Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto
Programa de Pós-Graduação em Toxicologia
Universidade de São Paulo
Estado nutricional, exposição ao mercúrio e situação
da Doença de Chagas em populações ribeirinhas da
Amazônia
Doutoranda: Juliana Valentini
Orientador: Dr. Fernando Barbosa Junior
Comitê de Tese: Dra. Cristina Romana; Dr. Carlos José Sousa
Passos
Ribeirão Preto – SP
Setembro, 2009
Resumo
As questões em torno da poluição ambiental por mercúrio (Hg) e conseqüente
exposição humana por via alimentar na Amazônia (consumo de peixes contaminados),
bem como o comportamento do MeHg e sua toxicidade em população exposta e em
animais de modelos experimentais tem sido objeto de diversas pesquisas ao longo das
últimas décadas, na tentativa de se determinar o risco real que este elemento apresenta
as populações ribeirinhas amazônicas. No entanto, os mecanismos que levam aos efeitos
tóxicos do MeHg ainda não são muito estudados em populações expostas ao metal.
Também nessa população, casos emergentes e isolados de Doença de Chagas
têm surgido e evoluído de forma exponencial. Este tipo de infecção torna-se um
problema de saúde pública, uma vez que os efeitos da infecção crônica, principalmente
no sistema cardiovascular, são altamente deletérios em um número considerável de
indivíduos, prejudicando assim a qualidade e expectativa de vida. No entanto não há
dados na região englobada pelo presente projeto acerca a incidência epidemiológica de
casos de Doença de Chagas.
Assim, o estilo de vida das populações da Amazônia levanta questionamentos
acerca da exposição ao Hg e a infecção chagásica, que representam ambos, riscos
cumulativos para a saúde em geral. Diante dessa problemática, a avaliação de tais
riscos, através de exames clínicos e bioquímicos nas populações ribeirinhas da área de
estudo, se fazem necessárias.
Em suma, o presente projeto de pesquisa propõe-se a adicionar esforços através
de um consórcio de pesquisadores brasileiros e canadenses a fim de explorar diversas
questões relacionadas à saúde humana. Particularmente, através de coletas de sangue, a
quantificação, bem como a elucidação dos mecanismos tóxicos envolvidos quando da
exposição ao Hg serão avaliados. Ao mesmo tempo, através da sorologia
proporcionaremos dados concretos acerca dos casos de infecção chagásica na região do
estudo, com concomitante avaliação bioquímica dos voluntários soro-positivo. Isto será
de suma importância para o entendimento de mecanismos fisiopatológicos decorrentes
da eventual exposição ao Hg e infecção chagásica em populações que vivem essa
problemática.
1. Revisão da Literatura
1.1. O cenário epidemiológico
A presença do mercúrio (Hg) nos ecossistemas amazônicos, e a exposição
humana a este poluente são objetos de muitas preocupações ao longo das últimas duas
décadas. Os níveis elevados de Hg encontrados no meio ambiente são associados
tradicionalmente às atividades de mineração de ouro. No entanto, a erosão dos solos e o
desmatamento têm sido também reforçados como provocadores da contaminação
mercurial de diversos ecossistemas amazônicos [1-10]. Em adição a esta dinâmica
social
e
ambiental,
estudos
demonstraram
concentrações
elevadas
de
Hg,
principalmente a forma metilada (MeHg) em tecidos biológicos de peixes e humanos
[11-13].
Junto a isto, a doença de Chagas está atualmente presente na Amazônia porque
os novos colonos, vindo de outras regiões, carregaram com eles o parasita T. cruzi para
a região. O parasita infecta os triatomíneos espalhados nas palmeiras do gênero Attalea
(mais de 40 tipos de utilidade conhecidos) de crescimento fácil e espontâneo geralmente
perto das casas depois do corte e da queima da floresta [14-18].
Assim, o estilo de vida das populações da Amazônia levanta cruciais dilemas,
visto que o consumo de peixes e as múltiplas utilizações das palmeiras Attalea
representam ambos, elementos do bem-estar e igualmente de riscos cumulativos.
