ISSN 1808-9909
Volume 5, Número 2, 2009
PLANT CELL CULTURE
&
MICROPROPAGATION
Cultura de Células
&
Micropropagação de Plantas
Publicação Científica da Associação Brasileira
de Cultura de Tecidos de Plantas
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, MG, v. 5, n. 2, p. 71-144, 2009
A revista Plant Cell Culture & Micropropagation , editada semestralmente pela Editora da
Universidade Federal de Lavras (Editora UFLA), publica artigos científicos da área de cultura de tecidos
de plantas por membros da comunidade científica nacional e internacional. Com uma tiragem de 600
exemplares é distribuída aos membros da ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE CULTURA DE
TECIDOS DE PLANTAS (ABCTP) em dia com a anuidade.
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Editoração Eletrônica
Luciana Carvalho Costa Editora UFLA
Christyane Aparecida Caetano Editora UFLA
Consultoria Científica (v.5, n.2, 2009)
Adriano Bortolotti da Silva UNIFENAS
Alice Sato UNIRIO
Áurea Maria randi UFSC
Breno Santos Unifal
Claudia Teixeira Guimarães EMBRAPA
Cristiane Elizabeth Costa de Macedo UFRN
Daiane Peixoto Vargas UFLA
Fernanda Carlota Nery UFSJ
Fernando Teixieira Nicoloso UFSM
João Maurício Cavalcante Alves UFLA
José Eduardo Brasil Pereira Pinto UFLA
José Magno Queiroz Luz UFU
Lenaldo Muniz de Oliveira UEFS
Magdi Ahmed Ibrahim Aloufa UFRN
Maria Apparecida Esquibel UFRJ
Raírys Cravo Nogueira UFPA
Rodrigo Kelson Silva Rezende UFGD
Soami Fernanda Caio Deccetti
Suzana Stefanello UNIPAR
Vera Lucia Bobrowski UFpel
ISSN 1808-9909
Plant Cell Culture & Micropropagation
CONTEÚDO
Aspectos do cultivo in vitro do manjericão cv. Maria bonita (Ocimum basilicum L.)
Aspects of the in vitro cultivation of sweet basil cv. Maria bonita (Ocimum basilicum L.)
Luciana Domiciano Silva Rosado, Jose Eduardo Brasil Pereira Pinto, Priscila Pereira Botrel, Arie
Fitzgerald Blank, Suzan Kelly Vilela Bertolucci .........................................................................................
71
Maize androgenesis: in vitro culture and microspore development in Brazilians genotypes
Androgênese em milho: cultura in vitro e desenvolvimento dos micrósporos em genótipos Brasileiros
Ana Paula Moraes, Luana Olinda Tacuatiá, Fernanda Bered, Fernando Irajá Felix de Carvalho, Eliane
Kalchuk-Santos ............................................................................................................................................
79
pH, carvão ativado e agentes geleificantes do meio de cultura no crescimento in vitro de Miltonia
flavescens Lindl.
pH, activated charcoal and gelling agents of the culture medium on the in vitro growth of Miltonia
flavescens Lindl.
Patrícia Inês Chapla, Jean Carlos Fernando Besson, Lana Karina Oliveira, Jaqueline Manzatti da Silva,
Andressa Camilo de Souza Rocha, Suzana Stefanello .................................................................................
87
Resposta de calos embriogênicos de cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.) a diferentes
concentrações de cloreto de sódio
Response of sugarcane (Saccharum officinarum L.) embryogenic callus to different concentrations of
sodium chloride
Isabele Aragão Gomes, Cibelley Vanucia Santana Dantas, Maria Tereza Franco Marques, Cristiane
Elizabeth Costa Macedo ...............................................................................................................................
94
Efeito do estiolamento na micropropagação de abacaxi cultivar Imperial
Effect of etiolation on the micropropagation of Imperial pineapple cultivar
Micaele da Costa Santos, Sarah Brandão Santa Cruz Barboza, Ana da Silva Lédo, Pedro Roberto
Almeida Viégas, Luiz Augusto Copati .........................................................................................................
101
Cinetina, ácido giberélico e BAP na indução de embriões somáticos a partir de anteras de cafeeiro
Coffea arabica L.
Kinetin, gibberellic acid and BAP in the formation of somatic embrios from coffee tree anthers Coffea
arabica L.
Leandro de Oliveira Lino, José Magno Queiroz Luz, Israel Vieira Naves, Tatiana Michlovská
Rodrigues, Letícia de Araújo Dias, Alcione da Silva Arruda ......................................................................
111
Enraizamento in vitro e aclimatização de mudas micropropagadas de caroá
In vitro rooting and acclimatization of micropropagated caroá
Daniela Garcia Silveira, Fernanda Vidigal Duarte Souza, Carlos Alberto da Silva Ledo, Ádila Melo
Vidal, José Raniere Ferreira de Santana .......................................................................................................
118
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 71-144, 2009
Micropropagation of Aristolochia gigantea Mart. Et Zucc. (Aristolochiaceae) through nodal
segment culture
Micropropagação Aristolochia gigantea Mart. Et Zucc. (Aristolochiaceae) através de cultura de
segmentos nodais
Kelly Araujo Lúcio, Maria Apparecida Esquibel, Alice Sato, Celso Luiz Salgueiro Lage ..........................
129
COMUNICAÇÃO CIENTÍFICA
Germinação in vitro de sementes de Merremia tomentosa Hallier f.: influência de meios de cultura e
GA3
In vitro germination of seeds of Merremia tomentosa Hallier f.: influence of culture medium and GA3
Agda Rabelo Centofante, Evaristo Mauro de Castro, Leticia Caravita Abbade, Renato Paiva, Elias
Centofante ....................................................................................................................................................
135
Desinfestação superficial de frutos-sementes de aroeira-do-sertão para germinação in vitro
Superficial disinfection of seed-fruit of aroeira-do-sertão for in vitro germination
João Paulo Saraiva Morais, Ana Cristina Portugal Pinto de Carvalho, Thiago Lustosa Jucá, Francisco de
Assis de Paiva Campos ................................................................................................................................
140
ASPECTOS DO CULTIVO
INcultivo
VITRO
MANJERICÃO CV. MARIA 71
Aspectos do
in vitroDO
do manjerição...
BONITA (Ocimum basilicum L.)
ASPECTS OF THE IN VITRO CULTIVATION OF SWEET BASIL CV. MARIA BONITA
(Ocimum basilicum L.)
LUCIANA DOMICIANO SILVA ROSADO1, JOSE EDUARDO BRASIL PEREIRAPINTO2,
PRISCILA PEREIRA BOTREL3, ARIE FITZGERALD BLANK4, SUZAN KELLY VILELA BERTOLUCCI5
1
Mestranda em Agronomia/Fitotecnia Universidade Federal de Lavras/UFLA Cx. P. 3037 37200-000 Lavras, MG
[email protected]
2
Doutor em Fisiologia Vegetal Universidade Federal de Lavras/UFLA Cx. P. 3037 37200-000-Lavras, MG - [email protected]
3
Mestranda em Agronomia/Fitotecnia
Universidade Federal de Lavras/UFLA Cx. P. 3037 37200-000 Lavras, MG
[email protected]
4
Doutor em agronomia/Fitotecnia Departamento de Engenharia Agronômica Universidade Federal de Sergipe Av. Marechal
Rondon s/n, Jardim Rosa Elze 49100-000 São Cristóvão, Sergipe [email protected]
5
Mestre em Agroquímica Universidade Federal de Lavras/UFLA Cx. P. 3037 37200-000 Lavras, MG [email protected]
RESUMO
Com o objetivo de avaliar a influência de reguladores de
crescimento na multiplicação in vitro de Ocimum basilicum L. cv.
Maria Bonita foram conduzidos dois experimentos. O primeiro,
com o objetivo de verificar o efeito dos reguladores de crescimento
(BAP e ANA) na propagação in vitro dessa cultivar de manjericão
nas seguintes concentrações (0,0; 0,5; 1,0 mg L-1) e o segundo,
avaliar as diferentes concentrações de 2,4-D (0,0; 0,5; 1,0; 2,0 mg
L-1) na indução de calos em explantes foliares. Os experimentos
foram implantados em delineamento inteiramente casualizado, sendo
o primeiro composto por 9 tratamentos e o segundo com 4. No
primeiro experimento, avaliou-se o comprimento e as biomassas
frescas e secas das brotações e as biomassas frescas e secas dos
calos. No segundo, avaliaram-se apenas as biomassas frescas e
secas dos calos. Observou-se que o comprimento das brotações e
biomassas frescas e secas das mesmas foi superior na ausência de
regulador de crescimento. Com relação à presença de calos em
segmentos nodais, a melhor concentração a ser utilizada foi 0,5 mg
L-1 ANA e 0,5 mg L-1 BAP combinados. A maior biomassa fresca
(2,10 g) de calos em explantes foliares de manjericão foi obtida com
meio MS suplementado com 1,26 mg L-1 do ácido 2,4-D. A maior
biomassa seca (1,18g) de calos em explantes foliares foi obtida com
0,31 mg L-1 de 2,4-D. Com o aumento das concentrações de 2,4-D
houve uma tendência de decréscimo tanto na biomassa fresca quanto
seca.
Termos para indexação: Ocimum basilicum, propagação in
vitro, reguladores de crescimento.
ABSTRACT
Two experiments were carried out with the objective to
evaluate the influence of growth regulators on in vitro multiplication
of sweet basil (Ocimum basilicum L.) cv. Maria Bonita. The first
experiment had the objective to verify the effect of different
concentrations (0.0; 0.5 and 1.0 mg L-1) of BAP and NAA on
sweet basil plantlets formation and the second one was to evaluate
callus induced by using different concentrations of 2,4-D (0.0; 0.5;
1.0 and 2.0 mg L-1) on leaf explants. The experiments used a
randomized complete design with 9 and 4 treatments in the first
and second experiments, respectively. In the first experiment, shoot
length, dry and fresh biomass and dry and fresh callus biomass
were evaluated. It was observed that shoot length, fresh and dry
shoot biomass were better without the growth regulators. In the
second experiment, only dry and fresh biomasses were evaluated.
It observed that shoot length and fresh and dry biomasses were
superior in the absence of growth regulators. Regarding the presence
of callus in nodal segment, the best used concentration was the
combination of 0.5 mg L-1 NAA and 0.5mg L-1 BAP. Higher leaf
callus fresh biomass (2.10g) was obtained in MS supplemented
1.26 mg L-1 2,4-D. Higher leaf dry callus biomass (1.18g) was
obtained with 0.31 mg L-1. With the increase of 2,4-D concentration,
it was observed a decrease in both fresh and dry biomass.
Index terms: Ocimum basilicum, propagation in vitro, growth
regulators.
INTRODUÇÃO
O Ocimum basilicum L. pertencente à família
Lamiaceae tem sido alvo de muitas pesquisas em razão das
características importantes que incluem a utilização na área
alimentar, de fármacos, de cosméticos e perfumaria (RABELO
et al., 2003). É um arbusto popularmente conhecido como
manjericão ou alfavaca, espécie muito valorizada pela
qualidade de óleo essencial e aroma que produz. Segundo
Blank et al. (2007) o óleo essencial de manjericão da cultivar
Maria Bonita PI 197442 apresenta elevado rendimento de
óleo essencial comparado a outras cultivares e possui
substâncias de importância econômica, terapêutica e
condimentar, como linalol, geraniol e 1,8 cineol.
(Recebido em 25 de setembro de 2008 e aprovado em 16 de março de 2009)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 71-78, 2009
72
ROSADO, L. D. S. et al.
Apesar da facilidade de se obter muda pelo método
convencional por meio de sementes e estacas, os plantios
com a espécie precisam ser formados a fim de se obter
características de interesse, as quais devem apresentar
fuste reto e crescimento uniforme com isso melhorando
seu rendimento (REIS et al., 2007). Assim, o
desenvolvimento de metodologias de micropropagação é
um meio efetivo para multiplicação rápida de espécies nas
quais é necessário obter alta uniformidade de progênie.
Então há um grande interesse de utilização destas técnicas
para ampliar a propagação de plantas medicinais e
aromáticas (MANTHELL et al., 1994).
A composição do meio de cultura, assim como a
concentração dos seus componentes, é fundamental para
o desenvolvimento dos tecidos (CALDAS et al., 1998). Os
reguladores de crescimento utilizados para induzir à
proliferação de brotos são as citocininas. Tanto o tipo de
citocinina quanto a concentração do regulador influenciam
a resposta in vitro, sendo necessária à avaliação de
distintas combinações para a otimização das condições de
micropropagação de uma planta (PEREIRA, 2004).
Segundo Torres et al. (1998), o acréscimo de
reguladores de crescimento ao meio de cultivo é utilizado
para suprir possíveis deficiências endógenas e melhorar
as características de cultivo in vitro. As concentrações
ideais de ANA (ácido naftalenoacético) e BAP
(benzilaminopurira) para o estabelecimento de calos variam
muito de acordo com o genótipo, explantes e interação
com outros fitoreguladores. A formação de raiz, parte aérea
e calo em cultura de tecidos é regulada pela disponibilidade
e interação dessas duas classes de reguladores de
crescimento.
Pela importância medicinal e econômica do
manjericão, neste presente trabalho, objetivou-se
estabelecer as melhores concentrações e combinações de
fitorreguladores adicionados ao meio de cultivo in vitro,
almejando a obtenção de plântulas com melhores
qualidades morfológicas e fisiológicas para posterior
aclimatização, bem como avaliar diferentes concentrações
de 2,4-D (ácido 2,4 diclofenoxiacético) na indução de calos
de manjericão com intenções de induzir embriogênese
somática futuramente.
MATERIAL E MÉTODOS
Experimento 1: Avaliação de diferentes concentrações de
ANA e BAP no desenvolvimento in vitro de segmento nodal
do manjericão cv. Maria Bonita
Este trabalho foi conduzido no Laboratório de
Cultura de Tecidos Vegetais e Plantas Medicinais do
Departamento de Agricultura (DAG) - da Universidade
Federal de Lavras (UFLA), MG.
Os explantes utilizados para a instalação do
experimento foram obtidos a partir de plântulas oriundas de
manjericão cv. Maria Bonita PI 197442 pré-estabelecidas in
vitro por 30 dias. Foram utilizados os segmentos nodais da
parte mediana com 1 cm de comprimento, sendo inoculados
em tubos de ensaio de 25 x 150 mm contendo 12 mL do meio
MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962), com 30 g L-1 de
sacarose solidificado com 6 g L-1 de ágar e suplementado
com os reguladores de crescimento ANA e BAP .
Foram avaliadas três concentrações (0,0; 0,5; 1,0 mg
-1
L ) de ambos reguladores de crescimento com as seguintes
combinações: T1 (0,0 ANA e 0,0 BAP), T2 (0,0 ANA e 0,1
BAP), T3 (0,0 ANA e 0,5 BAP), T4 (0,1 ANA e 0,0 BAP), T5
(0,1 ANA e 0,1 BAP), T6 (0,1 ANA e 0,5 BAP), T7 (0,5 ANA e
0,0 BAP), T8 (0,5 ANA e 0,1 BAP) e T9 (0,5 ANA e 0,5 BAP).
O pH foi ajustado para 5,7 ± 0,1 antes da autoclavagem.
Os tubos contendo os explantes foram mantidos
em sala de crescimento a temperatura de 26 ± 1ºC e
fotoperíodo de 16 h, sob intensidade luminosa de 25 µmol
m-2 s-1, por um período de 30 dias.
O delineamento experimental aplicado foi o
inteiramente casualizado (DIC) composto por 9 tratamentos,
sendo cada tratamento composto por 5 repetições de 4
tubos cada, totalizando 20 tubos por parcela.
Após 30 dias de cultivo, as variáveis analisadas
foram comprimento das brotações, biomassa fresca e seca
da parte aérea e biomassas fresca e seca de calos. Os dados
foram submetidos à análise de variância e as médias
comparadas pelo teste de Scott-Knott, a 5 % de
probabilidade.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 71-78, 2009
Aspectos do cultivo in vitro do manjerição...
Experimento 2: Diferentes doses de 2,4-D na indução de
calos de manjericão (Ocimum basilicum)em explantes
foliares.
Os calos foram obtidos utilizando-se explantes
foliares provenientes de plântulas de manjericão cultivar
Maria Bonita PI 197442 pré-estabelecidas in vitro com 30
dias de idade em meio de cultura MS (MURASHIGE &
SKOOG, 1962).
Os tratamentos testados foram meio MS com 30 g
L
-1
de sacarose solidificado com 6 g L -1 ágar e
suplementado com diferentes concentrações de 2,4-D (0,0;
0,5; 1,0; 2,0 mg L-1). O pH do meio de cultura foi ajustado
para 5,7 ± 0,1 antes da autoclavagem.
Os explantes foliares com tamanho de 1 cm2 de
comprimento foram inoculados em tubos de ensaio (25 x
150mm) contendo 10 mL de meio de cultura. Após esta
etapa, os tubos foram mantidos em sala de crescimento
com fotoperíodo de 16 h, temperatura de 25 ± 10C e
intensidade luminosa de 25 µmol m-2 s-1. A avaliação da
biomassa fresca foi realizada aos 30 dias após a inoculação
do explante. Já a obtenção da biomassa seca dos calos foi
realizada após a permanência dos mesmos em estufa
durante 5 dias com a temperatura de ± 500C.
O delineamento utilizado foi o inteiramente
casualizado (DIC), com 4 tratamentos contendo 5 repetições
sendo cada repetição composta por 4 tubos de ensaio
contendo um explante por tubo. A análise dos dados foi
realizada utilizando-se o software Sisvar (FERREIRA, 2000),
sendo realizada a análise de regressão polinomial.
RESULTADO E DISCUSSÃO
Experimento I: Avaliação de diferentes concentrações de
ANA e BAP no desenvolvimento in vitro de segmento nodal
do manjericão cv. Maria Bonita.
As diferentes combinações de ANA e BAP ao meio
de cultura influenciou significativamente (p< 0,05) no
desenvolvimento do segmento nodal do manjericão para
todas as variáveis analisadas (Tabela 1). Pode-se inferir
que a concentração e a combinação dos reguladores de
crescimento testados e a sua interação com os níveis
73
endógenos de hormônios presentes no explante são
determinantes.
Conforme Pérez-Toreno et al. (2000), os efeitos
decorridos do balanço entre os diferentes hormônios de
crescimento sobre o desenvolvimento in vitro dependem
do genótipo testado, tornando necessário o estudo
individualizado para cada espécie ou cultivar.
Para a variável comprimento das brotações,
recomenda-se não utilizar reguladores de crescimento, visto
que, brotações com maior comprimento e mais vigorosas
foram obtidas em segmentos nodais cultivados em meio
MS desprovindos destes.
Lima et al. (2007), estudando a influência dos
reguladores de crescimento in vitro de partes aérea de
Mentha viridis L. constatou que para a comprimento das
plantas, as médias mais superiores foram obtidas nos
tratamentos contendo 1 mg L- 1 de BAP isolado e 2 mg L-1
de BAP em combinação com 0,5 mg L-1 de ANA. No
entanto, estes não diferiram estatisticamente do meio sem
suplementação de reguladores de crescimento, sugerindo
que para redução de custos, estes podem ser utilizados em
baixas concentrações ou até mesmo eliminados do meio
de cultura. Observando os resultados com manjericão
cultivar Maria Bonita e de Mentha viridis comprova-se a
necessidade de estudos específicos para cada espécie.
Não foram avaliadas variáveis relacionadas ao
sistema radicular, pois o único tratamento que apresentou
indução de formação de raízes foi o tratamento sem o
acréscimo de regulador de crescimento (Figura 1). Em
contrapartida, Stella & Braga (2002) relatam que as auxinas
têm efeitos biológicos diferentes no explante, sendo ANA
e AIB mais efetivas na indução de raízes, e 2,4-D na indução
de calos fato este não observado para o manjericão cv.
Maria Bonita. Assim, a utilização de fitorregulador e da
concentração a ser escolhida dependerá da espécie, do
nível endógeno de auxina no explante e da capacidade do
tecido em sintetizar naturalmente a auxina.
Segundo Beduhn (2006), na multiplicação de
Ocimum basicum L., o melhor meio para o cultivo in vitro
desta espécie apresentou apenas ANA como regulador do
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 71-78, 2009
74
ROSADO, L. D. S. et al.
TABELA 1 Média do comprimento das brotações (cm), biomassa aérea fresca e seca (g), biomassa fresca e seca de
calos (g), submetidos aos tratamentos com diferentes concentrações de ANA, BAP (mg L-1).
Tratamento
Tratamento
ANA: BAP
mg L-1
Comprimento
das brotações
(cm)
Biomassa
aérea fresca
(g)
Biomassa
aérea seca
(g)
Biomassa
fresca calos
(g)
Biomassa seca
calos
(g)
T1
0,0 0,0
2,55a
1,32a
0,10a
0,00a
0,00a
T2
0,0 0,1
3,00a
1,20a
0,09a
0,38a
0,04a
T3
0,0 0,5
1,36b
1,16a
0,09a
0,35a
0,07a
T4
0,1 0,0
1,82b
0,91b
0,08c
0,00a
0,00a
T5
0,1 0,1
1,52b
0,85b
0,07c
0,76b
0,04a
T6
0,1 0,5
0,70c
0,53c
0,05b
0,95b
0,06a
T7
0,5 0,0
1,13c
0,91b
0,07c
0,21a
0,01a
T8
0,5 0,1
1,00c
0,37c
0,03d
3,36c
0,23b
T9
0,5 0,5
0,62c
0,24c
0,02d
4,11d
0,24b
*Medias seguidas da mesma letra nas colunas não diferem significativamente entre si a 5% de probabilidade pelo teste
de Scott- Knott.
FIGURA 1 Formação de brotações do manjericão em MS suplementado com os reguladores de crescimento T1 (0,0
ANA e 0,0 BAP); T2 (0,0 ANA e 0,1 BAP); T3 (0,0 ANA e 0,5 BAP); T4 (0,1 ANA e 0,0 BAP); T5 (0,1 ANA e 0,1 BAP); T6
(0,1 ANA e 0,5 BAP); T7 (0,5 ANA e 0,0 BAP); T8 (0,5 ANA e 0,1 BAP) e T9 (0,5 ANA e 0,5 BAP).
crescimento, não havendo, portanto, a necessidade de
BAP. Em relação à multiplicação da cv. Maria Bonita os
melhores resultados foram obtidos na ausência de
reguladores de crescimento.
Em trabalho realizado por Rubin et al. (2007) sobre
multiplicação in vitro de Thymus vulgaris L, concluíram que
baixas concentrações de ANA sem a adição de BAP no meio
de cultivo foi favorável para a multiplicação in vitro de plantas
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 71-78, 2009
Aspectos do cultivo in vitro do manjerição...
de tomilho, proporcionando característica morfológicas
e fisiológicas desejáveis para a sua comercialização.
Em relação ao efeito das diferentes concentrações
de BAP combinadas com ausência de ANA, para biomassa
fresca e seca da parte aérea, doses de 0,1 mg L-1 e 0,5 mg L1
não diferiram estatisticamente do tratamento sem os
reguladores ANA e BAP obtendo-se maiores valores de
biomassa fresca e seca da parte aérea. Para redução de
custos e uma boa formação de brotos, esses reguladores,
podem ser utilizados em baixas concentrações, ou até
mesmo evitados (Tabela 1). Normalmente, os reguladores
de crescimento podem induzir uma má formação de
brotações e induzir a hiperhidratação das mesmas, fato
esse, observado neste experimento. Esse comportamento
também foi observado por Dutra et al. (2004) em trabalhos
de multiplicação in vitro de oliveira (Olea europaea L.),
observaram que a medida em que aumentava a
concentração de BAP, houve redução de biomassa fresca
da parte aérea. Resultado semelhante foi observado por
Silva et al. (2001), relatando que melhores resultados para
o peso da matéria fresca da parte aérea foram obtidos com
plantas cultivadas na ausência de BAP, concluindo que
BAP pode exercer efeitos negativos no crescimento da
parte aérea. Em outro trabalho, Rosal et al. ( 2007),
estudando micropropagação em plantas de Eremanthus
erythropappus (DC.) N.E.F. Macleish concluíram que a
proliferação de brotos foi melhor na presença de BAP e
75
ANA, com 1,0 mg L-1, enquanto que a elongação de brotos
apicais foi obtida apenas em meio contendo 1,0 mg L-1 de
ANA. A elongação de segmentos nodais foi induzida na
presença de 2,0 mg L-1 de ANA.
Com relação à presença de calos, concentrações
de 0,5 mg L-1 de ANA e BAP induziram maior biomassa
fresca no manjericão cv. Maria Bonita; com relação à
biomassa seca dos calos os tratamentos T8 e T9 (Tabela 1)
apresentaram maior biomassa seca, entretanto não diferem
estatisticamente entre si, podendo-se utilizar 0,1 mg L-1 ou
0,5 mg L-1 BAP para o desenvolvimento de calos.
Experimento II: Diferentes doses de 2,4-D na indução de
calos de manjericão (Ocimum basilicum) em explantes
foliares.
De acordo com análise de variância e teste de
regressão, houve diferença significativa entre as
concentrações de 2,4-D. Não houve desenvolvimento de
calos no tratamento sem suplementação dessa auxina (Figura
2 A), evidenciando, com isso, a importância da utilização do
regulador de crescimento para indução da divisão celular e,
consequentemente, para formação de calos para a espécie
em estudo. Observa-se a indução dos calos nas extremidades
e sua proliferação em cima do explante. Os calos
apresentaram consistência firme e uma coloração verde clara
em todos os tratamentos, não sendo observada oxidação ou
necrose. Isso mostra que as células estão viáveis para
continuar a repicagem e o processo de multiplicação (Figura 2).
FIGURA 2 Indução de calos em folhas de manjericão em MS suplementado com diferentes concentrações do
regulador de crescimento (A=0,0; B=0,5; C=1,0 e D=2,0 mg L-1) do ácido 2,4 -D.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 71-78, 2009
76
ROSADO, L. D. S. et al.
O regulador de crescimento 2,4-D aplicado aos
explantes foliares de Ocimum basilicum L cv. Maria Bonita
propiciou a indução de calos. Pereira et al. (2007) também
observaram a necessidade da adição de reguladores de
crescimento para a indução de calogênese em explantes
foliares de Uncaria guianensis J.F. Gmel.
Resultados semelhantes foram obtidos por Gopi &
Ponmurumgan (2006) em experimento com explantes foliares
de Ocimum basilicum L. observando-se que a dose de 0,5
mg L-1 de 2,4-D e a combinação de 0,5 mg L-1 de 2,4-D + 1,0
mg L-1 de BAP proporcionaram maior porcentagem de
indução de calos.
Com relação à biomassa fresca dos calos,
observou-se um aumento de forma quadrática até o ponto
máximo estimado de 2,10 g na concentração de 1,26 mg L-1
de 2,4-D. À partir desse ponto ocorreu uma redução da
biomassa fresca (Figura 3 A). Para a biomassa seca,
observou-se comportamento semelhante, onde houve um
aumento da biomassa seca até o ponto máximo estimado
de 0,31g na concentração de 1,18 mg L-1 de 2,4-D (Figura
3 B).
A diminuição das biomassas fresca e seca dos calos
com a utilização de concentrações elevadas do 2,4-D pode
estar relacionada à fitotoxidez causada por este regulador
de crescimento. Esse comportamento também foi observado
por Santos et al. (2005), estudando a indução de calos friáveis
em explantes foliares de Salix (Salyx humboldtiana Willd).
no qual observaram que na ausência de reguladores de
crescimento não ocorrem a formação de calos friáveis e
quando se acrescenta-se 6,0 mg L-1 de ácido 2,4-D ocorre
uma produção de 90 % de calos friáveis. Segundo Nogueira
et al. (2007), trabalhando com calos de Muri-pequeno
(Byrsonima intermedia A. Juss.) obtiveram melhor resultado
com o uso de meio MS, acrescido de 1,0 mg L-1de 2,4-D.
