UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA
Amanda Fanelli de Souza
Estudo, Identificação e Evolução de Genes Transferases nos Vegetais
Lorena
2015
Amanda Fanelli de Souza
Estudo, Identificação e Evolução de Genes Transferases nos Vegetais
Monografia apresentada à Escola de
Engenharia de Lorena da Universidade de São
Paulo como requisito parcial para obtenção do
titulo de Engenheira Bioquímica.
Orientador: Elisson Antonio da Costa Romanel
Lorena
2015
NÃO
AUTORIZO
A REPRODUÇÃO
E DIVULGAÇÃO
TOTAL OU
PARCIAL
DESTE
POR
AUTORIZO
A REPRODUÇÃO
E DIVULGAÇÃO
TOTAL OU PARCIAL
DESTE
TRABALHO,
PORTRABALHO,
QUALQUER MEIO
CONVENCIONAL
ELETRÔNICO, PARA
FINS
DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE
QUALQUER
MEIOOU
CONVENCIONAL
OU
ELETRÔNICO.
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Automatizado
da Escola de Engenharia de Lorena,
com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)
Souza, Amanda Fanelli de
Estudo, identificação e evolução de genes
transferases nos vegetais / Amanda Fanelli de
Souza; orientador Elisson Antonio da Costa Romanel.
Lorena, 2015.
47 p.
Monografia apresentada como requisito parcial
para a conclusão de Graduação do Curso de Engenharia
Bioquímica - Escola de Engenharia de Lorena da
Universidade de São Paulo. 2015
Orientador: Elisson Antonio da Costa Romanel
1. Transferases. 2. Filogenia. 3. Bioinformática.
I. Título. II. Romanel, Elisson Antonio da Costa,
orient.
À meus pais, por terem me ensinado o valor
da educação
AGRADECIMENTOS
À Deus, por todas as bênçãos e oportunidades que colocou em minha vida.
À minha mãe Cleonice, por todo seu esforço para que eu pudesse estudar,
sem o qual eu jamais teria chegado até aqui. Por ter me ajudado, com toda
paciência e carinho, a superar as dificuldades e me incentivar sempre, fazendo
parte de cada conquista minha.
Ao meu pai Vladimir (em memória), por ter se preocupado com a minha
educação e pelos valores que me ensinou, que permanecerão comigo para
sempre. Sua dedicação e seu exemplo também foram e sempre serão
fundamentais para as minhas conquistas.
Ao meu irmão Gabriel, por estar sempre comigo, me ajudar sempre, tirar
minhas dúvidas, e por ter contribuído muito para minha formação.
Ao meu professor orientador, prof. Dr. Elisson Romanel, por todas as
coisas que me ensinou e por ter me mostrado novas oportunidades na incrível
área de genética e biologia molecular de plantas. Pela dedicação à este trabalho
e ajuda de sempre.
“Se você sabe que está na direção
certa, se você tem esse conhecimento
interno, então ninguém pode te impedir, não
importa o que digam.”
Bárbara McClintock
RESUMO
SOUZA, A.F. Estudo, identificação e evolução de genes transferases nos
vegetais. 2015. 47f. Monografia (Graduação) – Escola de Engenharia de Lorena,
Universidade de São Paulo, Lorena, 2015.
A conversão da biomassa vegetal em etanol é uma importante alternativa
para a substituição dos combustíveis fósseis e redução na emissão de gases do
efeito estufa. O etanol produzido a partir de materiais lignocelulósicos (etanol de
segunda geração), como o bagaço e a palha de cana-de-açúcar, traz o ganho de
produtividade. No entanto, devido à recalcitrância da biomassa, esse processo é
difícil e custoso. Nesse contexto, a alteração da estrutura da parede celular das
plantas de maneira a tornar a biomassa mais susceptível ao pré-tratamento e
conversão aumenta os rendimentos de sacarificação, tornando o processo mais
eficiente. Nesse trabalho foram destacados três genes transferases que podem
ser usados para alterar as estruturas de hemicelulose (OsAt10) e lignina (PMT e
FMT).
O
gene
OsAt10 está
relacionado
com
o
conteúdo
de ácidos
hidroxicinâmicos da hemicelulose de gramíneas. O PMT é responsável pela
transferência de um grupo p-cumarato a um monolignol, enquanto o FMT é
responsável pela transferência de um grupo ferulato a um monolignol. Em vista
dos avanços na pesquisa científica e biotecnológica de FMT, este gene foi
selecionado para estudo, identificação de genes homólogos, origem e evolução
nas espécies vegetais. Como resultado, na literatura foram encontradas espécies
com evidências de atividade FMT as quais foram classificadas dentro da
sistemática vegetal. A partir destes dados, realizou-se a identificação de genes
homólogos de FMT em 41 espécies vegetais cujos genomas já foram
sequenciados e disponibilizados. Esta análise revelou a identificação de possíveis
sequências homólogas em cinco espécies vegetais, como batata, algodão, uva,
álamo e cacau. A identificação do FMT em outras espécies vegetais permite
investigar a homologia funcional desta enzima, abrindo perspectivas para
aplicações biotecnológicas.
Palavras-chave: Transferases; Filogenia; Bioinformática.
ABSTRACT
SOUZA, A.F. Study, identification and evolution of transferases genes in
vegetables. 2015. 47f. Monografia (Graduação) – Escola de Engenharia de
Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, 2015.
The biomass conversion into ethanol is an important alternative to replace
fossil fuels and reduce greenhouse gases emissions. The ethanol produced from
lignocellulosic materials (second generation ethanol), like sugarcane bagasse and
straw, can improve productivity. But, because of biomass recalcitrance, this
process is hard and expensive. In this sense, altering plants cell wall to make
biomass more likely to pretreatments can improve sacharification, making the
process more effective. In this work, genes that can be used for altering
hemicellulose (OsAt10) and lignin (PMT and FMT) structures were highlighted.
The OsAt10 gene is related with the hydroxycinnamic acid content of grasses
hemicelluloses. The PMT is responsible for transferring a p-coumaroyl group to a
monolignol, while FMT is responsible for transferring a feruloyl group to a
monolignol. Because of the advances in scientific and biotechnological research of
FMT, this gene was selected to study, identification of homologs genes, origin and
evolution in vegetables. As a result, in literature, species with FMT activity
evidences, which were classified into the vegetable systematics, were found. With
that data, FMT’s homologs genes were identified in 41 species whose genomes
were already sequenced and available. It was found homolog sequences in five
vegetable species, like potato, grape, cocoa, cotton and poplar. The FMT
identification in other vegetable species allows investigation of the functional
homology of that enzyme, opening perspectives of biotechnological applications.