1.2. Exposição ao Mercúrio, mecanismos toxicológicos e seus efeitos sobre a saúde
A exposição do homem ao MeHg ocorre pela ingestão, principalmente de peixes
com altas concentrações deste metal. Após ser absorvido, o MeHg é distribuído por
todos os tecidos do corpo, processo este que leva em torno de 4 dias. Nos seres
humanos, o Hg orgânico tem uma meia vida biológica relativamente longa e muito
variada, de 35 a 100 dias [19], com média de 65 dias.
Uma vez absorvido, o MeHg acumula-se nos rins, fígado e cérebro e sua
eliminação se dá pelos rins, fígado, glândulas sudoríparas, pele e leite [20].
Vários são os mecanismos sugeridos para explicar os efeitos tóxicos do MeHg,
porém propõe-se que o estresse oxidativo deva ser o principal mecanismo envolvido na
toxicidade induzida pelo Hg, uma vez que seus efeitos podem atingir várias
biomoléculas do organismo, como mostraremos na descrição desse mecanismo nesse
projeto.
Os efeitos nocivos do MeHg são particularmente notáveis nos rins [21] e no
cérebro [22]. Os principais sintomas consistem em distúrbios visuais, parestesia, perda
da audição, dano nas funções do túbulo renal, tremor muscular, distúrbio da motilidade,
paralisia e até morte. O MeHg também é muito prejudicial ao desenvolvimento de
embriões, uma vez que mães intoxicadas por MeHg geraram crianças com severos
danos cerebrais, tais como paralisia cerebral, microcefalia e retardo mental [23].
Nós últimos anos tem aumentado o interesse sobre a relação entre a exposição ao
MeHg e o aumento do risco a doenças cardiovasculares [24,25].
1.3. Doença de Chagas
A doença de Chagas é bem reconhecida nos ecossistemas abertos da América
Latina, tais como ecossistemas de florestas tropicais úmidas. Esta infecção parasitária é
uma doença emergente e estima-se que 100 milhões de pessoas, em 21 países situados
em todas as Américas vivam em áreas endêmicas [18]. Em todos os países da região
amazônica (incluindo as Guianas) já foram relatados casos da doença e em algumas
localidades a incidência de casos está aumentando quase exponencialmente [26]. Até
recentemente, a doença de Chagas foi ausente ou não reconhecida, como é o caso da
Amazônia brasileira. Porém, casos isolados e emergentes apareceram e evoluíram a
sérias manifestações, particularmente no estado do Pará [27].
A doença de Chagas na Amazônia é principalmente uma infecção do tipo
zoofílica, onde os mamíferos silvestres servem de reservatório aos insetos triatomíneos
que representam o vetor de um protozoário mortal, o Trypanosoma cruzi (T. cruzi). As
atividades de corte e queima favorecem a proliferação deste triatomíneo nas palmeiras
do gênero Attalea (A. speciosa ou A. maripa no Brasil) [28]. Em termos ecológicos e
epidemiológicos, Attalea é hoje considerado o principal ecótopo silvestre para os
triatomíneos que estão invadindo de maneira freqüente e crescente as casas [18, 29]. A
maioria das transmissões da doença de Chagas tem sido atribuída aos triatomíneos
adultos que voam das palmeiras ou que cavam nas moradias. A transmissão oral pela
contaminação do alimento pelo inseto foi também relatada por Valente et al. 2004 [30]
em 174 casos diagnosticados no estado do Pará, ocorrendo em 62% dos casos
associados com 31 microepidemias familiares, com uma média de 5,5 pessoas
infectadas pelo parasito.
1.3.1. Infecção por Doença de Chagas, possíveis mecanismos de progressão e
seus efeitos sobre a saúde
A infecção em humanos pode apresentar duas fases: uma fase aguda que pode
evoluir em alguns pacientes para uma fase crônica, as quais são separadas por um
período de tempo indeterminado, onde os pacientes são assintomáticos.
