UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAI
VERA LUCIA LÂNGARO AMARAL
ESTUDO DE TOXICIDADE REPRODUTIVA E POTENCIAL
MUTAGÊNICO DE FITOTERÁPICO CONTENDO Cinchona calisaya,
Jateorhiza palmata, Centaurim erythraea, Baccharis trimera, Artemisia
absinthium, Matricaria recutita e Cinnamomum cassia.
Itajaí, 2011.
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAI
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS BIOATIVAS
VERA LUCIA LÂNGARO AMARAL
ESTUDO DE TOXICIDADE REPRODUTIVA E POTENCIAL
MUTAGÊNICO DE FITOTERÁPICO CONTENDO Cinchona calisaya,
Jateorhiza palmata, Centaurim erythraea, Baccharis trimera, Artemisia
absinthium, Matricaria recutita e Cinnamomum cassia.
Dissertação submetida à Universidade do Vale
do Itajaí como parte dos requisitos para
obtenção do grau de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade.
Co-orientador: Prof. Dr. Rilton Alves de Freitas.
Itajaí, julho de 2011
FICHA CATALOGRÁFICA
Amaral, Vera Lucia Lângaro, 1964A 13e
Estudo de toxicidade reprodutiva e potencial mutagênico
de fitoterápico contendo Cinchona calisaya, Jateorhiza palamta,
Centaurim erythraea, Baccharis trimera, Artemísia absinthium,
Matricaria recutita e Cinnamomum cassia
/ Vera Lucia Lângaro
Amaral, 2011.
76 f. ; il., tab. ; fig.
Cópia de computador (Printout(s)).
Dissertação (Mestrado) Universidade do Vale do Itajaí,
Mestrado em Ciências Farmacêuticas.
“Orientador : Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade”
Bibliografia : p.62-76
Josete
de Almeida
Burg de
– CRB
14.ª 293
1. Fitoterapia.
2. Testes
mutagenicidade.
3. Pesquisa
de mutagenos. 4. Camundongo. 5. Química farmacêutica. I. Título.
CDU: 615.1
Dedicatória
Este trabalho é dedicado aos animais
que de forma involuntária proporcionaram os
resultados deste estudo.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pela vida e pelas oportunidades de aprender e crescer;
Aos meus pais que me ensinaram os valores pessoais e sempre me incentivaram e
apoiaram na busca das minhas realizações;
À minha família, Silas, Victor e Nicole, pelo amor, apoio e compreensão pela minha
ausência em muitos momentos importantes;
Ao amigo Marcel, parceiro de caminhada, por me apresentar esta área apaixonante
que é a reprodução e pela tranquilidade e força que sempre me transmite.
À Martina, minha amiga, irmã e parceira de todos os momentos, pelo apoio, auxílio e
alegria que me faz sentir melhor.
À amiga Dirce, pela ajuda e amizade que sempre estiveram presente.
À Samara e Aninha, pela dedicação e auxilio na minha ausência durante algumas
etapas importantes deste estudo.
Ao Professor Sérgio Faloni, pela sua orientação e confiança depositada no meu
trabalho.
Ao Professor Rilton Alves pelo exemplo de profissionalismo e de dedicação ao
estudo, que me inspirará sempre.
A todos que de alguma forma contribuíram para execução deste trabalho e aos que
simplesmente
estiveram
ao
meu
lado
no
decorrer
do
companheirismo e amizade que tornam a vida mais leve e alegre.
mestrado,
pelo
ESTUDO DE TOXICIDADE REPRODUTIVA E POTENCIAL
MUTAGÊNICO DE FITOTERÁPICO CONTENDO Cinchona calisaya;
Jateorhiza palmata; Centaurim erythraea; Baccharis trimera; Artemisia
absinthium; Matricaria recutita e Cinnamomum cassia.
Vera Lucia Lângaro Amaral
Junho/2011
Orientador: Dr.Sérgio Faloni de Andrade
Área de Concentração: Produtos naturais e substâncias sintéticas bioativas
Número de páginas: 76
O uso de plantas medicinais é amplamente difundido e a maior parte dos
fitoterápicos comercializados é de venda sem prescrição médica. Um dos principais
problemas da utilização destes produtos é a crença de que produtos de origem
vegetal são isentos efeitos tóxicos. As gestantes constituem um grupo populacional
que culturalmente recorre ao uso de fitoterápicos, por acreditarem que não causam
danos ao feto. O fitoterápico (Água Inglesa ®) composto pela associação de
Cinchona calisaya (quinina), Jateorhiza palmata (calumba), Centaurim erythraea (felda terra), Baccharis trimera (carqueja), Artemisia absinthium (losna), Matricaria
recutita (camomila) e Cinnamomum cassia (canela da china), é comercializado com
a indicação de tônico e aperiente. Porém, tem sido amplamente utilizado de forma
empírica para tratar a infertilidade. Este estudo foi o primeiro a investigar este
composto e seus efeitos sobre a reprodução em fêmeas de camundongos BALB/c .
Também foi verificado seu potencial mutagênico através do ensaio do micronúcleo
em eritrócitos da medula dos camundongos. O fitoterápico foi administrado
diariamente por 42 dias, em três doses diferentes, abrangendo o período préacasalamento, acasalamento, período de embriogênese e implantação. Foram
avaliados os sinais clínicos de toxicidade, variação na massa corporal e peso do
fígado, além das variáveis que podem indicar toxicidade reprodutiva: cópula,
prenhez, perdas pré e pós-implantação, índice placentário (peso da placenta/peso
do feto) e malformações maiores nos conceptos. Os resultados, interpretados em
conjunto, mostraram que a formulação fitoterápica investigada, não causou
toxicidade sistêmica e reprodutiva quando administrado por via oral em dose
proporcional preconizada para humanos, durante 42 dias em fêmeas e fetos de
camundongos. O grupo que recebeu três vezes a dose indicada para humanos
apresentou um maior (p=0, 001) índice placentário em relação aos demais grupos,
indicando efeito tóxico materno que de forma indireta afetou negativamente o peso
dos fetos. Não houve efeito mutagênico ou citotóxico na dose de 2000 mg/kg nas
condições experimentais executadas. Desta maneira, a Água inglesa® pode ser
considerada relativamente inócua, desde que seja administrada na dose indicada.
Palavras-chave:
FITOTERÁPICO.
MUTAGENICIDADE. CAMUNDONGOS.
TOXICIDADE
REPRODUTIVA.
STUDY OF THE REPRODUCTIVE TOXICITY AND MUTAGENIC
POTENTIAL OF A HERBAL MEDICINE CONTAINING Cinchona
calisaya; Jateorhiza palmata, Centaurim erythraea, Baccharis trimera,
Artemisia absinthium, Matricaria recutita and Cinnamomum cassia.
Vera Lucia Lângaro Amaral
June/2011
Supervisor: Dr.Sérgio Faloni de Andrade
Area of Concentration: Natural products and bioactive synthetic substances
Number of pages: 76
The use of medicinal plants is widespread, and most herbal medicines are marketed
for sale without prescription. One of the main problems in the use of these products
is the belief that plant products are free of toxic effects. Pregnant women constitute a
group that traditionally uses herbal medicines, believing that they cause no damage
to the fetus. The herbal compound (Água Inglesa ®), which is composed of an
association of Cinchona calisaya (quinina); Jateorhiza palmata (calumba); Centaurim
erythraea (fel-da terra); Baccharis trimera (carqueja); Artemisia absinthium (losna);
Matricaria recutita (camomila) and Cinnamomum cassia (canela da china), is
marketed for its tonic and laxative effects. However, its empirical use is widespread
as a treatment for infertility. This study is the first to investigate this compound and its
effects on reproduction in female BALB/c mice. The compound was administered
daily for 42 days at three different doses, covering the periods of pre-mating, mating
and embryogenesis development. We evaluated the clinical signs of toxicity, variation
in body mass and liver weight, as well as the variables that may indicate reproductive
toxicity in mating, pregnancy, pre- and post-implantation loss, placental index (weight
of placenta/fetal weight), major malformations, and mutagenic potential of the
micronuclei in the bone marrow of mice. The results show that the herbal formulation
investigated did not cause systemic toxicity, and did not affect reproductive
performance when administered orally at a proportional dose to that used in humans,
for 42 days, in female mice. Also, no genotoxic effect was observed capable of
inducing mutations. The group that received three times the dose recommended for
humans showed a higher (p = 0,001) placental index than the other groups,
indicating a maternal toxic effect that had a negative indirect affect on the weight of
the fetus. At a dose of 2000mg/kg, under the experimental conditions, no mutagenic
or cytotoxic effect was observed. Thus, Água Inglesa® can be considered relatively
harmless, provided it is administered at the dose indicated.
Key words: HERBAL MEDICINE. TOXICITY. REPRODUCTIVE.
MUTAGENICITY. MICE.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Mecanismos de formação de micronúcleos. .............................................. 24
Figura 2: Citologia vaginal de fêmeas de camundongos. (A) células cornificadas, (B)
células nucleadas e (c) neutrófilos. .................................................................... 40
Figura 3: Período de tratamento. ............................................................................... 41
Figura 4: Eventos reprodutivos.................................................................................. 42
Figura 5: Células de medula de camundongos vistas sob microscopia (400x)
indicando a viabilidade celular determinada pela ausência de corante no interior
das células. ........................................................................................................ 44
Figura 6: Dados da variação de massa corporal (g), expresso em média dos grupos
durante as seis semanas de tratamento com as três doses do composto
fitoterápico e controles. ...................................................................................... 46
Figura 7: Média e erro padrão do peso do fígado das fêmeas prenhes (PR) e não
prenhes (NP) dos grupos tratados. .................................................................... 48
Figura 8: Tampão seminal depositado na vagina da fêmea de camundongo. .......... 49
Figura 9: Ovário de fêmea de camundongo com presença de corpos lúteos (n=5) no
15º dia de prenhez. ............................................................................................ 52
Figura 10: Reabsorções embrionárias (A) precoce (B) tardia. .................................. 53
Figura 11: Fetos de camundongo no 15º dia de prenhez e suas respectivas
placentas. ........................................................................................................... 55
Figura 12: Feto de camundongo no 15º dia de prenhez com ausência do membro
superior.......................................................................................................................58
Figura 13: Eritrócito policromático com micronúcleo (MN). ....................................... 58
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Dados de cópula e de prenhez das fêmeas dos grupos tratados e controle.
Os valores foram expressos em número absoluto (Nº de fêmeas e
prenhas) e percentual (Cópula e Prenhez). .............................................. 49
Tabela 2: Fetos vivos por grupo de fêmeas prenhes e media de fetos por fêmea.
Dados expressos em número absoluto (fêmeas prenhes e fetos vivos) e
média e erro padrão da média (fetos/fêmeas). ......................................... 51
Tabela 3: Índices materno-fetais observados nos grupos tratados e controle. Dados
expressos em média e erro padrão da média (corpos lúteos) e percentual
e erro padrão da média (implantação, perdas pré e pós-implantação e
viabilidade fetal)........................................................................................ 53
Tabela 4: Peso da placenta e respectivos fetos e o índice placentário dos grupos
tratados e controles. Dados expressos em média e erro padrão. ............ 55
Tabela 5: Análise de 2000 células de medula de machos e fêmeas tratados com o
composto fitoterápico e controles. Dados expressos em número (EPCMNs
por animal/sexo) e média e desvio padrão (EPCMNs e EPC/ENC). ........ 59
LISTA DE ABREVIATURAS
ANOVA
Análise de Variância
ANVISA
Agência Nacional de Vigilância Sanitária
COFID
Coordenação de Fitoterápicos, Dinamizados e Notificados
EMS
Etil metanossulfonato
EPA
Environmental Protection Agency, U.S. (Agência de Proteção Ambiental
dos Estados Unidos)
EPCMN
Eritrócito Policromático Micronucleado
GGMED
Gerência Geral de Medicamentos
GTFAR
Gerência de Tecnologia Farmacêutica
MN
Micronúcleo
NCE
Eritrócito normocromático
PCE
Eritrócito policromático
ROS
Espécies reativas de oxigênio
SFB
Soro Fetal Bovino
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO ............................................................................................... 12
2
OBJETIVOS ................................................................................................... 15
2.1
Objetivo geral ................................................................................................ 15
2.2
Objetivos específicos ................................................................................... 15
3
REVISÃO DA LITERATURA.......................................................................... 16
3.1
Plantas medicinais e a fitoterapia ............................................................... 16
3.2
Toxicologia sistêmica e reprodutiva ........................................................... 20
3.3
Teste do Micronúcleo ................................................................................... 22
3.4
Composto fitoterápico utilizado no estudo (Água Inglesa®) .................... 26
3.4.1 Cinchona calisaya ........................................................................................... 27
3.4.2 Artemisia absinthium....................................................................................... 29
3.4.3 Matricaria recutita L. ....................................................................................... 30
3.4.4 Baccharis trimera ............................................................................................ 31
3.4.5 Cinnamomum cassia ...................................................................................... 33
3.4.6 Jateorhiza palmata.......................................................................................... 34
3.4.7 Centaurim erythraea ....................................................................................... 35
4
METODOLOGIA ............................................................................................. 37
4.1
Animais .......................................................................................................... 37
4.2
Administração dos tratamentos .................................................................. 37
4.3
Citologia Vaginal ........................................................................................... 39
4.4
Delineamento experimental e Manejo reprodutivo .................................... 40
4.5
Avaliação dos parâmetros reprodutivos .................................................... 41
4.5.1 Taxa de cópula ............................................................................................... 42
4.5.2 Taxa de Prenhez ............................................................................................ 42
4.5.3 Taxa de Viabilidade fetal................................................................................. 42
4.5.4 Taxa implantação ........................................................................................... 42
4.5.5 Perdas pré-implante........................................................................................ 43
4.5.6 Perdas pós-implante ....................................................................................... 43
4.5.7 Índice placentário ............................................................................................ 43
4.6
Teste de micronúcleo em eritrócitos de medula de camundongo ........... 43
4.7
Análise estatística......................................................................................... 45
5
RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................... 46
5.1
Toxicidade e massa corporal ....................................................................... 46
5.2
Peso do fígado .............................................................................................. 47
5.3
Índices de fertilidade .................................................................................... 48
5.4
Índices materno-fetais .................................................................................. 50
5.5
Malformações fetais ..................................................................................... 57
5.6
Teste de mutagenicidade ............................................................................ 58
6
CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................... 61
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 62
12
1
INTRODUÇÃO
Observou-se nas últimas décadas a revalorização do emprego de
preparações fitoterápicas como terapia altrernativa (ASCHWANDEN, 2001).
