[ artigo original ] Efeitos de diferentes aditivos sobre as propriedades antimicrobianas, físicas e químicas do agregado trióxido mineral (MTA)
Introdução
O agregado trióxido mineral (MTA) é reconhecido
como um material bioativo com excelentes propriedades
químicas e físicas, como a baixa toxicidade, ausência de
efeito cocarcinogêncio, baixa solubilidade em contato com
fluidos dos tecidos e estabilidade dimensional1. Essas propriedades são responsáveis por seu uso bem-sucedido em
muitas aplicações clínicas, incluindo capeamento pulpar
direto2, apicificação, reparação de reabsorção radicular
externa e como material retro-obturador3,4.
As principais vantagens desse cimento incluem sua
biocompatibilidade e a capacidade de estimular a reparação de tecidos mineralizados5,6. A natureza hidrofílica
de suas partículas de pó permite sua utilização em ambientes úmidos, como no selamento de perfurações e
em cirurgias apicais7,8.
No que diz respeito ao tempo de presa, as características do MTA dependem do tamanho das partículas, a proporção de pó e líquido utilizada, temperatura e presença
de umidade9. No caso de ProRoot MTA (Dentsply Maillefer, Ballaigues, Suíça), o tempo de presa é de duas horas e
47 minutos8; o tempo de presa está relacionado à presença
e quantidade de sulfato de cálcio da fórmula. O fabricante
do MTA Angelus (Angelus, Londrina/PR) removeu o sulfato de cálcio de sua composição, proporcionando um tempo de presa menor, de 10 a 15 minutos6.
No entanto, quando o MTA é manipulado com água
destilada, produz-se uma mistura granulada e arenosa,
que se resseca rapidamente, dificultando a manipulação, inserção, preenchimento e condensação do material, principalmente em áreas de difícil acesso10. Algumas alternativas para a água destilada foram estudadas,
visando melhorar suas propriedades, como o propilenoglicol, por exemplo11.
Kogan et al.10 identificaram os tipos e a quantidade de
aditivos necessários para se obter as melhores propriedades para a utilização de ProRoot MTA em procedimentos
clínicos. Observaram que o MTA associado com hipoclorito de sódio gel (NaOCl) apresentou propriedades físico-químicas e tempo de trabalho satisfatórios. Além disso,
outras substâncias, como o K-Y gel e clorexidina (CHX)
gel a 2%, favoreceram o escoamento e, no entanto, não
interferiram nas propriedades químicas do material.
A atividade antimicrobiana do MTA é um ponto ainda muito discutido na literatura, devido aos diferentes
resultados encontrados12. A ação antimicrobiana deve-se ao seu pH alcalino e ao seu tempo de presa, devido
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à hidratação do MTA, resultando em CaOH2,8,13. A difusão de pH na ação antimicrobiana é pobre em meios de
cultura sólidos. A difusão em ágar requer gradientes de
difusão similares das substâncias, para a comparação
de sua eficácia14.
Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a
atividade antimicrobiana, solubilidade, tempo de presa,
nível de pH, liberação de cálcio, escoamento e características da superfície do MTA, quando associado às
substâncias NaOCl a 1% gel, CHX gel a 2%, água destilada/propilenoglicol (CCPG), K-Y gel, solução salina e
água destilada. A hipótese nula é a de que a substância
associada ao MTA não interfere na atividade antimicrobiana e nas propriedades físico-químicas do material.
Material e Métodos
O cimento MTA (Angelus), utilizado no presente estudo, foi associado a diferentes veículos, de acordo com
os seguintes grupos: Grupo 1, NaOCl a 1% gel; Grupo 2,
CHX gel a 2%; Grupo 3 (CCPG), água destilada/propilenoglicol (90% de água e 10% de propilenoglicol); Grupo 4,
K-Y gel (Johnson & Johnson, São José dos Campos/SP);
Grupo 5, solução salina; Grupo 6 (DW), água destilada
(grupo controle). As amostras foram pesadas em uma
balança de precisão e a proporção de manipulação foi
de 1,0g de pó de MTA para 0,35ml da substância testada
(de acordo com o grupo).
