UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS
APLICAÇÕES DAS ENZIMAS EM DIAGNÓSTICO
MOLECULAR: DESENVOLVIMENTO DE UM REAGENTE
ENZIMÁTICO PARA DETERMINAÇÃO DE LACTATO EM
FLUIDOS BIOLÓGICOS.
ROSCELLI SETTE SILVA MAIOLINI
LAVRAS
MINAS GERAIS - BRASIL
2009
ROSCELLI SETTE SILVA MAIOLINI
APLICAÇÕES DAS ENZIMAS EM DIAGNÓSTICO
MOLECULAR: DESENVOLVIMENTO DE UM REAGENTE
ENZIMÁTICO PARA DETERMINAÇÃO DE LACTATO EM
FLUIDOS BIOLÓGICOS.
Monografia apresentada ao Departamento
de Bioquímica da Universidade Federal de
Lavras, como parte das exigências do
curso de Pós-Graduação Lato Sensu em
Química, para a obtenção do título de
Especialização.
Orientador
Prof. Dr. Walclée de Carvalho Melo
Co-orientador
Dr. Márcio Henrique Lacerda Arndt
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
2009
ROSCELLI SETTE SILVA MAIOLINI
APLICAÇÕES DAS ENZIMAS EM DIAGNÓSTICO
MOLECULAR: DESENVOLVIMENTO DE UM REAGENTE
ENZIMÁTICO PARA DETERMINAÇÃO DE LACTATO EM
FLUIDOS BIOLÓGICOS.
Monografia apresentada ao Departamento
de Bioquímica da Universidade Federal de
Lavras, como parte das exigências do
curso de Pós-Graduação Lato Sensu em
Química, para a obtenção do título de
Especialização.
Aprovada em
de
de
Prof.
Prof.
Prof. Dr. Walclée de Carvalho Melo
UFLA
(Coordenador do curso)
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
2009
RESUMO
Esta monografia pretende fazer uma abordagem geral das propriedades das enzimas
enfatizando a especificidade enzimática, o que permitiu grande desenvolvimento da enzimologia com
aplicações em diversas áreas como na indústria farmacêutica, indústria de alimentos, Indústria do
álcool, papel, celulose, etc. Na indústria de Diagnóstico Molecular o avanço foi significativo
propiciando o desenvolvimento de reagentes de fácil aplicação laboratorial e alta especificidade o que
gerou resultados cada vez mais exatos e importantes para as decisões médicas. O Lactato, importante
analito plasmático encontrado em casos de exercícios severos, convulsões, acidose respiratória, etc.
pode ser quantificado por meio de um reagente enzimático-colorimétrico que após testes de validação
e análise de desempenho passou a ser fabricado pela BioTécnica Indústria de Diagnóstico in vitro.
Palavras-chaves: enzimas; especificidade; diagnóstico molecular; Lactato; reagente enzimático;
validação.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................................ 5
LISTA DE TABELAS ....................................................................................................................... 6
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 7
2. OBJETIVOS.................................................................................................................................. 10
2.1. Objetivo Geral.............................................................................................................................. 10
2.2. Objetivos específicos.................................................................................................................... 10
3. DESENVOLVIMENTO TEÓRICO........................................................................................... 11
3.1. Enzimas........................................................................................................................................ 11
3.2. Propriedades das Enzimas............................................................................................................ 12
3.3. O centro ativo enzimático............................................................................................................. 13
3.4. Desnaturação e Inibição Enzimáticas........................................................................................... 14
3.5. Importância do estudo das Enzimas e suas aplicações gerais....................................................... 15
3.5.1. Importância Clínica................................................................................................................... 16
3.5.2. Importância Prática.................................................................................................................... 16
3.6. Enzimas como reagentes analíticos em Diagnóstico Molecular................................................... 19
3.7. Exemplos de reações enzimáticas no Diagnóstico Molecular..................................................... 20
3.8. Fabricação de Reagentes/Kits para Diagnóstico Molecular.......................................................... 22
3.9. Desenvolvimento de um reagente enzimático na Indústria de
Diagnóstico in vitro.............................................................................................................................. 22
3.10. A importância do Lactato no Diagnóstico Clínico..................................................................... 23
3.11. O Reagente Lactato..................................................................................................................... 25
3.11.1. Composição do Reagente......................................................................................................... 26
4. Resultados obtidos no desenvolvimento do Reagente de Lactato
BioTécnica......................................................................................................................................... 27
5. Considerações Finais.................................................................................................................... 33
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA................................................................................................ 34
ANEXOS...........................................................................................................................................
36
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Comportamento cinético do reagente de Lactato após adição de amostra biológica (Reação
de Ponto Final)..................................................................................................................... 27
Figura 2 - Teste de precisão mostrando distribuição de 20 determinações de uma amostra em torno da
média no eixo Y e com escalas de três desvios padrões abaixo e acima da
média.................................................................................................................................... 28
Figura 3 - Linearidade: correlação entre as absorvâncias obtidas e as concentrações de Lactato
(Coeficiente de correlação) r = 0,9997................................................................................ 28
Figura 4 - Teste de Estabilidade do Calibrador de Lactato em condições de estresse (A absorvância em
função do Tempo em dias)................................................................................................... 29
Figura 5 – Análise Estatística do Teste de Sensibilidade Metodológica do Reagente de Lactato.
Gráfico da média das dosagens de amostras de baixa concentração de Lactato em função
do Coeficiente de Variação de tais amostras....................................................................... 30
Figura 6 - Teste de Correlação do Reagente de Lactato Trinder e Reagente de Lactato LDH UV
(Lactato Desidrogenase Ultravioleta).................................................................................. 31
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Valores de referência para o Lactato................................................................................... 25
Tabela 2 - Exatidão: determinação da concentração de lactato em relação aos soros controles e seus
respectivos desvios em relação ao valor esperado (Recuperação)..................................... 29
Tabela 3 - Dados referentes a Figura 5: Teste de Sensibilidade Metodológica do Reagente de
Lactato............................................................................................................................... 30
Tabela 4 - Teste de Reprodutibilidade do Reagente de Lactato BioTécnica......................................... 31
1. INTRODUÇÃO
As enzimas são essenciais para a vida já que apresentam uma eficiência catalítica
extraordinária, em geral muito maior que dos catalisadores sintéticos ou inorgânicos. Elas têm um alto
grau de especificidade por seus substratos (molécula que se liga ao sítio ativo e sofre ação da enzima),
aceleram as reações químicas de uma maneira formidável e funcionam em soluções aquosas sob
condições muito variáveis de temperatura e pH.
Com exceção de um pequeno grupo de moléculas de RNA que apresentam propriedade
catalítica, todas as enzimas são proteínas terciárias e quaternárias com propriedades catalíticas devido
sua capacidade de ativação específica dos seus substratos. Tal definição indica as propriedades
características das enzimas, que, por sua vez governam os fundamentos dos métodos de análise
enzimática.
“Pelo fato de serem proteínas com estrutura terciária ou quaternária,
as enzimas são dotadas de dobramentos tridimensionais em suas
cadeias polipeptídicas, o que lhes confere uma forma característica
e exclusiva. Assim, diferentes enzimas têm diferentes formas e,
portanto, diferentes papéis biológicos. As proteínas, como uma
classe de moléculas, são altamente eficientes na catálise de diversas
reações químicas, por causa da sua capacidade de se ligar
especificamente a uma larga variedade de moléculas. Pela
utilização de um repertório completo de forças intermoleculares, as
enzimas aproximam substratos a uma orientação ótima, o prelúdio
do fazer e quebrar ligações químicas. Em essência, elas catalisam
reações pela estabilização dos estados de transição, as espécies
químicas de maior nível de energia nos caminhos das reações.
Fazendo isto seletivamente, uma enzima determina qual das reações
químicas potenciais realmente ocorre. As enzimas podem também
agir como interruptores moleculares, na regulação da atividade
catalítica e na transformação de energia, por causa da sua
capacidade de acoplar as ações em centros de ligação separados.”
(STRYER, L.1996)
A determinação de um analito em qualquer amostra biológica se baseia primariamente na
reação do analito que se deseja avaliar, qualitativa ou quantitativamente, com um ou mais reagentes
visando a formação de um produto, que podem ser identificado visualmente ou medido através de um
equipamento. O trabalho no Laboratório Clínico baseia-se, quase na sua totalidade, no uso de
reagentes que produzem as reações desejadas e específicas, formando os produtos indicadores da
reação.