Terapias alternativas são métodos que visam à assistência à saúde, seja na
prevenção, tratamento ou cura do indivíduo. Seu objetivo é diferente daqueles da
assistência alopática, na qual a cura deve ocorrer através da intervenção direta no
órgão ou parte doente. Há crescente interesse mundial pela utilização dessas
práticas alternativas dentre as quais se inclui a fitoterapia, e tal interesse é devido a
vários fatores, tais como: elevado custo da assistência médica privada, elevado
custo dos medicamentos alopáticos e precariedade da assistência prestada pelos
serviços públicos de saúde (KLEIN et al., 2009).
No Brasil, o uso de plantas medicinais é amplamente difundido e a maior
parte dos fitoterápicos comercializados são vendidos sem a prescrição médica. A
população que utiliza estes recursos raramente informa o uso aos profissionais da
saúde. Um dos principais problemas da utilização destes produtos é a crença de que
produtos de origem vegetal são isentos de reações adversas e efeitos tóxicos
(RATES, 2001).
A ocorrência de efeitos indesejáveis decorrentes do uso de plantas
medicinais muitas vezes é menor quando comparada a fármacos sintéticos.
Entretanto experimentos clínicos têm revelado que efeitos adversos também
ocorrem com a utilização de plantas medicinais, e são necessários estudos
toxicológicos bem controlados para provar a sua segurança (CALIXTO, 2000).
Produtos de origem vegetal possuem constituição química complexa, sendo
possível que alguns dos seus constituintes não tenham sido identificados ou que
ainda não se conheça suas ações sobre o organismo. Isso faz com que seja
necessário um maior cuidado na administração destes produtos. Deve-se levar em
conta, também, que as plantas medicinais e ou fitoterápicos podem interferir na
atividade de outros medicamentos sintéticos, eventualmente utilizados pela
população em geral (CLARKE; RATES; BRIDI, 2007).
O uso concomitante de fármacos e plantas medicinais e/ou medicamentos
fitoterápicos pode alterar os processos de absorção, distribuição, metabolismo e
13
excreção dos fármacos, resultando em ampliação ou redução dos efeitos esperados,
devido ao sinergismo ou antagonismo, respectivamente (FUGH-BERMAN, 2000).
Gestantes e lactantes constituem um grupo populacional que culturalmente
recorre ao uso de plantas medicinais, por acreditarem que não causam danos ao
feto ou ao bebê (WEIER; BEAL, 2004). Pouca informação se tem sobre os possíveis
efeitos tóxicos sobre a fertilidade e reprodução. Ainda são escassos os estudos
clínicos controlados que forneçam subsídios para a prescrição e utilização segura de
fitoterápicos durante o período gestacional. Isto gera a necessidade de bases
normativas e estudos bem desenhados, para oferecer mais garantias aos
profissionais na orientação da gestante e nutriz (SILVA; LIMA, 2009).
No Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) tem como
papel proteger e promover a saúde da população, e como uma de suas ações o
registro de medicamentos. A regulamentação em vigor para o registro de
medicamentos fitoterápicos é a Resolução de Diretoria Colegiada (RDC) 48/2004
(BRASIL, 2004a).
Quanto a determinação da segurança do uso é necessária a realização de
estudos pré-clínicos de toxicidade que atendam às exigências estipuladas pelo
Conselho Nacional de Saúde – CNS (BRASIL, 2004b).
Entretanto, os testes de toxicidade reprodutiva não são obrigatórios, já os
estudos de mutagenicidade, verificado pelo ensaio do micronúcleo em eritrócitos da
medula de roedores, são indicados aos medicamentos fitoterápicos de uso
prolongado.
Dentre os testes de avaliação de genotoxicidade preconizados pelas
agências internacionais e instituições governamentais, o teste de micronúcleo em
medula óssea de roedores in vivo é amplamente aceito e recomendado para a
avaliação e o registro de novos produtos químicos e farmacêuticos que são inseridos
anualmente no mercado mundial (RIBEIRO; SALVADORI; MARQUES, 2003).
No mercado nacional é comercializado um fitoterápico (Água Inglesa®),
composto de sete tinturas, obtidas das seguintes plantas: Cinchona calisaya;
Jateorhiza palmata; Centaurim erythraea; Baccharis trimera; Artemisia absinthium;
Matricaria recutita e Cinnamomum cassia, que é indicado como tônico e estimulante
do apetite. Este composto também tem sido usado popularmente por mulheres para
tratar infertilidade. Porém, nenhum estudo científico foi encontrado na literatura
comprovando os efeitos indicados na bula, e muito menos os efeitos sobre a
14
reprodução. Existem algumas publicações isoladas do uso dos extratos que
constituem esse fitoterápico, mas não em associação, como neste produto
comercializado.
Tendo em vista o desconhecimento dos possíveis efeitos sobre os
parâmetros reprodutivos deste fitoterápico, justifica-se a execução de ensaios
biológicos e análises toxicológicas capazes de determinar os efeitos destes agentes
e suas conseqüências sobre a população. Neste estudo propôs-se a avaliação dos
efeitos desta associação fitoterápica sobre os parâmetros reprodutivos e seu
potencial mutagênico em camundongos.
De acordo com Ko e Luca (2009), o camundongo compreende 67% de todos
os animais utilizados na pesquisa biomédica. É um animal dócil, de fácil manuseio,
curto ciclo de vida, alta fecundidade, curta gestação, tamanho pequeno e baixo
custo. Essas características fazem que sejam modelos animais úteis para estudos
de genética e teratologia, além de outros, como a toxicologia.
15
2
2.1
OBJETIVOS
Objetivo geral
Avaliar os efeitos da utilização da associação fitoterápica (Água Inglesa ®),
nos parâmetros reprodutivos e potencial mutagênico em fêmeas de camundongos
BALB/c.
2.2
Objetivos específicos
Observar sinais de toxicidade sistêmica durante o tratamento;
Registrar a massa corporal das fêmeas durante o tratamento;
Analisar a taxa de cópula das fêmeas acasaladas durante o tratamento com o
composto fitoterápico;
Analisar a taxa de prenhez das fêmeas acasaladas durante o tratamento com o
composto fitoterápico;
Verificar os corpos lúteos no 15° dia de prenhez;
Verificar os sítios de implantação no 15° dia de prenhez;
Registrar os fetos vivos no 15° dia de prenhez;
Calcular o índice placentário através do peso das placentas e fetos;
Registrar o peso do fígado das fêmeas no15° dia de prenhez;
Avaliar o potencial mutagênico pelo ensaio de micronúcleo;
Registrar mortalidade das fêmeas durante o tratamento com o composto
fitoterápico.
16
3
3.1
REVISÃO DA LITERATURA
Plantas medicinais e a fitoterapia
As plantas têm sido há séculos, um recurso ao alcance do ser humano.
Durante milênios o homem empiricamente aprofundou seus conhecimentos com o
objetivo de buscar a melhoria nas condições de alimentação e cura de suas
enfermidades, demonstrando uma estreita inter-relação entre o uso das plantas e
sua evolução (MACIEL; PINTO; VEIGA, 2002; TAUFNER; FERRACO; RIBEIRO,
2006).
A
Agência
Nacional
de
Vigilância
Sanitária
(ANVISA)
considera
medicamentos fitoterápicos os obtidos com emprego exclusivo de matérias-primas
ativas vegetais, cuja eficácia e segurança são validadas por meio de levantamentos
etnofarmacológicos, de utilização, documentações tecnocientíficas ou evidências
clínicas (BRASIL, 2004a).
O conhecimento popular sobre o uso e a eficácia de plantas medicinais
contribui de forma relevante para a divulgação das propriedades terapêuticas dos
vegetais, prescritos ou utilizados com frequência, pelos efeitos medicinais que
produzem, apesar de não terem seus constituintes químicos conhecidos. De
maneira indireta, este tipo de cultura medicinal desperta o interesse de
pesquisadores em estudos envolvendo áreas multidisciplinares, como por exemplo,
botânica, farmacologia e fitoquímica, que juntas enriquecem os conhecimentos
sobre a inesgotável fonte medicinal natural: a flora mundial (MACIEL; PINTO;
VEIGA, 2002; TUROLLA; NASCIMENTO, 2006).
Nos últimos anos, a enorme contribuição das universidades brasileiras,
especialmente o grupo de pesquisadores dedicados à pesquisa e desenvolvimento
de fitoterápicos, e a interação com a indústria farmacêutica nacional, constituíram
um verdadeiro marco na história da fitomedicina do Brasil (BRANDÃO, 2009).
A tendência observada é de participação da fitoterapia cada vez mais
intensa na assistência à saúde da população. Desta forma, não se pode prescindir
da avaliação dos efeitos terapêuticos de cada fitomedicamento, com base em
17
estudos clínicos, conduzidos dentro de padrões éticos e científicos (KLEIN et al.,
2009).
A etnobotânica é citada na literatura como um dos caminhos alternativos que
mais evoluiu para a descoberta de produtos naturais bioativos. As pesquisas com
plantas medicinais envolvem investigações da medicina tradicional e popular
(etnobotânica); isolamento, purificação e caracterização de princípios ativos (química
orgânica, fitoquímica); investigação farmacológica de extratos e dos constituintes
químicos isolados (farmacologia); transformações químicas de princípios ativos
(química
orgânica
sintética);
estudo
da relação
estrutura/atividade
e
dos
mecanismos de ação dos princípios ativos (química medicinal e farmacologia) e
finalmente a operação de formulações para a produção de fitoterápicos. A
integração destas áreas na pesquisa de plantas medicinais conduz a um caminho
promissor e eficaz para descobertas de novos medicamentos (MACIEL; PINTO;
VEIGA, 2002).
É sabido que as plantas contêm uma grande diversidade de metabólitos
secundários e essa diversidade pressupõe uma elevada probabilidade de
interações. Na fitoterapia, existem vantagens significativas das associações, como o
aumento da eficiência, redução d e efeitos indesejáveis, aumento na estabilidade ou
a biodisponibilidade de agentes livres, e a obtenção de uma terapêutica adequada
com efeito com doses relativamente pequenas, quando comparado a um
medicamento sintético (BIAVATTI, 2009).
No Brasil, as plantas medicinais da flora nativa são consumidas com pouca
ou nenhuma comprovação de suas propriedades farmacológicas, propagadas por
usuários ou comerciantes. Muitas vezes essas plantas são, inclusive, empregadas
para fins medicinais diferentes daqueles utilizados pelos silvícolas (SILVA; LIMA,
2009).
A toxicidade de plantas medicinais e fitoterápicos pode parecer irrelevante
quando comparada com medicamento alopáticos. Isto, entretanto, não é verdade, os
efeitos adversos dos fitoterápicos, possíveis adulterações e toxidez, bem como a
ação sinérgica (interação com outras drogas) ocorrem comumente e este fato pode
ser considerado um problema sério de saúde pública (VEIGA JUNIOR; PINTO,
2005).
O aumento no consumo de fitoterápicos está associado ao fato de que as
populações questionam os perigos do uso dos medicamentos alopáticos associados
18
a seus custos muitas vezes dispendiosos e procuram substituí-los pelo uso de
plantas medicinais. A comprovação da ação terapêutica, associada à insatisfação da
população perante o sistema de saúde, tem favorecido essa dinâmica (TOMAZZONI;
NEGRELLE; CENTA, 2006).