Análise antimicrobiana
Foram adquiridas amostras de cada substância e inseridas em tubos de vidro esterilizados, de 3mm de altura e 4mm de diâmetro interno, obtidos a partir de corte
pela máquina de corte Isomet (Buehler, Lake Bluff, Illinois, EUA) com disco de diamante (Extec Corp, Enfield,
Ct, EUA). Os cimentos foram testados em dois períodos
experimentais: imediatamente e 24 horas após a manipulação. As amostras foram mantidas em estufa a 37ºC,
sob umidade controlada.
Para o teste antimicrobiano, foram utilizados Streptococcus mutans (ATCC 25175), Lactobacillus casei
(ATCC 7469), Enterococcus faecalis (ATCC 29212) e
Candida albicans (NTCC 3736). O meio de cultura utilizado para o crescimento bacteriano foi o Brain-Heart
Infusion (BHI, Difco, EUA) e Sabouraud (dextrose) (Difco), para crescimento de fungos. Foi adicionado 15%
de ágar para o meio sólido e plaqueado em placas de
Petri de 15 x 150mm.
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As culturas foram repicadas e cultivadas em tubos
contendo 3mL de caldo BHI, renovado uma vez ao dia,
durante três dias, para atingir o crescimento exponencial dos microrganismos. Cada espécime foi congelada
e armazenada.
A suspensão de células de cada tubo foi analisada
em espectrofotômetro (Bel Photonics do Brasil Ltda,
Osasco/SP), a 540nm, a fim de coincidir com a absorvência equivalente ao tubo 0,5 (1,5 x 108 UFC/mL), na
escala de McFarland.
Para o método de contato direto, o teste foi realizado
durante a fase exponencial, para cada microrganismo,
e definido durante o experimento piloto. O inóculo e as
amostras foram imersas em tubos e testados em triplicata. Para os controles positivos, foram utilizados apenas
os microrganismos; para os controles negativos, apenas
as amostras de cimento, sem microrganismos, foram
utilizadas nos meios de cultura. As amostras, nos diferentes períodos testados, foram previamente misturadas
e armazenadas em caixas esterilizadas. Em seguida, as
amostras imediatas e após 24 horas foram inseridas em
tubos de vidro, e a atividade antimicrobiana foi avaliada a
cada duas horas, durante 10 horas, utilizando um espectrofotômetro. Foram utilizados 50μl de suspensão celular, a partir de cada tubo, e semeadas em placas de ágar
BHI. Essas amostras foram, então, incubadas durante 24
a 48 horas, a 37ºC, para avaliar o crescimento microbiano, por meio de UFC (unidades formadoras de colônias).
A amostras foram categorizadas com as seguintes pontuações: 0 = sem colônias; 1 = até 100 UFC; 2 = mais de
100 UFC; 3 = mais de 100 UFC, com crescimento confluente. A pureza das culturas foi confirmada por meio de
coloração de Gram e da morfologia das colônias.
Em seguida, as amostras foram removidas dos moldes; algumas partículas foram removidas da superfície e,
então, pesadas em uma balança com precisão de 0,001g.
Depois, todas as amostras foram inseridas em um becker,
e 50ml de água destilada foram adicionados, sendo mantidas suspensas na água durante sete dias, sem tocar as
paredes do becker. Após esse período, os espécimes foram removidos, lavados, secados e aquecidos em desumidificador, durante 24 horas, para, então, serem pesados
novamente. A solubilidade foi calculada em porcentagem, multiplicando-se por 100 a diferença entre a massa
inicial e a final, e dividindo pela massa inicial.
Tempo de presa
As amostras foram confeccionadas de acordo com
a especificação #57 da ADA. A especificação utilizada
para avaliação dos tempos de presa inicial e final dos
cimentos testados foi a #C266-08 da ASTM (Sociedade
Americana de Testes e Materiais). Durante esse período, os espécimes foram armazenados em estufa, a uma
temperatura de 37°C, a uma umidade relativa de 100%.
Os cimentos foram manipulados e inseridos em
anéis metálicos com 10mm de diâmetro interno e 2mm
de altura. Para a avaliação dos tempos de presa inicial e
final, as superfícies foram penetradas com agulhas Gillmore de, respectivamente, 113,5g e 453,6g. Esse procedimento foi repetido em intervalos de dois minutos.
