XXV CONGRESSO BRASILEIRO DE ZOOTECNIA
ZOOTEC 2015
Dimensões Tecnológicas e Sociais da Zootecnia
Fortaleza – CE, 27 a 29 de maio de 2015
Polimorfismos Genéticos no Éxon II do Gene β-Defensina II em Ovinos da Região Amazônica do
Brasil.1
Genetic Polymorphisms in the Exon II of β-Defensin II gene in Amazon sheep herd in Brazil.
Beijiane Botelho de Souza2, Elizabeth Machado Barbosa3, Juliana Simão Nina de Azevedo4, Luiz Fernando
de Souza Rodrigues 4, Alex Sandro Schierholt4, Rafaelle Casseb Guimarães5, Evonnildo Costa Gonçalves6, e
Ednaldo da Silva Filho4.
1
Trabalho de TCC, da Universidade Federal Rural da Amazônia.
Acadêmica do Curso de Zootecnia da Universidade Federal Rural da Amazônia. Belém-PA, Brasil. Email:
[email protected]
3
Doutoranda do Curso de Pós-graduação em Ciência Animal da Universidade Federal do Pará. Belém-PA,
Brasil.
4
Centro de Pesquisa de Caprinos e Ovinos do Pará. Universidade Federal Rural da Amazônia. Belém-PA,
Brasil.
5
Acadêmica do Curso de Zootecnia da Universidade Federal Rural da Amazônia. Belém-PA, Brasil.
6
Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará. Belém-PA, Brasil.
2
Resumo: A Região Norte do Brasil é a quinta maior produtora de ovinos, sendo o Estado do Pará o maior
criador de ovinos na Região. A produção animal é um desafio para Região Amazônica por apresentar alta
diversidade de micro-organismos patógenos aos humanos e animais. As defensinas são peptídeos
antimicrobiais que atuam como uma primeira barreira contra os micro-organismos. Portanto, o objetivo deste
trabalho foi detectar polimorfismos no éxon II no gene β-Defensin II em ovinos da Amazônia. O gene foi
amplificado por PCR a partir de DNA extraído de amostras de sangue de ovinos da raça Santa Inês. Os
produtos sequenciados foram alinhados e as análises estatísticas realizadas. Três pontos com polimorfismos
de única base (SNP) com substituições do tipo transição (A↔G) nas posições 1643, 1659 e 1750 foram
observados. Os polimorfismos 1643 e 1750 apresentaram baixa variabilidade e significativos desvios do
Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) (P<0,05). O SNP 1659 apresentou moderada variabilidade genética e
ausência de desvios do EHW (P>0,05). Os SNP 1643 e 1659 resultaram em mudanças de aminoácidos da
cadeia peptídica, sendo Isoleucina para Valina e Argelina para Lisina. Portanto os polimorfismos detectados
são importantes marcadores para estudos da eficiência da β- Defensina II no sistema imunológico de ovinos
na Região Amazônica Brasileira.
Palavras–chave: AMPs, imune inato, ovelhas, SBD-2, SNP.
Abstract: The Brazil northern region is the fifth largest producer of sheep, and the Pará State is the largest
breeder of sheep in the region. Livestock production is a challenge for the Amazon region because of the
high diversity of microorganisms pathogens to humans and animals. Defensins are antimicrobial peptides,
acting as a first barrier against microorganisms. Therefore, the objective of this study was to detect βdefensin gene II polymorphisms in exon II in the Amazon sheep. The gene was amplified by PCR from DNA
extracted for Santa Ines sheep blood samples. The products were sequenced and aligned the statistical
analyzes performed. Three points with single nucleotide polymorphisms (SNP) were observed with transition
substitutions type (A↔G) at positions 1643, 1659 and 1750. Polymorphisms in 1643 and 1750 showed low
variability and significant deviations from Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) (P <0.05). The SNP 1659
showed moderate lack of genetic variability and deviation from HWE (P> 0.05). SNPs 1643 and 1659
resulted in changes of amino acid in the peptide chain, isoleucine to valine and argeline to lysine. Thus,
polymorphisms detected are important markers for studies of β- Defensin II efficiency in the immune system
of sheep in the Brazilian Amazon
Keywords: AMPs, innate immune, SBD-2, sheep, SNP
Introdução
A ovinocultura é uma das principais atividades do sistema agroecológico da Amazônia com a
produção de carnes, leite e outros derivados de origem animal, embora seja um desafio, pois existe uma
ampla diversidade de micro-organismos patógenos e de vetores, como os artrópodas hematófagos e os
vertebrados silvestres responsáveis por causar varias doenças (CASSEB et al., 2013).