Tanto a efetividade como a toxicidade e sua variabilidade é possível de ser
controlada pelos rígidos padrões de qualidade na produção de medicamentos
fitoterápicos, visando assegurar sua eficácia e segurança (YAMADA, 2009).
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) é o principal órgão
responsável no Brasil pela regulamentação de plantas medicinais e seus derivados,
e que tem como papel, proteger e promover a saúde da população garantindo a
segurança sanitária de produtos e serviços e participando da construção de seu
acesso. Uma das ações realizadas pela ANVISA para garantir a segurança da saúde
da população é o registro de medicamentos, etapa na qual os mesmos são
avaliados quanto a sua segurança, eficácia e qualidade antes de serem expostos a
venda para utilização pela população (CARVALHO et al., 2008).
A Coordenação de Fitoterápicos, Dinamizados e Notificados (COFID) é um
órgão da Anvisa que tem por atribuição emitir documentos circunstanciados e
conclusivos em relação ao registro e pós-registro de medicamentos fitoterápicos,
dinamizados (homeopáticos, antroposóficos e anti-homotóxicos) e notificação de
medicamentos conforme legislação vigente.
Como forma de aperfeiçoar o marco regulatório, a legislação sanitária
brasileira que dispõe sobre o registro de
medicamentos fitoterápicos foi
recentemente atualizada, sendo publicada na forma de Resolução de RDC nº.
14/2010,
permitindo
tecnológico,
e
o
acompanhamento
possibilitando
a
ampliação
do
do
desenvolvimento
acesso
da
científico
população
e
aos
medicamentos. Os ensaios pré-clínicos e clínicos de segurança e eficácia deverão
ser realizados quando não existirem estudos que comprovem a segurança préclínica, os mesmos deverão ser realizados seguindo, como parâmetro mínimo, o
"Guia para a realização de estudos de toxicidade pré-clínica de fitoterápico”
publicado pela ANVISA na RE nº. 90, de 16 de março de 2004, ou suas
atualizações.
Uma forma possível de registro é a apresentação de levantamento
bibliográfico etnofarmacológico, mostrando eficácia e segurança do produto que
tenha uso comprovado por um período igual ou superior a 20 anos. Nesse caso, é
19
necessário considerar o tempo de uso proposto para o medicamento, que deve ser
episódico ou curto, e uma busca detalhada por substâncias químicas potencialmente
tóxicas ao usuário. É necessário ainda apresentar comprovação de que o produto
não é potencialmente tóxico, sendo para isso solicitado um teste de toxicologia préclínica (BRASIL, 2010).
O uso de plantas medicinais e fitoterápicos durante a gravidez ou lactação
deve ser considerado, uma vez que podem causar: estímulo da contração uterina e
conseqüente aborto ou parto prematuro; ação hormonal que possibilite alterações no
desenvolvimento fetal ou do sexo da criança; ações genotóxicas, mutagênicas,
citotóxicas, fetotóxicas e teratogênicas (CAMPESATO, 2005).
Várias formulações fitoterápicas são compostas por extratos de mais de uma
planta, sendo para elas indispensáveis os estudos de eficácia e toxicidade. Nelas há
a explícita recomendação da não utilização durante a gestação, alegando ausência
de testes específicos (MELLO; LANGELOH; MELLO, 2007). Não há, até a presente
data, nenhum fitoterápico, aprovado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA), para utilização no ciclo gravídico-puerperal (SILVA; LIMA, 2009).
Entre as plantas medicinais de uso sistêmico que podem causar riscos para
mulheres grávidas, por estimular a motilidade uterina e provocar aborto, encontramse o alho (Allium sativum), babosa (Aloe ferox), angélica (Angelica archangelica),
arnica (Arnica montana), cânfora (Cinnamomum canphora), confrei (Symphitum
officinalis), eucalipto (Eucaliptus globulus), alecrim (Rosmarinus officinalis), gengibre
(Zengiber officinalis) e sene (Cassia angustifolia e Cassia acutifolia), entre outras
(VEIGA JUNIOR; PINTO, 2005).
Segundo Clarke, Rates e Bridi, (2007), o Rio de Janeiro é o único Estado
brasileiro que possui uma legislação sobre a utilização de plantas medicinais por
mulheres grávidas. A Resolução da Secretaria de Estado de Saúde/RJ nº. 1757,
leva em conta o potencial tóxico, teratogênico e abortivo de diversas espécies
vegetais medicinais e visa a esclarecer a população em geral e aos profissionais de
saúde sobre o risco do uso indiscriminado de espécies medicinais. Ainda,
contraindica o uso interno de drogas vegetais medicinais durante o primeiro trimestre
de gestação e lactação, cujos efeitos toxicológicos não tenham sido investigados,
bem como de produtos que tenham efeitos tóxicos comprovados.
O princípio básico da prescrição para gestantes e lactantes baseia-se,
sobretudo, no risco versus benefício. Porém, existem poucos trabalhos científicos
20
sobre o consumo de fitoterápicos durante a gravidez e seus efeitos tóxicos (SILVA;
LIMA, 2009).
Os clínicos dependem, na maior parte, de estudos realizados em animais e
de estudos epidemiológicos (que podem estar repletos de fatores geradores de
variáveis) para estabelecer o potencial tóxico e teratogênico de um fármaco (GOLAN
et al., 2009).
3.2
Toxicologia reprodutiva
A toxicologia é o estudo dos mecanismos de toxicidade e a sua subsequente
aplicação na previsão dos efeitos adversos resultantes da exposição de um
organismo a agentes químicos físicos ou biológicos (OGA, 2003; REIS, 2007).
Segundo Barros e Davino (2003), a toxicologia reprodutiva juntamente com a
teratologia, fazem parte da toxicologia do desenvolvimento que estuda efeitos
adversos que ocorrem nos organismos em desenvolvimento, decorrentes da
exposição a substancias nocivas antes da concepção, durante o período perinatal ou
pós-natal.
A toxicologia reprodutiva engloba a biologia reprodutiva e a toxicologia,
sendo necessário considerar tanto o mecanismo, bem como, o local de ação das
substâncias. Os processos reprodutivos agrupados na fase que antecede a
fertilização são bastante amplos e incluem o desenvolvimento do sistema
reprodutivo, maturação sexual, liberação de gametas e transporte, bem como efeitos
hormonais sobre os órgãos reprodutivos. A manifestação de toxicidade podem incluir
ainda,efeitos sobre a fertilidade, gestação, parto, lactação e modificações em outras
funções que são dependente da integridade do sistema reprodutor (MATTISON;
NIGHTINGALE; SHIROMIZU, 1983; OGA, 2003).
A unidade básica da reprodução é composta pela fêmea , macho e a prole.
A manutenção da homeostase de uma espécie requer um bom desenvolvimento na
função reprodutiva destes três componentes. Ao avaliar os efeitos reprodutivos, é
importante considerar a presença, e sempre que possível, de outras manifestações
da toxicidade como a mutagenicidade ou carcinogenicidade, bem como outras
formas de toxicidade sistêmica geral (HOYER, 2010).
21
O efeito tóxico de uma substância pode ocorrer durante todo o ciclo
reprodutivo de um mamífero, dependendo da fase em que ocorre essa exposição, as
conseqüências serão diversas . O corpo dos mamíferos é regulado por dois grandes
sistemas de controle: o sistema nervoso e endócrino. Cada órgão que compõe o
sistema endócrino secreta um tipo de hormônio que tem efeito regulador em outros
órgãos (LEMONICA, 2003).
Tanto em humanos como em animais, a sinalização endócrina está
envolvida na reprodução, desenvolvimento embrionário, crescimento, maturação,
produção de energia, uso e estoque de energia e balanço eletrolítico. Qualquer
desequilíbrio nesse balanço pode causar prejuízo fisiológico no organismo,
principalmente durante os estágios iniciais do desenvolvimento. Numerosos
compostos naturais e sintéticos podem interferir no eixo reprodutivo de mamíferos
(CASERTA et al., 2008; BIANCO et al., 2010).
Devido à complexidade do sistema reprodutivo feminino, o campo da
toxicologia reprodutiva feminina tem evoluído de forma relativamente lenta. Em
estudos epidemiológicos, avaliação de riscos humanos é fundamentada em
observações de grupos ou populações. Em contraste, uma abordagem toxicológica
utilizando estudos em animais e in vitro podem fornecer dados específicos de
toxicidade reprodutiva. Os estudos geralmente são conduzidos em animais de
laboratório (principalmente roedores), pois podem ser controlados e isto em
humanos é praticamente impossível e eticamente questionável (EPA, 1996;
FOSTER, 1999).
De uma forma geral, admite-se que o homem seja mais sensível aos
agentes químicos que os animais de laboratório, o que faz com que, para a
comercialização de uma nova droga, sejam aplicados índices de segurança para a
determinação das doses seguras, para a utilização humana, de uma molécula
testada em animais (HORTA, 2002; LEMONICA, 2003).
Uma riqueza de informações continua a ser recolhida sobre a base genética
do camundongo, e estas informações são de relevância clinica nas extrapolações
entre as duas espécies (GEORGIADES; FERGUSON-SMITH; BURTON, 2002).
Na área da reprodução, por exemplo, o camundongo tem sido utilizado
constantemente para estudos de toxicidade e um agente que produz efeito
reprodutivo adverso pode representar uma ameaça em potencial para os humanos.
22
Algumas suposições padrão na avaliação de toxicidade reprodutiva
determinam o risco para humanos (EPA,1996):
1. Um agente que produz um efeito adverso na reprodução de animais de
experimentação representa uma ameaça potencial para os humanos.
2. Efeitos de substâncias nos processos reprodutivos masculinos e
femininos são assumidos serem semelhantes, a menos que demonstrado o
contrário.
3. Na ausência de informações para determinar as espécies experimentais
mais adequadas, os dados das espécies mais sensíveis devem ser usados.
4. Na ausência de informações em contrário, um agente que afeta a função
reprodutiva em um sexo é assumido como afetar adversamente a função reprodutiva
no outro sexo.
5. A curva dose-resposta não linear é assumida por toxicidade reprodutiva.
3.3
Teste do Micronúcleo
Estudos de genotoxicidade e anti-genotoxicidade podem ajudar a avaliar a
segurança e a eficácia de plantas medicinais.
O estudo de danos ao DNA induzido por substâncias de origem natural ou
sintética é uma área essencial da toxicologia genética, uma vez que a mutação em
cromossomos é um evento importante para a
carcinogênese (FENECH, 2005;
KLEIN et al., 2006).
A toxicologia genética tem por objetivo detectar e entender a ação de
determinadas substâncias denominadas genotóxicas sobre o organismo, com
especificidade para ácidos nucléicos, especialmente DNA. Toda e qualquer
alteração no DNA ou RNA, que pode afetar o gene, é considerada uma mutação e
pode ser transmitida aos descendentes, se forem atingidas células germinativas,
gerando indivíduos com uma ou mais características genéticas diferentes
(FONSECA; PEREIRA, 2004).
As mutações gênicas são definidas como mudanças que ocorrem em um
determinado gene, enquanto as mutações cromossômicas são mudanças em uma
23
região cromossômica que envolve vários genes, ocasionando mudança na estrutura
do cromossomo ou no seu número (GRIFFITHS et al., 2008).
Segundo Ferrari (1991), torna-se cada vez mais necessário a utilização de
métodos confiáveis capazes de detectar e medir o dano no DNA, bem como,
estabelecer possibilidades de proteção ou redução desses efeitos.
De acordo com Flores e Yamaguchi (2008), é de fundamental importância a
avaliação do potencial mutagênico de xenobióticos e para isso existem diversas
metodologias adequadamente padronizadas, utilizadas com o objetivo de classificar
as substâncias quanto ao seu grau de toxicidade. Dentre todas estas técnicas, o
teste do micronúcleo destaca-se por apresentar algumas vantagens em relação aos
demais. Sua simplicidade o torna bastante atrativo, uma vez que grande número de
células pode ser analisado.
O teste do micronúcleo foi proposto por Schimid e colaboradores em 1971,
tendo sido modificado alguns anos depois (SCHIMID, 1975). O ensaio foi
desenvolvido primeiramente em sistema-teste in vivo, em células de medula óssea
de camundongos, e posteriormente teve a versão in vitro introduzida por Heddle, em
1976 (VILLARINI et al., 1998). Atualmente é aplicado em vários tipos celulares,
sendo muito utilizado para a detecção de agentes clastogênicos, os que quebram os
cromossomos, e de agentes aneugênicos (fig.1), os que induzem aneuploidia ou
segregação cromossômica anormal (FLORES; YAMAGUCHI, 2008; TERRADAS et
al., 2010).
O teste de micronúcleo (MN) em células da medula óssea de camundongos
tem sido amplamente empregado e aceito pelas agências reguladoras e comunidade
científica (RIBEIRO; SALVADORI; MARQUES, 2003; FENECH, 2005; MATEUCA et
al., 2006).
