UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
XANA RAQUEL ORTOLAN
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL OSTEOGÊNICO DE CHALCONAS
Itajaí
2013
0
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
XANA RAQUEL ORTOLAN
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL OSTEOGÊNICO DE CHALCONAS
Dissertação submetida à Universidade do
Vale do Itajaí como parte dos requisitos para
a obtenção do grau de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.
Orientador: Fátima de Campos Buzzi
Co-orientador: Rogério Corrêa
Itajaí, Dezembro de 2013
1
DEDICATÓRIA
Ao amigo professor Telmo José Mezadri,
Estivemos lado a lado por todos esses anos. Ensinou-me a aprender, a
refletir, a pesquisar, a decidir e a interrogar... Mostrou-me um caminho
que não tem fim. Presenteou-me com o que ninguém jamais poderá me
roubar: o conhecimento.
2
AGRADECIMENTOS
A minha orientadora, Fátima de Campos Buzzi, por ser uma grande guia, responsável pela
missão que agora se cumpre. As indicações, dicas e correções compõem uma somatória
fundamental não só para a construção do pensamento, mas como para a maturidade de toda
uma vida a seguir.
Aos professores da banca, Rogério Corrêa, Sérgio Faloni de Andrade, Clóvis Antonio Rodrigues
e Ricardo José Nunes, sempre disponíveis e dispostos a ajudar.
Ao professor David Rivero Tames. Aquele que, quando simplesmente deveria ser professor, foi
mestre, transmitindo seus conhecimentos e experiências. E que, quando mestre, foi amigo,
apoiando, compreendendo, inspirando, provocando e incentivando-me a trilhar outros caminhos.
As minhas amigas, dentro e fora dos laboratórios, Maria, Bia, Vanessa, Bruna e Jú, pelos
momentos que dividimos juntas, tornando minha caminhada mais leve.
Aos meus irmãos, Katiane Ortolan e Matheus Grigol Ortolan que com muita sabedoria,
discernimento, bom senso e dedicação estiveram sempre ao meu lado, encorajando nas horas
difíceis e aplaudindo nos momentos de glória. Obrigada por serem pessoas corretas e
competentes, fontes de inspiração, apoio e ensino diário.
Aos meus pais, Arildo Jorge Ortolan e Ivanete Grigol Ortolan, que me deram a vida e me
ensinaram a vivê-la com dignidade. Que iluminaram meus caminhos com afeto e dedicação para
que os trilhasse sem medo e cheia de esperanças. Que se entregaram por inteiro e renunciaram
aos seus sonhos, para que, muitas vezes, eu pudesse realizar os meus. Por serem exemplos de
integridade e serenidade.
À Willian Braz Hannecker, não tenho palavras para agradecer. Procuro arduamente uma forma
verbal de exprimir uma emoção ímpar. Uma emoção que jamais seria traduzida por palavras.
3
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL OSTEOGÊNICO DE CHALCONAS
Xana Raquel Ortolan
Dezembro/2013
Orientador: Fátima de Campos-Buzzi, Doutora em Química (UFSC)
Co-Orientador: Rogério Corrêa, Doutor em Química Orgânica (UFSC)
Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas
Número de Páginas: 82
Introdução. As chalconas são compostos da via de biossíntese dos flavonóides e
apresentam atividades biológicas e farmacológicas como: anti-inflamatórias,
antioxidantes e moduladoras de vias de sinalização celular. Muitas investigações com
substâncias encontradas em plantas têm sido relatadas quanto à atividades de reparo
em tecidos não mineralizados, entretanto ainda são incipientes os estudos sobre a
utilização de moléculas bioativas na estimulação do reparo ósseo. Objetivos. Avaliar o
potencial osteogênico de chalconas, analisando a relação estrutura-atividade, o
comportamento celular, a qualidade do tecido ósseo formado em microscopia de luz e o
grau de fechamento das feridas provocadas. Métodos. As chalconas foram sintetizadas
seguindo a condensação aldólica de Claisen-Schmidt a partir da acetofenona variandose os benzaldeídos substituídos (H; 4-CH3; 4-OCH3; 4-Cl; 3,4-Cl2); conforme o princípio
de Topliss verificando-se uma possível relação estrutura-atividade. Para os testes in
vivo foram utilizados 170 ratos Wistar, fêmeas com 45 dias de idade, divididos em 17
grupos (n=10). O primeiro grupo não recebeu tratamento (controle); o segundo foi
tratado somente com veículo (vaselina); em outros 5 grupos aplicou-se as moléculas de
chalcona na concentração de 1%. Outros 5 grupos receberam aplicação das mesmas
moléculas na dose de 5%; e os demais 5 grupos foram tratados da mesma forma na
concentração de 10%. No procedimento cirúrgico, os animais foram anestesiados e
tricotomizados na linha média da calota craniana, seguindo-se a incisão dos tecidos
moles. Com uma trefina cirúrgica de 5 mm de diâmetro, removeu-se um disco de tecido
ósseo, correspondendo a ferida crítica, local de aplicação do tratamento. Após 30 dias
da cirurgia, os animais foram eutanasiados, removendo-se para análise a área da ferida
crítica e o tecido adjacente. Após descalcificação das amostras com EDTA, realizaramse fotografias para mensurar a área remanescente das feridas com ajuda do programa
Image J. Os dados quantitativos foram tratados estatisticamente através do método de
ANOVA seguido pelo teste Student - Newman - Keuls e as lâminas analisadas
qualitativamente em microscopia de luz transmitida. O projeto pesquisa recebeu
aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais da UNIVALI, sob parecer 0402011. Resultados. Os dados mostram que os grupos controle e veículo apresentaram
neoformação óssea limitada, sem resultados significativos entre si quanto ao
fechamento da ferida óssea. As superfícies de reparo apresentaram-se revestidas por
células inativas, demonstrando baixa atividade em relação à osteogênese. Ainda, no
grupo veículo notou-se a presença de infiltrado inflamatório. Nos grupos tratados com
as moléculas de chalcona a 1%, as células presentes nas bordas ósseas mostram-se
com características de atividade, indicando continuidade do reparo. Nessa
concentração, somente os grupos tratados com as moléculas C3, C4 e C5
apresentaram resultados significativos quanto ao fechamento da ferida quando
comparadas ao grupo controle. A 5%, as moléculas C3, C4 e C5 mostraram resultados
estatisticamente significativos quanto a área das feridas remanescentes em relação aos
grupos controle e veículo, embora o resultado de todas as moléculas mostraram
4
osteoblastos ativos nas superfícies ósseas, indicativo de atividade secretora dessas
células. A concentração de 10% foi a mais efetiva para todas as moléculas analisadas.
Nessa dose, todas mostraram resultados significativos em relação aos grupos controle,
veiculo e ao grupo tratado a 1%, demonstrando uma relação dose-dependente em todas
as moléculas. A análise histológica mostrou osteoblastos ativos nas bordas do defeito
crítico em todos os grupos tratados nessa concentração, sendo que, os grupos C4 e C5
mostraram características de osso secundário. Não houve diferenças significativas entre
as moléculas em uma mesma concentração. A molécula não substituída mostrou-se
mais efetiva quanto a osteogênese, demonstrando que o efeito estéreo é mais
significativo que os efeitos hidrofóbicos e eletrônicos de acordo com a relação proposta
por Topliss. Conclusão. As chalconas estudadas apresentam potencial osteogênico,
algumas, entretanto, mostram que o reparo ósseo acontece mais rapidamente. Dessa
maneira, estas moléculas podem representar uma perspectiva farmacológica na
aceleração do processo de osteogênese.
Palavras-Chave: Chalconas, Osteogênese, Síntese Orgânica.
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EVALUATION OF THE OSTEOGENIC POTENTIAL OF
CHALCONES
Xana Raquel Ortolan
December/2013
Supervisor: Fatima Campos Buzzi, PhD in Chemistry (UFSC)
Co-Supervisor: Rogério Correa, PhD in Organic Chemistry (UFSC)
Area of Concentration: Natural Products and Synthetic Bioactive Substances
Number of Pages: 82
Introduction. Chalcones are compounds of the flavonoid biosynthetic pathway and
exhibit biological and pharmacological activities such as anti-inflammatory and
antioxidant activities and modulation of the cell signaling pathways. Many investigations
have been reported using substances found in plants, in terms of the activities of nonmineralized tissue repair’ However studies on the use of bioactive molecules in the
stimulation of bone repair are still in their infancy. Objectives. To evaluate the
osteogenic potential of chalcones, analyzing the structure-activity relationships, cell
behavior, and quality of bone tissue by light microscopy and the degree of closure of
wounds. Material and Methods. The chalcones were synthesized by Claisen-Schmidt
aldol condensation from acetophenone, varying the substituted benzaldehydes (H, 4CH3, 4 -OCH3, 4-Cl, 3,4-Cl2), according to the Topliss principle, to verify a possible
structure-activity relationship. For the in vivo tests, 170 female Wistar rats were used, 45
days old, divided into 17 groups (n = 10). The first group received no treatment (control),
the second group was treated only with vehicle (Vaseline), and five other groups
received the chalcone molecules at a concentration of 1%. Another group received the
same 5 molecules at a dose of 5%, and the remaining 5 groups were treated in the same
manner, at a concentration of 10%. During the surgical procedure, the animals were
anesthetized and shaved on the midline of the skull, followed by an incision of the soft
tissue. Using a surgical trephine 5 mm in diameter, a disc of hard bone tissue was
removed corresponding to a critical wound at the site of application of the treatment.
Thirty days after surgery, the animals were euthanized, removing for analysis the critical
wound area and surrounding tissue. After decalcification of the samples with EDTA,
photographs were taken to measure the remaining area of the wounds, using the
software program Image J. Quantitative data were statistically analyzed by the ANOVA
test followed by the Student-Newman-Keuls test, and the slides were qualitatively
analyzed under transmitted light microscopy. The research project was approved by the
Ethics Committee on the Use of Animals of UNIVALI, under opinion no. 040-2011.
Results. The data show that the control and vehicle groups showed limited formation of
new bone, without significant differences between them as to the closure of the bone
wound. The repair surfaces presented inactive cells, showing low activity in terms of
osteogenesis. Furthermore, in the vehicle group, the presence of inflammatory infiltrate
was noted. In the groups treated with the 1% chalcone molecules, the cells present at
the bone borders showed features of activity, indicating continuity of the repair. At this
concentration, only the groups treated with molecules C3, C4 and C5 showed significant
results in relation to wound closure, compared with the control group. At 5%, molecules
C3, C4 and C5 showed statistically significant results in relation to the remaining wound
area, compared with the control and vehicle groups, although all the molecules showed
active osteoblasts on the bone surfaces, indicative of secretory activity of these cells.
The 10% concentration was the most effective for all the analyzed molecules. At this
dose, all the molecules showed significant results compared with the control and vehicle
6
groups and the group treated at 1%, demonstrating a dose-dependent relationship in all
the molecules. Histological analysis showed active osteoblasts at the borders of the
critical defect in all the treated groups at this concentration, whereas the C4 and C5
groups showed characteristics of secondary bone. There were no significant differences
between the molecules at the same concentration. The unsubstituted molecule was
more effective in regard to osteogenesis, demonstrating that the stereo effect is more
significant than the hydrophobic and electronic effects, according to the relationship
proposed by Topliss. Conclusion. The chalcones studied showed osteogenic potential,
however, some showed faster bone healing. These molecules may, therefore, represent
a pharmacological prospect for accelerating the process of osteogenesis.
