1. Introdução
A utilização de sistemas vítreos a base de silicatos tem sido proposto para
aplicações médicas como, por exemplo, liberação de fármacos, já que tais sistemas
permitem utilizar estes géis como “plugs” de baixa difusibilidade. Entre os vários aspectos
a serem explorados nestes sistemas, os conhecimentos de como processos de transferência
de H+, de como espécies ácido-base de tampões reacionam e ainda da interferência de
solventes e co -solventes, é fundamental.
O estudo de processos prototrópicos de fotoácidos como o 8-hidroxi-1,3,6pirenotrissulfonato de sódio (piranina) possibilita acompanhar mudanças relativas ao teor
de água que ocorrem em sistemas vítreos obtidos pelo processo sol-gel [Kaufman et al.,
1988; Wasiucionek et al., 1997; Brennan et al., 1999]. Esta possibilidade advém do fato da
fotodissociação da piranina depender de água livre para ocorrer e, que estes sistemas
sofrem uma grande transformação no teor de água durante o envelhecimento do gel
[Brinker & Scherer et al., 1990].
As investigações de Brennan et al., 1999 evidenciaram que a transferência de
próton da piranina em sistemas vítreos derivados do tetraetilortosilano (TEOS) contendo
tampão fosfato varia conforme previsto com o envelhecimento. Em termos simples o
processo de envelhecimento espontâneo, isto é, para amostras expostas ao meio ambiente e
ao abrigo da luz, resulta na lixiviação de água e do etanol do seio do gel. Foi observado que
ao final de cerca de quinze dias de envelhecimento, a extensão de dissociação de
praticamente 100%, atribuída à presença de água residual presente no interior do monólito.
Após este período a diminuição desta porcentagem sugere a densificação do sistema com
perda de água de forma mais branda. Entretanto, o possível efeito do tampão no processo
de transferência de H+ competindo com a água como aceptor não foi aventado. Tendo em
vista a importância deste processo e a eventual possibilidade de transferências de H+ em
géis “secos”, neste estudo dedicamo-nos a investigar o efeito de tampão nestes sistemas.
1
1.1. Processo Sol-Gel
Define-se processo sol-gel pela transição de sistema sol (solução) para um sistema
gel (gelatina). Estes géis após completa secagem forma os denominados xerogéis. Neste
processo parte-se de uma solução do alcoóxido precursor, TEOS, por exemplo, em um
solvente ou em uma mistura de solventes adequados e promove-se a hidrólise. Dá-se inicio
à condensação formando uma dispersão de partículas coloidais (partículas com dimensões
entre 1 e 1000nm). Tipicamente neste período observa-se o branqueamento da suspensão,
em seqüência ocorre a reticulação levando ao gel. Os géis coloidais resultam da agregação
de partículas coloidais enquanto que os géis poliméricos são geralmente preparados a partir
de soluções onde se promovem reações de polimerização e poli - condensação. O esquema
1 ilustra os eventos acima em função das condições do meio (pH, sal) na morfologia do gel.
Deve-se notar o efeito do pH na formação seja de monólitos ou de partículas. Abaixo de pH
7, o precursor TEOS é transformado no respectivo ácido silícico, Si(OH)4, que condensa
para um monólito, a pH`s maiores ocorre a deprotonação do ácido silícico induzindo à
repulsão de cargas e conseqüentemente a formação de partículas.
2
Esquema 1. Comportamento de polimerização da sílica aquosa. Em solução básica (B), as
partículas crescem em tamanho com diminuição em número; em solução ácida ou na
presença de sal (A) as partículas se agregam em cadeia tri – dimensional e formam géis.
[Brinker & Scherer et al. 1990].
3
Existem três abordagens que são tradicionalmente empregadas na construção de
géis monolíticos.
1. Gelificação de uma solução de um pó coloidal;
2. Hidrólise e poli - condensação de precursores alcoóxidos ou nitratos seguidos
pela secagem hipercrítica do gel;
3. Hidrólise e poli – condensação de precursores alcoóxidos seguido pelo
envelhecimento e secagem à temperatura ambiente.
A abordagem que empregamos para obtenção de sistemas vítreos foi à terceira, na
qual hidrólise de alcoóxidos precursores empregando em meio ácido. Considerando
materiais vítreos derivados do silício, três reações principais descrevem o processo sol-gel:
1. Hidrólise:
≡ Si − OR + H2O
↔ ≡ Si − OH + ROH
(1)
2. Condensação alcoólica:
≡ Si − OR + HO − Si ≡ ↔ ≡ Si − O − Si ≡ + ROH
(2)
3. Condensação aquosa:
≡ Si − OH + HO − Si ≡ ↔
≡ Si − O − Si ≡ + H2O
(3)
onde R é um grupo alquil. Na reação de hidrólise ocorre a formação de grupos reativos do
tipo silanol (Si − OH). Nas reações de condensação ocorre a formação dos grupos siloxanos
(Si − O − Si), álcool (Equação 1) e água (Equação 2). Nesta etapa, o álcool e a água
4
produtos da reação permanecem nos poros da cadeia reticular [Hench & West et al., 1990].
Na condição utilizada neste trabalho, a concentração de água (razão molar H2O : Si >> 4)
em excesso implica na hidrólise quase que completa (reação 1) seguida da condensação.
Durante as reações de hidrólise e condensação ocorre à formação numerosos partículas
assim que o alcoóxisilano entra em contacto com a água.
Devido à imiscibilidade entre
alcoóxisilanos e água, normalmente um solvente mútuo é adicionado como agente de
homogeneização. Entretanto, géis derivados do TEOS podem ser preparados sem a
necessidade de um co-solvente, neste caso emprega-se ultra-som que promove a hidrólise
do TEOS (passo denominado pré-hidrólise) e gera o ácido silícico que é solúvel em água na
concentração de trabalho [Brinker et al., 1990; Brennan, et al., 1999]. Quando ligações
siloxanos suficientemente interconectadas são formadas na região, estas respondem
cooperativamente como partículas coloidais ou sol. Após este processo inicial a solução
inicial é transferida para um recipiente adequado para envelhecimento (“casting”). Neste
estudo empregou-se cubetas de poli – estireno, material inerte ao ácido silícico.
Detalhes
mecanísticos e outros podem ser encontrados em várias literaturas especializadas [Brinker
et al. ; 1988; Scherer et al. ; 1988; Brinker & Scherer et al. ; 1990; Hench et al. ; 1990 ].
5
1.2. Fluorescência
Espectroscopia de fluorescência é uma poderosa ferramenta analítica para estudar os
efeitos de vários parâmetros físico-químicos (pH, polaridade, viscosidade, concentração,
efeito dos solventes, processos moleculares no estado excitado, etc.) sobre as moléculas em
solução e, ultimamente, em materiais vítreos derivados do processo sol-gel [Kaufman &
Avnir, Pines & Huppert et al.,1988; Dunn & Zink et al., 1997; Wasiucionek & Breiter et
al., 1997; Wittouck & Schryver , Snijkers-Hendrickx et al., 1997). A utilização desta
técnica é função de sua inerente sensibilidade analítica [Lakowicz, 1983].
Fluorescência é a propriedade que alguns átomos ou moléculas (conhecidos por
fluoróforos ou sondas fluorescentes) têm em absorverem luz em um determinado
comprimento e posteriormente emitir luz em um comprimento de onda maior após um
breve intervalo de tempo. Os vários níveis de energia envolvidos na absorção e emissão de
luz são apresentados no diagrama de Jablonski (Figura 1).
Neste diagrama aparecem em linhas horizontais o estado fundamental (S0) e os
estados excitados singlete (spins emparelhados) (S1 e S2) e triplete (spins desemparelhados)
(T1, T2 e T3) com seus correspondentes níveis vibracionais. As linhas retas referem-se aos
processos radiativos e as sinuosas aos processos não radiativos. Os números nas linhas
referem-se as seguintes definições:
1. Absorção de Luz. Uma molécula no estado fundamental (S0) pode absorver um fóton de
luz e tornar-se excitada com escala de tempo de 10-15s. A maioria das transições prováveis é
S0 → S1 ou S0 → S2, embora transições de S0 para estados excitados singlete de maior
energia também são possíveis.
2. Relaxação Vibracional. A absorção do So para Sn envolve uma mudança do nível
vibracional zero do S0 para qualquer nível vibracional do estado excitado. Contudo, o nível
vibracional v” = 0 é o nível mais populoso à temperatura ambiente para a molécula em seu
6
estado eletrônico fundamental, e v’ = 0 é também o nível vibracional do estado eletrônico
excitado que é mais populoso no equilíbrio. Ao menos que a molécula dissocie antes do
equilíbrio ser alcançado, existe um processo rápido (10-12 s) que relaxa o nível vibracional
de maior energia do estado excitado para seu nível vibracional zero.
3. Conversão Interna. É um processo não radiativo que converte um estado eletrônico de
maior energia para um de menor energia de mesma multiplicidade. Por exemplo, O nível
vibracional zero do S2 é convertido em um nível vibracional do estado excitado S1 que tem
a mesma quantidade de energia. O nível vibracional excitado S1 pode então relaxar para seu
nível zero. A escala de tempo para a conversão interna é rápida (> 10
-10
s), especialmente
quando os dois estados são próximos em energia.
4. Decaimento não Radiativo. É um processo pelo qual o estado eletrônico excitado
retorna ao estado fundamental (tipicamente de S1 para S0) sem a emissão de luz. A escala
de tempo para decaimento não radiativo (< 10-6 s) é menor que para conversão interna
devido à diferença de energia entre S1 e S0 que usualmente é maior do que entre S2 e S1.
5. Cruzamento Intersistema. É a conversão de um estado singlete em um estado triplete
(ou vice versa), requer a mudança rápida do spin do elétron. A probabilidade do
cruzamento intersistema depende, entre outras coisas, da diferença de energia entre o estado
singlete e tripete, com escala de tempo entre 10-6 e 10-10 s. O estado Tn é menor em energia
do que o seu correspondente Sn devido a menor repulsão de elétron para elétrons não
emparelhados.
6. Fluorescência. É a emissão de luz de um estado excitado para o estado fundamental com
a mesma multiplicidade. Usualmente a emissão é de S1→ S0, com escala de tempo entre 109
e 10-7 s. Alguns casos de fluorescência anormal S2→ S0 são encontrados ocorre em alguns
compostos, tais como o azuleno e compostos tiocarbonil.
7. Fosforescência. É a emissão de luz de um estado excitado para o estado fundamental
com mudança de multiplicidade (usualmente de um estado excitado triplete para o estado
fundamental), ocorrendo à tempos longos (10-3 a 102s). Este processo envolve mudança de
7
estado eletrônico e de spin, assim como absorção S0→ Tn, fosforescência é um processo
spin proibido.