CONCLUSÕES
Recomenda-se utilizar o meio MS (6 g L-1 de
ágar + 30 g L-1 de sacarose) sem suplementação hormonal
Biomassa fresca (g)
(A)
2
y = -1,1055x + 2,7941x + 0,2924
2
3,00
R = 0,8373
2,00
1,00
0,00
0
0,5
1
1,5
2
-1
2,4-D mg L
Biomassa seca (g)
(B)
2
y = -0,1629x + 0,3858x + 0,0845
2
R = 0,8266
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
0
0,5
1
1,5
2
-1
2,4-D mg L
FIGURA 3
2,4-D.
Biomassa fresca (A) e seca (B) de calos de manjericão a partir de diferentes concentrações de ácido
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 71-78, 2009
Aspectos do cultivo in vitro do manjerição...
para obtenção de plântulas de manjericão cv. Maria bonita
in vitro. O uso de reguladores de crescimento induz a
formação de calos e reduz o crescimento das brotações.
Concentrações entre 1,0 e 1,5 mg L-1 do ácido 2,4-D
são ideais para a obtenção de calos em explantes foliares
de manjericão Ocimum basilicum L. cv. Maria Bonita.
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MAIZE ANDROGENESIS:
IN VITRO
CULTURE
AND MICROSPORE 79
Maize androgenesis:
in vitro culture
and microspore...
DEVELOPMENT IN BRAZILIAN GENOTYPES
ANDROGÊNESE EM MILHO: CULTURA IN VITRO E DESENVOLVIMENTO DOS
MICRÓSPOROS EM GENÓTIPOS BRASILEIROS
ANA PAULA MORAES1, LUANA OLINDA TACUATIÁ2, FERNANDA BERED3,
FERNANDO IRAJÁ FELIX DE CARVALHO4, ELIANE KALCHUK-SANTOS5
1
Mestranda, Programa de Pós graduação em Genética e Biologia Molecular Universidade Federal do Rio Grande de Sul/UFRGS
Av. Bento Gonçalves, 9500, Prédio 43323, Agronomia 91501-970 Porto Alegre, RS [email protected]
2
Graduanda em Ciência Biológica Universidade Federal do Rio Grande de Sul/UFRGS Av. Bento Gonçalves, 9500, Prédio 43323,
Agronomia 91501-970 Porto Alegre, RS [email protected]
3
Dra. em Agronomia, Professora Adjunta Dep. de Genética Universidade Federal do Rio Grande de Sul/UFRGS Av. Bento
Gonçalves, 9500, Prédio 43323, Agronomia 91501-970 Porto Alegre, RS [email protected]
4
Dr. em Agronomia Universidade Federal de Pelotas/UFPel Dep. de Fitotecnia Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel Cx. P.
354 96010-900 Porto Alegre, RS [email protected]
5
Dra. em Genética e Biologia Molecular , Professora Adjunta Dep. de Genética Universidade Federal do Rio Grande de Sul/UFRGS
Av. Bento Gonçalves, 9500, Prédio 43323, Agronomia 91501-970 Porto Alegre, RS [email protected]
RESUMO
No presente estudo, a resposta androgenética de vários
genótipos brasileiros de milho (Zea Mays L.) foi avaliada, em
especial nos aspectos como pré-tratamento, segmentação do
micrósporo e presença e importância de grãos de pólen atípicos.
A origem dos pró-embriões e estruturas embriogênicas foi
analisada citologicamente, visando reconhecer a via de divisão
mitótica, e a homozigose do embrião foi confirmada por meio de
marcadores SSR. Um forte efeito genotípico foi observado com
base nas análises citológicas, contudo os resultados indicam o
pré-tratamento a 4 °C por sete dias como o mais benéfico,
induzindo a formação de pró-embriões com células organizadas
em domínios e estruturas embriogênicas in vitro. Análise dos
grãos de pólen maduros mostrou um claro dimorfismo em todos
os genótipos, com a maior parte destes classificados como normal
e uma pequena parcela classificada como pequeno, fracamente
corado e atrasado no desenvolvimento (grãos de pólen atípicos).
A freqüência destes grãos de pólen atípicos variou
significativamente entre os genótipos, porém não mostrou
nenhuma correlação com aumento da indução androgenética.
Palavras chaves: Duplo-haplóide, cultura de anteras,
embriogênese do micrósporo, pólen P, Zea Mays.
ABSTRACT
In this study the androgenetic, response of several
Brazilian maize (Zea Mays L.) genotypes was analyzed, in special
aspects as pretreatments, microspore segmentation and the
presence and importance of atypical pollen grains. The origin of
pro-embryo and embryo structures was determined by cytological
analysis, aiming to understand which mitotic route was used,
and the embryo homozygosis was confirmed by SSR markers. A
great genotype-dependent response was observed in the
cytological analyses, but results indicated the pretreatment at 4
°C for seven days as more beneficial, inducing pro-embryos with
cells organized in domains and androgenetic embryo structure in
vitro. Analysis of mature pollen grains showed a clear pollen
dimorphism in all genotypes, with the most part being normal
and just a remainder part classified as small, light stained, and
clearly retarded in development (atypical pollen grains). The
frequencies of these atypical pollen grains varied significantly
among genotypes, but they did not show any correlation with
higher androgenetic induction.
Index terms: Double-haploid, anther culture, microspore
embryogenesis, P pollen grain, Zea Mays.
INTRODUCTION
Double-haploid is an important tool to develop
mapping and breeding populations, allowing to work with
smaller population and saving time; as well as in the genetic
transformation, enabling a faster generation of virtually
fully homozygous lines (AULINGER et al., 2003). Most of
the double-haploid populations are obtained by in vitro
induction of microspore embryogenesis, or androgenesis,
based on the deviation from normal gametophytic
development to a sporophytic route (WAN & WIDHOLM,
1992).
The frequency of induced androgenetic
microspores depends on many biotic and abiotic factors,
and varies widely among the grasses; out of them maize
has the lowest androgenetic induction rates. Dieu &
Beckert (1986) evaluated a few basic factors in 94 genotypes
(Recebido em 11 de junho de 2008 e aprovado em 23 de abril de 2009)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 79-86, 2009
80
MORAES, A. P. et al.
and found a strong genotypic effect in all experiments
performed, with only five of these genotypes producing
embryos. Cowen et al. (1992) obtained a mean number of
4.5 embryos for each 100 anthers inoculated, but a great
variation was observed among the genotypes.
A series of stress factors applied in vivo or in vitro
have been identified as responsible in the induction of
sporophytic process (SMYKAL & PECHAN, 2000). Among
them can be cited thermal shock (heat or cold), irradiation,
anti-mitotic agents (colchicine), nitrogen and
carbohydrates starvation, and incubation in manitol
solution (MARDHORST et al., 1997; REYNOLDS, 1997).
In maize, cold pretreatment has already proved to be
beneficial to androgenesis, raising the number of formed
haploid embryos in vitro (OBERT et al., 2000; PESCITELLI
et al., 1990).
For some species, the in vitro androgenetic
response appears to be associated with the presence of a
special class of microspores, known as P-pollen grains .
Several authors reported the occurrence of this class of
microspores in different species (CALIC et al., 2003;
GUZMÁN & ARIAS, 2000; KALTCHUK-SANTOS et al.,
1993) and they consider that these microspores would be
potentially embryogenic, since they are predetermined to
follow the androgenetic route.
In our study, an extensive experiment was carried
out on a range of Brazilian maize genotypes to evaluate
their response to anther culture. For this purpose, the
androgenetic response to cold thermal shock was evaluated
by quantification of the embryogenic structures formed in
vitro, as well as by the segmentation of the microspores
and the formation of multinucleated/cellular pro-embryos.
The relationship between the presence of P-pollen grain
and the androgenetic response in vitro was also evaluated.
MATERIAL AND METHODS
Fifteen Brazilian maize genotypes (Table 1) were
grown under field conditions at Faculdade de Agronomia/
UFRGS. The used tassels were selected based on
morphological criteria according to Chang & Neuffer (1989).
The maize tassels were submitted to two different
cold pretreatment: 4 °C for seven days or 10 C for 14
days, in the dark in wet boxes. The tassels were disinfested
in NaOCl 0.5%, with a drop of Tween, during 15 minutes
and washed three times in sterile distilled water. The
excised anthers were selected according to their color
(light yellow) and size in relation to the spikelet. The
anthers were inoculated in Petri plates with induction
medium YP (KU et al., 1978) supplemented with 7.7 mg l-1 of
glycine, 0.25 mg l-1 of thiamine-HCl, 0.25 mg l-1 of
pirodoxine-HCl, 1.3 mg l-1 of nicotinic acid, 0.25 mg l-1 of
pantetonate, 500 mg l-1 of hydrolysed casein, 2.5 g l-1 of
phytagel , 2 mg l-1 of 2,4-D, 1.5 mg l-1 of BA, 90 g l-1 of
sucrose and 5 g l-1 of activated coal, pH 5.8. Petri dishes
were maintained in the darkness in a growth-chamber at
25 °C for four weeks and, afterwards, exposed to a 16 h
light photoperiod provided by fluorescent illumination
(22.5 molm-2s-1).
A total of 5040 anthers were inoculated in this study.
The experiment was randomized, with two treatments (five
replications per treatment) with the experimental unit
consisted of a Petri dish containing 72 anthers. The
embryos formed were transferred to regeneration medium
constituted by the basal salts of the YP, 2.5% sucrose,
0.25% of phytagel , 1 mg/L de AIA, pH 5.8 (BÜTER et al.,
1991).
The origin of the formed structures in vitro was
analyzed by Simple Sequence Repeats (SSR). The DNA
was extracted according to Doyle & Doyle (1990) and
submitted to amplification according to Liu et al. (1996),
using the microsatellite primer ucm1331. The PCR products
were evaluated in 6% polyacrylamide gel stained with silver
nitrate.
Five anthers from each plate were collected at the
time of inoculation, at seven and 14 days, for cytological
analysis. The material was fixed at 3:1 (absolute alcohol:
glacial acetic acid, v:v) and stored at -20 °C. The anthers
were macerated in 6% propionic carmine and the slides
were analyzed under a Zeiss Axioplan Universal
photomicroscope.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 79-86, 2009
Maize androgenesis: in vitro culture and microspore...
Fifteen mature tassels from three adults plants of
five maize genotypes (AS 3601, De Kalb 205, De Kalb XL
330, Pioneer 3063, and Pioneer 32R21) were fixed and used
to analyze pollen dimorphism. The microspore dimorphism
was evaluated by counting the number of normal and
atypical pollen grains in a total slide sample. For each plant,
100 normal and 100 atypical pollen grains had their polar
diameter measured using measurement eyepieces. The
presence of this class of pollen was compared to the in
vitro response of the cultivars. Statistical analyses were
performed by non-parametrical Kruskal-Wallis test and
Dunn test, at a 5% probability level.
RESULTS AND DISCUSSION
Cytological analyses
This study shows an important set of data for the
initial design of the anther culture protocol for a group of
81
Brazilian maize genotypes, presenting an unknown
androgenetic capacity. At the moment of anther
inoculation, 97.58% of the microspores were at initial
uninucleated stage, a phase considered ideal for
androgenetic induction, ensuring the best results from in
vitro culture. The two cold pretreatments used, 4 °C for
seven days and 10 °C for 14 days, were evaluated for
frequency of asymmetrical x symmetrical first mitotic
division and multinuclear/multicelular structures observed
on cytological analysis.
The symmetrical binucleated pollen grains (Figure
1a) were observed after seven days of in vitro culture in
both pretreatments, showing a reduction after 14 days in
vitro (Table 1). The greatest frequency of symmetrical
binucleated pollen grains occurred in Pioneer 3063 and
Pioneer 30F33 genotypes, from material pretreated at 4 °C
for seven days, while the De Kalb 205, De Kalb 747, Pioneer
FIGURE 1 Cytological analysis of maize androgenesis. (a) Symmetrical pollen grain. (b) Pro-embryo with four nuclei
derived from vegetative nuclei. (c) Pro-embryo with four nuclei, two derived from vegetative nuclei and two from
generative nuclei. (d) Multinuclear pro-embryo. (e) Multicellular pro-embrioid. (f) Multicellular pro-embryo with domains.
(g) Mature pollen grains and two atypical pollen grains. (h) Atypical pollen grain with two asymmetrical nuclei. (i)
Atypical pollen grain with two equal nuclei. Arrows in (f) indicated the two formed domains in the pro-embryo. Letters
in (c) indicated the derived vegetative nuclei [V] and generative nuclei [G]. Bars = 10 m.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 79-86, 2009
82
MORAES, A. P. et al.
TABLE 1
Mean number symmetrical binucleated and multinucleated/cellular pollen grains per genotype per
pretreatment.
Symmetrical binucleated pollen grains
Genotypes
4 C by 7 days
10 C by 14 days
Pro-embryo multinuclear/cellular
4 C by 7 days
10 C by 14 days
7 days
14 days
7 days
14 days
7 days
14 days
7 days
14 days
AG 1051
0
0
0
0
0
1
0
0
AG 9014
0
0
0
1
2
1
0
2
AS 32
0
0
0
0
0
5
0
0
AS 3601
0
0
0
0
0
0
0
0
C 107
0
0
0
0
0
0
0
0
De Kalb 205
5
4
16
1
4
13
3
1
De Kalb 747
0
1
11
9
0
0
0
1
De Kalb XL 221
0
0
0
0
0
0
0
1
De Kalb XL 330
0
0
0
0
0
0
0
1
Flash
1
0
1
1
10*
25*
0
0
NB 7390
0
0
0
0
0
0
0
0
Pioneer 3063
18
9
4
0
15
17
4
9
Pioneer 30R07
2
0
10
0
9
4
32
1
Pioneer 30F33
18
0
4
0
2
0
2
7
Pioneer 32R21
2
1
0
0
1
9
0
10
* Indicates the presence of pro-embryos multicellular.
30R07 genotypes presented a higher frequency of
symmetrical binucleates after pretreatment at 10 °C for 14
days (Table 1). Unfortunately, these higher frequencies of
symmetrical pollen grains were concentrated in just one slide
in each genotype, without symmetrical pollen grains in the
other four slides analyzed. In this way, the increment in the
induction rate did not represent a real improvement in all
anthers in vitro. Although, the low frequency of symmetrical
pollen grains is in agreement with described in the literature
were the observation about the androgenetic routes in maize
indicates the successive mitosis of vegetative cells, after
the first asymmetrical mitosis, as the mainly route to the proembryo formation (PESCITELLI & PETOLINO, 1988).
The formation of multinuclear/multicelular
structures, called from here as pro-embryo, was restricted
to a few genotypes, as detected in the symmetrical pollen
grains, with 118 structures formed from material pretreated
at 4 °C and 74 structures formed on the second pretreatment.
The higher frequency was observed in Flash and Pioneer
30R07 , followed by De Kalb 205 and Pioneer 3063 (Table
1). The data suggested that these structures have risen,
preferentially, by successive mitosis of vegetative cells
after the first asymmetrical division (Figure 1b), since those
genotypes with higher frequencies of symmetricalbinucleate pollen not necessary presented higher proembryos frequencies. In some cases, multinucleated grains
were formed by the mitoses of both cells, vegetative and
generative (Figure 1c-e). Our data are in agreement to that
obtained by other authors (PESCITELLI & PETOLINO,
1988; PETROVA et al., 1992), confirming the asymmetrical
division as the preferential microspore segmentation route,
with sequential mitosis of the vegetative cell.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 79-86, 2009
Maize androgenesis: in vitro culture and microspore...
The importance of low temperature in the in vitro
culture could be explained by the instability caused on
microspore development, which can lead to the embryos
formation (OLESZCZUK et al., 2006). This positive effect
of cold pretreatments is believed to be due to the changes
in the gene expression of the in vitro microspores.
According to Reynolds (1997) the cold pretreatments favor
the occurrence of cycle arrest during incubation, causing
a reorganization of the cytoplasm and cytoskeleton. In
this way, the set of transcribed genes responsible for the
gametophytic route is silenced, favoring the sporophytic
route and the formation of haploid embryos. Cold treatment
has been routinely used, improving the androgenic
response of microspores in many cereals (LANTOS et al.,
2005).
The cytological analysis data was very
representative about the androgenetic development of the
microspores. The only genotype with embryo formation,
Flash , was the only one that presented the multicellular
structures with domain formation, i.e. differentiated cells
regions inside the multicellular structure (Figure 1e-f). The
best results in this genotype were obtained in the pretreated
material at 4 °C for seven days.
The presence of differentiated regions in
these pro-embryos was previously described by Ramírez
et al. (2001) and Testillano et al. (2002), both based on
histological sections in maize and barley. These authors
suggested that those regions, or domains, are associated
to the differential expression of genes involved with
83
endosperm and embryo formation, and the beginning of
the androgenetic development is characterized by the
formation of a multinuclear domain, linked to the
endosperm (also multinuclear at the beginning of its
development), and a multicellular domain, linked to the
embryo properly. Thus, the multicellular structures present
homology with the embryo and are probably those whose
advances in their development, generating the haploid
embryos. Electron microscopy analyses in Capsicum
showed that the pro-embryo cells are not identical,
presenting smaller external cells with thin cell walls, and a
different kind of cells inside, corroborating the hypothesis
of differentiated domains (BÁRÁNY et al., 2005).
In vitro culture
All the macroscopic embryogenic structures were
formed from Flash anthers pretreated at 4 °C for seven
days (Figure 2a-b), although no embryo reached the
seedling phase. The origin of the only well formed embryo
was analyzed by SSR, using the primer ucm1331, which
amplified two loci and was useful to distinguish
homozygote and heterozygote. The donor plant was
heterozygote to this locus
presenting two bands, while
the embryo was homozygote
showing just one band,
confirming its androgenetic origin (Figure 2c). This
approach has been used successfully in many studies to
evaluate the origin of embryogenic structures in culture,
as described by Aulinger et al. (2003) in maize and Song et
al. (2007) in Cucumber.
FIGURE 2 In vitro and SSR analyses of maize androgenesis. (a) Anthers in vitro with an embryo. (b) Haploid embryo
in vitro. (c) SSR gel. Arrows in (a) show the callus inside the anther, and arrows in (c) show the two SSR alleles (mother
plant) and one SSR allele (embryo).
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 79-86, 2009
84
MORAES, A. P. et al.
Atypical pollen analysis
In this study around 580,000 pollen grains were
examined to evaluate the occurrence of pollen dimorphism
in maize and if they could be classified as P-pollen grain, a
kind of pollen grains that stained very lightly, had late
development, were smaller and results in an improvement in
the androgenetic process. The cytological analysis showed
the existence of a class of atypical pollen grains in all
represent any improvement to androgenetic process.
Petolino et al. (1988) also observed the occurrence of an
abnormal microspores class in mature maize anthers which
were not related to an in vitro androgenetic response.
These atypical pollen grains abserved here should
represent inviavel pollen grains, representing a class of
abortive pollen grains, explaining why they had a negative
influence on the embryogenic development.
genotypes analyzed, that was smaller than the normal pollen
CONCLUSION
grains, with mean diameter of 65.17 and 83.88 m, respectively
Although the rates of androgenetic induction
obtained in the present study were low, it could be
suggested, based on the cytological and in vitro analysis,
that pretreatment at 4 °C for seven days was beneficial to
the induction of pro-embryos. The cytological data showed
that only the material incubated at 4 °C for seven days
presents pro-embryos with cells organized in two domains,
and not only nuclei, and all embryogenic structures formed
in vitro were induced in anther from this pretreatment.
The atypical pollen grains found in maize did not presented
any androgenetic capacity, as referred in others species,
(p<0.05, Figure 1g) and usually divided asymmetrically
(Figure 1h), although sometimes symmetrical division was
observed, typical of embryogenic pollen (Figure 1i).
The frequency of these atypical pollen grains
differs among genotypes, with De Kalb 205 presenting the
highest frequency, followed by Pioneer 32R21 (Table 2).
The presence of these atypical pollen grains was evaluated
in relation to the multinuclear/multicellular structures
formed, but a negative correlation was found (r=-0.6),
suggesting that they are not a P-pollen grain, but an
unviable pollen grains harmful to the embryogenic
development in vitro.
In this way, despite the atypical pollen grains
observed here presents all characteristics of a P-pollen
grain (lightly stained, late development, and smaller size),
they cannot be classified as P-pollen, since they did not
TABLE 2 Pollen grain measurements. Frequency and
polar diameter in normal and atypical pollen grains in five
genotypes analyzed.
Genotypes
P pollen frequency
(%)
AS 3601
De Kalb 205
0.98a
1.25a
De Kalb XL 330
0.95a
Pioneer 3063
0.30b
Pioneer 32R21
1.06a
*Means followed by the same letter are not significantly
different (p<0,05).
and could not be classified as P-pollen. In summary, the
pretreatment at 4 °C for seven days and the use of genotype
Flash seems to give better results, and should be helpful
in future studies, aiming to increase the frequency of
androgenetic embryos in Brazilian maize genotypes.
ACKNOWLEDGMENTS
This research was supported by Conselho Nacional
de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CNPq.
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pH, CARVÃO ATIVADO
E ativado
AGENTES
GELEIFICANTES DO MEIO
pH, carvão
e agentes geleificantes...
DE CULTURA NO CRESCIMENTO IN VITRO DE
Miltonia flavescens LINDL.
87
pH, ACTIVATED CHARCOAL AND GELLING AGENTS OF THE CULTURE MEDIUM
ON THE IN VITRO GROWTH OF Miltonia flavescens LINDL.
PATRÍCIA INÊS CHAPLA1, JEAN CARLOS FERNANDO BESSON2, LANA KARINA OLIVEIRA3,
JAQUELINE MANZATTI DA SILVA4, ANDRESSA CAMILO DE SOUZA ROCHA5, SUZANA STEFANELLO6
1
Bióloga, mestranda do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Aplicada a Agricultura Universidade Paranaense Av. Parigot
de Souza, 3636 85903-170 Toledo, PR [email protected]
2
Graduando em Ciências Biológicas Universidade Paranaense Av. Parigot de Souza, 3636 85903-170 Toledo, PR
[email protected];
3
Graduanda em Ciências Biológicas Universidade Paranaense Av. Parigot de Souza, 3636 85903-170 Toledo, PR
[email protected];
4
Graduanda em Ciências Biológicas Universidade Paranaense Av. Parigot de Souza, 3636 85903-170 Toledo, PR
[email protected];
5
Graduanda em Ciências Biológicas Universidade Paranaense Av. Parigot de Souza, 3636 85903-170 Toledo, PR
[email protected]
6
Bióloga, D.Sc., Professora Universidade Paranaense Av. Parigot de Souza, 3636 85903-170 Toledo, PR [email protected]
RESUMO
As orquídeas são plantas muito apreciadas pela beleza
de suas flores e pelo seu valor comercial. Muitas espécies
brasileiras estão ameaçadas de extinção em razão da devastação
de seus habitats naturais e a coleta indiscriminada. Neste
trabalho, objetivou-se avaliar o efeito de diferentes concentrações
de carvão, níveis de pH e agentes geleificantes no crescimento
in vitro de Miltonia flavescens Lind.. Foram realizados dois
experimentos. O primeiro, utilizando como explantes
protocormos com um ano de idade, obtidos por meio da
semeadura in vitro e inoculados em meio de cultura MS/2
suplementado com diferentes concentrações de carvão ativado
(0, 1 e 2 g L-1) e pH ajustado para 5,2 e 5,8. O segundo, com
plântulas com dois anos de idade obtidas por meio da semeadura
in vitro e inoculados em meio de cultura MS/2 suplementado
com Ágar e Phytagel®, tendo o pH ajustado para 5,2 e 5,8. As
culturas permaneceram por seis meses na sala de crescimento
sendo então avaliadas. A adição de 1 e 2 g L-1 de carvão ativado
ao meio de cultura apresentou efeito benéfico e significativo
sobre a altura da parte aérea, porém maior enraizamento foi
obtido na ausência de carvão em pH 5,2. As plântulas de Miltonia
flavescens apresentaram maior crescimento in vitro em meio de
cultura MS/2 suplementado com Phytagel® e em pH 5,8.
of activated charcoal, pH levels and gelling agents on the in
vitro growth of Miltonia flavescens. Two experimental assays
were carried out. The first assay used one-year-old protocorms
as explants. Protocorms derived from in vitro seeding were
inoculated into MS/2 medium supplemented with different
concentrations of activated charcoal (0, 1 and 2 g L-1), and pH
adjusted to 5.2 and 5.8. The second assay used two-year-old
seedlings derived from in vitro seeding and inoculated into
MS/2 medium supplemented with Agar and Phytagel®, with
pH adjusted to 5.2 and 5.8. Cultures were maintained in growth
room for six months. Addition of 1 and 2 g L-1 activated charcoal
to the medium had significant and beneficial effect on shoot
height, with higher rooting obtained in the absence of charcoal
at pH 5.2. Miltonia flavescens seedlings showed higher in
vitro growth in MS/2 medium supplemented with Phytagel®
at pH 5.8.
Termos para indexação: Orquídeas, cultura in vitro, meio de
cultivo, Miltonia flavescens.
beleza de suas flores e pelo seu alto valor comercial. Porém,
ABSTRACT
Orchids are very appreciated due to the beauty of its
flowers and commercial value. In Brazil, many native species
including Miltonia flavescens Lind., are threatened with
extinction by forest devastation and predatory collection. In
this work, we evaluated the effect of different concentrations
em razão da devastação de seus habitats naturais e a coleta
Index terms: Orchid, in vitro culture, culture medium, Miltonia
flavescens.
INTRODUÇÃO
As orquídeas são plantas muito apreciadas pela
muitas espécies brasileiras estão ameaçadas de extinção
indiscriminada. Dentre estas espécies encontra-se a
Miltonia flavescens Lindl., uma orquídea nativa do sul do
Brasil e do Paraguai (IMES, 1997).
(Recebido em 24 de dezembro de 2008 e aprovado em 29 de maio de 2009)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 87-93, 2009
88
CHAPLA, P. I. et al.
A cultura de tecidos tem sido uma ferramenta
biotecnológica amplamente utilizada para a propagação
de plantas ornamentais, pois apresenta vantagens sobre
os métodos convencionais de propagação, como
multiplicação rápida e obtenção de grande número de
plantas com alta qualidade genética e fitossanitária
(PASQUAL et al., 2008), sendo indicada para suprir a
demanda do mercado e ainda minimizar as coletas
predatórias de orquídeas.
O sucesso na aplicação desta técnica depende de
uma série de fatores que necessitam ser controlados
adequadamente durante o processo (COSTA et al., 2007).
Neste sentido, o crescimento e a morfogênese de células e
tecidos in vitro são regulados pela interação e pelo balanço
entre as substâncias adicionadas ao meio de cultura e por
aquelas produzidas de forma endógena nas células.
Diante do exposto, a adição de compostos, como
carvão ativado ao meio de cultura, tem sido benéfica no
cultivo in vitro de algumas espécies de orquídeas
(ARAÚJO et al., 2006; FRÁGUAS et al., 2003; SHI et al.,
2000). O carvão ativado tem sido utilizado para estimular o
enraizamentoem razão da sua alta capacidade de excluir a
luz do meio e diminuir a oxidação das culturas pela presença
de fenóis produzidos pelos próprios tecidos (GEORGE &
RAVISHANKAR, 1997).
