Latin American Journal of Pharmacy
(formerly Acta Farmacéutica Bonaerense)
Trabajos originales
Recibido el 31 de julio de 2007
Aceptado el 16 de diciembre de 2007
Lat. Am. J. Pharm. 27 (1): 56-61 (2008)
Estudo Fitoquímico e Biológico
de Vernonia tweediana Baker (Asteraceae)
Gaspar DIAZ *1, Marisa A. NOGUEIRA 2, Conceição F. A. OLGUIN 3,
Andressa SOMENSI 3 & Gentil J. VIDOTTI 4
Departamento de Química, Universidade Federal de Minas Gerais,
31270-901, Belo Horizonte, MG, Brasil
2 Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular,
Universidade Federal de Viçosa, 36570-000, Viçosa, MG, Brasil
3 Departamento de Química, Universidade Estadual do Oeste do Paraná, 85903-000, Toledo, PR, Brasil
4 Departamento de Química, Universidade Estadual de Maringá, 87020-900, Maringá, PR, Brasil
1
RESUMEN. A mistura de α-amirina, β-amirina e lupeol e o ácido palmítico puro foram os principais
constituintes químicos isolados do extrato clorofórmio da parte aérea de V. tweediana. Lupenil palmitato
puro e a mistura de α-amiril palmitato e β-amiril palmitato foram isolados a partir do extrato clorofórmio
das raízes. As estruturas foram caracterizadas por métodos químicos e espectroscópicos. Também foram
investigadas as atividades biológicas dos extratos hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol das partes aéreas e raízes de V. tweediana. Os extratos mostraram atividades boas a moderadas.
SUMMARY. “Phytochemical and Biological Study of Vernonia tweediana Baker (Asteraceae)”. The mixture of
α-amyrin, β-amyrin and lupeol and pure palmitic acid were the main constituents isolated from chloroform extract of the aerial part of V. tweediana. Pure lupenyl palmitate and a mixture of α-amyril palmitate and β-amyril
palmitate were isolated from chloroform extract of the roots. Their structures were established by chemical and
spectroscopic methods. The biological activities of the hexane, chloroform, ethyl acetate and methanol extracts
of the aerial parts and roots from V. tweediana were also investigated. The extracts showed good to moderated
activities.
INTRODUÇÃO
As pesquisas com plantas medicinais, além
de visar o desenvolvimento de medicamentos
de baixo custo resgatam a preservação da cultura popular de grupos étnicos definidos referentes ao uso das plantas com fins terapêuticos,
evitando-se deste modo, que este conhecimento
seja perdido 1. Destaca-se também a importância
destes estudos para a preservação dos ecossistemas onde existem tais espécies, além de agregar
valor à biodiversidade da região 2-4.
O gênero Vernonia (Asteraceae) contém
mais de 1000 espécies distribuídas em áreas tropicais e subtropicais da Ásia, África e América, e
destas, mais de 350 são encontradas na América
do Sul, mais abundantemente no sul do Brasil,
Argentina, Paraguai e Bolívia 5. Muitas espécies
do gênero Vernonia são utilizadas medicinalmente em alguns paises da África para o tratamento da malaria, amebíase, infecções e doenças sexualmente transmissíveis 6-9.
Algumas espécies deste gênero já tiveram
sua ação terapêutica comprovada cientificamente. Dentre estas destacamos, por exemplo, as espécies V. colorata, com atividade antibacteraiana e antiinflamatória 10,11, V. cinerea com atividade analgésica, antipirética, antiinflamatória e
ação citotóxica 12,13, V. arborea com atividade
antifúngica 14, V. amygdalina como agente antimalárico e anticancerígeno 15,16, V. scorpioides
com atividade antifúngica 17 e V. liatroides com
ação relaxante muscular 18.