8. Absorção Triplete – Triplete. Uma molécula no estado excitado triplete pode absorver
um fóton para originar um estado triplete de maior energia, assim espectro UV/VIS pode
ser obtido e o decaimento do estado excitado em função do tempo pode ser monitorado.
9. Absorção Singlete – Singlete. Estados tripletes podem persistir mais do que estados
excitados singletes, portanto só era possível absorção triplete – triplete. Entretanto, com o
advento da espectroscopia de pico e femto segundos, tornou-se possível medir transições de
um estado excitado singlete para um outro singlete de maior energia.
10. Absorção Singlete – Triplete. Como fosforescência, este é um processo proibido,
portanto a transição S0→Tn não é observada na espectroscopia UV/VIS [Carroll, 1998].
8
Figura 1: Diagrama de Jablonski [Carroll, 1998]
9
Três parâmetros fundamentais utilizados na descrição e comparação das sondas
fluorescentes são: coeficiente de extinção molar (ε), rendimento quântico (φf) e tempo de
vida de fluorescência (τf).
O coeficiente de extinção molar (ε) converte unidades de absorbância em unidades
de concentração molar para uma variedade de substâncias químicas, sendo determinado
pela medida de absorbância a um particular comprimento de onda (usualmente, o ε
utilizado é aquele relativo ao máximo valor de absorção no espectro UV/VIS) de um
fluoróforo. Coeficiente de extinção é a medida direta da habilidade do fluoróforo em
absorver luz, e aqueles fluoróforos que têm um alto coeficiente de extinção apresentam alta
probabilidade de emissão de fluorescência.
Rendimento quântico (φf) é um padrão para medir a eficiência da emissão de
fluorescência relativa a todos os caminhos possíveis para relaxação, ou seja, representa a
probabilidade de um fluoróforo excitado produzir um fóton emitido e é geralmente
expresso por (4):
φf = número de fótons emitido / número de fótons absorvido.
(4)
Tempo de vida de fluorescência é o tempo característico que uma molécula
permanece no estado excitado antes de retornar ao estado fundamental e é o tempo
disponível para a informação ser obtida do perfil de emissão. Durante o tempo de vida do
estado excitado, o fluoróforo pode sofrer mudanças conformacionais ou interagir com
outras moléculas e difundir através do ambiente local. A intensidade do decaimento de
fluorescência como uma função do tempo em uma população uniforme de moléculas
excitadas com um breve pulso de luz é descrito por uma função exponencial (5):
It = I0 – e (-t / τf)
(5)
onde: It é a intensidade de fluorescência medida a tempo t,
I0 é a intensidade inicial observada após a excitação e,
10
τf é o tempo de vida de fluorescência.
Formalmente, o tempo de vida de fluorescência é definido como o tempo no qual a
intensidade de fluorescência do fluoróforo decai para 1/e (~ 37%) da intensidade inicial,
conforme Figura 2(a). Esta quantidade é o recíproco da constante de velocidade para o
decaimento de fluorescência do estado excitado para o estado fundamental. Desde que, o
nível de fluorescência é diretamente proporcional ao número de moléculas no estado
excitado, medidas de tempo de vida podem se feitas através do decaimento de fluorescência
após um breve pulso de excitação. Em um solvente uniforme, o decaimento de
fluorescência é usualmente uma função mono-exponencial, conforme Figuras 2(a) e 2(b).
Além disso, processos como conversão interna, cruzamento intersistema e supressão podem
competir com emissão de fluorescência na relaxação dos elétrons do estado excitado para o
estado fundamental. Exceto fluorescência e fosforescência, os processos não radiativos são
mecanismos primários responsáveis pela relaxação dos elétrons do estado excitado. Todos
os processos não fluorescentes que competem para a desativação dos elétrons no estado
excitado podem ser combinados em uma única constante de velocidade, conhecida por
constante de velocidade não radiativa (knr). Esta constante ignora qualquer contribuição da
relaxação vibracional devido à rápida velocidade (10-12 s) destas conversões que são várias
ordens de magnitude mais rápida do que as transições de desativação (10-9 s). Portanto,
rendimento quântico pode ser descrito em termos de constante de velocidade, segundo a
expressão (6):
φf = kf / (kf + knr) = τf / τ0
(6)
onde: kf é a constante de velocidade para o decaimento por fluorescência,
τf é o tempo de vida de fluorescência medido,
τ0 é o tempo de vida intrínseco, ou seja, o tempo de vida do estado excitado na
ausência de todos os processos que competem com a fluorescência.
Na prática, o tempo de vida de fluorescência é diminuído pela presença de
processos não radiativos, resultando em um tempo de vida medido que é a combinação do
11
tempo de vida de fluorescência e dos mecanismos de relaxação não fluorescentes. Já que o
tempo de vida medido é sempre menor que o tempo de vida intrínseco, o rendimento
quântico nunca excede ao valor unitário [www.olympusfluoview.com].
(b)
Intensidade
Log da Intensidade
(a)
Inclinação
-1/τ
1/e
Tempo
Tempo
Figura
2:
Perfil
do
decaimento
do
tempo
de
vida
de
fluorescência
[www.olympusfluoview.com]
1.3. Equilíbrio Ácido- Base no Estado Excitado
Em 1931, Weber observou que o comprimento de onda de fluorescência do 1naftilamina-4-sulfonato apresenta alterações em função do pH da solução sem que
houvesse alterações no espectro de absorção. Em 1949, a observação de Weber foi
interpretada corretamente por Förster que considerou a possibilidade de que a constante de
equilíbrio ácido-base no estado excitado fosse diferente da constante de equilíbrio no estado
fundamental, [Förster et al., 1949; 1950].
12
A relação entre deslocamento de comprimento de onda acompanhada de protonação e
mudança na constante de equilíbrio sob excitação é formalizada no diagrama de energia do
Ciclo de Förster, ilustrada na Figura 3.
Figura 3: Ciclo de Förster [Carroll, 1998].
onde: ∆H e ∆H* são entalpias de dissociação do ácido AH em sua base conjugada A- no
estado fundamental e no estado excitado singlete mais baixo, respectivamente;
hν’ e hν” são as energias de transição eletrônica entre o estado fundamental e
estado singlete mais baixo para AH e A- , respectivamente;
h é a constante de Planck
13
Conforme o ciclo de Förster, é evidente que:
∆H* + hν
ν’ = ∆H + hν
ν”
(7 )
∆H* = ∆H + (hν
ν” - hν
ν’)
(8 )
Assumindo que a variação de entropia é a mesma no estado fundamental e excitado e que
∆G = ∆H - T∆
∆S, a equação (8) torna-se:
∆H* - ∆H ≈ ∆G* - ∆G
(9)
e utilizando a relação entre ∆G e equilíbrio
∆G = 2,303 RT pK
(10)
tem-se a relação (11), na qual pode-se determinar o valor pK* a partir do pK do estado
fundamental.
pK* - pK = (hν
ν” - hν
ν’) / (2,303 RT)
(11)
onde: R é a constante universal dos gases;
T é a temperatura em Kelvin.
Conforme o surgimento da emissão de fluorescência da base ou do ácido conjugado
(ou seja, um ácido ou base mais forte no estado excitado) essas substâncias passaram a ser
conhecida como fotoácidos e fotobases, respectivamente [Ireland & Wyatt et al., 1976;
Parker, 1968; Eigen et al., 1964; Weller et al., 1961; Gutman et al., 1981; Schulman, 1977].
Uma molécula no estado excitado pode ser considerada como um isômero
metaestável da mesma molécula no estado fundamental, uma vez que as propriedades
físicas e químicas são determinadas pelo arranjo do orbital eletrônico. Essa nova molécula
14
pode exibir reações não mostradas no estado fundamental (reações fotoquímicas) e ainda
pode tomar parte em reações análogas àquelas do estado fundamental. Entre estas reações
estão as reações denominadas de prototrópicas (Prototropismo significa dissociação e
associação de prótons) [Parker, 1968].
Dependendo das escalas de tempo envolvidas entre o processo prototrópico no
estado excitado (P) e o decaimento de fluorescência (D), e considerando-se fotoácidos,
existem três casos possíveis para o equilíbrio de protonação no estado excitado singlete.
1. Deprotonação é muito mais lento que o decaimento de fluorescência;
2. Deprotonação é muito mais rápido que o decaimento de fluorescência;
3. Deprotonação é competitivo com o decaimento de fluorescência.
No caso 1, prevalece a fluorescência, e não ocorre o processo de transferência de
próton, ou seja, a espécie ácida quando excitada irá fluorescer antes de ser convertida na
base conjugada. A fluorescência observada será devido à forma que estiver no estado
excitado (ácida ou básica). Substâncias que se comportam desta maneira são ótimas sondas
para determinar o pH, uma vez que a técnica fluorimétrica apresenta maior sensibilidade
em relação à técnica espectrofotométrica. Os casos 2 e 3 podem ser explicados
considerando um equilíbrio entre o ácido excitado AH* e sua base conjugada A-* (pKa* <<
pKa) e ambas as espécies fluorescem. Em solução alcalina, a população do estado
fundamental consiste de A- e sob excitação luminosa observa-se o processo (12) e em meio
fortemente ácido, AH será a espécie predominante e a emissão de fluorescência
corresponderá ao processo (13):
15
A-*
kf”
AH*
kf’
A-
+ hν
ν”
(12)
AH + hν
ν’
(13)
onde: h é a constante de Planck;
-
ν” é a freqüência de emissão de A ;
ν’ é a freqüência de emissão de AH.
Em um valor de pH intermediário (pKa* +1 < pH < pKa – 1) a espécie presente no
estado fundamental é AH mas, sob excitação luminosa, a espécie AH*
dissociar-se-á
-
parcialmente aparecendo a emissão devido a espécie A *.
Se o prototropismo no estado excitado é muito mais rápido que o decaimento por
fluorescência (caso 2), ocorre o processo de transferência de próton no estado excitado
sendo que a quantidade das espécies ácida e básica no estado excitado dependerá da
magnitude das constantes envolvidas.
Se o prototropismo é competitivo com o decaimento por fluorescência (caso 3)
atinge-se um estado de quasi-equilíbrio, onde ocorre o processo de transferência de próton,
mas o equilíbrio não é totalmente estabelecido, devido à competitividade entre os dois
processos.
Neste trabalho utilizou-se fotoácidos, como piranina e 2-naftol, para monitorar a
transferência de próton no interior dos monólitos derivados do TEOS. Estes fotoácidos
apresentam deprotonação no estado excitado mais rápido que o decaimento por
fluorescência.