Este teste detecta alterações genômicas ou/e dano ao aparato mitótico,
sendo os micronúcleos indicativos de perdas irreversíveis de DNA. Embora a
toxicidade genética não seja medida de carcinogenicidade, esta é freqüentemente
associada ao aparecimento do câncer, visto que, existe uma correlação positiva
entre o aumento da frequência de micronúcleos e o aparecimento de tumores em
roedores e no homem (AZEVEDO et al., 2003).
24
(A) O uso de agentes aneugênicos gera micronúcleos em consequência de perdas de cromossomos
inteiros. Esses cromossomos são deixados de fora do núcleo da célula, no final da mitose, assim, a
filha células iriam provavelmente levar micronúcleos com cromossomas inteiros. O DNA dos
micronúcleos poderia equilibrar o DNA nuclear e resultar em um genoma completo, ou estar
adicionais ao genoma da célula. Agentes (B) clastogênicos produzem micronúcleos, quebrando a
dupla hélice do DNA, formando fragmentos acêntricos. Esses fragmentos são incapazes de aderir às
fibras do fuso e se integrarem nos núcleos da filha, e são, portanto, deixados para trás durante a
mitose.
Figura 1: Mecanismos de formação de micronúcleos.
Fonte: Adaptado de Terradas et al. (2010).
A exposição crônica ou aguda a substâncias tóxicas que provocam lesão do
DNA pode sobrepujar o mecanismo de reparo, resultando em mutagênese,
carcinogênese ou morte celular (GOLAN et al., 2009).
De acordo com relatos de vários autores (KRISHNA; HAYASHI, 2000;
IARMARCOVAI et al., 2008; TERRADAS et al., 2010) por meio desta técnica é
possível
detectar
e identificar
efeitos genotóxicos através de
aberrações
cromossômicas em células de organismos expostos a substâncias com potencial de
mutagenicidade, inclusive radiações ionizantes, uma vez que os micronúcleos se
encontram significativamente aumentados, quando comparados com gruposcontrole. Assim, atuam como marcadores biológicos de danos genéticos e podem
ser utilizados como indicadores de mutagenicidade e como um instrumento de
monitoração, considerando-se que retornam aos níveis basais quando o organismo
permanece durante certo período sem contato com a substância indutora.
25
Os micronúcleos são corpos de cromatina presentes no citoplasma,
originários de fragmentos de cromossomos acêntricos ou de cromossomos inteiros
que não foram incorporados no núcleo de células filhas durante os últimos estágios
da mitose (WAHNSCHAFFE; BITSCH; KIELHORN, 2005). Estes possíveis danos
são analisados através de amostras de eritrócitos em células da medula óssea e/ou
em células do sangue periférico de animais, sendo os roedores os mais utilizados
(OECD, 1997).
Quando um eritroblasto da medula óssea se desenvolve em um eritrócito
policromático, o núcleo principal é excluído. Qualquer micronúcleo que foi formado
pode permanecer no lado anucleado do citoplasma e assim ser facilmente
detectado. O aumento na freqüência de micronúcleos de eritrócitos policromáticos
em animais tratados é indicativo da indução de danos cromossômicos (KRISHNA;
HAYASHI, 2000; WAHNSCHAFFE; BITSCH; KIELHORN, 2005; TERRADAS et al.,
2010).
De acordo com Mavournin et al. (1990), o tempo que deve transcorrer entre
a absorção pelo animal de um agente mutagênico, sua metabolização ,
complementação dos estágios finais do ciclo de divisão, eliminação do núcleo do
eritroblasto, e o aparecimento dos micronúcleos nos PCE da medula óssea, é no
mínimo de 6 h, incluindo os atrasos que podem ocorrer no ciclo de divisão.
Aproximadamente 12-24 h após a absorção, os PCE presentes na medula óssea
correspondem aos descendentes das células que foram expostas ao agente antes
da divisão celular.
Os micronúcleos são também indicadores de instabilidade cromossômica,
uma vez que a freqüência de micronúcleos é maior em células tumorais. Em alguns
sistemas celulares, micronúcleos são considerados como material genético que é
perdido, enquanto outros estudos sugerem que o DNA micronuclear está ativamente
transcrito e seus genes são totalmente expressos. Em geral, estes achados
reforçam as importantes conseqüências da formação de micronúcleos em termos de
instabilidade cromossômica em geral e perda de genes (IARMARCOVAI et al. 2008;
TERRADAS et al., 2010).
O uso do teste MN em estudos tem aumentado muito nos últimos 15 anos, e
recentes
esforços
da
comunidade
científica
internacional
têm
contribuído
sobremaneira para melhorar a fiabilidade deste teste, fornecendo orientações
26
técnicas e detecção das principais fontes de variabilidade (IARMARCOVAI et al.
2008).
O teste do MN além do baixo custo possui rapidez de análise para triagem de
grande número de substâncias. Ele também é capaz de considerar e avaliar as
diferentes fases da farmacocinética das drogas, analisar danos cromossômicos e
possui reprodutibilidade satisfatória, já que foi adaptado por vários autores ao estudo
em diferentes espécies (GARAJ-VRHOVAC; ZELJEZIC, 2002).
O teste de micronúcleo in vivo é então, especialmente relevante para indicar
dano mutagênico e permite considerar fatores metabólicos, farmacológicos e o
processo de reparo no DNA in vivo e também é útil para promover investigações
sobre efeitos mutagêncios detectados em testes genotoxicológicos in vitro
(KRISHNA; HAYASHI, 2000).
Os testes de genotoxicidade e mutagenicidade fazem parte da bateria de
estudos não clínicos de segurança durante o desenvolvimento de medicamentos
(BRASIL, 2010). Este estudo deve ser efetuado quando houver indicação de uso
contínuo ou prolongado do medicamento em humanos.
Os testes de genotoxicidade/mutagenicidade são, portanto, de particular
importância, pois são capazes de detectarem compostos que induzem danos
genéticos direta (metabolização) ou indiretamente (biotransformação) por diversos
mecanismos.
3.4
Composto fitoterápico utilizado no estudo (Água Inglesa®)
Encontra-se no mercado brasileiro um composto fitoterápico (Água
Inglesa®), indicado como aperiente e tônico, porém apesar de não existir indicação
na bula do produto, este é ampla e empiricamente utilizado pela população feminina
na busca de soluções para a infertilidade.
Numa rápida pesquisa num buscador da web, digitando o “nome comercial”
+ a palavra “gravidez”, é possível encontrar mais de 70 mil endereços de sites com
comentários, dúvidas e informações que associam essa formulação com a fertilidade
27
das mulheres. Muitos relatam sobre seu efeito de “limpar o útero” para engravidar e
sua utilização após abortos provocados ou retidos.
Nenhum artigo científico foi encontrado na literatura relacionado ao seu uso
para este fim, ou mesmo testes para comprovar este efeito ou outro qualquer. Num
contato, via e-mail, com o laboratório responsável por esta formulação, recebemos a
informação que os extratos isoladamente, já foram testados em animais,
comprovando as indicações da bula (aperiente e tônico). Porém, nenhum teste foi
realizado a fim de verificar os efeitos deste produto sobre a reprodução.
O fitoterápico é composto por esta associação:
Tintura extraída de Cinchona calisaya .................................. 0,0400 mL
Tintura extraída de Jateorhiza palmata ................................. 0,0150 mL
Tintura extraída de Centaurim erythraea .............................. 0,0150 mL
Tintura extraída de Baccharis trimera ................................... 0,0076 mL
Tintura extraída de Artemisia absinthium .............................. 0,0076 mL
Tintura extraída de Matricaria recutita................................... 0,0076 mL
Tintura extraída de Cinnamomum cassia .............................. 0,0036 mL
Excipiente: álcool (16%)
3.4.1 Cinchona calisaya
Popularmente, a Cinchona calisaya é denominada de quineira, quinaamarela, quina-verdadeira.
A árvore de Cinchona tem cerca de 20 m de altura, pertence à família das
Rubiáceas, que possui entre outros membros, o café e as gardênias. Os europeus
classificaram o gênero como Cinchona do qual as espécies mais importantes são:
Cinchona ledgeriana, C. officinalis, C. calisaya e C. pubescens (OLIVEIRA;
SZCZERBOWSKI, 2009).
A descoberta das propriedades curativas da quineira representou um dos
fatos mais importantes para as regiões tropicais no século XVII, tornando-se a planta
28
mais importante da época. Em 1820 foi isolado de sua casca o alcaloide (quinina) de
ação
eficaz
contra
malária,
passando
a
ser
extraído
industrialmente
e
comercializado (LORENZI; MATOS, 2002; BOTSARIS, 2007).
Após o isolamento do alcalóide quinina, seguiu-se uma intensa competição
para se identificar a espécie com o mais alto teor desse composto, o que causou a
extinção de populações de plantas de cinchonas selvagens no início do século XIX e
induziu o cultivo das espécies (POLLITO; TOMAZELLO FILHO, 2006; CUNICO et
al., 2008).
A descoberta da quineira ocasionou o contrabando de sementes, plantações
equivocadas e exploração predatória; a tentativa de obter sua síntese deu origem,
mesmo que por desconhecimento, ao desenvolvimento da indústria química
moderna e foi a base da indústria de corantes; sua síntese em 1944 foi feita (ainda
que parcialmente) sem equipamentos de ressonância magnética nuclear (RMN),
coluna flash ou cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) (OLIVEIRA;
SZCZERBOWSKI, 2009).
Os principais componentes das espécies do gênero Cinchona são os
alcalóides quinólicos (quinina, quinidina, dihidroquinidina, cinconidina, cinconina e
dehidrocinconina) e indólicos (dihidroquinamina e 3 epi-dihidroquinamina), com a
quinina
apresentando
a
mais
alta
atividade
antimalárica
(VERPOORTE;
SCHRIPSEMA; VAN-DER-LEER, 1988).
A quinina e a quinidina são utilizadas contra problemas de eretismo cardíaco
e anginas precordiais; o clohidrato de quinina para esclerose de origem hemorroidal;
o ascorbato de quinina, associado à vitamina B, para o tabagismo e para cãibra, é
analgésica e antipirética (REA, 1995). A quinina é usada como aditivo amargo nos
alimentos e bebidas e na indústria química nas catálises e imobilizações de matrizes
poliméricas (VERPOORTE; SCHRIPSEMA; VAN-DER-LEER, 1988). A quinidina
como
antifibrilante
é
adequada
ao
tratamento
preventivo
da
taquicardia
(BRUNETON, 2001).
A quinina não se acumula no organismo com a administração continuada,
porém atravessa a placenta, sendo encontrada em concentrações relativamente alta
no cordão umbilical. É também excretada no leite materno, atingindo concentrações
de aproximadamente 1/3 da concentração presente no plasma materno (TAVARES,
1996).
29
3.4.2
Artemisia absinthium
Popularmente, a espécie Artemisia absinthum é denominada de losna,
absinto, artemísia, erva-do-fel.
O gênero Artemisia compreende mais de 400 espécies, incluindo um número
enorme de espécies importantes pelas suas propriedades medicinais (WRIGHT,
2002). A Artemisia absinthum pertence a família Asteraceae, é detentora de
inúmeras espécies utilizadas na medicina popular. Conhecida popularmente por
possuir funções sobre o sistema digestivo sendo usada, inclusive, na fabricação da
bebida absinto (JOLY, 1998).
Análises do seu óleo essencial indicaram a presença de 60 a 90 compostos,
incluindo mono e sesquiterpenos, além de seus derivados oxigenados (LORENZI;
MATOS, 2002). Sua propriedade estimulante é dependente de substâncias amargas
como
lactonas
sesquiterpenicas
e
dímero
de
lactonas
sesquiterpênicas
(JUDPENTIENË; MOCKUTË, 2004).
Artemisia absinthium é uma erva aromática-amarga, usada tradicionalmente
no Irã. Esta espécie é conhecida por possuir propriedades relacionadas com a
atividade anti-helmíntica (TARIQ et al., 2009), antifúngicas e bacteriana, balsâmico,
depurativa, digestiva, diurética e no tratamento de leucemia e esclerose
(CANADANOVIC-BRUNET et al., 2004).
Em Cuba, a losna é utilizada no combate à giardíase e amebíase, enquanto
que os índios guaranis a utilizam no tratamento da malária e os marroquinos, na
aplicação em picadas de víboras e escorpiões. Em geral, a losna é usada como
aperiente, vermífuga, em transtornos digestivos pela hipoprodução de sucos
gástricos e no tratamento e anorexias, sendo também um abortivo perigoso
(ALONSO, 2004).
Em estudos prévios, foi verificado o potencial efeito abortivo do extrato
aquoso das partes aéreas quando administrado em ratas em doses a partir de 200
mg/kg (ALONSO, 2004). Além disso, a planta possui um potente agente neurotóxico,
cujo mecanismo de intoxicação já foi elucidado e seus principais metabólitos
identificados (HÖLD et al., 2000). Designado como α-tujona , esse componente é
responsável por vômitos, tremores e convulsões, sendo proibido o seu uso durante a
30
lactância, pois estudos já confirmaram que pode passar ao leite materno (ALONSO,
2004).
