Departamento de Microbiologia
Instituto de Ciências Biológicas
Universidade Federal de Minas Gerais
http://www.icb.ufmg.br/mic/diaadia
Hemaglutinação e Inibição da Hemaglutinação
Introdução
As reações de Hemaglutinação (HA) e de Inibição da Hemaglutinação (IHA) são métodos
indiretos de, respectivamente, detecção e quantificação de vírus e de anticorpos específicos
contra o vírus. Estes métodos se baseiam em um processo no qual as hemácias se agregam
(aglutinação) devido a interação com determinados vírus.
Os vírus capazes de causar a aglutinação de hemácias são chamados hemaglutinantes e o
que confere a eles essa característica é a presença da glicoproteína Hemaglutinina na
superfície da partícula viral. A hemaglutinina tem como receptor celular uma mucoproteína que
contém radicais de ácido n­acetlineuramínico (NANA), abundantes em hemácias e também em
células do trato respiratório. Esta interação é observada no ensaio de reação de
hemaglutinação pela formação de uma malha de hemácias devido à sedimentação difusa,
enquanto que as hemácias que não sofreram aglutinação se depositam no fundo do poço na
forma de um botão compacto.
Para a realização da reação de Hemaglutinação (HA) as hemácias em suspensão são
colocadas em contato com uma suspensão de vírus. Se a concentração de vírus for
suficientemente alta, haverá formação de múltiplas pontes entre eles e as hemácias, que se
depositarão de forma difusa. Como resultado temos o indicativo da presença do vírus e o título
deste vírus em unidades hemaglutinantes.
Já para a reação de Inibição da Hemaglutinação (IHA) parte­se do princípio que a infecção
causada por um vírus hemaglutinante induz a produção de anticorpos específicos capazes de
se ligar à hemaglutinina deste vírus, inibindo então a reação de hemaglutinação. Ensaios com
diferentes objetivos podem ser realizados, como por exemplo a identificação de um agente
viral a partir da reação com anticorpos conhecidos ou o diagnóstico de uma infecção a partir da
reação com agentes virais conhecidos.
Objetivos
Após a realização desta prática, o aluno estará apto a fazer a qualificar e quantificar a
capacidade de um vírus em causar hemaglutinação, além de determinar se há em um soro
anticorpos capazes de inibir tal processo.
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Reação de HA
Materiais
• Solução de vírus;
• Placas de plástico de 96 poços de fundo abaulado;
• Soro fisiológico;
• Pipetador automático e ponteira;
• Suspensão de hemácias a 1%.
Execução
• Fazer uma diluição seriada na razao de dois da solução de vírus em solução, conforme a
Figura 1, desprezando 0,1 mL da última. A câmara controle não deve receber a solução
contendo o vírus.
a
solução salina
solução de vírus
solução de hemácias
1:2
1:4
1:8
1:16
c
1:32
1:64
Controle
1:32
1:64
Controle
solução salina
solução de vírus
solução de hemácias
b
1:2
1:4
1:8
1:16
Figura 1: Diluição seriada do vírus. Em (a) e (b) o esquema da diluição seriada. Em (c) uma foto do
procedimento. Inicialmente preencha todos os poços a serem utilizados com 100µL de solução salina (a). Depois
coloque 100µL da solução de vírus no primeiro poço, homogeneíze e então transfira para o poço seguinte.
Repita o procedimento até o último poço e depois de homogeneizar, descarte 100µL (b). O procedimento deve
ser realizado em placa de fundo redondo (c).
• Agitar suavemente o frasco que contém a suspensão de hemácias a 1% e colocar 0,1 mL em
todas as câmaras, a partir da câmara Controle (C).
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a
b
solução salina
solução de vírus
solução de hemácias
1:2
1:8
1:4
1:16
1:32
1:64
Controle
Figura 2: da solução de hemácia. Em (a) a representação e em (b) uma foto do procedimento. Coloque 100µL
da solução de hemácias em cada poço (a).
• Agitar suavemente a placa para propiciar o contacto das partículas víricas com as hemácias;
• Incubar as placas a 40°C por 30­60 minutos para que as hemácias se depositem;
a
b
Figura 3 :Padrão de depósito das hemácias. Em (a) a
deposição em botão, quando não ocorre a hemaglutinação.
Em (b) o lençol, formado devido a ocorrência da
hemaglutinação.
Leitura e Interpretação
A formação de lençol ou membrana indica uma interação das células por pontes estabelecidas
pelas partículas de vírus e a reação de hemaglutinação é positiva. A formação de um anel ou
botão indica reação negativa. O título hemaglutinante do vírus é expresso pela maior diluição em
que houve a aglutinação de maneira nítida e evidente.
Resultados
• Anote o padrão de depósito e o título hemaglutinante do vírus
Tabela 1: Título hemaglutinante do vírus.
Diluições
Padrão de
depósito
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/128
Controle
Título
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a
b
Figura 4: Resultado da reação de hemaglutinação.
Em (a) a foto e em (b) a representação
esquemática. Reação positiva (formação de lençol)
nos seis primeiros poços, que correspondem às
diluições 1:2 , 1:4 , 1:8 , 1:16, 1:32 e 1:64. O
último poço é o controle e apresenta reação
negativa (formação de botão). O título
hemaglutinante do vírus, neste teste, não pode ser
determinado. Para que se possa encontrar o título
devemos fazer outras diluições além da 1:64.