Os metabólitos secundários característicos do
gênero Vernonia são os triterpenos, esteróides e
lignóides 19,20. Entretanto, os constituintes químicos mais comuns são as lactonas sesquiterpênicas e flavonóides 21-27. A espécie Vernonia tweediana (assa-peixe), é uma espécie abundante
na região Oeste do Paraná, sendo facilmente encontrada nos pastos. Além da sua utilização na
medicina popular, ela é um problema para os
pastos e lavouras, pois é considerada uma erva
PALAVRAS CHAVE: Atividade biológica, Triterpenos, Vernonia tweediana.
KEY WORDS: Biological activity, Triterpenes, Vernonia tweediana.
*
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Autor a quem a correspondência deve ser enviada: E-mail: [email protected]
ISSN 0326-2383
Latin American Journal of Pharmacy - 27 (1) - 2008
daninha muito resistente e de difícil controle 28.
Um levantamento bibliográfico 29,30,31 permitiu
conferir a existência de estudos biológicos já feitos desta espécie, porém revelou a ausência de
trabalhos relacionados ao estudo fitoquímico da
mesma.
Baseado nessa pesquisa bibliográfica, o presente trabalho teve como objetivo fazer um estudo fitoquímico e de algumas atividades biológicas complementares dos extratos orgânicos
obtidos das raízes e partes aéreas de V. tweediana, assim como a elucidação estrutural dos
compostos isolados utilizando-se técnicas espectroscópicas de RMN, IV e espectrometria de
massas.
MATERIAL E MÉTODOS
Procedimentos Experimentais
Os pontos de fusão foram determinados em
placa de aquecimento utilizando capilar, sem
correção dos valores. Os espectros de absorção
na região do IV foram registrados em um espectrofotômetro Bomem, modelo MB - 100C26, em
pastilha de KBr, na região de 400 a 4000 cm-1.
Utilizou-se absorção em 1601 cm-1 de um filme
de poliestireno como referência. Os espectros
de RMN de 1H e 13C foram obtidos em espectrômetro Varian modelo Gemini 2000, operando a
300 MHz para 1H e 75,5 MHz para 13C, tendo
como referência interna o tetrametilsilano (TMS)
ou o próprio solvente. Os deslocamentos químicos (δ) foram dados em ppm e o solvente utilizado foi CDCl3. As cromatografias em coluna foram realizadas em colunas de vidro utilizandose sílica gel 60 (0,063-0,200 mm) da Merck. Nas
cromatografias em placa utilizaram-se sílica gel
60 GF254 e sílica gel 60 G da Merck. As revelações das placas foram efetuadas por irradiação
no ultravioleta λ = 254 e 366 nm, e pulverização
com solução etanólica a 7% de ácido fosfomolíbdico, seguida de aquecimento.
Material Vegetal
As partes aéreas e as raízes de V. tweediana
foram coletadas em janeiro de 2004 em Umuarama (PR). Uma exsicata (no. 2283) encontra-se
catalogada no Herbário HUNOP-Unioeste, Departamento de Ciências Biológicas.
Extração e Isolamento
A planta coletada foi dividida em parte aérea
e raiz, sendo seca e moída, obtendo-se, respectivamente, 100 e 300 g que foram submetidas à
extração através de maceração contínua à temperatura ambiente com hexano fornecendo
(1,12 g da raiz e 1,18 g da parte aérea), clorofórmio (0,767 g da raiz e 1,19 g da parte aérea),
acetato de etila (0,294 g da raiz e 0,334 g da
parte aérea) e metanol (7,0 g da raiz e 1,75 g da
parte aérea). O extrato clorofórmio da parte aérea (1,19 g) foi fracionado em coluna de sílica
gel e eluído com hexano/diclorometano até
100% obtendo-se 198 frações. As subfrações 80100 forneceram um precipitado branco correspondente à mistura de 1, 2 e 3 (21,0 mg) e as
subfrações 111-140 forneceram à substância pura 4 (15,0 mg, PF=61-63 °C). O extracto clorofórmio da raiz (0,767 g) foi fracionado em coluna de sílica gel e eluído com hexano/diclorometano até 100%. A purificação das subfrações reunidas 84-96 forneceu a mistura dos triterpenos 5
e 6 (60,0 mg) e a purificação das subfrações
110-155 forneceu a substância pura 7 (75 mg,
PF= 123-125 °C).