Em ambos os registros, os tempos de presa foram registrados no momento em que a agulha não conseguia
deixar um recuo circular completo. Três amostras foram
utilizadas para cada material.
Teste de escoamento
O teste de escoamento foi realizado seguindo um
método semelhante ao descrito na especificação #57
da ADA. Um total de 0,5ml do cimento testado foi inserido sobre uma placa de vidro (40 x 40 x 5mm), usando
uma seringa graduada descartável de 3ml. Três minutos
após a manipulação, outra placa de vidro, com massa de
20 ± 2g e uma carga de 100g, totalizando 120g, foi aplicada no centro, em cima do material, e mantida a uma
temperatura de 23 ± 2ºC, a uma umidade de 50 ± 5%.
Dez minutos após a manipulação inicial, a carga foi retirada e calculada a média do maior e do menor diâmetro
dos discos comprimidos, medidos com um paquímetro
digital com resolução de 0,01mm (Mitutoyo MTI Corporation, Tóquio, Japão). Se ambas as medidas fossem
Teste de solubilidade
A solubilidade foi avaliada utilizando-se o método
descrito por Estrela et al.15, seguindo as especificação
#57 da ADA. Os cimentos foram manipulados e inseridos em anéis metálicos, produzindo amostras circulares
de 20mm de diâmetro e 1,5mm de espessura. Um fio de
nylon foi inserido no interior do cimento, a fim de manter a amostra em suspensão; em seguida, foram imersas em água destilada, durante o período experimental.
As amostras foram recobertas com uma placa de vidro com uma folha de papel celofane interposta. Essas
amostras foram armazenadas em um forno a 37ºC, por
três vezes o tempo de endurecimento do MTA.
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Análise estatística
Os dados dos testes de contato direto, solubilidade, pH,
liberação de íons cálcio, o tempo de presa e escoamento
foram distribuídos normalmente e a análise de variância
(ANOVA) foi usada para os testes de comparação múltipla.
O teste de Tukey-Kramer foi usado para as comparações
individuais; para análise das características de superfície,
usou-se o teste de Kruskal-Wallis para comparação global
e o teste de Dunn para as comparações individuais. O nível
de significância de 5% foi utilizado para todos os testes.
consistentes, dentro de um intervalo de 1,0mm, os resultados eram registrados; se os discos formados pelo
maior e menor diâmetro não fossem uniformemente circulares ou se não se encontrassem dentro desse
1,0mm, o teste era repetido. A média das três medições,
para cada amostra, foi considerada como a capacidade
de escoamento do material. De acordo com a especificação #57 da ADA para o teste de escoamento, um disco de pelo menos 25mm de diâmetro deve ser obtido.
pH e liberação de cálcio
Foram utilizados 65 dentes artificiais de resina acrílica,
que receberam preparo na extremidade da raiz. Esses dentes foram preenchidos com cimento, com os diferentes
veículos testados, e imersos, individualmente, em 10mL
de água deionizada. Um dente artificial, sem qualquer material de preenchimento, foi imerso e utilizado como controle. Após períodos de 3, 24, 72 e 168 horas, os dentes
foram colocados em novos frascos; a água na qual os dentes haviam sido mantidos teve seu pH determinado e sua
liberação de cálcio foi medida (mg/dL).
As medições de pH foram realizadas utilizando um
pHmetro, sempre calibrando sua precisão em soluções
tampão, com níveis de pH de 4, 7 e 14. A liberação de
íons de cálcio foi medida utilizando-se um espectrofotômetro de absorção atômica (Thermo Scientific, Solaar M Series AA, Cambridge, Inglaterra), equipado
com lâmpada de cátodo oco.
Para evitar possíveis interferências de metais alcalinos,
foi utilizada uma solução de cloreto de lantânio 0,20mol/L.
Foram utilizadas soluções padrão de cálcio, contendo
5mg/L, 10mg/L, 20mg/L, 40mg/L e 80mg/L. Água ultrapura foi utilizada como controle. As leituras de liberação de
íons Ca++ foram realizadas no mesmo momento em que o
nível de pH era determinado.