16
1.4. Fotólise de Relâmpago induzido a Laser (Salto de pH)
De acordo com o conceito de fotoácidos e fotobases estabelecido por Förster, sabese que álcoois aromáticos e aminas protonadas tornam-se ácido mais forte em seu estado
excitado singlete do que em seu estado fundamental enquanto que ácidos carboxílicos
aromáticos e ésteres usualmente tornam-se base mais forte. Em ambos os casos, uma rápida
mudança na concentração de próton provocada pelo salto de pH pode ser detectada pela
observação dos deslocamentos no espectro das espécies no estado fundamental.
A rápida mudança de pH causada pelo salto de pH têm sido estudada a partir de
álcoois aromáticos em solução [Gutman et al., 1981; Huppert et al., 1981; Gutman et al.,
1983; Pines et al., 1983; Politi et al., 1984] e em sol-gel [Mckiernan et al., 1994].
O salto de pH é alcançado pela irradiação da piranina em solução aquosa com um
intenso pulso de laser (λ=355nm, com largura de pulso da ordem de ~ 80ns)) resultando no
seu estado excitado singlete S1. A piranina caracteriza-se pelo menor valor de pka* (~ 0,5)
em relação ao pka (~7,0). Deste modo, o pulso de laser converte a piranina de um ácido
fraco para um ácido forte e dentro de 100 ps [Smith & Kaufmann; Huppert; Gutman et al.,
1979], esta se dissocia liberando prótons para a água. Esta mudança de concentração é
transitória; então a piranina relaxa para seu estado fundamental dentro (τf ~6 ns). O sistema
irá relaxar ao nível pré-pulso pela reprotonação da forma alcalina da piranina no estado
fundamental, processo este modulado pelo pH da solução [McKiernan; Simoni; Dunn;
Zink; et al.; 1994]. O esquema 2 apresenta o equilíbrio prototrópico da piranina.
17
λmáx. = 445 nm
POH* +
kf
POH
H2O
pKa*= 0.5
kdiss.*
kass.*
λmáx. = 510 nm
PO-* + H3O+
kf´
knr
+ H2O
λmáx. = 403 nm
kdiss.
kass.
pKa = 7.2
excitado
knr ´
PO-
+ H3O+
fundamental
λmáx. = 455 nm
Esquema 2: Representação do Equilíbrio Prototrópico da Piranina. O índice “*” refere-se às
espécies no estado excitado. POH e PO- são as espécies protonada e deprotonada da
piranina; kass. e k
diss.
são as constantes de velocidade para as reações de associação e
dissociação, kf e kf’são as constantes de velocidade para o decaimento por fluorescência da
sonda protonada e deprotonada, knr e knr’ são as constantes de velocidade para o decaimento
não radioativo da sonda protonada e deprotonada, respectivamente [Fernandez et al.; 1996].
18
1.5. Reações de Transferência de Prótons
Reações de transferência de prótons estão entre os mais comuns e importantes
processos químicos que ocorrem em soluções aquosas na biosfera [Bell et al., 1973].
Tratam-se também de reações extremamente rápidas, da ordem de 1010 a 2 x 1011 M-1s-1
[Gutman, et al., 1986]. Muito do que se conhece a respeito de equilíbrio químico, cinética
química, efeitos isotópicos, transporte de massa em solução, relações de energia livre e
reatividade química é derivado do estudo de reações de transferência de prótons [Huppert et
al., 1981].
Na química clássica de soluções aquosas, a dissociação de prótons é tratada como
uma simples reação de primeira ordem. Na verdade trata-se de uma reação bastante
complexa envolvendo mais de uma etapa [Huppert et al., 1982].
O esquema da transferência de próton proposto pelo autor [Huppert et al., 1981] está
expresso em (14):
k1
AH + B
k2
AH......B
k-1
k3
A......BH
k-2
A- + BH+ (14)
k-3
onde: k1 e k-1 representam os processos de encontro e separação dos reagentes;
k2 e k-2 descrevem a transformação química e;
k3 e k-3 representam os processos de encontro e separação dos produtos.
Essa reação pode ser dividida em três partes: a difusão dos reagentes para o raio da
atmosfera iônica; difusão acelerada até a distância de encontro e subseqüente conversão do
complexo de encontro até os produtos. Em reações onde o equilíbrio é estabelecido
19
rapidamente com o complexo de encontro, as equações de velocidade são dominadas por
processos de difusão. Isso resulta na perda da informação sobre a dinâmica do complexo de
encontro. O solvente exerce papel fundamental nessa reação.
Pelo uso de fotoácidos, o processo de dissociação total após o pulso de laser, pode
ser dividido em dois passos consecutivos de reação e difusão. No estágio reativo, ocorre
uma rápida separação de carga e forma-se um par iônico pelo estiramento da ligação do
doador de próton que é estabilizado pelo solvente. O tempo de vida desse estado transiente
é muito curto, comparável com o tempo da vibração. Para uma ligação OH esse tempo é de
30fs. Compostos com baixo valor de pKa irão atingir o estado [RO-......H+] numa freqüência
alta , enquanto que aqueles com alto valor de pKa irão atravessar muitas vibrações até que a
energia de estiramento supere o limiar para formar o par iônico [Gutman et al., 1984; Pines
& Huppert et al., 1986; Pines et al., 1988]. O estado [RO-......H+] é muito instável, estando
sujeito a uma enorme atração eletrostática. Sendo assim, não ocorre dissociação sem que
haja assistência do solvente. O próton carregado positivamente interage com o dipolo das
moléculas de água circunvizinhas e a camada de hidratação é formada num domínio de
tempo de 20 a 50fs [Rao & Berne et al., 1981; Warshel, et al., 1982]. O próton estabilizado
pode assim difundir (segundo estágio) da sua base conjugada devido a movimentos
randômicos térmicos, mas essa difusão ainda dentro do raio formado pela gaiola
coulômbica (ver adiante), está sujeito a forças eletrostáticas.
O processo reverso é a recombinação geminada (neutralização) dos dois íons
separados, tanto por colapso direto do par iônico, ou pelo reencontro geminado dos íons
“livres” solvatados, conforme (15).
Uma descrição simples e direta deste processo foi apresentada por Eigen [Eigen et
al., 1964; Eigen et al., 1964]:
kD
RO- +
H+
k2
[RO-......H+]
k-D
ROH
(15)
k1
20
onde: R é o radical orgânico;
[RO-......H+] é o par iônico formado entre o ânion molecular RO- e o próton H+;
kD e k-D são as constantes de velocidade direta e reversa, que podem ser obtidas da
solução da equação de Debye-Smoluchowski (equação 16) de estado estacionário e,
k2 e k1 são as constantes de velocidade de recombinação e dissociação molecular do
par iônico.
k = [(4π
πNR0ΣD) / 1000].[δ
δ / (eδ - 1)].[eδ (R0κ / (1 + R0κ))]
(16)
A equação de Debye - Smoluchowski (16) fornece a constante de velocidade
controlada por difusão. O primeiro termo da equação define a velocidade de colisão entre
os reagentes na ausência de interações eletrostáticas. Os parâmetros que aparecem no
primeiro termo são N (número de Avogadro), R0 (distância de colisão) e ΣD (somatória dos
coeficientes de difusão dos reagentes). Como o coeficiente de difusão do próton é muito
maior do que qualquer outra espécie, pode-se aproximar ΣD ~ DH+ onde, DH+ = 9,3 x 10-5
cm2s-1. Sendo assim, para um próton difundindo livremente e com R0 ~ 6Å, a velocidade
resultante do encontro entre H+ e uma espécie não carregada é aproximadamente 4 x 1010
M-1s-1.
Os outros termos na equação (16) levam em conta a interação eletrostática entre o
H+ e o aceptor. A intensidade de interação é expressa pelo termo δ que é a razão entre o raio
da gaiola coulômbica (ou o raio de Debye, RD) e R0. O RD é a distância na qual a interação
tanta atrativa quanto repulsiva entre os reagentes, se iguala à energia térmica (e0 é a carga
eletrônica e kB é a carga de Boltzmann), segundo a equação (17).
RD = |Z1Z2| e02 / ε kBT
(17)
Por definição RD é sempre positivo. Em solução aquosa, à temperatura ambiente,
|Z1Z2| = 1 e RD = 7 Å.
21
A natureza da interação eletrostática é dada pelo sinal de δ que corresponde ao
produto (Z1Z2), e reflete se o próton dentro da distância RD será atraído pelo ânion ou
repelido pelo cátion. Interações atrativas terão um valor negativo de δ, enquanto que forças
repulsivas têm um valor positivo de δ.
Uma vez que o próton (ou outra partícula carregada) penetra a gaiola coulômbica,
sua difusão é dificultada pela interação eletrostática. Se a interação é atrativa (δ < 0) os íons
irão colidir em menos de 1 ns. Interações repulsivas (δ > 0) causarão um desvio da partícula
e a probabilidade de encontro irá diminuir. A relação entre δ e a velocidade da reação é
dada pelo segundo termo [δ / (eδ - 1)] da equação 1. Um potencial fortemente repulsivo, δ >
1 faz reduzir a expressão muito rapidamente. Por outro lado, para potencial atrativo, a
expressão se aproxima da linearidade para δ < - 3. Assim, um aceptor muito positivo pode
efetivamente evitar a protonação, enquanto que cargas negativas não conseguem aumentar
a velocidade de protonação mesmo que por um fator de 10.
O último termo na equação 16 considera o efeito da força iônica na velocidade da
reação entre partículas carregadas. Ele combina δ, o comprimento de Debye (κ = 3,3 x 10-7
x µ½ cm-1) e o raio de encontro (R0) numa expressão que suprime a intensidade de interação
eletrostática. Quanto maior a carga do aceptor, mais este será susceptível aos efeitos do íon
em solução. Sob condições fisiológicas, um ânion carregado com uma única carga irá reagir
com um próton numa velocidade de aproximadamente 2 a 4 x 1010 M-1 s-1. Constantes de
velocidades menores que esse valor sugerem algumas peculiaridades no sítio de ligação do
próton [Gutman & Nachliel et al., 1995].
A aplicabilidade da equação 1 para o cálculo do coeficiente de difusão de um par
próton-ânion foi demostrada por Pines & Huppert (1983). Esta é uma ferramenta útil para
calcular o coeficiente de difusão do próton em espaços microscópicos onde outros métodos
não podem ser empregados [Gutman et al., 1989].