Da mesma forma, a seleção do agente geleificante
também é fundamental no cultivo in vitro, pois o meio de
cultura deve ser firme o suficiente para suportar as plantas
sem ser rígido demais para inibir a difusão de água e
nutrientes (CID, 2001).
O Ágar é um tipo de agente geleificante de
natureza polissacarídica produzido por algas (Gelidium
amansii) que tem sido tradicionalmente empregado na
preparação de meios de cultura semi-sólidos (GEORGE,
1993). Um agente geleificante alternativo que vem sendo
usado é o Phytagel® (Sigma), um heteropolissacarídeo
produzido pela bactéria Pseudomonas elodea (GEORGE,
1993). Seu custo por litro de meio é menor em virtude da
menor quantidade utilizada (2,5 g L-1), além de ser mais
puro que o Ágar (GEORGE, 1993).
Outro importante fator é o pH, que segundo Leifert
et al. (1992), seu efeito nos meios nutritivos in vitro tem
merecido atenção especial dos pesquisadores por sua
atuação direta sobre a disponibilidade de nutrientes nele
contidos. Meios de cultura levemente ácidos têm
favorecido o desenvolvimento de orquídeas (ARDITTI,
1977).
Sendo assim, conduziu-se este trabalho, com o
objetivo de avaliar o efeito de diferentes concentrações de
carvão ativado, níveis de pH e agentes geleificantes no
crescimento in vitro de Miltonia flavescens Lindl.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram realizados dois experimentos, um para
verificar o efeito do pH do meio de cultura associado a
diferentes concentrações de carvão ativado e outro para
avaliar o pH e dois agentes geleificantes no crescimento
in vitro.
Em ambos os experimentos, as culturas foram
mantidas em sala de crescimento a 25 ± 2ºC, com
fotoperíodo de 16 horas, sob irradiância de 40 molm-2s-1
fornecida por lâmpadas fluorescentes brancas (20W,
Osram, Brazil).
Efeito do pH e da concentração de carvão ativado no
crescimento in vitro
Os protocormos utilizados como explantes para este
experimento foram obtidos por semeadura in vitro em meio
de cultura MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) com metade
da concentração de sais (MS/2), suplementado com
sacarose (30 g L-1), vitaminas do MS, ágar (6,5 g L-1), sendo
metade deles cultivados no meio de cultura com pH
ajustado para 5,2 e outra metade para pH 5,8.
Os protocormos, após um ano de cultivo nestas
condições e apresentando tamanho aproximado de 0,3 ±
0,1 cm, foram inoculados em frascos de vidro (capacidade
250 mL) contendo 50 mL de meio de cultura MS/2,
suplementado com sacarose (30 g L-1), vitaminas do MS,
ágar (6,5 g L-1) e três concentrações de carvão ativado (0,
1 e 2 g L-1) combinadas com dois níveis de pH (5,2 e 5,8),
totalizando seis tratamentos.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 87-93, 2009
pH, carvão ativado e agentes geleificantes...
Os protocormos foram inoculados assepticamente
em câmara de fluxo laminar, tomando-se o cuidado de
inoculá-los no mesmo pH em que foram germinados. Após
a inoculação, os frascos de vidro foram vedados com
plástico PVC e então incubados em sala de crescimento.
O delineamento experimental utilizado foi
inteiramente casualizado, em esquema fatorial (três
concentrações de carvão ativado e dois níveis de pH),
com cinco repetições. A unidade experimental consistiu de
um frasco com dez explantes, totalizando 50 protocormos
por tratamento. As plantas permaneceram durante 6 meses
em cultivo, sendo realizado um subcultivo a cada dois
meses onde as plantas foram transferidas para um meio de
cultura com as mesmas concentrações de carvão e níveis
de pH. Após este período, foi efetuada a avaliação das
variáveis: altura da parte aérea, número de raízes,
comprimento da maior raiz, número de folhas e o peso da
matéria fresca.
Efeito do pH e de agentes geleificantes no crescimento in
vitro
Como explantes foram utilizadas plântulas com dois
anos de idade e aproximadamente 1,5 ± 0,2 cm obtidas a
partir da germinação in vitro em meio de cultura MS/2,
acrescido de sacarose (30 g L-1), vitaminas do MS, ágar
(6,5 g L-1) e pH ajustado para 5,8 antes da autoclavagem.
As plântulas foram inoculadas em frascos contendo
50 mL de meio de cultura MS/2, sacarose (30 g L-1),
vitaminas do MS, suplementados com ágar (6,5 g L-1) e
Phytagel® (2,6 g L-1) e com pH ajustado para 5,2 e 5,8,
totalizando 4 tratamentos. O pH foi ajustado utilizando
hidróxido de sódio (NaOH) ou ácido clorídrico (HCl) a 1N,
antes da adição dos agentes geleificantes.
O delineamento experimental foi inteiramente
casualizado, em esquema fatorial (dois agentes
geleificantes e dois níveis de pH), com seis repetições. A
unidade experimental consistiu de um frasco contendo oito
explantes, totalizando 48 plântulas por tratamento. Após
seis meses de crescimento in vitro, com um subcultivo a
cada dois meses, procedeu-se a avaliação das seguintes
variáveis: altura da parte aérea (cm), número de folhas,
89
número de raízes, comprimento da maior raiz (cm) e peso
da matéria fresca (g).
Os dados coletados em ambos os experimentos
foram submetidos à análise de variância, utilizando o
programa estatístico Sisvar (FERREIRA, 1999) e a
comparação de médias por meio do teste de Scott-Knott a
5% de significância.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Efeito do pH e da concentração de carvão ativado no
crescimento in vitro
Após seis meses de cultivo in vitro, foi verificado
efeito significativo das concentrações de carvão ativado
sobre a altura da parte aérea e comprimento da maior raiz.
Com relação aos níveis de pH empregados foram
encontradas diferenças significativas para o número de
folhas e número de raízes, em todas as concentrações de
carvão ativado testadas. O peso da matéria fresca não foi
afetado significativamente pela adição de carvão ativado
nem pelos níveis de pH (Tabela 1).
Foi observado maior desenvolvimento da parte
aérea quando os protocormos foram cultivados em meio
de cultura MS/2 suplementado com 1 e 2 g L-1 de carvão
ativado, evidenciando o efeito benéfico desse componente.
Resultados similares foram obtidos por Morales et al. (2006)
que relataram o efeito promotor do carvão ativado (5 g L-1)
no desenvolvimento da parte aérea de Catasetum
fimbriatum Lindl. & Paxton Faria et al. (2002) também
verificaram que a adição de 2 g L-1 de carvão ativado ao
meio de cultura foi benéfica para a propagação in vitro de
Cattleya walkeriana Gardner.
Em trabalho realizado por Murdad et al. (2006) com
orquídeas Phalaenopsis gigantea J.J.Sm., a suplementação
do meio de cultura com 2,5 g L-1 de carvão ativado mostrou
efeito positivo sobre o crescimento e promoveu a formação
de novos protocormos sobre os protocormos inicialmente
inoculados. De acordo com Grattapaglia & Machado (1998),
o carvão ativado em concentrações de 0,1 a 2% pode ser
benéfico em alguns casos. Fisicamente, ele simula a
condição de escuro, no qual as raízes normalmente se
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 87-93, 2009
90
CHAPLA, P. I. et al.
TABELA 1 Valores médios da altura da parte aérea (APA), comprimento da maior raiz (CR), número de raízes (NR)
número de folhas (NF) e peso da matéria fresca (PF) de protocormos de M. flavescens após 180 dias de cultivo, em meio
de cultura MS/2 com diferentes concentrações de carvão ativado e níveis de pH.
Carvão ativado ( g L-1)
0
1
2
pH 5,2
0,27 Ab
0,38 Aa
0,40 Aa
pH 5,8
0,21 Ab
0,44 Aa
0,29 Aa
pH 5,2
0,24 Aa
0,11 Ab
0,14 Ab
pH 5,8
0,16 Aa
0,10 Ab
0,10 Ab
pH 5,2
1,24 Aa
1,27 Aa
1,48 Aa
pH 5,8
0,80 Ba
0,90 Ba
0,50 Ba
pH 5,2
2,80 Aa
3,20 Aa
2,86 Aa
pH 5,8
2,05 Ba
2,16 Ba
2,20 Ba
0,0052 Aa
0,0126 Aa
0,0122 Aa
APA (cm)
CR (cm)
NR
NF
PF (g)
pH 5,2
pH 5,8
0,0030 Aa
0,0065 Aa
0,0237 Aa
Médias seguidas da mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem entre si pelo teste de SkottKnott a 5% de probabilidade.
desenvolvem melhor. Quimicamente, o carvão ativado tem
efeito de adsorção de substâncias inibitórias produzidas
pelo explante ou pelo meio e liberação de substâncias
naturalmente presentes no carvão que beneficiariam o
crescimento das culturas in vitro (PAN & STADEN, 1998).
O carvão ativado não é um regulador de crescimento, mas
modifica a composição do meio e, por isso, em algumas
circunstâncias, melhora ou regula o crescimento da planta
in vitro (PASQUAL et al., 1997).
Considerando a variável comprimento da maior raiz,
o maior valor (0,24 cm) foi obtido na ausência de carvão
ativado em pH 5,2. Trabalhos anteriores realizados por
Müller et al. (2007) com M. flavescens revelaram que a
suplementação do meio de cultura MS/2 com 1,5 e 3 g L-1
de carvão ativado não teve efeito significativo sobre o
crescimento das plântulas, nem diferiu do meio isento de
carvão ativado. Segundo Grattapaglia & Machado (1998),
o tipo do sistema radicular obtido no enraizamento in vitro
determina o sucesso do transplante, sendo as raízes mais
curtas as mais adequadas, pois apresentam-se em fase de
crescimento ativo, facilitando a aclimatização da planta.
Quanto ao número de raízes por plântula, não houve
diferença significativa entre os tratamentos com carvão
(Tabela 1). Esses resultados corroboram com os obtidos
por Faria et al. (2002) que também não encontraram
diferenças quanto ao número de raízes de Cattleya
walkeriana cultivadas por 210 dias em meio de cultura
MS/2 com 0, 1 e 2 g L-1 de carvão.
Os meios de cultura com pH 5,2 foram
significativamente diferentes daqueles com pH 5,8, pois
permitiram a formação de maior número de raízes e folhas,
independente das concentrações de carvão, as quais não
apresentaram diferença significativa (Tabela 1). De modo
similar, Teixeira da Silva et al. (2006), estudando orquídeas
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 87-93, 2009
pH, carvão ativado e agentes geleificantes...
91
de gênero Cymbidium, verificaram que o pH 5,3 mostrouse superior ao 6,3 no número de folhas e raízes.
Segundo Pierik (1987), para um crescimento
adequado da maioria das espécies, a faixa de 5 a 6,5 revela
o melhor ajuste de pH. A variação de pH no meio de cultura
pode ser decorrência da absorção diferencial do amônio e
do nitrato (SINGHA et al., 1987). Durante o crescimento
das células, o pH do meio de cultura se altera à medida que
diferentes íons são absorvidos e os produtos metabólicos
são excretados para o meio. O processo de autoclavagem
e a estocagem também acidificam os meios de cultura
(SKIRVIN et al., 1986).
analisadas e os melhores resultados foram obtidos com
Efeito do pH e de agentes geleificantes no crescimento in
vitro
sódio, cálcio e magnésio e está livre de impurezas orgânicas
Verificou-se a existência de diferença significativa
entre os agentes geleificantes para todas as variáveis
O ajuste do pH para 5,2 e 5,8 não interferiu
utilização do Phytagel®, cuja presença no meio de cultura
promoveu maior crescimento in vitro (Tabela 2).
Matos & Droste (2005) também verificaram que o
Phytagel® mostrou-se superior ao Ágar levando a um
maior número de brotos produzidos por plântula de Vriesea
gigantea Mez (Bromeliaceae). Amaral et al. (2007) sugerem
a suplementação dos meios de cultura com Phytagel®,
pois além de facilitar a difusão dos nutrientes disponíveis
às culturas, promove divisões celulares, a morfogênese e
o crescimento in vitro. George (1993) relata que o
Phytagel® contém quantidades significativas de potássio,
encontradas no Ágar.
significativamente em nenhuma variável quando o meio
TABELA 2 Altura da parte aérea (APA), comprimento da maior raiz (CR), número de raízes (NR) número de folhas (NF)
e peso da matéria fresca (PF) de plântulas de M. flavescens após 180 dias de cultivo com diferentes agentes geleificantes
e níveis de pH.
Agentes geleificantes
Ágar
Phytagel®
pH 5,2
1,79 Ab
3,82 Ba
pH 5,8
2,26 Ab
5,10 Aa
pH 5,2
1,06 Ab
5,84 Aa
pH 5,8
0,68 Ab
4,22 Ba
pH 5,2
3,37 Ab
14,42 Aa
pH 5,8
2,73 Ab
17,25 Aa
pH 5,2
7,95 Aa
7,23 Ba
pH 5,8
8,39 Ab
11,66 Aa
pH 5,2
0,08 Ab
0,36 Ba
pH 5,8
0,13 Ab
0,75 Aa
APA (cm)
CR (cm)
NR
NF
PF (g)
Médias seguidas da mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem entre si pelo teste de SkottKnott a 5% de probabilidade.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 87-93, 2009
92
CHAPLA, P. I. et al.
de cultura foi suplementado com Ágar, porém na presença
de Phytagel® não foi detectada diferença significativa
apenas para o número de raízes por plântula (Tabela 2).
Para as variáveis altura da parte aérea, número de folhas e
peso da matéria fresca os maiores valores foram obtidos
em pH 5,8.
Efeitos negativos da utilização do Phytagel (0,17%)
foram relatados por Te-Chato et al. (2005) na formação de
brotações de mangostin (Garcinia mangostana L.)
cultivadas em meio de cultura MS. Os autores verificaram
que o Phytagel estimulou a formação de calos, porém as
brotações apresentaram hiperidricidade (vitrificação) e
suas folhas possuíam estômatos malformados e diminuição
do conteúdo de clorofila.
CONCLUSÕES
A adição do carvão ativado ao meio de cultura MS/
2 com pH ajustado para 5,2 influencia positivamente o
crescimento de protocormos de Miltonia flavescens. As
plântulas de Miltonia flavescens apresentam maior
crescimento in vitro em meio de cultura suplementado com
Phytagel® e em pH 5,8.
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Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 87-93, 2009
94
RESPOSTA DE CALOS EMBRIOGÊNICOS
DE CANA-DE-AÇÚCAR
GOMES, I. A. et al.
(Saccharum officinarum L.) A DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE
CLORETO DE SÓDIO
RESPONSE OF SUGARCANE (Saccharum officinarum L.) EMBRYOGENIC CALLUS TO
DIFFERENT CONCENTRATIONS OF SODIUM CHLORIDE
ISABELE ARAGÃO GOMES1, CIBELLEY VANUCIA SANTANA DANTAS ²,
MARIA TEREZA FRANCO MARQUES 3, CRISTIANE ELIZABETH COSTA MACEDO 4
1
Estudantes do curso de Ciência Biológicas Universidade Federal do Rio Grande do Norte/UFRN Centro de Biociências
Departamento de Biologia Celular e Genética
Campos Universitário, Lagoa Nova, s/n
59072970
Natal, RN
[email protected],
2
Estudante do curso de Ciência Biológicas Universidade Federal do Rio Grande do Norte/UFRN Centro de Biociências
Departamento de Biologia Celular e Genética Campos Universitário, Lagoa Nova, s/n
59072970
Natal, RN
[email protected]
3
Estudantes do curso de Ciência Biológicas Universidade Federal do Rio Grande do Norte/UFRN Centro de Biociências
Departamento de Biologia Celular e Genética Campos Universitário, Lagoa Nova, s/n 59072970 Natal, RN
4
Profª. Dra. do Departamento de Biologia Celular e Universidade Federal do Rio Grande do Norte/UFRN Centro de Biociências
Departamento de Biologia Celular e Genética Campos Universitário, Lagoa Nova, s/n 59072970
Natal, RN
[email protected]
RESUMO
A salinidade interfere drasticamente no crescimento e na
produtividade de espécies glicófitas de grande valor econômico
como a cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.). Neste
trabalho, objetivou-se determinar a dose resposta ao NaCl de
calos embriogênicos de duas variedades (SP 813250 e RB 72454)
de cana-de-açúcar. Calos foram inoculados em meio básico,
composto pelos macro e micronutrientes do MS, na ausência
(controle) e presença de diferentes concentrações (50; 100; 200
mM) de cloreto de sódio (NaCl) durante 15 dias. Após este
período, características qualitativas tais como aspecto (compacto
ou friável) e coloração (translúcido ou amarelado) dos calos foram
avaliadas. Em seguida, os calos foram transferidos para o mesmo
meio descrito acima sem adição do NaCl. Após um período de 21
dias, foram computados: a taxa de conversão de calos (% de
regeneração) e o número médio de regenerantes por calo
regenerado. Os resultados mostram que o sal afeta a formação de
calos embriogênicos e sua posterior regeneração e que as
variedades estudadas respondem de forma diferenciada. Os calos
oriundos da variedade SP 813250 são mais resistentes ao NaCl
em comparação aos calos da RB 72454.
Termo para indexação: Saccharum officinarum, salinidade in
vitro, NaCl, embriogênese somática.
ABSTRACT
The salinity intervenes drastically in the growth and the
productivity of economically important glycophutes as the sugar
cane (Saccharum officinarum L.). The purpose of this study
was to determine the NaCl dose response in the embryogenic
callus of two sugar cane varieties (SP 813250 and 72454 RB).
Callus was inoculated in basic medium, composed of MS macro
and micronutrients, in the absence (control) and in the presence
of different sodium chloride (NaCl) concentrations (50, 100 and
200 mM) for 15 days. After this period, characteristics such as
appearance (compact or friable) and color (yellow or translucent)
of the callus were evaluated. Calli were transferred to the same
medium described above without addition of NaCl. After a period
of 21 days, the conversion rate of callus (% of regeneration) and
the average number of regenerants per callus regenerate were
evaluated. The results show that the salt affects the formation of
embryogenic callus and its regeneration and that the varieties
showed different response. According to the parameters
evaluated, callus from the SP 813250 appeared more tolerant to
NaCl than the callus of RB 72454 variety.
Index terms: Saccharum officinarum, in vitro salinity, NaCl,
somatic embryogeneses.
INTRODUÇÃO
A salinidade é uma característica comum das regiões
áridas e semiáridas que inibe o crescimento e a produtividade
das culturas (FLEXAS et al., 2004). Plantas dessas regiões
desenvolvem mecanismos para tolerar o baixo potencial
hídrico do solo causado tanto pelo excesso de sais, bem
como pela seca existente (ASHARAF & FOOLAD, 2006).
O estresse salino causa tanto estresse osmótico como
iônico. O osmótico ocorre quando há uma alta concentração
de sal em torno da raiz, dificultando a absorção de água, e
o iônico, quando existe uma concentração elevada de sal
no interior da célula (MUNNS & TESTER, 2008).
(Recebido em 17 de dezembro de 2008 e aprovado em 2 de agosto de 2009)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 94-100, 2009
Resposta de calos embriogênicos de cana-de-acúcar...
O Brasil se destaca como maior produtor mundial
de cana-de-açúcar, com produção de 571 milhões de
toneladas na última safra 2008 (COMPANHIA NACIONAL
DE ABASTECIMENTO - CONAB, 2008). Um milhão de
hectares de terra onde se cultiva a cana são afetados pela
salinidade ou sodicidade em razão do confinamento desta
espécie em áreas tropicais e subtropicais (PATADE et al.,
2008).
Em razão da sua posição de destaque no
agronegócio a cana-de-açúcar está inserida em vários
programas de melhoramento genético visando à introdução
de características de interesse agronômica dentre elas uma
maior resistência à salinidade (CIDADE et al., 2006; ERRABI
et al., 2006; FALCO et al., 2000).
Técnicas de cultura de tecido vegetal associadas a
uma pressão de seleção in vitro têm sido utilizadas visando
à produção de células e plantas tolerantes a salinidade em
diferentes espécies como o trigo (TRIVEDIA et al., 1991), o
arroz (HIEN et al., 2003; LUTTS et al., 1999, 2001) e o girassol
(ALVAREZ et al., 2003).
O sucesso do cultivo in vitro e da introdução de
um determinado genótipo nos programas de melhoramento
utilizando a seleção in vitro, depende das condições de
cultivo, do meio de cultura (SAHARAM et al., 2003), do
estado fisiológico da planta mãe de onde é retirado o
explante (DELPORT et al., 2001) e, sobretudo, da capacidade
do genótipo doador do explante de induzir calos
embriogenicos e de sua posterior regeneração em plantas
(GANDONOU et al., 2005b). Adicionalmente, antes de se
realizar uma seleção in vitro é necessário conhecer o grau
de resistência da espécie estudada face ao fator de estresse,
determinando-se as doses do agente estressor a serem
adicionados ao meio de cultura. Neste caso, pode-se
estudar a resposta em nível celular, utilizando-se assim
calos.
Neste contexto, conduziu-se este trabalho, com
objetivo de determinar a dose resposta ao cloreto de sódio
(NaCl), agente estressor utilizado para simular o estresse
salino, em calos embriogênicos de duas variedades (SP
813250 e RB 72454) de cana-de-açúcar (Saccharum
95
officinarum L.) selecionando a variedade mais resistente
pela ausência ou menor intensidade dos sintomas
causados pelo sal. As variedades SP 813250 e RB 72454
foram selecionadas por serem contrastantes quanto a sua
resistência ao estresse hídrico na condição de campo
(BRITO et al., 2008) e por serem as variedades mais
plantadas pela Usina Tavares de Melo que abastece o
estado do Rio Grande do Norte em quase 90% com a
produção sucro-alcooleira.
MATERIAL E MÉTODOS
Calos das duas variedade de cana-de-açúcar RB
72454 e SP 813250 com 3 meses foram obtidos de acordo
com Brito et al. (2008) e inoculados em meio básico,
composto por macro e micronutrientes do MS
(MURASHIGE & SKOOG, 1962), vitaminas de White
(WHITE, 1951), 0,1 g L-1 de inositol, 30 g L-1 de sacarose na
ausência (controle) e presença de diferentes concentrações
(50; 100; 200 mM) de cloreto de sódio (NaCl), agente
utilizado para simular o estresse salino, durante 15 dias. O
meio foi gelificado com 2 g L-1 de fitagel, o pH ajustado
para 5,7 ± 0,1 e, em seguida, esterilizado em autoclave
durante 20 min sob temperatura de 121º C e pressão igual a
1 atm. Foram distribuídos 20 mL do meio de cultura em
placas de petri e inoculados 3 calos por placa. Utilizaramse 15 calos de cada variedade de cana-de-açúcar (SP 813250
e RB 72454) para cada concentração. O experimento foi
mantido em sala de crescimento na ausência de luz e a
temperatura ambiente 25ºC ± 3. Após 15 dias de estresse,
características quantitativas tais como aspecto (compacto
ou friável) e coloração (translúcido ou amarelado) dos
calos, foram avaliadas. Em seguida, os calos foram
transferidos para um meio de regeneração, com a mesma
constituição básica sem adição de NaCl. Após um período
de 21 dias de regeneração foram computados: a taxa de
regeneração (%) e o número médio de brotos por calo. Os
dados coletados foram submetidos à análise de variância
e as medias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de
probabilidade, para efeito de análise estatística, os valores
foram transformados em arco seno ( x + 1,0).
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 94-100, 2009
96
GOMES, I. A. et al.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na embriogênese somática indireta, características
qualitativas tais como aspecto e coloração de calos são
fundamentais para sua posterior conversão em plantas
(GANDANOU et al., 2005b).
Com relação ao aspecto dos calos, observa-se que
após o estresse e independente da concentração de NaCl
no meio, os calos da variedade SP 813250 apresentaram
um bom desenvolvimento (expresso pela taxa de calos
friáveis), não existindo assim um efeito do sal (Figura 1).
Em todos os tratamentos foi observado uma taxa de
friabilidade superior a 70%. A mesma resposta foi observada
para a variedade RB 72454 (Figura 2 A-B)
Quanto à coloração translúcida ou amarelada,
observa-se que 100% dos calos da variedade SP 813250
apresentaram-se translúcidos, independente da
concentração de sal utilizada. A mesma observação não
pode ser feita para a variedade RB 72454, que apresentou
um aumento crescente nas taxas de calos translúcidos em
função de maiores concentrações salinas, sendo 100% para
a concentração de 200 mM de NaCl. Adicionalmente, calos
da variedade RB 72454 expostos a 0; 50 e 100mM de NaCl
apresentaram porcentagens menores com relação a
coloração translúcida quando comparados a todas as
concentrações utilizadas para a variedade SP 813250 e
quando utilizou-se 200 mM de NaCl para a variedade
RB72454 (Figura 2 C-D).
Tais resultados mostram claramente uma diferença
de resposta celular entre as duas variedades.
Provavelmente, essa diferença de resposta entre as
variedades seja constitutiva, relacionada a características
genéticas específicas decorrente da capacidade que cada
uma tem de suportar a alta concentração de sal no meio.
Diferentes trabalhos mostram que tanto a resposta in vitro
(SCHWEEN & SCHWENKEL, 2003; ZALE et al., 2004),
como a resposta ao sal é espécie dependente e, dentro de
uma mesma espécie pode ser variedade dependente
(GANDANOU et al., 2005a, 2006).
Nos programas de melhoramento in vitro, é
imperativo que a seleção ao agente estressor seja seguida
da regeneração de plantas. Analisando a capacidade de
regeneração dos calos em plântulas após o estresse,
observa-se que independente da concentração de NaCl
no meio, os calos oriundos da variedade SP 813250
apresentaram maiores taxa de regeneração quando
comparados aos da variedade RB 72454, mesmo na ausência
FIGURA 1 Calos de cana-de-açúcar da variedade SP 813250 tratados com cloreto de sódio, 0 mM (A), 50 mM (B), 100 mM
(C) e 200 mM (D). Calos da variedade RB 72454 tratados com cloreto de sódio 0 mM (E), 50 mM(F), 100 mM (G) e 200 mM (H).
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 94-100, 2009
Resposta de calos embriogênicos de cana-de-acúcar...
RB 72454
A
SP 813250
97
B
a
100
100
a
a
a
b
b
100 mM
200 mM
a
75
(%)
75
(%)
b
50
50
25
25
0
0
0 mM
50 mM
100 mM
0 mM
200 mM
50 mM
Concentração de NaCl
Concentração de NaCl
C
a
a
a
D
a
100
120
a
100
75
b
(%)
(%)
80
50
c
60
cd
40
25
20
0
0
0 mM
50 mM
100 mM
200 mM
0 mM
50 mM
Concentração de NaCl
100 mM
200 mM
Concentração de NaCl
FIGURA 2 Taxa de friabilidade (aspecto friável) de calos das variedades SP 813250 (A) e SP 72454 (B) e taxa de
coloração (aspecto translúcido) de calos SP 813250 (C) e RB 72454 (D) em presença de quatro concentrações de NaCl
( 0, 50, 100 e 200 mM). Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si a 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.
do estresse (controle). As maiores taxas de regeneração
(100%) da variedade SP 813250 foram observadas em
presença das concentrações mais elevadas (100 e 200 mM)
do sal quando, comparadas às concentrações de 0 e 50
mM. Já nos calos da variedade RB 72454, houve uma
redução significativa na taxa de regeneração nas doses de
50 e 200 mM (40 %). Os calos da variedade SP 813250 não
foram afetados pelo sal nas maiores concentrações (100 e
200 mM), aparentemente a presença deste no meio de
cultura estimulou a conversão dos calos em plântulas
(Figura 3 A B). Isso pode indicar que os calos apresentaram
uma maior resistência ao sal e/ou que as doses
administradas não foram eficientes para induzir um estresse
salino e inibir a formação de plântulas nesta variedade.