A
B
Análise das características de superfície
Para essa análise, foram utilizados 30 dentes de acrílico, cujas cavidades retrógradas foram preenchidas com
os materiais testados, consistindo de 5 espécimes por
grupo. Após o preenchimento, os dentes foram armazenados a 37ºC, com 100% de umidade, durante 24 horas,
para a presa do cimento. Após 24 horas, as amostras foram preparadas e analisadas em microscópio eletrônico
de varredura (Aspex Express, FEI Company, Eindhoven,
Países Baixos), avaliando-se as características de superfície dos materiais testados e sua porosidade (Fig. 1).
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C
Figura 1. Imagens de microscopia eletrônica de varredura para avaliação da porosidade e das características de superfície dos diferentes materiais testados. A primeira imagem representa a baixa porosidade (A),
seguida de média porosidade (B) e alta porosidade (C).
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Resultados
Teste de contato direto
Nenhum dos veículos testados com o MTA foi capaz de eliminar totalmente os microrganismos, apresentando apenas efeito inibidor. O Enterococcus faecalis apresentou um baixo crescimento entre duas e seis
horas, quando em contato com o grupo CHX, sendo
os valores bem acima dos observados para o NaOCl
a 1% gel, K-Y gel, CCPG e solução salina (Fig. 2).
Não houve diferença estatística significativa (p > 0,05)
entre os grupos após 8 a 10 horas, mas é possível
estabelecer a seguinte ordem decrescente de inibição: CHX > K-Y > NaOCl > CCPG > solução salina.
As amostras de 24 horas de MTA associadas aos
veículos CHX e K-Y promoveram maior inibição em
comparação ao CCPG.
Com relação à capacidade de inibição de UFC,
o CHX gel a 2% apresentou resultados significativos
após duas horas. No período de quatro horas, não foram observadas diferenças estatísticas significativas
(p > 0,05) entre os grupos; após seis e dez horas, o K-Y
gel promoveu o maior crescimento em comparação a
todos os veículos testados (Fig. 2). Os grupos testados
apresentaram resultados semelhantes após 24 horas,
e um crescimento confluente de escore 3.
Houve diferença estatística significativa (p < 0,05) na
inibição do Lactobacillus casei entre os grupos CCPG e
CHX gel a 2%. Após um período de quatro horas, o grupo da CHX gel a 2% apresentou melhores resultados em
comparação aos outros grupos, e o K-Y gel foi o mais
eficaz, seguido pelo CCPG (Fig. 3). Embora a CHX tenha
apresentado melhores resultados, não houve diferenças
estatísticas significativas (p < 0,05) entre os veículos utilizados, após 6, 8, 10 e 24 horas. As contagens de UFC
também não apresentaram diferença estatística (p > 0,05)
entre todos os veículos para todos os períodos.
Foram observadas diferenças estatísticas significativas (p < 0,05) entre o K-Y gel e o CCPG após duas
horas em contato direto com o Streptococcus mutans
(Fig. 4), mas nenhuma diferença depois de 4, 6, 8, 10 e
24 horas. Porém, nas placas de Petri foram observadas
diferenças estatísticas significativas (p < 0,05) após 2, 4
e 6 horas para a CHX, em comparação aos outros veículos (Fig. 4), que apresentaram poucas UFC.
Os resultados para a Candida albicans mostraram
diferença estatística significativa (p < 0,05) entre o
CCPG e o CHX após duas horas, assim como na comparação entre o CHX e a água destilada (Fig. 5). A
contagem de UFC teve crescimento confluente em todos as placas, sem diferença estatística. Nos períodos
de 4 e 10 horas, o K-Y teve o pior resultado, apresentando menor inibição; entre as amostras de 24 horas;
a CHX foi a mais eficaz (Fig. 5).
Liberação de cálcio
No período de três horas houve diferença estatística significativa (p < 0,05) entre os grupos K-Y, CCPG,
água destilada e solução salina. Além disso, houve diferença estatística significativa (p < 0,05) do NaOCl a 1%
e do CHX a 2% gel em comparação à água destilada.
Nas demais comparações, não foi encontrada diferença
estatística significativa (p > 0,05).