A fase aguda apresenta um quadro de infecção ativa, inflamação, dano ao
miocárdio, e parasitemia [31,32]. Os sintomas possíveis mais importantes desta fase
são: febre, linfadenopatia, anorexia, hepatoesplenomegalia, meningoence-falite em raros
casos, e miocardite, a qual pode causar infrequentemente morte repentina do paciente.
No entanto, na maioria dos infectados (60 a 70%) o sistema imune têm a capacidade de
combater a infecção [33].
Entre dois e três meses após a primo infecção, 20 a 60 % dos pacientes tornamse portadores, e entram na fase intermediária ou indeterminada, com presença dos
parasitas na corrente sanguínea em baixo número ou inexistência dos mesmos. Nesta
fase existe uma grande dificuldade de diagnosticar a infecção, uma vez que os
portadores não apresentam sintomatologia clínica e os parasitos praticamente inexistem
na corrente sanguínea. Nesta fase vários métodos sorológicos podem ser utilizados para
o diagnóstico da Doença de Chagas, tais como reação de fixação do complemento,
aglutinação, imunofluorescência, hemaglutinação e imunoenzimáticos.
Chamamos de fase crônica da doença quando iniciam-se os primeiros sinais e
sintomas clínicos, que são predominantemente no sistema cardíaco, e envolvem
inflamação e fibrose desse sistema. Assim, a cardiopatia chagásica é considerada
progressiva e extensiva, pois todas as áreas do coração estão envolvidas [34].
Na última década alguns estudos têm investigado o estresse oxidativo como um
mecanismo toxicodinâmico envolvido no aparecimento da cardiopatia crônica em
pacientes chagásicos, uma vez que o processo infeccioso crônico e a progressiva
inflamação podem levar a alteração no status antioxidante dos sistemas biológicos [35,
36,37, 38]. No entanto, esses estudos são poucos e controversos.
Também em relação a infecção por T. Cruzi as alterações na resposta imune e
inflamatória na fase aguda e crônica parecem ter efeitos mediadores na progressão e
destruição tecidual em pacientes chagásicos [39-44]. No entanto existem poucos estudos
acerca desses mecanismos em pacientes chagásicos [45, 46]. Também Fuents et al vem
demonstrando desde 2003 [47, 48] que anormalidades no imbalanço de citocinas próinflamatórias, originados por um desequilíbrio entre oxidantes/antioxidantes, poderiam
participar na evolução da patogenia crônica da doença de Chagas.
1.4. Estresse oxidativo
O estresse oxidativo é definido como o desequilíbrio entre os fatores oxidantes e
antioxidantes, a favor dos oxidantes, prejudicando a integridade celular [49,50], o que
prejudica a integridade de várias biomoléculas [51-53].
As EROs têm uma alta reatividade, e uma meia-vida curta [54]. Por esse motivo
sua determinação in vivo não é viável. Em contraste, os lipídios, proteínas, ácidos
nucléicos e carboidratos, após serem modificados pelas espécies reativas, têm uma
meia-vida maior, o que os torna marcadores ideais do estresse oxidativo. Dentre esses
marcadores encontramos proteínas carbonilas (PCO), malondialdeído (MDA), F2
isoprostanos; 2,4 hidroxinonenal (HNE) [55, 56] atividade e índice de reativação da
ácido
delta
aminolevulínico
(ALA-D)
[57-59].
Também
são
considerados
biomarcadores, os níveis de antioxidantes, como a concentração de glutationa reduzida
(GSH), a concentração de vitaminas antioxidantes (vitamina C e E), bem como o
desequilíbrio na atividade das enzimas antioxidantes, tais como superóxido dismutase
(SOD), a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GSH-Px).
Dentre os mecanismos toxicológicos do Hg que causam alteração no status
oxidativo são reportados na literatura as seguintes ações tóxicas:
a) Sobre os compostos com grupos tiólicos
Um dos mais importantes mecanismos para explicar o dano oxidativo induzido
pelo MeHg é a sua alta reatividade com os grupamentos sulfidrílicos (– SH) [60]. A
glutationa reduzida (GSH) - L-γ-glutamil-L-cisteinil-glicina - é o principal tiol nãoprotéico celular livre, e também o principal antioxidante endógeno do organismo [61].