Sabe-se que o estresse, dependendo do tipo e da
intensidade, é um fator que desencadeia competência
enbriogênica (BRITO et al., 2008; LUTTS et al., 1996).
A diferença na resposta das variedades à indução
de embriões somáticos e sua posterior conversão em
plântulas pode estar relacionada a características genéticas
específicas. Em estudos realizados por Brito et al. (2008)
foi observada maior formação de radículas nos calos da
variedade RB 72 454, indicando assim uma maior propensão
dessa variedade a organogênese. Ao contrário, os calos
variedade SP 813250 teve maior propensão a embriogênese
somática. Desse modo, essas variedades podem responder
de modo diferenciado à rota morfogénetica utilizada para a
conversão de plantas e, ainda, ao tratamento com NaCl
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 94-100, 2009
98
GOMES, I. A. et al.
utilizado para induzir um estresse salino. Trabalhos com
cana-de-açúcar (GANDANOU et al., 2005a,b, 2006;
GONZALEZ et al., 1995) e outras espécies como o arroz
(HOQUE & MANSFIELD, 2004) e trigo (BIRSIN et al., 2004)
reforçam a idéia de que tanto a regeneração como a
resposta ao sal é cultivar e dose dependente (BASU et al.,
2002; GONZÁLES et al., 1995; LUTTS et al., 1996).
Para este trabalho, a correlação entre a taxa de
regeneração e o aspecto dos calos, reforça que a resposta in
vitro e a resposta ao sal é também cultivar e dose dependentes.
Para a variedade SP 813250, calos friáveis e translúcidos
submetidos a um estresse salino, durante 15 dias de exposição
possuem uma maior capacidade de se converter em plântulas,
quando comparadas com a variedade RB 72454.
SP 813250
b
RB 72454
A
a
100
Outro indicador utilizado para avaliar a dose resposta
de NaCl em calos de cana-de-açúcar foi o número médio de
brotos por calo. Em uma seleção in vitro a taxa de
regeneração, bem como o número médio de brotos por calo
é fundamental na obtenção de um maior número de possíveis
variantes somaclonais.
Os maiores valores para o número médio de brotos por
calo para a variedade SP 813250 foram obtidos em presença
de 50 e 100 mM, dando origem a 8,2 e 8,0 brotos, respectivamente.
Os calos da variedade RB 72454 apresentaram um número
médio de regenerantes que variou entre 2,6 em 0 mM
(menor) e 5,6 em 100 mM (maior). Tais resultados mostram
claramente diferenças varietais, sugerindo que a resposta
ao sal é cultivar e dose dependente (Figura 4 A-B).
B
a
100
b
75
75
(%)
(%)
a
50
25
a
50
b
b
25
0
0
0 mM
50 mM
100 mM
200 mM
0 mM
50 mM
100 mM
200 mM
Concentração de NaCl
Concentração de NaCl
FIGURA 3 Taxa de regeneração d calos das variedade SP 813250 (A) e RB 72454 (B) submetidos a quatro diferentes
concentrações de NaCl ( 0, 50, 100 e 200 mM). Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si a 5% de probabilidade
pelo teste de Tukey.
D
C
10
10
a
a
b
8
Broto p/ calo
Broto p/ calo
8
c
6
4
2
a
6
4
b
b
c
2
0
0
0 mM
50 mM
100 mM
200 mM
0 mM
50 mM
Concentração de NaCl
100 mM
200 mM
Concentração de NaCl
FIGURA 4 Número médio de brotos por calo das variedades SP 813250 (C) e SP 72454 (B) submetidas a quatro
diferentes concentrações de NaCl ( 0, 50, 100 e 200 mM). Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si a 5% de
probabilidade pelo teste de Tukey.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 94-100, 2009
Resposta de calos embriogênicos de cana-de-acúcar...
Os resultados mostram por fim que o sal afeta a
formação de calos embriogênicos e sua posterior
regeneração e que, as variedades estudada, respondem de
forma diferenciada. Aparentemente, e de acordo com os
parâmetros avaliados, os calos oriundos da variedade SP
813250 são mais resistentes ao NaCl em comparação aos
calos da RB 72454. Com relação à escolha da concentração
de NaCl a ser utilizada em programas de melhoramento in
vitro, fatores como aptidão in vitro e nível de resistência
das variedades serão determinantes.
CONCLUSÃO
A presença de NaCl no meio de cultura afeta a
embriogênese somática indireta em cana-de-açúcar e a
resposta ao sal é cultivar e dose dependente. Os calos da
variedade SP 813250 são mais resistentes ao NaCl em
comparação aos calos da RB 72454.
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EFEITO DO ESTIOLAMENTO
NA MICROPROPAGAÇÃO
DE
Efeito do estiolamento na micropropagação
de abacaxi...
ABACAXI CULTIVAR IMPERIAL
101
EFFECT OF ETIOLATION ON THE MICROPROPAGATION OF
IMPERIAL PINEAPPLE CULTIVAR
MICAELE DA COSTA SANTOS1, SARAH BRANDÃO SANTA CRUZ BARBOZA2,
ANA DA SILVA LÉDO3, PEDRO ROBERTO ALMEIDA VIÉGAS4, LUIZ AUGUSTO COPATI5
1
Eng. Agr. Mestranda da Universidade Federal de Sergipe Núcleo de Biotecnologia, Av. Marechal Rondon 49100-000 São
Cristóvão, SE [email protected]
2
Eng. Agr. D. Sc. (in memorian)
3
Eng. Agr. D. Sc. Embrapa Tabuleiros Costeiros Cx. P. 44 CEP 49025-040 Aracaju, SE. [email protected]
4
Eng. Agr. D. Sc. Universidade Federal de Sergipe Av. Marechal Rondon 49100-000 São Cristóvão,SE [email protected]
5
Eng. Agr., M.Sc. Universidade Federal de Sergipe Av. Marechal Rondon 49100-000 São Cristóvão,SE [email protected]
RESUMO
Avaliou-se a eficiência da aplicação do estiolamento na
micropropagação do abacaxi Imperial [Ananas comosus (L.)
Merr], cultivar resistente a fusariose. O estiolamento in vitro
ocorreu em meio MS nos tratamentos: T1- sem fitorregulador;
T2- 1,86 mg L-1 de ácido nafataleno acético (ANA); T3- 1,75
mg.L-1 de ácido indol acético (AIA); T4- 2,03 mg L-1 de ácido
indolbutírico (AIB); T5- 1,73 mg L-1 e T6- 0,86 mg L-1 de ácido
giberélico (GA3) em delineamento inteiramente casualizado com
seis tratamentos e quatro repetições. Os explantes foram
inoculados em tubos de ensaio envoltos em papel alumínio e
mantidos em sala de crescimento com intensidade luminosa de
52 µmol m-2 s-1, temperatura de 25 ± 2ºC e fotoperíodo de 12
horas. A proliferação de brotos ocorreu na presença de luz em
meio MS nos tratamentos: T1- sem fitorregulador, T2- 1,0 mg
L-1 de BAP; T3- 2,0 mg L-1 de BAP; T4- 1,0 mg L-1 de BAP +
0,93 mg L-1 de ANA; T5- 2,0 mg L-1 de BAP + 1,86 mg L-1 de
ANA; T6- 5,4 mg L-1; T7- 7,5 mg L-1 e T8- 9,7 mg L-1 de
cinetina (CIN) em delineamento inteiramente casualizado com
oito tratamentos e sete repetições. Na ausência de luz, o
comprimento dos brotos aumentou em 100% aos 60 dias para
todos os tratamentos. Na presença de luz, as taxas de
multiplicação foram superiores quando se adicionou BAP isolado
ou combinado com ANA. A elevação da concentração de ANA
para 1,83 mg L-1 e de BAP para 2,0 mg L-1 proporciona um
incremento de 68% na taxa de multiplicação.
Termos para indexação: Ananas comosus, cultivo in vitro, taxa
de multiplicação, regeneração.
ABSTRACT
It was evaluated the etiolation for micropropagation of
the pineapple [Ananas comosus (L.) Merr] cultivar Imperial
resistant to Fusarium rot. In vitro etiolation was induced in MS
medium in the following treatments: T1- without phytoregulator
(control); T2- 1.86 mg L-1 naphthalene acetic acid (NAA), T31.75 mg L-1 indole acetic acid (IAA), T4 - 2.03 mg L-1 indole
butyric acid (IBA), T5- 1.73 and T6- 0.86 mg L-1 gibberellic acid
(GA3), respectively, in a completely randomized design with six
treatments and four replicates. The explants were inoculated in
test tubes wrapped in aluminum foil and maintained in growth
room with light intensity of 52 ìmol m-2 s-1, temperature of 25 ±
2º C and photoperiod of 12 hours. Shoot proliferation was induced
under light conditions in MS medium in the following treatments:
T1- without phytoregulator (control), T2- 1.0 mg L -1
benzylaminopurine (BAP), T3- 2.0 mg L-1 BAP, T4- 1.0 mg L 1
BAP + 0.93 mg L-1 NAA, T5- 2.0 mg L-1 BAP + 1.86 mg L-1
NAA, T6- 5.4 mg L-1, T7- 7.5 mg L-1 and T8- 9.7 mg L-1 kinetin
(KIN) in completely randomized design with eight treatments
and seven replicates. In the absence of light, shoot length increased
100% at 60 days for all treatments. Under light conditions,
multiplication rate were higher when BAP was added isolated or
combined with NAA. With the increase of NAA concentration
to 1.83 mg L-1 and BAP to 2.0 mg L-1, an increase of 68% was
observed in the multiplication rate.
Index terms: Ananas comosus, in vitro culture, multiplication
rate, regeneration.
INTRODUÇÃO
O abacaxizeiro, Ananas comosus (L.) Merr, é uma
espécie frutífera de grande importância econômica e social
cultivada em mais de 70 países de clima tropical e
subtropical. O Nordeste do Brasil destaca-se como a
principal região produtora de abacaxi, além de apresentar a
maior área colhida, com uma produção de 1.353.431
toneladas de frutos em 26.105 hectares (AGRIANUAL,
2008).
A fusariose, doença causada pelo fungo Fusarium
subglutinans (Wollen & Reinking) P.E. Nelan, que ataca o
abacaxizeiro tanto na fase vegetativa quanto produtiva,
está presente no Brasil em todas as regiões produtoras,
(Recebido em 15 de maio de 2009 e aprovado em 2 de agosto de 2009)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 101-110, 2009
102
SANTOS, M. da C. et al.
sendo que as cultivares Pérola e Smooth Cayenne são
suscetíveis (CABRAL & MATOS, 2005). A cultivar Imperial
é um híbrido resultante do cruzamento do abacaxi Perolera
com o Smooth Cayenne que, por ser resistente a fusariose,
apresentar frutos de boa qualidade e evidenciar bom
desempenho agronômico em três ciclos de avaliação, foi
lançado pela Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical,
em 2003 (CABRAL & MATOS, 2005).
Além disso, as mudas de abacaxizeiro representam
30% do custo de produção e, sendo assim, assume grande
importância à utilização de um método eficiente, seguro e
de baixo custo para a produção de mudas micropropagadas
(ALBUQUERQUE et al., 2000; GUERRA et al., 1999;
REINHARDT, 1998). Nesse sentido, técnicas de cultura
de tecidos vegetais estão sendo aplicadas para a
propagação clonal de variedades melhoradas. A
micropropagação além de disponibilizar maior quantidade
de mudas em curto tempo e um alto rendimento por explante
permite o controle total das condições ambientais durante
a propagação e a preservação de plantas matrizes sem
riscos de infecção (BARBOZA & CALDAS, 2001;
MOREIRA et al., 2003; PASQUAL et al., 1998, 2001).
Na produção de plantas in vitro de abacaxizeiro,
tem sido utilizada como metodologia básica a desfolha das
mudas, desinfestação do caule com hipoclorito de sódio,
retirada de gemas em ambiente asséptico, inoculação em
meio nutritivo e crescimento em condições ambientais
controladas para que ocorra a indução e multiplicação de
brotos (ALMEIDA et al., 2002; MACÊDO et al., 2003;
MOREIRA et al., 2003).
A manutenção da identidade genotípica é
indispensável para a propagação em massa de genótipos
selecionados e novas cultivares. A aplicação de métodos
alternativos para a propagação rápida de abacaxizeiro, como
o alongamento de brotos induzidos in vitro por meio de
estiolamento tem sido alvo de estudos (BARBOZA &
CALDAS, 2001; DIAS et al., 2008; KISS et al., 1995;
MOREIRA et al., 1999, 2003; PRAXEDES et al., 2001).
O estiolamento é o desenvolvimento de brotos,
ramos ou partes desses em ausência de luz, o que causa o
crescimento, geralmente alongado e com coloração amarela
ou branca, em razão da ausência de clorofila (HARTMANN
& KESTER, 1990). No escuro, os entrenós do talo da
plântula do abacaxizeiro se alongam, separando os nós
que, normalmente, em presença de luz, permanecem
próximos uns aos outros. Para fins de micropropagação, a
separação dos nós facilita o desenvolvimento de gemas
axilares e a manipulação de plântulas regeneradas
(BARBOZA & CALDAS, 2001).
Alguns resultados da aplicação do estiolamento
para cultivares comerciais de abacaxizeiro são promissores
e apontam que esse método tem a vantagem de evitar injúria
na zona de regeneração e impedir a formação de calo o que
poderia aumentar o aparecimento de variantes.
Conduziu-se este trabalho, com objetivo de avaliar
a eficiência do estiolamento para a produção de mudas in
vitro de abacaxi Imperial .
MATERIAL E MÉTODOS
Os trabalhos foram desenvolvidos no Laboratório
de Cultura de Tecidos de Plantas da Embrapa Tabuleiros
Costeiros, em Aracaju, SE, utilizando o abacaxizeiro cultivar
Imperial.
Para os estudos de estiolamento caulinar, utilizaramse brotações adventícias in vitro desenvolvidas a partir
de material vegetal proveniente do Banco Ativo de
Germoplasma de abacaxi da Embrapa Mandioca e
Fruticultura Tropical.
O meio de cultura básico usado para todos os
experimentos foi o MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962)
suplementado com sacarose a 30 g L-1 e gelificado com
ágar a 7 g L-1. O pH do meio foi ajustado para 5,8 ± 0,1 antes
da autoclavagem, que foi realizada a 120ºC, por 15 minutos.
O preparo dos explantes e a inoculação no meio de cultura
ocorreram em condições assépticas e as culturas mantidas
em sala de crescimento com intensidade luminosa de 52
µmol m-2 s-1, temperatura de 25 ± 2ºC e fotoperíodo de 12
horas.
Brotações adventícias in vitro, com comprimento
médio de 7,0 cm, foram desfolhadas e inoculadas
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 101-110, 2009
Efeito do estiolamento na micropropagação de abacaxi...
individualmente em tubo de ensaio, envoltos em papel
alumínio para simular a ausência de luz, contendo 10 mL de
meio MS. O delineamento experimental foi inteiramente ao
acaso com seis tratamentos: T1- sem regulador de
crescimento; T2- 1,86 mg L-1 de ácido nafataleno acético
(ANA); T3- 1,75 mg L-1 de ácido indol acético (AIA); T42,03 mg L-1 de ácido indolbutírico (AIB); T5- 1,73 mg L-1 e
T6- 0,86 mg L-1 de ácido giberélico (GA3), com quatro
repetições e três explantes por repetição.
Aos 30 e 60 dias após a inoculação foi avaliado o
número de brotos estiolados por explante, número de nós
por broto estiolado e comprimento de brotos.
Para a indução e proliferação de brotos, utilizaramse segmentos nodais estiolados in vitro, dos quais foram
retiradas as raízes e o meristema apical e, logo após, foram
transferidos dois segmentos nodais por placa de Petri,
contendo 25 mL de meio MS. Foram testados oito
tratamentos: T1- sem fitorregulador de crescimento, T21,0 mg L-1 de benzilaminopurina (BAP); T3- 2,0 mg L-1 de
BAP; T4- 1,0 mg L-1 de BAP + 0,93 mg L-1 de ácido naftaleno
acético (ANA); T5- 2,0 mg L-1 de BAP + 1,86 mg L-1 de
ANA; T6- 5,4 mg L-1; T7- 7,5 mg L-1 e T8- 9,7 mg L-1 de
cinetina (CIN). Esses tratamentos foram definidos, tomando
como base resultados obtidos por Barboza & Caldas (2001)
acrescidos de novas concentrações e reguladores de
crescimento, a fim de se confrontar resultados referentes
às respostas genotípicas para esta nova variedade de
abacaxi. As culturas foram mantidas em sala de crescimento
com intensidade luminosa de 52 µmol m-2 s-1, temperatura
de 25 ± 2ºC e fotoperíodo de 12 horas.
O delineamento experimental foi inteiramente ao
acaso com oito tratamentos e sete repetições, com três
brotos estiolados por repetição. Aos 30 e 60 dias após
inoculação, foi avaliado o número de nós com proliferação
de gemas.
A estimativa da taxa de multiplicação foi obtida aos
60 dias após a última avaliação do potencial de nós em
proliferar gemas em diferentes tratamentos, quando todo
material foi transferido para frascos com capacidade para
250 mL com meio MS sem fitorregulador para alongamento
103
dos brotos. Após 50 dias em meio MS sem regulador de
crescimento procedeu-se a individualização dos brotos e
avaliação da taxa de multiplicação por nó e por secção
estiolada, em cada ciclo de cultivo (estiolamento,
proliferação e alongamento de brotos em secções nodais),
que ocorreu em um período de seis meses.
Tomando por base o número de brotos obtidos em
cada tratamento, em dois ciclos de cultivo (estiolamento,
proliferação e alongamento de brotos), aos seis e doze
meses após inoculação, foi estimado o número total de
mudas produzidas por explante inicial (plântula
desenvolvida de gema axilar) e por muda do tipo filhote.
Para cada muda filhote foram consideradas, em média, 13
gemas axilares. As médias das variáveis foram submetidas
à análise de variância e, quando significativas, comparadas
pelo teste de Duncan a 5% de probabilidade.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As diferentes concentrações de auxinas e giberelina
não influenciaram, significativamente, a emissão de
brotações caulinares estioladas em explantes de abacaxi
cv. Imperial , aos 30 e 60 dias de cultivo na ausência de luz
(Tabela 1). Houve diferença significativa para número de
nós por broto aos 30 dias de inoculação. Na ausência de
regulador de crescimento, observou-se maior valor
numérico para o rendimento de nós por broto estiolado
(2,43).
Aos 60 dias de cultivo, apesar de não terem sido
detectadas diferenças significativas entre os tratamentos,
observou-se maiores valores no número de nós/broto
estiolado (Tabela 1) e no comprimento dos brotos (Tabela
2). O incremento no comprimento dos brotos, no intervalo
entre os 30 e 60 dias de cultivo, foi superior a 100% em
todos os tratamentos mostrando uma relação direta com
o número de nós/broto (Tabelas 1 e 2). Tendo em vista
que a proliferação de gemas ocorre em nós dos brotos
estiolados, esta variável é importante para a fase
subsequente deste protocolo de micropropagação,
podendo ser correlacionada com aumento da taxa de
multiplicação.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 101-110, 2009
104
SANTOS, M. da C. et al.
TABELA 1 Número médio de brotos estiolados/explante e número de nós/broto de abacaxi cv. Imperial em diferentes
tratamentos aos 30 e 60 dias de cultivo na ausência de luz.
Aos 30 dias
Tratamentos
Aos 60 dias
Brotos
estiolados/explante
Número de
nós/broto
Brotos
estiolados/explante
Número de
nós/broto
sem fitorregulador
1,80 a
2,43 a
2,20 a
3,51 a
-1
1,47 a
2,09 ab
2,00 a
3,76 a
-1
2,00 a
1,74 b
1,93 a
3,53 a
-1
1,53 a
1,83 b
2,00 a
3,60 a
-1
1,21 a
2,00 ab
1,71 a
3,30 a
-1
GA3 0,86 mg L
1,23 a
1,75 b
1,54 a
4,00 a
CV (%)
36,6
23,6
25,6
28,8
ANA 1,86 mg L
AIA 1,75 mg L
AIB 2,03 mg L
GA3 1,73 mg L
Médias seguidas da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Duncan (p
0,05)
TABELA 2 Comprimento médio de brotos estiolados de abacaxi cv. Imperial em diferentes tratamentos aos 30 e 60
dias de cultivo na ausência de luz.
Comprimento dos brotos estiolados (cm)
Tratamento
30 dias
60 dias
sem fitorregulador
2,02 a
4,98 a
-1
2,27 a
5,85 a
-1
2,39 a
4,97 a
-1
2,14 a
5,24 a
-1
2,82 a
4,67 a
-1
GA3 0,86 mg L
2,32 a
5,15 a
CV (%)
33,4
34,7
ANA 1,86 mg L
AIA 1,75 mg L
AIB 2,03 mg L
GA3 1,73 mg L
Médias seguidas da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Duncan (p
Trabalhando com o abacaxi PE x SC - 52, Barboza &
Caldas (2001) não observaram efeito significativo para
número de brotos estiolados por explante e para o
comprimento médio dos brotos estiolados, aos 35 dias após
cultivo em ausência de luz. No entanto, o número de nós
por broto na presença de 1,86 mg L-1 de ANA e 1,75 mg L1
de AIA (6,7 e 6,2, respectivamente) foi superior ao obtido
no presente trabalho. Kiss et al. (1995) alcançaram uma
média de 7,0 nós por broto, após 30 a 35 dias de
estiolamento, utilizando explantes da cultivar Smooth
Cayenne em meio suplementado com 1,86 mg L-1 de ANA.
0,05).
Na multiplicação in vitro de Cattleya x mesquitae
por estiolamento, Ramos & Carneiro (2007) observaram
que para a altura da brotação principal não houve diferença
significativa para três concentrações ANA e de BAP
testadas. Suzuki (1999) também relata que plantas de
Catasetum fimbriatum Rchb. f. apresentavam caules
significativamente maiores quando mantidas na ausência
de luz, independente da natureza do regulador de
crescimento e das concentrações utilizadas.
As giberelinas estimulam o crescimento do caule
por promover tanto o alongamento quanto a divisão celular
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 101-110, 2009
Efeito do estiolamento na micropropagação de abacaxi...
e fatores ambientais como o fotoperíodo, temperatura,
presença de auxina no ápice caulinar e níveis endógenos
desse fitorregulador regulam sua própria síntese (TAIZ &
ZEIGER, 2004). A adição de giberelinas exógenas em tecidos
vegetais leva a um incremento dos níveis endógenos de
auxinas e, consequentemente, ao alongamento das hastes
em muitas espécies (VALDOVINOS et al., 1967). Neste
trabalho não se observaram efeitos significativos da
giberelina. Na obtenção de segmentos nodais estiolados
do abacaxizeiro híbrido PE x SC - 60, maiores hastes foram
obtidas em meio MS suplementado com 1,0 mg L-1 de ANA
(9,7 cm), aos 90 dias de cultivo (SOUZA et al., 2007). Os
autores também relatam que os tratamentos com GA3 não
diferiram da testemunha.
Em estudos de estiolamento caulinar in vitro de
abacaxi cv. Pérola, Moreira et al. (2003) obtiveram maior
taxa de multiplicação em meio MS suplementado com 1,8
mg L-1 de ANA + 2 mg L-1 de BAP, aos 40 dias de cultivo, na
ausência de luz. Os autores relatam expressiva presença
de calos na base do explante. Na otimização de um
protocolo de micropropagação via segmentos nodais é
preferida a obtenção de maior número de nós por broto,
105
sem formação de calos, tanto na fase escura quanto na
clara. Neste trabalho, o uso de citocinina, para a proliferação
de brotos em segmentos nodais estiolados, ocorreu
apenas na presença de luz.
Os segmentos nodais estiolados in vitro cultivados
na presença de diferentes concentrações de reguladores
de crescimento apresentaram diferentes potenciais de
proliferação de gemas e desenvolvimento de brotos (Tabela
3, Figura 1). Em cada segmento caulinar estiolado, o número
de nós que proliferaram gemas variou entre tratamentos e
em um mesmo tratamento, aos 30 e 60 dias após inoculação.
Segundo Grattapaglia & Machado (1998) gemas axilares
podem não apresentar a mesma razão de multiplicação in
vitro; enquanto algumas gemas apresentam maior e mais
rápido potencial de multiplicação, outras têm potencial de
multiplicação mais lento.
Na regeneração dos segmentos estiolados em
presença de luz, o uso de BAP isolado ou combinado com
ANA foi eficiente para indução e proliferação de gemas em
segmentos nodais estiolados, independente da
concentração utilizada, observando-se melhores resultados
para 2 mg L-1 BAP + 1,86 mg L-1 ANA aos 30 e 60 dias. A
TABELA 3 Efeito de diferentes tratamentos na proliferação de gemas em segmentos nodais estiolados de abacaxi cv.
Imperial aos 30 e 60 dias após inoculação.
Número de nós com proliferação de gemas
Tratamentos
sem fitorregulador
-1
BAP 1 mg L
-1
BAP 2 mg L
Aos 30 dias
Aos 60 dias
1,0 d
1,7 c
2,1 bc
2,8 bc
2,6 ab
3,0 b
-1
-1
2,6 ab
3,0 b
-1
-1
BAP 2 mg L + ANA 1,86 mg L
3,2 a
4,0 a
CIN 5,4 mg L-1
1,0 d
1,1 d
-1
CIN 7,5 mg L
1,7 c
1,9 c
CIN 9,7 mg L-1
1,7 c
2,1 c
CV (%)
27
20
BAP 1 mg L + ANA 0,93 mg L
Médias seguidas da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Duncan (p
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 101-110, 2009
0,05).
106
SANTOS, M. da C. et al.
A
B
C
D
FIGURA 1 Proliferação de brotos em secções nodais estioladas de abacaxi cv. Imperial sob diferentes tratamentos. A - BAP
1 mg L-1; B - BAP 2 mg L-1 + ANA 1,86 mg L-1; C - BAP 2 mg L-1; D - Planta alongada in vitro aos 60 dias após a inoculação.
cinetina foi pouco efetiva obtendo-se, aos 60 dias, valores
estatisticamente iguais àqueles observados em meio de
cultura sem fitorregulador (Tabela 3). A dificuldade em
quebrar a dominância apical dos brotos estiolados para
indução de gemas foi observada por Moreira et al. (2003)
que propõem a individualização de cada nó.
As taxas de multiplicação por nó e por segmento
estiolado na presença de BAP foram superiores quando
comparadas às obtidas em meio com cinetina e sem
fitorregulador (Tabela 4), discordando dos resultados
obtidos por Barboza & Caldas (2001) para o híbrido PE X
SC-52. Os autores obtiveram melhor taxa de multiplicação
na presença de BAP, cinetina e ANA + BAP não houve
diferença estatística no número de plântulas regeneradas
por nó em brotos com cinco ou mais nós por segmento
estiolado e o tratamento sem reguladores de crescimento
teve a menor regeneração de plântulas por nó.
