‐clicar em Detail), especialmente os alinhamentos, que estão por debaixo das tabelas. 4. Escolher uma proteína que vai ser utilizada como molde da página de resultados, E‐clicar no seu nome na segunda coluna (“download the PDB”), guardar o ficheiro e lê‐lo posteriormente no SPDBV (não escolher nenhuma proteína com Blast‐score inferior a 1e‐44). 5. No menú, File > Open PDB file, seleccionar o ficheiro PDB que deseja utilizar como molde. 6. Para alinhar a sequência do alvo com o molde, escolher Fit>Fit Raw Sequence. Obtém‐se um alinhamento preliminar (provavelmente sem intervalos). Na janela de alinhamento aparecerão duas sequências. Provavelmente teremos que ajustar os alinhamentos manualmente, comparando com os alinhamentos obtidos no ponto 3. 7. Para ajustar os alinhamentos manualmente: use a barra de espaço para inserir intervalos, Backspace para eliminar, e as setas Esquerda/Direita para deslocar o intervalo (requer um pouco de prática mas é muito fácil). 8. [Opcional, energia de threading] À esquerda da janela de alinhamento existe um pequeno triângulo branco. Clicando invoca‐se o gráfico de energia de threading ao longo da cadeia peptídica, que basicamente mostra a energia do ambiente dos resíduos na estrutura construída: quanto menor melhor. Para ver estas energias ainda melhor, fazer SwissModel > Auto Color by Threading Energy que mostra as energias de threading e os resíduos correspondentes (azul escuro significa que a energia é baixa (o resíduo está contente esse ambiente), vermelho significa uma energia de threading alta (o resíduo não está contente no ambiente). Tarefa 3: 1. A seguir temos que submeter o modelo construído ao SwissModel. a) Estabelecer as preferências Preferences > Swiss‐Model: Your Name: (o vosso nome) Your E‐mail: (introduzir o vosso e‐mail, o modelo construído será enviado para essa conta de correio). b) Para submeter um pedido clicar SwissModel>Submit Modelling Request. Aparece uma janela que pede para guardar o modelo com um nome qualquer, por exemplo fcpn2.htm. Depois disto, abre‐se uma página intitulada “SWISS‐MODEL Optimize”. Examinar essa página. Copiar a linha vermelha para um campo por baixo dessa linha. Depois disso, clicar no botão “Send Request”. Esperar que chegue a resposta (provavelmente menos de meia hora). c) Ler o ficheiro PDB que foi enviado e examinar o alinhamento que foi produzido. As fitas vermelhas indicam zonas da proteína que foram totalmente reconstruídas, e a verde as regiões que são muito semelhantes ao molde e não foram muito alteradas. Se quisermos melhorar o modelo construído podemos ajustar as cadeias laterais e/ou intervalos ou reconstruir os laços e voltar a submeter o trabalho.