A GSH serve como uma primeira linha de defesa celular contra os compostos de Hg
[62]. Tanto o Hg2+ quanto o MeHg se ligam à GSH e também a resíduos de cisteína de
forma covalente, minimizando os efeitos deletérios deste metal. O conhecimento da
afinidade do Hg pelos grupamentos – SH tem sido base para o planejamento de
antídotos contra a intoxicação por este metal [63].
Na literatura é bem conhecido que a concentração de GSH é diminuída em ratos
expostos ao Hg [64]. No entanto em humanos expostos cronicamente ao MeHg
proveniente da dieta existe um único trabalho reportando a diminuição deste importante
antioxidante [65].
Outras enzimas antioxidantes podem proteger o organismo desse desequilíbrio
oxidativo. No entanto, essas enzimas podem tornar-se inativas devido à ligação direta
do metal ao sítio ativo da enzima, se o sítio contenha grupamentos sulfidrílicos. Este é o
caso da enzima δ-aminolevulinato desidratase (ALA-D), enzima essencial na rota de
biossíntese do heme, que apresenta grupamentos – SH na sua constituição [66]. Em um
estudo realizado por Perottoni e colaboradores [67], a atividade da enzima ALA-D foi
reduzida em 60% em ratos expostos a HgCl2. Não existem trabalhos na literatura até o
momento que investiguem a atividade da ALA-D em populações humanas expostas a
este metal.
b) Sobre a cadeia de transporte de elétrons
Sugere-se que tanto o Hg inorgânico quanto o MeHg aumentem a produção de
H2O2 e O2•- por prejudicar a eficiência da fosforilação oxidativa e do transporte de
elétrons no passo ubiquinona – citocromo b5 Q [68,69]. Além disso, pode ocorrer
deficiência na síntese do ATP, colaborando para a toxicidade do metal nos tecidos
renais, hepático e nervoso.
c) Peroxidação lipídica
Um dos principais produtos da peroxidação lipídica é o malondialdeído (MDA),
o qual é muito utilizado como indicador do dano da membrana celular [52].
Em um estudo realizado por Huang e colaboradores [70], níveis elevados de
MDA foram encontrados em rins, fígado e pulmão de ratos tratados com HgCl2. Outro
estudo, porém in vitro, também apresentou aumento da peroxidação lipídica, pela
quantificação de MDA [71]. No entanto, estudos que investiguem a peroxidação lipídica
em populações expostas ao MeHg não existem, até o momento.
d) Sobre enzimas antioxidantes
Além de induzir a peroxidação lipídica, o MeHg pode atuar sobre a atividade de
algumas enzimas. A atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase
(CAT), glutationa peroxidase (GSH-Px), pode ser afetada após a exposição a este metal.
Porém, na literatura, não há um consenso entre os trabalhos com relação ao aumento ou
à diminuição da atividade das enzimas.
Ariza e colaboradores mostraram que o Hg inorgânico induz a formação de
H2O2, estimula a atividade da SOD e não afeta a atividade da CAT e da GSH-Px [72].
Já em trabalhadores ocupacionalmente expostos ao Hg elementar, as atividades da SOD
e da GSH-Px mostraram-se ambas diminuídas [73], enquanto que para Hussain e
colaboradores houve um aumento na atividade da CAT e da GSH-Px [74].
Em outro estudo, no qual as atividades da SOD e da GSH-Px, bem como os
níveis de GSH aumentaram após exposição crônica ao Hg, concluiu-se que os aumentos
na atividade das enzimas e na concentração do antioxidante GSH poderiam ser uma
resposta compensatória indireta das células ao aumento do estresse oxidativo, como
forma de mecanismo de auto-proteção [75].
Em relação à população cronicamente expostas ao MeHg existe até o momento
um trabalho que investiga a atividade da CAT e GSH-Px em um grupo de mulheres, e
neste estudo a atividade da GSH-Px era aumentada, enquanto a atividade da CAT não
demonstrou alteração [65].