Aos 30, 45 e 60 dias de cultivo, o número de
plântulas regeneradas por nó de Ananas comosus var.
an an asso id es, n ão d iferiu entre si em d iv ersas
co ncen trações de B A P, en tretan to em meio s
suplementados com 4,44 e 8,88 µM de BAP observaram-se
maiores valores para número de plantas por nó (DIAS et
al., 2008). Segundo Rocca & Mroginski (1991), o BAP é
uma das citocininas mais utilizadas na indução de brotos,
entretanto, a concentração recomendada varia
consideravelmente entre os laboratórios que trabalham com
a micropropagação do abacaxi.
Quando aumentaram as concentrações de BAP e
ANA ocorreu à formação de massas de gemas por nó,
indicando a formação de gemas adventícias, o que
promoveu um incremento nas taxas de multiplicação por
nó e por segmento estiolado nestes tratamentos. Em
presença de CIN, as taxas de multiplicação foram bastante
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 101-110, 2009
Efeito do estiolamento na micropropagação de abacaxi...
107
TABELA 4 Taxa de multiplicação média de abacaxi cv. Imperial por nó (TMN) e por segmento nodal estiolado (TMS)
em diferentes tratamentos.
Tratamentos para Proliferação de Gemas
sem fitorregulador
Taxa de multiplicação
TMN
TMS
0,4 de
2,5 de
-1
BAP 1 mg L
1,3 c
8,2 cd
BAP 2 mg L-1
1,7 c
10,9 c
-1
-1
4,1 b
23,0 b
-1
-1
6,9 a
34,0 a
BAP 1 mg L + ANA 0,93 mg L
BAP 2 mg L + ANA 1,86 mg L
-1
CIN 5,4 mg L
0,3 e
1,4 e
CIN 7,5 mg L-1
0,4 de
2,2 de
CIN 9,7 mg L-1
0,4 de
2,2 de
CV (%)
36
35
Médias seguidas da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Duncan (p
reduzidas, não justificando a utilização das concentrações
testadas no presente trabalho para multiplicação da
variedade Imperial (Tabela 4).
Submetendo dois genótipos de abacaxi, a cultivar
Smooth Cayenne e o híbrido PE x SC - 52, a diferentes
combinações de fitorreguladores para multiplicação in
vitro, utilizando o método de micropropagação
convencional, Barboza et al. (2004), obtiveram variação
nas taxas de multiplicação dos genótipos, em um mesmo
tratamento, sugerindo diferenças genotípicas na
resposta à indução morfogenética in vitro. A
necessidade de otimização de um protocolo para cada
variedade também foi evidenciada em trabalho realizado
por Guerra et al. (1999), usando a cultivar Perolera que
produziu, em média, um maior número de broto/explante
do que a cultivar Primavera, quando submetidas a um
mesmo protocolo.
Neste trabalho, maior eficiência na multiplicação
in vitro, em dois ciclos de cultivo foi obtida quando se
utilizaram 2 mg L-1 de BAP + 1,86 mg L-1 de ANA.
Aplicando-se as taxas de multiplicação obtidas nos
diferentes tratamentos em dois ciclos de estiolamento,
proliferação de gemas e alongamento de brotos, verificase que do total de brotos produzidos ao final de 12
meses, em todos os tratamentos, 61% foram
0,05).
provenientes do meio de cultura suplementado com 1,86
mg L-1 de ANA + 2 mg L-1 de BAP (Tabela 5). O melhor
desempenho das culturas em comprimento de brotos
estiolados e o número de nós por broto foram de
fundamental importância para a obtenção de melhores
taxas de multiplicação.
Quando se utilizou 0,93 mg L-1 de ANA combinado
com 1 mg L -1 de BAP a taxa de multiplicação e,
consequentemente, o número de brotos foi,
aproximadamente, três vezes maior que os valores obtidos
em presença apenas 2 mg L-1 de BAP (Tabelas 4 e 5). A
elevação da concentração de ANA para 1,86 mg L-1 e de
BAP para 2 mg L-1 proporcionou um incremento de
aproximadamente 68% em relação aos valores obtidos em
menor concentração desses fitorreguladores. Na
multiplicação in vitro de Cattleya x mesquitae Ramos &
Carneiro (2007) relatam um aumento de 75% na produção
de novos explantes em meio suplementado com BAP 0,5
mg L -1 comparativamente àquele na ausência de
fitorreguladores.
A adição de concentrações mais elevadas de BAP
e ANA ao meio de cultura determinou maior produção
de brotos de abacaxizeiro da variedade Pérola (Macêdo
et al., 2003). Respostas similares foram obtidas por
Dalvesco et al. (2000) e Guerra et al. (1999) em outras
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 101-110, 2009
108
SANTOS, M. da C. et al.
TABELA 5 Estimativa do número de brotos produzidos por gema axilar e por muda do tipo filhote, em cada tratamento,
tomando como base a taxa de multiplicação por segmento nodal estiolado.
Rendimento em Brotos (n°)
Tratamentos
Gema Axilar
Muda Filhote
Aos 6 meses (primeiro ciclo)
sem fitorregulador
-1
BAP 1 mg L
-1
BAP 2 mg L
5c
65 d
16 b
208 c
22 ab
283 c
-1
-1
46 ab
598 b
-1
-1
BAP 1 mg L + ANA 0,93 mg L
BAP 2 mg L + ANA 1,86 mg L
68 a
884 a
-1
CIN 5,4 mg L
3c
36 d
CIN 7,5 mg L-1
4c
57 d
-1
CIN 9,7 mg L
4c
57d
CV (%)
36,5
31,2
Aos 12 meses (segundo ciclo)
sem fitorregulador
-1
BAP 1 mg L
-1
BAP 2 mg L
12 d
162 d
134 c
1.748 c
237 c
3.089 c
-1
-1
1.058 a
13.754 b
-1
-1
BAP 2 mg L + ANA 1,86 mg L
2.312 a
30.056 a
CIN 5,4 mg L-1
4d
51 e
-1
10 d
126 d
-1
CIN 9,7 mg L
10 d
126 d
CV (%)
48,7
42,7
BAP 1 mg L + ANA 0,93 mg L
CIN 7,5 mg L
Médias seguidas da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Duncan (p
variedades de abacaxi. Moreira et al. (2003), trabalhando
com a cultivar Pérola obtiveram maior taxa de multiplicação,
utilizando brotos onde os ápices foram retirados.
O uso do meio MS líquido e o seccionamento
das brotações contribuíram para o aumento da taxa
de multiplicação da cultivar Pérola (Almeida et al.,
2002). Segundo os autores, pode-se obter até 161.080
plântulas de abacaxi, no final de oito meses, partindo
de uma única planta com oito filhotes e dez gemas
axilares/filhote.
Para a produção de mudas in vitro, em escala
comercial, os acréscimos obtidos na taxa de multiplicação
e no rendimento em brotos são fatores de grande
0,05).
importância para uma tomada de decisão quanto ao tipo e
concentração de citocinina a serem utilizados.
CONCLUSÕES
1. A taxa de proliferação de gemas por nó e por
segmento nodal estiolado in vitro de abacaxi cv. Imperial
varia em função de tipos e concentrações de reguladores
de crescimento e apresenta diferentes potenciais de
desenvolvimento de brotos.
2. Em meio de cultura MS suplementado com 1,86
mg L-1 de ANA e 2 mg L-1 de BAP obtém-se maior taxa de
multiplicação por nó e por segmento estiolado de abacaxi
cv. Imperial e maior rendimento na produção de mudas
micropropagadas.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 101-110, 2009
Efeito do estiolamento na micropropagação de abacaxi...
AGRADECIMENTOS
Ao Sergipe Parque Tecnológico e Empresa de
Desenvolvimento Agropecuário de Sergipe pela concessão
de bolsas de iniciação científica e a Embrapa Tabuleiros
Costeiros pelo aporte de recursos financeiros e
infraestrutura.
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GIBERÉLICO
BAP
NA deINDUÇÃO
DE EMBRIÕES
ácido giberélico eEbap
na indução
embriões...
111
SOMÁTICOS A PARTIR DE ANTERAS DE CAFEEIRO Coffea arabica L.
KINETIN, GIBBERELLIC ACID AND BAP IN THE FORMATION OF SOMATIC
EMBRIOS FROM COFFEE (Coffea arabica L.) ANTHERS
LEANDRO DE OLIVEIRA LINO1, JOSÉ MAGNO QUEIROZ LUZ2, ISRAEL VIEIRA NAVES1,
TATIANA MICHLOVSKÁ RODRIGUES3, LETÍCIA DE ARAÚJO DIAS1, ALCIONE DA SILVAARRUDA4
1
Graduando do Curso de Agronomia Universidade Federal de Uberlândia/UFU Campus Umuarama 38400-902 Uberlândia,
MG [email protected].
2
Professor Associado II do Instituto de Ciência Agrárias Universidade Federal de Uberlândia /ICIAG UFU Av. Amazonas s/n
Campus Umuarama 38400-902 Uberlândia, MG [email protected]
3
Pós-Doutoranda do Instituto de Ciência Agrárias Universidade Federal de Uberlândia/ICIAG UFU Av. Amazonas SN
Campus Umuarama 38400-902 Uberlândia, MG [email protected]
4
Professora do Instituto de Genética e Bioquímica Universidade Federal de Uberlândia/UFU Av. Amazonas SN Campus
Umuarama 38.400-902 Uberlândia, MG [email protected]
RESUMO
Objetivando determinar a influencia de diferentes
concentrações de cinetina, GA3 e BAP na formação e regeneração
de embriões somáticos de Coffea arabica L., inocularam-se anteras
da cultivar Catuaí Vermelho 44 em meio MS suplementando com
BAP (0, 1, 2, 4 mg L-1) em combinação com 2,4-D (1; 2 e 4 mg L1
). Para cultivar Catuaí Vermelho 99 o meio foi acrescido de
diferentes concentrações de Cinetina (1, 2, 4 e 8 mg L-1) e GA3
(0,1, 0,2 e 0,4 mg L-1). Calos primários do cultivar Catuaí Vermelho
99 foram transferidos para meio de cultura MS suplementado
com 8 mg L-1 de ANA, 1 mg L-1 de AIB, 2 mg L-1 de GA3 e 2 mg
L-1 de Cinetina, testando quatro concentrações de BAP (1,0; 1,5;
2,0 e 2,5 mg L-1). Utilizou-se um delineamento inteiramente
casualizado em fatorial (4x3), sendo 4 as concentrações de BAP
e 3 de 2,4-D, avaliando porcentagem de calos embriogênicos.
Para cultivar Catuaí Vermelho 44 recomenda-se o uso de meio
MS acrescido 2,0 mg L-1 de 2,4-D e 2,31 mg L-1 de BAP para
formação de calos embriogênicos. Para cultivar Catuaí Vermelho
99, a cinetina e o GA3 apresentaram diferenças na indução e
regeneração de embriões, obtendo 73% de calos embriogênicos.
Apesar da contribuição dos reguladores de crescimento ao meio
de cultura para o desenvolvimento de calos embriogênicos, nas
circunstâncias citadas neste trabalho não houve formação de
embriões somáticos a partir de anteras de Coffea arabica L.
Termos para indexação: Coffea arabica, reguladores de
crescimento, androgênese, cultivo in vitro.
ABSTRACT
With the objective to establish the influence of different
concentrations of kinetin, GA3 and BAP on the development and
regeneration of Coffea arabica L. somatic embryo, anthers of Catuaí
Vermelho 44 cultivar were inoculated in MS supplemented with
BAP (0; 1; 2 and 4 mg L-1) combined with 2,4-D (1; 2 and 4 mg L1
). In order to cultivate Catuaí Vermelho 99, different concentrations
of kinetin (1; 2; 4 and 8 mg L-1) and GA3 (0.1; 0.2 and 0.4 mg L-1)
were used. Primary callus of Catuaí Vermelho 99 cultivar were
transferred to MS supplemented with 8 mg L-1 NAA, 1 mg L-1
AIB, 2 mg L-1 GA3 and 2 mg L-1 kinetin testing four concentrations
of BAP (1.0; 1.5; 2.0 and 2.5mg L-1). An entire randomized factorial
(4x3) was used with four BAP concentrations and three 2,4-D
concentrations, in order to evaluate the percentage of embryogenic
callus. For Catuaí Vermelho 44 cultivar, use of MS supplemented
with 2.0 mg L-1 2,4-D and 2.31 mg L-1 BAP is recommended to
form embryogenic callus. For Catuaí Vermelho 99 cultivar, kinetin
and GA3 show some differences on the induction and regeneration
of embryos obtaining 73% of embryogenic callus. Despite the
contribution of growth regulators for the development of
embryogenic callus, in the condition of this study no somatic
embryos were formed from Coffea arabica L. anthers.
Index terms: Coffea arabica, development regulators,
androgenesis, in vitro culture.
INTRODUÇÃO
O sucesso da cafeicultura deve-se, em parte, aos
avanços obtidos nos trabalhos de melhoramento genético,
disponibilizando, com os resultados, variedades
melhoradas, adaptadas às diferentes regiões e aos sistemas
de cultivo, com elevada produtividade de grãos (ALMEIDA
et al., 2000).
O melhoramento do cafeeiro (Coffea arabica L.) é
realizado por meio de hibridações seguidas de seleção de
populações segregantes pelo método genealógico,
finalizando com a obtenção de linhagens, o que leva
aproximadamente trinta anos. No entanto, este tempo pode
ser reduzido por meio da obtenção de haplóides em
gerações segregantes.
(Recebido em 17 de março de 2009 e aprovado em 18 de agosto de 2009)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 111-117, 2009
112
LINO, L. de O. et al.
Sendo uma espécie perene, de ciclo longo e porte
arbustivo, as práticas de melhoramento genético são
dificultadas, principalmente, pelo tempo e pela extensão
da área experimental necessários ao desenvolvimento das
variedades (ALMEIDA et al., 2000).
A técnica de culturas de anteras pode facilitar e
adiantar o melhoramento genético das culturas, o que leva
à rápida produção de plantas homozigóticas por meio da
duplicação do número de cromossomos em uma única
etapa, substituindo, assim, as várias gerações de
autofecundação (PALÚ et al., 2004). Essa técnica já foi
empregada para a regeneração de calos e embrióides de
plantas em aproximadamente 247 espécies, 88 gêneros e 34
famílias.
De acordo com Georg & Sherrington (1984), a
técnica consiste em cultivar anteras imaturas em meio de
cultura apropriada e sob condições ambientais adequadas,
para desviar a rota normal de desenvolvimento dos
micrósporos, levando-os a formação de células vegetativas.
A indução e regeneração de embriões são
determinadas pela composição do meio de cultura e pelos
reguladores de crescimento contidos no mesmo. Os
reguladores de crescimento são substâncias orgânicas que
atuam sobre o desenvolvimento e sobre alguns tipos de
organogênese, regulando ainda, o comportamento in vitro
da planta (PALÚ et al., 2004), sendo indispensáveis em
qualquer técnica de cultura de tecidos.
As auxinas e as citocininas representam os dois
principais grupos de reguladores. As auxinas são
responsáveis pelo crescimento vegetal (podem também
inibir o crescimento, dependendo da concentração na qual
aparecem no vegetal), e ainda podem ser responsáveis
pela abscisão das folhas e pela formação dos frutos. As
auxinas mais utilizadas para promover a androgênese são:
o 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético), ANA (ácido
nafetalenoacético), AIA (ácido indolil-3-acético) e o AIB
(ácido indolil-3-butírico).
As citocininas são reguladores vegetais que
participam ativamente dos processos de divisão e
diferenciação celular, sendo a 6-benzilaminopurina (BAP)
umas das mais utilizadas. Ao contrário das citocininas que
aumentam a produção de etileno, mas com menor efeito
quando comparado com as auxinas, as giberelinas
diminuem a produção de etileno (LUZ, 1995).
No Brasil, o C. arabica já apresenta alguns
resultados com relação à aplicação da cultura de anteras,
sendo que estes definiram a calogênese e a indução de
embrióides nos estágios iniciais de desenvolvimento, no
entanto, necessita-se de maior indução e, principalmente,
regeneração de embriões somáticos.
A fim de contribuir com os estudos nessa cultura,
objetivou-se determinar a influencia de diferentes
concentrações de cinetina, GA3 e BAP na formação e
regeneração de embriões somáticos a partir de calos
provenientes de anteras de Coffea arabica L.
MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório
de Biotecnologia do Instituto de Ciências Agrárias da
Universidade Federal de Uberlândia, MG. Foram utilizados
cultivares de cafeeiro Coffea arabica L.: Catuaí Vermelho
44 e Catuaí Vermelho 99, provenientes da Fazenda
Experimental do Glória da Universidade Federal de
Uberlândia.
Os botões florais foram coletados pela manhã e
medidos com um paquímetro com tamanho de 4,5 a 6,0 mm
que correspondem a anteras contendo micrósporos
uninucleados. Os mesmos foram desinfestados em
solução de álcool 70% por trinta segundos e solução de
hipoclorito de sódio 1% de cloro ativo por quinze minutos,
mantidos sob agitação e em fluxo laminar. Após esse
procedimento, foram lavados três vezes em água destilada
e autoclavada.
As anteras foram retiradas com auxílio de pinças
finas e bisturi, previamente esterilizados, sob luz de um
microscópio estereoscópio em aumento de quarenta vezes.
Concentrações de BAP e 2,4-D na indução de calos na
cv. Catuaí Vermelho 44
As anteras foram inoculadas em tubos de ensaio
contendo o meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 111-117, 2009
Cinetica, ácido giberélico e bap na indução de embriões...
suplementado com BAP em diferentes concentrações (0,0;
1,0; 2,0 e 4,0 mg L-1) em combinação com diferentes
concentrações de 2,4-D (1,0; 2,0 e 4,0 mg L-1) e 30,0 g L-1 de
sacarose. O meio foi solidificado com 7 g L-1 de ágar e o pH
ajustado em 5,7, antes da autoclavagem. A incubação foi
realizada em sala de crescimento, sob condição de
obscuridade, com temperatura de 26 ± 2°C.
Utilizou-se o delineamento inteiramente
casualizado, em fatorial com 4 concentrações de (BAP) x 3
concentrações de (2,4-D), com quatro repetições por
tratamento, sendo cada repetição composta por três tubos
de ensaios contendo um explante (antera) por tubo. A
avaliação foi realizada aos 90 dias após a inoculação,
observando a porcentagem de calos embriogênicos.
Concentrações de Cinetina e Ácido Giberélico (GA3) na
indução de calos embriogênicos na cultivar Catuaí
Vermelho 99.
113
Cada tratamento composto por dez repetições, constituídas
de frascos com 30 mL de meio e um explante (calo) por
frasco, totalizando 40 frascos que permaneceram em sala
de crescimento com temperatura de 26ºC, sob condições
de obscuridade, até o fim do experimento. Após 112 dias,
foram avaliados o diâmetro e a porcentagem de calo com
formação de embriões somáticos.
Todos os dados obtidos foram submetidos à análise
estatística, com aplicação do teste F a 5% de probabilidade.
Para cultivar Catuaí Vermelho 99, utilizou se, para análise,
a comparação de médias no programa estatístico Sisvar®
(FERREIRA, 2000).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Concentrações de BAP e 2,4-D na indução de calos na cv.
Catuaí Vermelho 44
Foram verificadas diferenças significativas para a
As anteras foram inoculadas em meio MS com 1 mg
L de BAP e 2 mg L-1 de 2,4-D, o meio foi solidificado com
0,7% de ágar e o pH foi ajustado em 5.7, antes da
autoclavagem. Os calos obtidos foram transferidos para
os meios MS com diferentes concentrações de cinetina (1,
2, 4 e 8 mg L-1) e GA3 (0,1; 0,2 e 0,4 mg L-1). A incubação foi
semelhante ao experimento anterior. As avaliações foram
realizadas 80 dias após a instalação do experimento,
analisando a porcentagem de calos embriogênicos.
O delineamento utilizado foi inteiramente
casualizado, em fatorial de 4 concentrações de (CIN) x 3
concentrações (GA3), com quatro repetições, sendo cada
repetição composta por três tubos, contendo um explante
(antera) por tubo, num total de 180 tubos.
indução de calos embriogênicos utilizando BAP e 2,4-D.
Concentrações de BAP, ANA, AIB, GA3 e Cinetina, na
diferenciação de embriões somáticos para cultivar Catuaí
Vermelho 99.
cultivar Catuai Vermelho LCH-2077-2-5-44 da espécie Coffea
Calos primários, obtidos de anteras em meio MS
com 1 mg L-1 BAP e 2 mg L-1 de 2,4-D, foram transferidos
para meio de cultura MS suplementado com 30 g L-1 de
sacarose, 6 g L-1 de ágar, 8 mg L-1 de ANA, 1 mg L-1 de AIB,
2 mg L-1 de GA3 e 2 mg L-1 de cinetina, e foram testadas
quatro concentrações de BAP (1,0; 1,5; 2,0 e 2,5 mg L-1).
respondeu melhor formação de calo, embora não diferindo
Ocorreu interação significativa entre 2,4-D e BAP
-1
apenas para a concentração de 2,0 mg L-1 de 2,4-D, quando,
nessa concentração, os tratamentos seguiram uma
tendência quadrática, tendo a concentração de 2,31 mg L1
de BAP correspondendo ao ponto máximo da curva,
atingindo o máximo de calos em 64,26%, de acordo com a
equação derivada. Esse comportamento quadrático indicou
que concentrações acima e abaixo de 2,31 mg L-1 tiveram
tendência de redução do número de calos embriogênicos
formados (Figura 1).
Os resultados deste trabalho, quanto à interação
auxina e citocinina, corroboram com os dados apresentados
por Marques (2006) que trabalhando com anteras de
arabica L. constatou que a combinação de auxina com
citocinina (2 mg L-1 de 2,4-D + 2 mg L-1 de BAP) foi a que
estatisticamente das combinações de 2 mg L-1 de Cinetina
+ 1 mg L-1 de 2,4-D e 2 mg L-1 de 2,4-D + 0,5 mg L-1 TDZ,
porém numericamente foi mais eficiente que as demais.
Magalhães et al. (2006), trabalhando com ápices
caulinares de batata-doce, verificou que a maior
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 111-117, 2009
114
LINO, L. de O. et al.
FIGURA 1 Porcentagem de calo embriogênico de Coffea
arabica L. cv. Catuaí Vermelho 44 em diferentes
concentrações de BAP mantidos na concentração de 2
mg L-1 de 2,4-D.
porcentagem de calos embriogênicos formados foram
obtidos em meio com 2 mg L-1 de 2,4-D para as cultivares
92 ; 94 ; 188 ; 449 ; 594 ; White Star ; Jewel
favorecendo a maturação dos embriões somáticos.
Já para a cultivar Catuaí Vermelho 44 de Coffea
arabica L. quando utilizou-se somente 2,4-D, verificou-se
baixa porcentagem de calos embriogênicos (4,21%), no
entanto, com a adição de BAP houve um acréscimo
significativo (64,26%) até a concentração 2,31 mg L-1.
Bispo et al. (2007) verificaram que para Avena sativa
L. houve a influência do genótipo na frequência de calos
embriogênicos onde a cultivar OR3 produziu a mais alta
frequência desse tipo de calo (66,7%). Flores et al. (2006)
também observaram que a formação de calos em Pfaffia
tuberosa (Moq. ex DC.) Hicken foi induzida em 27% dos
explantes foliares quando cultivados em meio com 221 mg
L-1 de 2,4-D.
Influência de diferentes concentrações de Cinetina e Ácido
Giberélico (GA3) na indução de calos embriogênicos na
cultivar Catuaí Vermelho 99.
Avaliando a indução de calos embriogênicos em
diferentes concentrações de cinetina e ácido giberélico,
observou-se maior porcentagem de calos embriogênicos,
aos 80 dias após a inoculação, obtida em meio de cultura
com a combinação de (8 mg L-1 de cinetina + 0,2 mg L-1 de
GA3), obtendo 73% de calos embriogênicos, seguido do
tratamento com (1 mg L-1 de cinetina + 0,1 mg L-1 de GA3)
com 47% de calos embriogênicos (Tabela 1).
Pereira et al. (2007) trabalhando com embriogênese
somática direta em explantes foliares de café (Coffea
arabica L.) cultivar Acaiá Cerrado, obtiveram o maior
número de embriões somátios utilizando 5,6 mg L-1 de
cinetina combinada com 10 mg L-1 de GA3, porém, ao
aumentar a concentração de GA3 para 10 mg L-1 e 20 mg L1
e reduzir a concentração de cinetina para 6 mg L-1,
verificaram uma redução na formação de embriões. Esses
autores concluíram que a formação de embriões somáticos
é fornecida pela cinetina.
De uma forma geral, a maior concentração de
cinetina, 8 mg L-1, associadas com 0,1 mg L-1; 0,2 mg L-1 e
0,4 mg L-1 de GA3 promoveram 30% de calos embriogênicos,
enquanto que baixas concentrações de cinetina, 1 mg L-1,
associadas com 0,1 mg L-1; 0,2 mg L-1 de GA3 promoveram
47% a 40% de calos embriogênicos, demonstrando a
especificidade das interações desses fitoreguladores na
embriogênese, não havendo um sinergismo entre doses
crescentes, nem antagonismo, tornando-se evidente a
importância da cinetina, tanto para a formação de
embriogênese somática direta em explantes foliares, quanto
para formação de calos embriogênicos a partir de anteras.
Quanto à importância das giberelinas (GA3), sabese que são responsáveis pela regulação do crescimento por
meio da redução do potencial osmótico e potencial hídrico
da célula do embrião, resultando na absorção de água e no
aumento do potencial de pressão necessários para o
alongamento celular, porém, pouco se sabe sobre sua ação
em cultura de calos haplóides (PEREIRA et al., 2007).
De acordo com os mesmos autores, a friabilidade
dos calos nas fases iniciais de indução é desejada, porém
em excesso compromete a qualidade dos calos
embriogênicos e, consequentemente, podem até mesmo
reduzir o número de embriões somáticos, em razão da
ausência de uma massa celular densa e organizada.
Calos friáveis são originados de concentrações
iguais ou próximas de auxinas e citocininas, no entanto, o
fator genético parece ser o mais importante do que até
mesmo fatores exógenos, pois a diferenciação dos calos
ocorreu concomitantemente ao processo de indução, em
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 111-117, 2009
Cinetica, ácido giberélico e bap na indução de embriões...
que anteras provenientes de diversas plantas são
inoculadas nas mesmas condições de obscuridade,
temperatura, atmosfera e nas mesmas composições do meio
de cultura, com respostas diferentes para a friabilidade
(MARQUES, 2006).
Os demais tratamentos diferiram pouco entre si
quanto ao diâmetro médio dos calos, sendo distinguidas
diferenças apenas pela análise estatística, não sendo
115
encontrada nenhuma relação entre o diâmetro e a
porcentagem de calos embriogênicos e nem com a
porcentagem de calos friáveis (Tabela 2).
Concentrações de BAP, ANA, AIB, GA3 e cinetina, na
diferenciação de embriões somáticos na cultivar Catuaí
Vermelho 99.
Aos 112 dias após a inoculação, não houve
formação de embriões somáticos e os tratamentos
TABELA 1 Porcentagem de calos embriogênicos obtidos da interação de cinetina (1, 2, 4, 8 mg L-1) e GA3 (0,1; 0,2; 0,4
mg L-1) em anteras da cultivar Catuaí Vermelho 99 inoculadas em meio de cultura MS, Uberlândia-MG, 2007.