Key-words: Transferases; Phylogeny; Bioinformatics
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1 – Estrutura da lignocelulose ..............................................................14
Figura 2.2 – Visão global do processo de produção do etanol de segunda
geração ..........................................................................................15
Figura 2.3 – Efeitos do pré-tratamento na biomassa lignocelulósica ..................16
Figura 2.4 – Estrutura do ácido ferúlico esterificado a unidades de
arabinofuranose em glucuronoarabinoxilanas...............................18
Figura 2.5 – Reação de acilação via PMT ..........................................................21
Figura 2.6 – Reação de acilação via FMT ..........................................................26
Figura 2.6 – Rendimento de sacarificação de linhagens de Populus
transgênicas submetidas ao pré-tratamento alcalino,
comparadas com a planta do tipo selvagem ..................................23
Figura 4.1 - Filogenia das angiospermas eudicotiledôneas, de acordo com
a classificação APG III (2009).........................................................35
Figura 4.2 – Árvore filogenética de sequências homólogas de AsFMT ..............40
LISTA DE TABELAS
Tabela 4.1 – Taxonomia das espécies com evidências de atividade FMT .........32
Tabela 4.2 – Taxonomia das espécies do clado Asterids cujos genomas
foram sequenciados .......................................................................33
Tabela 4.3 – Taxonomia das espécies do clado Rosids cujos genomas foram
sequenciados .................................................................................34
Tabela 4.4 – Pontuações obtidas no Phytozome 9.1 para o gene FMT
utilizando a ferramenta BLASTP em todas as espécies
disponíveis .....................................................................................37
SUMÁRIO
1
Introdução ................................................................................................ 10
2
Revisão Bibliográfica .............................................................................. 13
2.1
A cana de açúcar como matéria prima para produção de etanol........ 13
2.2
Estrutura da lignocelulose...................................................................... 13
2.3
Processo de produção do etanol de segunda geração........................ 15
2.3.1 Pré-Tratamento ........................................................................................ 16
2.4
Alteração da estrutura da parede celular para melhorar o
processamento da biomassa ................................................................. 17
2.5
Alterações na hemicelulose de gramíneas ........................................... 17
2.5.1 Gene transferase OsAt10 ........................................................................ 19
2.6
Alterações na lignina .............................................................................. 19
2.6.1 Gene transferase PMT ............................................................................. 20
2.6.2 Gene transferase FMT ............................................................................. 21
2.7
Revisão dos métodos de bioinformática ............................................... 23
2.8
Busca por possíveis sequências homólogas ....................................... 24
2.8.1 BLAST....................................................................................................... 24
2.8.2 BLAST no banco de dados do Phytozome............................................ 26
2.9
Reconstrução de filogenias .................................................................... 26
2.9.1 Programa de alinhamento: MUSCLE ..................................................... 27
2.9.2 Reconstrução de filogenias: MEGA 6 .................................................... 27
3
Materiais e Métodos ................................................................................ 30
4
Resultados e Discussão ......................................................................... 31
4.1
Análise das espécies quanto à presença de genes FMT ..................... 31
4.1.1 Espécies com evidências de atividade FMT ......................................... 31
4.1.2 Levantamento das espécies vegetais com genoma disponível
com possível atividade FMT ................................................................... 32
4.2
Identificação dos genes homólogos e análise filogenética ................. 36
5
Conclusões .............................................................................................. 42
REFERÊNCIAS………………………………………………………………………....44
10
1
Introdução
Nas últimas décadas, muitos esforços foram realizados na tentativa de
substituir os combustíveis fósseis por fontes renováveis de energia. Neste
contexto, a biomassa surge como uma alternativa viável, com o potencial de ser
uma fonte sustentável capaz de suprir a crescente demanda por energia.
Os
combustíveis
sólidos,
líquidos
ou
gasosos
produzidos
predominantemente a partir de biomassa são chamados biocombustíveis
(DEMIRBAS, 2009). Seus principais atrativos são a possibilidade de substituição
do petróleo e redução na emissão de gases de efeito estufa. Isso porque as
plantas absorvem CO2 durante o seu crescimento através da fotossíntese, e este
carbono retorna para a atmosfera quando a biomassa é queimada ou degradada.
Dessa forma, é possível atingir um balanço neutro de carbono.
Os chamados biocombustíveis de primeira geração são produzidos
principalmente a partir de cultivares alimentícios, como cereais, cana-de-açúcar e
oleaginosas (SIMS et.al, 2010). De fato, benefícios relacionados à redução da
emissão de CO2 e à diminuição da dependência do petróleo foram relatados.
Estudos de avaliação de ciclo de vida (LCA, life cicle assessment) demonstraram
uma redução nas emissões de CO2 globais e no consumo de energia fóssil devido
ao uso de biocombustíveis como o bioetanol e biodiesel, utilizados para substituir
o diesel e a gasolina, respectivamente (RODRIGUES, 2011).
No entanto, existem algumas críticas. Os custos ainda são relativamente
altos, necessitando muitas vezes de incentivos governamentais, bem como
industriais. Além disso, cerca de 1% da terra arável hoje é utilizada para a
produção de biocombustíveis, fornecendo 1% dos combustíveis para transporte
no mundo. Essa produção concentra-se nos Estados Unidos (42,1% da produção
mundial de biocombustíveis) e no Brasil (24,2 % da produção mundial) (BP,
2014). É preciso ampliar essa produção, porém aumentar a quantidade de terras
aráveis não é uma opção ecologicamente viável (POTTERS, G.; VAN GOETHEM,
D; SCHUTTE F., 2010).
Existe também uma preocupação quanto ao uso de matérias-primas
alimentícias. Isso pode gerar uma competição, entre a produção de alimentos e
11
de combustível, pelo uso da terra e água. Muitas autoridades, pelo menos em
parte, concordam que alguns biocombustíveis de primeira geração contribuíram
para o aumento do preço das commodities para alimentação e ração animal.
(SIMS et.al, 2010).
Com o objetivo de superar os problemas ambientais e econômicos dos
biocombustíveis de primeira geração, foi desenvolvido um novo tipo de
biocombustível, chamado de segunda geração. A matéria-prima neste caso é a
biomassa lignocelulósica, que é abundante, barata e não compete com a
produção de alimentos. Dentre esses materiais, destacam-se co-produtos como
palha e bagaço de cana-de-açúcar, ou ainda resíduos (florestais, industriais ou
agrícolas).
Muitos
estudos publicados demonstram
vantagens
sobre os
biocombustíveis de primeira geração, em termos de eficiência do uso da terra e
desempenho ambiental (RODRIGUES, 2011).
O Brasil possui um enorme potencial para a produção do etanol de
segunda geração, a partir da palha e bagaço de cana-de-açúcar. Por já se tratar
do maior produtor mundial do etanol derivado de cana-de-açúcar, a integração
dos processos de hidrólise seria de fácil adaptação (FUGITA, 2010). O
aproveitamento da palha tornaria a produção bem mais eficiente. Estima-se que 1
tonelada de palha equivale a cerca de 1,2 a 2,8 EBP (equivalentes em barril de
petróleo), significando uma fonte de energia desperdiçada (SANTOS et.al, 2012).
No entanto, a conversão da biomassa lignocelulósica em etanol é um
desafio, sobretudo porque a lignocelulose é composta por celulose, hemicelulose
e lignina, que formam uma estrutura complexa e recalcitrante (MOOD, 2013). A
lignina obstrui o acesso aos polissacarídeos, que são fontes de açúcares para a
fermentação.
Para superar essa recalcitrância, é preciso realizar o pré-tratamento da
biomassa lignocelulósica. Os principais objetivos são remover a barreira da
lignina, diminuir a cristalinidade da celulose e separar a hemicelulose (RAMIREZ,
2014). Assim, a celulose se torna mais acessível para as enzimas hidrolíticas, que
a convertem em glicose. Essa etapa é uma das mais caras de todo o processo,
chegando a contribuir com $ 0.09 por litro de etanol (RAMIREZ, 2014).
Muitas pesquisas têm focado no desenvolvimento de tecnologias que
facilitem e tornem mais barato o processamento da biomassa. Uma das
alternativas mais promissoras é a alteração da estrutura e composição da parede
12
celular via engenharia genética de plantas (RALPH et.al, 2013, BARTLEY et.al,
2013).
Uma abordagem nas gramíneas é alterar a estrutura da principal
hemicelulose, a glucuronoarabinoxilana. Essa hemicelulose em gramíneas é
esterificada com ácidos ferúlico e p-cumarílico. Estudos em arroz (Oryza sativa)
identificaram
genes
responsáveis
por
alterar
a
composição
da
glucuronoarabinoxilana, dentre eles destaca-se o OsAt10, aumentando o
rendimento de sacarificação de 20-40% (BARTLEY et.al, 2013).
Outra abordagem é alterar a estrutura da lignina, inserindo ligações
quimicamente mais lábeis, tornando mais fácil quebrá-la. Estudos buscaram
identificar os genes necessários para essas alterações (RALPH et.al, 2013).
Sabe-se que alguns genes transferases já participam da lignificação em algumas
plantas. O gene PMT, por exemplo, transfere um grupo cumarato a monolignois
em gramíneas (Ralph et.al, 2013). Outros genes podem produzir conjugados que
podem ser endereçados para a lignificação (RALPH et.al, 2013). Tais novos
genes transferases, como o FMT, que transfere um grupo ferulato a um
monolignol, têm o potencial de promover a inserção de ésteres na estrutura da
lignina (monolignois ésteres conjugados).
Então, levando-se em conta todos os benefícios dos biocombustíveis de
segunda geração, com destaque para o bioetanol brasileiro, o objetivo deste
trabalho foi fazer uma revisão na literatura sobre os genes OsAt10, PMT e FMT,
os quais promovem diferentes alterações na biomassa lignocelulósica. Devido à
relevância do avanço científico e biotecnológico para o gene FMT, a proposta
deste trabalho foi fazer uma busca por espécies vegetais com essa atividade,
classificá-las dentro da sistemática vegetal, identificar possíveis genes homólogos
nas diversas espécies vegetais que apresentam o genoma disponível e
compreender a origem e diversificação destes genes nos vegetais.