22
Resumidamente, a equação de Debye-Smoluchowski (16) descreve a busca mútua
entre os reagentes até que a distância entre eles seja igual ao raio de Debye (RD). Assim que
o próton penetra na superfície da esfera limitada pelo raio de Debye, também denominada
gaiola coulômbica, a velocidade dos eventos é altamente acelerada pela forte atração
eletrostática. Em fração de nanosegundos, o próton se aproximará da distância de contato
(R0) e a formação da ligação covalente irá se processar. Em comparação com a busca mútua
que é relativamente longa, os eventos dentro da gaiola coulômbica são ignorados.
A Gaiola Coulômbica é o espaço no qual a energia potencial eletrostática ao redor
de um íon é maior que sua energia térmica. A aproximação de um próton até a gaiola
coulômbica de um ânion é uma reação controlada por difusão e é medida em escala de
microsegundos.Uma vez que o próton penetra na gaiola coulômbica, sua trajetória é
dominada pelo potencial eletrostático e colisão com o ânion, que é da ordem da
nanosegundos, uma escala de tempo que é comparável com o tempo de vida dos
indicadores de pH fluorescentes. A avaliação das medidas de fluorescência deve considerar
a dinâmica interna à gaiola coulômbica, ou seja, é importante dar ênfase à constante
dielétrica, ao coeficiente de difusão e à geometria do espaço reacional. Outro termo que
afeta as reações dentro da gaiola coulômbica é a geometria do espaço reacional. Quando se
considera a interação próton-ânion em meio aquoso, o espaço reacional é esférico. Mas,
quando a porção dissociante está inserida numa cavidade definida, a dispersão do próton
não ocorre num meio simetricamente esférico. Ambos os fatores, campo elétrico local e
espaço reacional não esférico são tratados quantitativamente pelo formalismo da
recombinação geminada entre próton e ânion por Pines e seus colaboradores [Pines et al.,
1988].
23
1.5.1. Efeito do Solvente
O solvente pode afetar a velocidade de dissociação de fotoácidos e fotobases por
três efeitos independentes:
1. Velocidade de hidratação do próton.
2. Velocidade da difusão.
3. Constante dielétrica do meio.
No primeiro efeito, a água tem papel fundamental na solvatação do próton que é
dissociado, e uma das características do solvente é refletida diretamente na velocidade da
dissociação, que pode ser utilizada como uma ferramenta para investigar o meio onde o
reagente se encontra. Embora a natureza exata da solvatação do próton em água seja
controversa, reconhece-se que a solvatação do próton e sua difusão em água pura envolvem
algum tipo de participação cooperativa de moléculas de água [Pines & Fleming et al.,
1991]. Na representação clássica da estrutura da água [Bernal & Fowler et al., 1933]
assume-se que o próton é solvatado por 4 moléculas de água formando um complexo de
geometria tetraédrica. Em outras palavras, primeiro o próton se ligaria a uma única
molécula de água e posteriormente os hidrogênios se ligariam as três primeiras camadas de
solvatação de moléculas de água [Robinson et al., 1986; Eigen, 1964]. Utilizando a técnica
de salto de pH induzido por laser e utilizando fotoácidos em várias misturas de água-álcool,
os seguintes autores [Robinson et al., 1986; Huppert & Kolodney, 1981; Huppert et al,
1982] em experimentos independentes, interpretaram a diminuição das velocidades de
dissociação do próton como uma manifestação da quebra da estrutura da água causada pela
diluição da água pelo solvente orgânico.
Os outros dois efeitos (velocidade de difusão do próton e constante dielétrica do
meio) afetam a velocidade com a qual o próton escapa da gaiola coulômbica. A difusão dos
prótons é mediada por uma troca rápida na rede de ligações de hidrogênio. Qualquer
ruptura da rede encurta a distância sobre a qual o próton pode migrar. Assim, solventes
24
orgânicos encurtam o trecho de passagem rápido e tornam o próton mais lento no seu
caminho de saída da gaiola coulômbica. Por sua vez, a constante dielétrica dos solventes
orgânicos expande o tamanho da gaiola coulômbica, o que também diminui a probabilidade
do sucesso do escape.
A constante de velocidade da dissociação do próton é extremamente sensível ao
meio. Exceto para fotoácidos muito fortes (pKa* < 0), não ocorre dissociação a menos que
moléculas de água estejam na vizinhança para atuar como receptoras de prótons. Ainda,
essas moléculas de água precisam estar livres para reagir com o próton na escala de tempo
comparável com o tempo de vibração (30fs). Durante esse período curto de tempo, as
moléculas de água estão praticamente fixas no espaço e somente aquelas moléculas que já
se encontram numa distância igual a da primeira e da segunda camada de hidratação irão
participar da reação. Simulações de dinâmica molecular [Rao & Berne et al.,1981]
demonstraram que o processo de hidratação total de um íon de carga positiva ocorre dentro
de uma esfera de menos de 4Å. Portanto, a cinética da dissociação do próton pode ser
considerada uma técnica adequada para medir a atividade da água.
1.5.2. Efeito do Tampão
As espécies oriundas do tampão afetam diretamente o tratamento cinético de
reações de transferência de próton. Após um pulso de acidificação de uma solução, a
protonação de um sítio será afetada pela presença das espécies do tampão por mais de uma
maneira. Por um lado, as espécies do tampão competirão pelos prótons livres, diminuindo
assim a velocidade de protonação direta. Por outro lado, a difusão livre do tampão pode
fazer com que este atue como um carregador de prótons. A difusão de prótons em soluções
aquosas se dá pela troca de hidrogênios ligados covalentemente entre prótons solvatados e a
matriz circundante. Devido a esse mecanismo, a difusibilidade da carga protônica em água
(DH+ = 9,3 x 10-5 cm2s-1) é maior do que qualquer outro íon; esta é mais rápida até do que a
difusão da própria água em água (DH2O = 2,5 x 10-5 cm2s-1). A dispersão do excesso de
25
ácido em solução numa escala macroscópica não representa somente a difusão do próton.
Trata-se de uma somatória de muitos processos, tais como difusão do próton livre,
liberação e captura de prótons pelo tampão e difusão de moléculas protonadas de tampão.
Generalizando-se, pode-se assumir que o tampão sempre irá reduzir a difusibilidade do
ácido abaixo do medido em água pura. E ainda, qualquer coeficiente de difusão medido
pela dispersão da acidez em uma solução tamponada é um coeficiente aparente e não
representa o parâmetro molecular de DH+.
26
2. Objetivos
Este trabalho tem como objetivos:
1. Estudar a transferência de próton nos monólitos derivados do TEOS através de reações
fotoinduzidas da piranina.
2. Estudar a participação das espécies H2PO4- e HPO4= oriundas do tampão fosfato no
interior dos monóliotos derivados do TEOS no processo prototrópico.
3. Estudar o comportamento dos indicadores ácido-base dopados nos monólitos derivados
do TEOS.
4. Estudar a participação da água nas reações de transferência de próton em sistemas
“secos” constituídos por espécies de tampão fosfato.
3. Materiais, Equipamentos e Métodos.
3.1. Materiais.
Os materiais, abaixo relacionados, foram todos de qualidade analítica e utilizados
como recebidos.
Tetraetilortosilano (TEOS), foi obtido da Acros Organic.
Piranina foi obtida da Eastman Kodak.
2-Naftol foi obtido da J. T. Baker Chemical.
Fosfato de potássio monobásico foi obtido da Mallinckrodt Chemicals.
Fosfato de potássio dibásico foi obtido da J. T. Baker Chemical.
Dodecil Sulfato de Sódio foi obtido da Sigma-Aldrich.
Azul de Bromofenol (BFB), foi obtido da Sigma-Aldrich.
27
Azul de Bromotimol (BTB), foi obtido da Sigma-Aldrich.
Lilás de Bromocresol (BCP), foi obtido da J. T. Baker Chemical.
Vermelho Cresol (CR), foi obtido da Merck.
Verde de Bromocresol (BCG), foi obtido da Merck.
Cubetas de poli-estireno, com 1 cm de caminho óptico e 4 faces polidas e transparentes
foram obtidas da Sigma-Aldrich.
3.2. Equipamentos.
Balança Analítica, Sartorius e Analitical Plus.
pH-metro, Orion modelo 307.
Sonicador de haste, Braun Sonic 1510, foi utilizado para acelerar a hidrólise do TEOS, com
potência de 70W.
Sonicador de Banho, Branson modelo N, foi utilizado para assegurar a homogeneização na
preparação do monólito derivado do TEOS.
Espectrofotômetro, Cary 300.
Espectrofluorímetro, Hitachi F-200 e SPEX modelo DM 3000F.
Fotólise de Relâmpago a Laser, Applied Photophysics.
Forno de Secagem à vácuo, BUCHI GKR 51.
28
3.3. Métodos.
3.3.1. Medidas de fluorescência da piranina dopada nos monólitos derivados do
TEOS.
Os ensaios de fluorescência da Piranina dopada nos monólitos derivados do TEOS
foram realizados no HITACHI com geometria de 90°, com largura de banda de 10 nm e
com uma tensão de 400V na fotomultiplicadora, nas seguintes condições:
a) λexcitação = 350 nm com varredura entre 420 e 600 nm;
b) λemissão = 510 nm com varredura entre 350 e 470 nm.
3.3.2. Medidas de fluorescência da piranina e 2-naftol dopados na mistura de KH2PO4
e K2HPO4.
As medidas de fluorescência da piranina e 2-naftol dopados na mistura de KH2PO4 e
K2HPO4 foram realizadas no SPEX utilizando geometria de face frontal, com 2 mm de
fendas de excitação e de emissão (largura de banda 13nm/mm), nas seguintes condições:
a) Piranina:
a1) λexcitação = 400 nm com varredura entre 420 e 600 nm;
a2) λemissão = 540 nm com varredura entre 350 e 470 nm.
b) 2-Naftol:
b1) λexcitação = 294 nm com varredura entre 320 e 500 nm;
b2) λemissão = 350 nm com varredura entre 250 e 330 nm.
29
3.3.3. Medidas de Fotólise de Relâmpago.
As medidas de fotólise de relâmpago a laser de Nd: YAG com ~20 mJ de potência,
pulsado em 355 nm, com largura de pulso de ~80 ns e monitorado à 455 nm via Lâmpada
de Xenônio e demais componentes eletrônicos para captura e digitalização de sinais.
3.3.4 Preparação do hidrolisado de TEOS.
Uma mistura de TEOS e água bi-destilada (Razão molar Si: H2O = 1: 4) em meio
ácido (HCl 2mM) foi agitada em um sonicador de haste até a obtenção de uma mistura
miscível e translúcida. Esta mistura foi mantida em banho de gelo para evitar a gelificação
durante a pré-hidrólise. Este hidrolisado de TEOS foi utilizado para preparar todos os
monólitos. Convém ressaltar que nesta etapa não houve a adição de álcool como cosolvente, tornando o meio adequado para aplicações biológicas [Avnir et al. 1987; Brennan
et al. 1999].