Atividades Biológicas
Os bioensaios foram feitos de acordo com as
metodologias já pré-estabelecidas na literatura
32,33. No bioensaio de A. salina, os extratos obtidos da parte aérea e raiz foram pesados e diluídos nos respectivos solventes, preparando-se
concentrações de 1000, 100 e 10 ppm. Após este procedimento prepararam-se dez frascos com
os extratos e o branco, evaporou-se o solvente
e adicionaram-se, aproximadamente 50 µL de
DMSO, 3 mL de água salgada e 10 larvas de A.
salina completando o volume para 5 mL. Os
frascos foram deixados descobertos e após 24 h
foram contados os sobreviventes. A ED50 a 95%
de intervalo de confiança foi determinada pela
análise de Probit.
No bioensaio de bioautografia, os extratos
obtidos da parte aérea e raiz foram diluídos em
DMSO e nos respectivos solventes e aplicados
na concentração de 100 µg/µL em cromatofolhas de alumínio sílica gel G F254 0,2 mm 6 x 6
cm (Branco e Amostra). O controle foi feito
aplicando-se 2 µL da solução de ciclopirox olamina. As placas foram então desenvolvidos com
Hexano/AcOEt (80:20), o solvente foi evaporado e a placa (amostra) foi colocada dentro de
uma placa de Petri de 90 mm de diâmetro, contendo o meio de cultura (20 mL), após a solidificação do meio de cultura foi aplicado cerca de
100 µL da suspensão de microrganismo contendo, aproximadamente 108 células/mL com auxílio de uma alça de Drigalski e incubada a 37 °C.
A leitura do resultado foi feita 24 h após a aplicação medindo-se os halos de inibição e comparando-os com o controle e com o branco.
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DIAZ G., NOGUEIRA M.A., OLGUIN C.F.A., SOMENSI A. & VIDOTTI G.J.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A purificação do extrato clorofórmico da parte aérea (folhas e caules), foi feita por cromatografia em coluna de sílica gel, utilizando como
eluente uma mistura de hexano/diclorometano
em ordem crescente de polaridade, resultando
na obtenção de uma fração (21 mg) composta
de uma mistura dos triterpenos 1, 2 e 3 e (15
mg) do ácido palmítico puro (4), Figura 1.
Os sinais simpletos intensos entre 0,8 e 1,2
ppm observados no espectro de RMN de 1H da
mistura são característicos de hidrogênios metílicos de esqueletos triterpénicos, os dois sinais
tripletos largos com integração para um hidrogênio cada, em 5,18 e 5,13 ppm, respectivamente, caracterizam os hidrogênios vinílicos em
1 e 2. Os sinais dupleto largo e duplo dupleto
com integração para um hidrogênio cada, acoplando entre si, em 4,69 e 4,57 ppm caracterizam os hidrogênios vinílicos em 3. Já, a maioria
dos sinais no espectro de RMN de 13C encontrase na região entre 14 e 35 ppm referente aos
carbonos metílicos e metilênicos.
Entretanto, a caracterização das substâncias
nessa mistura foi feita a partir do método proposto por Gallegos e Roque 34. Este método se
baseia na análise dos dados de RMN de 13C de
vários triterpenos em mistura, que mostra um
padrão inconfundível de deslocamentos químicos de carbonos sp2 característicos de cada esqueleto triterpênico oxigenados em C-3.
A análise dos deslocamentos químicos dos
carbonos sp2 desta mistura sugere que a mesma
seja composta dos triterpenos cujas estruturas
pertencem a α-amirina (1) (δ 139,8-C-13, 124,6-C12), a β-amirina (2) (δ 145,4-C-13; 121,9-C-12) e
ao lupeol (3) (δ 151,2-C-20; 109,5-C-29), respectivamente. A comparação dos dados obtidos para
os compostos 1, 2 e 3 com aqueles descritos por
Gallegos e Roque é mostrada na Tabela 1.