1.5. Respostas imunológicas e inflamatórias
Trypanosoma cruzi é um estimulador potente da imunidade celular e humoral, e
da indução de citocinas pró-inflamatórias. A imunidade humoral ou adquirida é mediada
por anticorpos, os quais são produzidos por células linfocitárias B. A imunidade celular
envolve macrófagos, células NK, e células T CD4+, CD8+ e CD12+ [76].
Por sua vez, as citocinas são moléculas que interligam, amplificam e propagam a
resposta imune, através do recrutamento de células para as áreas de inflamação,
estimulando sua divisão, proliferação e diferenciação [77]. Não só células imunológicas,
mas também fibroblastos, plaquetas, endotélio, músculo liso vascular e o próprio
cardiomiócito, principalmente sob estímulo de hipóxia, estresse mecânico e da
endotoxina, são capazes de produzir um amplo e variado espectro desses peptídeos
biológicos [77-79]. A ação das citocinas sobre o sistema cardiovascular está bem
assentada em bases experimentais que demonstram promoção de inflamação, disfunção
endotelial, coagulação intravasculares, desacoplamento do estímulo beta-adrenérgico,
geração de radicais livres, perda gradativa de massa muscular e intolerância ao
exercício, entre outros efeitos [80]. As principais citocinas que agem como mediadores
inflamatórios (IL-1, IL-6, IL-8 e fator de necrose tumoral -TNF-β). Também a
quantificação de proteína C reativa (PCR) serve como uma determinação indireta da
produção de citocinas.
As alterações na resposta imune e inflamatória na fase aguda e crônica parecem
ter efeitos mediadores na progressão e destruição tecidual em pacientes chagásicos [8286]. No entanto existem poucos estudos acerca destes mecanismos em modelos
experimentais [87-90] e em pacientes chagásicos [91,92]. Também Fuents et al vem
demonstrando desde 2003 [93,94] que anormalidades no imbalanço de citocinas próinflamatórias, originados por um desequilíbrio entre oxidantes/antioxidantes, poderiam
participar na evolução da patogenia crônica da doença de Chagas.
1.6. Pesquisas pioneiras em relação ao estado nutricional
Em relação à exposição ao Hg via alimentação através do consumo de peixes um
trabalho inicial realizado pelo projeto Caruso já foi realizado. Esse grupo realizou uma
intervenção participativa realizada num vilarejo da região do Rio Tapajós (Estado do
Pará), a qual se baseou na sensibilização e na capacitação comunitária no intuito de
estimular o consumo preferencial de espécies de peixes herbívoros, os quais são menos
contaminados (Lucotte et al., 2004; Mertens et al., 2005), e como consequência,
constatou-se uma melhora substancial de funções motoras e de indicadores
citogenéticos da população graças à diminuição da exposição (Mergler et al., 2001;
Bahia et al., 2004).
Paralelamente a referida campanha, um inquérito alimentar baseado em
questionários permitiu o registro do consumo de todos os alimentos componentes dos
hábitos alimentares dos ribeirinhos (Passos et al., 2001). Os resultados deste inquérito
mostraram primeiramente que, além dos peixes constituírem a principal fonte protêica,
as famílias têm acesso, também, a diversos alimentos pertencentes a diferentes
categorias alimentares e provenientes tanto da floresta quanto dos quintais familiares,
sugerindo também que seu estado nutricional, provavelmente, é suficientemente capaz
de contribuir a uma boa saúde. Além disso, este estudo permitiu evidenciar a influência
do consumo de frutas regionais sobre a relação entre o consumo de peixes contaminados
e os teores de Hg nos cabelos e sangue. Para um mesmo consumo de peixes, pessoas
consumindo frutas mais frequentemente apresentam níveis inferiores de Hg do que
pessoas consumindo frutas menos frequentemente ou que não têm o hábito de consumir
tais frutas (Passos et al., 2003, 2004).
Num segundo estágio, essa investigação foi estendida a toda a bacia do Rio
Tapajós, e a análise dos dados confirmaram que as frutas constituem um alimento capaz
de modular a associação citada acima se manteve (Passos et al., 2005, 2007b).