3.3.5. Preparação dos Monólitos derivados do TEOS.
Todos os monólitos derivados do TEOS foram preparados em cubetas de poliestireno. Após a preparação dos monólitos, as cubetas foram mantidas à temperatura
ambiente e na ausência de luz. Os monólitos obtidos foram submetidos aos ensaios de
UV/VIS, fluorescência e fotólise de relâmpago.
3.3.5.1. Monólitos derivados do TEOS contendo piranina.
Em cada cubeta foi adicionado na seguinte ordem: 20 µl de piranina, 1,5 ml de água
ou 1,5 ml de diferentes concentrações de solução tampão fosfato (pH 6,0), e 1,5 ml do préhidrolisado de TEOS. Durante a adição do pré-hidrolisado de TEOS, a cubeta foi mantida
30
em sonicador de banho para assegurar a homogeneização do monólito derivado da
gelificação do TEOS. A razão molar final de Si : H2O é de 1 : 16,5 e a concentração final
da piranina foi de 50 µM. As concentrações finais de solução tampão fosfato estão
apresentadas nas legendas.
3.3.5.2 Monólitos derivados do TEOS contendo piranina e dodecil sulfato de sódio.
Em cada cubeta foi adicionado na seguinte ordem: 20 µl de piranina, 0,75 ml de
água ou 0,75 ml de diferentes concentrações de solução tampão fosfato (pH 6,0), 0,75 ml
de SDS (Dodecil Sulfato de Sódio), e 1,5 ml do pré-hidrolisado de TEOS. Durante a adição
do pré-hidrolisado de TEOS, a cubeta foi mantida em sonicador de banho para assegurar a
homogeneização do monólito derivado da gelificação do TEOS. A razão molar final de Si :
H2O é de 1 : 16,5 e as concentrações finais de piranina e de SDS foram 50 µM e 20 mM,
respectivamente. As concentrações finais de solução tampão fosfato estão apresentadas nas
legendas.
3.3.5.3 Monólitos derivados do TEOS contendo indicadores ácido-base
Em cada cubeta foi adicionado na seguinte ordem: 40 µl de diferentes indicadores
ácido-base, 1,5 ml de água ou 1,5 ml de diferentes concentrações de solução tampão fosfato
(pH 6,0) e 1,5 ml do pré-hidrolisado de TEOS. Durante a adição do pré-hidrolisado de
TEOS, a cubeta foi mantida em sonicador de banho para assegurar a homogeneização do
monólito derivado da gelificação do TEOS. A razão molar final de Si: H2O é de 1 : 16,5 e
as concentrações finais de indicadores ácido-base e de solução tampão fosfato foram 10 µM
e 50 mM; 40 mM; 30mM; 20 mM e 5 mM, respectivamente.
31
3.3.6 Mistura de KH2PO4 e K2HPO4 dopadas com piranina e 2 - naftol
Em um almofariz foi triturado uma mistura de KH2PO4 e K2HPO4 na proporção de
pHaparente= 4,0 à 6,0 dopada com piranina ou 2 - naftol. Esta mistura foi submetida à
secagem a vácuo por 1 hora e a 150 ºC. Estas misturas foram submetidas ao ensaio de
fluorescência.
4. Resultados e Discussão.
4.1 Efeito da concentração de tampão fosfato sobre a piranina em solução.
A Figura 4 apresenta o espectro de absorção da piranina em solução ácida e aquosa,
no qual observa-se somente a presença da espécie protonada, POH, (λmáx. = 403 nm e ε =
29.900 cm-1 M-1 , onde ε representa o coeficiente de absortividade) e em solução básica
somente a presença da espécie deprotonada, PO-, (λmáx. = 455 nm e ε = 26.000 cm-1 M-1) no
estado fundamental.
A Figura 5 apresenta o espectro de emissão de fluorescência da piranina (λexc. = 350
nm, εácido = 14.150 cm-1 M-1 e εbásico = 2.450 cm-1 M-1) em soluções ácida, aquosa e básica.
Em solução ácida, verifica-se a presença da espécie ácida, POH*,(λmáx. = 445 nm) e uma
leve contribuição da espécie básica, PO-*, (λmáx. = 510 nm). Esta contribuição é resultante
da dissociação prototrópica da espécie POH* no estado excitado, conforme equilíbrio
prototrópico da piranina (Esquema 1). A piranina em solução aquosa apresenta uma
pequena contribuição da espécie POH* e a da espécie básica, PO-*; esta última espécie é
resultante da dissociação da espécie POH* no estado excitado. Em solução básica apresenta
somente a presença da espécie PO-*que é o reflexo da excitação da espécie PO- presente no
estado fundamental.
32
1.6
1.4
absorbância
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
380
400
420
440
460
480
500
520
λ (nm)
Figura 4: Espectro de absorção da piranina em soluções () ácida (pH 1), () aquosa e
() básica (pH 10).
33
intensidade normalizada (u. ar.)
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
420
450
480
510
540
570
600
λ (nm)
Figura 5: Espectro de emissão de fluorescência da piranina (λexc. = 350 nm) em soluções
() ácida (pH 1), () aquosa e () básica (pH 10).
34
A Figura 6 apresenta o espectro de excitação de fluorescência da piranina (λem. =
510 nm) em função da concentração de solução tampão fosfato pH 6,0. Independente da
concentração, observa-se a presença da espécie POH (λmáx. = 403 nm)
e uma leve
contribuição da espécie PO- (λmáx. ~ 445 nm, na região ampliada). De acordo com a região
ampliada, verifica-se que a contribuição da espécie PO- é diretamente proporcional à
concentração de solução tampão fosfato, ou seja, quanto maior é a concentração salina,
maior é a dissociação prototrópica da piranina, e conseqüentemente menor é o valor do
pKa da piranina.
A Figura 7 apresenta o espectro de emissão de fluorescência da piranina (λexc. = 350
nm) em função da concentração de solução tampão fosfato pH 6,0. Observa-se a presença
majoritária da espécie PO-* (λmáx. = 510 nm) e uma leve contribuição da espécie POH*
(λmáx. = 440 nm, região ampliada) para todas as concentrações de tampão, indicando a
dissociação prototrópica da piranina no estado excitado. De acordo com a região ampliada,
verifica-se que a dissociação prototrópica da piranina é diretamente proporcional à
concentração de solução tampão fosfato, ou seja, quanto maior é a concentração de tampão
maior é dissociação prototrópica da piranina.
35
1050
100
80
900
intensidade (u. ar.)
60
750
40
20
600
0
450
430
440
450
460
470
300
150
0
390
405
420
435
450
465
λ (nm)
Figura 6: Espectro de excitação de fluorescência da piranina (λem. = 510 nm) em função
da concentração de solução tampão fosfato pH 6,0 () 250 mM, () 50 mM, () 5 mM,
() 0,5 mM, e () água.
36
600
30
25
500
20
intensidade (u.ar.)
15
400
10
300
5
430
440
450
540
570
600
460
200
100
0
420
450
480
510
λ (nm)
Figura 7: Espectro de emissão de fluorescência da piranina (λexc. = 350 nm) em função da
concentração de solução tampão fosfato pH 6,0 () 250 mM, () 50 mM, () 5 mM, ()
0,5 mM, e () água.
37
As Figuras 8 (A) e 8 (B) apresentam os transientes obtidos por fotólise de
relâmpago da piranina em função da concentração de solução tampão fosfato pH 6,0. A
partir destes transientes, pode-se calcular a constante de reprotonação observada da piranina
no estado fundamental (Tabela 1). A espécie POH presente na solução é submetida a um
pulso de laser tornando-se um ácido mais forte, POH*. Esta espécie ácida dissocia-se em
PO-* que por sua vez relaxa na forma de PO- sendo reprotonada, completando o equilíbrio
prototrópico da piranina (Esquema 1). Observa-se que a constante de reprotonação
observada é diretamente proporcional à concentração de tampão fosfato.
Tabela 1: Constante de reprotonação observada da piranina em
função da concentração de solução tampão fosfato pH 6,0.
[tampão fosfato]
50 mM
40 mM
30 mM
20 mM
5 mM
água
kreprotonação obs (s-1)
2,80E+06
2,12E+06
1,56E+06
8,90E+05
2,50E+05
5,60E+05
38
0.025
0.025
(B)
(A)
0.020
absorbância
absorbância
0.020
0.015
0.010
0.005
0.015
0.010
0.005
0.000
0.3
0.6
0.9
tempo (µs)
1.2
1.5
1.8
0.000
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
tempo (µs)
Figura 8: Transientes obtidos por fotólise de relâmpago (1600W) a 325 nm e monitorado a
455 nm para a piranina em função da concentração de solução tampão fosfato pH 6,0. (A)
() 50 mM, () 40 mM e () 30 mM; (B) () 20 mM, () 5 mM e () água,
respectivamente.
39
4.2. Efeito da concentração de ácido clorídrico sobre o monólito derivado do TEOS
Na preparação do hidrolisado de TEOS, concentrações de HCl na ordem de 10 mM
e 100 mM apresentaram soluções turvas e posteriormente monólitos opacos. Portanto, a
utilização de 2 mM de HCl na preparação do hidrolisado foi a concentração adequada para
a obtenção de monólitos transparentes.
4.3 Efeito da concentração de tampão fosfato sobre o monólito derivado do TEOS
Dados experimentais mostraram que a concentração de tampão fosfato interfere no
tempo de gelificação do monólito derivado do TEOS. A gelificação foi praticamente
instantânea, com a formação de um sólido opaco e quebradiço, para o monólito contendo
500 mM de tampão. O tempo de gelificação foi de 5 minutos para o monólito com 250
mM e dentro de 24 horas para os monólitos com 5 mM e 0,5 mM de tampão fosfato pH =
6,0, com a formação de monólitos uniformes e translúcidos. Após a gelificação, os
monólitos sofrem contração em todo o seu volume ao longo do tempo.
Após a preparação dos monólitos, monitorou-se a perda de massa e a transferência
de próton da piranina até o momento em que a massa dos monólitos e os respectivos
espectros da piranina tornaram-se praticamente constante.