Calos Embriogênicos (%)
Tratamentos
8mg CIN+0,2mgGA3
73,0 a
1mg CIN+0,1mgGA3
47,0 b
1mg CIN+0,2mgGA3
40,0 c
8mg CIN+0,1mgGA3
33,0 d
8mg CIN+0,4mgGA3
33,0 d
2mg CIN+0,4mgGA3
27,0 e
4mg CIN+0,4mgGA3
27,0 e
2mg CIN+0,2mgGA3
20,0 f
2mg CIN+0,1mgGA3
13,0 g
4mg CIN+0,1mgGA3
13,0 g
4mg CIN+0,2mgGA3
7,0 h
1mg CIN+0,4mgGA3
7,0 h
Números seguidos de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
TABELA 2 Diâmetro Médio dos Calos obtidos da interação de cinetina ((1, 2, 4, 8 mg L-1) e GA3 (0,1; 0,2; 0,4 mg L-1)
em anteras da cultivar Catuaí Vermelho 99 inoculadas em meio de cultura MS, Uberlândia-MG, 2007.
Tratamento
Diâmetro Médio dos Calos (mm)
8mg CIN+0,2GA3
5,77 a
8mg CIN+0,1GA3
5,33 b
2mg CIN+0,4GA3
5,20 c
1mg CIN+0,1GA3
5,17 d
4mg CIN+0,2GA3
4,93 e
1mg CIN+0,2GA3
4,80 f
4mg CIN+0,4GA3
4,43 g
1mg CIN+0,4GA3
4,20 h
8mg CIN+0,4GA3
4,20 h
4mg CIN+0,1GA3
4,15 i
2mg CIN+0,2GA3
3,85 j
2mg CIN+0,1GA3
3,73 l
Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 111-117, 2009
116
LINO, L. de O. et al.
(concentrações de BAP) não diferem estatisticamente entre
si. O que pode ser explicado pela perda da capacidade
embriogênica comum em embriogênese indireta. Vários
estudos têm demonstrado a importância da transferência
imediata dos calos, após a sua formação para o meio de
regeneração, a fim de evitar ou reduzir aberrações genéticas
e maximizar a porcentagem de regeneração (CHEN, 1986;
MERQUES, 2006; PEREIRA et al., 2007). Na cultura de anteras,
vários são os fatores que afetam a eficiência do processo,
determinando, muitas vezes, falta de reprodutibilidade dos
resultados, desde genótipos responsivos a fatores
fisiológicos e ambientais (SILVA & FERREIRA, 2006).
Segundo Uhrig (1985), a capacidade de formar calo
ou embrióides é hereditária, e parece que essa resposta é
controlada por um número limitado de genes nucleares.
Resultados semelhantes, obtidos neste trabalho, foram
encontrados por Silva & Ferreira (2003) para anteras de
cafeeiro inoculadas em meio de cultura MS suplementado
com ANA, cinetina, AIB, GA3 e BAP que verificaram que
os tratamentos não diferiram significativamente entre si
quanto à característica diâmetro dos calos e obtiveram um
baixo índice de respostas à formação de embriões
somáticos, ocorrendo em apenas dois tratamentos não
mencionados pelo autor e em somente cinco calos.
CONCLUSÕES
Para cultivar Catuaí Vermelho 44, recomenda-se o
uso de meio MS acrescido 2,0 mg L-1 de 2,4-D e 2,31 mg L1
de BAP para formação de calos embriogênicos.
Para cultivar Catuaí Vermelho 99, a combinação de
-1
8 mg L de cinetina e 0,2 mg L-1 de GA3 favorece a obtenção
de 73% calos embriogênicos.
Apesar da contribuição dos reguladores de
crescimento ao meio, para o desenvolvimento de calos
embriogênicos, nas circunstâncias citadas neste trabalho
não houve formação de embriões somáticos a partir de
anteras de Coffea arabica L.
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Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 111-117, 2009
118
ENRAIZAMENTO IN VITRO
E ACLIMATIZAÇÃO
DE MUDAS
SILVEIRA,
D. G. et al.
MICROPROPAGADAS DE CAROÁ
IN VITRO ROOTING AND ACCLIMATIZATION OF MICROPROPAGATED
NEOGLAZIOVIA VARIEGATA (ARRUDA) MEZ
DANIELA GARCIA SILVEIRA1, FERNANDA VIDIGAL DUARTE SOUZA2, CARLOS ALBERTO DA SILVA LEDO3,
ÁDILA MELO VIDAL4, JOSÉ RANIERE FERREIRA DE SANTANA5
1
Professora visitante Departamento de Ciências Biológicas Universidade Estadual de Feira de Santana/UEFS Avenida Universitária,
s/n 44031-460 Feira de Santana, BA [email protected]
2
Pesquisador
Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical
Cx. P. 007
44380-000
Cruz das Almas, BA
[email protected]
3
Pesquisador Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical Cx. P. 007 44380-000 Cruz das Almas, BA [email protected]
4
Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Ciências Agrárias Universidade Federal do Recôncavo da Bahia/UFRB 44380-000
Cruz das Almas, BA [email protected]
5
Professor Departamento de Ciências Biológicas Universidade Estadual de Feira de Santana/UEFS Avenida Universitária s/n
44031-460 Feira de Santana, BA [email protected]
RESUMO
Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez pertence à família
das Bromeliáceas e é largamente usada para a extração de fibras
na Região Nordeste do Brasil, constituindo-se em atividade
econômica importante para famílias da Região pela confecção
de produtos artesanais. Atividades antrópicas têm reduzido de
forma drástica a população de plantas de caroá. Para otimizar a
produção de plantas in vitro, avaliou-se o efeito da interação
entre ANA (0,0 µM; 0,5 µM e 5,3 µM) e CIN (0,0 µM, 2,2
µM e 4,4 µM) no meio de cultura MS, visando a estabelecer um
protocolo para enraizamento in vitro e, posteriormente, a
aclimatização ex vitro das plantas no substrato Plantmax®.
Verificou-se que a presença de ANA no meio de cultura MS
acelera o processo de enraizamento in vitro de caroá e que a
aclimatização das mudas originadas dos meios com a presença
da ANA foram as que apresentaram os melhores resultados
para a taxa de sobrevivência, número de folhas, altura da parte
aérea, comprimento da maior raiz, massa seca da parte aérea e
da raiz.
rate, leaf number, shoot height, length of the longest root and
shoot and dry matter weight.
Termos para indexação: Neoglaziovia variegata, Bromeliaceae,
cultura de tecidos, extração de fibras.
produção organizado reduziram de forma drástica a
ABSTRACT
Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez belongs to
Bromeliaceae family and is wide used for fiber extraction in the
Northeast Region of Brazil constituting a very important
economical activity for several Northeastern families with the
manufacturing of hand made products. Anthropic activity has
been caused severe losses in natural plant population of Caroá.
To optimize the in vitro plant production of Neoglaziovia
variegate, the effect of the interaction between NAA (0.0; 0.5
and 5.3 µM) and KIN (0.0; 2.2 and 4.4 µM) in MS media in
order to established an in vitro rooting protocol and the later
acclimatization in Plantmax®. The results showed that the use of
NAA improved the in vitro rooting process and the produced
plants from using this hormone showed the best results for survival
sistema reprodutivo preferencialmente alógamo, apesar de
Index terms: Neoglaziovia variegata, Bromeliaceae, tissue
culture, fiber extraction.
INTRODUÇÃO
Neoglaziovia variegata (Arruda) Mez é uma espécie
de Bromeliaceae, nativa do estrato baixo da Caatinga e
conhecida na Região Nordeste do Brasil como caroá. Suas
fibras já foram usadas para produção de linho no século
passado e atualmente são usadas na confecção de produtos
artesanais, gerando empregos e renda para famílias da
Região Nordeste (BARROS, 1941; RIBEIRO, 2007).
A coleta predatória e a falta de um sistema de
população de plantas de caroá. Essa espécie apresenta um
ser propagado principalmente por via vegetativa
(SILVEIRA et al., 2009a), porém suas inflorescências são
difíceis de serem encontradas, por serem utilizadas como
fonte de alimento por animais e pássaros, além de possuir
taxa de multiplicação baixa, o que constitui uma limitação
para a produção de mudas, e, consequentemente, para o
estabelecimento de cultivos racionais.
Desde 2005, estudos vêm sendo realizados com
vistas ao desenvolvimento de um protocolo de propagação
(Recebido em 27 de fevereiro de 2009 e aprovado em 21 de agosto de 2009)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 118-128, 2009
Enraizamento in vitro e aclimatização de mudas...
de caroá que permita a obtenção de mudas sadias,
constituindo-se no primeiro passo para o estabelecimento
de um sistema de cultivo e produção, a fim de se evitar o
extrativismo predatório. A micropropagação do caroá
mostrou-se possível, quando a partir de plântulas
germinadas in vitro, milhares de plantas foram produzidas
(SILVEIRA et al., 2009b). No entanto, dentre as etapas
dessa técnica, o enraizamento in vitro e posterior
transferência dos brotos enraizados para condições
ambientais são as mais críticas. Nesse momento, ocorre a
transição do heterotrofismo para o autotrofismo, em
condições ex vitro (SCIUTTI & MORINI, 1993), havendo
um número expressivo de espécies vegetais
micropropagadas que não sobrevive nesse período
(HARARIKA, 2003), por possuir um sistema radicular
adventício in vitro ser, em geral, pouco ramificado,
quebradiço e isento de pêlos radiculares, com raízes pouco
funcionais na absorção de água e nutrientes durante a
aclimatização (HOFFMANN et al., 2001).
Na fase de enraizamento in vitro, diversas auxinas,
isoladamente ou em combinação, podem ser utilizadas
para a maioria das espécies (BOSA et al., 2003),
principalmente em espécies ornamentais, pois as
características de interesse comercial são mantidas
(TAGLIACOZZO et al., 1998). Contudo, diversas
espécies, principalmente as herbáceas, enraízam
facilmente in vitro, em meio básico sem reguladores de
crescimento ou com baixa concentração de auxinas
(ANDERSON, 1984). Além disso, Barboza et al. (2004) e
Gupta (1986) referem-se à adição de citocinina como
favorável ao enraizamento. Conforme Hartmann & Kester
(1990) há necessidade de estudos para determinar o melhor
regulador e a concentração ideal, visto que as espécies
respondem de forma diferenciada.
O caroá, à semelhança de outras plantas da família
Bromeliaceae, necessita de um longo período de
aclimatização, demandando estudos que possam melhorar
o desempenho das plantas nesta etapa e tornar o processo
mais eficiente. A indução da rizogênese in vitro pode auxiliar
na melhoria desse processo.
119
Em vista do exposto e visando a otimizar a produção
de mudas de caroá, objetivou-se avaliar o efeito de
reguladores de crescimento que pudessem favorecer o
enraizamento in vitro e, posteriormente, a aclimatização de
plantas de caroá.
MATERIAL E MÉTODOS
Para a avaliação do enraizamento in vitro, utilizouse como explantes brotos e plantas de caroá [Neoglaziovia
variegata (Arruda) Mez] provenientes do quinto
subcultivo dos meios de cultura MS (MURASHIGE &
SKOOG, 1962) com 0,5 µM de ANA (ácido naftalenoacético)
+ 4,4 µM de BAP (6-benzilaminopurina), MS com 0,5 µM
de ANA + 2,2 µM de CIN (cinetina) e MS com 0,5 µM de
ANA + 4,4 µM de CIN (SILVEIRA et al., 2009b).
Considerou-se como broto o explante oriundo do
tratamento com BAP, pois não havia presença de raízes, e
como plantas, o que foi originado dos tratamentos com
CIN, que apresentavam um sistema radicular desenvolvido
durante a etapa de multiplicação. Contudo, essas raízes
foram eliminadas, antes de serem introduzidas nos
diferentes meios de cultura.
O delineamento experimental foi inteiramente
casualizado, em esquema fatorial 3x3x3 (tipos de
explantes oriundos de meios de multiplicação x
concentrações de ANA x concentrações de CIN) com 25
repetições por tratamento. Foram analisadas todas as
combinações entre concentrações de ANA (0,0 µM; 0,5
µM e 5,3 µM) e CIN (0,0 µM, 2,2 µM e 4,4 µM) em meio
de cultura MS suplementado com 30 g L-1 de sacarose,
solidificado com 2 g L -1 de Phytagel ® , pH 5,8 e
esterilizado a 120 °C.
Os explantes foram incubados sob condições de
temperatura de 27 ± 1 ºC, fotoperíodo de 16 horas e
densidade de fluxo de fótons de 22 µE m-2 s-1. Após 60
dias de cultivo, avaliou-se a taxa de enraizamento (TE), o
número de folhas (NF), altura (cm) da parte aérea (APA),
o número de raízes (NR) e o comprimento (cm) da maior
raiz (CMR). Nas variáveis NF, APA e CMR aplicou-se a
transformação raiz quadrada e na variável NR utilizou-se
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 118-128, 2009
120
SILVEIRA, D. G. et al.
log (x + 10) a fim de se corrigir desvios na distribuição
normal dos dados.
Para a etapa de aclimatização, as mudas obtidas do
experimento de enraizamento in vitro foram transplantadas
em tubetes contendo o substrato Plantmax® e mantidas em
estufa sob nebulização durante 210 dias.
O delineamento experimental foi inteiramente
casualizado, em esquema de parcela subdividida no
tempo, com 25 repetições. As parcelas foram constituídas
pelos tratamentos do experimento anterior e as
subparcelas foram formadas por três períodos de
avaliação: período 1 (antes da transferência dos explantes
para tubetes), período 2 (aos 90 dias de aclimatização) e
período 3 (após 210 dias de aclimatização). Essas
avaliações foram realizadas nesses períodos visando a
obter uma melhor distribuição das leituras para observar
o desenvolvimento das mudas.
Nos três períodos, avaliou-se o número de folhas
(NF) e altura (cm) da parte aérea (APA). As variáveis taxa
de sobrevivência (TS), comprimento (cm) da maior raiz
(CMR), massa seca (g) da parte aérea (MSPA) e massa
seca (g) da raiz (MSR) só foram estudadas no período 3. A
variável número de raízes (NR) foi avaliada nos períodos 1
e 3. Nas variáveis APA, MSPA e MSR aplicaram-se a
Meios de enraizamento
B: ANA (0,5 µM) + BAP (4,4 µM)
transformação raiz quadrada, a fim de se corrigir desvios
na distribuição normal dos dados.
As médias referentes aos tipos de meios foram
agrupadas pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade
e as médias dos explantes e das variáveis avaliadas foram
comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade de
erro.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A resposta rizogênese variou de 80% a 100%, sendo
que as plantas oriundas do meio MS com ANA (0,5 µM) +
CIN (2,2 e 4,4 µM) apresentaram taxas de enraizamento
mais altas em todos os tratamentos (Figura 1). As menores
taxas de enraizamento (84%, 88% e 80%) foram registradas
com os brotos nos tratamentos 1 (0,0 µM ANA + 0,0 µM
CIN), 2 (0,0 µM ANA + 2,2 µM CIN) e 3 (0,0 µM ANA + 4,4
µ M CIN), respectivamente, que continham somente
cinetina no meio de cultura, com exceção do tratamento 1
que constituiu a testemunha, não contendo nenhum
regulador de crescimento. Estudos com enraizamento in
vitro de brotos de abacaxi provenientes do meio com ANA
+ BAP realizado por Barboza et al. (2004) obtiveram 12%
de enraizamento in vitro, quando cultivados no meio com
a presença de cinetina.
P: ANA (0,5 µM) + CIN (2,2 µM)
P: ANA (0,5 µM) + CIN (4,4 µM)
T9: ANA (5,3 µM) + CIN (4,4 µM)
T8: ANA (5,3 µM) + CIN (2,2 µM)
T7: ANA (5,3 µM) + CIN (0,0 µM)
T6: ANA (0,5 µM) + CIN (4,4 µM)
T5: ANA (0,5 µM) + CIN (2,2 µM)
T4: ANA (0,5 µM) + CIN (0,0 µM)
T3: ANA (0,0 µM) + CIN (4,4 µM)
T2: ANA (0,0 µM) + CIN (2,2 µM)
T1: ANA (0,0 µM) + CIN (0,0 µM)
0
20
40
60
80
100
Enraizamento (%)
FIGURA 1 Enraizamento in vitro de brotos e plantas micropropagados de caroá (N. variegata) após 60 dias cultivados
em meio MS com as diferentes combinações de ANA e Cinetina. Brotos [B: ANA + BAP (4,4 µM)] e Plantas [P: ANA +
CIN (2,2 µM) e P:ANA + CIN (4,4 µM)].
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 118-128, 2009
Enraizamento in vitro e aclimatização de mudas...
Esses resultados evidenciam a necessidade da
presença da auxina no meio de cultura para obtenção de
taxas mais elevadas no enraizamento in vitro dos brotos
de caroá, corroborando com os resultados que foram
encontrados no enraizamento in vitro de explantes de
Vriesea cacuminis L.B.Smith (Bromeliaceae) proveniente
de meios de cultura com BAP ou GA3 (MENDES et al.,
2007).
A maior formação de folhas foi observada nos
brotos de caroá em relação às plantas (Tabela 1). O maior
número de folhas dos brotos (15,88) foi obtido no meio
com ANA (5,3 µM) + CIN (2,2 µM), apesar desse valor não
diferir estatisticamente quando este explante foi cultivado
no meio com a mesma concentração de ANA sem a
presença da cinetina (14,92). As plantas também
apresentaram comportamento semelhante nessa variável,
pois as maiores médias foram obtidas na ausência de
cinetina no meio de cultura.
Na Tabela 1, observa-se que o meio com a maior
concentração de ANA (5,3 µM) sem a presença de cinetina
foi o mais eficiente para a altura da parte aérea, sendo que
a altura mais expressiva (4,16cm) foi verificada nas plantas
provenientes do meio de multiplicação ANA + CIN (2,2
µM). Já para a variável número de raízes as melhores
respostas foram obtidas nos meios de enraizamento,
utilizando a maior concentração de ANA combinado com a
presença (2,2 µM) ou ausência de cinetina, porém, os
brotos oriundos do meio ANA + BAP (4,4 µM) foram os
que apresentaram a maior quantidade de raízes (8,80).
Com relação ao comprimento da maior raiz (Tabela
1), o meio sem reguladores de crescimento proporcionou a
melhor resposta para brotos e plantas, exceto para as
plantas provenientes do meio de multiplicação ANA + CIN
(4,4 µM) que apresentaram o maior comprimento na
presença de 0,5 µM de ANA. Entretanto, esse tratamento
não diferiu estatisticamente do meio de cultura sem
reguladores (Testemunha).
Observou-se também uma diminuição do
comprimento das raízes com o aumento da concentração
de ANA no meio de cultura (Tabela 1). Silva et al. (2007)
121
obtiveram resultados semelhantes utilizando a auxina,
ácido idol-butírico (IBA), no enraizamento in vitro de Aloe
vera L. Salisbury & Ross (1991) relataram que existe
necessidade de auxina na fase de indução do sistema
radicular, porém o aumento da concentração de ANA ou
IBA no meio pode ocasionar a inibição completa do
crescimento radicular.
Com base nesses resultados, verifica-se que a
presença de ANA no meio de cultura MS é de fundamental
importância na aceleração do processo de enraizamento in
vitro de caroá, tanto para os explantes provenientes dos
meios com BAP (brotos), como os de cinetina (plantas).
Em estudos com outras espécies de Bromeliáceas,
observaram resultados similares com o uso de ANA
(BARBOZA et al., 2004; MENDES et al., 2007; MERCIER
& KERBAUY, 1993). Em geral, o aumento na concentração
de auxinas adicionadas ao meio de cultura, com o propósito
de induzir enraizamento, é favorável até uma determinada
concentração, a partir do qual o efeito pode se tornar
contrário, sendo influenciada pela espécie, pelo tipo de
explante e da concentração de auxina endógena que o
tecido utilizado possui (MENDES et al., 2007). Sendo assim,
a formação de raízes dos explantes de caroá cultivados em
meio sem reguladores de crescimento, provavelmente
ocorreu em razão do acúmulo de auxinas endógenas
provenientes das folhas e principalmente das gemas.
Segundo Coll et al. (1988) a parte aérea da planta é fonte de
intensa produção de auxina que, ao ser translocada para
base, estimula a rizogênese.
Na aclimatização das mudas enraizadas in vitro com
o substrato Plantmax® observou-se que após 210 dias de
aclimatização a taxa de sobrevivência variou de 72 a 100%
para as mudas originadas do meio ANA-BAP (4,4 µM)
(brotos), sendo que as menores taxas foram obtidas nos
tratamentos em que a cinetina estava presente no meio de
enraizamento, exceto no tratamento 2. Já para as mudas
provenientes dos meios ANA-CIN (2,2 e 4,4 µM) (plantas)
a taxa de sobrevivência foi de 80 a 100%, apresentando as
maiores taxas nas plantas que foram cultivadas sem ANA
e com a menor concentração de cinetina (Figura 2).
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 118-128, 2009
122
SILVEIRA, D. G. et al.
TABELA 1 Valores médios do número de folhas (NF), altura (cm) da parte aérea (APA), número de raízes (NR) e
comprimento (cm) da maior raiz (CMR) dos brotos e plantas de caroá (Neoglaziovia variegata) após 60 dias de
enraizamento in vitro.
CIN
(µM)
0
2,2
4,4
CIN
(µM)
0
2,2
4,4
CIN
(µM)
0
2,2
4,4
CIN
(µM)
0
2,2
4,4
NF
Explante-Meio de Multiplicação
B:ANA + BAP (4,4 µM)*
P:ANA + CIN (2,2 µM)
ANA (µM)
0
0,5
5,3
0
0,5
5,3
9,32aC** 11,20aB 14,92aA
10,75aA 10,16aA 10,56aA
7,92bB
8,36bB 15,88aA
9,16bA
8,72bA
9,28aA
8,00bB
9,52bA
9,84bA
6,38cB
7,60bA
7,72bA
APA
Explante-Meio de Multiplicação
B:ANA + BAP (4,4 µM)
P:ANA + CIN (2,2 µM)
ANA (µM)
0
0,5
5,3
0
0,5
5,3
2,78aA
3,08aA
3,08aA
3,26aB
3,50aB
4,16aA
1,96bA
2,29abA 2,12bA
3,14aA
2,60bA
3,16bA
2,32abAB
1,94aB
2,66abA 2,01bB
2,34bAB 2,81bA
NR
Explante-Meio de Multiplicação
B:ANA + BAP (4,4 µM)
P:ANA + CIN (2,2 µM)
ANA (µM)
0
0,5
5,3
0
0,5
5,3
4,52aB
4,96aB
8,80aA
4,04aB
3,36aB
7,95aA
2,28bB
3,60abB 7,80aA
3,40aB
3,08aB
5,96aA
1,84bB
2,84bB
7,84aA
3,24aA
3,60aA 4,15bA
CMR
Explante-Meio de Multiplicação
B:ANA + BAP (4,4 µM)
P:ANA + CIN (2,2 µM)
ANA (µM)
0
0,5
5,3
0
0,5
5,3
5,01aA
4,75abA 2,63abB
4,53aA
3,61aB 2,30aC
3,27bB
4,80aA
2,09bC
3,43bA
3,41aA 2,54aB
2,87bB
3,93bA
3,32aAB
2,52cA
3,65aB 2,33aA
P:ANA + CIN (4,4 µM)
0
9,12aB
7,68bB
7,60bA
0,5
9,76aB
7,68bB
8,40bA
5,3
10,24aA
9,52abA
8,60bA
P:ANA + CIN (4,4 µM)
0
3,34aA
1,99bB
1,96bA
0,5
3,34aA
2,01bB
2,15bA
5,3
3,71aA
3,52bA
2,42bA
P:ANA + CIN (4,4 µM)
0
4,08aB
4,00abA
2,56bA
0,5
4,52aB
3,48aB
2,95aAB
5,3
7,52aA
6,64aA
4,32bA
P:ANA + CIN (4,4 µM)
0
3,37aA
2,74abA
2,48bA
0,5
3,78aA
2,15bAB
2,69bA
5,3
1,86aB
1,83aB
1,99aA
*Brotos [B: ANA + BAP (4,4 µM)] e Plantas [P: ANA + CIN (2,2 µM) e P: ANA + CIN (4,4 µM)].
**Médias seguidas pela mesma letra minúscula dentro das colunas e maiúscula nas linhas em cada tipo de explante
oriundo dos meios de multiplicação não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade.
Na Tabela 2, pode-se observar que as maiores
médias do número de folhas foram obtidas nos períodos 1
e 2 para todos os tratamentos dos três tipos de explantes
provenientes dos meios de multiplicação, ocorrendo uma
diminuição dessa variável no período 3. Contudo, as mudas
enraizadas no meio ANA (0,5 µM) + CIN (0,0 µM) (T4)
foram as que apresentaram as maiores médias para todos
os explantes, após os 210 dias de aclimatização. Essa
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 118-128, 2009
Enraizamento in vitro e aclimatização de mudas...
B: ANA (0,5 µM) + BAP (4,4 µM)
P: ANA (0,5 µM) + CIN (2,2 µM)
123
P: ANA (0,5 µM) + CIN (4,4 µM)
T9: ANA (5,3 µM) + CIN (4,4 µM)
Meios de enraizamento
T8: ANA (5,3 µM) + CIN (2,2 µM)
T7: ANA (5,3 µM) + CIN (0,0 µM)
T6: ANA (0,5 µM) + CIN (4,4 µM)
T5: ANA (0,5 µM) + CIN (2,2 µM)
T4: ANA (0,5 µM) + CIN (0,0 µM)
T3: ANA (0,0 µM) + CIN (4,4 µM)
T2: ANA (0,0 µM) + CIN (2,2 µM)
T1: ANA (0,0 µM) + CIN (0,0 µM)
0
20
40
60
80
100
Sobrevivência (%)
FIGURA 2 Sobrevivência das mudas de caroá (N. variegata) originadas de diferentes meios de cultura e enraizadas
in vitro em diferentes tratamentos após 210 dias de aclimatização. Brotos [B: ANA + BAP (4,4 µM)] e Plantas [P: ANA
+ CIN (2,2 µM) e P:ANA + CIN (4,4 µM)].
diminuição do número de folhas pode ser decorrente de
uma deficiência na disponibilidade e aporte de nutrientes,
precisando assim uma adubação foliar para ajudar no
desenvolvimento das mudas.
A altura da parte aérea (APA) das mudas de caroá
apresentou resultados semelhantes para os tipos de
explantes (brotos e plantas) provenientes dos diferentes
meios de multiplicação (Tabela 2). Aos 210 dias de
aclimatização, obtiveram-se as maiores médias para essa
variável, sendo que as mudas enraizadas no tratamento 4
foram as que mais se destacaram independentemente do
meio de multiplicação utilizado. Ainda que as mudas
originadas dos meios ANA + CIN (2,2 e 4,4 µ M)
apresentassem a maior média nos tratamentos 7 e 8
respectivamente, não diferiram estatisticamente da média
do tratamento 4.