Keywords: Chalcones, Osteogenesis, Organic Synthesis
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrura geral das chalconas. .............................................................. 16
Figura 2. Mecanismo de reação de Claisen-Schmidt ........................................ 17
Figura 3. Síntese das chalconas ....................................................................... 32
Figura 4. Incisão dos tecidos moles. ................................................................. 36
Figura 5. Anatomia de calota craniana de uma amostra de um crânio de rato
Wistar indicando a região de confecção da ferida crítica. .................................. 37
Figura 6. Realização da ferida crítica com uma broca trefina sob irrigação com
soro fisiológico.................................................................................................... 37
Figura 7. Remoção do fragmento ósseo de 5mm compreendendo a ferida
crítica. ................................................................................................................. 37
Figura 8. Aplicação dos tratamentos com uma espátula. .................................. 38
Figura 9. Programa Image J utilizado para mensuração da área da ferida na
calota craniana do animal................................................................................... 39
Figura 10. Áreas das feridas remanescentes dos animais tratados com a
molécula C1 à 1%, 5% e 10% e dos grupos controle e veículo após 30 dias do
tratamento.. 44
Figura 11. Áreas das feridas remanescentes dos animais tratados com a
molécula C2 à 1%, 5% e 10% e dos grupos controle e veículo após 30 dias do
tratamento. ......................................................................................................... 45
Figura 12. Áreas das feridas remanescentes dos animais tratados com a
molécula C3 à 1%, 5% e 10% e dos grupos controle e veículo após 30 dias do
tratamento. ......................................................................................................... 46
Figura 13. Áreas das feridas remanescentes dos animais tratados com a
molécula C4 à 1%, 5% e 10% e dos grupos controle e veículo após 30 dias do
tratamento.. ........................................................................................................ 47
Figura 14. Áreas das feridas remanescentes dos animais tratados com a
molécula C5 à 1%, 5% e 10% e dos grupos controle e veículo após 30 dias do
tratamento. ......................................................................................................... 48
Figura 15. Áreas das feridas remanescentes dos animais tratados com as
moléculas na concentração de 1%. .................................................................... 49
8
Figura 16. Áreas das feridas remanescentes dos animais tratados com as
moléculas na concentração de 5%. .................................................................... 49
Figura 17. Áreas das feridas remanescentes dos animais tratados com as
moléculas na concentração de 10%. .................................................................. 50
Figura 18. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal
do grupo controle, 30 dias após o experimento. ................................................. 51
Figura 19. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal
do grupo veículo, 30 dias após o experimento. .................................................. 52
Figura 20. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal
do grupo veiculo, 30 dias após o experimento. .................................................. 52
Figura 21. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal
tratado com a molécula C1 a 1% 30 dias após o experimento........................... 53
Figura 22. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal
tratado com a molécula C1 a 5% 30 dias após o experimento........................... 53
Figura 23. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal
tratado com a molécula C1 a 10% 30 dias após o experimento. ........................ 54
Figura 24. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal
tratado com a molécula C2 a 1% 30 dias após o experimento........................... 55
Figura 25. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal
tratado com a molécula C2 a 5% 30 dias após o experimento........................... 55
Figura 26. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal
tratado com a molécula C2 a 10% 30 dias após o experimento. ........................ 56
Figura 27. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal
tratado com a molécula C3 a 1% 30 dias após o experimento........................... 57
Figura 28. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal
tratado com a molécula C3 a 5% 30 dias após o experimento........................... 57
Figura 29. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal
tratado com a molécula C3 a 10% 30 dias após o experimento......................... 58
Figura 30. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal
tratado com a molécula C4 a 1% 30 dias após o experimento........................... 59
Figura 31. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal
tratado com a molécula C4 a 5% 30 dias após o experimento........................... 59
Figura 32. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal
tratado com a molécula C4 a 10% 30 dias após o experimento. ........................ 60
9
Figura 33. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal
tratado com a molécula C5 a 1% 30 dias após o experimento........................... 61
Figura 34. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal
tratado com a molécula C5 a 5% 30 dias após o experimento........................... 61
Figura 35. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal
tratado com a molécula C5 a 10% 30 dias após o experimento. ........................ 62
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Valores dos parâmetros físico-químicos π e  e ambos
relacionados. ...................................................................................................... 21
Tabela 2. Ordem de potência para diversos parâmetros físico-quimicos
proposta por Topliss ........................................................................................... 22
Tabela 3. Proposta de Topliss para a seleção de novos substituintes em
função dos prováveis parâmetros mais ativos. ................................................... 23
Tabela 4. Tratamentos aplicados em cada um dos grupos experimentais. ....... 35
Tabela 5. Mostra a média±erro padrão das áreas das feridas 30 dias após
os tratamentos. ................................................................................................... 43
11
LISTA DE ABREVIATURAS
UNIVALI
Universidade do Vale do Itajaí
BMPs
Proteína(s) morfogenética(s) óssea(a)
rhBMP-2
Proteína morfogenética óssea recombinante humana
FGF
Fator de crescimento de fibroblastos
HE
Hematoxina e Eosina
PDGF
Fator de crescimento derivado das plaquetas
SF
Solução fisiológica
TGF
Fator de transformação do crescimento
TGF-β
Fator de crescimento de transformação beta
QSAR
Formulação quantitativa da relação estrutura atividade
EDTA
Ácido etilenodiamino tetra-acético
OCC
Osteocalcina
OPN
Osteopontina
OCN
Osteonectina
ALP
Fosfatase alcalina
pH
Potencial de Hidrogênio
CCD
Cromatografia de coluna delgada
UV
Ultravioleta
KBr
Brometo de potássio
Hz
Hertz
MHz
Megahertz
TMS
Tetrametilsilano
12
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 13
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ................................................................... 16
2.1 Chalconas ................................................................................................. 16
2.2 Relação estrutura-atividade ...................................................................... 19
2.3 Reparo ósseo ........................................................................................... 24
3 OBJETIVOS .................................................................................................... 31
3.1 Objetivo Geral ........................................................................................... 31
3.2 Objetivos Específicos................................................................................ 31
4 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................... 32
4.1 Síntese de Chalconas (1,3-difenilprop-2-em-1-onas) ............................... 32
4.1.1. Caracterização estrutural dos compostos ......................................... 33
4.2 Animais ..................................................................................................... 35
4.3 Procedimento cirúrgico e tratamento das feridas críticas ......................... 36
4.4 Procedimento macroscópico e técnica histológica.................................... 38
4.5 Análise macro e microscópica e tratamento estatístico ............................ 39
5 RESULTADOS ................................................................................................ 40
5.1 Chalconas ................................................................................................. 40
5.2 Análise macroscópica ............................................................................... 42
5.3 Análise Microscópica ................................................................................ 51
5 DISCUSSÃO ................................................................................................... 63
6 CONCLUSÃO .................................................................................................. 70
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 71
ANEXO ............................................................................................................... 79
13
1 INTRODUÇÃO
Os ossos são estruturas resistentes e rígidas que apesar do aspecto
inerte, crescem, remodelam-se e mantêm-se ativos durante toda a vida do
organismo. Quando lesados, como ocorre nas fraturas, são capazes de
reparação, fenômeno que demonstra sua permanente vitalidade. Em condições
normais a maioria das fraturas não apresenta problemas de consolidação, porém
existem situações em que o processo de reparo pode ser acelerado,
assegurando rápido retorno da função músculo-esquelética (RISO et al., 2010).
Doenças como a osteoporose, injúrias traumáticas, cirurgias ortopédicas,
ressecção de tumores primários, podem formar defeitos ósseos, constituindo-se
em uma ferida crítica quando não ocorre reparo espontâneo, necessitando de
materiais substitutos para preencher o tecido lesado.
Diante da perspectiva de acelerar o reparo ósseo, várias intervenções têm
sido estudadas com a finalidade de estimular o reparo de fraturas, acelerando a
osteindução, osteocondução e a osteointegração.
Alguns
mecanismos
correspondem ao
utilizados
transplante
no
autólogo,
tratamento
alogênico
músculo-esqueletais
ou
xenotransplantes,
entretanto esses métodos exigem controle rigoroso relacionado com a
transmissão de agentes infecciosos (PUTZIER et al., 2009; ZWITSER et al.,
2012).
Por outro lado, a engenharia tecidual tem proposto o uso de matrizes
extracelulares como suporte de órgãos possibilitando a função celular de
proliferação, migração e diferenciação no processo de regeneração óssea e
também o desenvolvimento de uma matriz inteligente, ou seja, sem adição de
moléculas componentes da superfamília TGF-β, que possa iniciar a cascata de
diferenciação celular para produzir tecido ósseo (RIPAMONTI, 2010).
Atualmente os principais medicamentos utilizados na prática clínica,
quando se trata de tecido ósseo, tem seu mecanismo de ação baseada na
reabsorção óssea ou na reposição de minerais que compõe o osso. Entretanto,
ainda não existe, um medicamento eficaz que promova a indução da formação
óssea (DIMITRIOU et al., 2011). Desta maneira, a síntese orgânica através do
desenvolvimento de moléculas bioativas mostra-se necessária para atender uma
14
demanda cada vez maior de desordens ósseas. Muitas classes de compostos
orgânicos tem apresentado efeitos biológicos promissores e a literatura cientifica
relata um crescimento significativo de novas moléculas com potencial similar ou
superior àquele de um fármaco (CECHINEL FILHO, et al. 2003).
Nesse sentido, as chalconas representam um grupo de compostos
intermediários ou produtos finais na biossíntese de flavonóides e são
extensivamente investigadas em virtude da alta aplicabilidade já encontrada.
Estudos farmacológicos de várias chalconas sintéticas, mostram potencial
antioxidante, antiinflamatório, citotóxico e quimiopreventivo em relação à células
cancerosas, antibacteriano, antifúngico antiviral, antiparasitário, analgésico e
osteogênico (BATOVSKA; TODOROVA, 2010; HAN; et al., 2010; VOGEL; et al.,
2010; ORTOLAN et al., 2013).
Diversos tipos de biomateriais e suas associações experimentais com
diversas substâncias vêm sendo estudados no processo de cicatrização. Um dos
modelos mais utilizados para estudar o potencial indutor de reparo ósseo é o da
ferida crítica que consiste em promover uma ferida cujas dimensões não
permitem seu reparo espontâneo e completo, assim, o modelo permite estudar,
com relativa segurança, a capacidade de substâncias orgânicas e/ou inorgânicas
de induzir o reparo ósseo quando implantadas dentro delas.
Muitas investigações com substancias isoladas de plantas tem sido
relatadas quanto à atividades de reparo em tecidos não mineralizados
(SASIDHARAN et al., 2011; MEZADRI et al., 2012; MANOJ, MURUGAN, 2012 ),
entretanto pouco se conhece sobre o uso no reparo de feridas ósseas.
Recentemente, Kim et al (2012), ao avaliar o potencial osteogênico da
licochalcona A demonstraram, em estudos in vitro e in vivo, que essa chalcona
apresenta atividade quanto a osteogênese, aumentando os níveis de fosfatase
alcalina e cálcio e interferindo na diferenciação celular, com uma possível
indução dos níveis da expressão de BMPs (Proteínas Morfogenéticas Ósseas).
Já, Tames et al. (2010) sugeriram indução de reparo ósseo da chalcona
1-fenil-3-(4-clorofenil)-2-propen-1-ona no modelo de ferida crítica em calota
craniana de ratos, uma vez que as feridas tratadas com essa molécula
apresentaram uma cicatrização significativamente maior do que as feridas
controle (sem tratamento).
15
Em continuidade aos estudos de Tames et al. (2010), este estudo
objetivou sintetizar e avaliar o potencial osteogênico de chalconas em modelo “in
vivo”, analisando o grau de fechamento das feridas, a morfologia celular,
qualidade do tecido recém formado e a possível relação estrutura-atividade.
16
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 Chalconas
As chalconas são substâncias químicas abundantemente encontradas em
plantas, tendo por característica a pigmentação amarela. Possuem importante
papel em sistemas ecológicos em função das cores que produzem nos vegetais,
auxiliando na polinização como atraentes de insetos e/ou pássaros (ZUANAZZI,
2001).
A estrutura química (Figura 1) das chalconas (1,3 difenil-2-propen-1-onas)
consiste de uma porção olefínica e a carbonila conjugadas, ligadas á
grupamentos aromáticos. Esses anéis são identificados como anel A (advindo da
cetona) e anel B (advindo do aldeído).
Quimicamente
são
conhecidas
como
cetonas
α-β-insaturadas
e
contrariamente à maioria outros flavonóides, o núcleo A das chalconas é
numerado com números ordinários seguidos de uma linha ( ‘ ) e o núcleo B
somente com números ordinários (CHIARADIA, 2008; RAHMAN, 2011).
Figura 1. Estrura geral das chalconas.
Teoricamente, essas moléculas podem existir nas conformações Z e E.
Entretanto, estudos demonstraram que em extratos vegetais, o produto
majoritário isolado é o isômero trans, uma vez que estes são considerados mais
estáveis termodinamicamente (CAMPOS-BUZZI et al., 2007; CORRÊA et al.,
2001).
As chalconas podem também, facilmente, ser obtidas de forma sintética
através da síntese orgânica, pela condensação de cetonas e aldeídos
17
aromáticos num processo conhecido como Claisen-Schmidt (EDDARIR et al.,
2003; LI et al., 2002).
A reação de condensação aldólica é uma reação geral para todas as
cetonas e aldeídos com átomos de hidrogênio alfa (α). A reação ocorre quando
uma base remove um hidrogênio alfa ácido de uma molécula de aldeído ou
cetona para formar o enolato, que se estabiliza por ressonância. O enolato ataca
uma outra molécula de aldeído ou cetona (na posição alfa ao grupo carbonila
eletrofílico) por adição nucleofílica e forma um íon alcóxido (intermediário
tetraédrico). A protonação do íon alcóxido gera o produto de condensação e
regenera o catalisador básico. A formação da enona conjugada ocorre por
desidratação, que pode ser catalisada por base ou por ácido. Em condições
básicas, um hidrogênio ácido é abstraído da posição α para dar um íon enolato
que elimina o grupo de saída –OH. Em condições ácidas, forma-se o enol, o
grupo –OH é protonado e a água, eliminada (Figura 2).
Figura 2. Mecanismo de reação de Claisen-Schmidt
Conforme Avila (2008), substâncias, muitas vezes de difícil produção
sintética, podem servir como protótipos para o desenvolvimento de novas
biomoléculas possibilitando a análise da relação estrutura atividade, assim como
permitem modificações em seu esqueleto com o intuito de torná-los mais
eficazes.
18
Desta maneira, as chalconas mostram-se uma fonte riquíssima e
interessante para a obtenção de novos princípios ativos, uma vez que além de
apresentar um amplo espectro de atividades biológicas possuem vantagens
sobre outros compostos naturais como a versatilidade sintética.
Campos-Buzzi et al. (2007) verificaram que a introdução de diferentes
grupos substituintes nos anéis aromáticos da chalcona causam drásticas
mudanças nas atividades biológicas.
Chiaradia et al (2008) descrevem que reações de substituição no anel A
e B de um hidrogênio por qualquer outro substituinte pode resultar em
compostos com propriedades farmacológicas totalmente distintas, é por isso que
o alvo principal dos pesquisadores está na variedade de substituintes que se
pode adicionar a estes anéis.
Diversos estudos tem revelado que algumas chalconas sintéticas simples
incluindo aquelas derivadas de produtos naturais, como a xantoxilina exibiram
um pronunciado efeito antinociceptivo em camundongos no teste de contrações
abdominais (BOECK et al., 2006). Ainda, Corrêa et al., (2008) investigando a
ação de três séries de chalconas, usando diferentes aldeídos e acetofenonas
substituídas,
mostraram
no
mesmo
modelo,
um
significativo
efeito
antinociceptivo quando comparado aos fármacos não esteroidais como aspirina,
paracetamol e diclofenaco.