Os espectros de IV e de RMN de 1H e de 13C
de 4 foram compatíveis com aqueles descritos
na literatura.
A purificação do extrato clorofórmico da
raiz, por cromatografia em coluna de sílica gel,
eluída com hexano/diclorometano em ordem
crescente de polaridade forneceu a mistura dos
triterpenos esterificados 5 e 6 (60,0 mg), além
da substância pura 7 (37 mg).
O espectro de infravermelho da mistura de 5
e 6 apresentou uma banda em 1731 cm-1, característica de carbonila de éster.
Figura 1. Constituintes químicos isolados a partir dos extratos clorofórmico da parte aérea e da raiz de V. twee-
diana.
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Latin American Journal of Pharmacy - 27 (1) - 2008
α-amirina (1)
β-amirina (2)
Lupeol (3)
C - δ (ppm)
C - δ (ppm) - literatura
139,8 (C-13); 124,6 (C-12)
145,4 (C-13); 121,9 (C-12)
151,2 (C-20); 109,5 (C-29)
139,4 (C-13); 124,1 (C-12)
145,1 (C-13); 121,7 (C-12)
150,5 (C-20); 109,3 (C-29)
Tabela 1. Principais dados observados de RMN-13C (75,5 MHz, CDCl3) dos C-sp2 nos triterpenos 1, 2 e 3 e os da
literatura.* Usaram-se somente os valores considerados úteis para comparação.
O sinal em 80,8 ppm no espectro de RMN de
da mistura de 5 e 6 atribuídos ao carbono
carbinólico (C-3), sugere a esterificação do
oxigênio ligado a este carbono. Esta mistura
também foi caracterizada com o auxilio do método proposto por Gallegos e Roque 34. O espectro de RMN de 13C dessa mistura apresentou
67 sinais, sendo que a maioria destes encontrase na região entre 14 e 35 ppm correspondendo
aos carbonos metílicos e metilênicos. Os sinais
dos carbonos sp2 observados sugerem que a
mistura é composta pelos esteres α-amiril palmitato (5) (δ 139,8-C-13 e 124,5-C-12) e β-amiril
palmitato (6) (δ 145,4-C-13 e 121,9-C-12), Figura
1. Além disso, a comparação dos dados de RMN
de 13C do β-amiril palmitato (6) com aqueles
descritos na literatura 35 foram totalmente concordantes com este composto.
Hidrólise alcalina da mistura forneceu o correspondente ácido palmítico (4), que foi confirmado por comparação dos dados espectrais
com aqueles descritos na literatura e por CCD
com amostras autenticas, e outra mistura da αamirina (1) e β-amirina (2).
Os principais deslocamentos químicos no espectro de RMN de 13C para os compostos 5 e 6
são mostrados na Tabela 2, com destaque para
os carbonos sp2.
A análise do espectro de RMN de 1H da mistura reforça as conclusões feitas a partir dos dados observados no espectro de carbono. Os
13C
C
5, δ (ppm)
6, δ (ppm)
3
12
13
18
19
20
COO
CH3
80,8
124,5
139,8
59,3
39,8
39,8
173,9
14,1
80,8
121,9
145,4
47,4
47,0
31,3
173,9
14,1
Tabela 2. Principais dados observados de RMN-13C
(75,5 MHz, CDCl3) das substâncias 5 e 6, com desta-
que para os carbonos sp2.* Usaram-se somente os valores considerados úteis para comparação e elucidação.
principais deslocamentos químicos para os compostos 5 e 6 são mostrados na Tabela 3, com
destaque para os sinais característicos de hidrogênios vinílicos.
O espectro de infravermelho da substância 7
apresentou uma absorção em 1729 cm-1, confirmando a presença de carbonila de éster e outra
banda em 1641 cm-1 atribuída ao estiramento de
carbono olefínico. Observou-se também uma
absorção em 720 cm-1, que caracteriza a presença de várias unidades metilénicas (-CH2-)n
de uma cadeia hidrocarbonatada longa.