13
2
Revisão Bibliográfica
2.1
A cana-de-açúcar como matéria-prima para o bioetanol
A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma gramínea tropical e
semiperene, que se desenvolve bem em solos onde há boa aeração e drenagem
(CONAB, 2014).
O Brasil, além de maior produtor de cana-de-açúcar, é líder na produção de
etanol e açúcar derivados dessa cultura. Na safra 2014/2015 estima-se que a
produção total de cana-de-açúcar seja de 642,1 milhões de toneladas (CONAB,
2014). Como o processamento da cana-de-açúcar produz cerca de 14% de palha
e 12,5% de bagaço (em massa seca) (SZCZERBOWSKI, 2014), nesse período
foram gerados 89,9 e 80,3 milhões de toneladas de palha e bagaço,
respectivamente. Esses co-produtos são materiais lignocelulósicos e possuem
grande potencial para a produção de etanol.
O aproveitamento integral da cana-de-açúcar (colmo, palha e bagaço) traz
um impacto enorme na produção de etanol, uma vez que possibilita o aumento na
produtividade sem a necessidade de ampliar a área cultivada (SANTOS, 2012).
Dessa forma, a produção de etanol de segunda geração a partir de bagaço
e palha de cana-de-açúcar tem atraído à atenção da agroindústria brasileira.
2.2
Estrutura da lignocelulose
Os principais componentes da biomassa lignocelulósica são a celulose, a
hemicelulose e a lignina, estando presentes extrativos e cinzas em pequenas
quantidades (BALAT, 2010).
A celulose é o principal componente da biomassa (cerca de 30-60% em
massa seca). Trata-se de um polímero linear de glicose, com alto grau de
polimerização (BALAT, 2010) e de cristalinidade. As cadeias de celulose se
organizam em feixes, formando estruturas chamadas fibrilas. As fibras de celulose
14
interagem entre si por uma série de ligações de hidrogênio intra- e intermoleculares (MOOD et.al, 2013).
A hemicelulose contribui com cerca de 20-40% em massa seca do material
lignocelulósico (BALAT, 2010). Consiste em um polímero ramificado heterogêneo,
contendo pentoses (xilose, arabinose), hexoses (manose, glicose, galactose) e
ácidos urônicos (ácidos glucurônicos, metilgalacturônicos, galacturônicos) (MOOD
et.al, 2013). É de natureza amorfa e possui baixo grau de polimerização (BALAT,
2010).
A lignina é um polímero hidrofóbico, constituído principalmente de unidades
fenilpropano chamadas monolignois, que são: guaiacil (G), siringil (S) e hidróxifenol (H). Esses monômeros ou outros menos frequentes formam uma matriz
extremamente complexa. A lignina é responsável por fixar as hemiceluloses e a
celulose umas nas outras, garantindo a rigidez da estrutura (HENRIKSSON,
2009). A figura 2.1 mostra a estrutura recalcitrante da lignocelulose.
Figura 2.1 – Estrutura da lignocelulose
Fonte: RAMIREZ, 2014.
15
2.3
Processo de produção de etanol de segunda geração
De uma forma geral, o etanol pode ser produzido a partir dos
polissacarídeos (celulose e hemicelulose) após hidrólise e fermentação
(SZCZERBOWSKI,
2014).
No
entanto,
as
pentoses,
provenientes
da
hemicelulose, requerem microrganismos específicos para a fermentação (BALAT,
2010).
Dessa forma, o processo produtivo do etanol a partir da biomassa
lignocelulósica envolve várias etapas (figura 2.2), sendo as principais: colheita da
biomassa, pré-tratamento, hidrólise, conversão dos açúcares em etanol por meio
da fermentação e recuperação do produto (RAMIREZ, 2014).
Figura 2.2 – Visão global do processo de produção do etanol de segunda
geração
Fonte: Sticklen, 2008
16
2.3.1 Pré-tratamento
O pré-tratamento é necessário para superar a recalcitrância da biomassa,
tornando os carboidratos disponíveis para a hidrólise e fermentação.
Os principais objetivos do pré-tratamento são remover a lignina, separar a
hemicelulose, diminuir a cristalinidade da celulose e aumentar a área superficial
acessível da biomassa (BEHERA et.al, 2014).
Figura 2.3 Efeitos do pré-tratamento na biomassa lignocelulósica
Fonte: Mood, 2013
O pré-tratamento ideal deve aumentar o rendimento de açúcares depois da
hidrólise, prevenir a degradação de carboidratos, evitar a formação de compostos
tóxicos ou inibitórios da fermentação e minimizar o gasto de energia e de
químicos (SINGH, SUHAG, DHAKA, 2015).
Existem vários tipos de pré-tratamento, como por exemplo: físico (trituração
e moagem), físico-químico (explosão a vapor), químico (alcalino, solventes
orgânicos), ou ainda biológico. No entanto, todos esses métodos são custosos, o
que dificulta a aplicação em grande escala (BALAT, 2010).
17
2.4
Alteração
da
estrutura
da
parede
celular
para
melhorar
o
processamento da biomassa
Diversas pesquisas buscam desenvolver formas de tornar a biomassa
menos recalcitrante, mais susceptível a diferentes tipos de pré-tratamento e
posterior hidrólise, de forma a aumentar o rendimento de sacarificação (açúcares
para a fermentação).
Uma das alternativas mais promissoras é a alteração da estrutura e
composição da parede celular, via engenharia genética de plantas. Uma
possibilidade para as gramíneas, como a cana-de-açúcar, é alterar a composição
da principal hemicelulose, a glucuronoarabinoxilana (BARTLEY et.al, 2013). Outra
possibilidade é alterar a estrutura da lignina, tornando-a mais lábil, e, portanto,
mais facilmente removível (RALPH et.al, 2013).
2.5
Alterações na hemicelulose de gramíneas
A parede celular das gramíneas e outras monocotiledôneas é constituída
de 40% (em massa seca) do polissacarídeo glucuronoarabionoxilana (GAX). A
GAX de gramíneas é um polímero de xilanas, substituídas na posição O3 por
arabinofuranose e pouco frequentemente por ácido glucurônico (BARTLEY et.al,
2013). O ácido p-cumárico, além de ser esterificado com lignina, também se
associa com GAX de gramíneas (BARTLEY et.al, 2013).
Além disso, em parte dos resíduos de arabinofuranose, ocorre substituição
na posição O5 pelo ácido ferúlico (Figura 2.4). Existem também ligações éter
entre os ferulatos e monolignois, formando complexos ferulato-polissacarídeolignina (BUNAFINA, 2009). Também são formados dímeros de ferulato
(diferulatos), de maneira a unir por ligações cruzadas as cadeias de xilanas
(BARTLEY et.al, 2013; ISHII; SHIMIZU, 2000). Essas ligações cruzadas nas
cadeias laterais interferem nas propriedades físicas da parede celular, e
consequentemente, na sua resistência à digestão enzimática (ISHII; SHIMIZU,
2000).
18
Figura 2.4 – Estrutura do ácido ferúlico esterificado a unidades de
arabinofuranose em glucuronoarabinoxilanas
Fonte: Adaptado de Oliveira et.al, 2014. A) Ácido ferúlico esterificado à arabinofuranose de
GAX. B) Ácido diferúlico unindo por ligações cruzadas duas FA-GAX. C) Àcido ferúlico
ligando a lignina à GAX.
O ácido ferúlico, especialmente os diferulatos, fortificam a parede celular.
Sabe-se que os ésteres ferúlicos dificultam a digestão da biomassa, de forma que
a quantidade de ácido ferúlico é inversamente relacionada com os parâmetros de
liberação de açúcar em processos enzimáticos in vitro (BARTLEY et.al, 2013).
As proteínas que incorporam os ácidos ferúlico e p-cumarílico na parede
celular de gramíneas ainda estão sendo caracterizadas. Mitchell et.al (2007)
propuseram que uma subclasse de proteínas, mais abundantes em gramíneas do
que em eudicotiledôneas, seriam responsáveis pela incorporação de ácido
ferúlico. Essas enzimas pertencem ao domínio PFAM PF02458.