Devido à α-tujona, a ingestão de losna em altas concentrações pode
provocar crises epiléticas e até mesmo aborto (DUKE, 2002; SIMÕES et al., 2003).
Tal excesso de uso é conhecido por absintismo, e que, segundo Mengue, Mentz e
Schenkel (2001), foi associado a distúrbios visuais, alterações de personalidade e
convulsões, podendo causar danos irreversíveis ao sistema nervoso central, motivo
pelo qual, seu uso é proibido em alguns países.
O extrato metanólico das partes aéreas da A. Absinthium demonstrou
atividade antioxidante e antidepressiva em camundongos e apresentou alto teor de
compostos fenólicos e flavonóides (MAHMOUDI et al., 2009).
3.4.3 Matricaria recutita L.
Popularmente, a Matricaria recutita é denominda de camomila, maçanilha e
matricária
Matricaria recutita L. é da família Asteraceae, é uma das plantas mais
usadas e bem documentadas do mundo, originária da Europa e cultivada em
inúmeros países, inclusive na região centro-sul do Brasil é uma excelente auxiliar na
digestão, nas inflamações da boca, da pele, da faringe e do trato gastrintestinal
(LORENZI; MATOS, 2002).
A camomila é amplamente consumida como um chá ou tônico, seu uso é
interno ou externo e está indicada para tratamento de uma extensa lista de
condições fisiológicas. É usada externamente para feridas, úlceras, eczemas, gota,
irritação da pele, nevralgias, dores reumáticas e hemorróidas (NEWALL;
ANDERSON; PHILLIPSON, 1996) e internamente para tratar a ansiedade, histeria,
pesadelos, insônia e outros problemas do sono, convulsões e até mesmo delirium
tremens (MARTENS, 1995).
Grande parte de seus efeitos farmacológicos são devido à presença de
flavonóides e de óleo essencial, dando ênfase à atividade antiinflamatória e
31
antiespasmódica. Seu óleo é utilizado no tratamento de inflamações oculares e em
eczemas (ALONSO, 2004).
A Matricaria recutita é uma das poucas plantas medicinais cujos
constituintes
químicos
foram
exaustivamente
avaliados
farmacologicamente,
inclusive em testes clínicos. A atividade antinflamatória da droga deve-se à presença
de óleos essenciais, ricos em azuleno, matricina e alfa(-)-bisabolol, enquanto a
atividade espasmolítica é atribuída à presença de grande concentração de
flavonóides e outros constituintes fenólicos (CATTELAN et al., 2007).
Devido à presença de componentes bioativos (sesquiterpenos, flavonóides,
cumarinas e poliacetilenos) é uma planta de grande interesse por possuir diversas
propriedades farmacológicas (HOJATI et al., 2011).
Kupfersztain et al. (2003), analisaram a associação dos extratos de Angélica
sinensis e Matricaria recutita L. em 55 mulheres na pós-menopausa durante 12
semanas e relataram que houve um declínio de 90% em fogachos no grupo tratado
versus uma redução de 15% no grupo placebo.
Chandrashekhara et al. (2010), em recente estudo, sugerem que a
Matricaria recutita L. possui um potencial de neuroproteção contra a isquemia
cerebral induzida pelo estress oxidativo em ratos.
3.4.4
Baccharis trimera
Popularmente, a Baccharis trimera é denominada de carqueja ou carqueja
amargosa.
A Baccharis trimera é pertencente à família Asteraceae (Compositae), sendo
uma espécie vegetal herbácea ou arbustiva (JOLY, 1998), nativa dos campos e
beiras de matas do sul do Brasil, Bolívia, Paraguai, Uruguai e norte da Argentina, e
segundo Oliveira e Akissue (1993), está incluída na Farmacopéia Brasileira.
O gênero Baccharis é constituído por cerca de 500 espécies. Uma das mais
importantes é Baccharis trimera (Less.) DC, também denominada Baccharis
genistelloides var. trimera (Less.) Baker, com grande utilização na medicina
32
tradicional e na produção de fitoterápicos (RITTER et al., 2002; NUNES et al., 2003;
BORELLA et al., 2006).
Conforme o saber popular, seu chá é utilizado no tratamento de problemas
hepáticos, digestivos, malária, úlceras, diabetes, anemia, diarréia, inflamações
urinárias, amidalite, verminoses (VERDI; BRIGHENTE; PIZZOLATI, 2005), além do
uso como agente abortivo (ALONSO, 2004). Lorenzi e Matos (2002) registram seu
uso sobre o tratamento da esterilidade feminina e impotência masculina. Entretanto,
Franco (2001), havia relatado que a administração do extrato de carqueja em ratas
exerceu ação abortiva, sendo contra-indicada durante a gestação e a lactação.
Gené et al. (1996), ressaltam o uso da infusão da carqueja no combate a
inflamações, em especial do trato digestório, anemia, enfermidades renais,
pancreáticas e da bexiga, auxiliando, inclusive, em regimes de emagrecimento e no
tratamento do diabetes. A análise química desta espécie permitiu determinar a
presença de grande quantidade de terpenoides, seguido de flavonoides, ligninas,
carquejol e em menor quantidade, cumarinas.
Os efeitos analgésicos e
antinflamatórios observados devem-se, principalmente, a um complexo de
saponinas que tem como componente majoritário o ácido equinocístico.
Rodrigues et al. (2009), relatam a ação protetora contra as espécies reativas
de oxigênio (ROS) associada à ação antioxidante dos flavonóides. Pádua et al.
(2010), também observaram ação antioxidante em testes in vitro e in vivo do extrato
hidroetanólico da Baccharis trimera, que é capaz de reduzir a produção e liberação
de ROS em neutrófilos, as principais células recrutadas durante processos
inflamatórios, protegendo o organismo contra os radicais livres.
Souza e Rocha (2005), utilizaram meristemas radiculares de Allium cepa no
monitoramento do efeito do extrato aquoso de Baccharis trimera e observaram a
redução do ciclo mitótico, em concentrações elevadas, bem como o surgimento de
anormalidades cromossômicas. Fachinetto e Tedesco (2009), também verificaram
atividade antiproliferativa e mutagênica dos extratos aquosos de Baccharis trimera
sobre o sistema teste de Allium cepa.
33
3.4.5
Cinnamomum cassia
Popularmente, a Cinnamomum cassia é chamada de canela da China,
pertence à família Lauraceae, a canela tem como espécies mais conhecidas a
canela-do-Ceilão (Cinnamomum zeylanicum) e a canela da China (Cinnamomum
cassia), tendo como principais diferenças entre elas, as variadas concentrações de
constituintes químicos, como o eugenol e a ausência de súber na C. zeylanicum
(BENARROZ, 2007). Estas duas espécies encontram-se na Farmacopeia Brasileira,
são geralmente usadas na forma de chás, tanto das folhas quanto da casca, para o
tratamento de resfriados, porém, a infusão feita com a casca é considerada um
abortivo, o que restringe seu uso (MARQUES, 2001).
A Cinnamomum cassia é uma espécie de árvore perene, amplamente no
Sudeste da Ásia, a sua casca tem sido considerada como uma especiaria natural e
popular desde a antiguidade e têm sido utilizada tradicionalmente em tratamentos de
gastrite, distúrbios da circulação arterial, dispepsia e doenças inflamatórias (CHOI et
al., 2001; WANG et al., 2008).
Devido às suas propriedades organolépticas, a canela é muito difundida na
culinária ocidental, em perfumarias, nas indústrias de flavorizantes, de bebidas e de
alimentos. Na cultura popular, tem uma variedade de aplicações empíricas, que vai
desde o tratamento de transtornos digestivos, sendo tônico, carminativo e
antidiarreico, ao tratamento de resfriados, hipertensão, inflamação dos olhos,
vaginite, reumatismo, ferimentos e cefaléia (ALONSO, 2004).
Kong et al. (2002), verificaram que C. cassia pode ser eficiente também no
tratamento da gota, possivelmente devido ao efeito inibitório da xantina oxidase. Yu,
Lee e Jang (2007), registraram que o extrato etanólico da C. cassia apresenta efeito
ansiolítico que pode ser regulado pelos sistemas gabaérgico e serotonérgico e, além
disso, o extrato não apresenta efeito sedativo nem relaxante muscular
O óleo essencial obtido a partir da casca e dos ramos jovens da planta tem
sido largamente utilizado para a medicina, pelas propriedades antioxidantes e
atividades antiifúngicas e antibacteriana (GENG et al., 2011). O Cinamaldeído foi
identificado como um componente ativo fungitóxico e é também conhecido por inibir
a proliferação de linfócitos e crescimento de tumores. A atividade antimutagênica in
vitro do cinamaldeído foi relatada pela primeira vez por Ohta et al. (1983), na
34
mutagênese induzida em Escherichia coli como resultado do rastreio de fatores
antimutagênico nos gêneros alimentícios.
Em estudos realizados por Sharma et al. (2001), demonstram que o
potencial antimutagênico da Cinnamomum cassia poderia ser atribuído ao seu efeito
modulador sobre a bioativação de xenobióticos e processos de detoxificação.
Verspohl, Bauer e Neddermann (2005), relataram em um estudo com ratos
diabéticos, a ação do extrato de Cinnamomum cassia. Na diminuição dos níveis de
glicose no sangue, mostrando seu efeito hipoglicemiante.
Recentemente Sung et al. (2011), demonstrou que o extrato de C. cassia
reduziu a infiltração dérmica de células inflamatórias em camundongos com
dermatite atópica induzida, suprimindo a resposta celular do linfócito T auxiliar 2
(Th2) e assim, inibindo o desenvolvimento da patologia.
3.4.6
Jateorhiza palmata
Popularmente, a Jateorhiza palmata é denominada de calumba, columbo.
A raiz amarga dessa planta menispermácea africana é usada com tônico
estomacal, indicada em distúrbios gástricos, cólicas gástricas, flatulência, disenteria,
diarréia, anemia, opilação, fraqueza geral, falta de apetite, anorexia, tonteira, vermes
intestinais, febre intermitente, bronquite, hipertensão arterial, impotência sexual,
debilidade muscular em crianças, náusea e vômito (inclusive em grávidas), afecção
do estômago, dispepsia, atonia do tubo intestinal e escorbuto (PLANTAMED, 2010),
Kohno et al. (2002), publicaram resultados que indicam a capacidade
quimiopreventiva da raiz da Jateorhiza palmata contra a tumorigênese do cólon
induzido quimicamente durante a fase de iniciação. Fornecendo uma base científica
para a capacidade de um quimiopreventivo contra o câncer de cólon humano.
A bibliografia é extremamente escassa a respeito de estudos realizados para
avaliação dos efeitos da Jateorhiza palmata.
35
3.4.7 Centaurim erythraea
Popularmente, a Centaurium erythraea é denominada de fel-da-terra,
cantáurea-menor.
A Centaurium erythraea é da família Gentianaceae. Esta planta é mais
abundante na zona do Mediterrâneo, na medicina popular marroquina é utilizada em
diferentes terapias, e tem sido utilizada na medicina por seu efeito depurativo,
sedativo e as propriedades antipiréticas, é também utilizado para aliviar a indigestão,
tratar a icterícia, feridas e úlceras (HALOUI et al., 2000; HAMZA et al., 2010). A
infusão das partes aéreas possui uma atividade antioxidante e é utilizado para
reduzir a pressão arterial, espasmos do trato gastrintestinal, inflamação e edema
(VALENTÃO et al., 2002).
É uma erva muito amarga, que possui propriedades eupépticas, coleréticas,
por possuir glicosídeos amargos como a genciopicrina e eritrocentaurina, agindo
ainda como antigripal. Como uso externo, possui indicações em casos de alopecia e
crises reumáticas. Além do uso do ponto de vista medicinal, tal espécie é usada na
elaboração de licores e bebidas amargas (ALONSO, 2004).
A planta tem sido utilizada também, no tratamento de asma, eczema,
icterícia, parasitoses intestinais, reumatismo, feridas e úlceras, como bem como para
reduzir a pressão sanguínea, espasmos, edema e distúrbios digestivos (KULTUR,
2007).
Tahraoui, Israili e Lyoussi (2010), administraram o extrato da Centaurium
erythraea em doses relativamente altas por via oral e intraperitoneal em roedores, e
observaram ausência de mortalidade ou mudanças clínicas adversas significantes
nos parâmetros biológicos e hematológicos, e também na morfologia do fígado e dos
rins. Constataram assim, a ausência de toxicidade, além disso, considerando as
doses consumidas empiricamente na medicina tradicional, concluem que há uma
ampla margem de segurança para o seu uso terapêutico do extrato da Centaurium
erythraea .