Outro estudo conduzido por Lin et al. (2001) avaliou uma série de
flavonóides, chalconas e derivados em sua ação inibitória contra Mycobacterium
tuberculosis H37RV. Seis substâncias, nas séries sintetizadas, apresentaram
inibição do crescimento bacteriano maior que 90%. A presença de um
substituinte hidrofóbico em um dos anéis aromáticos e um grupo doador/aceptor
de hidrogênio no outro anel resultou no aumento da atividade antituberculose
das chalconas e derivados.
Dimmock et al. (1999) demonstraram que algumas chalconas apresentam
ação antimicrobiana, frente a bactérias e fungos. A introdução de grupos metóxi
ou 2-dietilaminoetoxi no anel A produziu substâncias que possuem atividade
bactericida e fungicida.
Ainda, uma variedade de chalconas e seus derivados apresentam
importante atividade citotóxica, com relação a diferentes linhas de células
19
tumorais (DIMMOCK et al., 1998; EDENHARDER et al., 1997 apud DIMMOCK et
al, 1999).
Por conseqüência das diversas atividades biológicas apresentadas pelas
chalconas, as quais variam conforme os diferentes substituintes, estas
moléculas são de grande interesse químico e farmacológico. As chalconas são
referenciados
por
efeitos
analgésico,
antiulcerogênico,
antioxidante,
imunomodulatório, antileucêmico, anti-inflamatório e osteogênico (KIM et al.,
2012, TAMES et al 2010, HAN et al., 2010; LIN et al., 2001; LUNARDI et al.,
2003; MOHAMAD et al, 2010; RAHMAN, 2011; VIANA; BANDEIRA;MATOS,
2003).
De acordo com a natureza dos substituintes, podemos classificar as
interações estruturais das chalconas quanto aos efeitos estéricos causados por
substituintes volumosos; aos efeitos eletrônicos decorrentes da diferença da
eletronegatividade entre átomos ou grupos subtituintes e aos efeitos hidrofóbicos
(CESARIN-SOBRINHO; NETTO-FERREIRA; BRAZ FILHO, 2001).
2.2 Relação estrutura-atividade
A relação estrutura atividade é o objeto de estudo da química medicinal,
que se configura como uma disciplina baseada na química, também envolvendo
aspectos biológicos, ciência médica e farmacêutica. Essa área de estudo
preocupa-se com a invenção, descobrimento, projeção, identificação e
preparação de novas entidades químicas biologicamente ativas (BARREIRO;
FRAGA, 2008).
Nesse contexto, a multi e a interdisciplinaridade são conceitos
fundamentais em relação a capacidade de produção de novos medicamentos.
Os químicos medicinais, depois de estabelecerem relações qualitativas e
quantitativas entre certas características estruturais (físico-químicas), podem
otimizar a produção de compostos bioativos com características farmacológicas
determinadas (TEUTSH, 1997).
A grande maioria dos fármacos deve sua atividade à sua ligação
específica a uma biomacromolécula ou alvo molecular, geralmente uma enzima
ou um receptor. As interações dos fármacos com estes sistemas biológicos é
20
dependente
de
fatores
relacionados
com
sua
estrutura
química
e,
consequentemente, de suas propriedades físico-químicas (TAVARES, 2004).
A modificação estrutural é um método muito utilizado para a obtenção de
estruturas farmacologicamente ativas ou para a otimização da ação destas
moléculas. Dependendo da estrutura protótipo, podem ser introduzidas
mudanças como a simplificação da estrutura, a conservação da mesma ou o
aumento desta pela incorporação de novos grupamentos (CECHINEL-FILHO,
YUNES, 2001).
Assim, dois fármacos com estrutura química semelhantes, diferenciandose apenas por um átomo ou posição que este ocupa na molécula, podem
apresentar
diferenças quanto
às
suas propriedades físico-químicas e,
conseqüentemente, quanto à atividade biológica (TAVARES, 2004).
Sabe-se que a substituição de um átomo de hidrogênio por um
determinado substituinte (grupo alquila, nitro, metil, metóxi, entre outros) pode
modificar profundamente a potência, duração e ainda o efeito farmacológico de
uma molécula.
Os estudos de correlação estrutura-atividade, fundamentados no efeito do
susbtituinte em um determinado anel aromático, são muito comuns na química
medicinal, uma vez que mais de 50% dos fármacos ou compostos bioativos
possuem esse tipo de anel. As modificações produzidas pela introdução de um
substituinte podem atingir várias propriedades físico-químicas da molécula, tais
como a hidrofobicidade, a densidade eletrônica, a conformação estrutural, as
propriedades farmacocinéticas, entre outros (CECHINEL-FILHO, YUNES, 2001).
Na química medicinal, um bom planejamento de fármacos permite
conseguir um grupo de substâncias-teste importante para realizar um tratamento
quantitativo da relação estrutura-atividade.
A formulação quantitativa da relação estrutura atividade (QSAR) foi
originalmente proposta por Hansch e Fujita em 1960, e desde então, a análise
QSAR evoluiu como ciência devido aos avanços que ocorreram nas últimas
décadas na área molecular (SANTOS-FILHO et al., 2009).
As pesquisas na área de QSAR têm como principal objetivo a construção
de modelos matemáticos que relacionem a estrutura química e a atividade
biológica de uma série de substâncias análogas. A construção dos modelos
requer a elaboração de conjunto ou matriz de dados contendo a medida
21
quantitativa da atividade biológica e os parâmetros físico-químicos e estruturais
capazes de descrever suas propriedades (POLANSKI, 2009).
O estudo de QSAR propõe que a ação de um fármaco pode ser dividido
em dois estágios: o transporte para seu sítio de ação e a ligação ao mesmo.
Assim, a atividade biológica está associada às mudanças de energia livre que
ocorrem nos processos de absorção, distribuição e biotransformação ou à
própria interação fármaco-receptor, sendo esse o paradigma que fundamenta o
estudo de QSAR. Este fenômeno poderia ser explicado por modelos
matemáticos simples ou multiparamétricos, em que a atividade biológica pode
ser determinada por parâmetros que medem a influência de cada uma das
propriedades (LIMA NETO, et al., 2006).
Já Topliss (1977), sugere um método não estatístico baseado no fato de
que alguma correlação quantitativa deve existir entre atividade biológica, a
hidrofobicidade e a descrição molecular eletrônica dos substituintes aromáticos
(YUNES et al., 2002).
O método manual consiste na análise dos resultados da atividade
farmacológica de cinco compostos que possuam anel aromático na sua estrutura
e que estejam presentes os seguintes substituintes: H, 4-Cl, 3,4-Cl2, 4-CH3 e 4 –
OCH3 (CECHINEL-FILHO; NUNES; YUNES, 1993).
A avaliação da atividade biológica está relacionada aos parâmetros
hidrofóbicos (), eletrônicos () e estéricos (Es) conforme demonstrados na
tabela 1.
Tabela 1. Valores dos parâmetros físico-químicos π e e ambos relacionados.
Substituinte
π
σ
π-σ
2 π - σ π -2 σ π -3 σ
-σ
π+ σ
H
0
0
0
0
0
0
0
0
4-Cl
0.71
0.23
0.48
1.19
0.25
0.02
-0.23
0.94
3,4-Cl2
1.25
0.52
0.73
1.98
0.21
-0.31
-0.52
1.77
4-CH3
0.56 -0.17
0.73
1.29
0.90
1.07
0.17
0.39
4-OCH3
0.02 -0.27
0.25
0.23
0.52
0.79
0.27
-0.29
3-CF3,4-Cl
1.59
0.66
0.93
2.52
2.91
-0.39
-0.66
2.25
3-CF3,4-NO2
0.60
1.21
-0.61
-0.01
-1.82
-2.97
-1.21
1.81
4-CF3
0.88
0.54
0.34
1.22
-0.20
-0.74
-0.54
1.42
2,4-Cl2
1.42
0.46
0.96
2.38
0.50
0.04
-0.46
1.88
c-C5H9
2.14
0.02
2.16
4.30
2.18
2.20
0.02
2.12
c-C6H11
2.51 -0.22
2.73
5.24
2.95
3.17
0.22
2.29
4-CH(CH3)2
1.53 -0.05
1.58
3.11
1.63
1.68
0.05
1.48
4-C(CH3)3
1.98 -0.20
2.18
4.16
2.38
2.58
0.20
1.78
3,4-(CH3)2
0.99 -0.30
1.29
2.28
1.59
1.89
0.30
0.69
2π-π²
0
0.92
0.94
0.81
0.04
0.65
0.84
0.99
0.82
-0.30
-1.28
0.72
0.04
1.00
22
4-O(CH2)3CH3
4-N(C3H5)2
4-N(CH3)2
4-NH2
4-NHC4H9
4-OCH(CH3)2
3-CH3, 4-OCH3
4-Br
4-CF3
4-C2H5
4-O(CH2)2CH3
3-CH3, 4-Cl
3-Cl
3-CH3
3-OCH3
3-N(CH3)2
3,5-Cl2
2-Cl
2-CH3
2-OCH3
2-F
4-F
4-NHCOCH3
4-NHSO2CH3
4-NO2
4-COCH3
4-SO2CH3
4-CONH2
4-SO2NH2
1.55
1.18
0.18
-1.23
1.45
1.03
0.54
0.86
0.88
1.02
1.05
1.29
0.71
0.56
-0.02
0.18
1.25
0.71
0.56
-0.02
0.14
0.14
-0.97
-1.18
0.28
-0.55
-1.63
-1.49
-1.82
-0.32
-0.83
-0.83
-0.66
-0.51
-0.45
-0.26
0.23
0.43
-0.15
-0.25
0.17
0.37
-0.07
0.12
-0.15
0.75
0.23
-0.17
-0.27
0.06
0.06
0.00
0.03
0.78
0.50
0.72
0.36
0.57
1.87
2.01
1.01
-0.57
1.96
1.48
0.80
0.57
0.45
1.17
1.30
1.12
0.34
0.63
0.14
0.33
0.50
0.48
0.73
0.25
0.08
0.08
-0.97
-1.21
-1.16
-1.5
-2.32
-1.85
-2.39
3.42
3.19
1.19
-1.80
2.39
2.51
1.34
1.49
1.43
2.19
2.35
2.41
1.05
1.19
-0.16
0.51
1.75
1.19
1.29
0.23
0.22
0.22
-1.94
-2.39
-1.34
-1.60
-3.98
-3.34
-4.21
2.19
3.84
1.84
0.09
2.47
1.93
1.06
0.40
0.02
1.32
1.55
0.95
-0.03
0.70
-0.26
0.48
-0.25
0.25
0.90
0.52
0.02
0.02
-0.97
-1.24
-1.84
-1.55
-3.07
-2.21
-3.01
5.21
4.67
2.67
0.75
2.98
2.38
1.32
1.55
2.17
1.47
1.80
0.78
-0.30
0.77
-0.38
0.63
1.00
0.02
1.07
0.79
-0.04
-0.04
-0.97
-1.27
-2.62
-2.05
-3.79
-2.57
-3.53
0.32
0.83
0.83
0.66
0.51
0.45
0.26
-0.23
-0.43
0.15
0.25
-0.17
-0.37
0.07
-0.12
0.15
-0.75
-0.23
0.17
0.27
-0.06
-0.06
0.00
-0.03
-0.78
-0.50
-0.72
-0.36
-0.57
1.23
0.35
-0.65
-1.89
0.94
0.58
0.28
1.09
1.31
0.87
0.80
1.46
1.08
0.49
0.10
0.03
2.20
0.94
0.39
-0.29
0.20
0.20
-0.97
-1.15
0.50
-0.05
-0.72
-1.13
-1.25
0.70
0.97
0.33
-3.97
0.80
1.00
0.79
0.98
0.99
1.00
1.00
0.92
0.92
0.81
-0.04
0.33
0.94
0.92
0.81
-0.04
0.28
0.28
-2.88
-3.75
-0.64
-1.40
-5.92
-5.20
-6.95
A ordem de potência para estes parâmetros relacionados aos 5
substituintes encontra-se na tabela 2. A partir do resultado da atividade biológica
avaliada utiliza-se esta tabela a fim de se encontrar qual parâmetro ou
combinação dos parâmetros estão envolvidos nas moléculas mais ativas
(TOPLISS; 1976).
Tabela 2. Ordem de potência para diversos parâmetros físico-quimicos proposta por
Topliss
Substituintes
Parâmetros físico-quimicos de Topliss
π + 2π - π - π - 2π - 3Es
π
2π– π2
3,4-Cl2
1
1-2
1
1
1
1-2
3-4
5
2-5
4-Cl
2
1-2
2
2
2-3
3
3-4
3-4
2-5
4-CH3
3
3
4
3
2-3
1-2
1
1
2-5
4-OCH3
4-5
4-5
5
5
4
4
2
2
2-5
H
4-5
4-5
3
4
5
5
5
3-4
1
23
A tabela 3 indica a proposta de seleção de novos substituintes que podem
otimizar a atividade farmacológica dos compostos em estudo. Aos parâmetros
relacionados π e σ, baseados nos estudos de correlação de Hansch, Topliss
incluiu também os efeitos estéricos (Es), que muitas vezes exercem influência
dominante.
Este método visa uma síntese mais racional e objetiva, visto que, fazendo
primeiramente a análise e comparação dos resultados da atividade biológica
com
a
estrutura
química
dos
compostos
pode-se
determinar
futuras
modificações estruturais com o objetivo de obter um composto ainda mais
potente que os iniciais.
Tabela 3. Proposta de Topliss para a seleção de novos substituintes em função dos
prováveis parâmetros mais ativos.