Na grande maioria das vezes, os reagentes utilizados na análise instrumental ou quantitativa
devem gerar produtos, cuja quantidade pode ser medida com a utilização de equipamento como o
fotômetro e o espectrofotômetro. Os dados obtidos são comparados com padrões para se obter então a
concentração do analito presente na amostra.
Durante muito tempo os reagentes empregados na pesquisa instrumental utilizaram somente
substâncias químicas, orgânicas ou inorgânicas, capazes de gerar um produto mensurável. Para gerar
produtos estes reagentes devem, em muitos casos, produzir grandes quantidades de energia ou
necessitam da adição de energia externa fornecida por incubações em temperaturas elevadas. Estes
reagentes químicos, no entanto, apresentam os seguintes problemas:
1 - dificuldades de manuseio por serem em muitos casos, reagentes muito cáusticos ou muito ácidos;
2 - o ensaio pode requerer o emprego de mais de um reagente, e estes reagentes não podem ser
combinados para formar reagente único;
3 - o sistema de reagentes requer incubações em temperaturas elevadas são dificilmente aplicáveis nos
analisadores;
4 - em muitas situações utilizam-se sistemas analíticos complexos ou demorados, que por diversas
razões não podem ser aplicados em aparelhos.
O desenvolvimento de métodos eficientes de fermentação e separação permitiu a obtenção de
enzimas purificadas de custo acessível, fazendo com que as enzimas pudessem ser utilizadas como
reagentes, substituindo os reagentes químicos em muitos sistemas analíticos. As enzimas passaram
então a fazer parte da formulação de um número cada vez maior de sistemas analíticos com as
seguintes vantagens:
- emprego de reagentes pouco agressivos e de fácil utilização;
- facilidade para utilização de reagentes únicos de alta especificidade;
- aplicação em analisadores automáticos, por empregarem reagentes únicos pouco agressivos que não
requerem incubações em temperaturas muito elevadas;
- custos operacionais totais muito similares aos dos reagentes químicos, porque reduzem as operações
manuais.
As enzimas são também produtos químicos, mas devido a características próprias, os sistemas
analíticos utilizando enzimas são denominados reagentes enzimáticos. Os usuários dos reagentes
enzimáticos sentiram necessidade de distinguir estes reagentes dos reagentes químicos e criou-se então
a denominação de reagentes colorimétricos para os reagentes químicos e de reagentes enzimáticos para
aqueles utilizando enzimas. Entretanto, muitos reagentes enzimáticos formam produtos coloridos,
sendo colorimétricos também. Assim, para distinguir os dois tipos de reagentes, deve-se denominar
como enzimáticos os reagentes que utilizam enzimas, e como reagentes químicos aqueles que não
utilizam enzimas.
O ácido láctico ou lactato é um resíduo do metabolismo glicídio, predominantemente
encontrado no músculo esquelético, no cérebro e nas hemácias. A concentração de lactato no sangue
depende também da taxa da produção metabólica no fígado e nos rins. O aumento da concentração de
lactato no sangue é, então, um indicador do metabolismo anaeróbico, sendo, portanto, um importante
marcador de insuficiência da circulação local por lesões e isquemias específicas ou generalizadas por
estresse metabólico ou exercícios físicos.
A acidose láctica pode ocorrer em dois perfis clínicos característicos. No primeiro, ocorre a
diminuição de oxigenação tecidual (hipoxia), resultante de choques, hipovolemia e insuficiência
ventricular esquerda. No segundo perfil (metabólico), ocorre associação a doenças como o diabetes
mellitus, neoplasias, doenças hepáticas, ou então está relacionado a drogas e/ou toxinas como o etanol,
o metanol e o salicilato. A acidose láctica também pode ocorrer na falência renal, na leucemia e na
deficiência de tiamina. Portanto, as determinações de lactato são importantes para a avaliação do status
ácido-base sanguíneo e tratamento da acidose láctica (acidez anormal do sangue).
O Lactato é dosado no plasma e no Líquido Céfalo-raquidiano através da reação com um
reagente enzimático-colorímétrico. A concentração de L-Lactato na amostra é determinada através da
reação:
L-Lactato + O2
Lactato Oxidase
Piruvato + H2O2
H2O2 + 4-aminoantipirina + TOOS*
Peroxidase
Cromógeno + 2 H2O
* TOOS (N-etil-N-(2 hidroxi-3-sulfopropil)-3-metilanilina)
“A intensidade da cor formada na reação é proporcional a concentração de Lactato na amostra,
que quando lido em fotômetro a 546 nm e comparado a um calibrador protéico fornece o valor de
Lactato na amostra.” (SHIMOJO; et al. 1991)
O desenvolvimento e análise do reagente enzimático-colorimétrico para dosagem de Lactato
ocorreu mediante pesquisa bibliográfica, pesquisa de mercado, estudo e otimização de lotes Pilotos e
por fim realização da Validação da formulação por meio de testes como: o Teste da Linearidade, Teste
de Exatidão, Teste de Ponto Final, etc., que comprovaram o desempenho adequada do reagente diante
de amostras biológicas.
2. OBJETIVO
2.1. Objetivo Geral:
Destacar a importância das enzimas para o desenvolvimento de reagentes para a Indústria
de Diagnóstico in vitro, exemplificado pelo reagente de Lactato.
2.2. Objetivos específicos:
- Descrever as principais propriedades das enzimas enfatizando a especificidade, o centro
ativo e sua inibição;
- Destacar o avanço alcançado com as diversas aplicações enzimáticas;
- Descrever o funcionamento de um reagente enzimático e exemplificar;
- Descrever o Fluxograma na Indústria de Diagnóstico;
- Descrever as etapas de desenvolvimento de um reagente enzimático-colorimétrico na
Indústria de Diagnóstico;
- Discutir sobre testes realizados durante o processo de Validação do reagente de Lactato
BioTécnica para uso laboratorial.
3. DESENVOLVIMENTO TEÓRICO
3.1. Enzimas
Existem duas condições fundamentais para a vida. Uma delas é que o organismo vivo deve
ser capaz de se auto-replicar e a segunda é que o organismo deve se auto-sustentar, o que se dá através
da catálise de reações químicas eficientes e seletivas. Sem a catálise, as reações químicas necessárias
para sustentar a vida não ocorrem em uma escala de tempo útil. As enzimas são responsáveis pela
catálise de reações e apresentam alta especificidade.
Em sistemas vivos, a maioria das reações bioquímicas dá-se em vias metabólicas, que são
seqüências de reações em que o produto de uma reação é utilizado como reagente na reação seguinte.
Diferentes enzimas catalisam diferentes passos de vias metabólicas, agindo de forma concertada de
modo a não interromper o fluxo nessas vias. Cada enzima pode sofrer regulação da sua atividade,
aumentando-a, diminuindo-a ou mesmo interrompendo-a, de modo a modular o fluxo da via
metabólica em que se insere.
“As enzimas, como outras proteínas, têm pesos moleculares que
variam de cerca de 12.000 até mais de um milhão. Algumas
enzimas não requerem nenhum outro grupo químico além de seus
resíduos de aminoácidos. Outras requerem um componente químico
adicional chamado co-fator – um ou mais íons inorgânicos, uma
molécula orgânica complexa ou uma molécula metalorgânica
chamada de coenzima. A coenzima, ou íon metálico, que está
firmemente ou até mesmo covalentemente ligada à parte protéica da
enzima, é chamado de grupo prostético. Uma enzima completa e
cataliticamente ativa, juntamente com sua coenzima e/ou íons
metálicos ligados, é chamada de holoenzima. A parte protéica dessa
enzima é chamada de apoenzima ou apoproteína.” (LEHNINGER.
1995)
A função das enzimas e de outros catalisadores é diminuir a energia de ativação da reação
e, desta forma, aumentar a velocidade da reação de um fator de 105 a 1017. Cada enzima é classificada
de acordo com a reação específica que ela catalisa. As reações catalisadas pelas enzimas são
caracterizadas pela formação de um complexo entre o substrato e a enzima (complexo ES).
K1
[E] + [S]
K3
[ES]
→
[E] + [P]
K2
[E]: Concentração de Enzima
[S]: Concentração de Substrato
[ES]: Concentração do complexo enzima-substrato
[P]: Concentração de Produto
K1, K2, K3: Constantes de velocidade
A ligação ocorre em uma fenda na molécula da enzima chamada de sítio ativo. Como
catalisadores, as enzimas não são consumidas na reação e não alteram seu equilíbrio químico.