Inibição da Reação de HA
Materiais
• Soro pareado;
• Vírus parainfluenza 1 (diluição contendo 4 UHA);
• Solução salina;
• Hemácias a 1%;
• Pipetador, ponteiras e placas de plástico de 10 câmaras.
Execução
• Fazer uma diluição seriada na razão de dois do soro coletado durante a fase aguda em
solução salina, conforme a Figura 5, desprezando 0,1 mL da última. Preencher mais dois
poços com 0,1mL de solução salina pra serem usados como controle de vírus e de hemácia.
a
soro
solução salina
solução de vírus
solução de hemácias
1:2
1:4
1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
Controle Controle
Vírus Hemácia
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4
b
soro
solução salina
solução de vírus
solução de hemácias
1:2
1:4
1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
Controle Controle
Vírus Hemácia
Figura 5: Diluição seriada do soro. Coloque 100µL de solução salina nos
poços a serem utilizados (a). Coloque 100µL de soro no primeiro poço,
homogeneíze e transfira 100µL para o próximo poço. Repita o processo até o
poço 1:256, quando então deve­se desprezar 100uL. Aos dois poços
reservados para o controle coloque apenas solução salina (b).
• Repetir o processo com o soro coletado na fase convalescente;
• Adicionar a solução de vírus às diluições dos soros e a um dos poços contendo apenas a
solução salina, que será o controle de vírus (Figura 6). Incubar a temperatura ambiente por 10
minutos.
soro
solução salina
solução de vírus
solução de hemácias
1:2
1:4
1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
Controle Controle
Vírus Hemácia
Figura 6: Adição da solução de vírus. Coloque 100µL da solução de vírus em
cada poço contendo a diluição do soro e no poço do controle de vírus (CV).
• Adicionar solução de hemácias aos poços contendo o soro, ao CV e ao poço contendo
apenas solução salina, que será o controle de hemácias (Figura 7).
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soro
solução salina
solução de vírus
solução de hemácias
1:2
1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
Controle Controle
Vírus Hemácia
Figura 7: Adição de hemácias. Coloque 100µL da solução de hemácia em todos
os poços, incluindo o controle de vírus e o controle de hemácias.
• Agitar suavemente e manter a temperatura ambiente até haver a sedimentação/depósito das
hemácias (30 min. a 60 min.). Fazer a leitura.
Leitura e Interpretação
Observar o padrão de depósito das hemácias no fundo das câmaras. No poço do controle
de hemácias deve ser observada a formação do botão de hemácias, devido à sedimentação
das células. Já no poço do controle de vírus deve ser observada a formação do lençol, devido
à sedimentação difusa das células, característico da reação de hemaglutinação. A observação
dessas características nos respectivos controles é um indicativo de que o teste está
funcionando conforme o esperado e que os resultados são confiáveis.
Resultados
Anote o padrão de depósito e o título dos soros da fase aguda e da fase convalescente.
Tabela 2: Titulação do soro da fase aguda.
Diluições
Padrão de
depósito
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/128
Controle
Título
Tabela 3: Titulação do soro da fase convalescente.
Diluições
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/128 Controle de Controle de
vírus
hemácia
Padrão de
depósito
Título
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Na fase aguda (Figura8.a e b), apenas os dois primeiros poços, correspondentes às diluições
1:2 e 1:4, apresentaram a deposição de padrão botão resultante da inibição da
hemaglutinação. Nos demais poços não houve a inibição da hemaglutinação, observado pela
formação do lençol de hemácias. O título do anticorpo na fase aguda então foi de 4 unidades
hemaglutinantes. Na fase convalescente (Figura8.c e d), os poços com as diluições de 1:2 a
1:64 apresentaram padrão de depósito da forma de botão, representando a inibição da
hemaglutinação. Nos poços das diluições 1:128 e 1:256 o padrão de depósito foi o lençol,
formado em decorrência da hemaglutinação. O título do anticorpo esta representado então
pela última diluição na qual foi possível observar a inibição da hemaglutinação, 1:64.
a
b
c
d
Figura 8: Resultado da reação de inibição da hemaglutinação do soro da
fase aguda (a e b) e da fase convalescente (c e d). Em a e c a foto e em b
e d a representação esquemática do resultado
.
Referências Bibliográficas
MADIGAN, Michael T.; MARTNKO, John M.; PARKER, Jack. Microbiologia de Brock. 12 ed.
Editora: Artmed. São Paulo 2010.
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L.; Microbiologia. 8a ed.,
Porto Alegre. Ed. Artmed, 2005.
MURRAY, Patrick R; ROSENTHAL, Ken S; PFALLER, Michael A. Microbiologia médica.
Rio de Janeiro Elsevier, 2010.
ERICHSEN, Elza Santiago; VIANA, Luciana de Gouvêa; FARIA, Rosa Malena Delbone de;
SANTOS, Silvana Maria Elói. Medicina laboratorial para o clínico.
Belo Horizonte.COOPMED, 2009.
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