Página - 1 - de 3
XXV CONGRESSO BRASILEIRO DE ZOOTECNIA
ZOOTEC 2015
Dimensões Tecnológicas e Sociais da Zootecnia
Fortaleza – CE, 27 a 29 de maio de 2015
Existe uma família de pequenos peptídeos chamados de Defensinas que estão envolvidas no
mecanismo imune inato, atuando contra bactérias, vírus, e fungos através de suas atividades antimicrobial e
citotóxica. Monteleone et al. (2011) realizaram pesquisa com os ovinos italianos e encontraram cinco SNPs,
sendo um no éxon I e quatro no éxon II. Alguns desses polimorfismos do éxon II causam mudanças na cadeia
de aminoácidos da SDB-2. Portanto, o objetivo desse trabalho foi analisar a sequência de nucleotídeos do
éxon II e parte da região 3’ não traduzida (3’-UTR) do gene SDB-2 de um rebanho de ovinos na Amazônia
(Estado do Pará-Brasil) e identificar possíveis polimorfismos não silenciosos, quando comparadas com outras
sequências encontrados na literatura.
Material e Métodos
Procedimentos Laboratoriais das Amostras
Um total de 47 animais (40 machos e 7 fêmeas) da raça Santa Inês foi selecionado do Centro de
Pesquisa de Caprinos e Ovinos do Pará da Universidade Federal Rural da Amazônia, na cidade de Belém,
Estado do Pará. Foram coletados 5 mL de sangue da veia jugular usando tubos de Vacuntainer. A partir
dessas amostras foram realizadas as extrações de DNA pelo método Fenol:clorofórmio:álcool isoamílico
(25:24:1) em tubo tipo eppendorf de 1,5 mL.
As reações em cadeia da Polimerase (PCR) foram realizadas para isolar e amplificar o éxon II do gene
da Beta Defensina II (SBD-2) e parte da 3’-UTR de ovinos (392 pb) utilizando os primers ForwardGTTGTCATGAAGCCGTGTCCA e Reserve- ACCTCAATGACCAGTGGGCAAGAT, desenvolvidos por
Monteleone et al. (2009). As condições dos PCR foram para um volume final de 25 μl, com1X STR 10X
Buffer; 3 mM de MgCl2; 1,2 mM de cada dNTP; 5 pMol de primer; 1 U Taq DNA Polimerase (kit da Life
Technology, Brasil); e 50-100 ng de DNA genômico. A temperatura de desnaturação inicial foi de 94˚C por 5
minutos, seguido por 30 ciclos de 94˚C por 1 minuto, 60˚C por 45 segundos e 72˚C por 1 minuto. Por fim era
mantido uma temperatura de extensão de 72˚C durante 10 minutos. O termociclador usado para as reações foi
o 2720 Thermal Cycler (Applied Bisystems).
Os produtos dos PCR foram visualizados em gel de agarose 1.5% contendo gelred (Biotium –
California/USA). Em seguida, os produtos dos PCR foram purificados com a enzima Illustra ExoProStar 1Step (GE Healthcare – UK), seguindo as recomendações do fabricante. Os produtos purificados foram
sequenciados utilizando kit BIG DYE (Life Technology) em sequenciador automático de DNA ABI 3500 XL
(Applied Byos).
Análise de Sequências e Estatísticas
As sequências foram editadas e alinhadas pelo programa Bioedit. Em seguida, os polimorfismos
observados foram tabulados e analisados. O programa POPGENE 1.32 (Yeh et al. 1999) foi usado para
determinar as frequências alélicas e genotípicas, como também o índice de Shannon, determinar as
homozigoses observadas, heterozigoses observadas e esperadas, os desvios a partir do equilíbrio de HardyWeinberg (HWE) com a existência de associações randômicas dos genótipos através do método em Cadeia
de Markov e os coeficientes de endocruzamentos (Fis) no rebanho analisado, como também o desequilíbrio
de ligação entre os genótipos.
Resultados e Discussão
Todos os produtos de PCR representativos de cada animal foram sequenciados nos sentidos forward e
reverse. Após a edição e alinhamento das sequências, foram observadas três posições polimórficas: 1643,
1659 e 1750. Todas as substituições foram do tipo transição (A↔G), sendo que a posição 1643 foi de A para
G. Contudo, o alelo selvagem A foi mais frequente que o alelo mutante G. Na posição 1659 a substituição foi
de G para A, sendo o alelo mutante G mais frequente o alelo mutante A. Na posição 1750 a substituição foi
de G para A e o alelo selvagem G foi mais frequente que o alelo mutante A. Foram encontrados todos os
genótipos possíveis para cada SNP, sendo AA o genótipo mais frequente na posição 1643, AG o genótipo
mais frequente na posição 1659 e GG na posição 1750.