Prováveis parâmetros mais ativos
π, π + , 
Seleção de novos substituintes
3-CF3, 4-Cl; 3-CF3, 4-NO2; 4-CF3; 2,4-Cl2;
4-C-C5H9
π, 2π – , π – 
4-CH(CH3)2; 4-C(CH3)3; 3,4(CH3)2; 4O(CH2)3CH3; 4-OCH2Ph; 4-NEt2
π - 2, π – 3, 
4-N(C2H5)2; 4-N(CH3)2; 4-NH2; 4-NHC4H9;
4-OH; 4-OCH(CH3)2; 3-CH3; 4-OCH3
2π – π2
4-Br, 3CF3; 3,4(CH3)2; 4-C2H5; 3Cl; 3CH3; 3-OCH3; 3-N(CH3)2; 3-CF3; 3,5-Cl
Na aplicação de estratégias de planejamento de fármacos, os estudos dos
processos evolutivos de reconhecimento molecular em sistemas biológicos
assumem grande importância, pois constituem as bases fundamentais para o
entendimento de propriedades como potência, afinidade e seletividade. Diante
desse complexo paradigma, as ferramentas biotecnológicas associadas aos
métodos de química medicinal ganham papel destacado no desenvolvimento de
novas moléculas com atividade biológica (GUIDO; ANDRICOPULO, OLIVA,
2010).
Esse processo de descoberta e desenvolvimento de fármacos é muitas
vezes complexo, longo e de alto custo, tendo suas raízes profundamente ligadas
às inovações científicas e tecnológicas. Os avanços expressivos da ciência
24
tornaram
possível
a
descoberta
de
inovações
terapêuticas
notáveis,
proporcionando melhorias significativas na qualidade de vida das diversas
populações no mundo (GUIDO et al., 2008).
2.3 Reparo ósseo
O sistema esquelético é tão essencial à vida quanto qualquer outro
sistema orgânico, pois desempenha papel fundamental na homeostase mineral.
O tecido ósseo serve de suporte para os tecidos não mineralizados e protege
órgãos vitais, como os contidos nas caixas craniana e torácica. Aloja e protege a
medula óssea, formadora das células sanguíneas, proporciona apoio aos
músculos esqueléticos, transformando suas contrações em movimentos úteis, e
constitui um sistema de alavancas que amplia as forças geradas na contração
muscular (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
O tecido ósseo compreende um tecido conjuntivo altamente rígido e
resistente. Suas propriedades dependem das características da matriz
extracelular, composta por porção orgânica (formada por proteínas colagenosas
– das quais 90% são representadas por colágeno tipo I e aproximadamente 10%
por proteoglicanos, e proteínas não colagenosas como osteocalcina (OCC),
osteopontina (OPN), osteonectina (OCN) e fosfatase alcalina (ALP) sintetizadas
por osteoblastos com propriedades específicas na mineralização do tecido
ósseo. O componente protéico da matriz é responsável pela resistência a fratura,
compressão e tensão, conferindo certa maleabilidade ao tecido sem que o
mesmo perca morfologicamente sua dureza (KLEIN et al., 2003; MOTA et al.,
2008).
Os
componentes
inorgânicos,
responsáveis
pela
resistência
à
deformação, apresentam fosfato de cálcio organizados em forma de cristais de
hidroxiapatita, além de magnésio, bicarbonato, sódio e potássio, em menor
quantidade. Estes se associam a proteínas estruturais e se encontram distribuídos entre as fibras de colágeno formando, assim, feixes impregnados por
partículas iônicas (MOTA et al., 2008).
25
Apesar do aspecto aparentemente inerte, o tecido ósseo é um tecido
metabolicamente ativo que sofre remodelação contínua ao longo da vida. Tal
remodelação envolve a remoção de osso mineralizado pelos osteoclastos,
seguida pela formação da matriz óssea pelos osteoblastos, que posteriormente
se torna mineralizada (HADJIDAKIS; ANDROULAKIS, 2006).
Quando lesados, como em fraturas, são capazes de reparação, fenômeno
que demonstra sua permanente vitalidade. No entanto, esta capacidade
regenerativa tem limites e pode falhar em certas condições. As condições que
influenciam para que o reparo ósseo se consolide são a presença de uma
adequada vascularização e de um arcabouço tridimensional (GONDIM, 2007;
SALGADO, 2002) além do tamanho e local do sítio lesionado, a preservação ou
não do periósteo, a interposição de tecido mole ou a presença de osso necrótico
entre os fragmentos ósseos, a infecção local e a inadequada imobilização do
material implantado com o seu consequente deslocamento (BARRIAS et al.,
2005).
Quando se trata de reparo ósseo, pode se designar tal processo como o
restabelecimento da continuidade de tecidos defeituosos por outros tecidos que
não tem capacidade de substituir funcionalmente e estruturalmente o tecido
lesado, enquanto a regeneração óssea pode ser definida como um processo
biológico complexo, de renovação da arquitetura e função do tecido ósseo
perdido (COSTA, 2009; MELCHER, 1969).
A regeneração óssea guiada, por sua vez, é definida como uma
renovação óssea controlada em áreas onde existe um defeito ósseo, através da
osteoindução ou osteocondução restabelecendo as características funcionais e
estruturais dos tecidos lesado (BOSCH; MELSEN; VARGERVIK, 1998; FRANCO
et al., 2001; GAROFALO, 2007).
A osteoindução estimula a osteogênese, ou seja, é o processo pelo qual
substâncias induzem a diferenciação de células progenitoras do leito receptor
em osteoblastos, com posterior formação do tecido ósseo (LINDHE; KARRING;
LANG, 2005). O termo refere-se ao processo pelo qual as células tronco
mesenquimais, presentes no tecido circunjacente ao local da aplicação da
substância, são induzidas à diferenciação em células de linhagem osteogênica
(ALEXANDER, 1987). Na osteoindução, as células mesenquimais são
estimuladas a se transformarem em osteoblastos que produzem a matriz óssea
26
mineralizada. A osteoindução é ativa e representa a propriedade do material em
estimular a produção óssea pelo tecido receptor.
A osteocondução ocorre quando uma matriz física serve de arcabouço
para formação de um novo osso através da proliferação e migração de células
progenitoras do leito receptor, que se diferenciam em osteoblastos (TEIXEIRA,
2009). A osteocondução é passiva, sendo representada pela capacidade do
enxerto em permitir a invasão vascular e celular proveniente da área receptora.
A osteocondução é o processo tridimensional de intracrescimento de capilares
em
processo
de
brotamento
do
tecido
perivascular
e
de
células
osteoprogenitoras do leito recipiente em direção a estrutura de um implante ou
enxerto (BAUER; MUSCHLER, 2000; CARVALHO; BASSI; VIOLIN, 2004;
STEVENSON, 1998).
Apesar do alto potencial de regeneração do tecido ósseo, esta função
pode não se desencadear em defeitos de grandes dimensões, uma vez que a
regeneração óssea é um processo complexo e contínuo que objetiva uma
restauração anatômica e funcional.
Lee; Shin (2009) descrevem que a formação de osso é um processo que
envolve um grande número de hormônios, citocinas e fatores de crescimento.
Durante o estágio embrionário do desenvolvimento ósseo e no processo de
regeneração, vários eventos biológicos são regulados por essas moléculas
bioativas em um determinado espaço de tempo.
Atualmente o desenvolvimento de biomateriais para a substituição do
tecido ósseo é uma grande área da ciência. Funcionalmente os biomateriais
podem ser divididos em dois grandes grupos: aqueles para substituir funções
puramente
mecânicas
(próteses
metálicas)
e
aqueles
destinados
ao
preenchimento de cavidades ósseas com o intuito de reconstrução e
estimulação da neoformação de tecido mineralizado (PAGAN, 2003).
O biomaterial é definido como uma substância ou combinação de duas ou
mais substâncias, sintéticas ou naturais, que pode ser utilizado por um período
de tempo para melhorar, aumentar ou substituir, parcial ou inteiramente um
tecido ou órgão (PAGAN, 2003); provocando resposta biológica específica na
interface do material com o tecido. Sabe-se que nenhum material implantado em
tecido vivo é inerte, todos provocam alguma resposta tecidual (CARLO et al.,
2007; ELBATAL et al., 2003).
27
Inúmeros eventos ocorrem quando um determinado biomaterial entra em
contato com o ambiente biológico; interações moleculares e celulares
influenciam as características teciduais ao redor dos biomateriais. Na presença
destes, fatores de crescimento são adsorvidos ou umedecem a superfície dos
substitutos ósseos, promovendo uma adequada integração com o osso do
hospedeiro. A função dos biomateriais é promover rápida formação óssea, assim
quando se estabelece uma total integração, ocorrerá uma gradual substituição
por novo osso (GAROFALO, 2007).
As propriedades físico-químicas de cada biomaterial, somadas ao
ambiente fisiológico, influenciam diretamente na neoformação óssea e como
e
quando ocorrerá
de
forma
equilibrada
a
sua
biodegradação.
As
propriedades físicas dos biomateriais são específicas à área de superfície
ou formato (bloco, partícula) a porosidade (denso, macro ou microporoso) e a
cristalinidade (cristalino ou amorfo) (KARAGEORGIU, KAPLAN, 2005; MISCH,
2000; YANG, DENNISON, ONG, 2005).
O principal objetivo da pesquisa com substitutos ósseos tem sido o
desenvolvimento de materiais para implantação que favoreçam um reparo ósseo
rápido e controlado e que resulte em regeneração tecidual (BRUNSKI; PULEO;
NANCI, 2000). Por estar em íntimo contato com tecidos biológicos no sítio de
implantação, a superfície do material se constitui em fator crítico na
determinação de sua biocompatibilidade e no processo de integração (NANCI et
al., 1998; NETO 2006)
Desta forma, espera-se que o material seja o mais parecido possível com
o tecido vivo, além de ser capaz de interagir sem ativar o sistema de defesa do
hospedeiro e que não apresente toxicidade, não causando destruição de células
e não liberando radicais nocivos que possam afetar o tecido (HOLLINGER;
LEONG, 1996; PRETEL, 2005) .
Por outro lado, a engenharia tecidual oferece perspectivas promissoras
para tratar defeitos ósseos causados por trauma, neoplasias, malformações
congênitas, infecções e resultantes do tratamento cirúrgico. Essa área de estudo
utiliza células, carreadores e fatores de indução para criar um novo tecido, sendo
as proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), os fatores mais utilizados para a
regeneração óssea, devido sua atividade osteoindutiva da matriz óssea
orgânica.
28
Há muitos anos, as BPMs vem sendo isoladas, clonadas e identificadas
como membros da família das TGF-β (fator de crescimento de transformação
beta). Acredita-se que as BMPs são glicoproteínas responsáveis pelo
recrutamento de células osteoprogenitoras para os locais de formação óssea.
Aparentemente, através da quimiotaxia promovem a migração de células
mesenquimais indiferenciadas e monócitos para o local da lesão, atuando na
proliferação celular, maturação, mineralização e remodelação da matriz óssea
com consequente neoformação de osso (SCHMIDT, 2006).
O uso de BMPs na regeneração óssea é considerado um potente
substituto aos enxertos ósseos autógenos e aloimplantes, diminuindo o risco de
complicações associadas a cirurgias e limitações do doador. Atualmente mais de
20 tipos de BPMs foram identificadas, sendo responsáveis pela formação de
cartilagem e osso e por exercerem papel na formação de outros órgãos. A BPM2 nativa, por exemplo, esta presente na cortical óssea e induz a ossificação
endocondral localizada e a formação óssea intermembranosa, possuindo grande
eficácia na formação de osso (SCHMIDT, 2006).
As BMPs podem ser obtidas através de diferentes espécies de animais,
uma vez que apresentam uma homologia estrutural e funcional. Entretanto, para
se obter essa proteína é necessário cerca de um quilograma de osso para
poucos microgramas de BPM, restringindo o uso em quantidade dessa proteína
(SCHMIDT, 2006).
Comercialmente, as proteínas morfogenéticas ósseas recombinante
humanas
(rhBMP-2)
estão
disponíveis
apresentando
boa
capacidade
osteoindutiva. Estudos in vivo e in vitro encontraram que a rhBMP-2 rapidamente
se difunde do sitio de aplicação, diminuindo o efeito osteocondutivo. Ainda,
outros autores descrevem que a aplicação de grandes quantidades de rhBMP-2
diretamente nos tecidos não é efetivo para a indução de osteogênese porque
acelera o metabolismo de proteínas, sustentando que quantidades menores
parecem produzir melhores resultados (ISSA et al., 2010).
Existe um longo caminho entre o desenvolvimento de um novo biomaterial
ou técnica até a utilização em seres humanos. Para utilização na clínica, é
necessário que os materiais e técnicas sejam testados in vitro e in vivo (LUIZ;
COSTA; NADANOVSKY, 2005).
29
Dessa forma, nos últimos anos, uma grande variedade de biomateriais
tem sido avaliada in vivo em diferentes modelos animais, como ratos coelhos,
cães
e macacos (ACCORSI MENDONÇA et al, 2008, SILVA et al., 2005;
SCHLEGEL et al., 2003, THALLER, 1994).
A escolha do modelo animal para avaliar o reparo de defeitos ósseos
utilizando biomateriais geralmente envolve animais jovens com alto potencial
para osteogênese (SCHIMITZ, HOLLINGER, 1986).
Vários modelos animais de defeitos ósseos têm sido estudados para
avaliar o potencial de materiais e candidatos biológicos para promoção de
regeneração do tecido ósseo. Esses modelos tem ajudado a elucidar os
mecanismos de integração endósseos (fenômeno de osteocondução), bem
como os mecanismos de remodelação óssea (fenômeno de osteindução)
(COSTA, 2009; MANKANI, et al., 2006).