As Figuras 9 (A) e 9 (B) apresentam o espectro de absorção dos monólitos
derivados da gelificação do TEOS em função da concentração de solução tampão fosfato
pH = 6,0 após 7 dias de envelhecimento sem SDS e com SDS, respectivamente. Em ambos
os casos, observa-se a presença da espécie protonada, POH, (λmáx. = 403 nm) e uma leve
contribuição da espécie deprotonada, PO-, (λmáx. = 455 nm, na região ampliada). Esta leve
contribuição da espécie deprotonada é diretamente proporcional à concentração de solução
tampão fosfato, ou seja, quanto maior é a concentração salina, maior é a dissociação
prototrópica da piranina. A dissociação prototrópica da piranina, neste caso, é atribuída a
presença de sal que favorece a dissociação da espécie protonada e estabiliza os íons PO- e
40
H3O+. Em outros termos o aumento da força iônica conduz a uma diminuição do pKa e
assim mantendo-se o pH constante observar-se-á o predomínio das espécies dissociadas
(Fernandez et al., 1996). A dependência do pKa com a força iônica segue a função
representada pela equação (18).
pKaµ≠o piranina = pKaµ=o - [(1,02 x Z1 x Z2 x µ½ ) / (1 + 2 x µ½ )]
(18)
onde: µ é a força iônica; µ = ½ΣCiZi2
Z1 e Z2 são as cargas das espécies;
Ci é a concentração molar das espécies.
Observou-se que os espectros de absorção coletados ao longo de 74 dias não
apresentaram alterações com relação à dissociação prototrópica no estado fundamental,
independendo da utilização do SDS. O SDS foi introduzido na tentativa de
compartimentalizar espécies e de alguma forma conduzir a cinéticas mais lentas. Estas e
outras alternativas, como o uso de outros surfatantes e tampões será realizada futuramente.
41
2.4
(A)
2.5
(B)
2.0
2.0
absorbância
absorbância
1.6
1.2
0.07
0.8
0.06
1.5
0.08
0.06
1.0
0.04
0.02
0.05
0.5
0.04
0.00
440
0.4
450
460
470
480
0.03
0.02
0.0
0.01
0.0
440
380
380
0.00
400
420
440
λ (nm)
460
460
480
480
400
420
440
460
480
500
500
λ (nm)
Figura 9: Espectro de absorção da piranina dopada nos monólitos derivados do TEOS em
função da concentração de solução tampão fosfato pH = 6,0 () 50 mM, () 40 mM, ()
30 mM, () 20 mM, () 5 mM e () água, após 7 dias de envelhecimento (A) sem SDS e
(B) com SDS.
42
Nas Figuras 10 (A) e 10 (B) estão apresentados os espectros normalizados de
emissão de fluorescência (λexc. = 350 nm) da piranina dopada nos monólitos derivados do
TEOS em função da concentração de solução tampão fosfato pH = 6,0, após 1 e 51 dias de
preparação do monólito, respectivamente. De acordo com a Figura 10 (A), observa-se a
presença da espécie POH* (λmáx. = 431 nm) e da espécie PO-* (λmáx. = 505 nm) para todas
as concentrações, indicando a dissociação prototrópica no estado excitado. Ao longo de 51
dias, observa-se somente a presença da espécie PO-* para as concentrações de 250 mM e 50
mM; e a presença das espécies POH* e PO-* para as demais concentrações. Ambos os
espectros, mostram que a presença da espécie POH* é inversamente proporcional à
concentração de tampão fosfato, ou seja, quanto maior é a concentração de tampão fosfato
menor é a presença da espécie POH*e, maior é a dissociação prototrópica no estado
excitado.
Os monólitos contendo SDS apresentaram praticamente o mesmo comportamento
em relação aos monólitos que não continham SDS, conforme ilustra as Figuras 11 (A) e 11
(B).
43
(B)
(A)
1.0
intensidade normalizada
intensidade normalizada
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
420
450
480
510
540
570
600
λ (nm)
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
420
450
480
510
540
570
λ (nm)
Figura 10: Espectros normalizados de emissão de fluorescência (λexc. = 350 nm) da piranina
dopada nos monólitos derivados do TEOS em função da concentração de solução tampão
fosfato pH = 6,0 () 250 mM, () 50 mM, () 5 mM, () 0,5 e () água, após (A) 1 e
(B) 51 dias de preparação, respectivamente.
44
600
(B)
(A)
1.0
intensidade normalizada
intensidade normalizada
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
420
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
420
450
480
510
540
570
450
480
510
540
570
600
600
λ (nm)
λ (nm)
Figura 11: Espectros normalizados de emissão de fluorescência (λexc. = 350 nm) da piranina
dopada nos monólitos derivados do TEOS contendo SDS em função da concentração de
solução tampão fosfato pH = 6,0 () 50 mM, () 40 mM, () 30 mM, () 20 mM, () 5
mM e () água, após (A) 1 e (B) 74 dias de preparação, respectivamente.
45
Uma vez que os monólitos derivados do TEOS sofrem encolhimento com o
processo de envelhecimento, o posicionamento da amostra no mesmo caminho óptico no
espectrofluorímetros fica comprometido. Desta maneira as intensidades medidas são
bastante variantes. Tendo em vista que, cada espectro contém os percentuais das espécies
POH* e PO-* e que ambas as espécies tem rendimento quântico de fluorescência próximo à
unidade, pode-se empregar a razão de intensidades como parâmetro analítico. Monitorouse, portanto a extensão de dissociação nos vários géis (e sistemas secos, vide infra) através
do percentual de PO-*. O percentual de PO-* é a relação entre as espécies POH* e PO-*,
segundo a expressão (19).
% PO-* = I(PO-*) / (I (POH*) + I (PO-*))
(19)
onde: I (PO-*) é a intensidade de fluorescência da espécie deprotonada;
I (POH*) é a intensidade de fluorescência da espécie protonada.
A Figura 12 apresenta o percentual de PO-* da piranina dopada nos monólitos
derivados de TEOS em função do tempo. Até ~12 dias, observa-se o aumento da
transferência de próton para todas as concentrações de tampão. Observa-se que a extensão
da transferência de próton é diretamente proporcional à concentração de tampão fosfato.
Inicialmente, a atividade relativamente baixa da transferência de próton é devida à presença
de etanol, proveniente da hidrólise de TEOS, que é lixiviado juntamente com a água assim
que o monólito derivado do TEOS envelhece. Conforme apresentado na introdução, a
transferência de próton da piranina em solução aquosa é inibida pela presença de etanol
[Chaudhury et al., 2003; Huppert & Kolodney et al., 1981]. Posteriormente ao
envelhecimento inicial, observa-se que para os monólitos contendo 250 mM e 50 mM de
tampão fosfato a transferência de próton mantém-se constante ao longo do tempo.
Entretanto, as demais concentrações (5 mM, 0,5 mM e na presença de água) apresentam
uma pequena estabilização (até ~ 22 dias), seguida pela diminuição da extensão de
transferência de prótons.
46
100
90
%PO-*
80
70
60
50
4
8
12
16
20
24
28
32
36
40
44
48
52
tempo (dias)
Figura 12: Percentual de PO-* da piranina dopada nos monólitos derivados do TEOS em
função do tempo, para as concentrações de solução tampão fosfato pH = 6,0 () 250 mM,
() 50 mM, () 5 mM, () 0,5 mM e () água.
47
As Figuras 13 (A) e 13 (B) apresentam os transientes obtidos por fotólise de
relâmpago da piranina dopada nos monólitos derivados do TEOS em função da
concentração de solução tampão fosfato após 2 e 19 dias de preparo, respectivamente.
Verifica-se que a constante de reprotonação observada é diretamente proporcional à
concentração de tampão fosfato e que esta constante torna-se maior após 19 dias de
preparo. Na Tabela 2 são apresentados os valores da constante de reprotonação observada
da piranina em função do tempo para os monólitos sem e com SDS relativos aos dias 1 e 8
de envelhecimento dos géis. Os monólitos contendo SDS apresentaram uma pequena
diminuição da difusibilidade do H+ atribuida à partição desta espécie em micelas de SDS.
Tabela 2: Constante de reprotonação observada da piranina dopada nos monólitos
derivados de TEOS sem e com SDS em função da concentração de tampão fosfato pH = 6,0
ao longo do tempo.
constante de reprotonação observada (s-1)
sem SDS
com SDS
[tampão fosfato]
dia 1
dia 8
dia 1
dia 8
50 mM
2,41E+06 1,99E+06 1,85E+06 2,10E+06
40 mM
2,25E+06 1,96E+06 1,75E+06 1,97E+06
30 mM
2,08E+06 1,76E+06 1,71E+06 1,99E+06
20 mM
2,04E+06 1,57E+06 1,43E+06 1,73E+06
5 mM
2,35E+06 1,78E+06 2,08E+06 1,91E+06
água
2,33E+06 1,68E+06 1,79E+06 1,88E+06
48
(B)
0.06
0.03
(A)
0.02
absorbância
absorbância
0.04
0.02
0.00
0.01
0.00
-0.01
-0.02
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
tempo (µs)
tempo (µs)
Figura 13: Transientes obtidos por fotólise de relâmpago (1600W) a 325 nm e monitorado a
455 nm para a piranina dopada nos monólitos derivados do TEOS em função da
concentração de solução tampão fosfato pH = 6,0 () 50 mM, () 40 mM e () 30 mM;
(B)
() 20 mM, () 5 mM
após (A) 2 dias e (B)
19 dias
de preparação,
respectivamente.
49
1.0
Estes resultados demonstram além do efeito marcante das espécies do tampão, mais
especificamente da forma alcalina do mesmo, o efeito da aproximação das espécies PO-, H+
e HPO4= com o envelhecimento do gel. Neste sentido os valores das constantes de
reprotonação estão influenciados pela concentração de sal no interior do gel o qual leva à
diminuição de pKa da piranina e do próprio tampão. Paralelamente ainda o aumento de
salinidade afeta diretamente a reação de reprotonação pela atuação ao nível do potencial
eletrostático. No sentido de se monitorar o teor de água residual no gel, após o
envelhecimento do monólito ~50 dias, verifica-se que ainda existe uma certa quantidade de
água no interior do monólito, sendo que a razão molar Si : H2O reduz-se a 1 : 7. O teor de
água foi monitorado através do percentual de perda de massa ao longo de aproximadamente
4 meses, visto que durante o envelhecimento ocorre perda de etanol e água. O percentual
de massa foi calculado, segundo a expressão (20).
Perda de massa = (mi – mx)/mi
(20)
onde: mi é a massa do monólito no dia da preparação;
mx é a massa do monólito no dia x após a preparação.
A Figura 14 apresenta o percentual de perda de massa em função do tempo. Até ~
36 dias, este percentual é crescente indicando a perda de etanol e água por lixiviação e
posteriormente tornando-se praticamente constante. Os monólitos apresentaram 80% de
perda de massa, este valor é consistente com a literatura [Brennan et al., 1997]. Torna-se
evidente que a perda de massa dos monólitos independe da concentração de solução tampão
fosfato e que aparentemente não ocorre a lixiviação destes sais do interior do gel. Deve-se
notar que os géis são visualmente isotrópicos e que não se observa a formação de cristais
nas superfícies externas dos mesmos. Estas observações estão em acordo que somente
espécies como a H2O e o ETOH conseguem difundir apreciavelmente, isto é, sofrem o
processo de lixiviação.