A energia empregada para aumentar a velocidade da reação enzimática é derivada das
ligações fracas (ligações de Hidrogênio, interações hidrofóbicas e iônicas) entre o substrato e a
enzima. O sítio ativo enzimático está estruturado de tal maneira que algumas dessas interações fracas
ocorrem preferencialmente no estado de transição da reação, estabilizando assim o estado de transição.
A energia disponibilizada pela formação das numerosas ligações fracas entre a enzima e o substrato (a
energia de ligação) é substancial e em geral pode explicar as acelerações nas velocidades das reações.
3.2. Propriedades das Enzimas
A cinética é uma metodologia importante para o estudo dos mecanismos enzimáticos. A
maioria das enzimas tem algumas propriedades cinéticas em comum. À medida que a concentração do
substrato aumenta, a atividade catalítica de uma concentração fixa de uma enzima aumenta de forma
hiperbólica, aproximando-se de uma velocidade máxima, Vmáx característica, na qual praticamente
toda enzima está na forma do complexo ES. A concentração de substrato que produz metade da
velocidade máxima é a constante de Michaelis , KM, que é característica para cada enzima agindo
sobre um determinado substrato. A equação de Michaelis-Menten
V0 = Vmáx [S]
KM+ [S]
relaciona a velocidade inicial de uma reação enzimática (V0) com a concentração de substrato [S] e a
velocidade máxima (Vmáx) pela constante KM. Tanto o KM como a Vmáx podem ser medidos. Eles têm
significados diferentes para enzimas diferentes. Em condições de saturação, a velocidade limite de
uma reação catalisada enzimaticamente é descrita pela constante Kcat, também chamada número de
renovação. A relação Kcat/KM fornece então uma boa medida de eficiência catalítica. Cada enzima tem
um pH ótimo (ou intervalo de pH) no qual apresenta atividade máxima.
As enzimas, como outros catalisadores, não interferem na constante de equilíbrio das reações,
mas aumentam a velocidade das reações químicas, diminuindo a energia de ativação dos reagentes,
necessária para transformá-los em produto. Para que haja essa transformação, os reagentes precisam
atingir um estado de transição e as enzimas aceleram a velocidade da reação reduzindo a energia do
estado de transição.
As enzimas não somente aceleram as reações, mas também acoplam reações de maneira
produtiva: Considerando a energia livre (ΔG°’) necessária para transformar glicose em glicose-6fosfato:
Glicose → Glicose-6-Pi
ΔG°’ = 4,0 kcal/mol
e a energia de hidrólise do ATP:
ATP → ADP + Pi
ΔG°’ = -7,3 kcal/mol
A enzima hexoquinase catalisa o acoplamento destas duas reações, gerando glicose-6fosfato, com ΔG°’ de hidrólise -3,3 kcal/mol:
Glicose + ATP → Glicose-6-Pi + ADP + Pi
3.3. O Centro Ativo Enzimático
O centro ativo de uma enzima é a região que se liga aos substratos (e ao grupamento
prostético, se houver algum), e contém os radicais de aminoácidos que participam diretamente na
geração e quebra de ligações. Estes radicais são chamados de grupamentos catalíticos. Embora as
enzimas difiram amplamente em estrutura, especificidade e modo de catálise, podem ser feitas
algumas generalizações referentes aos seus centros ativos:
1. O centro ativo ocupa uma parte relativamente pequena do volume total de uma enzima.
A maioria dos radicais de aminoácidos em uma enzima não está em contato com o substrato. Isto
levanta uma questão intrigante de por que as enzimas são tão grandes. Praticamente todas as enzimas
são feitas de mais de 100 aminoácidos, o que lhes dá uma massa maior do que 10 KDa e um diâmetro
de mais de 25Å.
2. O centro ativo é uma entidade tridimensional formada por grupamentos que vêm de
diferentes partes da seqüência linear podem interagir mais fortemente do que os adjacentes na
seqüência.
3. Os substratos são ligados a enzimas por atrações fracas múltiplas. Os complexos ES têm
geralmente constantes de equilíbrio que variam de 10-2 a 10-8M, correspondendo a energias livres de
interação que variam de cerca de -3 a -12 kcal/mol. As interações não covalentes de complexos ES são
muito mais fracas do que ligações covalentes, as quais têm energias entre -50 e -110 kcal/mol. A
enzima e o substrato devem ter formas complementares de ligação, já que as interações reversíveis de
biomoléculas são feitas por ligações eletrostáticas, pontes de hidrogênio, forças de Van der Waals e
interações hidrofóbicas. O caráter direcional das pontes de hidrogênio entre enzima e substrato
freqüentemente obriga um alto grau de especificidade.
4. Centros ativos são fendas ou frestas. Em todas as enzimas de estrutura conhecida, as
moléculas de substrato estão ligadas a uma fenda ou a uma fresta. A água é geralmente excluída, a não
ser que ela seja um reagente. O caráter apolar da maior parte da fenda melhora a ligação do substrato.
Contudo, a fenda pode também conter aminoácidos polares. Ela cria um microambiente no qual certos
radicais adquirem propriedades especiais, essenciais para a catálise. As posições internas destes
aminoácidos polares são exceções biologicamente cruciais à regra geral de que aminoácidos polares
estão expostos à água.
5. A especificidade de ligação depende do arranjo precisamente definido de átomos no
centro ativo. Para caber dentro do centro, um substrato deve ter um formato correspondente. A
metáfora de Emil Fisher, da chave e fechadura expressa em 1890, provou ser altamente estimulante e
profícua. Contudo, está evidente agora que os formatos dos centros atvos de muitas enzimas são
acentuadamente modificados pela ligação do substrato, como foi postulado por Daniel E. Koshland,
Jr., em 1958. Os centros ativos destas enzimas assumem formatos que só são complementares ao do
substrato depois que o substrato estiver ligado. Este processo de reconhecimento dinâmico é chamado
de encaixe induzido.
3.4. Desnaturação e Inibição Enzimáticas
“A atividade biológica de uma molécula de proteína – sua atividade
catalítica no caso da molécula de enzima – depende geralmente da
integridade de sua estrutura. Portanto, qualquer alteração de sua
estrutura é acompanhada de uma perda de atividade, processo
conhecido como desnaturação. Se o processo de desnaturação não for
demasiado, poderá ser revertido, e a atividade recuperada, quando o
agente desnaturante for removido. Isso acontece graças à tendência da
molécula da enzima de reassumir sua conformação habitual. Contudo,
condições desnaturantes prolongadas ou intensas resultam numa perda
irreversível da atividade. As condições desnaturantes incluem
temperaturas elevadas, que quebram as ligações de estabilização por
aumentar a vibração dos átomos constituintes. As temperaturas baixas
são, portanto, necessárias para preservar a atividade da enzima,
especialmente em soluções aquosas com soro. Os extremos de pH
também causam o desenovelamento das estruturas moleculares das
enzimas.” (BURTIS e ASHWOOD. 1998)
“Algumas enzimas, por apresentarem alta estabilização por efeito hidrofóbico, podem
também sofrer desnaturação a frio.” (KYTE. 1995)
As enzimas podem também ser inativadas por modificações irreversíveis de um grupo
funcional essencial para atividade catalítica. Podem ser inibidas ainda por moléculas que se ligam
reversivelmente. Os inibidores competitivos competem reversivelmente com o substrato pelo centro
ativo, mas não são transformados pela enzima. Os inibidores não-competitivos ligam-se somente ao
complexo ES, em um sítio distinto do sítio ativo. Na inibição mista, o inibidor liga-se tanto a E como a
ES. Neste último caso, em um sítio distinto daquele em que o substrato se liga.
Se uma enzima é quebrada em seus aminoácidos constituintes, a sua atividade catalítica é
sempre destruída. Assim, as estruturas protéicas primária, secundária, terciária e quaternária das
enzimas são essências para a atividade catalítica.
A maioria das enzimas pode ser inibida por certos reagentes químicos. Essa inibição por
pequenas moléculas e íons específicos é importante nos mecanismos de controle em sistemas
biológicos. O estudo de inibidores de enzimas, também se constitui em uma fonte valiosa de
informações sobre os mecanismos da ação enzimática.
Os inibidores podem ser agrupados em:
Inibidores irreversíveis – aqueles que se ligam ou destroem um grupo funcional,
imprescindível para a atividade enzimática. A ligação pode ser covalente ou não e sua dissociação é
muito lenta. O composto diisopropilfluorofosfato (DIFP), por exemplo, reage com uma serina, no sítio
catalítico da acetilcolinesterase. A inibição da enzima compromete a transmissão dos impulsos
nervosos.