No estudo do processo de regeneração de defeitos ósseos criados em
modelos animais, um fator importante a ser considerado é o tamanho do defeito.
Se este for muito amplo, o reparo resultará, em parte, em um tecido conjuntivo
muito fibroso, ao invés de tecido ósseo. Assim, existe o conceito de tamanho
crítico, que é o menor tamanho do defeito que não irá regenerar
espontaneamente. Além disso, existe um tamanho crítico do defeito para cada
modelo animal e também para cada tipo de osso em particular. Esses defeitos
críticos em animais são usados como padrão na análise experimental de
diversas substâncias que possam aumentar a regeneração do tecido ósseo
(HOLLINGER; KLEINSCHMIDT, 1990).
Atualmente, para o estudo de regeneração óssea in vivo, o modelo mais
utilizado de acordo com a literatura é a reconstrução de defeitos críticos criados
na calota craniana de ratos e esses defeitos são considerados críticos, uma vez
que não se regeneram espontaneamente durante a vida do animal.
Kneser et al. (2006) estudaram feridas críticas de calota craniana de ratos
tratadas com enxerto de discos de osso esponjoso bovino e recobertos com gel
de fibrina contendo osteoblastos, um segundo grupo sem osteoblastos e um
terceiro com controle negativo. Os espécimes obtidos no dia 0, 2 e 4 meses de
período experimental, analisados histológica e morfometricamente, mostraram
em um mês, neoformação óssea limitada a pequenas áreas periféricas de todas
as feridas tratadas. Dois a 4 meses depois, nessas feridas, ocorreu uma
30
neoformação óssea significativa, áreas de reabsorção do enxerto, bem como a
integração a osso neoformado e nas feridas controle não houve formação
significante de osso.
Nyan et al. (2007) mostraram a ação de moléculas bioativas e
biomateriais na melhora do reparo ósseo, utilizando 45 ratos com feridas críticas
de 8mm de diâmetro, observando radiografias e tomografias computadorizadas,
2, 4 e 8 semanas após as cirurgias, verificaram que a sinvastatina em
combinação com o sulfato de cálcio, promove uma inflamação intensa nos
períodos iniciais do reparo e osteogênese mais acentuada nos períodos tardios.
Kramer et al. (2008) trataram defeitos críticos na calota de quatro
carneiros
com
distração
bifocal,
colocando
segmentos
transportadores
osteogênicos constituídos de osso autógeno ou de biomaterial de tecido ósseo
esponjoso bovino desproteinizado. Após um período de latência de 5 dias a
distração (1mm/dia) foi realizada durante 28 dias. Através de exames
radiográficos e microscópico, observaram que em ambos os grupos, o transporte
osteogênico resultou em formação óssea; indicando que o biomaterial pode
contribuir para a regeneração óssea no transporte bifocal osteogênico, evitandose uma segunda intervenção para obter osso autólogo.
Kim et al. (2012) ao estudarem o potencial osteogênico da licochalcona A
em modelos in vitro
demonstraram que em baixas concentrações, essa
molécula estimulou a diferenciação celular e induziu a expressão de BMPs. Em
testes in vivo, a licochalcona A acelerou o desenvolvimento do esqueleto no
método de zebrafish e melhorou consideravelmente a formação do tecido ósseo
no modelo de ferida crítica, podendo ser benéfica no tratamento de desordens
ósseas.
Assim, a avaliação de diferentes chalconas no modelo de calota craniana
em ratos possibilitou avaliar o potencial osteogênico destas moléculas em um
modelo in vivo.
31
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral:
Sintetizar e avaliar o potencial osteogênico de chalconas em modelo “in vivo”.
3.2 Objetivos Específicos:
- Sintetizar e caracterizar uma série de chalconas segundo as substituições
propostas por Topliss;
- Mensurar macroscopicamente o fechamento das feridas ósseas através do
programa Image J;
- Verificar a atividade de osteoblastos na formação de matriz óssea;
- Comparar a matriz óssea entre os grupos;
- Analisar a relação estrutura-atividade da série de chalconas sintetizadas.
32
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Síntese de Chalconas (1,3-difenilprop-2-em-1-onas)
As 1,3-difenilprop-2-en-1-onas (C1 á C5) foram obtidas pelo método de
Claisen Schmidt (CORREA et al., 2008).
O método consistiu em dissolver uma mistura equimolar de benzaldeído
substituído (0,05 mol) e acetofenona (0,05 mol), em 25 mL de etanol, em meio
básico (5g de hidróxido de sódio) (Figura 3). A solução permaneceu sob
agitação magnética a temperatura ambiente por 24 horas, ou até o ponto que a
agitação não fosse mais possível (devido à formação de precipitados). A fim de
confirmar o término da reação, a formação do produto reacional foi
acompanhada por cromatografia de camada delgada em silicagel, utilizando
como eluentes gradientes hexano/acetato de etila. Os produtos reacionais foram
filtrados à pressão reduzida e vertidas em gelo e água gelada, filtrada e lavada
sucessivas vezes com água gelada, até que as águas de lavagens se
apresentassem neutras ao teste com papel de tornassol. O produto foi então
lavado com 20 mL de etanol gelado e submetido à secagem em dessecador na
presença de pentóxido de fósforo.
Para a purificação dos compostos, a recristalização foi realizada sob
aquecimento, utilizando-se etanol e carvão ativo. Após, os compostos foram
novamente filtrados e secos, obtendo-se o produto puro.
Figura 3. Síntese das chalconas
O
O
CH3
O
H
+ R
EtOH
R
NaOH
R= H, 4-CH3, 4-OCH3, 4-Cl, 3,4-Cl2
33
4.1.1. Caracterização estrutural dos compostos
O andamento das reações durante os procedimentos reacionais, bem
como a pureza preliminar dos compostos utilizando-se como comparação os
padrões dos reagentes, foram monitorados por cromatografia de camada
delgada. Os procedimentos de purificação foram os usuais, por recristalização
com etanol. A caracterização de todos os compostos sintetizados foi realizada
através de ponto de fusão, espectroscopia no infravermelho e espectroscopia de
ressonância magnética nuclear de hidrogênio e carbono (NIQFAR/UNIVALI).
Na técnica de cromatografia em camada delgada (CCD) foram utilizadas
placas pré-revestidas de sílica gel com indicador de fluorescência - F254, em
folhas
com
base
de
alumínio,
Merck.
cromatográficos
foram
utilizados
gradientes
hexano/acetato
de
etila.
Os
solventes
Em
todos
do
os
sistema
utilizados
procedimentos
de
foram
solventes
adquiridos
comercialmente das marcas Aldrich e Merck. Os compostos foram visualizados
como manchas (spots) através de luz UV de ondas curtas. Para a recristalização
dos compostos foram utilizados diferentes solventes.
Os pontos de fusão, dos compostos obtidos, foram determinados de
forma direta, com o equipamento Microquímica APF-301, não necessitando
correção por curva de calibração.
As análises espectrométricas no infravermelho foram realizadas em
espectrômetro interfotométrico por transformada de Fourier, SHIMADZU,
Prestige – 21, pelo método de reflectância difusa – DRIFTS. Os espectros foram
obtidos registrando transmitância versus número de onda (cm-1) e foram
corrigidos pelo algoritmo Kubelka Munk.
Os espectros de RMN1H e RMN13C foram obtidos em espectrômetro de
ressonância magnética nuclear Bruker Advance DPX – 300, a 300MHz e 75
MHz, respectivamente. Os deslocamentos químicos foram expressos em valores
adimensionais (δ = ppm) em relação a um padrão de referência de
tetrametilsilano
(TMS).
hexadeuterado,
acetona
Foram
utilizados
deuterada
e
os
solventes
clorofórmio
dimetilsulfóxido-
deuterado
adquiridos
comercialmente. As constantes de acoplamento (J) foram expressas em Hertz
(Hz). As multiplicidades dos sinais foram indicadas como segue: s=simpleto,
34
d=dupleto, dd=duplo dupleto, t=tripleto e m=multipleto. A visualização foi
realizada no programa ACDSpec Manager 10.08 (licença no: 41159) e Bruker
TopSpin 5.0.
(2E) 1-fenil-3-(3,4-diclorofenil)-2-propen-1-ona – C1
Utilizou-se acetofenona (5,84mL/ 0,05mol) e 3,4-clorobenzaldeído (8,75g/
0,05mol) na presença de hidróxido de sódio dissolvidos em etanol (25mL) sendo
a reação acompanhada por CCD.
(2E)-1-fenil-3-(4-clorofenil)- 2-propen-1-ona – C2
Utilizou-se acetofenona (5,84mL/ 0,05mol) e 4-clorobenzaldeído (7,03g/
0,05mol) na presença de hidróxido de sódio dissolvidos em etanol (25mL) e a
reação foi acompanhada por CCD.
(2E)-1-fenil-3-(4-metilfenil) 2-propen-1-ona – C3
Utilizou-se acetofenona (5,84mL/ 0,05mol) e tolualdeído (6,08mL/ 0,05mol) na
presença de hidróxido de sódio dissolvidos em etanol (25mL). O produto
reacional foi acompanhado por CCD.
(2E)-1-fenil-3-(4-metoxifenil)-2-propen-1-ona – C4
Utilizou-se acetofenona (5,84mL/ 0,05mol) e anisaldeído (5mL/ 0,05mol) na
presença de hidróxido de sódio dissolvidos em etanol (25mL) e a reação foi
acompanhada por CCD.
(2E) 1,3-difenil-2-propen-1-ona – C5
Utilizou-se acetofenona (5,84mL/ 0,05mol) e benzaldeído (5,10mL/ 0,05mol) na
presença de hidróxido de sódio dissolvidos em etanol (25mL) sendo a reação
acompanhada por CCD.
35
4.2 Animais
Foram utilizados 170 ratos Wistar, fêmeas (45 dias de idade) provenientes
do
Biotério
Central
da
Universidade
do
Vale
do
Itajaí,
com
peso
aproximadamente de 200g, os quais foram alimentados com ração granulada
Nuvital® na quantidade de 10 a 20 g/animal/dia e água a vontade, mantidos em
ambiente com ciclo claro/escuro de 12/12 horas à temperatura de 22°C ±2. Este
trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da UNIVALI
(processo
40/2011).
O
trabalho
foi
desenvolvido
conforme
o
modelo
experimental apresentado na tabela a seguir:
Tabela 4. Tratamentos aplicados em cada um dos grupos experimentais.
GRUPOS
TRATAMENTO/DOSES
NÚMERO DE ANIMAIS
Controle
Sem tratamento
10
Veículo
Veículo
10
C1
(2E) 1-fenil-3-(3,4-diclorofenil)-2-propen-1-ona
C2
C3
C4
C5
1%
10
5%
10
10%
10
(2E) 1-fenil-3-(4-clorofenil)-2-propen-1-ona
1%
10
5%
10
10%
10
(2E) 1-fenil-3-(4-metilfenil)-2-propen-1-ona
1%
10
5%
10
10%
10
(2E) 1-fenil-3-(-4metoxilfenil)-2-propen-1-ona
1%
10
5%
10
10%
10
(2E) 1,3-difenil-2-propen-1-ona
1%
10
5%
10
10%
10
36
4.3 Procedimento cirúrgico e tratamento das feridas críticas
Os
animais,
sob
condições estéreis do
campo
cirúrgico
foram
anestesiados com solução de 3,75ml de cloridrato de cetamina (10%), 2,5ml de
xilazina (2%) e 3,35ml de água destilada; aplicando-se 0,1ml/kg/im e
tricotomizados manualmente na região da linha média da calota craniana, onde
se procedeu a incisão dos tecidos moles (Figura 4).
Figura 4. Incisão dos tecidos moles.
Os planos cutâneo (pele e hipoderme) e periosteal foram rebatidos e entre
as suturas interparietal e interocipital ao lado direito (Figura 5), com uma trefina
cirúrgica de 5 mm de diâmetro (Figura 6), adaptada em peça de mão de baixa
rotação e sob constante irrigação com soro fisiológico, removeu-se um disco de
tecido contendo as corticais ósseas e o osso esponjoso subjacente até a
exposição da dura-máter (Figura 7).
37
Figura 5. Anatomia de calota craniana de uma amostra
de um crânio de rato Wistar indicando a região de
confecção da ferida crítica.
Figura 6. Realização da ferida crítica com uma broca
trefina sob irrigação com soro fisiológico.
Figura 7. Remoção do fragmento ósseo de 5mm
compreendendo a ferida crítica.
38
Nos animais controle, as feridas foram lavadas somente com soro
fisiológico; nos animais experimentais, após esta irrigação, foram aplicados os
tratamentos (aplicação única) com vaselina (grupo veículo) e as moléculas com
veículo carreador: (2E) 1-fenil-3-(3,4-diclorofenil)-2-propen-1-ona – C1, (2E),
(2E) 1-fenil-3-(4-clorofenil)-2-propen-1-ona – C2, 1-fenil-3-(4-metilfenil)-2-propen1-ona – C3, (2E) 1-fenil-3-(-4metoxilfenil)-2-propen-1-ona – C3, (2E) 1,3-difenil2-propen-1-ona – C5 nas concentrações de 1%, 5% e 10% (Figura 8).
Em seguida, o periósteo foi reposicionado e suturado, utilizando-se fio
absorvível Catgut 5-0 simples (Polysuture®), seguindo-se a síntese dos tecidos
moles com fio não absorvível 6-0 (Polysuture®). Para analgesia, aplicou-se por
via subcutânea, cetoprofeno 1% (0,25ml/100g) nas primeiras 72 horas, conforme
as diretrizes da SBCAL (princípio do bem estar animal).
Figura 8. Aplicação dos tratamentos com uma
espátula.