Recentemente, Hamza et al. (2010), publicaram que o extrato da Centaurium
erythraea reduziu os efeitos do diabetes tipo 2 em camundongos alimentados com
uma dieta hiperlipídica. Estes resultados confirmam os resultados anteriores
encontrado em um modelo preventivo de diabetes tipo 2 em camundongos (HAMZA
36
et al., 2010), e se apresentam como um modelo estabelecido de tratamento, análogo
ao tratamento de pacientes humanos com diabetes.
Sefi et al. (2011), também demonstraram um efeito terapêutico protetor para
o diabetes, diminuindo o estresse oxidativo e danos às celulas pancreáticas de
ratos, provavelmente pelo seu potencial antioxidante.
37
4
4.1
METODOLOGIA
Animais
Foram utilizados 35 camundongos (Mus musculus) machos adultos com
idade entre 3 a 4 meses e 105 fêmeas da linhagem isogênica BALB/c, pesando
entre 20-30g e com aproximadamente 3 meses de idade, provenientes do Biotério
Central da Universidade do Vale do Itajaí – UNIVALI para os testes de
mutagenicidade e de toxicologia reprodutiva. O camundongo torna-se apto à
reprodução aos 60 dias de idade, sendo que os efeitos hormonais iniciais já estão
presentes em ambos os sexos ao redor dos 30 dias de idade, (CHORILLI;
MICHELIN; SALGADO, 2007). Os animais foram mantidos em caixas de
polipropileno, em ambiente com temperatura (22 + 2ºC) e ciclo controlado
(claro/escuro 12 horas cada), com ração (Nuvital) e água a vontade. Os animais
foram aclimatados no laboratório experimental por uma semana antes do inicio do
estudo. O microambiente foi enriquecido com papel toalha para elaboração de
ninhos. Este projeto foi submetido à Comissão de ética no uso de animais CEUA/UNIVALI, e foi aprovado sob o Parecer nº 004/10.
4.2
Tratamentos
A dose terapêutica diária do composto fitoterápico indicada para seres
humanos é 30 mL antes das refeições, a dose total diária a ser ingerida por um
adulto médio (60 kg) é de 90 mL. Portanto,a dose diária/animal baseada na humana
de 1,5 mL/kg, foi considerada de 1,5
L/g. Levando em conta que a formulação
fitoterápica deve ser empregada por via oral, esta via foi eleita para a administração
nos animais, sendo administrada por sonda rígida. Os animais foram pesados
semanalmente para ajuste da dose.
As fêmeas (n=90) foram divididas em 6 grupos, além dos três grupos que
receberam o composto fitoterápico em doses diferentes, o grupo do excipiente e
38
controle negativo, outro grupo controle negativo foi adicionado, com o objetivo de
avaliar a hipótese de que a contensão física diária do animal para a administração
dos tratamentos, causasse estresse e assim pudesse influenciar os resultados. Para
Stott (1981) o estresse é uma reação a forças deletérias que podem manifesta-se
por alterações neuroendócrinas ou adrenocorticais, e pode ser causado por técnicas
de contenção e afetar inclusive a reprodução.
Grupo CTSM: Este grupo foi mantido sem nenhum tratamento ou contenção
manual.
Grupo CT (controle negativo): Os animais receberam água (150 L) uma vez
ao dia, via oral, por sonda rígida.
Grupo AL (excipiente): Os animais receberam álcool a 16% (150 L) uma vez
ao dia, via oral, por sonda rígida.
Grupo AI1 (dose humana): os animais receberam a dose do composto (150
L), equivalente a indicação do laboratório para um adulto de 60 kg, ou seja, 1,5
L/g, uma vez ao dia, via oral, por sonda rígida.
Grupo AI2 (2x dose humana): Os animais receberam 2x (3 L/g), a dose do
composto (150 L), uma vez ao dia, via oral, por sonda rígida.
Grupo AI3 (3x dose humana): Os animais receberão 3x (4,5 L/g) a dose do
composto, uma vez ao dia, via oral, por sonda rígida.
As doses diárias foram administradas no mesmo horário e num volume
ajustado para 150 L/animal. Para a administração oral (gavagem), os animais foram
contidos manualmente em posição vertical e a sonda rígida introduzida até o
estomago do animal. A água e ração foram fornecidas a vontade durante todo o
experimento.
Os grupos foram constituídos por 15 fêmeas nulíparas, com pelo menos um
ciclo estral comprovado por citologia vaginal e receberam os tratamentos
diariamente por aproximadamente 42 dias.
O peso corporal foi registrado semanalmente durante o tratamento. Também
foram observados sinais de toxicidade como perda de peso, piloereção, diarréia,
convulsões, alterações do comportamento e da locomoção. A toxicidade sistêmica
pode ser verificada pela diminuição da massa corporal dos animais e diminuição do
desenvolvimento ponderal, ingestão alimentar, pelo aparecimento de alterações
39
comportamentais como apatia, prostração, piloereção, além de alterações na massa
relativa dos órgãos (MELLO, 2001; RAZA et al., 2002).
4.3
Citologia Vaginal
O ciclo estral refere-se a uma série de alterações do trato reprodutor da
fêmea levando a uma condição de cio ou estro, no momento que a fêmea é mais
receptiva ao acasalamento (KO; LUCA, 2009).
Via de regra o ciclo total tem uma duração aproximada de 5 dias, sendo que
este período depende do tempo de regressão do corpo lúteo e cessação da ação da
progesterona (SALGADO; PASSOS, 2009). O ciclo estral das fêmeas é dividido em
quatro fases: proestro, estro, metaestro e diestro.
O ciclo estral em camundongos pode ser aferido por esfregaço vaginal, as
mudanças anatômicas e hormonais no trato reprodutor estão relacionadas com a
diversidade celular apresentada no epitélio vaginal.
Na citologia, a característica é o aparecimento de células cornificadas (como
células de descamação), durante o estro, elas aparecem em maior número, muitas
vezes podem formar grumos (Figura 2A).
A fase do proestro é confirmada pela presença de células epiteliais
nucleadas (Figura 2B) e ocorre aumento nos níveis de estradiol (ALVES et al.,
2009).
A fase do metaestro caracteriza-se por predominância de leucócitos e
poucas células cornificadas. A fase diestro é a mais longa do ciclo e caracteriza-se
pela quase que exclusiva prevalência de leucócitos (Figura 2C) e caracteriza-se por
concentrações baixas de estrogênio esta fase é considerada como pré- ovulatória.
Foi realizado o esfregaço vaginal das fêmeas diariamente, com a utilização
de pinça apropriada e algodão embebido em soro fisiológico. Foi realizada a
coloração das lâminas com o Kit Panótico Rápido (Laborclin®). A visualização feita
em microscopia óptica da citologia vaginal foi relacionada com a fase do ciclo estral.
40
A
B
C
Figura 2: Citologia vaginal de fêmeas de camundongos. (A) células cornificadas, (B)
células nucleadas e (c) neutrófilos.
4.4
Delineamento experimental e Manejo reprodutivo
Após os primeiros 28 dias de tratamento as fêmeas foram acasaladas
individualmente com machos adultos, com fertilidade testada. As fêmeas
permaneceram com o macho por um período de 7 dias consecutivos, considerandose que o ciclo estral tem duração de 4-5 dias, e segundo Ko e Luca (2009), as
fêmeas acabam entrando em cio três dias após o primeiro contato, em sincronia
(efeito Whitten). Durante este período as fêmeas continuaram a receber os
tratamentos. A ciclicidade do estro e ovulação é controlada pelo ritmo diurno do
fotoperíodo. Acasalamento, estro e ovulação ocorrem com maior frequência durante
a fase escura do fotoperíodo (JACOBY; FOX; DAVISSON, 2002).
A cada manhã após a exposição com os machos, as fêmeas eram
inspecionadas quanto a presença de tampão vaginal (sêmen solidificado), o que
confirmaria que as mesmas foram copuladas. As fêmeas que tiverem confirmação
de cópula foram separadas e este foi considerado o dia zero da prenhez, isto se deu
com variação do primeiro ao último dia de acasalamento. As fêmeas prenhes
continuaram recebendo o tratamento por mais 7 dias, durante a embriogênese e
início da gastrulação. As fêmeas foram mortas por deslocamento cervical, no 15º dia
da prenhez para avaliação dos parâmetros reprodutivos que indicassem toxicidade.
O período de gestação em camundongos é de 19 a 21 dias (Figura 3).
41
Figura 3: Período de tratamento.
4.5
Avaliação dos parâmetros reprodutivos
Imediatamente após a morte do animal, foi realizada uma incisão abdominal
para exteriorização dos cornos uterinos e registrado os seguintes parâmetros.
Número de fetos vivos (avaliados pela resposta táctil) e mortos.
Presença de malformações maiores nos fetos.
Número de implantações;
Número de reabsorções precoces e tardias;
Corpos lúteos;
Peso do feto e respectiva placenta
Peso da fêmea no 15º dia da prenhez.
A contagem dos corpos lúteos (indicativo do número de ovulações) se deu
após a retirada dos ovários e observação sob estereomicroscópio, reconhecidos
pela coloração rósea e forma arredondada.
Para avaliação de malformações maiores nos fetos, estes foram retirados
dos envoltórios embrionários e placentários e sob estereomicroscópio foram
observadas a presença de fenda palatina, inserção de orelhas e alteração ou falta
de membros.
As reabsorções precoces e tardias foram avaliadas por observação direta.
As reabsorções tardias foram reconhecidas pela possibilidade de distinção entre os
tecidos embrionários e placentários, o que não acontece na reabsorção precoce
(Figura 4). Além dos parâmetros reprodutivos, também foi avaliado um parâmetro
metabólico através do peso do fígado.
42
Figura 4: Eventos reprodutivos.
As taxas e índices reprodutivos foram calculados conforme a descrição
abaixo (EPA, 1996; LEMONICA et al.,2003):
4.5.1 Taxa de cópula
Nº de fêmeas acasaladas x 100
Nº de fêmeas copuladas (com tampão seminal)
4.5.2 Taxa de Prenhez
Nº de fêmeas copuladas e prenhes x100
Nº de fêmeas copuladas não prenhes
4.5.3 Taxa de Viabilidade fetal
Total de fetos vivos x100
Total de implantes
4.5.4 Taxa implantação
Nº de implantações x 100
Nº de corpos lúteos
43
4.5.5 Perdas pré-implante
Nº de corpos lúteos- N de implantes x 100
Nº de corpos lúteos
4.5.6 Perdas pós-implante
Nº de implantes – N de fetos vivos x 100
Nº de implantes
4.5.7 Índice placentário
Peso da Placenta
Peso do feto
4.6
Teste de micronúcleo em eritrócitos de medula de camundongo
Para este ensaio foram utilizados três grupos de 10 animais, compostos por
5 machos e 5 fêmeas de camundongos Balb/c.
Grupo I - Controle negativo (água, via oral)
Grupo II- Controle positivo (etilmetanossulfonato-EMS- 50 mg/kg)
Grupo III - Tratamento (composto fitoterápico 2000 mg/kg, via oral)
A técnica utilizada para o estudo de micronúcleo (MN) em células de medula
óssea foi descrita por Schmid (1975), com modificações seguidas da OECD- 474
(1997).
Os animais receberam em dose única (0,1 mL/10g), por via oral com sonda
rígida, a água (controle negativo) e o composto fitoterápico (2000 mg/kg). O controle
positivo (agente mutagênico) etilmetanometilsufonato (EMS) foi administrado (50
mg/kg) por via intraperitoneal.
Após 24 h os animais foram mortos por deslocamento cervical os fêmures
foram retirados e as epífises distais cortadas.
A medula óssea foi coletada com o auxílio de uma seringa de 1 mL
preenchida com soro fetal bovino- SFB(Gibco®). O material foi depositado em um
44
tubo cônico contendo 1 mL de SFB, e homogeneizado com uma pipeta Pasteur
descartável.
A suspensão celular foi centrifugada por 5 minutos a 2000 rpm descartandose o sobrenadante e conservando um volume de 0,5 mL para posterior
homogeneização do precipitado celular.
Uma alíquota de 20 L foi adicionada a 80 l de azul de tripan (Sigma) para
verificação da viabilidade celular. Em seguida, uma gota da suspensão foi colocada
em câmara de Neubauer e realizada a contagem percentual, sendo consideradas
mortas as células que incorporavam o corante e, vivas as que excluíam o azul tripan
(Figura 5).
Da suspensão resultante, foi retirado 10 L para a realização do esfregaço
em lâminas limpas e previamente marcada com o código do animal, em seguida,
com o auxilio de outra lamina num ângulo de 45°, realizou-se o esfregaço. As
laminas foram secas à temperatura ambiente e fixadas com metanol.
Para a avaliação da atividade genotóxica as lâminas foram e coradas com
Wright-Giemsa (Merck®) e analisadas em microscopia de luz (1000x). Em cada
lâmina, foram analisados 2000 os eritrócitos policromáticos (PCEs) nos quais foram
contadas a quantidade de micronúcleos encontrados. Para avaliação da citotoxidade
foram
avaliados
os
eritrócitos
normocromáticos
(NCEs)
e
os
eritrócitos
policromáticos (PCEs) simultaneamente.