Por outro lado, não existem na literatura trabalhos que quantifiquem no sangue
componentes nutricionais e os relacionem com a concentração de Hg no mesmo
compartimento. Adicionalmente, também não existem investigações acerca do status
nutricional e sua relação com os mecanismos de toxicidade aqui propostos (estresse
oxidativo e mediadores inflamatórios) para a eventual exposição ao Hg e infecção
chagásica.
2. Objetivos específicos
2.1. Nesse estudo serão investigadas amostras de sangue de voluntários de três
comunidades localizadas nas proximidades do rio Tapajós, estado do Pará. As
comunidades selecionadas são Lago Araipá, Nova Estrela e São Tomé, as quais são
heterogêneas em relação à paisagem, cultura e hábitos alimentares de seus habitantes.
Todas as análises bioquímicas e clínicas posteriormente delimitadas neste texto (íten
2.2; 2.3; 2.4; 2.5; 2.6 ; 2.7 e 2.8) serão também comparadas intercomunitariamente, a
fim de relacionar a heterogeneidade das mesmas ;
2.2. Avaliar a concentração de Hg em sangue total e plasma dos voluntários
participantes do projeto.
2.3. Através da sorologia, realizar um mapeamento dos casos de Doença de Chagas
nos voluntários participantes do projeto.
2.4. Avaliação clínica dos voluntários participantes da pesquisa pelo médico
participante da equipe. Essa incluirá exame físico, aferição da pressão arterial
sanguínea e eletrocardiograma.
2.5. Determinar em sangue total, eritrócitos e plasma biomarcadores do estresse
oxidativo (relacionados ao mecanismo de toxicidade do Hg). Posteriormente comparar
tais resultados as concentrações de Hg encontradas e eventual soropositividade para
Chagas;
2.6. Avaliar no plasma mediadores inflamatórios gerais e específicos. Após, comparar
tais mediadores com a eventual exposição ao Hg e infecção chagásica;
2.7. Na eventualidade da concomitante exposição ao Hg e soropositividade para
Chagas será avaliado a interação do dano oxidativo e inflamatório nos voluntários
responsivos a tais critérios. A partir dos dados obtidos da quantificação sanguínea, a
ocorrência das referidas interações serão testadas por análises estatísticas de
regressão múltipla.
2.8. Avaliar os componentes nutricionais vitamina C, vitamina E e selênio no sangue
dos voluntários ;
3. Materiais e Métodos
3.1. Seleção de voluntários e coleta: Neste estudo, serão investigados voluntários de
três comunidades localizadas nas proximidades do rio Tapajós, estado do Pará. As
comunidades selecionadas são Lago Araipá, Nova Estrela e São Tomé, as quais são
heterogêneas em relação à paisagem, cultura e hábitos alimentares de seus habitantes.
Serão incluídos no estudo pessoas com idade superior a 15 anos oriundos destas
comunidades. Não há como informar o número de participantes do estudo, uma vez que
a aderência ou não por parte dos comunitários será voluntária. Além da idade não será
usado no estudo nenhum outro critério de inclusão/exclusão, uma vez que objetivamos
ter um perfil o mais real possível da população estudada, e para isso o número. Para
corrigir diferenças individuais em relação a variáveis contínuas (por exemplo, peso,
altura, índice de massa corporal, idade, entre outras) e categóricas (por exemplo, hábito
de fumar, hábito de beber, sexo, gravidez, amamentação, doenças crônicas, doenças
infecciosas, entre outras) pretendemos fazer uma análise estatística que considere essas
diferenças (iten 3.3.7).
A amostragem sanguínea visará contar com a participação do maior número
possível de voluntários. Para essa finalidade, palestras de esclarecimentos serão
proferidas junto aos comunitários. A clareza e adequação a termos de fala conhecidos
dos comunitários serão o foco dessas palestras. Tais esclarecimentos visarão adquirir a
confiança das populações locais no projeto, e consequente adesão de um maior número
de voluntários, a fim de que a amostragem sanguínea e clínica representem com
fidelidade um perfil da população de estudo.