4.4 Procedimento macroscópico e técnica histológica
Após 30 dias da intervenção cirúrgica, os animais foram eutanasiados
com
sobredose
anestésica
seguida
de
perfusão
intracardíaca
de
paraformaldeído a 4% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, removendo-se as
calotas cranianas e mantendo as amostras na mesma solução fixadora utilizada
para a perfusão intracardíaca durante 7 dias. Após este período, foram obtidas
39
fotografias das feridas para análise quantitativa, calculando-se as áreas das
feridas remanescentes (em mm2) através do programa Image J. Em
continuidade da técnica histológica, as amostras foram desmineralizadas em
solução de EDTA a 7% em tampão fosfato, desidratadas em álcoois de
concentrações crescentes (70, 90 e 100%), clareadas em xilol e incluídas em
parafina. Cinco cortes semisseriados (1:10) obtidos em micrótomo rotatório, com
espessura de 7µm, corados com Hematoxilina e Eosina, foram utilizados para
observação, em microscopia de luz transmitida.
4.5 Análise macro e microscópica e tratamento estatístico
O programa Image J (Figura 9) foi utilizado para mensurar as áreas das
feridas críticas, com a finalidade de comparação com os demais resultados. Os
dados quantitativos foram tratados estatisticamente através da análise de
variância do método de ANOVA seguido pelo teste de múltiplas comparações
Student - Newman - Keuls, utilizando o programa GraphPad Instat e as lâminas
analisadas qualitativamente em microscopia de luz transmitida, avaliando-se
tipos celulares e teciduais na área de reparo das feridas. Os exemplares
padronizados das áreas de reparo foram documentados com fotomicroscópio
(BX50, Olympus, Tokio, Japão).
Figura 9. Programa Image J
utilizado para mensuração da
área da ferida na calota craniana
do
animal
40
5 RESULTADOS
5.1 Chalconas
(2E)-1- fenil-3-(3,4-diclorofenil)- 2-propen-1-ona – C1
O
Cl
Cl
O produto amorfo obtido foi recristalizado em etanol com rendimento de 68 % e
tempo reacional: 3,5 horas.
Características físico-químicas: p. f.: 114-115 ºC (lit. p.f.: 114-115 segundo
CORRÊA et al., 2001), Rf : 0,72.
Fórmula Molecular: C15H10Cl2O (279,0 g/mol).
IV max/cm-1 pastilhas de KBr: 1661 (C=O); 1605 (C=C).
RMN1H (DMSO/TMS) δ dado em ppm: 7,27 (d, 1H, J: 15,70 Hz, Hα); 7,39 (d,
1H, J: 15,70 Hz, Hβ); 7,50-7,93 (m, 8H, Ar).
NMR13C (75.47 MHz, DMSO – d6, δppm): 121,3, 133,3, 132,6, 137,9, 134,7,
127,8, 130,1, 128,5, 127,1, 129,2, 134,5, 189,7, 145,1.
(2E)-1-fenil-3-(4-clorofenil)-2-propen-1-ona - C2
O
Cl
O produto amorfo obtido foi recristalizado em etanol com rendimento de 74 %.
Tempo recional: 4 horas.
41
Características físico-químicas: p. f.:113-115 ºC (lit. p.f.: 114,4-117,1 segundo
CABRERA et al., 2007), Rf : 0,68.
Fórmula Molecular C15H11ClO (244,5 g/mol).
IV max/cm-1 pastilhas de KBr: 1658 (C=O); 1604 (C=C).
RMN1H (DMSO/TMS) δ dado em ppm: 7,28 (d, 1H, J: 15,71 Hz, Hα); 7,42 (d,
1H, J: 15,71 Hz, Hβ); 7,25-7,76 (m, 9H, Ar).
NMR13C (75.47 MHz, DMSO – d6, δppm): 122,32, 128,48, 129,13 129,54,
132,79, 133,43, 136,65, 137,98, 143,09, 189,76.
(2E)-1-fenil-3-(4-metilfenil)-2-propen-1-ona – C3
O
CH3
O produto amorfo obtido foi recristalizado em etanol com rendimento de 90 %;
tempo reacional: 12 horas; p. f.: 95 - 99 ºC (lit. p.f.: 98 - 100 ºC segundo LOPEZ
et al., 2001), Rf : 0,67.
Fórmula Molecular: C16H14O (224,0 g/mol).
IV max/cm-1 pastilhas de KBr 1660 (C=O); 1603 (C=C).
RMN1H (DMSO/TMS) δ dado em ppm: 2,32 (s, 3H, Me); 7,54 (d, 1H, J: 15,50
Hz, Hα); 7,60 (d, 1H, J: 15,50 Hz, Hβ); 7,26-8,17 (m, 9H, Ar).
NMR13C (75.47 MHz, DMSO – d6, δppm): 121,3, 137,9, 132,2 137,6, 128,5,
128,9, 129,2, 134,5, 189,7, 145,1, 21,3.
(2E)-1-fenil-3-(4-metoxifenil)-2-propen-1-ona – C4
O
O
CH3
42
O produto amorfo obtido foi recristalizado em etanol com rendimento de 95 %;
tempo reacional: 10horas; p. f.: 116-118 ºC (lit. p.f.: 114-116 ºC segundo IWATA
et al., 1995), Rf : 0,52.
Fórmula Molecular: C16H14O2 (240,0 g/mol).
IV max/cm-1 pastilhas de KBr 1659 (C=O); 1598 (C=C).
RMN1H (DMSO/TMS) δ dado em ppm: 3,39 (s, 3H, OMe); 7,54 (d, 1H, J: 16,00
Hz, Hα); 7,62 (d, 1H, J: 16,00 Hz, Hβ); 7,00-8,16 (m, 9H, Ar).
NMR13C (75.47 MHz, DMSO – d6, δppm): 122,00, 128,40, 128,47, 128,89,
130,45, 132,67, 134,80, 138,17, 144,64, 190,29.
NMR13C (75.47 MHz, DMSO – d6, δppm):121,3, 159,8, 137,9, 127,5, 114,2,
128,5, 130,2, 130,2, 129,2, 134,5, 189,7, 55,8, 145,1.
(2E) 1,3-difenil-2-propen-1-ona – C5
O
O produto amorfo obtido foi recristalizado em etanol com rendimento de 77 %
com tempo reacional de 6 horas.
Características físico-químicas: p. f.:119-122 ºC (lit. p.f.: 118-120 segundo
ADEWUNMI et al.,1987), Rf : 0,67.
Fórmula Molecular: C15H12O (210,0 g/mol).
IV max/cm-1 pastilhas de KBr: 1661 (C=O); 1605 (C=C).
RMN1H (DMSO/TMS) δ dado em ppm: 7,75 (d, 1H, J: 15,81 Hz, Hα); 7,95 (d,
1H, J: 15,81 Hz, Hβ); 7,46-8,17 (m, 10H, Ar).
NMR13C (75.47 MHz, DMSO – d6, δppm): 122,00, 128,40, 128,47, 128,89,
130,45, 132,67, 134,80, 138,17, 144,64, 190,29.
5.2 Análise macroscópica
A Tabela 5 mostra, 30 dias após o tratamento, os valores das médias das
áreas remanescentes das feridas experimentais tendo como parâmetro a área
43
da ferida crítica inicial (5mm – 19,635mm2). Os dados foram avaliados
quantitativamente em cada um dos grupos e doses testadas, utilizando a Análise
de Variância (ANOVA) seguido do Teste de múltiplas comparações StudentNewman-Keuls.
Tabela 5. Mostra a média±erro padrão das áreas remanescentes das feridas 30 dias
após o tratamento.
Grupos
Média±erro padrão
Controle
16,28±0,48
14,97±1,20
Veículo
Concentrações
5%
Moléculas
1%
10%
C1
13,83±0,53
12,24±0,63
9,11±1,19
C2
14,06±0,61
11,96±0,91
7,93±1,05
C3
12,36±0,60
9,53±0,62
7,34±1,05
C4
11,59±0,95
9,18±0,64
6,25±1,05
C5
11,78±0,61
8,58±0,53
5,94±0,72
Grupo Controle
Após um mês de cirurgia, constatou-se pelo método estatístico que no
grupo controle, a média das áreas remanescentes nas feridas desse grupo
apresentou-se em 16,28mm2;
mostrando pouca capacidade de reparo
espontâneo, estatisticamente não significativo em relação à área da ferida inicial.
Grupo Veículo
Quando somente o veículo, utilizado para carrear a molécula de chalcona,
foi avaliado, os resultados mostraram uma média das áreas da ferida
semelhante ao grupo controle com valor de 14,97mm2, mostrando formação
óssea limitada não significativa em relação ao grupo controle e a área da ferida
inicial.
44
(2E)-1- fenil-3-(3,4-diclorofenil)- 2-propen-1-ona – C1
Os resultados obtidos na mensuração das áreas de tecido ósseo
neoformado evidenciaram que no tratamento com concentração de 1% e 5%,
esta
molécula
apresentou
uma
média
da
área
das
feridas
ósseas
remanescentes de 13,82mm2 e 12,24mm2 respectivamente. Na dose de 10%, o
grupo tratado apresentou uma média de 9,11mm2 da área da ferida.
Em relação a esta molécula, os valores das médias de área de reparo
ósseo ao utilizar a concentração de 1% mostraram associação estatística
significativa somente em relação ao grupo tratado com a concentração de 10%
(p<0,01). Quanto ao uso da dose de 5% os valores apresentaram-se
significativos quando comparados ao grupo controle (p<0,01). Já a concentração
de 10% mostrou associação significativa (p<0,001) em relação aos grupos
controle e veículo (Figura 10).
Observou-se ainda, que o grau de reparo envolvido na osteogênese
apresentou uma relação dose-resposta, ou seja, a concentração à 10% mostrase mais efetiva em relação as demais.
Figura 10. Áreas das feridas remanescentes dos animais tratados com a molécula C1 à 1%, 5%
e 10% e dos grupos controle e veículo após 30 dias do tratamento. Os dados são apresentados
como média±erro padrão. [**] = p<0,01; [***] = p<0,001. ANOVA seguido do teste Student Newman - Keuls, n=10 animais por grupo.
45
(2E)-1-fenil-3-(4-clorofenil)-2-propen-1-ona - C2
Quantitativamente, na concentração de 1%, aos 30 dias de experimento,
esta molécula apresentou uma média de 14,06mm2 em relação a áreas das
feridas remanescentes. Já nas concentrações de 5% e 10%, as feridas críticas
mostraram uma média de 11,96mm2 e 7,93mm2 respectivamente.
Comparando-se os dados obtidos, a concentração de 1% mostrou
diferenças significativas em relação ao grupo tratado com a dose de 10%
(p<0,01). A concentração de 5% mostrou associação significativa somente ao
grupo controle (p<0,01). A de 10% apresentou valores significativos quando se
compara aos grupos controle e veículo (p<0,001).
Nota-se ainda, que o uso dessa molécula mostrou maior neoformação
óssea na concentração de 10%, mostrando uma relação dose-dependente
(Figura 11).
Figura 11. Áreas das feridas remanescentes dos animais tratados com a molécula C2 à 1%, 5%
e 10% e dos grupos controle e veículo após 30 dias do tratamento. Os dados são apresentados
como média±erro padrão. [**] = p<0,01; [***] = p<0,001. ANOVA seguido do teste Student Newman - Keuls, n=10 animais por grupo.
46
(2E)-1-fenil-3-(4-metilfenil)-2-propen-1-ona – C3
Em relação a esse o composto na concentração de 1% observou-se uma
média de feridas remanescentes de 12,36mm2. À 5% a média apresentada pelo
grupo foi de 9,53mm2. À 10%, quanto ao reparo ósseo, o composto exibiu média
de 7,34mm2.
Estatisticamente, observou-se na concentração de 1% maior grau de
fechamento da ferida em relação ao grupo controle (p<0,01) e ao grupo tratado
com a molécula na dose de 10% (p<0,001). A concentração de 5% mostrou
diferenças estatísticas somente em relação aos grupos controle e veículo
(p<0,001).
Já o grupo tratado com a concentração de 10% mostrou maior atividade
de reparo em relação aos grupos controle; veículo (p<0,001) e ao grupo tratado
à 1% (p<0,01), apresentando uma relação dose-resposta (Figura 12).
Figura 12. Áreas das feridas remanescentes dos animais tratados com a molécula C3 à 1%, 5%
e 10% e dos grupos controle e veículo após 30 dias do tratamento. Os dados são apresentados
como média±erro padrão. [**] = p<0,01; [***] = p<0,001. ANOVA seguido do teste Student Newman - Keuls, n=10 animais por grupo.
47
(2E)-1-fenil-3-(4-metoxifenil)-2-propen-1-ona – C4
Após 4 semanas, o composto na concentração de 1% e 5% exibiu uma
média de área de ferida de 11,59mm2 e 9,18mm2.
Na concentração de 10%a média de área das feridas foi de 6,25mm2.
A concentração de 1% mostrou resultados significativos em relação aos
grupos controle (p<0,01) e ao tratado à 10% (p<0,001).
Os grupos tratados com as doses de 5%, e 10% mostraram associação
estatística em relação aos grupos controle e veículo (p<0,001).
Comparando-se os dados, observa-se uma relação dose-efeito (Figura
13).
Figura 13. Áreas das feridas remanescentes dos animais tratados com a molécula C4 à 1%, 5%
e 10% e dos grupos controle e veículo após 30 dias do tratamento. Os dados são apresentados
como média±erro padrão. [**] = p<0,01; [***] = p<0,001. ANOVA seguido do teste Student Newman - Keuls, n=10 animais por grupo.