Em plantas,
foram denominadas BAHD-aciltransferases.(BARTLEY et.al, 2013). Bartley e
colaboradores (2013) demonstraram que essa subclasse de Mitchell está
presente em gramíneas e sofreu expansão gênica com relação às espécies
eudicotiledôneas e não-espermatófitas.
19
2.5.1 Gene transferase OsAt10
Bartley e colaboradores (2013) identificaram 20 genes aciltransferases em
arroz (Oryza sativa), que foram denominados de OsAt1 a OsAt20. Eles estudaram
17 linhagens transgênicas de arroz (activation tagged lines). Oligonucleotídeos
específicos de PCR, (reação em cadeia da DNA polimerase) com alvo em 12 dos
20 genes transferases, foram usados para identificar a ausência ou presença do
T-DNA. Das 17 linhagens estudadas, apenas quatro tiveram alteração fenotípica
no conteúdo de ácidos ferúlico e p-cumarílico na parede celular. Em uma delas,
identificou-se que a super-expressão do gene OsAt10 aumenta as ligações éster
da matriz do polissacarídeo com ácido p-cumarílico (em aproximadamente 300%)
e diminui as com ácido ferúlico (em aproximadamente 60%) nas folhas e nas
bainhas.
A super-expressão de OsAt10 provocou um aumento na sacarificação in
vitro, sem efeitos no desenvolvimento vegetativo da planta. Após pré-tratamento
em condições brandas, seguido de hidrólise com coquetel de celulases, essa
linhagem transgênica teve rendimento de açúcares redutores 20% maior que a
planta tipo selvagem. É importante notar que, nenhuma alteração significativa
ocorreu na estrutura da lignina nos mutantes analisados (BARTLEY et.al, 2013).
Em suma, o gene OsAt10 é um alvo biotecnológico, uma vez que pode
melhorar e tornar mais economicamente viável a produção de etanol de segunda
geração.
2.6
Alterações na lignina
Nas últimas décadas, comprovou-se que outros monômeros, além dos
tradicionais três monolignois (G, S, H), podem ser incorporados na lignina,
naturalmente ou em plantas mutantes ou transgênicas. Em Kenaf (Hibiscus
canabinnus), a lignina das fibras da entrecasca é cerca de 50% gama-acetilada.
Em gramíneas, mais de 10% das unidades da lignina é substituída por p-
20
cumaratos (RALPH et.al, 2004). Além disso, ferulatos em glucuronoarabinoxilanas
de gramíneas são incorporados na lignina, podendo ser considerados monômeros
(RALPH et.al, 2013). Ademais, quando a capacidade da planta de sintetizar
monolignois é comprometida, ela exporta uma série de outros monômeros para a
parede celular (RALPH et.al, 2013).
Dessa forma, a introdução de “novos” monômeros na lignina é uma
estratégia viável para alterar sua estrutura visando à eficiência no processamento
da biomassa (RALPH et.al, 2013). Dentre as várias possibilidades, uma das mais
vantajosas é a lignificação com monômeros que insiram ligações mais lábeis na
lignina, como ésteres.
Alguns genes transferases necessários para essas alterações já foram
identificado (PMT e FMT), enquanto alguns ainda estão sendo estudados (AMT e
BMT) (RALPH et.al, 2013). Neste trabalho, foram descritos dois genes que
inserem monolignois ésteres conjugados na lignina: PMT e FMT.
2.6.1 Genes transferase PMT
Em todas as gramíneas, a lignina é acilada por p-cumaratos. Tal acilação
ocorre via lignificação com monolignol p-cumarato éster conjugados (RALPH et.al,
2013).
O gene PMT codifica a enzima monolignol p-cumaril Coa transferase. A
atividade da enzima PMT foi demonstrada em extratos proteicos de milho, e
recentemente um possível candidato à gene PMT foi identificado no genoma de
arroz (RALPH et.al, 2013). O gene OsAt4 foi recentemente nomeado como PMT (
WITHERS et.al, 2012).
A atividade dessa enzima só foi identificada via expressão em E.coli.
Estudos na planta modelo Brachypodium têm demonstrado o papel do gene e da
proteína na planta (RALPH et.al, 2013).
A lignificação com monolignois p-cumarato conjugados não introduz
ligações ésteres na lignina. Por causa de sua preferência por transferência de
radical em vez de acoplamento, o p-cumarato não participa das reações de
polimerização em cadeias crescentes de lignina, e permanece quase sempre
21
como uma extremidade fenólica livre (WILKERSON et.al, 2014). No entanto, o
gene PMT pode ser um alvo pelo fato de que o p-cumarato liberado das
gramíneas durante o pré-tratamento inibe a fermentação. Além disso, ele tem
uma função similar à de outro gene muito importante, o FMT (RALPH et.al, 2013).
Figura 2.5 – Reação de acilação via PMT
Fonte: Adaptado de Ralph et.al, 2013.
2.6.2 Genes transferase FMT
Uma das formas de introduzir ligações ésteres na lignina é por meio da
introdução de monolignois ferulatos conjugados.
A ideia é que monolignois ferulatos sejam produzidos e endereçados para
a parede celular. Sabe-se que esses monômeros são compatíveis com as
reações de lignificação, uma vez que existem ligações ésteres entre os ferulatos
de glucuronoarabinoxilanas de gramíneas e a lignina. Tal transformação requer
uma enzima que transfira ferulato a um monolignol (Figura 2.6). Isso não faz parte
de nenhuma via de síntese de monolignois conhecida, em nenhuma planta
(RALPH et.al, 2013).
22
Figura 2.6 – Reação de acilação FMT
Fonte: Adaptado de Ralph et.al, 2013.
Dessa forma, houve uma busca por espécies com atividade enzimática do
tipo monolignol ferulato transferase (FMT), ou seja, que catalisa a transferência de
ferulato para um monolignol. Sabe-se que Angelica sinensis produz o coniferil
ferulato como extrativo, em quantidades acima de 2% em massa seca da raiz
(RALPH et.al, 2013).
Wilkerson et.al (2014) isolaram um gene de Angelica sinensis, que
produziu em E. coli uma enzima com a desejada atividade FMT. Esse gene foi
inserido em linhagens de Populus híbridos (Populus alba × grandidentata). Como
a expressão deveria ser endereçada para os tecidos em que há formação de
lignina, foi utilizado um promotor tecido-específico de xilema CesA8, envolvido na
biossíntese da celulose na parede celular secundária. Utilizou-se também o
promotor 35S (expressão constitutiva) como controle. A fusão com o gene
repórter proteína fluorescente amarela (YFP-Yellow Fluorescence Protein)
demonstrou que, de fato, na presença do promotor CesA8, a enzima FMT só
estava sendo produzida no xilema, enquanto que na presença do promotor 35S, a
enzima FMT estava expressa em vários tecidos.
Apesar da dificuldade em detectar a inserção de monolignol ferulato na
lignina, foram feitas alterações em um método (derivatização seguida de clivagem
redutora- DFRC), que permitiram comprovar que coniferil ferulato e sinapil ferulato
foram de fato incorporados na estrutura em linhagens transgênicas.
Após tais linhagens serem submetidas ao pré-tratamento alcalino brando
(6.25 mMNaOH, 90°C, 3 horas), obtiveram-se rendimentos maiores de
sacarificação (hexoses e pentoses) (Figura 2.7) (WILKERSON et.al, 2014).
23
Figura 2.7 – Rendimento de sacarificação de linhagens de Populus
transgênicas
submetidas
ao
pré-tratamento
alcalino,
comparadas com a planta do tipo selvagem.
Fonte: Wilkerson et.al, 2014.
Na figura 2.7, nota-se que o aumento no rendimento de sacarificação é
expressivo. O rendimento de glicose chega a ser aproximadamente 10% maior do
que em plantas do tipo selvagem. Os resultados de Wilkerson e colaboradores
(2014) demonstram que a inserção de FMT extraído de Angelica na árvore
Populus torna a planta mais eficiente para a produção de etanol de segunda
geração. Dessa forma, a identificação e as pesquisas científicas sobre o gene
FMT e sua inserção e estudo biotecnológico em árvores, torna o gene FMT um
alvo biotecnológico de grande relevância. Por isso, foi escolhido para estudo
nesse trabalho.