A análise do espectro de RMN de 1H de 7
mostra um dupleto largo em δ 4,68 (dl, J=2,4
Hz) e outro duplo dupleto largo em δ 4,56 (ddl,
J=1,2 e 2,4 Hz) integrando para um hidrogênio
cada, característicos de hidrogênios olefínicos
geminais presentes no esqueleto do lupeol 36 e
outro duplo dupleto em δ 4,48 (dd, J=5,6 e 10,8
Hz) integrando para um hidrogênio, característico de α-hidrogênio carbinólico esterificado no
C-3.
O espectro de RMN de 13C de 7 apresentou
um sinal em δ 173,6, atribuído a carbonila de
éster. O sinal em δ 80,6 atribuído ao carbono
carbinólico (C-3) sugere a esterificação nesse
carbono. Os sinais referentes aos carbonos sp2
foram observados em 109,3 ppm (C-29) e 150,9
ppm (C-20), respectivamente. Os demais sinais
foram atribuídos por técnicas conhecidas incluindo APT e DEPT (90°) e revelaram que a
unidade éster de cadeia longa tem um efeito sobre os deslocamentos de RMN de 13C no C-2, C4 e C-24. Com a finalidade de determinar o tamanho da cadeia lateral do éster, foi obtido um
espectro de RMN de 13C quantitativo com delay
H
δ (ppm)
J (Hz)
3
12’
12”
RCH2COO
4,50 (ql)
5,18 (tl)
5,12 (tl)
2,29 (t)
5,40
3,90
3,30
7,50
Tabela 3. Principais dados observados de RMN-1H
(300 MHz, CDCl3) nas substâncias 5 e 6.* Usaram-se
somente os principais valores considerados úteis para
elucidação.
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DIAZ G., NOGUEIRA M.A., OLGUIN C.F.A., SOMENSI A. & VIDOTTI G.J.
de 10 s para permitir a relaxação completa de
todos os carbonos. As áreas dos sinais dos carbonos referentes à cadeia lateral mostraram a
presença de 16 carbonos. Sob hidrólise alcalina
o composto forneceu o correspondente ácido
palmítico (4) e o lupeol (3), os quais foram confirmados por comparação dos dados espectrais
e por CCD com amostras autenticas.
A associação de todos esses dados e a comparação com os dados descritos na literatura 35,37
permitiu confirmar que a estrutura foi do lupenil
palmitato (7). Os principais deslocamentos químicos observados no espectro de RMN de 1H e
13C para o composto 7 são mostrados na Tabela
4.
Bioensaios
Os extratos hexânico, clorofórmico, acetato
de etila e metanólico obtidos, tanto da parte aérea quanto da raiz foram submetidos aos bioensaios de Artemia salina e bioautografia. No bioensaio de A. salina, apenas o extrato hexânico
da raiz apresentou atividade citotóxica significativa com um DL50 de 9,32 ppm. No bioensaio
de bioautografia, os extratos obtidos da parte
aérea e da raiz apresentaram atividade bacteriana, para as bactérias Proteus vulgaris, Enterobacter aerogenes, Proteus mirabilis, Serratia
marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii e Ba-
Ca
C
δ (ppm)
H - δ (ppm)
J (Hz)
2
23,7
-
-
3
80,6
4,48 (dd)
5,6 e 10,8
4
37,8
20
150,9
-
-
29’
109,3
4,57 (ddl)
1,2 e 2,4
29”
109,3
4,68 (dl)
2,4
COO
173,6
-
-
CH3
14,1
-
-
Tabela 4. Principais dados observados de RMN-1H
(300 MHz, CDCl3) e RMN-13C (75,5 MHz, CDCl3) para
a substância 7. * Usaram-se somente os valores considerados úteis para elucidação.
cillus cereus, sendo que alguns apresentam halos de inibição maiores que o do controle (Tabela 5).
Nesse sentido, supõe-se que as atividades citotóxicas e bactericidas dos extratos ativos estejam relacionadas a algumas substâncias presentes nestes extratos, dai o interesse em poder
obtê-las em suas formas puras para verificar estas atividades.