48
(2E) 1,3-difenil-2-propen-1-ona – C5
A concentrações de 1% e 5% mostraram valores de médias das áreas
das feridas remanescentes de 11,78mm2 e 8,58mm2 respectivamente. Na
concentração de 10% a média das áreas das feridas ósseas mostrou valor de
5,94mm2.
Em relação a esta molécula, a concentração de 1% mostrou associação
estatística em relação ao grupo veículo (p<0,01) e ao tratado a 10% (p<0,001).
Quanto as doses de 5% e 10% estas mostraram valores significativos em
relação aos grupos controle e veículo (p<0,001) (Figura 14), demonstrando
efeito dose-dependente.
Figura 14. Áreas das feridas remanescentes dos animais tratados com a molécula C5 à 1%, 5%
e 10% e dos grupos controle e veículo após 30 dias do tratamento. Os dados são apresentados
como média±erro padrão. [**] = p<0,01; [***] = p<0,001. ANOVA seguido do teste Student Newman - Keuls, n=10 animais por grupo.
Conforme representado nas figuras 15, 16 e 17, ressalta-se que em
nenhuma das concentrações utilizadas (1%, 5% e 10%) observaram-se
diferenças estatísticas significativas quando se comparam as moléculas
utilizadas.
49
Figura 15. Áreas das feridas remanescentes dos animais tratados com as moléculas na
concentração de 1%. Os dados são apresentados como média±erro padrão. ANOVA seguido do
teste Student - Newman - Keuls, n=10 animais por grupo.
Figura 16. Áreas das feridas remanescentes dos animais tratados com as moléculas na
concentração de 5%. Os dados são apresentados como média±erro padrão. ANOVA seguido do
teste Student - Newman - Keuls, n=10 animais por grupo.
50
Figura 17. Áreas das feridas remanescentes dos animais tratados com as moléculas na
concentração de 10%. Os dados são apresentados como média±erro padrão. ANOVA seguido
do teste Student - Newman - Keuls, n=10 animais por grupo.
51
5.3 Análise Microscópica
Na análise microscópica, as feridas remanescentes do grupo controle
mostraram na área central do defeito, tecido conjuntivo fibroso, sem sinais de
inflamação. Houve discreta neoformação óssea nas bordas da ferida critica, com
superfícies ósseas revestidas principalmente por células achatadas que
caracterizam osteoblastos inativos ou células ósseas de revestimento e
osteócitos incluídos na matriz óssea recém-formada. A substância osteóide
apresenta-se de forma discreta indicando ausência de atividade secretora
(Figura 18).
Figura 18. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal do grupo
controle, 30 dias após o experimento.
Figura 18. Coloração H.E. Aumento no original 40x. Tecido
conjuntivo fibroso (TC); superfície de reparo ósseo revestida por
células achatadas ou osteoblastos inativos (setas) e matriz
osteóide (O).
Em relação ao grupo veículo, as feridas se mostram semelhantes às do
grupo controle. Entretanto, observa-se na área central do defeito infiltrado
inflamatório, caracterizado por células mononucleares (linfócitos e macrófagos) e
vasos sanguíneos neoformados. As bordas ósseas apresentam reduzida
formação óssea com presença de células de revestimento ósseo ou
osteoblastos inativos (Figura 19 e 20).
52
Figura 19. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal do grupo
veículo, 30 dias após o experimento.
Figura 19. Coloração H.E. Aumento aproximado no
original 20x. Tecido conjuntivo (TC) e infiltrado
inflamatório caracterizado por linfócitos (setas),
macrófagos (seta dupla) e vasogênese (V).
Figura 20. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal do grupo
veiculo, 30 dias após o experimento.
Figura 20. Coloração H.E. Aumento aproximado no
original 40x. Osteoblastos inativos (setas) na superfície
das feridas.
(2E)-3-(3,4-diclorofenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona - C1
Microscopicamente, após 30 dias do experimento, essa molécula na dose
de 1% e 5% mostrou tecido conjuntivo em continuidade com o periósteo
preenchendo toda a extensão do defeito crítico, sem sinais de inflamação. A
53
neoformação mostrou-se restrita as bordas do defeito ósseo, revestidas por
células cúbicas, característica de osteoblastos ativos. O tecido ósseo
neoformado osteócitos incluídos na matriz mineralizada (Figura 21 e 22).
Figura 21. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal tratado
com a molécula C1 a 1% 30 dias após o experimento.
Figura 21. Coloração H.E. Aumento aproximado no
original 40x. Bordas ósseas revestidas por células cúbicas
ou osteoblastos ativos (setas).
Figura 22. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal tratado
com a molécula C1 a 5% 30 dias após o experimento.
Figura 22. Coloração H.E. Aumento aproximado no original
40x Bordas ósseas revestidas por células cúbicas ou
osteoblastos ativos (setas) e osteócitos na matriz do osso
recém-formado (cabeça de seta).
54
Histologicamente, na concentração de 10%, foi observada na região
central do defeito, formação de tecido conjuntivo sem sinais de inflamação. Não
se observou neoformação óssea na região central da ferida, ou seja, a
osteogênese
permaneceu
restrita
às
bordas
do
defeito,
revestidas
principalmente por células cúbicas que indicam osteoblastos ativos. A
neoformação óssea mostra características de tecido primário, com distribuição
irregular de osteócitos incluídos na matriz mineralizada (Figura 23).
Figura 23. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal tratado
com a molécula C1 a 10% 30 dias após o experimento.
Figura 23. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 20x
Bordas ósseas revestidas por células cúbicas ou osteoblastos
ativos (setas) e osteócitos na matriz do osso recém formado
(cabeça de seta).
(2E)-3-(4-clorofenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona – C2
Na concentração de 1%, este grupo exibiu proliferação celular junto ao
periósteo, sem indícios de inflamação. As feridas mostraram neoformação óssea
limitada, partindo das bordas do defeito crítico, com osteócitos na matriz recém
mineralizada. Os osteoblastos presentes nas superfícies ósseas possuem
morfologia de atividade, indicando continuidade da osteogênese (Figura 24).
55
Figura 24. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal tratado
com a molécula C2 a 1% 30 dias após o experimento.
Figura 24. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 40x.
Superfície de reparo ósseo revestida por osteoblastos ativos
(setas) e osteócitos incluídos na matriz (cabeça de seta).
Na dose de 5%, nota-se formação óssea restrita as bordas do defeito
crítico e presença de tecido conjuntivo preenchendo a ferida. As células
adjacentes as bordas do defeito mostram características de atividade. O osso
recém formado apresenta osteócitos incluídos na matriz mineralizada (Figura
25).
Figura 25. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal tratado
com a molécula C2 a 5% 30 dias após o experimento.
Figura 25. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 40x.
Superfície de reparo ósseo revestida por osteoblastos ativos
(setas) e osteócitos incluídos na matriz (cabeça de seta).
56
À 10%, a análise histológica demonstrou que o osso recém-formado
apresenta-se revestido por osteoblastos ativos e osteócitos na matriz óssea
mineralizada. A substância osteóide é mais evidente nessa concentração
indicando maior atividade secretora (Figura 26).
Figura 26. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal tratado
com a molécula C2 a 10% 30 dias após o experimento.
Figura 26. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 40x.
Superfície de reparo ósseo revestida por osteoblastos ativos
(setas), osteócito (cabeça de seta) e matriz osteóide (O).
(2E)-3-(4-metilfenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona – C3
Em relação a esse composto na concentração de 1% e 5% observou-se
na análise microscópica, que este grupo demonstrou feridas preenchidas por
tecido conjuntivo fibroso, sem sinais de inflamação, limitada neoformação óssea,
com superfícies revestidas por células ativas (Figura 27 e 28).
57
Figura 27. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal tratado
com a molécula C3 a 1% 30 dias após o experimento.
Figura 27. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 40x.
Superfície de reparo ósseo revestida por osteoblastos ativos
(setas) e osteócito (cabeça de seta).
Figura 28. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal tratado
com a molécula C3 a 5% 30 dias após o experimento.
Figura 28. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 40x.
Presença de osteoblastos ativos nas superfícies de reparo (setas).
À 10%, essa molécula mostrou tecido conjuntivo sem sinais de
inflamação; formação óssea restrita as bordas do defeito crítico; com presença
58
de matriz osteóide secretada por osteoblastos ativos dispostos por toda a
extensão da superfície óssea (Figura 29).
Figura 29. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal tratado
com a molécula C3 a 10% 30 dias após o experimento.
Figura 29. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 40x.
Tecido conjuntivo (TC), superfície de reparo ósseo revestida por
osteoblastos ativos (setas), osteócitos incluídos na matriz
mineralizada (cabeça de seta) e matriz osteóide (O).
(2E)-3-(4-metoxifenil)-1-fenilprop-2-en-1-ona – C4
Após 4 semanas, o composto C4 na concentração de 1% mostrou que os
sítios apresentavam osteogênese restrita as bordas do defeito em contato com o
osso basal e mineralização da matriz óssea neoformada, enquanto a região
central apresentava-se preenchida por tecido conjuntivo fibroso em continuidade
com o periósteo sem indícios de inflamação (Figura 30).
59
Figura 30. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal tratado
com a molécula C4 a 1% 30 dias após o experimento.
Figura 30. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 40x. Tecido
conjuntivo (TC), osteoblastos ativos (setas) na superfície das feridas, osteócitos
na matriz mineralizada (cabeça de seta).
Já, na concentração de 5% e 10% as características apresentadas foram
similares. O composto apresentou tecido conjuntivo fibroso, sem indícios de
inflamação. A neoformação óssea apresenta matriz osteóide secretada pelos
osteoblastos ativos nas bordas ósseas. Nota-se, na concentração de 10%
indícios de remodelamento ósseo com áreas características de osso secundário.
(Figura 31 e 32).
Figura 31. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal tratado
com a molécula C4 a 5% 30 dias após o experimento.
Figura 31. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 40x.
Tecido conjuntivo (TC), superfície de reparo ósseo revestida por
osteoblastos ativos (setas), osteócitos (cabeça de seta).
60
Figura 32. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal tratado
com a molécula C4 a 10% 30 dias após o experimento.
Figura 32. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 20x.
Superfície de reparo ósseo revestida por osteoblastos ativos
(setas), osteócitos (cabeça de seta) osso primário (OP) e osso
secundário (OS).
(2E)-1,3-difenilprop-2-en-1-ona - C5
Nas concentrações de 1% e 5% observa-se tecido conjuntivo na região
central do defeito. A osteogênese parece estar ainda ocorrendo, uma vez que os
osteoblastos nas superfícies ósseas apresentam características de atividade,
com formação de matriz osteóide (Figura 33 e 34).
61
Figura 33. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal tratado
com a molécula C5 a 1% 30 dias após o experimento.
Figura 33. Coloração H.E. Aumento no original 40x. Osteoblastos
ativos (setas) na superfície das feridas, osteócitos na matriz
mineralizada (cabeça de seta).
Figura 34. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal tratado
com a molécula C5 a 5% 30 dias após o experimento.
Figura 34. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 40x.
Superfície de reparo ósseo revestida por osteoblastos ativos
(setas) e osteócitos incluídos na matriz (cabeça de seta).
Nas feridas tratadas com a molécula á 10% as amostras apresentavam na
área central do defeito a presença de tecido conjuntivo e ausência de infiltrado
inflamatório. Houve neoformação óssea nas bordas do defeito crítico, com
redução significativa do diâmetro do defeito. O tecido ósseo recém-formado
62
apresenta
características
concêntricas,
sugerindo
de
remodelamento
maturidade
do
ósseo,
tecido.
com
Ainda,
estruturas
caracterizando
continuidade da osteogênese, há presença de osteoblastos ativos nas
superfícies ósseas (Figura 35).
Figura 35. Corte histológico de defeito crítico na calota craniana de um animal tratado
com a molécula C5 a 10% 30 dias após o experimento.
Figura 35. Coloração H.E. Aumento aproximado no original 20x.
Tecido conjuntivo (TC), superfície de reparo ósseo revestida por
osteoblastos ativos (seta), osteócitos (cabeça de seta),
estruturas concêntricas (seta tracejada), osso primário (OP) e
osso secundário (OS)
63
5 DISCUSSÃO
Este trabalho objetivou estudar o potencial osteogênico em defeitos
críticos na calota craniana de ratos de moléculas de chalcona com diferentes
substituintes propostos por Topliss, em diferentes concentrações (1%; 5% e
10%) utilizando como veículo carreador, a vaselina. A calvária desse animal foi
escolhida para simular perdas ósseas porque é composta por osso
membranoso, tem um suprimento sanguíneo relativamente limitado o que lhe
confere pouca capacidade para se regenerar. Além disso, é uma área
anatomicamente livre de estresse mecânico, com uma estabilidade relativa das
estruturas que circundam os defeitos críticos, como margens calvariais intactas,
a base da dura-máter e os músculos temporais e frontais. Essas características
criam uma situação na qual é possível estudar as interações entre o material
implantado e o osso “in situ” (MANKANI et al., 2006; SPICER et al., 2012).
O periósteo foi mantido, pois corresponde um tecido fibroso condensado e
altamente celular e vascularizado, fornecendo aporte sanguíneo, bem como
células osteoprogenitoras, desempenhando importante papel no crescimento
dos ossos e na reparação de fraturas (GONDIN, 2007).
Utilizou-se o período máximo de 30 dias, pois estudos (ORTOLAN et al.,
2013) demonstram que 45 dias pós-tratamento, o uso de uma molécula bioativa
como a chalcona, é capaz de promover um reparo completo da ferida crítica,
limitando o estudo com o objetivo de comparar o crescimento ósseo entre os
grupos experimentais. Dessa maneira, 30 dias de experimento torna-se o
período de escolha para mensurar a reparação óssea, através da medida dos
diâmetros das feridas ósseas remanescentes, sem que ocorra a reparo total do
defeito.