Figura 5: Células de medula de camundongos vistas sob microscopia (400x)
indicando a viabilidade celular determinada pela ausência de corante no
interior das células.
45
4.7
Análise estatística
Os parâmetros registrados foram avaliados por Análise de variância
(ANOVA). Em caso de uma Anova significativa (p<0,05), o teste de Tukey para
comparação de médias foi utilizado. Todas as análises foram avaliadas com
confiança de 95% (α =0,05) ou 99% (α =0,01). No texto, foram relatados os níveis de
significância alcançados (P). Todos os resultados foram apresentados em média e
erro padrão da média.
46
5
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O presente estudo avaliou um fitoterápico (Água Inglesa®) que vem sendo
usado há décadas no mercado, indicado como tônico e aperiente. Entretanto é
sabido que inúmeras mulheres fazem seu uso para promover a fertilidade. Não há
bibliografia espéciefica que comprove sua ação ou toxicidade. Na literatura são
encontrados somente estudos isolados dos extratos das espécies que o constituem
(Cinchona calisaya; Jateorhiza palmata; Centaurim erythraea; Baccharis trimera;
Artemisia absinthium; Matricaria recutita e Cinnamomum cassia), porém não foram
encontrados relatos da ação de sua associação
5.1
Toxicidade e massa corporal
Não foram encontrados indícios clínicos de toxicidade (diarréia, piloereção,
tremores, mudança de hábitos de postura e higiene, etc) em nenhum dos grupos
observados durante o tratamento. Foi registrada a morte de uma fêmea do grupo AI2
no 22º dia de tratamento, sem apresentar nenhuma causa aparente.
Não houve diferença estatística entre os grupos no peso inicial das fêmeas
(p=0,36) e também na variação da massa corporal (p=0,42) entre os grupos tratados
e controle durante o período de pré-acasalamento (28 dias), acasalamento (1 a 7
dias) e no período da embriogênese e início da gastrulação (1 a 7 dias) (Figura 6).
Figura 6: Dados da variação de massa corporal (g), expresso em média dos grupos
durante as seis semanas de tratamento com as três doses do composto
fitoterápico e controles.
47
O teste do composto fitoterápico de Água Inglesa, nas três doses
administradas, no período pré-acasalamento não afetou o ganho de massa corporal
dos grupos tratados. Estes resultados sugerem que o composto testado nas doses
investigadas não demonstrou toxicidade no período avaliado.
Muto et al. (2003),
também não encontraram sinais de toxicidade sistêmica em estudo realizado com a
utilização de extrato de Artemisia absinthium em ratos, planta que faz parte da
composição do fitorerápico em nosso estudo.
Tahraoui, Israili e Lyoussi (2010), em recente estudo de toxicidade subcrônica do extrato de Centaurim erythraea em ratos, administrado por via oral em
doses diárias de 100, 600 e 1200 mg/kg por 90 dias, não encontraram alterações no
comportamentodos animais. O ganho de peso corporal não foi diferente nos ratos
tratados em comparação com os controles.
O efeito do extrato hidroetanólico de Baccharis trimera (planta presente na
associação fitoterápica testada neste estudo), testado na dose de 8,4 mg/kg por via
oral em ratas prenhes, não resultou em sinais clínicos de toxicidade materna e
nenhuma
alteração
nos
parâmetros
hematológicos;
embora
alterações
histopatológicas tenham sido encontradas no fígado (GRANCE et al., 2008).
5.2
Peso do fígado
O fígado é considerado o principal órgão de metabolismo dos fármacos.
Alterações no peso do fígado podem demonstrar sinais de toxicidade, pois é o órgão
que encerra maior concentração de enzimas responsáveis pela biotransformação de
agentes tóxicos (OGA, 2003; GOLAN et al., 2009).
O peso do fígado das fêmeas prenhes (PR) foi maior (p<0,001) que o das
fêmeas não prenhes (NP) (Figura 7). Porém quando comparados dentro de cada
grupo (fêmeas prenhes e não prenhes) não houve diferença entre os tratamentos
(p=0,1).
48
Figura 7: Média e erro padrão do peso do fígado das fêmeas prenhes (PR) e não
prenhes (NP) dos grupos tratados.
O peso do fígado aumenta durante a prenhez em ratas, em decorrência da
retenção hídrica e aumento dos constituintes citoplasmáticos (MOURA; QUEIRÓZ;
CURI, 1991). Provavelmente este aumento tem como finalidade suprir a elevada
carga metabólica que é imposta neste período.
Este episódio foi observado em nosso estudo, pois o peso do fígado das
fêmeas prenhes foi maior quando comparado com as fêmeas não-prenhes.
Alterações no peso do fígado podem demonstrar sinais de toxicidade, entretanto isto
não foi observado em nosso estudo, pois quando comparamos o peso do fígado
somente entre as fêmeas prenhes e somente entre as não-prenhes não foi
encontrada diferença significativa.
5.3
Índices de fertilidade
Agentes tóxicos podem afetar parâmetros como o comportamento sexual,
normalidade do ciclo reprodutivo, função gonadal e consequentemente a fertilidade
(EPA, 1996). Nesta linha, todas as fêmeas acasaladas neste estudo (89)
apresentaram tampão seminal (Figura 8), indicativo de cópula, dado este que sugere
a ausência de influencia dos tratamentos no ciclo estral ou libido .
49
Figura 82: Tampão seminal depositado na vagina da fêmea de camundongo.
O desempenho reprodutivo pode ser definido como uma medida de avaliar a
capacidade dos machos e fêmeas para acasalar com sucesso e produzir
descendentes viáveis (FOSTER, 1999).
Todos os machos utilizados neste estudo, copularam e tiveram fêmeas
prenhes. O grupo CTSM apresentou um número maior de fêmeas prenhes (p=0,18)
em relação aos outros grupos (Tabela 1).
Tabela 1: Dados de cópula e de prenhez das fêmeas dos grupos tratados e controle.
Os valores foram expressos em número absoluto (Nº de fêmeas e
prenhas) e percentual (cópula e prenhez).
*Diferença significativa entre os grupos (p< 0,05; ANOVA).
A taxa de cópula é um índice que fornece informações associadas ao eixo
neuroendócrino-gonadal, e muitos parâmetros podem ser influenciados por este
sistema, incluindo libido, estabilidade hormonal e alterações no ciclo estral
(FOSTER, 1999).
50
Embora o presente estudo tenha registrado 100% de cópula no
acasalamento, a média geral de prenhez foi de 60,5% sendo observada uma
variação entre 50 a 86% de fêmeas prenhes entre os grupos. Estes dados são
maiores que alguns apresentados na literatura para esta linhagem. A linhagem
isogênica BALB/c apresenta em média 47% de cruzamentos produtivos sendo que
outras linhagens como, por exemplo, a C57BL/6J tem uma produtividade alta com
cerca de 84% de cruzamentos viáveis (ANDERSEN et al., 2004).
De acordo com Eskola e Kaliste-Korhone (1999), um grupo alojado de
camundongos fêmeas mantidas isoladas, quando apresentado a um macho ou
feromônios masculinos, retoma o ciclo estral sincronizado, efeito este conhecido
como Whitten. Também a pseudoprenhes pode ocorrer causada por alterações nas
interações sociais. Outro aspecto relacionado ao feromônio na fisiologia da
reprodução em camundongos é o efeito Bruce. Se a fêmea prenhe for exposta a um
novo macho ou mesmo o odor de sua urina até 4 dias após a cópula, a prenhez
existente será geralmente reabsorvida e a fêmea retornará ao estro (KO; LUCA,
2009).
Além destes fatores expostos, outra possível explicação para os resultados
observados pode ser que algumas fêmeas aceitaram a monta, mesmo sem estar no
estro, por insistência do macho, por estresse ou cansaço da fuga. A qualidade
oocitária também pode afetar a fertilização e implantação dos embriões, porém isto
não foi avaliado no presente estudo.
O grupo que não recebeu tratamento (CTSM) e nem mesmo foi contido
manualmente, apresentou um número maior de fêmeas prenhes. É possível sugerir
que o estresse diário da contenção e a gavagem interferiram nas funções
reprodutivas. Dallman et al. (1985), também relatam a influência do estresse,
quando prolongado, pode inibir a secreção dos hormônios luteinizante (LH) e do
folículo estimulante (FSH) causando bloqueio da ovulação.
5.4
Índices materno-fetais
Um total de 332 fetos vivos foi observado no 15º dia de prenhez. O grupo
CTSM apresentou uma média de fetos por fêmea menor que os demais grupos. Não
houve diferença estatística (p= 0,7) entre os grupos (Tabela 2).
51
Tabela 2: Fetos vivos por grupo de fêmeas prenhes e media de fetos por fêmea.
Dados expressos em número absoluto (fêmeas prenhes e fetos vivos) e
média e erro padrão da média (fetos/fêmeas).
Sem diferença significativa entre os grupos (p>0,05; ANOVA).
A média de fetos por fêmea encontrada neste estudo foi de 6,03. Embora
tenha sido observado que o grupo CTSM apresentou uma média de fetos por fêmea
menor que os demais grupos, estes resultados encontram-se dentro da expectativa
de fetos para esta linhagem. Segundo Silver (1995), o tamanho da ninhada de
fêmeas da linhagem BALB/c é de 5 a 7 filhotes por fêmea.
Vários fatores podem influenciar o tamanho da ninhada, dentre eles o
aumento de filhotes após o primeiro parto e a diminuição após o quinto, além de
fatores genéticos como diferenças entre várias linhagens de camundongos
(KRACKOW; GRUBER, 1990). Um estado ótimo de produtividade é alcançado entre
a segunda e oitava gestação. Em isogênicos a produtividade é, em geral, menor que
nos heterozigotos (HARKNESS; WAGNER, 1993).
Ainda, segundo Foster (1999), a diminuição no tamanho da ninhada indica
um efeito adverso no desempenho reprodutivo e pode muitas vezes ser um
indicador mais sensível que outros índices. Ela pode resultar de uma diminuição do
número de oócitos ovulados, um aumento de perdas pré ou pós-implantação,
concentração espermática insuficiente, ou espermatozóides de má qualidade.
O número de oócitos ovulados está relacionado com o número de corpos
lúteos (CL) formados. No camundongo o CL apresenta-se de coloração roseada e é
possível realizar sua contagem sob lupa (Figura 9). O número de corpos lúteos é um
52
dado importante, visto que pode-se saber quantos oócitos foram ovulados em cada
ovário, e assim, calcular as taxas de implantação, perdas pré e pós-implantação.
A ovulação da fêmea de camundongo é espontânea, ocorre quando os
folículos
maduros
se
rompem
de
forma
independentemente
da
cópula/acasalamento. Após a ruptura do folículo e liberação dos oócitos, o LH
(hormônio luteinizante) estimula formação o corpo lúteo e favorece a produção de
estrogênio e progesterona, caso houver a cópula (SALGADO; PASSOS, 2009).
Em seres humanos o corpo lúteo é a fonte primária para produção de
esteróides sexuais durante o primeiro trimestre de gestação sendo a placenta a
principal responsável pela secreção destes hormônios até o nascimento. Em
roedores a manutenção do CL está sob a influência de picos diários de prolactina
liberada pela hipófise. Estes picos são iniciados como resultado da estimulação
cervical que ocorre durante a cópula. Se a cópula não ocorrer o corpo lúteo sofre
atresia (MALASSINE; FRENDO; EVAIN-BRION, 2003).
Figura 9: Ovário de fêmea de camundongo com presença de corpos lúteos (n=5) no
15º dia de prenhez.
Não houve diferença estatística (p=0,6) na média (8,22±0,25) de ovulações
(número de corpo lúteo) por fêmeas entre os grupos. Grance (2007), em estudo
similar a este, também não encontrou diferença na ovulação de ratas tratadas com
extrato hidroetanólico de Baccharis trimera.
Dos oócitos ovulados e fertilizados, a taxa de implantação embrionária do
estudo foi de 96,6 ± 0,4%. Não houve diferença estatística (p=0,8) entre os grupos
tratados e o controle quanto a esta taxa. Da mesma forma, não houve diferença
estatística (p=0,8) entre os grupos tratados e o controle quanto a taxa de perdas pré
e pós-implantação embrionária (reabsorções precoces e tardias) (Figura 10). A
53
média geral do estudo foi de (20,4±1,6%) e (2,7±0,01%) para as perdas pré e pósimplantação embrionária, respectivamente (Tabela 3).
A
B
Figura 103: Reabsorções embrionárias (A) precoce (B) tardia.
Não houve diferença estatística (p=0,8) na viabilidade fetal entre os grupos
tratados e o controle (Tabela 3).
