UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ANIMAL
DESENVOLVIMENTO DE NANOPARTÍCULAS DE
QUITOSANA CONTENDO O PEPTÍDEO CITOLÍTICO
MELITINA PARA O TRATAMENTO IN VITRO E IN VIVO DE
CÉLULAS TUMORAIS DE MAMA
KELLIANE ALMEIDA DE MEDEIROS
Orientador: Luciano Paulino da Silva
Brasília – DF
Julho, 2015
UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ANIMAL
DESENVOLVIMENTO DE NANOPARTÍCULAS DE
QUITOSANA CONTENDO O PEPTÍDEO CITOLÍTICO
MELITINA PARA O TRATAMENTO IN VITRO E IN VIVO DE
CÉLULAS TUMORAIS DE MAMA
KELLIANE ALMEIDA DE MEDEIROS
Tese de doutorado submetida ao
Programa de Pós-Graduação em
Biologia Animal da Universidade de
Brasília, como parte integrante dos
requisitos para a obtenção do título de
Doutora em Biologia Animal.
Orientador: Luciano Paulino da Silva
Brasília – DF
Julho, 2015
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RESUMO
O câncer de mama é considerado o tipo de câncer que tem maior incidência em
mulheres nos países em desenvolvimento. O tratamento mais comum para os cânceres é
com quimioterápicos isoladamente ou em associação a outros procedimentos, que têm
revelado diversos efeitos colaterais adversos ao organismo. Por isso, novas formas de
tratamento são necessárias. Biomoléculas encontradas em animais tem se revelado
alternativas aos quimioterápicos. Dentre as biomoléculas, o peptídeo melitina é
citotóxico e não seletivo devendo, assim, ser aprisionado em nanossistemas utilizando
polímeros e, ainda, ser direcionada a célula-alvo, por meio de moléculas como
peptídeos. Dentre os polímeros, a quitosana (QS) é utilizada por ser biocompatível e
biodegradável. A QS, quando na presença de ânions como o tripolifosfato de sódio
(TPP), forma nanopartículas espontaneamente pelo método de geleificação iônica. As
nanopartículas de QS têm tendência à aglomeração, assim é necessária a adição de
copolímeros como o polietilenoglicol (PEG). O presente estudo teve como objetivo
desenvolver nanopartículas de QS e PEG com peptídeo direcionador visando à liberação
sustentada in vitro e in vivo de melitina a células tumorais de mama. Assim, foi extraída
a melitina da peçonha de Apis mellifera e sintetizados peptídeos direcionadores. Esses
peptídeos foram associados em nanopartículas, que foram testadas in vitro e in vivo.
Todas as nanopartículas foram polidispersas e aumentavam de tamanho de acordo com
o aumento nas concentrações de TPP e PEG. Nos testes in vitro, notou-se que a melitina
livre foi citotóxica, enquanto os dois peptídeos direcionadores não foram citotóxicos.
Apenas as nanopartículas formuladas com 2 mg/mL de TPP foram tóxicas apenas
quando continham melitina associada. Em outra abordagem experimental, a melitina foi
substituída nas nanopartículas pela peçonha da abelha parcialmente hidrolisada e um
novo peptídeo presente nesta. Foi observado que a peçonha perde a citotoxicidade com
a hidrólise parcial. Assim, foram escolhidas as formulações com 2 mg/mL de TPP e
13,3 mg/mL de PEG 2000 homogeneizados em ultraturrax para os testes in vivo. As
análises in vivo tiveram início com a comparação do implante de células ectópico
(flanco) em relação ao ortotópico (4ª mama). Não foram observadas células neoplásicas
nos órgãos analisados em nenhum tipo de implante e o ortotópico foi escolhido por
formar único e uniforme tumor, o que facilita o tratamento intratumoral. As análises in
vivo seguiram com o implante ortotópico na 3ª mama, o qual apresentou
desenvolvimento diferente, mais agressivo, o que levou muitos animais a óbito. Houve
metástase na forma de pólipos, ao longo do peritônio dos animais, mas não foram
observadas células neoplásicas nos órgãos analisados. Os animais tratados com melitina
livre e nanopartícula contendo melitina (completa) não apresentaram pólipos. Todos os
animais apresentaram alterações hematológicas e os animais que receberam os
tratamentos com melitina e completa apresentaram alterações bioquímicas. Ainda houve
alterações histopatológicas evidenciando dano no fígado em todos os grupos, hemólise
em alguns órgãos no tratamento com melitina livre e maior regressão de células
neoplásicas no tratamento com melitina em relação ao tratamento com nanopartícula. A
atuação imediata da melitina livre na inibição tumoral, em relação às nanopartículas
completa, também foi confirmada com a maior expressão de proteínas antitumorais.