Assim, de acordo com a metodologia utilizada, observou-se que os grupos
controle e veículo apresentaram pequena área de neoformação óssea, sem
diferenças estatísticas entre si, sendo que nenhuma das amostras evoluiu para
regeneração
significativa
nos
30
dias
experimentais
desse
trabalho,
caracterizando o modelo de ferida crítica.
A análise histológica mostrou, nos grupos controle e veículo, que os
osteoblastos presentes nas bordas das feridas ósseas, caracterizados como
64
células de revestimento ósseo, formam uma camada contínua de células
achatadas que reveste a matriz calcificada, apresentando, em ambos os grupos,
capacidade de síntese reduzida, indicativo de neoformação óssea limitada, como
apresentado pelos resultados quantitativos.
Oliveira et al. (2008) obteve resultados semelhantes ao avaliar o reparo
de feridas críticas, promovido pelo implante de osso bovino desmineralizado,
mostrando que, 21 dias após o experimento, esse biomaterial é substituído por
tecido fibroso e que em períodos posteriores (90 dias) o reparo continua
incompleto.
Na concentração de 1%, os animais tratados com as diferentes
moléculas, demonstraram formação óssea limitada. Nessa concentração,
apenas as moléculas C3, C4 e C5 mostraram diferenças estatísticas em relação
ao grupo controle, embora em todas as amostras encontram-se osteoblastos
ativos nas superfícies do tecido ósseo recém formado.
Já, as feridas tratadas com as 5 chalconas na concentração de 5%
apresentam resultados quantitativos significantes em comparação ao grupo
controle quanto ao fechamento da ferida óssea, confirmado pela análise
histológica, que mostra osteoblastos ativos nas bordas do tecido ósseo,
indicativo de atividade secretora dessas células.
Quanto ao tratamento das feridas com as moléculas a 10%, novamente
todas mostraram-se significativas em relação ao controle e ao veículo, sugerindo
intensa atividade dos osteoblastos nas superfícies ósseas do tecido recém
formado.
Embora, neste estudo, não se observou a cascata de eventos vinculados
à osteogênese, como relata o estudo de Ripamonte e Reddi (1992) em
implantes heterotópicos de matriz óssea desmineralizada, podemos inferir a sua
ocorrência “induzida” pelas moléculas de chalcona utilizadas.
Além disso, neste estudo, as feridas tratadas com veículo mostraram
intensa reação inflamatória, caracterizada pela presença de vasos sanguíneos
ingurgitados e células mononucleares. Issa et al. (2010) mostraram que quando
se usa um carreador como o colágeno, mesmo sendo considerado um material
biocompatível, duas semanas após a sua aplicação, as amostras apresentam na
região central da ferida crítica, um infiltrado inflamatório, com grande quantidade
de células sanguíneas.
65
Entretanto, apesar de primariamente a inflamação representar um dos
mecanismos de defesa do organismo, vale ressaltar que aparentemente o
veículo utilizado neste estudo (vaselina) parece promover uma inflamação
intensa, comprometendo o processo de regeneração óssea, uma vez que em
nosso estudo, mesmo após 30 dias, essa fase do reparo (inflamatória) ainda
permanece bem evidenciada.
Nas feridas tratadas com as moléculas de chalcona, durante o período de
estudo, não se observou sinais de inflamação em nenhuma das amostras
analisadas. Nyan et al (2007) observou em feridas críticas de calota craniana de
ratos, que a sinvastatina em combinação com sulfato de cálcio, durante 2, 4 e 8
semanas, promove uma inflamação intensa nos períodos iniciais seguida de
reparo ósseo acentuado nos períodos tardios.
Aparentemente, as chalconas utilizadas nesse estudo minimizam os
efeitos do processo inflamatório (KIM et al., 2007; BANDGARD et al., 2010),
contribuindo para a melhora do estímulo do reparo ósseo. Estudos de CamposBuzzi (2007) mostram que a introdução de substituintes doadores e sacadores
de elétrons sugerem contribuem de forma significativa para a antinocicepção
dessas substâncias, como consequência da diminuição da inflamação
(CAMPOS-BUZZI, 2007).
Ainda, neste estudo, os resultados mostraram que nas feridas tratadas
com as chalconas em todas as concentrações (1%, 5% e 10%) observou-se
predominantemente osteoblastos ativos, que contribuem para a formação de
matriz óssea, indicativo de reparo da ferida em períodos maiores de estudo (45,
60 dias do experimento), como demonstrado em estudos de Ortolan et al.
(2013).
O fato de que os grupos tratados com as moléculas de chalcona, mesmo
após 30 dias de tratamento, ainda apresentarem células ativas permite sugerir
que as chalconas apresentam maior potencial osteogênico quando comparado
ao FGF-1 em estudos de Gomez et al. (2006), o qual mostra que em feridas
críticas de calota craniana de ratos tratadas com essa substância, houve baixa
formação de osso, concluindo que o FGF-1 apresenta poucos benefícios quando
se trata de reparo ósseo.
Sabe-se que, como no processo de reparo ósseo geralmente ocorre o
mesmo tipo de osteogênese que deu origem ao tecido lesado, tudo indica que o
66
reparo induzido pela chalcona ocorreu por mecanismo intramembranoso, que é
responsável pela formação dos ossos de calota craniana (ORTOLAN et al.,
2013).
De acordo com Ortolan et al. (2013), inicialmente, o mecanismo de reparo
do tecido ósseo apresenta uma fase de síntese e maturação de fibras
colágenas, porém, acredita-se que não houve interação das chalconas com as
células ectomesenquimais na diferenciação celular quanto à formação de tecido
conjuntivo fibroso porque de acordo com os resultados desse trabalho, o tecido
fibroso formou-se em todos os grupos, ou seja, tratados e não tratados, sem
sinais de osteogênese na região central das feridas.
Neste estudo, a formação de tecido ósseo a partir das bordas dos defeitos
críticos evoluindo para o fechamento significativo das feridas, principalmente nos
grupos tratados com as chalconas a 10%, sugere que estas substâncias podem
atuar na diferenciação celular da linhagem osteogênica propriamente dita
(células osteoprogenitoras e osteoblastos).
Acredita-se que a estrutura das chalconas utilizadas nessa pesquisa dada
por dois anéis aromáticos e substituintes propostos por Topliss conferem a
essas moléculas certo grau de lipofilicidade (WON et al., 2005; JHA et al., 2007),
podendo, desta maneira, interagir em alguma das fases do reparo junto a
receptores de membrana ou citoplasmáticos de células ósseas, ou através de
fatores de transcrição e secreção de proteínas não colágenas como as BMPs
entre outros, responsáveis pela elaboração de matrizes extracelulares que
mineralizam, estando de acordo com estudo de Kim et al (2012) quanto a
possível indução da Licochalcona A na expressão de BMP, fator importante no
mecanismo de osteogênese.
Assim, o reparo promovido pelas chalconas, é semelhante ao obtido com
rhBMP-2, cuja eficiência já foi demonstrada por Issa et al. (2008) relatando uma
melhoria substancial em qualidade e quantidade do reparo quando comparadas
com
reparo espontâneo. Convém ressaltar que é necessário cerca de um
quilograma de osso para se obter poucos microgramas de BPM, dificultando o
uso generalizado desse material (SCHMIDT, 2006) em razão dos custos. Desta
forma, as chalconas tem a vantagem de obtenção simples, economicamente
viável e em quantidade desejada.
67
Atualmente, a proposta da bioengenharia quando se trata de regeneração
óssea é a combinação de células tronco com matrizes artificiais, tridimencionais,
porosas, biodegradáveis que oferecam condições favoráveis para a proliferacao
e diferenciacao celular (TUZLAKOGLU; REIS, 2009).
Kneser et al. (2006) revestiu discos de osso esponjoso bovino com uma
matriz de fibrina contendo osteoblastos e observou que, após 4 meses houve
neoformação óssea significativa e que a presença dos osteoblastos não
modificou o potencial de reparo do disco de osso esponjoso.
Ressalta-se que este estudo, limitou-se a avaliar o potencial de reparo
ósseo das chalconas, sem a elaboração de uma matriz tridimensional nem a sua
combinação com células tronco, em um período de 30 dias acreditando-se,
entretanto, que melhores resultados poderiam ser obtidos em estudos com
intervalos de tempo maiores que 4 semanas, conforme demonstrado por Issa et
al. (2008) ao estudarem o potencial osteogênico das rhBMP-2. Esta proteína
bovina foi capaz de induzir a regeneração óssea tendo sua ação potencializada
quando combinada com elementos carreadores, sendo também, a reparação
óssea dependente do tempo.
Ainda, neste estudo, a osteogênese apresentada pelas 5 moléculas de
chalcona, se mostrou de maneira dose dependente, ou seja, foram observadas
diferenças crescentes de formação óssea quando se utilizou concentrações
maiores.
Estudos de Kim (2012), utilizando a licochalcona A em modelos in vivo e
in vitro, demonstraram que essa molécula não apresenta um bom potencial
osteogênico na dose de 10µM em comparação com as doses menores (2,5 e
5uM), embora a concentração maior não apresente nenhum tipo de
citotoxicidade.
Neste estudo, não se observou, no teste in vivo, alteração celular com
processos de necrose, confirmando a baixa toxicidade destes compostos já
descritos na literatura (Santana 2012). Ao contrário, o uso das moléculas a 10%
representou em todos os grupos, a dose mais efetiva quanto ao estímulo de
osteogênese, mostrando maior neoformação óssea quando comparada as
demais concentrações. Além disso, a qualidade do osso formado parece ser
superior nessa concentração (10%), principalmente nos grupos tratados com as
moléculas C4 e C5, pois apresentaram características de osso secundário.
68
De qualquer maneira, sabe-se que uma dose adequada e que promova
um reparo ósseo adequado, depende da espécie que esta sendo utilizada nos
testes experimentais. Ainda, a dose parece ser dependente do local onde foi
implantada a substância testada, pois, as diferenças encontradas devem-se ao
aporte sanguíneo adequado, presença de células mesenquimais e de linhagem
osteogênica.
Além disso, a dose eficaz varia de acordo com o carreador que esta
sendo utilizado (veículo) o que demonstra a importância das propriedades do
biomaterial transportador na administração de substâncias que possam
promover a osteogênese (BOERCKEL et al., 2011).
Neste estudo, os graus diferentes de reparo ósseo observados pelo
tratamento com as 5 moléculas de chalconas com os substituintes de Topliss
não demonstraram grandes diferenças quando comparadas entre si, sugerindo
que, independente da molécula utilizada, a osteogênese continua ocorrendo
devido a presença de células ativas nas superfícies do tecido ósseo neoformado,
diferente dos grupos controle e veículo que, ao contrário, demonstraram
osteoblastos ativos nas bordas ósseas. Portanto, as 5 moléculas utilizadas
apresentam potencialidades quanto à formação óssea, entretanto as moléculas
C4 e C5 na concentração de 10% apresentaram maior neoformação óssea no
período estudado e melhor qualidade óssea.
Na concentração de 10%, a molécula mais efetiva foi a não substituída
demonstrando que o efeito estéreo é mais significativo que os efeitos
hidrofóbicos e eletrônicos observando-se a relação proposta por Topliss.
O efeito das variações da forma e do tamanho de uma molécula a ser
analisada é de grande importância quando se quer comprovar sua eficácia frente
a uma atividade biológica. Por outro lado, deve-se considerar que ainda
permanece desconhecida a estrutura e o receptor no qual as chalconas estão
atuando. Portanto, há a necessidade de síntese de compostos análogos com
maior variedade de substituintes para que se possa comprovar essa hipótese
através da análise de outros parâmetros físico-químicos que podem também
estar envolvidos nesta atividade biológica.
Neste estudo, de acordo com o método utilizado, levando em conta o
potencial osteogênico apresentado pelas chalconas, estas moléculas podem
representar uma perspectiva farmacológica na aceleração do reparo ósseo,
69
todavia, é importante continuar os estudos avaliando outras moléculas e
carreadores, em outras metodologias, a fim de determinar especificamente a
função das chalconas, considerando o aspecto custo/benefício envolvido no
processo de síntese dessas substâncias.
70
6 CONCLUSÃO
Os resultados desse estudo, de acordo com a metodologia utilizada, permitem
concluir que:
 Na concentração à 1%, somente as moléculas C3, C4 e C5 mostraram
diferenças significativas em relação ao grupo controle, embora todas as
amostras apresentam osteoblastos ativos, indicativo de continuidade da
osteogênese;
 Nas concentrações de 5% e 10%, em todos os grupos, houve maior
atividade de reparo da ferida óssea, com fechamento ósseo significativo
em relação ao grupo controle; demonstrando maior atividade secretora
dos osteoblastos ativos presentes nas bordas ósseas;
 Todas as moléculas apresentaram uma relação dose-resposta;
 Não se observou, com os diferentes substituintes propostos por Topliss,
diferenças
significativas
entre
as
moléculas,
em
uma
mesma
concentração;
 A concentração a 10% foi a mais efetiva em relação a formação óssea em
todas as moléculas analisadas;
 A inibição do infiltrado inflamatório observado nas feridas tratadas com a
chalcona pode ser favorável no processo de “indução” de osteogênese;
 A molécula mais efetiva foi a não substituída, na concentração de 10%,
apresentando maior potencial osteogênico quanto ao fechamento da
ferida óssea e a qualidade de osso formado.
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79
ANEXO
Artigo científico “Osteogenic potential of a chalcone in a critical-size defect in rat
calvaria bone” publicado no Journal of Cranio-Maxillofacial Surgery.