2.7
Revisão dos métodos de bioinformática
O desenvolvimento da biologia molecular permitiu que muitas informações
fossem obtidas a partir do sequenciamento do genoma de diversas espécies.
Com isso, houve a necessidade da organização dessas sequências de DNA em
24
bancos de dados, de forma a torná-las disponíveis para a comunidade científica
internacional.
Além
disso,
esses dados
permitem
a
obtenção
de
informações
extremamente importantes, como comparação dos genes entre as espécies e
inferências evolutivas.
A análise e processamento dessa quantidade cada vez maior de
sequências e informações requer o uso de ferramentas de informática. A
bioinformática é, portanto, a aplicação da ciência da computação, matemática e
estatística para entender e organizar a informação contida em macromoléculas
como o DNA (Luscombe et.al, 2001).
Para a análise evolutiva de sequências de DNA ou de proteínas, as
ferramentas de bioinformática são fundamentais. Quando se tem um gene de
interesse, é importante investigar como ele se relaciona com os seus homólogos.
Isso é possível a partir da reconstrução da história evolutiva dessas sequências
expressa através da construção de árvores filogenéticas.
Para isso, é preciso buscar por sequências homólogas à de interesse,
alinhá-las e então reconstruir a filogenia. Existem diversos softwares disponíveis
para execução desse trabalho.
2.8
Busca por possíveis sequencias homólogas
2.8.1 BLAST
A ferramenta BLAST ou Basic Local Alignment Search Tool identifica, a
partir de uma sequência em particular (isca), a sequência mais similar possível
em um banco de dados (LESK, 2008).
O BLAST faz o chamado alinhamento local entre sequências. Isso significa
que o programa encontra regiões similares, em vez de alinhar todos os caracteres
de uma sequência com os de outra (alinhamento global). (MADDEN, 2002).
Quando a sequência isca é submetida ao BLAST, o algoritmo identifica
pequenas subsequências, ou seja, trechos contíguos de um número determinado
de aminoácidos/pares de bases (por padrão, para sequências de proteínas, esse
25
número é três). Essas subsequências são chamadas words. Em seguida, ele
inicia a procura nas sequências do banco de dados por partes similares a tais
porções. Assim que o programa encontra uma região bem pareada sem permitir a
introdução de lacunas (gaps), ele tenta expandir e distanciar as bases ou
aminoácidos de uma sequencia no alinhamento. Depois de encontrar todas as
regiões possíveis e estendê-las ao máximo, o algoritmo encontra o melhor
alinhamento para cada par de sequências isca-banco de dados. O programa
exibe, então, as sequências do banco de dados, na ordem da mais similar para a
menos similar à sequência usada como isca (MADDEN, 2002).
Essa identificação da qualidade do alinhamento se dá através da atribuição
de uma pontuação (score), que representa uma medida quantitativa da
similaridade entre as sequências (LESK, 2008).
Uma abordagem para sequências de comprimentos distintos é a definição
da distância de Levenshtein ou de edição, que é o número mínimo de operações
de edição necessário para converter uma sequência na outra. Uma operação de
edição pode ser uma inserção, deleção ou alteração de um caractere em uma
sequência (LESK, 2008).
É preciso considerar que algumas operações de edição são mais prováveis
de acontecer evolutivamente. É mais plausível a troca de um aminoácido por
outro que possua as mesmas propriedades físico-químicas (por exemplo, um
aminoácido básico por outro básico). Também é mais provável a deleção de uma
sequência contínua de bases ou aminoácidos do que a deleção do mesmo
número de bases ou aminoácidos em posições isoladas na sequência. Dessa
forma, um programa de computador pode atribuir pontos para essas operações
de edição. Para cada substituição, dependendo do par de resíduos envolvido, ele
atribui uma pontuação, que é maior para a operação mais provável. Também
atribui uma penalidade adequada para a deleção ou inserção de lacunas,
dependendo de sua extensão. Dessa forma, quanto maior a similaridade, maior a
pontuação (LESK, 2008).
Dentre os tipos de programas BLAST, o BLASTp é usado para comparar
uma sequência de aminoácidos com um banco de dados contendo um conjunto
de sequências de aminoácidos (MADDEN, 2002).
26
2.8.2 BLAST no banco de dados do Phytozome
O BLAST permite que, em um banco de dados, possa se buscar por
sequências similares de uma sequência usada como isca. Um dos bancos em
que se pode realizar a busca em genomas e proteomas de espécies vegetais é o
disponibilizado
pelo
website
Phytozome
v.10.2
(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html) (Goodstein, 2012). Trata-se de um
projeto do Joint Genome Institute, da Universidade da Califórnia. A versão 10.2,
mais recente, permite o acesso a 48 genomas sequenciados e anotados de
plantas (GOODSTEIN, 2012).
O próprio Phytozome executa a ferramenta BLAST. Basta selecionar opção
BLAST, a espécie de interesse, o tipo de alvo (genoma ou proteoma) e inserir a
sequência isca (query). O resultado é exibido em ordem decrescente de
pontuação.
2.9
Reconstrução de filogenias
Mutações ocorrem nas sequências de ácidos nucleicos dos indivíduos e
algumas delas podem se tornar substituições que passam a fazer parte de uma
população. Quanto mais relacionadas estiverem as populações, maior a chance
de existir as mesmas sequências de DNA, e tais sequencias serem similares em
sua ordem de bases nitrogenadas. Então, quando se realiza o alinhamento de
sequências de DNA (ou de proteínas), é possível identificar hierarquias de
substituições compartilhadas. Esses padrões podem ser usados para reconstruir
a história evolutiva, representada por uma filogenia (BROMHAM, 2008).
27
2.9.1 Programa de alinhamento: MUSCLE
É preciso inicialmente alinhar as diversas sequências que se deseja
relacionar por meio de uma árvore filogenética.
Um software disponível online para esse fim é o MUSCLE, que significa,
em inglês, Multiple sequence comparison by Log-Expectation. O serviço é
oferecido pelo EMBL-EBI, European Molecular Biology Laboratory – European
Bioinformatics Institute
De uma forma geral, o algoritmo do MUSCLE funciona em várias etapas. A
função para atribuição da pontuação dos alinhamentos é a chamada logexpectation. Assim, constrói-se um alinhamento múltiplo (EDGARD, 2004).
A interface com o usuário do MUSCLE é simples. Basta inserir as
sequências que serão alinhadas (input sequences), escolher o formato de saída
(Clustalw, FASTA) e enviar o trabalho. O resultado pode então ser salvo (no
formato de saída selecionado).
Por padrão, o MUSCLE rearranja as sequências no arquivo de saída, de
forma que sequências similares sejam adjacentes (EDGAR, 2004).
É possível visualizar a qualidade do alinhamento pelos símbolos. A
anotação asterisco (*) indica posições que têm resíduos conservados, 100%
idênticos. Os dois pontos (:) indicam conservação entre dois grupos com forte
similaridade (aminoácidos de mesma propriedade, que têm altas pontuações). O
símbolo ponto (.) significa que há conservação entre grupos de baixa similaridade
(menores pontuações) (LARKIN et.al, 2007).
2.9.2 Reconstrução de filogenias: MEGA 6
O software MEGA 6, Molecular evolutionary genetics analysis, foi
desenvolvido para inferir relações evolutivas a partir de sequências de DNA ou
proteínas. Atualmente, a sexta versão se encontra disponível para baixar no site
http://www.megasoftware.net/ (TAMURA et.al, 2013).
28
O MEGA 6 constrói uma árvore filogenética a partir de um arquivo
contendo o alinhamento múltiplo de sequências, que pode ser gerado usando o
MUSCLE ou outro software.
O MEGA exige a conversão desse arquivo de alinhamento para o formato
*.meg. Após a conversão, o programa pode reconstruir uma filogenia utilizando
diversos métodos (Neighbor-joining, UPGMA maximum parsimony, Bayesian
inference and Maximum Likehood) (HALL, 2013). A seguir, segue uma descrição
geral do método usado nesse trabalho, Neighbor- joining
A partir do alinhamento múltiplo, o algoritmo analisa as sequências par a
par, contendo o número de diferenças entre as sequências de cada par. Essa
informação é convertida numa medida de distância. Dessa forma, é criada uma
matriz de distâncias.
Em seguida, é feito um agrupamento progressivo das sequências, em um
método chamado agrupamento (cluster). Primeiro, as sequências cujas distâncias
entre si são menores são agrupadas. Cada grupo é considerado uma linhagem.