Inibidores reversíveis – caracterizados por uma rápida dissociação do complexo enzimainibidor. Podem ser de dois tipos:
Competitivos – em que a enzima pode ligar-se ao substrato ou ao inibidor, mas não aos dois
simultaneamente. Uma vez ligado, o inibidor competitivo não sofre transformação. Esse tipo de
inibição é revertido pelo simples aumento da concentração do substrato.(competição)
Não-competitivos – nesse caso o inibidor liga-se à enzima em um local diferente do sítio
ativo, alterando a sua conformação. Nesse caso a enzima pode ligar-se simultaneamente ao inibidor e
ao substrato. O aumento na concentração de substrato, no entanto, não atenua a inibição.
“A inibição da atividade enzimática, por pequenas moléculas e iontes
específicos, é importante porque ela serve como dos principais
mecanismos de controle em sistemas biológicos . Além disso, muitos
medicamentos e agentes tóxicos agem inibindo enzimas. Mais ainda, a
inibição pode ser uma fonte de esclarecimento dos mecanismo de
ação enzimática: aminoácidos críticos para a catálise podem, muitas
vezes, ser identificados pelo uso de inibidores específicos. O valor de
análogos de estado de transição.” (STRYER. 1996)
3.5. Importância do estudo das Enzimas e suas aplicações gerais
As enzimas, importantes componentes do metabolismo de todos os seres vivos, têm a
capacidade de promover e acelerar reações químicas. Microrganismos ou substâncias com essa
propriedade já eram usados por populações humanas muito antigas para modificar alimentos –
fermentar uvas e fabricar o vinho, ou alterar o leite e produzir queijo, por exemplo. Depois que os
cientistas desvendaram a atuação das enzimas, estas passaram a ser cada vez mais empregadas, com
variadas finalidades. Hoje, essas proteínas especiais são úteis inclusive na indústria, não apenas na
área de alimentos, mas em muitos outros setores.
O estudo das enzimas tem uma grande importância prática e clínica. Em algumas doenças,
especialmente nas desordens genéticas herdadas, pode ocorrer uma deficiência ou mesmo a ausência
total de uma ou mais enzimas. Outras condições anormais também podem ser causadas pela excessiva
atividade de uma enzima. Medidas da atividade de enzimas no plasma sanguíneo, eritrócitos ou
amostras de tecido são importantes no diagnóstico de várias doenças. Muitas drogas exercem seu
efeito biológico por meio de interações com as enzimas. As enzimas tornaram-se importantes
ferramentas práticas não apenas na medicina, mas também na indústria química, no processamento de
alimentos e na agricultura.
3.5.1. Importância Clínica:
Todas as enzimas presentes no corpo humano são sintetizadas intracelularmente. Três casos
se destacam:
- Enzimas plasma-específicas: Enzimas ativas no plasma utilizadas no mecanismo de
coagulação sangüínea e fibrinólise. Exemplo: pró-coagulantes: trombina, fator XII, fator X e outros.
- Enzimas secretadas: São secretadas geralmente na forma inativa e após a sua ativação
atuam extracelularmente. Os exemplos mais óbvios são as proteases ou hidrolases produzidas no
sistema digestivo. Exemplos: lipases, alfa-amilase, tripsinogêneo, fosfatase ácida prostática e antígeno
prostático específico. Muitas são encontradas no sangue.
- Enzimas celulares: Normalmente apresentam baixos teores séricos que aumentam quando
são liberadas a partir de tecidos lesados por alguma doença. Isso permite inferir a localização e a
natureza das variações patológicas em alguns órgãos, tais como o fígado, o pâncreas e o miocárdio. A
elevação da atividade sérica depende do conteúdo de enzima do tecido envolvido, da extensão e do
tipo de necrose. São exemplos de enzimas celulares as transaminases, lactato desidrogenases,
creatinoquinases, etc.
Enzimas digestivas tais como a amilase, protease e lipase, reduzem os alimentos em
componentes menores que são mais facilmente absorvidos no trato digestivo.
3.5.2. Importância Prática:
Segundo MUSSATO (2007), é vantajoso usar enzimas na indústria, porque elas são naturais, não tóxicas e específicas para determinadas ações. Além disso, são capazes de alterar as
características de variados tipos de resíduos, contribuindo para reduzir a poluição ambiental,
substituindo processos químicos rigorosos.
Os microrganismos são a principal fonte de enzimas de aplicação industrial, mas diversas
podem ser obtidas de animais (pancreatina, tripsina, quimotripsina, pepsina, renina e outras) ou
vegetais (papaína, bromelina, ficina e outras). Hoje, porém, como é possível modificar geneticamente
os microrganismos para que forneçam qualquer enzima, a tendência é substituir as produzidas por
vegetais e animais pelas de origem microbiana.
O uso de enzimas em processos industriais é de grande interesse, em especial devido à
facilidade de obtenção (por biotecnologia) e às vantagens em relação aos catalisadores (aceleradores
de reações) químicos, como maior especificidade, menor consumo energético e maior velocidade de
reação. Além disso, a catálise enzimática tem outros benefícios, como o aumento da qualidade dos
produtos, em relação à catálise química; a redução dos custos de laboratório e de maquinário, graças à
melhoria do processo; ou a fabricação controlada de pequenas quantidades.
Medicamentos: Várias enzimas têm propriedades que permitem seu uso como
medicamentos. São exemplos as que têm ação antibiótica ou antiinflamatória (lisozima, bromelina,
hialuronidase e outras), as que auxiliam a terapia da leucemia (L-asparaginase) ou facilitam a digestão
(papaína, bromelina, tripsina e outras). Em geral, enzimas utilizadas com essa finalidade devem ter
pureza e especificidade altas, antigenicidade baixa (para evitar reações imunológicas) e estabilidade
em condições fisiológicas.
Além das aplicações terapêuticas, diversas enzimas são empregadas na síntese de fármacos
(penicilina, por exemplo). As lipases, que degradam gorduras, são úteis em reações químicas
necessárias à produção de remédios.
Atuação na produção de alimentos: As enzimas têm destacado papel no setor alimentício,
pois podem influir na composição, no processamento e na deterioração dos alimentos. Elas às vezes
são indesejáveis: provocam, por exemplo, o escurecimento de frutas e vegetais (é o caso das
polifenoloxidases), o ranço de farinhas (lipases e lipoxigenases) e o amo-lecimento de tecidos vegetais
(enzimas pécticas).
Na panificação, a enzima alfa-amilase promove a decomposição do amido, que leva à
produção de maltose, aumentando a maciez e a textura da massa e do miolo e mantendo o pão fresco
por mais tempo. Já a amilase maltogênica e a xilanase dão estabilidade à massa, enquanto a protease
altera a elasticidade e a textura do glúten e melhora a cor e o sabor do pão. No processamento de
amidos, enzimas como glicose isomerase, alfa-amilase, beta-amilase, pululanase e isoamilase
convertem o amido em dextrose ou xaropes ricos em açúcares simples.
Na indústria de laticínios, a quimosina promove a coagulação do leite (para a produção de
queijos), a lactase decompõe a lactose em açúcares mais simples, a protease quebra proteínas de soro.
Neste e em outros setores, as lipases decompõem gorduras.
Enzimas como papaína, bromelina e ficina ajudam a amaciar carnes, e outras são
empregadas nos processos de produção de bebidas alcoólicas. No caso das bebidas destiladas, a alfaamilase e a glicoamilase decompõem o amido. No caso dos vinhos, a pectinase facilita a prensagem, a
filtração e a clarificação e reduz o tempo de processamento. Nos dois tipos de bebidas, as proteases
quebram proteínas. As cervejarias usam diferentes enzimas para liquefazer e fermentar a matériaprima (alfa-amilase), aumentar o teor de certos açúcares (glicoamilase), aumentar a velocidade de
filtração (glucanase), remover compostos indesejáveis (pentosanases) e evitar a turbidez do produto
final (papaína, bromelina ou ficina).
Enzimas, celulose e papel: Muitas enzimas interessam à indústria de papel e celulose. Para
produzir papel, composto basicamente de fibras de celulose, é preciso picar a madeira, transformá-la
em polpa, por processos químicos, e retirar dessa polpa a hemicelulose, a lignina, certas resinas e
outros componentes. Enzimas capazes de realizar algumas dessas tarefas permitem, nessa indústria,
substituir produtos químicos responsáveis por sérios problemas ambientais.