50
100
90
% perda de massa
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
16
32
48
64
80
96
112 128 144 160
tempo (dias)
Figura 14: Percentual de perda de massa dos monólitos derivados de TEOS em função do
tempo, para as concentrações de solução tampão fosfato pH = 6,0 () 250 mM, () 50
mM, () 5 mM, () 0,5 mM e () água.
\
51
4.4 Efeito da concentração de tampão fosfato sobre a mistura de KH2PO4 e K2HPO4
Com intuito de monitorar a participação efetiva das espécies do tampão fosfato,
foram dopadas misturas secas de KH2PO4 e K2HPO4 com valores de pHaparente = 4,0 a 6,0
com as sondas: piranina e 2-naftol.
Monitorou-se a transferência de próton da piranina no estado excitado e
fundamental nas misturas secas de KH2PO4 e K2HPO4 com os seguintes valores de
pHaparente 4,0; 4,3; 4,7; 5,0; 5,6; 5,8 e 6,0. De acordo com a Figura 15 (espectro de emissão
de fluorescência da piranina dopada na mistura seca), observa-se somente a presença da
espécie ácida, POH*, no estado excitado para pHaparente = 4,0 e 4,3 e, para os demais valores
de pHaparente a presença das espécies ácida e básica, PO-*, no estado excitado.
Com relação ao estado fundamental não foi possível experimentalmente definir a
presença das bandas devido às espécies ácida e básica em condições secas. Entretanto,
dados experimentais de fluorescência da piranina em cloreto de sódio sólido mostraram que
não ocorre a transferência de próton no estado excitado em condições secas, (Figuras 16 e
17).
A Figura 16 apresenta o espectro de excitação de fluorescência (λem. = 540 nm) da
piranina em cloreto de sódio sólido, no qual observa-se a presença das espécies POH (λmáx.
= 408 nm) e PO- (λmáx. = 460 nm) no estado fundamental.
A Figura 17 apresenta o espectro de emissão de fluorescência (λexc. = 380 nm) da
piranina em cloreto de sódio sólido, no qual observa-se a presença das espécies POH* (λmáx.
= 439 nm) e PO-* (λmáx. = 509 nm) no estado excitado. A presença das espécies no estado
excitado é o reflexo da excitação das espécies presentes no estado fundamental, justificando
a ausência de dissociação prototrópica no estado excitado nesta condição. Diante deste fato,
observou-se experimentalmente que o valor do pKa da piranina na condição de mistura seca
de KH2PO4 e K2HPO4 é 4,7; lembrando que o valor do pKaµ=0 da piranina é 8,0. O pKa da
piranina foi determinado através do percentual de PO-* em função do pHaparente da mistura
seca de KH2PO4 e K2HPO4, conforme Figura 18. O percentual de PO-* é a relação entre as
espécies POH* e PO-*, segundo a expressão (19).
52
% PO-* = I PO-* / (I (POH*) + I (PO-*))
(19)
onde: I (PO-*) é a intensidade de fluorescência da espécie deprotonada da piranina;
I (POH*) é a intensidade de fluorescência da espécie protonada da piranina.
A ausência de prototropismo da piranina em mistura seca de KH2PO4 e K2HPO4
sugere que as espécies H2PO4- e HPO4= do tampão não atuam como par ácido-base no
equilíbrio prototrópico da piranina e que há necessidade de uma certa quantidade de água
para que ocorra prototropismo. Então, investigou-se o teor limiar de água necessário para a
transferência de próton em mistura seca KH2PO4 e K2HPO4 na proporção de pHaparente = 6,0
com piranina e 2-naftol.
A Figura 19 apresenta o espectro de excitação de fluorescência (λem. = 540 nm) da
piranina dopada na mistura seca KH2PO4 e K2HPO4 na proporção de pHaparente = 6,0 em
função da fração molar de água adicionada. Após a adição de água à mistura seca, ocorre o
aparecimento da espécie POH (λmáx. = 402 nm) indicando a transferência de próton. Nesta
condição a fração de água limiar para a transferência de próton da piranina é 0,13; ao passo
que para o 2-naftol este valor é de 0,44.
53
intensidade normalizada
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
425
450
475
500
525
550
575
600
λ (nm)
Figura 15: Espectro de emissão de fluorescência (λexc. = 380 nm) da piranina dopada em
mistura seca de KH2PO4 e K2HPO4 em função do pHaparente () 6,0; () 5,8; () 5,6;
() 5,0; () 4,7; () 4,3 e () 4,0.
54
6.00
intensidade.e5 (u.ar)
5.25
4.50
3.75
3.00
2.25
360
380
400
420
440
460
480
λ (nm)
Figura 16: Espectro de excitação de fluorescência (λem. = 540 nm) da piranina em cloreto
de sódio sólido.
55
20
intensidade .e 5 (u.ar.)
16
12
8
4
0
425
450
475
500
525
550
575
600
λ (nm)
Figura 17: Espectro de emissão de fluorescência (λexc. = 380 nm) da piranina dopada em
cloreto de sódio sólido.
56
80
60
% PO
-*
pKa = 4,7
40
20
0
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
pH
Figura18: Percentual de PO-* da piranina dopada em mistura seca de KH2PO4 e KH2PO4 em
funcão do pHaparente.
57
14
(9)
intensidade.e6 (u. ar.)
12
10
(1)
8
6
4
2
0
360
380
400
420
440
460
λ (nm)
Figura 19: Espectro de excitação de fluorescência (λem. = 540 nm) da piranina dopada na
mistura seca de KH2PO4 e K2HPO4 com pHaparente = 6,0 em função da Xw de água
adicionada (1) 0,22; (2) 0,36; (3) 0,46; (4) 0,53; (5) 0,59; (6) 0,63; (7) 0,69; (8) 0,74 e (9)
0,76.
58
O fotoácido 2- naftol apresenta pKa = 9,5 no estado fundamental e pka* = 2,81 no
estado excitado [Ireland et al. 1976], ou seja torna-se um ácido
fraco em relação à
piranina. Conforme o espectro de excitação de fluorescência (λem. = 430 nm) do 2-naftol em
solução ácida ( pH 1), (Figura 20) observa-se somente a presença da espécie ácida no
estado fundamental, NOH, (λmáx. = 320 nm) já que o pH da solução ácida é 8 unidades
menor que pKa do 2-naftol. A Figura 21 apresenta o espectro de excitação de fluorescência
do 2-naftol em meio básico e aquoso. Em meio básico (pH = 10), observa-se a presença das
espécies ácida, NOH, ( λmáx. = 320 nm), e básica, NO- , (λmáx. = 360 nm), considerando que
o valor do pH da solução básica é próximo ao valor do pKa; e em meio aquoso somente a
presença da espécie ácida.
Na Figura 22 está apresentado o espectro de emissão de fluorescência (λexc. = 250
nm) do 2-naftol em soluções ácida, aquosa e básica. Em meio ácido, observa-se somente a
presença da espécie ácida no estado excitado, NOH* , ( λmáx. = 350 nm), indicando a
ausência de transferência de próton no estado excitado já que o pH do meio é menor que o
pKa do 2-naftol. Em meio básico, observa-se somente a presença da espécie básica no
estado excitado, NO-* , que é resultante da dissociação prototrópica da espécie NOH*. Ao
passo que, em solução aquosa observa-se à presença das espécies NOH* e NO-* indicando a
dissociação prototrópica no estado excitado.
A Figura 23 apresenta o espectro de emissão de fluorescência (λexc. = 294 nm) do 2naftol dopado na mistura seca KH2PO4 e K2HPO4 na proporção de pHaparente = 6,0 em
função da fração molar (Xw) de água adicionada. Na ausência de água, observa-se somente
a espécie NOH* (λmáx. = 402 nm) e, após a adição gradativa de água à mistura seca iniciase o processo de transferência de próton com o aparecimento da espécie NO-* (λmáx. = 414
nm). A extensão da dissociação prototrópica do 2-naftol é dependente do teor de água
adicionada à mistura seca, conforme Figura 24. A extensão de dissociação prototrópica do
2-naftol é expressa pela equação (21):
% NO-* = I( NO-*) / (I(NOH*) + I (NO-*))
(21)
59
onde: I (NO-*) é a intensidade de fluorescência da espécie deprotonada do 2-naftol;
I (NOH*) é a intensidade de fluorescência da espécie protonada do 2-naftol.
60
18
intensidade (u.ar.)
15
12
9
6
3
0
300
320
340
360
380
400
λ (nm)
Figura 20: Espectro de excitação de fluorescência (λem. = 430 nm) do 2-naftol em solução
ácida (pH 1).
61
800
700
intensidade (u.ar.)
600
500
400
300
200
100
0
300
320
340
360
380
400
λ (nm)
Figura 21: Espectro de excitação de fluorescência (λem. = 430 nm) do 2-naftol em soluções
() básica (pH 10) e () aquosa.
62
675
600
intensidade (u.ar.)
525
450
375
300
225
150
75
0
350
375
400
425
450
475
500
λ (nm)
Figura 22: Espectro de emissão de fluorescência (λexc. = 250 nm) do 2-naftol em soluções
() ácida (pH 1), () básica (pH 10) e () aquosa.
63
25
intensidade x 105 (u.ar.)
20
15
10
5
330
360
390
420
450
λ (nm)
Figura 23: Espectro de excitação de fluorescência (λem. = 294 nm) do 2-naftol dopado na
mistura seca de KH2PO4 e K2HPO4 com pHaparente = 6,0 em função da Xw de água
adicionada () isento; () 0,19; () 0,31; () 0,41; () 0,44; () 0,48; () 0,53; ()
0,56; (
) 0,60; () 0,61; () 0,63.
64
70
60
50
%NO
-*
40
XW 0.44
30
20
10
0
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Xágua
Figura 24: Extensão da dissociação prototrópica do 2-naftol em função da fração molar de
água adicionada à mistura seca de KH2PO4 e K2HPO4.
65
4.5 Efeito dos indicadores ácido-base sobre os monólitos derivados do TEOS
Os indicadores ácido-base: Azul de Bromofenol (BFB), Verde de Bromocresol
(BCG), Lilás de Bromocresol (BCP), Azul de Bromotimol (BTB) e Vermelho Cresol (CR)
são bem conhecidos como sonda de pH para monitorar a transferência de próton no estado
fundamental. A Tabela 3 mostra as bandas características de absorção, pKa e faixa de
viragem dos indicadores em solução acima citados.