Então a matriz de distância é recalculada para encontrar a distância média entre
cada sequência e esse novo grupo criado. Então, a menor distância é usada para
construir um novo agrupamento, e assim por diante.
Por fim, é desenhada a árvore, indicando as sequências mais similares
entre si, podendo-se visualizar a história evolutiva (BROMHAN, 2008).
O software MEGA 6 permite a escolha de diversos parâmetros para a
construção de uma filogenia pelo método Neighbor- joining.
Um parâmetro importante é o modelo de substituição, usado no cálculo da
matriz de distâncias. Como supracitado, ao se comparar duas sequências
relacionadas filogeneticamente, uma diferença em um sítio significa que houve
uma ou mais substituições, que deram origem a uma nova sequencia.
Para aminoácidos, os modelos de substituição que o MEGA 6 disponibiliza
são: p-distance, Poisson model, equal input model, dayhoff model e Jones Taylor
Thorton model (HALL, 2013). Neste trabalho, utilizou-se o método p-distance.
Trata-se do método mais simples. Consiste apenas na proporção (p) de
nucleotídeos diferentes entre duas sequências que são comparadas. É obtido por
meio da divisão entre o número de diferenças de aminoácidos pela quantidade
total de aminoácidos. Esse método não leva em conta múltiplas substituições.
Mesmo se um aminoácido substituído várias vezes, o que se observa pelo
29
alinhamento é apenas uma diferença, que é o que se considera no cálculo (NEI;
KUMAR, 2000).
É possível ainda selecionar um método para testar a filogenia. O MEGA 6
fornece as opções interior brench step e bootstrapping method (HALL, 2013). Este
último foi usado no trabalho.
O método bootstrap é uma técnica estatística, que consiste em replicar os
dados. O programa realiza um alinhamento, e a partir deste gera um novo similar,
mas não idêntico. Se a mesma filogenia é obtida sempre, não importa quantas
vezes é realizada a réplica dos dados, então, para o método escolhido, esses
pontos realmente estão relacionados nessa árvore em particular. No MEGA 6, o
usuário pode escolher o número de bootstrapping desejado (BROMHAN, 2008).
A principal vantagem do método Neighbor-joining utilizado é a sua rapidez.
O MEGA 6, utilizando esse método, retorna uma árvore de distâncias quase que
imediatamente, enquanto que outros métodos levam horas, dias, semanas ou até
meses. Entretanto, outros métodos podem ser exigidos em alguns casos,
sobretudo quando se sabe que a taxa de mutação não é a mesma em todas as
linhagens (BROMHAN, 2008).
30
3
Materiais e Métodos
A sequência do gene FMT e sua respectiva proteína da espécie Angelica
sinensis foi retirada do GenBank (accession number JA758320.1) (WILKERSON,
2014), baixada e armazenada.
Com o objetivo de identificar possíveis espécies com atividade FMT,
utilizou-se
o
banco
de
(https://genomevolution.org/wiki/index.php/Main_Page)
dados
(LYONS;
CoGePedia
FREELING,
2014) o qual contempla informações sobre os genomas das espécies vegetais
que já foram sequenciados e disponibilizados.
Para encontrar possíveis homólogos das sequências de FMT, foram
utilizados os proteomas de todas as espécies que estão disponíveis no
Phytozome
v.9.1
(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)
(GOODSTEIN,
2012). Utilizou-se a ferramenta BLASTp para realizar essa busca.
Foi utilizado o software MEGA 6 (TAMURA et.al, 2013) para inferir e
visualizar árvores filogenéticas, usando o método Neighbour-joining. O método de
teste da filogenia foi o Bootstrap, com 1000 replicações. O modelo de
substituições de aminoácidos usado foi a distância-p. Já o tratamento de buracos
(gaps) ou deleção de aminoácidos, a deleção par a par.
31
4
Resultados e discussão
4.1
Análise das espécies quanto à presença de genes FMT
4.1.1 Espécies com evidências de atividade FMT
Com o objetivo de encontrar plantas contendo monolignol ferulatos na
composição dos extrativos e evidências de atividade FMT, fez-se uma busca na
literatura, no banco de dados do pubmed do NCBI.
Relatos de atividade monolignol ferulato foram encontrados nas seguintes
espécies: Cinidium officiale (KOBAYASHI; FUJITA; MITSUHASHI, 1984);
Ligusticum Chuaxiong (LI; LIN; TAM, 2006) e Lomaticum Californicum (CHOU
et.al, 2006).
Segundo Ralph e colaboradores (2013), a análise dos extrativos das
espécies Kenaf (Hibiscus canabinnus) e Balsa (Ochroma pyramidale) demonstra
ferulatos cujas estruturas derivam da dehidrodimerização de monolignol ferulatos
ou similares, indicando que ambas possuem atividade FMT. Além disso, a
espécie Angelica sinensis produz o coniferil ferulato em suas raízes, em uma taxa
acima de 2% em massa seca da raiz (RALPH et.al, 2013).
A partir da identificação das espécies com atividade FMT, buscou-se
classificar tais espécies dentro da sistemática vegetal para ampliar a possibilidade
de identificação deste composto em outras espécies vegetais. Como resultado,
verificou-se que os gêneros Angelica, Cinidium, Ligusticum e Lomatium
pertencem à ordem Apiales, enquanto que os gêneros Hibiscus e Ochroma
pertencem
à
ordem
Malvales,
eudicotiledôneas (Tabela 4.1).
ambas
pertencentes
às
angiospermas
32
Tabela 4.1 – Taxonomia das espécies com evidências de atividade FMT
Nome
C officinale
L. chuanxiong
L. californicum
Chinese angelica
Kenaf
Balsa
Clado
Asterids
Asterids
Asterids
Asterids
Rosids
Rosids
Ordem
Apiales
Apiales
Apiales
Apiales
Malvales
Malvales
Família
Apiaceae
Apiaceae
Apiaceae
Apiaceae
Malvaceae
Malvaceae
Gênero
Cinidium
Ligusticum
Lomatium
Angelica
Hibiscus
Ochroma
Espécie
C. officinale
L. chuanxiong
L. californicum
A. sinensis
H. canabinnus
O. pyramidale
Fonte: Bremer et.al, 2009
Pode-se observar que não foi encontrada na literatura nenhuma evidência
de atividade FMT nas angiospermas monocotiledôneas (inclui as gramíneas),
gimnospermas e briófitas. No entanto, outras espécies filogeneticamente
relacionadas ao clado Asterids ou Rosids podem conter atividade FMT.
4.2
Levantamento das espécies vegetais com genoma disponível com
possível atividade FMT
A partir dos resultados expostos no item anterior, foi feita uma busca na
literatura por outras espécies, cujos genomas já foram sequenciados, que
poderiam apresentar genes com atividade FMT.
Como hipótese do trabalho, baseado na teoria evolutiva e da seleção
natural das espécies (DARWIN, 1859), infere-se a partir da origem e
diversificação das espécies que as atividades biológicas caracterizadas, possam
ser identificadas nas espécies próximas.
Assim, se a espécie está filogeneticamente relacionada com um dos
gêneros supracitados (Cinidium, Ligusticum, Lomatium, Angelica, Hibiscus e
Ochroma), existe a possibilidade de possuir genes homólogos ao FMT. Desses
gêneros, os quatro primeiros pertencem ao clado Asterids, e os outros dois ao
clado Rosids (Tabela 4.1). Portanto, a probabilidade de encontrar espécies com
sequências similares de FMT é maior nesses clados. Essa probabilidade aumenta
33
à medida que as espécies apresentam uma origem em comum, recente na
história evolutiva.
Dessa forma, foi feito um levantamento no banco de dados do CoGePedia
(LYONS; FREELING, 2014), de todas as espécies do clado Asterids com
genomas disponíveis. O mesmo procedimento foi realizado para as espécies do
clado Rosids. Em seguida, buscou-se a taxonomia das espécies encontradas.
Encontraram-se 14 espécies para a busca em Asterids (Tabela 4.2) e 31 para
Rosids (Tabela 4.3).