Na variável número de raízes os brotos e plantas
originados dos meios de multiplicação apresentaram
respostas similares, sendo que. no período 1 as maiores
médias foram obtidas no meio de enraizamento com ANA
(5,3 µM) + CIN (0,0 µM) (T7) (Tabela 3). Contudo, aos 210
dias observou-se aumento dessa variável nos tratamentos
1 a 6 e uma diminuição nos tratamentos 7 a 9. O maior
número de raízes (8,00) foi observado no tratamento 1 para
os brotos originados do meio com ANA-BAP, contudo.
esse valor não diferiu estatisticamente dos demais
tratamentos. Para as mudas provenientes do meio de
multiplicação ANA + CIN (2,2 µM) a maior média foi no
tratamento 4 (6,20), não tendo diferença também entre os
tratamentos. Já as mudas originadas do meio de
multiplicação ANA + CIN (4,4 µM) apresentaram os
melhores resultados nos tratamentos 4 e 8 com os valores
de 5,60 e 6,50, respectivamente. Coll et al. (1988) relataram
que o crescimento acelerado das raízes pode retardar o
desenvolvimento da parte aérea, em razão do crescimento
ativo do sistema radicular necessitar de substâncias
orgânicas translocadas da parte aérea para a base,
comprometendo, assim, o desenvolvimento do caule e das
folhas.
As variáveis analisadas somente no terceiro
período da avaliação apresentaram diferenças entre os
tratamentos e o tipo de explante (Tabela 4). A maior média
para o comprimento da maior raiz foi observada nas plantas
originadas do meio de multiplicação ANA + CIN (4,4 µM)
quando enraizadas no meio T4 (14,470 cm), porém nesse
tratamento os explantes (brotos e plantas) não diferiram
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 118-128, 2009
124
SILVEIRA, D. G. et al.
TABELA 2 Valores médios do número de folhas (NF) e altura (cm) da parte aérea (APA) de mudas de caroá (N.
variegata) originadas de diferentes meios de cultura e enraizadas in vitro em diferentes tratamentos em três períodos
da aclimatização.
Meios de
enraizamento
T1: ANA (0,0 µM)
+ CIN (0,0 µM)
T2: ANA (0,0 µM)
+ CIN (2,2 µM)
T3: ANA (0,0 µM)
+ CIN (4,4 µM)
T4: ANA (0,5 µM)
+ CIN (0,0 µM)
T5: ANA (0,5 µM)
+ CIN (2,2 µM)
T6: ANA (0,5 µM)
+ CIN (4,4 µM)
T7: ANA (5,3 µM)
+ CIN (0,0 µM)
T8: ANA (5,3 µM)
+ CIN (2,2 µM)
T9: ANA (5,3 µM)
+ CIN (4,4 µM)
Meios de
enraizamento
T1: ANA (0,0 µM)
+ CIN (0,0 µM)
T2: ANA (0,0 µM)
+ CIN (2,2 µM)
T3: ANA (0,0 µM)
+ CIN (4,4 µM)
T4: ANA (0,5 µM)
+ CIN (0,0 µM)
T5: ANA (0,5 µM)
+ CIN (2,2 µM)
T6: ANA (0,5 µM)
+ CIN (4,4 µM)
T7: ANA (5,3 µM)
+ CIN (0,0 µM)
T8: ANA (5,3 µM)
+ CIN (2,2 µM)
T9: ANA (5,3 µM)
+ CIN (4,4 µM)
NF
Explante-Meio de Multiplicação
B-ANA+BAP (4,4 µM)*
P-ANA+CIN (2,2 µM)
Períodos de avaliação (dias)
0
90
210
0
90
210
P-ANA+CIN (4,4 µM)
0
90
9,32cB*
*
7,92dA
10,61aA
6,83bC
10,75aA
11,33aA
7,60bB
9,12aA
9,68bA
7,08bB
8,00bA
6,50bB
9,16bB
10,24bA
7,36bC
7,68bB
8,88cA
6,24bC
8,0dAB
8,60bA
7,54aB
6,38dB
7,65dA
6,00cB
7,60bA
8,25cA
6,39bB
11,2bA
10,08aB
8,20aC
10,16aA
11,13aA
8,80aB
9,76aB
11,30aA
8,00aC
8,36dB
10,04aA
7,24aB
8,72bA
9,60cA
5,95cB
7,68bB
8,95cA
6,66bB
9,52cA
8,12bB
6,29bC
7,60cB
9,35cA
6,35cC
8,40bB
9,95bA
6,73bC
14,92aA
8,96bB
6,28bC
10,56aA
10,00bA
7,13bB
10,24aA
9,31bA
7,59aB
15,88aA
8,75bB
5,60bC
9,28bA
9,28cA
6,72cB
9,52aB
10,83aA
7,37aC
9,84cA
10,15aA
6,70bB
7,72cB
9,29cA
6,79cB
8,60bA
9,40bA
6,92bB
APA
Explante-Meio de Multiplicação
B-ANA+BAP (4,4 µM)
P-ANA+CIN (2,2 µM)
Períodos de avaliação (dias)
0
90
210
0
90
210
210
P-ANA+CIN (4,4 µM)
0
90
210
2,78aB
3,27aB
5,43bA
3,26bB
2,75bB
5,88aA
3,34aA
2,56aB
3,92bA
1,96bC
2,83aB
4,62cA
3,14cB
2,63bB
5,24bA
2,00bB
1,96bB
3,55cA
2,32bB
2,46bB
5,11bA
2,01dB
2,11bB
4,45bA
1,96bB
1,57bB
3,18cA
3,08aB
3,06aB
6,16aA
3,50bB
2,91bA
6,35aA
3,34aB
2,97aB
5,47aA
2,29bC
3,03aB
5,69aA
2,60cB
2,64bB
4,53bA
2,01bB
2,01bB
3,72cA
1,94bB
2,14bB
4,55cA
2,34dB
2,69bB
4,50bA
2,15bB
1,97bB
4,35bA
3,08aC
2,36bB
5,25bA
4,16aB
4,13aB
6,92aA
3,71aB
2,71aC
5,29aA
2,12bB
1,75cB
3,72dA
3,16bB
2,60bC
4,82bA
3,52aB
3,03aB
6,20aA
2,66aB
2,93aB
6,04aA
2,81cB
2,62bB
4,57bA
2,42bB
2,26aB
4,17bA
*Brotos [B: ANA + BAP (4,4 µM)] e Plantas [P: ANA + CIN (2,2 µM) e P: ANA + CIN (4,4 µM)].
**Médias seguidas pela mesma letra minúscula nas colunas pertencem ao mesmo grupo pelo teste de Scott-Knott a
5% de probabilidade e pela mesma letra maiúscula nas linhas não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey
a 5 % de probabilidade.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 118-128, 2009
Enraizamento in vitro e aclimatização de mudas...
125
TABELA 3 Valores médios do número de raízes de mudas de caroá (N. variegata) originadas de diferentes meios de
cultura e enraizadas in vitro em diferentes tratamentos em dois períodos da aclimatização.
B: ANA+BAP (4,4 µM)*
Meios de
enraizamento
Explante-Meio de Multiplicação
P: ANA+CIN (2,2 µM)
P: ANA+CIN (4,4 µM)
Períodos de avaliação (dias)
0
4,52bB**
210
8,00aA
0
4,34cA
210
5,60aA
0
4,08bA
210
2,90bA
T2: ANA (0,0 µM)
+ CIN (2,2 µM)
2,28cB
6,70aA
3,40cA
5,00aA
4,00bA
3,30bA
T3: ANA (0,0 µM)
+ CIN (4,4 µM)
1,84cB
5,80aA
3,23cA
4,50aA
2,56cB
4,30bA
T4: ANA (0,5 µM)
+ CIN (0,0 µM)
4,96bA
6,10aA
3,36cB
6,20aA
4,52bA
5,60aA
T5: ANA (0,5 µM)
+ CIN (2,2 µM)
3,60bA
5,00aA
3,08cB
5,30aA
3,48cA
3,80bA
T6: ANA (0,5 µM)
+ CIN (4,4 µM)
2,84cB
4,90aA
4,15cB
4,00aA
2,95cA
4,60bA
T7: ANA (5,3 µM)
+ CIN (0,0 µM)
8,80aA
5,60aB
7,95aA
4,80aB
7,52aA
4,30bA
T8: ANA (5,3 µM)
+ CIN (2,2 µM)
7,80aA
5,70aB
5,96bA
4,40aA
6,64aA
6,50aA
T9: ANA (5,3 µM)
+ CIN (4,4 µM)
7,84aA
6,50aA
3,60cA
3,80aA
4,32bA
4,20bA
T1: ANA (0,0 µM)
+ CIN (0,0 µM)
*Brotos [B: ANA + BAP (4,4 µM)] e Plantas [P: ANA + CIN (2,2 µM) e P: ANA + CIN (4,4 µM)].
**Médias seguidas pela mesma letra minúscula nas colunas pertencem ao mesmo grupo pelo teste de Scott-Knott a
5% de probabilidade e pela mesma letra maiúscula nas linhas não diferem estatisticamente entre si pelo teste de
Tukey a 5 % de probabilidade.
estatisticamente entre si. No que se refere a massa seca da
parte aérea, o melhor resultado foi obtido no meio de
enraizamento sem a presença dos reguladores (T1) para os
brotos provenientes de ANA-BAP, sendo que esse
tratamento não foi diferente estatisticamente do tratamento
com a presença de 0,5 µM de ANA na ausência da cinetina
(T4). Para a massa seca da raiz as plantas provenientes do
meio ANA + CIN (2,2 µM) foram as que apresentaram o
maior valor no meio de enraizamento T4 não diferindo dos
tratamentos 1 e 7, todos sem a presença de cinetina.
Com esses resultados observa-se que cada
explante apresentou resposta diferenciada na aclimatização
com o substrato Plantmax®, apesar de que a aclimatização
dos explantes originados dos meios de enraizamento com
a presença de ANA foram os que apresentaram os melhores
resultados para as variáveis analisadas neste trabalho.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 118-128, 2009
CMR
11,690aA
11,690aA
13,330aA
6,780bB
7,900bB
12,040bA
9,620aA
13,230aA
8,300bAB
12,410aA
9,260bA
10,840bA
13,770aA
10,880aAB
12,050aA
12,390aA
12,710aA
P: ANA+CIN
(2,2 µM)
13,030aA**
B:ANA+BAP
(4,4 µM)*
9,310cAB
10,940bA
8,840cB
7,180cB
6,640cB
14,470aA
6,980cA
7,080cB
6,570cB
P:ANA+CIN (4,4
µM)
0,789bA
0,156cC
0,971bA
0,368cA
0,735bA
1,101aA
0,717bA
0,560bA
1,345aA
B:ANA+BAP
(4,4 µM)
0,422bA
0,446bB
0,763aA
0,361bA
0,328bB
0,876aAB
0,354bAB
0,502bA
0,471bB
P:ANA+CIN
(2,2 µM)
MSPA
0,387cA
0,865aA
0,500bA
0,320cA
0,222cB
0,516bB
0,156cB
0,186cB
0,234cB
P: ANA+CIN (4,4
µM)
0,187aA
0,059bB
0,142aAB
0,057bA
0,083bA
0,083bB
0,056bA
0,092bA
0,159aA
B:ANA+BAP
(4,4 µM)
MSR
0,081bB
0,042bB
0,148aA
0,073ba
0,083bA
0,202aA
0,081bA
0,120bA
0,136aA
P:ANA+CIN (2,2
µM)
0,074bB
0,137aA
0,078bB
0,043bA
0,026bB
0,122aAB
0,056bA
0,017bB
0,023bB
P: ANA+CIN
(4,4 µM)
*Brotos [B: ANA + BAP (4,4 µM)] e Plantas [P: ANA + CIN (2,2 µM) e P: ANA + CIN (4,4 µM)].
**Médias seguidas pela mesma letra minúscula nas colunas pertencem ao mesmo grupo pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade e pela mesma
letra maiúscula nas linhas não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade.
T1: ANA (0,0 µM)
+ CIN (0,0 µM)
T2: ANA (0,0 µM)
+ CIN (2,2 µM)
T3: ANA (0,0 µM)
+ CIN (4,4 µM)
T4: ANA (0,5 µM)
+ CIN (0,0 µM)
T5: ANA (0,5 µM)
+ CIN (2,2 µM)
T6: ANA (0,5 µM)
+ CIN (4,4 µM)
T7: ANA (5,3 µM)
+ CIN (0,0 µM)
T8: ANA (5,3 µM)
+ CIN (2,2 µM)
T9: ANA (5,3 µM)
+ CIN (4,4 µM)
Meios de enraizamento
TABELA 4 – Médias de comprimento da maior raiz (CMR) e massa seca da parte aérea (MSPA) e da raiz (MSR) de mudas micropropagados de caroá (N.
variegata) enraizadas in vitro em diferentes tratamentos e aclimatizadas em substrato após 210 dias.
126
SILVEIRA, D. G. et al.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 118-128, 2009
Enraizamento in vitro e aclimatização de mudas...
CONCLUSÕES
1. Para o enraizamento in vitro de caroá, a presença
da auxina aumenta a taxa de enraizamento.
2. A presença de cinetina influencia de forma
negativa no alongamento das plantas e no número de raízes.
3. As mudas enraizadas in vitro independentes da
origem do explante apresentam sucesso na aclimatização
quando se utiliza o substrato Plantmax®.
AGRADECIMENTOS
Ao Banco do Nordeste, a Cooperativa Regional de
Artesãs Fibras do Sertão (COOPERAFIS) e a FABESB pelo
financiamento da pesquisa.
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Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 118-128, 2009
MICROPROPAGATION
OF
Aristolochia
Mart. et Zucc. 129
Micropropagation of
Aristolochia
gigantea gigantea
Mart. et Zucc...
(ARISTOLOCHIACEAE) THROUGH NODAL SEGMENT CULTURE
MICROPROPAGAÇÃO DE Aristolochia gigantea Mart. et Zucc.
(ARISTOLOCHIACEAE) ATRAVÉS DE CULTURA DE SEGMENTOS NODAIS
KELLYARAUJO LÚCIO1, MARIA APPARECIDA ESQUIBEL2, ALICE SATO3, CELSO LUIZ SALGUEIRO LAGE4
1
Lab. de Fisiologia Vegetal Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho Universidade Federal do Rio de Janeiro Av. Brigadeiro
Trompowisk, s/nº 21951-590 Ilha do Fundão Rio de Janeiro, RJ [email protected]
2
Lab. de Fisiologia Vegetal Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho Universidade Federal do Rio de Janeiro Av. Brigadeiro
Trompowisk, s/nº 21951-590 Ilha do Fundão Rio de Janeiro, RJ
3
Lab. de Cultura de Tecidos Vegetais Dep. Botânica Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro Av. Pasteur, nº 458
22290-240 Urca Rio de Janeiro,RJ [email protected]
4
Lab. de Fisiologia Vegetal Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho Universidade Federal do Rio de Janeiro Av. Brigadeiro
Trompowisk, s/nº 21951-590 Ilha do Fundão Rio de Janeiro, RJ [email protected]
ABSTRACT
Aristolochia gigantea Mart. et Zucc. (Aristolochiaceae)
is an ornamental herbaceous plant, also used utilized in folk
medicine due to properties antibacterial, anti-inflammatory
activity and poison snake. A micropropagation protocol of
Aristolochia gigantea was established through nodal segment
culture on Murashige and Skoog (MS) medium supplemented
with 0.52 µM indole-3-acetic acid (IAA), 0.49 µM indole-3byturic acid (IBA) and 2.32 µM kinetin (Kin). In vitro proliferated
buds were multiplied by culture of nodal segments on MS
medium, MS with IAA (0.52 µM) and Kin (2.32 µM). The best
results for elongation of shoots were obtained with 0.52 µM
IAA (3.2 cm).The highest rooting percentage (80%) and number
roots (2.4 root/explant) were promoted by 0.52 µM IAA and
0.49 µM IBA. MS supplemented with 0.49 µM IBA and 2.32
µM Kin promoted the induction of callus at the base of the
explant in the A. gigantea culture. Plants with well developed
roots were transferred to soil and 85% of them survived after 30
days.
Index terms: Aristolochia gigantea; growth regulators; in vitro
germination; in vitro propagation.
RESUMO
Aristolochia gigantea Mart. et Zucc. (Aristolochiaceae)
é uma trepadeira ornamental, utilizada na medicina popular em
razão de suas diversas propriedades antibactericidas, antiinflamatórias, e contra veneno de cobras. Um protocolo de
micropropagação foi apresentado, por meio da cultura de
segmentos nodais em meio de Murashige e Skoog (MS)
suplementado com 0,52 µM ácido indol-3-ácetico (AIA), 0,49
µM ácido indol-3-butírico, (AIB), 2,32 µM cinetina (Cin). A
proliferação in vitro de brotos foi obtida em meio MS, MS
acrescido de AIA (0,52 µM) e Cin (2,32 µM). O melhor resultado
para alongamento dos brotos foi obtido com 0,52 µM AIA (3,2
cm). Taxas eficientes de enraizamento (80%) e desenvolvimento
de raízes (2,4 raiz/explante) foram obtidos em 0,52 µM AIA e
0,49 µM de AIB. MS suplementado com 0,49 µM AIB e 2,32
µ M Cin promoveram a indução de calos de base. Plantas
regeneradas foram transferidas para o solo e apresentaram taxa
de sobrevivência de 85%, após 30 dias.
Termos para indexação: Aristolochia gigantea, reguladores de
crescimento, germinação in vitro, propagação in vitro.
INTRODUCTION
Aristolochia gigantea Mart. et Zucc.
(Aristolochiaceae) is an ornamental herbaceous plant
commonly known in Brazil as jarrinha, papo-de-peru and
angelicó . It s distributed through tropical and temperate
regions (LORENZI & MATOS, 2002; WETTSTEINS et al.,
1944) and it is commonly used in Brazil and other countries
in folk medicine as abortifacient, amenagogues and against
poison snake (AHUMADA, 1975; LORENZI & MATOS,
2002). Several studies were carried out to investigate
therapeutic action described to Aristolochia species. The
plants from Aristolochia genus frequently present
properties as for instance: antibacterial (GADHI et al., 1999,
2001b; SHAFI et al., 2002), and specifically antiHelicobacter pylori (GADHI et al., 2001a). Alvarez et al.
(2001) reported general antimicrobial action of Aristolochia
and anti-inflammatory action was also reported (SOSA et
al., 2002). This genus may present insecticide properties
(BROUSSALIS et al., 1999). However it has been discovered
that extracts of plants from Aristolochia genus frequently
have mutagenic (BIANUCCI et al., 1993; ROBISCH et al.,
(Recebido em 24 de dezembro de 2008 e aprovado em 22 de setembro de 2009)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 129-134, 2009
130
LÚCIO, K. A. et al.
1983), carcinogenic and nefrotoxic (LORD et al., 1999;
NORTIER et al., 2000; NORTIER & VANHERWEGHEM,
2002) and cytotoxic activities (MONGELLI et al., 2000;
POPOCA et al., 1998; RUFFA et al., 2002). These properties
of the Aristolochia genus have been attributed to the
presence of aristolochic acid, which was not detected in A.
gigantea (LEITÃO & KAPLAN, 1992), the specie used in
this work. The use of an Aristolochia species that does
not present the aristolochic acid must be of great interest
taking into consider that its extracts may be less toxic than
the other species of the same genus.
The forest harbors a large number of plant species,
but deforestation has been responsible for the rapid loss of
many of them, such that several valuable medicinal plants
are at risk of extinction. Pharmaceutical companies depend
largely on materials procured from naturally occurring stands
that are being rapidly depleted (ROUT & SAMANTARAY,
2000). Plant tissue culture is an alternative method to
commercial propagation of plant species (GEORGE &
SHERRINGTON, 1994), due to rapid multiplication of plants,
especially for those presenting medicinal properties. This
technique has already been used successfully in
Aristolochia species (BRAVO et al., 1999, 2001; MANJULA
et al., 1997; REMANSHREE et al., 1994, 1997).
This work presents an efficient micropropagation
protocol for A. gigantea, through axillary shoots
proliferation obtained from in vitro germinated seeds.
MATERIAL AND METHODS
In vitro germination
Seeds of A. gigantea were obtained from green fruit,
collected from Rio de Janeiro Botanic Garden (RB 301.112/
section 34). After preliminary selection, they were washed
under agitation in 5% neutral detergent for 30 minutes,
followed by 3 rinses with distilled water. They were
immersed in 70% alcohol for 5 minutes and 30% sodium
hypochlorite solution for 5 minutes containing 2-3 drops
of Tween 20, rinsed three times in distilled water for 5
minutes. At the laminar flow chamber the seeds were
distributed in culture tubes (10.0 x 1.24 cm), with 10 mL of
sterile medium containing the basic MS salts
(MURASHIGE & SKOOG, 1962), supplemented with 30 g
L 1sucrose, 7 g L 1 agar, 4.1 µM nicotinic acid, 1.5 µM
thiamine HCl, 0.6 mM myo-inositol, 2.4 µM pyridoxine HCl.
The pH was adjusted to 5.8 before autoclaving sterilization
at 121 ºC, 1.1 Kgf.cm-2 for 15 minutes. The seeds were
maintained at 25 + 2 ºC and a 16 hours photoperiod under
cool light of photon flux of 23.4 µmol m-2 s-1. The criterion
for germination was the radicle protrusion and the rate of
germination was determined utilizing 10 seeds per
repetition and all experiments were conducted at least five
times. The seeds were analyzed every seven days and
after 56 days of the culture the young plants were utilized
as source nodal segment to culture establishment.
Establishment of culture and effect of growth regulators
Culture establishment of A. gigantea from nodal
segments (1cm length and 1 or 2 axillary buds) explants were
obtained of in vitro seedlings and inoculated in culture
cylindrical glass (14.7 x 5.7 cm) containing 40 mL MS medium
without growth regulators (MSØ). After 60 days establishment
of culture, the explants were subcultivated on MSØ and MS
supplemented with different growth regulators (0.49 µM
indole-3-butyric acid - IBA, 0.52 µM indole-3-acetic acid IAA and 2.32 µM Kinetin Kin) to shoot and roots
development, at the culture conditions as above described.
The plant development was evaluated during 60
days of culture taking into account the number of axillary
buds, shoots and roots; length of shoots and roots and
the occurrence of calli were recorded.
The experiment was performed used 7 replicates
with flask containing five nodal segment, totalizing four
treatment and all data obtained were analyzed using
standard ANOVA procedure and the difference between
the means were compared using Tukey s test ( =0.05).
Statistic analysis were performed by Graph InStat v.3.0
Acclimatization
Rooted plantlets were washed running tap water to
remove the nutrient medium of roots avoid the fungal attack
of the last system.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 129-134, 2009
Micropropagation of Aristolochia gigantea Mart. et Zucc...
The plants were transferred individually to seeds
pots (66 x 33 cm) containing a soil mix prepared by mixing
sand and humus (1:1). Humidity was kept covering plants
with a plastic cover at greenhouse. Plants were irrigated
with water plus norbixin (30%) during the acclimatization
process to avoid the oxidation of the A. gigantea aerial
parts - adaptation of the procedure of Universidade Federal
do Rio de Janeiro UFRJ (2001) at each two days. During
the ex vitro process no agrotoxic product was utilized.
The percentage of survival and average height of
the plants was recorded after 30 days post-transplant.
131
effects on shoot, buds and roots proliferation. The best
evaluation parameters; however, for the number of shoots
there was not statistical difference between MSØ and MS
plus growth regulators, as well as the means were about
one shoot per explant for all treatments (Table 1).
Remashree et al. (1994) working with A. bracteolata
reported a mean of the 0.46 shoots per explant on MS
basal supplemented with 8.8 µM BA (6 benzyl adenine) +
0.57 µM IAA + 4.6 µM Kin on a period of the 60 to 70 days
in culture.
In this work the presence of IAA promoted the best
shoot elongation (3.2 cm) if compared to MSØ, IBA and
Kin (1.9, 1.4 and 2.7 cm, respectively) with 60 days of culture
(Table 1). whereas Remashree et al. (1994) reported shoot
length of 7 cm, using association of different
concentrations of growth regulators (22.2 µM BA + 5.7
µM IAA + 7.2 µM Kin) on a period of 60 to 70 days in
culture. Similar results of A. gigantea were obtained in the
culture A. indica (SIDDIQUE et al., 2006), in spite of author
utilize both different combination and concentration growth
regulators.
The number of buds per explant among the media
MSØ, MS plus IAA or Kin (6.0, 5.8 and 7.0, respectively)
did not present significant differences, while the addition
of 0.49 µM IBA reduced bud organogenesis (Table 1). It
is known that IBA is an auxin indicated to induce in vitro
rooting, but not to produce bud organogenesis (CALDAS
et al., 1998). Manjula et al. (1997) demonstrated that on
the tissue culture of A. indica is necessary the presence
result was obtained in presence of IAA to the most of the
of NAA and BA at high concentration (2.69 and 13.31
RESULTS AND DISCUSSION
In vitro germination
The protocol of disinfection utilized to A. gigantea
seeds presented efficiency of 98%.
The results of germination showed that of fiftyfour seed distributed in culture tubes, forty-eight
germinated representing a percentage of 89%; in contrast
to Teixeira & Luca (2002) that reported necessity of pregerminative treatments (sulphuric acid 10 %, to boil a 3
minute and control in nature) to produce Aristolochia
seeds germination of 60%.
Effect of growth regulators in A. gigantea culture
The media MS without growth regulators (MSØ),
MS plus IAA, IBA or Kin were tested to evaluate their
TABLE 1 Effects of growth regulators on nodal segments development of A. gigantea in vitro culture after 60 days.
Conc.
(µM)
Shoot Number/ Shoot length
explant
(cm)
Buds/
explant
Roots/
explant
Rooting
(%)
Root length
(cm)
Callus
(%)
1.0 + 0.0a
1.99 + 0.27c
6.0+ 0.3a
1.3 + 0.1b
55b
1.52 + 0.19a
0
IBA 0.49
1.2 + 0.1a
1.47 + 0.20d
3.9 + 0.2b
2.4 + 0.2a
80a
0.41 + 0.03b
100
IAA 0.52
1.2 + 0.1
a
a
5.8 + 0.3
a
a
a
b
1.3 + 0.1
a
7.0 + 0.4
a
MSØ
Kin
0
2.32
3.20 + 0.26
2.75 + 0.28
b
2.4 + 0.3
-
77
0
c
0.58 + 0.09
-
0
100
*Different letters indicates different statistical level of the p < 0.05 between treatments (n = 30 plants/ treatments);
media + standard error.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 129-134, 2009
132
LÚCIO, K. A. et al.
µM, respectively) to stimulate the development of the
axillary buds (average 4.3 buds/ plant).
In vitro plantlets cultivated in MS medium
without growth regulators (MSØ) show that only MSØ
is not enough to promote efficient rooting (55%). MS
plus 0.49 µM IBA and MS plus 0.52 µM IAA, resulted
an increase root development (80%). Similar effects were
obtained in the culture of A. fimbriata supplemented
with different concentrations of IBA, which induced
rooting (BRAVO et al., 1999), while MS medium
containing 2.32 µM Kin, inhibited the rooting process
(Table 1). In contrast with our results, it was observed
by Siddique et al. (2006) that Kin alone promoted root
formation. However, Bliss et al. (2009) describe that the
effect of IBA (0.49 and 4.9 µM) on rooting promotion
did not present significant difference in relation to
control medium (MS without growth regulation) in the
tissue culture of A. fimbriata.
Although our results with culture of A. gigantea
(average root length of 1.52 cm) are not as satisfactory as
those obtained by Remashree et al. (1994) in the culture of
A. bracteolate (average root length 3.5 cm), was not
necessary the utilization of high concentrations of growth
regulators (8.8 µM BA + 4.60 µM Kin + 2.60 µM AIA) as
utilized by authors.
The nodal segments of A. gigantea formed basal
callus in the MS medium containing 0.49 µM IBA or 3.32
µM Kin (Table 1, Figure 1A and 1B). In the work of
Remashree et al. (1994) to successful induction of A.
bracteolate callus (50-70%) from the entire leave, it was
necessary to use combination of the different
concentrations of Kin (9.2-23 µM), BA (0.44-35 µM) and
IAA (2.6 5.7 µM). The same authors (REMASHREE et al.,
1997) reported that to A. indica, MS supplied with BA
(4.44 22.19 µM) was required to obtain 50 to 70% of callus
induction.