Tecidos com maior requinte: Na indústria têxtil, a presença das enzimas tem crescido nas
últimas décadas. Elas podem atuar nas fases de fiação, tingimento e acabamento dos tecidos. Nesse
último caso, ajudam a limpar a superfície do material, a reduzir as pilosidades e a melhorar a
aparência, o brilho, o caimento, a resistência e a estabilidade. Em outra aplicação relevante, certas
enzimas (proteases) conferem resistência ao encolhimento às fibras da lã. Em muitos processos têxteis,
substâncias químicas sintéticas podem ser substituídas por enzimas, que têm ação mais específica e
geram benefícios ambientais, pois são biodegradáveis e dependem de menor consumo de energia.
Aumento do poder de limpeza: É cada vez maior o número de produtos de limpeza que
contêm enzimas, em especial amilases, proteases, lipases e celulases. Cada uma delas ‘ataca’ um tipo
de substância, tornando-a solúvel em água e facilitando sua remoção: as amilases atuam sobre o amido
(presente em manchas de molhos, frutas, chocolate e outras), as proteases quebram proteínas, as
lipases degradam gorduras e as celulases ajudam a remover fibrilas de celulose que aparecem com o
tempo nos tecidos (essa remoção melhora o brilho e a maciez das roupas).
Cosméticos: Outra área em que as enzimas vêm ganhando espaço é a de cosméticos. Já há
enzimas incorporadas à formulação de vários produtos presentes no mercado, como tinturas,
depilatórios, alisantes de cabelo, sais de banho, dentifrícios, desodorantes, produtos anti-caspa,
curativos e outros, ou aplicadas em limpezas de pele (descamação) e produtos aromáticos. Enzimas
que quebram proteínas têm recebido atenção especial da cosmetologia, com destaque para a papaína,
capaz de promover a penetração de compostos na pele e atuar como agente de raspagem e depilação
em produtos de uso local. É importante, no desenvolvimento do cosmético, conhecer as características
da enzima usada, dos demais componentes da fórmula e do recipiente onde é acondicionado, além das
condições de armazenamento, para evitar reações entre essas substâncias, que prejudicariam a eficácia
e a segurança do produto.
Uso no tratamento de efluentes: O desenvolvimento das chamadas tecnologias limpas, ou
seja, que reduzem o impacto ambiental de uma atividade industrial, também conta com a participação
de enzimas. Um exemplo é o uso na produção de polpa de celulose e no branqueamento desta.
Combinadas com técnicas de processamento, as enzimas permitem reduzir ou até eliminar o uso de
cloro nessas atividades industriais, evitando a emissão de substâncias organocloradas – altamente tóxicas e mesmo cancerígenas – para o ambiente.
Enzimas são aplicadas ainda no tratamento de efluentes e resíduos industriais. As águas
residuais das indústrias alimentícias, por exemplo, contêm gorduras sólidas ou líquidas (graxas e
óleos), que causam sérios problemas de poluição, ao formar filmes na superfície dos corpos receptores
(impedindo o fluxo do oxigênio necessário à vida aquática) e ao causar entupimentos. A adição de
lipases a esses efluentes gera substâncias mais simples, facilmente degradadas, evitando tais
problemas.
O mercado mundial de enzimas industriais é estimado hoje em US$ 2,3 bilhões anuais e
tem três segmentos: enzimas técnicas (destinadas a indústrias de tecidos e de produtos de limpeza),
enzimas para alimentos e bebidas e enzimas para ração animal. As principais enzimas de aplicação
industrial são proteases, amilases, lipases, celulases, xilanases e fitases, e as maiores empresas
produtoras são européias: Gist-Brocades (Holanda), Genencor International (Finlândia) e Novo
Nordisk (Dinamarca). A última detém, sozinha, cerca de metade do mercado mundial de enzimas
industriais.
No Brasil, em 2005, as importações de enzimas chegaram a US$ 31 milhões e as
exportações a US$ 3 milhões. As mais importadas foram amilases (US$ 4 milhões), seguidas de
proteases (US$ 2,5 milhões). O mercado brasileiro de enzimas, embora ainda pouco representativo
(cerca de 2% do total mundial), revela grande potencial, devido à enorme geração de resíduos
agroindustriais e ao dinamismo das indústrias de alimentos, medicamentos, tecidos e celulose/papel. A
redução do custo de produção de enzimas é favorecida, no país, pela possibilidade de bioconversão de
subprodutos agrícolas como farelo de trigo, farelo de algodão, casca de soja e outros. Acredita-se, por
isso, em um aumento rápido do uso de enzimas, de forma geral, e em particular em processos
industriais, no país.
3.6. Enzimas como reagentes analíticos em Diagnóstico Molecular
“Em todos os métodos analíticos, a quantidade da substância a ser determinada deve ser a
única variável que cause uma diferença observável nos resultados.” (BURTIS e ASHWOOD. 1998)
De acordo com GURTMANN (1974), a quantidade de substrato transformada em produtos
durante uma reação enzimática pode ser determinada com qualquer método analítico apropriado.
Contudo, o método mais comumente utilizado é a análise fotométrica. A reação pode ser acompanhada
de uma mudança característica de absorbância de algum componente do sistema de ensaio, no espectro
do visível ou do ultravioleta e esta mudança pode ser observada enquanto progride.
As necessidades fotométricas das análises enzimáticas não são diferentes daquelas das
análises quantitativas fotométricas em geral. Contudo, o fotômetro utilizado deve ser provido de meios
para manter os conteúdos da cubeta numa temperatura constante durante a reação.
A utilização de enzimas como reagentes analíticos oferece a vantagem de maior
especificidade para a substância a ser dosada. Esta alta especificidade reduz a necessidade de etapas
preliminares de separação e purificação, de modo que a análise pode ser executada diretamente em
misturas complexas como o soro, a urina, o líquor, etc. As enzimas com especificidade absoluta para a
substância a ser avaliada são claramente preferíveis para o uso analítico. Contudo, este ideal não pode
ser sempre alcançado na prática, e o conhecimento das especificidades para o substrato das enzimas
reagentes é, portanto, essencial para permitir que uma possível interferência com o ensaio seja prevista
e evitada. As reações acopladas são, com freqüência, utilizadas para construir um sistema analítico
enzimático para dosagem de um composto em particular, e a especificidade das reações acopladas
pode modificar a especificidade de todo o processo.
O fundamento mais amplamente utilizado para determinar a quantidade de uma substância
de modo enzimático é permitir que a reação chegue ao fim, de maneira que todo o substrato seja
convertido a um produto mensurável. Tais métodos são chamados de “ponto final” ou, mais
corretamente, de método de equilíbrio, pois a reação cessa, quando o equilíbrio é alcançado. As
reações nas quais o ponto de equilíbrio corresponde realmente à conversão completa do substrato são
preferidas para esse tipo de análise. Todavia, o equilíbrio desfavorável pode, com freqüência, ser
deslocado no sentido desejado por reações enzimáticas ou não-enzimáticas adicionais, que
transformam ou “aprisionam” um produto da primeira reação.
É importante destacar que o tempo necessário para transformar uma quantidade fixa do
substrato em produtos é inversamente proporcional à quantidade da enzima presente. Os métodos de
equilíbrio podem, portanto, requerer o uso de quantidades apreciáveis de enzimas para cada amostra, a
fim de impedir períodos de incubação inconvenientemente longos. Quando a concentração do
substrato cai a níveis baixos pouco antes do fim da reação, a KM da enzima torna-se importante na
determinação da velocidade da reação. As enzimas com altas afinidades pelos substratos (valores
baixos de KM) são, portanto, mais apropriadas para as análises de equilíbrio. Os métodos de equilíbrio
são muito insensíveis a pequenas variações nas condições da reação. Não é necessário ter exatamente a
mesma quantidade de enzima em cada mistura de reação, ou manter o pH ou a temperatura
absolutamente constante, contanto que as variações não sejam grandes, a ponto da reação não se
completar dentro de um tempo fixo permitido.
A quantidade de enzima reagente necessária para cada análise pode ser reduzida e o tempo
encurtado pelo uso de métodos nos quais a quantidade de mudança produzida num intervalo de tempo
fixo seja medida. É uma propriedade das reações de primeiro grau que a variação na concentração de
substrato por um intervalo de tempo fixo seja diretamente proporcional à sua concentração inicial.
A seleção cuidadosa das condições de reação, como concentrações dos substratos e cofatores pode, com freqüência, melhorar as curvas e os mecanismos de marcha da reação, eliminando as
fases de demora e prolongando o período de linearidade, de modo que os métodos de análise com
tempo fixo tornam-se factíveis. Aperfeiçoamentos na fotometria, levando a medidas mais sensíveis da
formação do produto, também permitiram que a duração da incubação fosse encurtada em comparação
com os testes mais antigos.