Tabela 4.2 – Taxonomia das espécies do clado Asterids cujos genomas
foram sequenciados
Nome comum
Ordem
Família
Gênero
Espécie
Tomate
Batata
Berinjela
Pimenta
vermelha
Tabaco
Monkey Flower
Freixo
Genlisea aurea
Mirtilo
Cranberry
Solanales
Solanales
Solanales
Solanales
Solanaceae
Solanaceae
Solanaceae
Solanaceae
Solanum
Solanum
Solanum
Capsicum
Solanum sp.
S. tuberosum
S. melongena
C. annuum
Solanales
Lamiales
Lamiales
Lamiales
Ericales
Ericales
Solanaceae
Phrymaceae
Oleaceae
Lentibulariaceae
Ericaceae
Ericaceae
Nicotiana
Mimulus
Fraxinus
Genilsea
Vaccinium
Vaccinium
Kiwi
Café
Urticularia gibba
Buva
Ericales
Gentianales
Lamiales
Asterales
Actinidaceae
Rubiaceae
Lentibulariaceae
Asteraceae
Actinidia
Coffea
Urticularia
Conyza
N. benthaniana
M. guttatus
F. excelsior
G. aurea
V. spp
V. macrocarpon
Ait.
A. chinensis
Coffea sp.
U. gibba
C. canadensis
Fonte: Bremer et.al, 2009.
34
Tabela 4.3 – Taxonomia das espécies do clado Rosids cujos genomas
foram sequenciados
Nome
comum
Uva
Eucalipto
Álamo
Salgueiro
roxo
Linho
Mamona
Mandioca
Borracha
Bétula
Carvalho
Pepino
Morango
selvagem
Maçã
Pêra
Cannabis
Lúpulo
Jujuba
Pêssego
Barrel medic
Grão de bico
Lotus
japonicas
Ervilha
d'angola
Lentilha
Tremoço
Algodão
Cacau
Aquilaria
Neem
Citrus
Papaya
Arabidopsis
Ordem
Família
Gênero
Espécie
Vitales
Myrtales
Malpighiales
Malpighiales
Vitaceae
Myrtaceae
Salicaceae
Salicaceae
Vitis
Eucalyptus
Populus
Salix
V. vinifera
E.grandis
P.thricocarpa
S. purpurea
Malpighiales
Malpighiales
Malpighiales
Malpighiales
Fagales
Fagales
Cucurbitales
Rosales
Linaceae
Euphorbiaceae
Euphorbiaceae
Euphorbiaceae
Betulaceae
Fagaceae
Cucurbitaceae
Rosaceae
Linum
Ricinus
Manihot
Hevea
Betula
Quercus
Cucumis
Fragaria
L.usitatissimum
R.communis
M.esculenta
H. brasilliensis
B.nana
Q.robur
C. sativus
F.vesca
Rosales
Rosales
Rosaceae
Rosaceae
Malus
Pyrus
Rosales
Rosales
Rosales
Rosales
Fabales
Fabales
Fabales
Cannabaceae
Cannabaceae
Rhamnaceae
Rosaceae
Fabaceae
Fabaceae
Fabaceae
Cannabis
Humulus
Ziziphus
Prunus
Medicago
Cicier
Lotus
M.domestica
P.
bretschneideri
C.sativa
H.lupulus
Z.jujuba
P.persica
M.truncatula
C.arietinum
L.japonicus
Fabales
Fabaceae
Cajanus
C.cajan
Fabales
Fabales
Malvales
Malvales
Malvales
Sapindales
Sapindales
Brassicales
Brassicales
Fabaceae
Fabaceae
Malvaceae
Malvaceae
Thymelaeaceae
Meliaceae
Rutaceae
Caricaceae
Brassicacea
Vigna
Lupinus
Gossypium
Theobroma
Aquilaria
Azaridchta
Aurantioideae
Carica
Arabidopsis
V.radiata
L.angustifolius
G. raimonddi
T.cacao
A. agallocha
A. indica
Citrus sp
C.papaya
Arabidopsis sp.
Fonte:Bremer et.al, 2009.
35
Com o objetivo de selecionar, dentre as espécies acima (Tabelas 4.2 e
4.3), as mais próximas daquelas com atividade FMT (membros das ordens
Apiales e Malvales), analisou-se a árvore filogenética das angiospermas (Figura
4.1).
Figura 4.1 – Filogenia das angiospermas eudicotiledôneas, de acordo com
a classificação APG III (2009)
Fonte: Adaptado de Bremer et.al, 2009.
36
Observou-se na figura 4.1 a relação filogenética entre as ordens Apiales e
Malvales (Tabela 4.1) e as espécies membros dos clados Asterids e Rosids cujos
genomas foram sequenciados (Tabela 4.2 e 4.3).
No caso das Asterids (Tabela 4.2), a espécie mais próxima das Apiales é a
Conyza canadensis. Isso porque ela é da família Asterales, que é do clado
Campanulids (Figura 1). Já as outras famílias encontradas (Solanales, Lamiales,
Ericales, Gentianales) são Lamiids.
No caso das Rosids (tabela 4.3), as espécies mais próximas encontradas
foram G. raimondii (algodão), T. cacao (cacau) e A. agallocha, pois são Malvids.
Entretanto, as duas primeiras espécies estão mais relacionadas ao H. canabinnus
e ao O. pyramidale porque também pertencem à família das Malvales.
Então, pela hipótese do trabalho, as espécies: C. canadensis, G. raimondii
e T. cacao têm maior probabilidade de possuírem atividade FMT.
No entanto, embora o genoma de C. canadensis já tenha sido sequenciado
(PENG
et.al,
2014),
não
é
possível
acessá-lo,
pois
os autores
não
disponibilizaram para acesso público.
4.2.1 Identificação dos genes homólogos e análise filogenética
Na tentativa de encontrar genes homólogos de FMT utilizou-se como isca a
sequência encontrada na literatura de Angelica sinensis (AsFMT) (WILKERSON,
2014).
Inicialmente, utilizou-se a ferramenta BLASTp, para todas as espécies do
Phytozome v. 9.1.
Utilizando a proteína AsFMT como isca no Phytozome v. 9.1 para todas as
41 espécies desse banco de dados, foi possível identificar as espécies que
possuíam sequências mais similares a AsFMT, por meio da comparação entre as
pontuações. A organização dessa pontuação em ordem decrescente permitiu uma
visualização clara dessas espécies (Tabela 4.4).
37
Tabela 4.4 – Pontuações obtidas no Phytozome 9.1 para o gene FMT
utilizando a ferramenta BLASTP em todas as espécies
disponíveis
Espécie
Pontuação
Theobroma cacao
Populus trichocarpa
Solanum tuberosum
Solanum Lycopersicum
Vitis vinifera
Gossypium raimondii
Carica papaya
Manihot esculenta
Malus domestica
Citrus sinensis
Ricinus communis
Citrus clementina
Fragaria vesca
Eucalyptus grandis
Thellungiella halophile
Cucumis sativus
Glycine max
Capsella rubella
Arabidopsis thaliana
Linium usitatissimum
Brassica rapa chiifu 401 v1.2
Arabidopsis lyrata
Medicago truncatula
Mimulus guttatus v1.1
Phaseolus vulgaris
Prunnus persica
Selaginella moellendorffii
Aquilegia coerulea
Oryza sativa
Sorghum bicolor v1.4
Panicum virgatum v0.0
Setaria italic
Zea mays
Brachypodium distachyon
Physcinitrella patens v1.6
Chlamydomonas reinhardtii
Volvox carteri
Coccomyxa subellipsoidea C-169
Micromonas pusilla CCMP1545
Micromonas pusilla RCC 299
Ostreiciccus lucimarinus
276,2
261,5
258,8
256,9
254,6
244,6
235,7
229,9
223
223
219,9
216,9
212,2
207,6
196,1
194,1
193,4
193
189,1
188,3
188,3
188
186,8
183
182,6
172,9
119,4
115,2
114,4
114
113,6
113,2
112,1
110,5
97,8
0
0
0
0
0
0
Fonte: Phytozome V. 9.1
38
O resultado demonstra que dentre as espécies com proximidade
filogenética à ordem Apiales (Angelica sinensis), as que apresentaram maior
similaridade ao AsFMT foram as espécies Solanum tuberosum (pontuação 258,8)
e Solanum lycopersicum (pontuação 256,9). Estas espécies ocuparam a terceira e
quarta posição, respectivamente. Em vista do aparecimento de duas espécies do
mesmo gênero com alta pontuação, apenas uma foi selecionada para prosseguir
no estudo: S. tuberosum. Observa-se na figura 4.1, que as ordens Solanales e
Apiales pertencem ao mesmo clado Asterids.