Agradecimentos. Ao CNPq pelo apoio financeiro,
Processo no 479150/2004-4.
Parte aérea b
Raiz
Halo de inibição (mm) c
Microrganismos
H
C
M
H
C
M
n/a
n/a
Acinetobacter baumannii *
10
n/a
12
n/a
n/a
Escherichia coli
10
n/a
n/a
n/a
n/a
n/a
n/a
Enterobacter aerogenes
12
15
15
15
8
n/a
n/a
Pseudomonas aeruginosa *
10
n/a
18
n/a
4
n/a
n/a
Proteus mirabilis *
12
8
15
n/a
n/a
n/a
8
Proteus vulgaris
12
n/a
15
n/a
n/a
5
n/a
Klebsiella pneumoniae
10
n/a
n/a
n/a
n/a
n/a
n/a
Staphylococcus aureus
10
n/a
18
n/a
12
n/a
n/a
Bacillus cereus
10
n/a
12
n/a
5
n/a
5
Salmonella typhimurium
10
n/a
n/a
n/a
n/a
n/a
n/a
Serratia marcescens
10
n/a
12
n/a
5
n/a
n/a
Shigella flexneri
10
n/a
n/a
n/a
n/a
n/a
n/a
Tabela 5. Atividade antibacteriana dos extratos hexânico, clorofórmico e metanólico da parte aérea e da raiz de
V. tweediana Baker.* Bactérias multi-droga resistentes; a = Controle Ciclopirox Olamina; b = Folhas e Caules; c =
Média de duas repetições; n/a = não ativo.
60
Latin American Journal of Pharmacy - 27 (1) - 2008
REFERÊNCIAS
1. Noldin, V.F., V.F. Cechinel, F.D. Monache, J.C.,
Benassi, I.L. Christamann, R.C. Pedrosa & R.A.
Yunes (2003) Quim. Nova 26: 331-4.
2. Alves, M.H. (2001) Química Nova na Escola 3:
10-5.
3. Hamburger, M. & K. Hostettmann, (1991) Phytochemistry 30: 3864-74.
4. Newman, D.J., G.M. Cragg & K.M. Snader
(2000) Nat. Prod. Rep. 17: 215-34.
5. Robinson, H.S. (1999) Contr. Bot. 89: 1-116.
6. Hamill, F.A., S. Apio, N.K. Mubiru, M. Mosango, R. Bukenya-Ziraba, W. Maganyi & D.D.
Soejarto (2000) J. Ethnopharmacol. 70: 281300.
7. Kambizi, L. & A. Afolayan (2001) J. Ethnopharmacol. 77: 5-9.
8. Kelmanson, J.E., A.K. Jäger & J. van Staden
(2000) J. Ethnopharmacol. 69: 241-6.
9. Tona, L., R.K. Cimanga, K. Mesia, C.T. Musuamba,T. De Bruyne, S. Apers, N. Hernans,
S., Van Miert, L. Pieters, J. Totté & A.J. Vlietinck (2004) J. Ethnopharmacol. 93: 27-32.
10. Rabe, T., D. Mullholland & J. van Staden
(2002) J. Ethnopharmacol. 80: 91-4.
11. Cioffi, G., R. Sanago, D. Diallo, G. Romussi &
N. De Tommasi (2004) J. Nat. Prod. 67: 389-94.
12. Iwalewa, E.O., O. Jiwalewa & J.O. Adeboye
(2003) J. Ethnopharmacol. 86: 229-34.
13. Kuo, Y-H., Y.-J. Kuo, A.-S., Yu, M.-D. Wu, C.
Wong, L.-M.Y. Kuo, J.-T. Huang, C.-F. Chen &
S.-Y. Li (2003) Chem. Pharm. Bull. 51: 425-6.
14. Kumari, G.N.K., S. Masilamani, M.R. Ganesh, S.
Aravind, S.R. Sridhar & D. Zaluzanin (2003) Fitoterapia 74: 479-82.