3.7. Exemplos de reações enzimáticas no Diagnóstico Molecular
1 – Na determinação enzimática da glicose no soro, plasma ou no LCR (Líquido céfalo
raquidiano) a enzima glicose oxidase catalisa a oxidação da glicose existente na amostra, em presença
de oxigênio e água, produzindo peróxido de hidrogênio. A enzima peroxidase catalisa a oxidação do
fenol pelo peróxido de hidrogênio formado em presença de 4-aminoantipirina produzindo um
composto róseo-avermelhado (quinonimina), que apresenta um máximo de absorção em 505 nm. A
intensidade de cor é proporcional à concentração de glicose na amostra, que quando comparado a um
padrão de concentração conhecida permitir o cálculo da concentração absoluta no soro ou plasma.
glicose oxidase
Glicose + O2 + H2O
Ácido Glucônico + H2O2
peroxidase
2H2O2 + 4-Aminoantipirina + Fenol
Quinonimina + 4 H2O
2 – Outro exemplo é a determinação enzimática do ácido úrico no soro, na urina, no líquido
amniótico e sinovial. O ácido úrico da amostra sofre a ação da uricase, na presença de oxigênio,
produzindo alantoína e peróxido de hidrogênio; este, em presença do reagente fenólico (DHBS)* e de
4-aminoantipirina, sofre a ação da peroxidade produzindo um composto violáceo (quinonimina) com
máximo de absorção em 500 nm.
Ácido Úrico + O2 + 2 H2O
uricase
Alantoína + CO2 + H2O2
2 H2O2 + 4-aminoantipirina + DHBS*
peroxidase
Quinonimina + 3 H2O
* DHBS (Ácido Di-hidróxi benzeno sulfônico)
3 - A uréia da amostra biológica é hidrolisada pela enzima urease com produção de gás
carbônico e íons amônio. Estes íons são captados por uma segunda enzima, a glutamato
desidrogenase, que em presença dos substratos NADH e α-cetoglutarato produz NAD+ e glutamato. A
taxa de diminuição da concentração de NADH no meio pode ser medida no espectrofotômetro em 340
nm, sendo proporcional à concentração de uréia na amostra.
Urease
Uréia + H2O
2 NH4+ + CO2
4+
NH + α-cetoglutarato + NADH + H
+
glutamato desidrogenase
Glutamato + NAD+
4 - A Aspartato aminotransferase (AST ou TGO) catalisa a transferência do grupo amino do
aspartato a α-cetoglutarato, formando oxalacetato e glutamato. A concentração catalítica se determina,
empregando a reação acoplada de malato desidrogenase (MDH), a partir da velocidade de
desaparecimento no NADH, medido em 340 nm.
AST
L-Aspartato + α-cetoglutarato
Oxalacetato + NADH + H+
Oxaloacetato + L-Glutamato.
MDH
Malato + NAD+
5 - A Alanina Aminotransferase (ALT ou TGP) catalisa a transferência do grupo amino da
alanina a α-cetoglutarato, formando piruvato e glutamato. A concentração catalítica se determina,
empregando a reação acoplada de lactato desidrogenase (LDH), a partir da velocidade de
desaparecimento do NADH, medido a 340 nm.
ALT
L - alanina + α-cetoglutarato
Piruvato + NADH + H+
Piruvato + L-Glutamato
LDH
D - Lactato + NAD+
3.8. Fabricação de Reagentes/Kits para Diagnóstico Molecular
A fabricação de reagentes nas indústrias de diagnóstico in vitro acontece de acordo com as
Boas Práticas de Fabricação e Controle (BPFC), da Portaria 686 BRASIL - ANVISA. (1998) e da
RDC 167 ANVISA – BRASIL (2004), o que garante a confiabilidade no produto e a rastreabilidade
do processo produtivo.
Após validação do reagente pelo setor de Pesquisa e Desenvolvimento o reagente está
disponível para fabricação. As matérias-primas são adquiridas conforme especificações e o Controle
de Qualidade (CQ) realiza testes com os produtos químicos como verificação do pH, ponto de fusão,
densidade, teste de especificidade para enzimas, etc. Após aprovação dos produtos químicos, é
manipulado um lote Piloto que passa por nova análise no CQ. Se aprovado, é manipulado o lote
comercial com as mesmas características do lote piloto. Após uma série de testes no CQ como: Teste
de exatidão, repetibilidade, linearidade, teste de branco, de estresse e do limite de detecção. Estes
testes têm como objetivo avaliar a performance e estabilidade do produto fabricado. Se o reagente
obtiver um desempenho adequado será aprovado para envase e montagem do kit. O kit passa por uma
última inspeção do CQ e é aprovado então para venda. A cada lote envasado e embalado, após
aprovação do CQ, são retirados kits para o estoque de rastreabilidade e o lote é monitorado
periodicamente no CQ conforme prazo de validade. (Anexo A – Fluxograma de Produção)
3.9. Desenvolvimento de um reagente enzimático na Indústria de Diagnóstico
in vitro
Após pesquisa bibliográfica, pesquisa de mercado e desenvolvimento da formulação, o
reagente é submetido a uma série de testes para sua validação como:
1. Estudo de efeito matriz, que é a influência de um componente na amostra, diferente do
analito a ser medido, na dosagem quantitativa e/ou qualitativa daquele analito.
2. Interferência de anticoagulante, lipemia, bilirrubina e hemólise.
3. Teste de Sensibilidade (limite de detecção): variação da resposta de um método de
medição dividida pela correspondente variação do mensurando ou a menor quantidade, diferente de
zero, que o método consegue medir.
4. Teste de Linearidade: quantidade máxima de um analito que um reagente (ou sistema
analítico) consegue medir.
5. Teste Cinético: Teste que avalia o comportamento da reação em função do tempo. Feito
em espectrofotômetro com leitura em intervalos determinados, imediatamente após a adição da
amostra.
6. Teste de Exatidão: Teste que avalia o quanto a dosagem realizada com o reagente em
análise se aproxima do valor real da amostra. A calibração do ensaio deverá ser feita com Calibrador
ou Padrão de Referência. Deverá ser dosado pelo menos um Soro Controle.
7. Teste de Branco de Reagente: Determina a cor do reagente em análise em
espectrofotômetro e em relação à água no comprimento de onda pré-determinado, avaliando a sua
determinação.
8. Teste de correlação com reagente referência utilizando pelo menos 50 amostras humanas.
9. Teste de Inspeção das características visuais do produto: os reagentes em análise devem
ser colocados em frascos e/ou tubos transparentes e seu aspecto visual observado e registrado,
conforme especificações.
10. Teste de Repetibilidade: Avalia a dispersão dos resultados do teste realizado em um dia,
por um operador, por um reagente usando um equipamento. Um soro humano é ensaiado 20 (vinte)
vezes seguidas pelo lote em teste, calibrado com Calibrador ou Padrão de Referência. Deverão ser
calculados a Média, Desvio Padrão (DP) e Coeficiente de Variação (CV) para cada ensaio.
11. Teste de Reprodutibilidade: Teste em que um dos parâmetros é modificado para avaliar
o comportamento analítico do reagente como, por exemplo, teste realizado em dia diferente, por
operador diferente, lotes diferentes de reagentes, etc.
12. Teste de Campo: teste de rotina que simula a utilização do produto no Laboratório
Clínico, de forma a avaliar o seu desempenho a partir de parâmetros pré-estabelecidos.
Se o reagente é aprovado nos testes citados, possui desempenho adequado para o uso em
Laboratório Clínico.
3.10. A importância do Lactato no Diagnóstico Clínico
“O ácido láctico ou íon lactato, um intermediário no metabolismo dos
carboidratos, é proveniente do músculo esquelético, cérebro e
eritrócitos. A concentração de lactato sangüíneo é dependente da sua
produção e degradação no fígado, rins e músculos esqueléticos. Ao
redor de 30% do lactato formado é utilizado no fígado,
predominantemente na glicogênese para a produção da glicose.
Aumentos moderados na formação de lactato resultam no incremento
da depuração do lactato hepático. No entanto, a captação fica saturada
quando as concentrações excedem dois mmol/L, por exemplo, durante
o exercício intenso, as concentrações de lactato podem aumentar
significativamente de uma média de 0,9 mmol/L para mais de vinte
mmol/L em apenas dez segundos. Não existe uniformidade quanto aos
teores de Lactato que caracterizam a acidose láctica. Níveis de lactato,
excedendo cinco mmol /L e pH sangüíneo <7,25, indicam acidose
láctica.” (MOTTA. 2003)
A acidose láctica se apresenta em duas condições clínicas diversas:
Tipo A (hipóxica): Esse é o tipo mais comum. Associada com a redução de oxigenação
tecidual (hipóxia) encontrada em exercícios severos, convulsões, pobre perfusão tecidual (hipotensão,
insuficiência cardíaca, parada cardíaca), conteúdo de oxigênio arterial reduzido (asfixia, hipoxemia,
toxicidade pelo monóxido de carbono e anemia por deficiência de ferro severa).