É interessante notar que dentre as espécies vegetais que são membros da
ordem Malvales (Rosids), cacau (pontuação 276,2) teve a primeira colocação,
enquanto que algodão (pontuação 244,6) teve a sexta posição. Como cacau e
algodão são membros da mesma ordem, é possível que a divergência entre estas
espécies tenha levado a divergências nos genes homólogos de FMT.
Ademais, Populus trichocarpa (261,5) e Vitis vinifera (254,6) ocuparam a
segunda e quinta posição, respectivamente. Na tabela 4.3, observa-se que elas
pertencem ao clado Rosids e às ordens Vitales e Malphigiales, respectivamente.
Esses resultados mostraram que, dentre as espécies com genomas
disponíveis cujas pontuações obtidas foram mais altos, S. tuberosum e S.
lycopersicum não apresentaram a melhor colocação, apesar de serem do mesmo
clado que Angelica sinensis. Adicionalmente, o fato de encontrar outras espécies
do clado Rosids em melhores posições que os gêneros Solanum, indica que o
gene homólogo ao FMT pode existir nestas espécies.
Nesse trabalho, o objetivo foi identificar e analisar a origem e evolução do
gene FMT nas espécies vegetais. Somente a análise filogenética fornece dados
suficientes para inferir homologia entre os genes. Os resultados de pontuação
representam a similaridade entre as sequências, ou seja, uma medida quantitativa
de suas semelhanças e diferenças. A homologia, por sua vez, significa descender
de um ancestral comum. Trata-se de uma característica qualitativa.
Dessa forma, com o objetivo de compreender a relação filogenética dos
genes homólogos ao AsFMT encontrados nas espécies acima mencionadas,
construiu-se uma árvore filogenética (Figura 4.2) para todos os genes FMT
homólogos que tiveram maior similaridade ao AsFMT das cinco espécies
selecionadas. Como controle, incluiu-se na análise Arabidopsis thaliana, em que
39
não há evidências de atividade FMT (WILKERSON, 2014). Na análise filogenética
foram utilizadas as sequências encontradas de cada uma das cinco espécies,
para as quais as pontuações obtidas usando a ferramenta BLASTp no Phytozome
v9.1 foram mais altas.
40
Figura 4.2 – Árvore filogenética de sequências homólogas de AsFMT
100
100
At4G15390
At3G30280
49
At5G47950
At1G24420
93
At5G47980
71
96
AtG23970
At3G26040
93
100
Tc1EG015761
Gr004G187400
100
29
Tc1EG023828
61
Tc1EG010738
100
Tc1EG025010
Gr012G006600
Vv01008706001
68
59
100
91
Gr007G301400
Gr002G117800
Tc1EG034371
100
100
51
Tc1EG034377
Gr009G188000
41
Tc1EG034370
100
Gr002G117900
100
Tc1EG025946
Tc1EG025949
100
Tc1EG014579
97
55
Tc1EG014578
Tc1EG014580
At1G24430
99
99
97
Tc1EG010714
Vv01010312001
100
83
Gr008G162900
Gr011G203000
97
Tc1EG010715
100
Gr005G172900
100
St400029255
St400007801
100
74
St400036129
St400012542
62
St400012537
100
St400012539
39
St400012540
AsFMT
100
Tc1EG007415
Gr005G224100
36
Pt017G029300
30
100
PtT124500
100
Pt015G126600
91
Pt015G127000
73
Pt006G036100
98
Pt019G001400
16
100
Pt019G001200
100
Vv01015704001
Vv01024119001
Pt001G310000
36
Pt004G017600
76
Pt005G028500
100
100
Pt005G028200
Fonte: A autora, 2015. Sequências de Arabidopsis thaliana em verde, Theobroma cacao
em vermelho, Populus trichocarpa em marrom, Vitis vinifera em roxo, Gossypium raimondii em
rosa, Solanum tuberosum em azul e a FMT de Angelica sinensis em amarelo.
41
A análise filogenética (Figura 4.2) permitiu observar a existência de
sequências homólogas de AsFMT em cinco espécies vegetais, tais como
Theobroma cacao (cacau), Populus trichocarpa (álamo), Vitis vinifera (uva),
Gossypium raimondii (algodão) e Solanum tuberosum (batata). Dentre estas
espécies, cinco genes de batata (Solanum tuberosum) apresentaram maior
similaridade ao AsFMT, sugerindo que a atividade FMT exista nesta espécie. É
interessante notar que este resultado confirma a hipótese do trabalho,
encontrando genes homólogos nesta espécie vegetal pertencente ao clado
asterids assim como A. Sinensis.
A presença de genes homólogos de AsFMT em espécies do clado Rosids,
como uva (Vitis vinifera), álamo (Populus trichocarpa), cacau (Theobroma cacao)
e algodão (Gossypium raimondii), indica que provavelmente a origem deste gene
ocorreu antes da divergência entre os clados Rosids e Asterids. O fato de terem
sido encontrados genes homólogos em uva é interessante, uma vez que é
possível notar que a família Vitales, à qual a espécie pertence, está na base da
evolução das Rosids (Figura 4.1) reforçando a existência de genes homólogos em
espécies Rosids.
Outro resultado importante é que não foram encontrados genes homólogos
em monocotiledôneas, o que está de acordo com a hipótese do trabalho que
inferiu a ausência do gene em gramíneas como a cana-de-açúcar.
Nota-se que, de fato, o grupo de genes de Arabidopsis thaliana mais
próximos de AsFMT, incluindo o At3g26040 identificado com moderada
similaridade ao AsFMT (RALPH et.al, 2013) não apresenta alta similaridade com
o próprio AsFMT de Angelica sinensis, reforçando a não existência da atividade
monolignol ferulato transferase em Arabidopsis ou a perda desta atividade em
Brassicales (Figura 4.1)
42
5
Conclusões
Considerando a importância da produção de etanol de segunda geração a
partir de cana-de-açúcar, a proposta de alterar a estrutura da parede celular das
plantas de forma a facilitar a conversão de biomassa é bastante promissora.
Na literatura, foram encontrados três genes de grande relevância,
responsáveis por tais alterações: OsAt10, PMT e FMT. A partir do estudo feito
para o gene FMT, identificaram-se na literatura espécies com evidência de
atividade FMT, membros dos clados Asterids e Rosids. Também foram
encontradas espécies desses clados com possível atividade FMT, cujos genomas
já foram sequenciados. Isso é importante para estudos futuros, baseados em
sequências de FMT dessas espécies que venham a ser disponibilizadas.
Nesse trabalho, a sequência protéica de FMT de Angelica Sinensis
(AsFMT) foi usada como isca para a busca de homólogos . Esperava-se encontrar
espécies relacionadas filogeneticamente com a família de Angelica (Apiales), cujo
proteoma estivesse disponível, para realizar essa busca. Entretanto, encontraramse apenas espécies pertencentes ao mesmo clado Asterids.
A busca por homólogos realizada para todas as espécies disponíveis no
banco de dados do phytozome v.9.1 confirmou a hipótese do trabalho, pois as
sequências mais relacionadas, ou seja, com ancestral comum mais próximo, são
de fato as do clado Asterids.
No entanto, também foram encontradas sequências homólogas em
espécies Rosids. Isso, aliado ao fato de que outras espécies desse clado têm
evidência de atividade FMT descrita na literatura, pode significar que o gene FMT
surgiu antes da divergência entre os dois clados, Asterids e Rosids. É
interessante destacar que o gene homólogo encontrado em uva, sugere o
surgimento de FMT na origem das angiospermas eudicotiledôneas e ausência
nas monocotiledôneas. O fato deste gene não ter sido identificado nas
monocotiledôneas evidencia a atividade FMT ausente nas gramíneas.
Estes resultados demonstram como os métodos de bioinformática e
evolução podem auxiliar na identificação de genes de interesse biotecnológico.
Como perspectivas, novos trabalhos nessa área podem confirmar a
atividade FMT nas espécies vegetais onde os homólogos de FMT foram
43
encontrados. Pode-se realizar a extração e identificação do composto monolignol
ferulato para evidenciar a atividade.
44
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