Na posição 1643, a homozigose observada (Hoob) foi muito alta e a heterozigose observada (Heob) foi
muito baixa demonstrando significativos (P<0,01) desvios do Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW). A
diversidade genética do referido locus, obtida por meio dos valores de Heterozigosidade esperada (He es) e
Índice de Shannon (IS), foi considerada baixa. Na posição 1659, a Hoob e a Heob foram moderados e
demonstraram que o locus não apresenta desvios de EHW (P>0,05). A diversidade genética do referido locus
foi moderado por meio da Hees e do IS. Na posição 1750, a Hoob foi alta e a Heob foi baixa, demonstrando
significativos (P<0,01) desvios do EHW e a diversidade genética do referido locus foi considerada baixa
Página - 2 - de 3
XXV CONGRESSO BRASILEIRO DE ZOOTECNIA
ZOOTEC 2015
Dimensões Tecnológicas e Sociais da Zootecnia
Fortaleza – CE, 27 a 29 de maio de 2015
através dos valores de Hees e IS. No geral, quando o rebanho é avaliado com todos os loci os desvios de
Hardy-Weinberg foram significativos (P<0,05).
Monteleone et al. (2009) registram três SNPs no éxon II da β-defensina de ovinos italianos nas
posições 1659, 1750 e 1761. Em seguida, Monteleone et al. (2011) registram quatro SNPs, sendo os três
anteriores e um novo na posição 1667. Portanto, nesta pesquisa foi registrado um novo SNP no éxon II da β defensina de ovinos na posição 1643. Este polimorfismo ocorre no 37° códon, sendo o selvagem ATC, o qual
codifica o aminoácido Isoleucina, enquanto que códon mutante é GTA, que codifica Valina, ambos os
aminoácidos são apolares (Belitz et al., 2009). Hervé et al (2014), observaram que alterações na estrutura
proteica da β-defensina resulta em modificações tri-dimensionais e alteram o espectro anti-microbial devido a
mudanças nas cadeias betas do polipeptídeo, gerando uma menor eficiência do sistema imune inato em
Ovodefensina de frangos. Contudo, Monteleone et al. (2011) observaram que os SNPs que possibilitaram
modificações de aminoácidos na β-defensina 2 de ovinos não foram suficiente para alterar a estrutura e a
função do polipeptídeo.
Monteleone et al. (2009) observaram correlações dos polimorfismos do éxon II com o polimorfismo
na posição 1761 na região 3’não traduzida (3’-UTR). No entanto, o polimorfismo na posição 1761não foi
detectado, tendo sido somente verificado na posição 1750 da 3’-UTR. Portanto, este trabalho corrobora com
Monteleone et al. (2009) associando somente o polimorfismo da posição 1659 com a posição o 1761 da
região 3’-UTR, mas a posição 1643 não foi correlata com a posição 1750.
Conclusões
Pela relevância das atividades antimicrobiais da β-defensina II nos ovinos e outros animais
domésticos, principalmente na Região Amazônica, os polimorfismos genéticos demonstraram ser de grande
importância na modulação do sistema imunológico dos ovinos. Sendo assim, seria de fundamental
importância avaliar outros rebanhos e outras raças criadas na Região e associar esses polimorfismos com
caracteres que demonstrem o desempenho dos animais com auxílio do sistema imune inato.
Literatura citada
BELITZ, H.D.; GROSCH, W.; SCHIEBERLE, P.; JOHN, M. Food Chemistry. 4ª.ed. Berlin Heidelberg:
Springer. Capítulo 1. Amino Acids, Peptides, Proteins. p. 8-34. 2009.
CASSEB, A.R; CASSEB, L.M.N; SILVA, S.P; VASCONCELOS, P.F.C. ARBOVÍRUS: IMPORTANTE
ZOONOSE NA AMAZÔNIA BRASILEIRA. Veterinária e Zootecnia. v. 20. p. 9-21. 2013.
HERVÉ, V.; MEUDAL, H.; LABAS, V.; RÉHAULT-GODBERT, S.; GAUTRON, J.; BERGES, M.;
GUYOUT, N.; DELMAS, A.F.; NYS, Y.; LANDON, C. Three-dimensional NMR structure of Hen Egg
Gallin (Chicken Ovodefensin) reveals a new variation of the β-defensin fold. J Biol Chem. v. 289 (10). p.
7211-20. 2014.
MONTELEONE, G; CALASCIBETTA, D. ; REINA, R. Study of β-defensin polymorphisms in Valle del
Belice dairy sheep. Ital. J. Anim. Sci. v. 8 (Suppl. 2). p. 111-113. 2009.
MONTELEONE, G. et al. Polymorphisms of b-defensin genes in Valle del Belice dairy sheep. MolBiol
Rep (2011) 38:5405–5412.
YEH, F. YANG, C and BOYLE T. POPGENE Version 1.32 Microsoft Window-Based Freeware for
Population Genetic Analysis. University of Alberta, Edmonton. 1999.
Página - 3 - de 3