Tabela 3: Índices materno-fetais observados nos grupos tratados e controle. Dados
expressos em média e erro padrão da média (corpos lúteos) e percentual
(implantação, perdas pré e pós-implantação e viabilidade fetal)
Não houve diferença significativa entre os grupos (p>0,05; ANOVA).
Grance (2007) relatou redução significativa na taxa de implantação e aumento
na taxa de perdas pré-implantação em ratas tratadas com 8,4 mg/kg do extrato
hidroalcoólico de B. trimera, informando que este achado pode estar associado ao
efeito relaxante do extrato na musculatura lisa da tuba uterina, interferindo no
transporte do embrião até o útero.
Este efeito já foi relatado por Torres et al. (2000) em estudos experimentais
com flavonóides isolados de B. trimera Franco (2001) relatou que a administração do
extrato de carqueja em ratas exerceu ação abortiva, sendo contra-indicada durante a
gestação e a lactação.
54
Apesar dos relatos de diminuição da implantação e perdas embrionárias com
o B. trimera, este efeito não foi observado no presente estudo. A diferença de
concentração deste extrato ou mesmo o sinergismo com as várias outras tinturas
presentes no fitoterápico testado podem ser o motivo da ausência de alterações na
implantação.
Existem vários pontos no processo de implantação que pode ser perturbado
por substâncias tóxicas e levar à interrupção da prenhez (HARENG et al., 2005).
Esta ação tóxica pode ser observada através de índices que fornecem dados de
implantação embrionária, desenvolvimento embrionário e fetal, reabsorções,
viabilidade fetal, entre outros.
A viablilidade fetal é calculada pela diferença de fetos vivos pelo total de
fetos que implantaram e indica a capacidade de se manter a relação materno/fetal
até o final da gestação. Os fetos são considerados viáveis quando respondem ao
estímulo táctico ou mesmo é possivel observar movimentos, após a abertura do
corno uterino e retirada dos envoltórios fetais. O presente estudo apresentou uma
média de 78,% de fetos viáveis, sendo que no grupo AI1 foi observado um número
maior de fetos viáveis e o grupo AI3 menor que os outros grupos, apesar de não
haver diferença estatistica.
O grupo AI3 apresentou redução significativa (p< 0,01) no peso dos fetos
em relação aos outros grupos. Este resultado fez com que o índice placentário
(peso da placenta/peso do feto) (Figura 11) fosse maior (p< 0,01) neste grupo.
Grance (2007) também verificou aumento do índice placentário quando
utilizou 8,4 mg/kg do extrato hidroetanólico de B. trimera em ratas prenhes.
Não houve diferença (p=0,059) no peso das placentas entre os grupos. A
média do peso das placentas dos grupos foi de 0,124 ±0,008 mg (Tabela 4).
55
Figura11: Fetos de camundongo no 15º dia de prenhez e suas respectivas
placentas.
Tabela 4: Peso da placenta e respectivos fetos e o índice placentário dos grupos
tratados e controles. Dados expressos em média e erro padrão.
*Diferença estatística significativa p<0,01 entre os tratamentos (ANOVA e Tukey)
O grupo AI3 recebeu três vezes a dose terapêutica do composto e esta pode
ter sido a causa deste efeito A maior concentração dos extratos pode ter causado
algum efeito tóxico na mãe que comprometesse as trocas materno-fetais através da
placenta. De acordo com Hareng e colaboradores (2005), um bom funcionamento da
placenta é essencial para o desenvolvimento embrionário e fetal e o sofrimento fetal
pode de fato ser secundária a disfunção placentária.
Tem sido demonstrada uma correlação positiva entre o peso placentário e
peso fetal, mas a base fisiológica desta correlação ainda está sendo estudada. Este
fato constitui uma lacuna importante, porque a placenta é uma estrutura importante
pela estreita relação materno-fetal.
Se a função placentária estiver insuficiente, pode se tornar um fator limitante,
não apenas para a nutrição do feto, mas também para a troca materno-fetal dos
56
constituintes fisiológicos e resíduos que podem representar um risco patológico para
o feto (RAMA SASTRY, 1998).
A placenta desempenha, entre outras, a função de respiração, de excreção,
de hematopoese e produção hormonal, todas diretamente relacionadas com a
nutrição fetal e com o objetivo de preparar o feto para a vida extra-uterina (RAMA
SASTRY, 1998; DIAS; RUDGE; TRINDADE, 2001).
Vários autores observaram redução no peso placentário, tanto na espécie
humana como em outros animais, devido a causas, como a nutrição materna e
exposição a substâncias tóxicas pela mãe (DIAS; RUDGE; TRINDADE, 2001).
A placenta de camundongos possui inúmeras similaridades com a placenta
de humanos, inclusive fatores de transcrição envolvidos na expressão de vários
genes. O uso de modelos de camundongos transgênicos tem melhorado muito a
compreensão do controle genético da placenta e de investigação em biologia do
desenvolvimento (MALASSINE; FRENDO; EVAIN-BRION, 2003).
Os agentes químicos que apresentam características necessárias para
transpor outras membranas atravessam também a barreira placentária. Assim,
substâncias com baixo peso molecular transpõem facilmente a placenta por simples
gradiente de concentração. Além do peso molecular, interferem com a passagem
outras propriedades, a lipossolubilidade, grau de ionização e ligação com proteínas
plasmáticas (LEMONICA, 2003).
Outro aspecto importante é que a quantidade de álcool utilizado como
excipiente também foi administrado em dose tripla. Segundo Rama Sastry (1998),
gestantes expostas ao álcool têm suas funções placentárias comprometidas. O
efeito se apresenta como um atraso de crescimento intra-uterino do feto e um
decréscimo em todas as dimensões do crescimento fetal. O álcool influencia o fluxo
sanguíneo placentário e a fluidez da membrana da placenta e, consequentemente, o
aporte nutricional do feto.
Como o álcool atravessa facilmente a placenta, se ingerido pela gestante é
entregue diretamente para o feto que possui muito pouca tolerância para seu
metabolismo. O álcool tem propriedades teratogênicas e seus efeitos adversos
incluem aborto espontâneo, parto prematuro, baixo peso ao nascer, anomalias do
crescimento, entre outros (COOK, 2003).
57
5.5
Malformações fetais
Foram avaliados 332 fetos e não se observou alterações morfológicas
externas que evidenciassem malformações maiores ou menores, com exceção de
um feto do grupo AI1 que apresentou ausência de um dos membros superiores
(Figura 12), porém esta incidência
pode ser considerada normal, visto que em
humanos, é cerca de 2 a 3% (MONTELEONE-NETO; CASTILLA; LOPEZ-CAMELO,
1991).
Mesmo com uma dose três vezes maior do composto fitoterápico, que a
preconizada para uso em humanos, os fetos não apresentaram malformações
visíveis, como fenda palatina, alterações ou falta de membros.
Figura 12: Feto de camundongo no 15º dia de prenhez com
ausência do
membro superior.
Grance (2007) testou o extrato hidroetanólico de B. trimera, na concentração
de 8,4 mg/kg durante todo o período de prenhez em ratas e observou toxicidade
materna e a presença de malformações nos conceptos que incluíram alterações
viscerais e esqueléticas, redução no peso, tamanho fetal e ossificação. Este efeito
encontrado na prole é consequência da toxicidade materna.
Mello, Mello e Langelohn (2008), testaram um fitoterápico contendo B.
trimera e outras associações (Gotas Preciosas®) quanto aos potenciais efeitos
tóxicos com dose 10 vezes maior que a preconizada para fins terapêuticos em
humanos. O produto foi administrado por via oral em ratas Wistar durante 44 dias,
58
correspondendo ao período de prenhez e lactação. O tratamento foi considerado
inócuo, pois nenhuma malformação foi observada nos conceptos.
Estes resultados, como em nosso estudo, sugerem que a associação
fitoterápica estudada, não é potencialmente capaz de desencadear efeitos como
malformações nos fetos.
5.6
Teste de mutagenicidade – Micronúcleo
Os resultados deste estudo mostraram que a utilização de 2000 mg/kg do
composto
fitoterápico
não
induziu
aumento
de
eritrócitos
policromáticos
micronucleados (EPCMNs) (Figura 13), comparado com os grupos controle.
Figura 13: Eritrócito policromático com micronúcleo (MN).
A frequência de (EPCMNs) do grupo controle positivo em relação ao controle
negativo e do composto testado foi significativa (p < 0,001). O grupo do composto
testado não diferiu do grupo controle negativo (p>0,05). A proporção estimada de
EPC/NCE
entre
os
grupos
não
significativas na eritropoiese (Tabela 5).
apresentaram diferenças
estatisticamente
59
Tabela 5: Análise de 2000 eritrócitos policromáticos da medula de machos e fêmeas
de camundongos tratados com o composto fitoterápico e controles. Dados
expressos em número (EPCMNs por animal/sexo) e média e desvio
padrão (EPCMNs e EPC/ENC).
EPCMNs = Eritrócitos policromáticos micronucleados; EPC=Eritrócitos policromáticos;
ENC = Eritrócitos normocromáticos.
F= feminino
M= Masculino
*Diferença significativa para o controle negativo (p < 0.001).
Rodrigues
e
colaboradores
(2009),
investigaram
in
vivo
o
efeito
genotóxico/antigenotóxico e potencial mutagênico da B. trimera. Independentemente
da dose, nenhum efeito genotóxico foi observado em amostras de sangue e fígado
de camundongos, analisadas pelo ensaio cometa. Porém, a mostrou um efeito
antigenotóxico no sangue dos animais tratados, desta forma protegendo as células
contra danos oxidativos no DNA induzidos pelo tratamento ex- vivo com peróxido de
hidrogênio. Por outro lado, o extrato aumentou a frequência de micronúcleos na
medula óssea dos camundongos tratados, indicando uma atividade mutagênica.
Também não encontrraram diferença na relação EPC/ENC em nenhum dos grupos
tratados e controles, assim como demonstrado em nosso estudo.
Entretanto, os autores advertem que medicamentos preparados a partir
desta planta devem ser usados com cautela, embora os resultados também sugiram
efeitos antigenotóxicos de extrato aquoso de B. trimera.
Ainda, a mutagenicidade da infusão da carqueja (Baccharis trimera), nas
concentrações de 6,85 e 68,50 mg/mL e do suco de beringela (Solanum melongena
L.), nas concentrações de 21,97 e 43,94 mg/mL, foi testada em células de medula
óssea de ratos. As concentrações testadas das duas plantas não causaram ação
60
citotóxica, estatisticamente significativa, e nem alterações cromossômicas nas
células de medula óssea dos ratos. (PERON et al., 2008).
Aquino, Perazzo e Maistro (2011), avaliaram o artesunato, um derivado da
artemisina, principio ativo da Artemisia annua L. em um ensaio de células da medula
óssea de camundongos. Foi observado que altas doses de artesunato causou um
aumento no número médio de eritrócitos policromáticos micronucleados (EPCMNs)
demonstrando efeito clastogênico.
Sharma et al. (2001) utilizaram o teste do MN para avaliar o efeito
antimutagênico de Cinnamomum cassia contra dois agentes mutagênicos em ratos.
Os resultados deste estudo demonstram que seu potencial antimutagênico poderia
ser atribuída ao seu efeito modulador sobre a bioativação xenobióticos e processos
de desintoxicação.
O aumento de frequência de MN nas células é indicativo do potencial
mutagênico por quebras e/ou perdas cromossômicas e fornece evidências de
genotoxicidade sistêmica do composto avaliado. Assim, este estudo sugere a Água
Inglesa não possui potencial mutagênico e genotoxicidade sistêmica.
61
6
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados deste estudo demonstraram que o composto conhecido como
Água Inglesa®, quando testado em camundongos fêmeas da linhagem BALB/c, na
dose correspondente e indicada para humanos não apresentou efeitos sobre os
seguintes parâmetros: massa corporal das fêmeas; sinais de toxicidade sistêmica;
peso do fígado das fêmeas; ovulações; perdas pré e pós-implantação; viabilidade
fetal, malformações fetais e índice placentário.
A Água Inglesa® quando administrada na dose de 2000mg/kg não
apresentou efeito mutagênico ou toxicidade celular, verificado pelo ensaio de
micronúcleo.
Os dados obtidos sugerem que a Água Inglesa®, quando utilizada da forma
indicada é inócua para os parâmetros avaliados. Entretanto, quando utilizada na
dose três vezes maior que a preconizada para humanos, apresentou efeito negativo
sobre o peso dos fetos, com alteração no índice placentário.
Nenhum estudo em humanos ou em animais, com a Água Inglesa® foi
encontrado na literatura, somente referências com seus extratos testados
isoladamente. A escassez de estudos relacionados a toxicidade reprodutiva e a
ausência de trabalhos semelhantes a este, dificultou a comparação dos resultados.
Este
estudo
avaliou
parâmetros
reprodutivos
importantes
como
o
desempenho reprodutivo das fêmeas, fertilidade e o desenvolvimento embrio-fetal. O
desenvolvimento da prole e função materna na amamentação poderia ser a próxima
etapa de investigação.
62
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