Contudo o tratamento com nanopartículas de quitosana contendo melitina foi menos
agressivo para o organismo, por não causar hemólise, e foi ativo sobre células
neoplásicas de mama.
Palavra-chave: Tumor de mama; melitina; nanopartícula de quitosana; in vitro e in vivo.
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ABSTRACT
Breast cancer is considered the cancer that has a higher incidence in women in
developing countries. The most common treatment for cancers is with chemotherapy
alone or associated with other treatments, which has revealed many adverse side-effects
in the body. Therefore, new treatments are needed. Biomolecules found in animals has
proven alternatives to chemotherapy. Among biomolecules, the melittin peptide is
cytotoxic and not selective, should be entrapped in nanosystems using polymers and,
also, be directed to targets using molecules, such as peptides. Among the polymers, the
chitosan (QS) is used to be biocompatible and biodegradable. QS, in the presence of
anions such as sodium tripolyphosphate (TPP), form spontaneously nanoparticles by
ionic gelation method. The QS nanoparticles tend to agglomerate, so it is necessary to
add copolymers such as polyethylene glycol (PEG). This study aimed to develop
nanoparticles with PEG and QS and driver peptide at sustained release in vitro and in
vivo of melittin to breast tumor cells. So, it was extracted melittin from the venom of
Apis mellifera and synthesized driving peptides. These peptides were associated in
nanoparticles, which were tested in vitro and in vivo. All nanoparticles were
polydisperse increased in size and in accordance with the increase in TPP and PEG
concentrations. In in vitro tests, it was noted that the free melittin was cytotoxic,
whereas both driving peptides were not cytotoxic. The nanoparticles formulated with 2
mg/mL of TPP were toxic only when were associated melittin. In another experimental
approach, melittin was replaced in nanoparticles by the partially hydrolyzed bee venom
and a new peptide present in this venom. It was observed that the venom loses
cytotoxicity when partially hydrolyzed. Thus, the formulations were selected with 2
mg/mL of TPP and 13.3 mg/mL PEG 2000 homogenized in the ultraturrax for in vivo
tests. The in vivo tests were started by the comparison of the ectopic cells implant
(flank) over the orthotopic (4th breast). Neoplastic cells were not observed in organs
examined on either type of implant and orthotopic was chosen to form unique and
uniform tumor, which facilitates the intratumoral treatment. In vivo analyses followed
with orthotopic implantation in the 3rd breast, which presented different development,
more aggressive, leading many animals to dye. There were metastasis in the form of
polyps along the peritoneum of the animals, but not observed cancer cells in analyzed
organs. The animals treated with free nanoparticles containing melittin and melittin
(complete) showed no polyps. All animals showed hematological changes and the
animals that received the treatments with melittin and complete had biochemical
changes. All the animal groups still showed histopathological changes associated with
damages in the liver, hemolysis in some organs in the treatment with free melittin and
enhanced regression of neoplastic cells on the treatment with melittin when compared
treatment with the nanoparticle. Immediate action of free melittin in tumor inhibition,
compared to the full nanoparticles was confirmed with the highest expression of antitumor proteins. However, the treatment with chitosan nanoparticles containing melittin
was less aggressive to the body, does not cause hemolysis, and was active on neoplastic
breast cells.
Keyword: breast tumor; melittin; chitosan nanoparticle; in vitro and in vivo.
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