15. Abosi, A. & B. Raseroka (2003) J. Biomed. Sci.
60: 89-91.
16. Howard, C.B., J. Stevens, E.B. Izevbigie, A.
Walker & O. McDaniel (2003) Cell. Mol. Biol.
49: 1057-65.
17. Freire, M., H. Abreu, L. da Cruz & R. Freire
(1996) Rev. Microbiol. 27: 1-6.
18. Campos, M., M. Oropeza, H. Ponce, J. Fernandez, M. Jimenez-Estrada, H. Torres & R. ReyesChilpa (2003) Biol. Pharm. Bull. 26: 112-5.
19. Tchinda, A.T., P. Tane, J.F. Ayafor & J.D. Connolly (2003) Phytochemistry 63: 841-6.
20. Akihisa, T., Y. Hayashi, G.W. Patterson, N. Shimizu & T. Tamura (1992) Phytochemistry 31:
1759-63.
21. Pollora, G.C., A. Bardón, C.A.N. Catalán, C.L.
Griffin & W. Herz (2004) Biochem. Syst. Ecol.
32: 619-25.
22. Ganjian, I., I. Kubo & P. Fludzinski (1983)
Phytochemistry 22: 2525-6.
23. Miserez, F., O. Potterat, A. Marston, G.M. Mungai & K. Hostettmann (1996) Phytochemistry
43: 283-86.
24. Carvalho, M.G. & P.M. Costa (1999) J. Braz.
Chem. Soc. 10: 163-6.
25. Kotowicz, C., A. Bardón, C.A.N. Catalán, C.M.
Croda-Garcia-Rojas & P. Joseph-Nathan (1998)
Phytochemistry 47: 425-8.
26. Bazon, J.N., C.J.L. Lopes, W. Vichnewski, A.D.
Dias, K. Nagamiti, W.R. Cunha & W. Herz
(1997) Phytochemistry 44: 1535-36.
27. Costa, P.M. da. Dissertação de Mestrado, Departamento de Química; Universidade Federal
Rural do Rio de Janeiro, Brasil, 1996, págs. 520.
28. Schneider, M.B., C.B.D. Bosco, C.F.A. Olguin,
J.M.B. Bocardi, A. Assenheimer, N.M. Klaus,
M.B. Cunha, R.A.S. Lucca & A.C.C. Bobato
(2002) Anais do II Seminário de Extensão Universitária, Toledo, Brasil, 323-7.
29. Olguin, C.F.A., L. Hamerski, M.F. Percio & A.
Somensi (2005) Varia Scientia 5: 137-43.
30. Monks, N.R., A. Ferraz, S.A.L. Bordignon, K.R.
Machado, M.F.S. Lima, A.B., da Rocha &, G.
Schwartsmann (2002) Pharm. Biol. 40: 494500.
31. Monks, N.R., A. Ferraz, S.A.L. Bordignon, K.R.
Machado, D.H. Faria, R.M. Lopes, C.A. Mondin, I.C.C. Souza, M.F.S. Lima, A.B. da Rocha
& G. Schwartsmann (2002) Pharm. Biol. 40:
603-16.
32. Cepleanu, F., K. Ohtani, M. Hamburger, K.
Hostettmann, P.M. Gupta & P. Solis (1993)
Helv. Chim. Acta 76: 1379-88.
33. Saxena, G.S., G.H.N. Towers & R.E.W. Hancock (1995) Phytochem. Anal. 6: 125-9.
34. Gallegos, R.S.O. & F.N. Roque (1990) Quim.
Nova 13: 278-81.
35. Chávez, J.P., I.D. Dos Santos, F.G. Cruz & J.M.
David (1996) Phytochemistry 41: 941-3.
36. Mahato, S.B. & A.P. Kundu (1994) Phytochemistry 37: 1517-75.
37. Razdan, T.K., P.K. Kachroo, M.A. Qurishi, A.K.
Kalla & E.S. Waight (1996) Phytochemistry 41:
1437-8.
61