Tipo B (metabólica): Associada com doença subjacente: diabetes melitus, malignidade
(leucemias, linfomas e câncer de pulmão), hepatopatia, acidose respiratória, cetoacidose respiratória,
infecções (malária, e cólera) insuficiência renal, feocromocitoma, deficiência de tiamina, intolerância a
proteínas do leite, pancreatite e sepse. Fármacos/toxinas/infusões: antiretrovirais, ácido valpróico,
agentes beta-adrenérgicos, cocaína, etanol, metanol, salicilatos, nitroprussianos, fenformin,
catecolaminas, frutose e sorbitol. Acidose láctica congênita: defeitos na gliconeogênese (deficiência de
glicose 6-fosfatase ou piruvato carboxilase), no metabolismo do piruvato (deficiência da piruvato
desidrogenase ou piruvato carboxilase), deficiência da fosforilação oxidativa mitocondrial e acidúria
metilmalônica. O tipo B pode ser dividido em três subtipos:
Tipo B1: ocorre em associação à doença subjacente.
Tipo B2: promovida por fármacos.
Tipo B3: devida a erros inatos do metabolismo.
“O mecanismo da acidose láctica tipo B não é conhecido, mas
acredita-se que o defeito primário seja o impedimento mitocondrial na
utilização do oxigênio que produz os estoques de ATP e NAD+, com
acúmulo de NADH e H+. Em presença de perfusão hepática reduzida
ou enfermidade hepática, a remoção do lactato é diminuída
provocando o agravamento da acidose láctica.” (MOTTA. 2003)
“O teor de lactato no LCR (líquido céfalo-raquidiano)
normalmente varia de forma paralela aos encontrados no sangue. Em
alterações bioquímicas no LCR, entretanto, o lactato altera de forma
independente dos valores sanguíneos. Níveis aumentados no LCR são
encontrados
em
acidentes
cerebrovasculares,
hemorragia
intracraniana, meningite bacteriana, epilepsia e outras desordens do
SNC. Na meningite asséptica (viral), os níveis de lactato no LCR não
elevam. (Motta) O aumento da concentração de lactato no sangue é
um indicador do metabolismo anaeróbico, isto é, diminui o fluxo
sanguíneo aos tecidos e a diminuição do oxigênio é insuficiente.
Graves insuficiências de oxigênio podem originar “Acidose Láctica”.
O L-lactato pode, portanto ser utilizado como um indicador da
gravidade da insuficiência circulatória.” (SHIMOJO. et al..1991)
Na coleta sanguínea, como o lactato é produzido pela glicólise nas hemácias, o sangue deve
ser colhido na presença de fluoreto obtendo-se assim o plasma fluoretado, e centrifugado rapidamente.
Apenas após estes cuidados o lactato ficará estável 14 dias se armazenado de 2 a 8 oC. Ainda, como há
presença de lactato na saliva humana, deve-se utilizar máscara e evitar conversar próximo ao local de
ensaio e proceder com rigorosa higienização dos materiais de laboratório.
Tabela 1: Valores de Referência para o Lactato.
Amostra
Plasma
LCR
mg/dL
4,5-19,8
4,5-14,4
mmol/L
0,5-2,2
0,5-1,6
Especificação
Venoso
Arterial
10-60
10-40
10-25
10-22
1,1-6,7
1,1-4,4
1,1-2,8
1,1-2,4
Neonato
De 3 a 10 dias
> 10 dias
Adulto
Conversão para Unidade do Sistema Internacional (SI):
Lactato (mg/dL) x 0,111 = Lactato (mmol/L)
3.11. O Reagente Lactato
O Kit de Lactato é destinado à determinação no plasma e líquido cefalorraquidiano (LCR).
O reagente de Lactato enzimático segue a metodologia TRINDER (1969 e 1972) (Lactato
Oxidase / Peroxidase), apresenta-se na forma MONOREAGENTE pronto para uso e contém um
calibrador protéico líquido e estável com valor definido, sendo adequado para a utilização em todos os
sistemas manuais e automatizados de bioquímica clínica.
O lactato da amostra sofre a ação da enzima lactato oxidase na presença de oxigênio,
produzindo piruvato e peróxido de hidrogênio. Este último, em presença de um reagente fenólico
(TOOS) e de 4-aminoantipirina, sofre a ação da peroxidade produzindo um cromógeno violáceo
(quinonimina) com máximo de absorção em 546 nm:
Lactato oxidase
L-Lactato + O2
Piruvato + H2O2
Peroxidase
H2O2 + 4-aminoantipirina + TOOS
Cromógeno + 2 H2O
Em outra metodologia, o lactato é oxidado a piruvato pela lactato desidrogenase (LDH) na
presença de NAD+. O NADH formado nesta reação é determinado por espectrofotometria em 340 nm
e serve como uma medida da concentração de lactato. (DURLIAT. 1976; MARTI. 1997)
3.11.1. Composição do Reagente
1 - Reagente: Tampão Pipes 200 mmol/L pH 6,8; Lactato Oxidase > 6.000 U/L; Peroxidase
> 2.500 U/L, 4-aminoantipirina 0,5 mmol/L; TOOS (N-etil-N-(2 hidroxi-3-sulfopropil)-3-metilanilina)
4 mmol/L; Triton X100 0,1% v/v.
2 - Calibrador: Contém; Albumina bovina 7% p/v; azida sódica 0,05% p/v e Lactato.
4. Resultados obtidos na Validação do Reagente de Lactato BioTécnica
De acordo com NOLL (1974), para assegurar a qualidade nos Laboratórios Clínicos é
necessário implementar um sistema de qualidade que inclua um conjunto de processos e o uso de
reagentes de qualidade. As determinações quantitativas na rotina laboratorial são realizadas por
instrumentos automatizados. Assim sendo, torna-se pré-requisito a elaboração de métodos de
padronização na indústria de diagnóstico tais como: comportamento cinético da reação, exatidão,
precisão e linearidade os quais foram avaliados durante o desenvolvimento da reagente enzimáticocolorimétrico de Lactato, que então permitiram avaliar o desempenho do produto segundo Manual de
Validação dos Produtos, BIOTÉCNICA (2006).
O comportamento cinético do reagente de lactato é de ponto final, ou seja, o produto formado
atinge ponto máximo de concentração e permanece inalterado por um determinado tempo em função
da estabilidade do produto (equilíbrio). A concentração do produto formado é medida através de
leituras fotométricas.
Na figura 1 encontram-se resultado do reagente de lactato durante o processo de validação:
Absorvância (546 nm)
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
1
2
3
4
5
Tem po (m inutos)
6
7
8
Figura 1 – Comportamento cinético do reagente de Lactato após adição de amostra biológica (Reação de Ponto Final)
O reagente apresentou ponto final da reação em três minutos e permaneceu estável até sete
minutos com absorvância de aproximadamente 0,500A. É preconizado que a reação atinja ponto final
no máximo em cinco minutos, sendo assim, o reagente em desenvolvimento atendeu a especificação.
Teste de repetibilidade onde forma obtidos os seguintes resultados: Média de 46,2 mg/dL,
Desvio Padrão de 2,14 mg/dL e Coeficiente de Variação de 4,64%. Os resultados podem ser
visualizados na Figura 2:
52,58
50,44
Valores
48,3
46,16
44,02
41,88
39,74
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Análises
Figura 2 – Teste de precisão mostrando a distribuição das vinte dosagens de uma amostra em torno da média no eixo Y e
com escalas de três desvios padrões abaixo e acima da média
No teste de precisão foi obtido coeficiente de variação de 4,64% atendendo ao determinado
pelo setor de Pesquisa e Desenvolvimento da BioTécnica e pelo Manual do Controle de Qualidade
BIOTÉCNICA (2008), que é de no máximo 5% e a dispersão das determinações em torno da média
não mostram tendências de elevação ou diminuição em determinações em seqüência. Além disto,
nenhuma delas ultrapassa os limites de três desvios padrões conforme especificações internas da
BioTécnica e Regras de WESTGARD (1981). A obtenção de baixo coeficiente de variação indica
baixo erro aleatório.