Tabela 3: Propriedade dos indicadores ácido-base.
indicador
BPB
BCG
BCP
BTB
CR
banda de absorção λmáx. (nm) (a)
ácida
básica
437
591
443
616
431
589
433
617
434
572
pKa (a)
3,9
4,7
6,3
7,3
8,2
faixa de viragem (b)
3 ~ 4,6
4 ~ 5,6
5,2 ~ 6,8
6,2 ~ 7,6
7,2 ~ 8,8
(a) dados obtidos experimentalmente.
(b) [Lide, 2004-2005].
As Figuras 25 a 29, apresentam os espectros de UV/VIS dos monólitos derivados do
TEOS dopados com os indicadores ácido-base em função da concentração de solução
tampão fosfato.
Os espectros abaixo foram coletados logo após a preparação dos
monólitos, entretanto monitorou-se a transferência de próton ao longo de 50 dias.
66
4.5.1 Azul de Bromofenol e Verde de Bromocresol dopados nos monólitos
O comportamento dos indicadores Azul de Bromofenol e Verde de Bromocresol
dopados nos monólito foram bastante semelhantes com relação às espécies presentes no
estado fundamental. O espectro de absorção do Azul de Bromofenol dopado nos monólitos
apresenta bandas devido às espécies ácidas (λmáx. = 431 nm) e básicas (λmáx. = 597 nm),
conforme, Figura 25. As bandas de absorção devido às espécies ácidas (λmáx. = 433 nm) e
básicas (λmáx. = 623 nm) do Verde de Bromocresol dopados nos monólitos estão
apresentadas na Figura 26.
Ambos os indicadores, apresentam a presença da espécie básica, In-, para os
monólitos contendo 50, 40, 30 e 20 mM de tampão fosfato pH = 6,0, indicativo de que o
pH no interior do monólito é maior que o pKa do indicador (vide Tabela 3) para estas
concentrações. Para o monólito contendo 5 mM de tampão fosfato, observa-se a presença
das espécies ácida, HIn, e básica, portanto o pH do meio para esta concentração está
próximo do pKa do indicador. Para o monólito com água, observa-se a presença da espécie
ácida, indicando que o pH no interior do monólito, nesta condição, é inferior ao pKa do
Azul de Bromofenol e Verde de Bromocresol.
4.5.2. Lilás de Bromocresol dopado nos monólitos
De acordo com a Figura 27, observa-se a presença das espécies ácida, HIn, (λmáx. =
426 nm) e básica, In-, (λmáx. = 594 nm) para os monólitos contendo 50, 40, 30 e 20 mM de
tampão fosfato, indicando que o pH no interior no monólito está próximo de 6,3; valor do
pKa do Lilás de Bromofenol . Para as demais amostras, observa-se a presença da espécie
ácida, indicando que o pH, nesta condição, é inferior a 6,3, ou seja, valor do pKa do
indicador.
67
4.5.3. Azul de Bromotimol e Vermelho Cresol dopados nos monólitos
As Figuras 28 e 29 apresentam os espectros de absorção do Azul de Bromotimol e
Vermelho Cresol dopados nos monólitos, respectivamente. Observa-se a somente a
presença da espécie ácida, HIn, (λmáx. = 428 nm) e (λmáx. = 431 nm) para o Azul de
Bromotimol e Vermelho Cresol, respectivamente. Este comportamento indica que o pH no
interior dos monólitos é menor que o pKa destes dois indicadores .
Os espectros de absorção coletados ao longo de 50 dias não apresentaram nenhuma
alteração com relação às espécies presentes no dia da preparação dos monólitos;
confirmando a ausência de dissociação prototrópica no estado fundamental. Este fato
sugere que não ocorre mudança de pH no interior do monólito derivado de TEOS.
Outro aspecto observado é variação de pH no interior do monólito em função da
concentração de tampão fosfato pH = 6,0. Esta variação de pH ocorre devido à presença de
ácido clorídrico utilizado na preparação do hidrolisado de TEOS. Calculou-se o pHteórico
(vide Tabela 4) no interior dos monólitos em função das concentrações de tampão fosfato,
utilizando a equação de Henderson-Hasselbalch (22).
pH = pKa + log {[base conjugada]/ [ácido conjugado]}
(22)
onde: pKa é o logaritmos negativos da constante de dissociação do tampão fosfato;
[base conjugada] é a concentração da espécie básica do tampão fosfato;
[ácido conjugado] é a concentração da espécie ácida do tampão fosfato.
68
Tabela 4. pHteórico no interior do monólito derivado do
TEOS em função da concentração de tampão fosfato.
[tampão fosfato]
50 mM
40 mM
30 mM
20 mM
5 mM
água
pHteórico
5,8
5,7
5,6
5,2
3,2
3,0
Comparando a coloração dos indicadores em solução em função do pH e a coloração dos
indicadores dopados nos monólitos derivados de TEOS verifica-se que o valor de pHteórico
está de acordo ao pH no interior do monólito monitorado pelos indicadores. As Figuras 30
a 40 mostram a coloração dos indicadores em solução e nos monólitos.
69
1.2
1.0
absorbância
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
400
450
500
550
600
650
700
(λ) nm
Figura 25: Espectro de absorção do Azul de Bromofenol dopado no monólito derivado do
TEOS em função da concentração de tampão fosfato pH = 6,0 () 50 mM; () 40 mM;
() 30 mM; () 20 mM; () 5 mM; () água no dia da preparação.
70
0.6
0.5
absorbância
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
400
450
500
550
600
650
700
(λ) nm
Figura 26: Espectro de absorção do Verde de Bromocresol dopado no monólito derivado do
TEOS em função da concentração de tampão fosfato pH = 6,0 () 50 mM; () 40 mM;
() 30 mM; () 20 mM; () 5 mM; () água no dia da preparação.
71
0.5
absorbância
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
400
450
500
550
600
650
700
(λ) nm
Figura 27: Espectro de absorção do Lilás de Bromocresol dopado no monólito derivado do
TEOS em função da concentração de tampão fosfato pH = 6,0 () 50 mM; () 40 mM;
() 30 mM; () 20 mM; () 5 mM; () água no dia da preparação.
72
0.5
absorbância
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
400
450
500
550
600
650
700
(λ) nm
Figura 28: Espectro de absorção Azul de Bromotimol dopado no monólito derivado do
TEOS em função da concentração de tampão fosfato pH = 6,0 () 50 mM; () 40 mM;
() 30 mM; () 20 mM; () 5 mM; () água no dia da preparação.
73
0.5
absorbância
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
400
450
500
550
600
650
700
(λ) nm
Figura 29: Espectro de absorção do Vermelho Cresol dopado no monólito derivado do
TEOS em função da concentração de tampão fosfato pH = 6,0 () 50 mM; () 40 mM;
() 30 mM; () 20 mM; () 5 mM; () água no dia da preparação.
74
Figura 30: Azul de Bromofenol em função do pH
(2,2; 2,5; 2,9; 3,2; 3,6; 3,9; 4,3; 4,6; 4,9; 5,4).
Figura 31: Azul de Bromofenol nos monólitos em função do tampão
(água; 50 mM; 40 mM; 30 mM; 20 mM e 5 mM).
75
Figura 32: Verde de Bromocresol em função do pH
(2,9; 3,2; 3,6; 3,9; 4,3; 4,6; 5,0; 5,4; 5,9 e 6,4).
Figura 33: Verde de Bromocresol nos monólitos em função do tampão
(água; 50 mM; 40 mM; 30 mM; 20 mM e 5 mM).
76
Figura 34: Lilás de Bromocresol em função do pH
(3,9; 4,3; 4,6; 5,0; 5,4; 6,2; 6,4; 6,8; 7,3; 7,7).
Figura 35: Lilás de Bromocresol nos monólitos em função do tampão
(água; 50 mM; 40 mM; 30 mM; 20 mM e 5 mM).
77
Figura 36: Azul de Bromotimol em função do pH
(5,0; 5,4; 5,9; 6,4; 6,8; 7,4; 7,7; 7,9; 8,4; 8,9).
Figura 37: Azul de Bromotimol nos monólitos em função do tampão
(água; 50 mM; 40 mM; 30 mM; 20 mM e 5 mM).
78
Figura 38: Vermelho Cresol em função do pH
(6,4; 6,8; 7,4; 7,7; 7,9; 8,4; 8,9; 9,3; 9,6; 9,9).
Figura 39: Vermelho Cresol nos monólitos em função do tampão
(água; 50 mM; 40 mM; 30 mM; 20 mM e 5 mM).
79
5. Conclusões
Neste trabalho confirmou-se a ocorrência da transferência de próton da piranina no
estado excitado em sistemas vítreos derivados do TEOS em acordo com os resultados
obtidos anteriormente [Brennan et al., 1999]. Verificou-se que não há alteração do valor do
pH no interior do monólito após sua preparação, conforme dados de indicadores dopados
nos monólitos.
A partir dos resultados obtidos, é evidente que a concentração de tampão fosfato afeta o
equilíbrio prototrópico da piranina no interior dos monólitos. Um ponto a ser levantado é
que as espécies HPO4= e H2PO4- possam estar participando do equilíbrio prototrópico da
piranina.
Outro ponto a ser considerado é a presença da água no interior do monólito, já que a
piranina é uma sonda de pH muito susceptível à presença de água. Com o envelhecimento
do monólito ao longo do tempo, o teor de água torna-se reduzido (razão molar Si:H2O
inicial 1:16,5 e final 1:7 envelhecimento de ~ 120dias) e o equilíbrio de transferência de
prótons permanece ativo.
Entretanto, os resultados obtidos com a mistura seca de K2HPO4 e KH2PO4 na
proporção de pHaparente = 6,0 dopada com piranina e 2-naftol
demonstram
que
a
transferência de próton ocorre somente a partir de um dado limiar de água e, este limiar
depende ainda da força do ácido. A quantidade limiar para a transferência de próton da
piranina é de Xágua = 0,13 ao passo que para o 2-naftol é de Xágua = 0,44, lembrando que a
piranina é um ácido mais forte que o 2-naftol.
Em conclusão, os dados apresentados mostram que equilíbrios prototrópicos em géis e
em misturas “secas” de tampão ocorrem somente na presença de uma quantidade limite de
água, sendo ainda função do pKa da espécie doadora do H+. Desta forma torna-se aparente
que a difusibilidade das espécies H3O+ e H2O são os determinantes do processo. Em outros
80
termos ainda que a proximidade das espécies HPO4= e POH* ou HPO4= e NOH* seja
bastante próxima, somente a presença de H2O permite a separação, ou difusão, do H+
portanto a ocorrência de prototropismo.
.
81
6. Referências Bibliográficas.
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