O sangue somente será coletado dos indivíduos por punção venosa após a leitura
e assinatura do termo de consentimento aprovado pelo CONEP. A coleta das amostras
será realizada em 2 etapas, a partir da aprovação pelo CONEP do projeto proposto,
sendo que cada etapa terá duração média de 2 meses. O objetivo é coletar amostras de
uma comunidade por semana, no entanto para comunidades maiores será dispensado um
período maior de tempo. As amostras de sangue serão acondicionadas em freezer -20
ºC, e semanalmente serão enviadas para o Laboratório de Toxicologia de Metais da
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCF-RP), unidade da
Universidade de São Paulo. No referido laboratório as mesmas serão acondicionadas em
freezer -80 ºC. A parte de análises laboratoriais das amostras biológicas obtidas
perfizera um período médio de 1 ano, no qual as amostras serão unicamente usadas para
o desenvolvimento do projeto aqui proposto.
3.2. Separação e tratamento das amostras de sangue coletadas humanos
Para análise de PCO, GSH, MDA, e citocinas inflamatórias o sangue será
coletado em tubo contendo anticoagulante EDTA. O sangue será rapidamente
centrifugado em centrífuga no local da coleta. O plasma resultante será utilizado para a
quantificação de PCO, MDA, citocinas inflamatórias e PCR, e os eritrócitos para a
dosagem de GSH. Para a análise do Hg e das enzimas GSH-Px, SOD, CAT e ALA-D, o
sangue será coletado em tubo contendo anticoagulante heparina. Para análise de Hg o
sangue será coletado em tubo com EDTA (específico em coletas de análise de metais),
sendo o sangue total e plasma serão separados.
Para a avaliação da infecção chagásica o sangue será coletado em tubo sem
anticoagulante. O sangue será rapidamente centrifugado, e o soro resultante será
utilizado para os testes imunológicos de ELISA, RIFI, e para posterior contagem de
células CD4, CD8 e CD12.
Todas as amostras serão acondicionados, impreterivelmente, em freezer -20ºC
até o momento de transporte para o Laboratório de Toxicologia de Metais da FCF-RP,
onde então serão acondicionadas em freezer -80 ºC.
3.3. Metodologias para avaliações sanguíneas propostas nos objetivos
3.3.1 Determinação dos níveis de Hg nos fluidos biológicos por espectrometria de
massa com plasma acoplado (ICP-MS)
Um espectrômetro de massas com plasma acoplado (ELAN DRCII PerkinElmer), pertecente ao Laboratório de Toxicologia de Metais, será utilizado para a
determinação dos teores de Hg nos fluidos biológicos. Para isto será utilizado método
proposto por Palmer e colaboradores [104].
Materiais de Referência Certificada de sangue e plasma de animais provenientes
da National Institute of Standards and Technology (NIST) e do Departamento de Saúde
do Estado de Nova Iorque, contendo mercúrio, serão analisados previa e posteriormente
à análise de um grupo de 20 amostras das usadas no estudo, para controle dos resultados
obtidos.
3.3.2 Avaliação da infecção chagásica
3.3.2.1 Análise fenotípica das populações celulares por citofluorimetria de
fluxo
A contagem de linfócitos T CD4+, CD8+ e CD12+ serão realizadas por
citometria de fluxo, baseada em anticorpos monoclonais marcados com substâncias
fluorescentes, dirigidos contra antígenos de superfície de células esplênicas do baço.
3.3.2.2 Reação Elisa (imunoenzimático)
A pesquisa de anticorpos anti -T. cruzi será realizada por kits comercial
produzidos pelo instituto de tecnologia Bio-Manguinhos da Fiocruz de Belo Horizonte,
Minas Gerais, Brasil.
3.3.3 Avaliação Clínica dos Voluntários
Exames clínicos de rotina, incluindo verificação da pressão arterial serão
realizados pelo médico da equipe antes da coleta de sangue dos voluntários.