Contato direto - Enterococcus faecalis 4 horas
Contagem de UFC - Enterococcus faecalis 10 horas
3
1,5
2
Scores
Densidade óptica
2,0
1,0
1
0,5
0
0,0
Cl
O
Na
HX
C
» NaOCl = NaOCl a 1% gel
Y
K-
G
CP
C
» CHX = Clorexidina gel a 2%
l
DW
OC
Na
» K-Y = K-Y gel
X
CH
Y
K-
» CCPG = água destilada/propilenoglicol
PG
CC
DW
» DW = água destilada (grupo controle)
Figura 2. Representação gráfica da absorbância e unidades formadoras de colônias (UFC) do meio de cultura com Enterococcus faecalis, após 4 e
10 horas, respectivamente, da manipulação do cimento, com os diferentes veículos.
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Contato direto - Lactobacilus 4 horas
Contagem de UFC - Lactobacilus 4 horas
4
3
1,5
Scores
Densidade óptica
2,0
1,0
0,5
2
1
0,0
0
Cl
X
CH
O
Na
» NaOCl = NaOCl a 1% gel
Y
G
CP
K-
C
» CHX = Clorexidina gel a 2%
l
X
OC
DW
CH
Na
» K-Y = K-Y gel
» CCPG = água destilada/propilenoglicol
Y
PG
K-
DW
CC
» DW = água destilada (grupo controle)
Figura 3. Representação gráfica da absorbância e unidades formadoras de colônia (UFC) do meio de cultura com Lactobacillus Casei, após o período
de 4 horas da manipulação do cimento, com os diferentes veículos.
Contato Direto - Streptococcus mutans 2 horas
Contagem de UFC - Streptococcus mutans 2 horas
0,8
3
2
Scores
Densidade óptica
0,6
0,4
1
0,2
0,0
0
Cl
O
Na
X
CH
» NaOCl = NaOCl a 1% gel
Y
K-
l
PG
OC
CC
» CHX = Clorexidina gel a 2%
Na
» K-Y = K-Y gel
X
CH
Y
K-
PG
CC
» CCPG = água destilada/propilenoglicol
Figura 4. Representação gráfica da absorbância e das unidades formadoras de colônias (UFC) do meio de cultura com Streptococcus mutans, após
o período de 2 horas da manipulação do cimento, com os diferentes veículos.
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Contato direto - Candida albicans 2 horas
Contagem de UFC - Candida albicans 24 horas
2.5
4
3
1.5
Scores
Densidade óptica
2.0
2
1.0
1
0.5
0
0.0
l
OC
Na
X
CH
» NaOCl = NaOCl a 1% gel
Y
K-
PG
CC
» CHX = Clorexidina gel a 2%
l
OC
DW
Na
» K-Y = K-Y gel
X
CH
» CCPG = água destilada/propilenoglicol
Y
K-
PG
CC
DW
» DW = água destilada (grupo controle)
Figura 5. Representação gráfica da absorbância e unidades formadoras de colônias (UFC) do meio de cultura com Candida albicans, após os períodos de 2 e 24 horas, respectivamente, da manipulação do cimento, com os diferentes veículos.
No período de 24 horas, houve diferença estatística significativa (p < 0,05) nas comparações entre os
grupos da CHX gel a 2% e solução salina, NaOCl a
1% gel, CCPG e K-Y gel. Também houve diferença
estatística significativa (p < 0,05) entre a água destilada e os grupos do K-Y gel e NaOCl gel a 1%. Na
comparação entre o grupo solução salina e os grupos
água destilada e CHX gel a 2%, houve diferença estatística significativa (p < 0,05) no período de 72 horas.
No período de 168 horas, houve diferenças estatísticas significativas (p < 0,05) entre os grupos água
destilada e solução salina e CCPG (Tab. 1).
Na análise de 72 horas, houve diferença estatística significativa (p < 0,05) entre NaOCl a 1% gel e o CCPG, solução salina, K-Y gel e água destilada. Além disso, houve
diferença estatística significativa (p < 0,05) entre CHX gel a
2% e solução salina. No período de 168 horas, houve diferença estatística significativa (p < 0,05) entre água destilada
e CCPG, CHX gel a 2%, solução salina e K-Y gel (Tab. 1).