Os resultados obtidos no teste de linearidade estão demonstrados no Gráfico 3:
Absorvância (546 nm)
1,2
1
0,8
0,6
0,4
R2 = 0,9994
0,2
0
0
25
50
75
Concentração (m g/dL)
100
125
Figura 3 – Linearidade: correlação entre as absorvâncias obtidas e as concentrações de Lactato (Coeficiente de correlação
r = 0,9997)
No teste de linearidade os resultados obtidos mostram leituras de absorvâncias lineares no
intervalo de concentração de zero a 120 mg/dL e r= 0,9997 demonstrando comportamento linear neste
intervalo. Para este método o coeficiente de variação r foi maior que 0,99 conforme determinado no
Manual de Validação do setor de Pesquisa e Desenvolvimento da BioTécnica.
Os resultados obtidos no teste de exatidão encontram-se na Tabela 2.
Tabela 2 - Exatidão: determinação da concentração de Lactato em relação aos soros controles e seus respectivos desvios em
relação ao valor esperado (Recuperação)
Amostra
Soro Controle um
Soro Controle dois
Soro Controle três
Valor obtido
11,8 mg/dL
38,2 mg/dL
13,8 mg/dL
Valor esperado
11,4 mg/dL
37,9 mg/dL
13,7 mg/dL
Desvio
3,50%
0,79¨%
0,73%
Recuperação
103,5%
99,21%
99,27%
O teste apresentou desvios de 3,5%, 0,79% e 0,73% para os soros controles um, dois e três
respectivamente, demonstrando baixo erro sistemático em relação ao valor esperado e de acordo com o
preconizado no Manual de Validação de produtos da BioTécnica que é de 10% para este analito.
Os resultados obtidos no Teste de Estabilidade do Calibrador de Lactato estão demonstrados
na Figura 4:
Estabilidade CALIBRADOR - Lactato
60,00
55,00
Concentração (mg/dL)
50,00
45,00
40,00
35,00
30,00
2 a 8 oC Plástico
37oC Plástico
37oC Vidro
25,00
20,00
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Tem po ( dias)
Figura 4 – Teste de Estabilidade de Calibrador de Lactato em condições de estresse
(Absorvância em função do Tempo em dias)
No teste de Estabilidade do Calibrador de Lactato a concentração inicial foi de 38,0 mg/dL.
Após sete dias, as amostras de Calibrador que foram colocadas em estufa a 37ºC obtiveram queda na
concentração para 37,1 mg/dL (em frasco de plástico) e para 37,4 mg/dL (em frasco de vidro) não
sendo esta queda significativa devido às variações intra-ensaio, que são da ordem de aproximadamente
3% (~1,11 mg/dL) e variações de calibração do equipamento da ordem de 5% (~1,85%). Na amostra
refrigerada a concentração obtida após sete dias foi de 41,8 mg/dL. Após 20 dias as amostras
obtiveram mesma concentração. Após 27, 34 e 41 dias a amostra de Calibrador de Lactato em
condição de estresse e em frasco de vidro obteve uma queda significativa na concentração. Portanto o
Calibrador de Lactato tem maior estabilidade quando envasado em frasco plástico, mesmo em
condições de estresse.
Os resultados obtidos no Teste de Sensibilidade Metodológica do Reagente de Lactato estão
demonstrados na Tabela 3 e na Figura 5:
Tabela 3 - Dados referentes à Figura 5: Teste de Sensibilidade Metodológica do Reagente de Lactato
Média de cinco replicatas(mg/dL)
1,66
3,4
6,46
12,7
24,82
CV (%)
3,30
0
1,38
0,56
1,96
Figura 5 – Análise Estatística do Teste de Sensibilidade Metodológica do Reagente de Lactato. Gráfico da média das
dosagens de amostras de baixa concentração de Lactato em função do Coeficiente de Variação (CV) de tais amostras
Os resultados obtidos no Teste de Sensibilidade (ou limite de detecção) Metodológica do
Reagente de Lactato, de acordo com a Tabela 3 e a Figura 5, mostram uma replicata de maior
Coeficiente de Variação foi a média de 1,66 mg/dL, sendo este valor aproximado a sensibilidade o
Reagente de Lactato, já que a sensibilidade se refere a variação da resposta de um método de medição
que é possível se medir.
Os resultados obtidos no Teste de Correlação do Reagente de Lactato BioTécnica
(Metodologia Trinder) em relação a um reagente de Lactato (Metodologia LDH UV – Lactato
Desidrogenase Ultra violeta), estão demonstrados na Figura 6:
Teste de Correlação - Lactato
120
LDH UV (mg/dL)
100
80
60
Y = 0,945X + 2,1316
2
R = 0,9946
R = 0,9973
40
20
0
0
20
40
60
80
100
120
Biotécnica LOD POD (mg/dL)
Figura 6 - Teste de Correlação do Reagente de Lactato Trinder BioTécnica e Reagente de Lactato LDH UV (Lactato
Desidrogenase – Ultra violeta)
No Teste de Correlação do Reagente de Lactato Trinder BioTécnica que apresenta como
princípio do método a reação do Lactato com a Lactato oxidase e a Peroxidase e leitura em
espectrofotômetro em 546 nm com um reagente de Lactato que tem como princípio do método a
oxidação do Lactato pela Lactato Desidrogenase e leitura em 340 nm, o r obtido foi de 0,9973
demonstrando comportamento linear e atendendo aos requisitos do Manual de Validação de Reagente
da BioTécnica que é de r no mínimo de 0,99. O reagente Lactato BioTécnica apresentou valores
correspondentes aos obtidos pelo reagente de Lactato LDH UV.
Os resultados obtidos no Teste de Reprodutibilidade encontram-se na Tabela 3:
Tabela 4 - Teste de Reprodutibilidade do Reagente de Lactato BioTécnica
Teste de Reprodutibilidade
Tempo (dias)
Resultados (mg/dL)
Um
Dois
Três
Quatro
Cinco
Média (mg/dL)
Desvio Padrão (mg/dL)
Coeficiente de Variação (%)
27,35
29,20
30,26
28,60
29,41
28,96
1,08
3,73
No Teste de Reprodutibilidade um dos parâmetros é modificado para avaliar o comportamento
analítico do reagente. No caso dos resultados apresentados na Tabela 4 o teste foi realizado usando um
mesmo sistema analítico (Equipamento, operador, calibrador, etc) variando-se somente o dia. Foi
obtido coeficiente de variação de 3,73% atendendo as especificações do Manual de validação do setor
de Pesquisa e Desenvolvimento da BioTécnica que é de no máximo 5%. Este resultado demonstra que
o sistema analítico, que inclui o reagente em análise é estável mesmo após um determinado intervalo
de tempo.
5. Considerações Finais
Neste trabalho foram revisadas as características gerais das enzimas e exploradas as suas
diversas aplicações na ciência e na indústria. Atenção especial foi dada à aplicação destas em
diagnóstico molecular conforme explicações mais detalhadas que seguem.
Após a pesquisa e o desenvolvimento de metodologia Trinder para a dosagem do Lactato (um
analito plasmático encontrado em diversas patologias ou situações de estresse físico), a formulação
proposta para o produto apresentou desempenho adequado, demonstrado nos testes de: exatidão,
sensibilidade, especificidade, estabilidade, linearidade, reprodutibilidade, etc.
O desenvolvimento do reagente para dosagem de Lactato foi possível devido à alta
especificidade enzimática que utiliza enzimas como a Peroxidase e a Lactato oxidase, demonstrando a
importante aplicação das enzimas no Diagnóstico Molecular dentre as diversas áreas. A otimização e
estabilização das enzimas em meio líquido foi possível através da formulação desenvolvida na
BioTécnica de acesso restrito. Verificou-se que a metodologia enzimática-colorimétrica para dosagem
de lactato atendeu de modo satisfatório a determinação para o Diagnóstico Clínico, o que possibilitou
sua utilização na rotina laboratorial. Os procedimentos de validação, Controle de Qualidade e controle
estatístico foram perfeitamente aplicáveis a essa metodologia e forneceram dados que garantem a
qualidade do processo analítico. Os laboratórios puderam, então, adquirir reagentes confiáveis para a
determinação de lactato dos seus pacientes.
A prevenção de erros no desenvolvimento do reagente enzimático implica na criação de
Processos Analíticos capazes de atingir os requisitos da qualidade para a Produção de reagentes e
consequentemente resultados de utilidade médica. É uma atitude que determina a qualidade inerente
dos processos de medidas.
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