3.3.4. Avaliação dos marcadores inflamatórios
3.3.4.1. Quantificação de proteína C reativa (PCR)
A quantificação de PCR será realizada usando kit imunoenzimático comercial
PharmPak (R&D Systems).
3.3.4.2. Quantificação das citocinas
A quantificação dos mediadores inflamatórios (FASL, IP-10, MCP-1, RANTES,
interleucinas (IL-1, IL-6, IL-8, IL-10) e TNF-β) será por Kits comerciais adquiridos da
BD Bioscience, San Jose, CA, USA para citocinas. Usaremos este tipo de determinação
para avaliar a resposta inflamatória mediada por citocinas baseado em importantes
vantagens deste método, tais como: uso de pequena quantidade de amostra sanguínea
(50 µl); rapidez e sensibilidade do teste; e uma avaliação mais completa (vários tipos de
citocinas) do processo inflamatório na população e animais estudados [105].
3.3.5. Determinação dos biomarcadores sanguíneos do estresse oxidativo
3.3.5.1 Quantificação das PCO
As proteínas carboniladas serão quantificadas por espectrofotometria
UV-VIS segundo o método de Levine e colaboradores [106].
3.3.5.2 Quantificação da GSH
As análises de GSH serão realizadas por cromatografia líquida de alta eficiência
com detector de UV/VIS (CLAE-UV/VIS) segundo o método de Garcia e colaboradores
[107].
3.3.5.3 Quantificação do MDA
As análises de MDA serão realizadas por CLAE – UV/VIS segundo o método
de Grotto e colaboradores [108].
3.3.5.4 Determinação da atividade da GSH-Px
A atividade da enzima GSH-Px será quantificada por espectrofotometria de
UV/VIS utilizando método de Paglia e Valentine [109].
3.3.5.5 Determinação da atividade da CAT
A atividade da enzima catalase será quantificada por espectrofotometria de
UV/VIS utilizando método de Aebi [110].
3.3.5.6 Determinação da atividade da SOD
A atividade da enzima superóxido dismutase será quantificada por
espectrofotometria de UV/VIS utilizando método de McCord e Fridovich [111].
3.3.5.7 Determinação da atividade e reativação da ALA-D
A atividade da enzima ALA-D será quantificada por espectrofotometria UV/VIS
utilizando o método de Sassa com algumas modificações [57,58, 112].
3.3.6. Estado Nutricional
3.3.6.1. Determinação do Selênio em Plasma
Um espectrômetro de massas com plasma acoplado (ELAN DRCII PerkinElmer) será utilizado para a determinação de Se em plasma. Para isto será utilizado
método proposto por Palmer e colaboradores [104].
3.3.6.2. Determinação de Vitamina C
A vitamina C será determinada em plasma, o qual ficará em eppendorf protegido
da luz e estabilizado por TCA 10%. O método de quantificação é realizado por HPLCFluorescente [107].
3.3.6.3. Determinação de Vitamina E
A quantificação da vitamina E em plasma será realizada após extração e
posterirmente quantificação em fluorímetro descrito pelo método de Garcia et al [107].
3.3.7. Análise Estatística dos Dados
As análises dos dados envolverão descrição dos dados, obtendo-se a média,
mediana, desvio padrão, erro padrão, e valores mínimos e máximos encontrados, para
cada variável analisada. Posteriormente serão realizados testes paramétricos (teste t de
Student, ANOVA) ou não paramétricos (teste de Mann Whitney, Kruskall Wallis),
dependendo da distribuição das variáveis, para verificar diferenças entre grupos e
correlações (Pearson, Spearman, e ANCOVA) para todas as variáveis analisadas no
estudo. Por último, usaremos análises de regressão múltipla, com a qual é possível
considerar as diferenças individuais, e considerar as informações obtidas no
questionário (em anexo), uma vez que não usaremos critérios de exclusão neste estudo.
Para todas estas análises usaremos os programas estatísticos Jump® 5.0, Statistica® 6.0 e
Statview® versão 5.0 para Windows (SAS Institute Inc.).
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