Teste de solubilidade
Os resultados encontrados mostraram aumento
da solubilidade do MTA quando manipulado com os
veículos testados, sendo que o K-Y foi o mais solúvel,
apresentando diferença estatística significativa quando
comparado aos outros grupos (p < 0,05) (Tab 2).
pH
Com relação ao pH, no período de três horas houve
diferença estatística significativa (p < 0,05) entre os grupos CCPG, solução salina e NaOCl gel a 1%, em relação
aos grupos K-Y gel e água destilada. Além disso, também houve diferença estatística significativa (p < 0,05)
nas comparações entre os grupos CHX gel a 2%, K-Y
gel e água destilada. No período de 24 horas, houve diferença estatística significativa (p < 0,05) entre o CCPG
e a solução salina e CHX gel a 2%. Também houve diferença estatística significativa (p < 0,05) entre CHX gel a
2% e o K-Y gel, NaOCl a 1% gel e água destilada.
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Escoamento e tempo de presa
Quanto ao escoamento, não houve diferença estatística significativa (p > 0,05) entre os grupos testados. Para
os tempos de presa inicial e final, os menores valores foram encontrados para o grupo da solução salina; e os valores mais elevados, para CHX gel a 2%. Não houve diferença estatística (p > 0,05) entre NaOCl a 1% gel, CCPG
e água destilada; nem entre K-Y gel e a solução salina; ou
entre água destilada e CCPG. Nas outras comparações,
houve diferença significativa (p < 0,05) (Tab. 2).
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Tabela 1. Médias e desvios-padrão do pH e do nível de íons Cálcio (Ca) (mg/L), dos diferentes materiais testados, em diferentes períodos.
3 horas
24 horas
72 horas
168 horas
pH
28,05 ± 15,77
11,15 ± 5,34
9,65 ± 3,86
14,15 ± 4,85
Ca
11,17 ± 0,76
7,92 ± 0,77
6,75 ± 0,35
7,48 ± 0,20
pH
43,35 ± 16,75
37,10 ± 12,23
14,85 ± 4,23
10,10 ± 5,56
Ca
11,43 ± 0,36
9,00 ± 1,25
7,10 ± 0,42
7,44 ± 0,49
pH
17,15 ± 10,07
10,20 ± 4,79
9,90 ± 4,33
14,65 ± 7,52
Ca
7,270 ± 1,73
7,77 ± 0,43
7,23 ± 0,26
7,06 ± 0,43
pH
63,10 ± 26,70
12,95 ± 4,49
9,55 ± 3,42
9,35 ± 2,36
Ca
11,97 ± 0,37
7,12 ± 0,36
7,25 ± 0,17
7,27 ± 0,44
pH
71,45 ± 26,43
13,35 ± 4,44
8,50 ± 2,90
8,75 ± 3,29
Ca
11,87 ± 0,89
7,98 ± 0,89
7,68 ± 0,30
7,21 ± 0,17
pH
114,5 ± 51,61
24,50 ± 10,83
18,50 ± 6,21
26,00 ± 11,83
Ca
8,10 ± 0,67
8,00 ± 0,03
7,45 ± 0,15
7,90 ± 0,23
NaOCl gel
CHX gel
K-Y gel
CCPG
Solução salina
Água destilada
Tabela 2. Médias e desvios-padrão do escoamento (mm), do tempo de presa inicial e final (minutos), solubilidade (porcentagem); mediana, valores
máximo e mínimo dos escores das características de superfície.
Escoamento
Tempo de presa inicial
Tempo de presa final
Solubilidade
Características superficiais
NaOCl gel
9,14 ± 0,84
16,78 ± 0,63
58,60 ± 2,07
0
1,0 (1,0 – 2,0)
CHX gel
9,47 ± 0,14
25,11 ± 0,07
72,62 ± 0,86
0,10 ± 0,06
0,0 (0,0 – 1,0)
K-Y gel
10,56 ± 0,82
13,11 ± 0,07
47,63 ± 0,52
0,75 ± 0,18
0,0 (0,0 – 2,0)
CCPG
8,37 ± 0,45
16,50 ± 0,70
60,62 ± 0,86
0,28 ± 0,33
2,0 (2,0 – 2,0)
Solução salina
9,22 ± 0,28
12,63 ± 0,52
45,58 ± 0,60
0
1,0 (0,0 – 1,0)
Água destilada
8,64 ± 0,87
15,25 ± 0,35
60,62 ± 0,86
0
1,0 (0,0 – 1,0)
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