Acclimatization
FIGURE 1 Aspects of development of A. gigantea. (A) In
vitro culture on MS + 0.49 µM IBA, (B) MS+ 2.32 µM Kin.
The arrows to indicate on A and B, formation of roots and
callus; axillary buds, base callus and roots, respectively.
(C) Regenerated plant in the seed pots containing soil, after
30 after days at greenhouse condition.
environmental conditions; more than 85% of the plants
survived during the acclimatization procedure (Figure 1C).
These plants showed 5.4 cm of height, green leaves and
more resistant and flexible stems, after 30 days of
acclimatization.
CONCLUSIONS
Rooted plantlets developed via axillary s bud
break were successfully acclimatized to the greenhouse
In vitro germination was an efficient procedure to
initiate the in vitro culture; the disinfection and germination
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 129-134, 2009
Micropropagation of Aristolochia gigantea Mart. et Zucc...
rates were almost 100%, and it was a good source of nodal
segments for establishment of the tissue culture.
The protocols for the successful multiplication of
A. gigantea nodal segments under different growth
regulators were developed. The best medium for
multiplication was basic MS supplemented with 0.52 µM
IAA, which induced the shoot elongation, axillary buds
and roots development in 60 days of culture. The
acclimatization was successfully obtained.
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors are grateful for José Bonifácio
Foundation and financial support from CNPq.
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COMUNICAÇÃO
CIENTÍFICA
Germinação
in vitro de sementes de
Mirremia tomentosa...
135
GERMINAÇÃO IN VITRO DE SEMENTES DE Merremia tomentosa
Hallier F.: INFLUÊNCIA DE MEIOS DE CULTURA E GA3
IN VITRO GERMINATION OF Merremia tomentosa Hallier F. SEEDS: INFLUENCE OF
CULTURE MEDIUM AND GA3
AGDA RABELO CENTOFANTE¹, EVARISTO MAURO DE CASTRO²,
LETICIA CARAVITA ABBADE³, RENATO PAIVA4, ELIAS CENTOFANTE5
1
Bióloga, Mestranda em Agronomia/Fisiologia Vegetal Departamento de Biologia/DBI Universidade Federal de Lavras Cx. P.
3037 37200-000 Lavras, MG [email protected]
2
Engenheiro Florestal, Doutor, Professor Departamento de Biologia/DBI Universidade Federal de Lavras Cx. P. 3037 37200-000
Lavras, MG [email protected]
³Engenheira Florestal, M.Sc em Fisiologia Vegetal, bolsista de Apoio Técnico Departamento de Biologia/DBI Universidade
Federal de Lavras Cx. P. 3037 37200-000 Lavras, MG [email protected]
4
Engenheiro Agrônomo, PhD, Professor Departamento de Biologia/DBI Universidade Federal de Lavras Cx. P. 3037 37200-000
Lavras, MG [email protected]
5
Biólogo, Mestrando em Ecologia e Conservação Departamento de Biologia Universidade Estadual de Mato Grosso Cx. P. 08
78690-000 Nova Xavantina, MT [email protected]
RESUMO
Conduziu-se este trabalho com o objetivo de avaliar a
germinação de sementes in vitro de Merremia tomentosa Hallier
F., nativa do cerrado e campos rupestres, utilizadas na
medicina popular como depurativo do sangue. Para a
germinação in vitro, foram utilizados diferentes meios de
cultura e no meio MS com redução de 50% de concentração de
sais, acrescidos em diferentes concentrações de GA3. Foi
realizada a assepsia das sementes em água corrente por 20
minutos, depois foram imersas em álcool 70% (v/v) por 60
segundos e em solução de hipoclorito de sódio (NaOCl) com
50% (v/v) por 20 minutos e, posteriormente, foram lavados
por 3 vezes em água destilada e autoclavada e após a
inoculação, as sementes foram mantidas em sala de crescimento
sob irradiância de fótons de 36 µmol m-2 s-1, fotoperíodo de 16
horas e temperatura de 25 ± 2°C. A avaliação foi realizada
diariamente durante 30 dias após inoculação e as médias dos
tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey, com
significância fixada em 5% de probabilidade. Os resultados do
experimento com diferentes concentrações de GA3 foram
submetidos à análise de variância, sendo analisados pelo teste
de regressão no Sisvar. A melhor porcentagem de germinação
in vitro foi obtida em meio MS com redução de 50% de
concentração salina suplementado com 1 mg L-1 de GA3.
Termos para indexação: Convolvulaceae; cultura de tecidos;
giberelina; MS; WPM, Merremia tomentosa.
ABSTRACT
This work was conducted with the objective of
evaluating the in vitro germination of seeds of Merremia
tomentosa Hallier f., native specie of the cerrado and rupestrian
fields, used in folk medicine as a blood depurative. For in vitro
germination, it was used different culture media and MS medium
with a reduction of 50% its salt concentration, supplemented
with different concentrations of GA3. Asepsis of the seeds in
running water for 20 minutes was performed. Afterwards, seeds
were immersed in 70% alcohol (v/v) for 60 seconds and in
solution of 50% sodium hypochlorite (NaOCl) (v/v) for 20
minutes and then washed for three times in distilled and
autoclaved water. After inoculation, the seeds were mainatned
in a growth room under irradiance of photons of 36 µmol m-2 s1
, photoperiod of 16 hours and temperature of 25±2° C. The
evaluation was performed daily for 30 days after inoculation
and the average of the treatments were compared by the Tukey
test, with the significance set at 5% of probability. The
experiment with different concentrations of GA3, the results
were submitted to the analysis of variance, they were being
analyzed by the regression test in Sisvar. The best percentage
of in vitro germination was obtained in MS medium, with a
reduction of 50% of salt concentration supplemented with 1.0
mg L-1 GA3.
Index terms: Convolvulaceae; tissue culture; gibberelin; MS;
WPM, Merremia tomentosa.
A cultura de tecidos vegetais é uma técnica de
surgimento recente, pois os primeiros passos foram dados
já no início do século XX e os maiores avanços foram
notados a partir da segunda metade do século (PASCAL,
2001). Segundo Maciel et al. (2000), a propagação in vitro
é uma técnica de cultura de tecidos bem sucedida e propicia
(Recebido em 24 de julho de 2008 e aprovado em 23 de abril de 2008)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 135-139, 2009
136
CENTOFANTE, A. R. et al.
vantagens sobre os métodos convencionais de
propagação, permitindo a obtenção de um grande número
de plantas de boa qualidade fitossanitária em curto espaço
de tempo e em qualquer época do ano.
O emprego de técnicas biotecnológicas se constitui
em ferramenta bastante útil para a reprodução de exemplares
com propriedades desejáveis (FRANÇA, 2001).
A taxa de germinação de sementes de algumas
espécies pode ser aumentada quando são utilizados
métodos de cultura de tecidos, principalmente, quando as
sementes apresentam dormência, endosperma reduzido ou
grande infestação por microrganismos (PASCAL, 2001). O
que acontece muito nessa espécie, onde há predação dos
frutos ainda imaturos por larvas, dificultando a coleta dos
frutos maduros.
Diversas formulações de meios básicos têm sido
utilizadas no cultivo in vitro. Não há uma formulação
padrão, mas o meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962),
com suas modificações e diluições, tem sido utilizado com
sucesso para diversas espécies. Para espécies lenhosas,
entretanto, o meio MS não se mostra satisfatório em alguns
casos, e composições mais diluídas em macronutrientes
apresentam melhor desempenho (GRATTAPLAGLIA &
MACHADO, 1998). O meio nutritivo WPM (LLOYD &
MCCOWN, 1980), por exemplo, apresenta 25% das
concentrações de íons nitrato e amônia do meio MS, além
de maior concentração de potássio e de íons sulfato, sendo
amplamente utilizado para a micropropagação de espécies
lenhosas (PASQUAL, 2001).
Não foram encontradas na literatura informações
sobre a germinação in vitro de Merremia tomentosa,
havendo necessidade de estudos que possam fornecer
dados sobre sua germinação, dormência e propagação.
Diante do exposto, neste trabalho, objetivou-se estabelecer
um protocolo para a germinação de sementes in vitro de
Merremia tomentosa Hallier f., e avaliar a germinação in
vitro da mesma.
O trabalho foi conduzido no Setor de Fisiologia
Vegetal do Departamento de Biologia da Universidade
Federal de Lavras (UFLA).
Os frutos foram coletados no município de Lavras,
na Serra do Macaia, com uma altitude aproximada de 850 m
à 1.000 m, situado no Sul do Estado de Minas Gerais.
As sementes foram retiradas dos frutos imaturos
manualmente e lavados em água corrente por 20 minutos e
transferidos para câmara de fluxo laminar, no qual foram
imersos em álcool 70% (v/v) por 60 segundos e em solução
de hipoclorito de sódio (NaOCl) com 50% (v/v) por 20
minutos. Posteriormente, foram lavados por 3 vezes em
água destilada e autoclavada para eliminação do excesso
de soluções desinfestantes. Após a desinfestação, as
sementes foram inoculadas em diferentes meios de cultura.
Foram testados os meios de cultura WPM (LLOYD
& MCCOWN, 1980), MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962)
e MS com 50% de sua concentração de sais, suplementados
com 3% de sacarose e solidificados com ágar 0,6%. O pH
foi corrigido para 5,8 antes da autoclavagem a 120°C,
durante 20 minutos.
Após a inoculação, as sementes foram mantidas
em sala de crescimento sob irradiância de fótons de 36
µmol m-2 s-1, fotoperíodo de 16 horas e temperatura de 25
± 2°C. A avaliação foi realizada diariamente, durante 30
dias de inoculação, sendo observada a porcentagem de
sementes germinadas em cada tratamento e o índice de
velocidade de germinação (IVG). Foi considerada
germinada a semente que apresentava a radícula
protrundida.
O IVG foi determinado registrando-se o número de
sementes germinadas por dia até o final do experimento,
calculado pela fórmula de Maguire (1962).
O delineamento estatístico utilizado foi o
delineamento inteiramente casualizado, com dez
repetições por tratamento, sendo cada uma composta por
cinco tubos de ensaio e cada tubo contendo uma semente.
As médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste
de Tukey, com significância fixada em 5% de
probabilidade, utilizando o programa estatístico SISVAR
(FERREIRA, 2000).
O processo de assepsia das sementes foi idêntico
ao descrito anteriormente. Foram testados seis
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 135-139, 2009
Germinação in vitro de sementes de Mirremia tomentosa...
concentrações de GA3 (0, 1, 2, 3, 4 e 5 mg L-1) no meio de
cultura MS com redução de 50% de concentração salina,
suplementado com 3% de sacarose e solidificado com
ágar 0,6%. O pH foi corrigido para 5,8 antes da
autoclavagem.
Após a inoculação, as sementes foram mantidas
em sala de crescimento sob irradiância de fótons de 36
µmol m-2 s-1, fotoperíodo de 16 horas e temperatura de 25
± 2°C. A avaliação foi realizada diariamente, durante 30
dias após inoculação, sendo observada a porcentagem
de sementes germinadas em cada tratamento e índice de
velocidade e germinação (IVG). Foi considerada
germinada a semente que apresentava a radícula
protrundida.
O delineamento estatístico utilizado foi o
delineamento inteiramente casualizado. Foram utilizadas
cinco repetições por tratamento, sendo cada repetição
composta por três tubos de ensaio e cada tubo contendo
uma semente. Os resultados foram submetidos à análise
de variância, sendo analisados pelo teste de regressão no
SISVAR (FERREIRA, 2000).
Observa-se na Figura 1, que houve diferença
estatística significativa entre os meios de cultura MS, MS
com redução de 50% de concentração salina e WPM.
Sendo o melhor resultado no meio MS com redução de
50% de concentração salina.
Germinação %
.
80
a
70
60
a
50
40
30
20
b
10
0
MS
MS 50%
WPM
FIGURA 1 Gráfico de porcentagem de germinação in
vitro de sementes de M. tomentosa, em diferentes meios
de cultura. Médias seguidas da mesma letra não diferem
entre si, pelo teste de Tukey (p<0,05). UFLA, Lavras, MG,
2008.
137
Souza (2003), em estudo com germinação de
sementes de arnica (Lychnophora pinaster Mart.), ao testar
os meios MS, MS/2 e MS/4, verificou a superioridade do
MS/4 (68% de germinação) e a necessidade da utilização
de meios de cultura menos concentrados para o
estabelecimento de plântulas.
Observa-se na tabela 1, que não houve diferença
estatística significativa para o IVG, entre os meios de cultura
MS, MS com redução de 50% de concentração salina e
WPM, porém para a porcentagem de germinação o meio
MS 50% , obteve o melhor resultado.
TABELA 1 Índice de Velocidade de Germinação (IVG) e
Porcentagem de Germinação (% G) de sementes de M.
tomentosa in vitro em diferentes meios de cultura. UFLA,
Lavras, MG, 2008.
Tratamentos
IVG
%G
MS
0,582
56 a
MS 50%
0,663
68 a
WPM
0,383
10 b
* Significativo a nível de 5% de probabilidade, pelo teste
de Tukey.
Utilizou-se o MS com redução de 50% de
concentração salina com diferentes concentrações de GA3,
pois, este obteve o melhor IVG e a melhor porcentagem de
germinação.
Pela análise de regressão (Figura 2), houve diferença
estatística entre os tratamentos.
Pela análise de regressão, a concentração ideal de
GA3 foi de 2,19 mg L-1 com uma porcentagem esperada de
99% de germinação.
A maior velocidade de germinação foi observada
em sementes mantidas no meio MS com 50% de
concentração de sais suplementados com 1mg L-1 de
GA3.
Melo (1993), avaliando o efeito do ácido giberélico
(GA3) sobre a germinação de sementes de araticum
(Annona crassiflora Mart.), verificou que não houve efeito
do período de embebição sobre a germinação, porém, o
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 135-139, 2009
.
138
CENTOFANTE, A. R. et al.
120
radicular ou estimula o desenvolvimento de uma zona
radicular existente.
Para a germinação in vitro, o meio MS com redução
de 50% de concentrações de sais, suplementado com 3%
de sacarose e acrescido de 1mg L-1 de GA3, proporciona
maior porcentagem de germinação.
Germinação (%)
100
80
60
40
2
y = -4,95x + 21,68x + 75,43
2
R = 72%
20
0
0
1
2
3
4
5
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
-1
Concentração de GA 3 (mg L )
FIGURA 2 Gráfico de porcentagens de germinação in
vitro de sementes de M. tomentosa, em meio de cultura
MS com 50% de concentrações de sais e diferentes
concentrações de GA3. UFLA, Lavras, MG, 2008.
efeito da concentração do ácido giberélico foi significativo,
havendo aumento da germinação proporcional ao aumento
da concentração do referido ácido.
Pela analise de variância (tabela, 2), não houve
diferença estatística significativa para o IVG, porém houve
diferença significativa entre os tratamentos para a
porcentagem de germinação.
Melo (1993) aponta que o tratamento de sementes
com giberelinas pode promover a germinação. Sendo
assim, sementes que possuem uma concentração relativa
de giberelina baixa, quando tratadas com ácido giberélico
(GA3) na concentração adequada, teriam uma germinação
mais homogênea e em maior quantidade. Segundo Kochaba
et al. (1974), a presença de ácido giberélico no meio de
cultura proporciona a iniciação de uma zona meristemática
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TABELA 2 Índice de Velocidade de Germinação (IVG) e Porcentagem de Germinação (% G) de sementes verdes de M.
tomentosa in vitro no meio MS com redução de 50% de sua concentração de sais, com diferentes concentrações de
GA3. UFLA, Lavras, MG, 2008.
Tratamentos
MS 50%
-1
IVG
%G
0,396
74,6 ab
MS 50% + 1mg L GA3
0,393
98,6 a
MS 50% + 2mg L-1 GA3
0,626
90,6 ab
MS 50% + 3mg L-1 GA3
0,433
89,3 ab
-1
0,493
88,6 ab
-1
0,500
53,3 b
MS 50% + 4mg L GA3
MS 50% + 5mg L GA3
* Significativo a nível de 5% de probabilidade, pelo teste de Tukey.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 135-139, 2009
Germinação in vitro de sementes de Mirremia tomentosa...
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and evaluation for seedling emergence and vigour.
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FAEPE, 2001. 97 p.
SOUZA, A. V. de. Propagação in vitro e aspectos
anatômicos de arnica (Lychnophora pinaster) Mart. 2003.
126 p. Dissertação (Mestrado) Universidade Federal de
Lavras, Lavras, 2003.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 135-139, 2009
140
COMUNICAÇÃO
CIENTÍFICA
MORAIS, J. P. S.
et al.
DESINFESTAÇÃO SUPERFICIAL DE FRUTOS-SEMENTES DE
AROEIRA-DO-SERTÃO PARA GERMINAÇÃO IN VITRO
SUPERFICIAL DISINFECTION OF SEED-FRUIT OF Myracrodruon urundeuva Allem.
FOR IN VITRO GERMINATION
JOÃO PAULO SARAIVA MORAIS1, ANA CRISTINA PORTUGAL PINTO DE CARVALHO2,
THIAGO LUSTOSA JUCÁ3, FRANCISCO DE ASSIS DE PAIVA CAMPOS4
1
Mestre em Bioquímica Embrapa Agroindústria Tropical Rua Dra Sara Mesquita, 2270 Planalto do Pici 60511-110
Fortaleza, CE [email protected]
2
Doutora em Genética, Embrapa Agroindústria Tropical; Bioquímica Embrapa Agroindústria Tropical Rua Dra Sara Mesquita,
2270 Planalto do Pici 60511-110 Fortaleza, CE [email protected]
3
Graduado em Biologia, Universidade Federal do Ceará Campus do Pici bloco 907 Fortaleza, CE [email protected]
4
Doutor em Bioquímica, Universidade Federal do Ceará. Universidade Federal do Ceará Campus do Pici bloco 907 Fortaleza,
CE [email protected]
RESUMO
A aroeira-do-sertão (Myracrodruon urundeuva Allem.)
é uma árvore da família Anacardiaceae de grande valor madeireiro
e medicinal para o Nordeste brasileiro. Encontra-se vulnerável à
extinção, principalmente, em razão da sua exploração excessiva.
Neste trabalho, objetivou-se determinar o protocolo mais
adequado para a desinfestação superficial dos frutos-sementes,
visando a posterior inoculação in vitro. A melhor condição testada
foi duas imersões em etanol 70% por 2 minutos, seguida de
hipoclorito de sódio 2,5% por 10 minutos.
resistente ou muito resistente a cupins e fungos (PAES et
Termos para indexação: Posição da semente, assepsia,
Anacardiaceae, micropropagação, espécie ameaçada de extinção,
Myracrodruon urundeuva
A extração abusiva da sua madeira e da sua
al., 2002), sendo definida por alguns autores como
imputrescível (QUEIROZ et al., 2002). Quanto ao seu uso
medicinal, na forma de decocto da entrecasca, é utilizada
para o tratamento caseiro de afecções cutâneas, problemas
genito-urinários, gastro-intestinais e das vias respiratórias
(BANDEIRA, 2002; LORENZI & MATOS, 2002).
entrecasca levou essa árvore a figurar na lista brasileira de
espécies ameaçadas de extinção, como vulnerável
ABSTRACT
Myracrodruon urundeuva Allem. is an Anardiaceae
tree with great wood and medicinal values to Brazilian Northeast.
It is vulnerable to endangerment due to excessive exploitation.
The objective of this work was to determine the most suitable
protocol for superficial washing of fruit-seeds to further in
vitro inoculation. The best tested condition is two washings in
ethanol 70% per 2 minutes, followed by 2.5% sodium
hypochlorite per 10 minutes.
(INSTITUTO BRASILEIRO DE MEIO AMBIENTE -
Index terms: Seed position, asepsis, Anacardiaceae,
micropropagation, endangered species, Myracrodruon urundeuva.
comercial da espécie, reduzindo a pressão sobre áreas
A aroeira-do-sertão (Myracrodruon urundeva
Allem.), ou simplesmente aroeira, é uma Anacardiaceae
amplamente usada tanto por sua madeira, como por suas
aplicações fitoterápicas. Sua madeira é classificada como
De acordo com George (1993), a escolha da parte
IBAMA, 2006), e na lista vermelha da World Conservation
Union (INTERNATIONAL UNION FOR CONSERVATION
OF NATURE - IUCN, 2006).
A cultura de tecidos, nesse contexto, apresenta-se
como uma ferramenta alternativa auxiliar na produção de
mudas, em programas de reflorestamento ou para plantio
nativas, nas quais impera o extrativismo.
da planta que fornecerá o explante depende do tipo de
cultura a ser iniciada, do propósito da cultura e da espécie
vegetal que está sendo usada. Segundo Soares (2003),
(Recebido em 25 de setembro de 2008 e aprovado em 13 de maio de 2009)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 140-144, 2009
Desinfestação superficial de frutos-sementes...
quando uma planta tem a idade aumentada, sua capacidade
regenerativa é reduzida. O autor cita que tecidos
embrionários
geralmente
demonstram
alta
totipotencialidade e, assim, embriões e sementes são
utilizados frequentemente como material experimental para
o cultivo in vitro.
Altas taxas de contaminação fúngica ou bacteriana
durante a iniciação da cultura inviabilizam o cultivo in vitro.
A unidade de semeio da aroeira é o fruto-semente
(ANDRADE, 1998), no qual é praticamente impossível
separar a semente do fruto. Por meio de experimentos
preliminares, constatou-se que esses frutos-sementes
apresentavam altos índices de contaminação fúngica,
quando inoculados in vitro. Couto et al. (2004), para avaliar
o melhor protocolo para desinfestação superficial de
sementes de mogno (Swietenia macrophylla King), testou
três doses de soluções de hipoclorito de sódio, quatro
tempos de contato e duas posições de inoculação. Com
base nesses trabalhos, realizaram-se ensaios para a
determinação do protocolo de assepsia mais adequado
para a desinfestação superficial de frutos-sementes de
aroeira, para permitir seu cultivo in vitro com sucesso.
O presente trabalho foi dividido em dois testes,
realizados na Universidade Federal do Ceará, Departamento
de Bioquímica e Biologia Molecular, usando-se frutossementes da safra de 2003, gentilmente cedidos pelo
IBAMA/CE, assim realizados:
Teste 1: Efeito do número de imersões em soluções
desinfestantes na assepsia e da posição dos frutossementes de M. urundeuva na germinação in vitro e
Teste 2: Efeito de diferentes concentrações e tempos de
exposição à solução de hipoclorito de sódio na
desinfestação superficial dos frutos-sementes de M.
urundeuva, visando a germinação in vitro.
Quatro amostras de 120 frutos-sementes de M.
urundeuva foram dispostos em recipiente de 250 mL de
capacidade, contendo 100 mL de solução de detergente
comercial diluído a 25% em água destilada sob agitação
magnética constante por 10 minutos. A seguir, foram
lavados com água destilada até não haver mais traços
141
visíveis de espuma. Foram utilizados 240 explantes por
teste.
No primeiro teste, os frutos-sementes foram
desinfestados em câmara de fluxo laminar, em frascos com
capacidade de 220 mL, contendo 100 mL de solução de
etanol (EtOH) 70% por 2 minutos e 100 mL de hipoclorito
de sódio (NaOCl) a 2,5% por 15 minutos, de acordo com os
tratamentos (0, 1, 2 ou 3 imersões em soluções de etanol/
hipoclorito) e finalmente enxaguados em três lavagens, de
30 segundos cada, em água destilada autoclavada.
O modelo experimental usado foi o inteiramente
casualizado, em esquema fatorial 4 x 2, tendo como fatores
o número de imersões (de 0 a 3), e a posição do hilo
(posicionado de forma a ficar em contato com o meio de
cultura ou oposto ao meio). Cada tratamento foi constituído
de 3 repetições de 10 frutos-sementes, totalizando 240
frutos-sementes, um por tubo de ensaio.
No segundo teste, em câmara de fluxo laminar, os
frutos-sementes foram desinfestados, com duas imersões,
em 100 mL de solução de EtOH 70% por 2 minutos e 100 mL
de solução de NaOCl, em frascos de capacidade de 220
mL, de acordo com os tratamentos (2,5% ou 5% de NaOCl,
em esquema fatorial com 5, 10, 15 ou 20 minutos de
exposição), e enxaguados em três lavagens, de 30 segundos
cada, em água destilada autoclavada.
O modelo experimental usado foi o inteiramente
casualizado, em esquema fatorial 2 x 4, tendo como fatores
a concentração de NaOCl (2,5% ou 5%) e o tempo de
contato com a solução (5, 10, 15 ou 20 minutos). Cada
tratamento foi constituído de 3 repetições de 10 frutossementes, totalizando 240 frutos-sementes, um por tubo
de ensaio.
Em ambos os testes, os frutos-sementes foram
inoculados em tubos de ensaio contendo meio de cultura
MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962), constituído de metade
da concentração de macro e de micronutrientes,
concentração normal de vitaminas, 3% de sacarose e 0,7%
de ágar, sendo o pH ajustado para 5,8 antes da
autoclavagem, com o hilo em contato com o meio de cultura,
ou diametralmente oposto a esse.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 140-144, 2009
142
MORAIS, J. P. S. et al.
Aos 28 dias após a inoculação, avaliou-se a
contaminação, protrusão de radícula, surgimento de
cotilédones e de ápices caulinares, e formação de calos
nos explantes. Para a análise estatística dos dados, utilizouse o programa SISVAR®, transformando-se as porcentagens
calculadas para o arco seno da raiz quadrada.
No primeiro teste, verificou-se que houve redução
significativa na porcentagem de contaminação dos
explantes, à medida que se aumentou o número de imersões,
mas não ocorreram diferenças estatisticamente
significativas (F < 0,05) entre 2 e 3 imersões (Tabela 1).
Como os frutos-sementes encontravam-se em condições
de campo, a assepsia é uma condição primordial para não
haver contaminação e as plântulas poderem se desenvolver.
Durante o teste, não foi verificada nenhuma
contaminação bacteriana e, aos 28 dias, somente uma
plântula, no tratamento de uma imersão, formou calos na
sua base. Os frutos-sementes que não sofreram qualquer
tipo de desinfestação apresentaram baixa porcentagem de
protusão de radículas e ausência de cotilédones e ápices
caulinares, diferindo estatisticamente dos outros
tratamentos. Por outro lado, não houve diferenças
estatisticamente significativas entre os tratamentos em que
foram feitas uma, duas ou três imersões nas soluções
desinfestantes.
Não foi verificada diferença estatisticamente
significativa na germinação dos frutos-sementes (F < 0,05)
de acordo com a posição do hilo, nem interação
estatisticamente significativa entre os fatores posição e
número de imersões.
Entretanto, na germinação de sementes de mogno,
Couto et al. (2004) verificaram que aquelas com a
concavidade em contato com o meio apresentaram maior
índice de germinação. Durante a germinação dos frutossementes de aroeira, verificou-se que a radícula não emerge
do hilo, mas sim de ponto na lateral do fruto-semente, entre
o hilo e o pólo oposto.
Teste 2: No segundo teste, verificou-se que os melhores
tratamentos foram, para os parâmetros de germinação
avaliados, aproximadamente semelhantes dentre os dois
experimentos de germinação in vitro de sementes,
indicando a conformidade da taxa de germinação com o
trabalho de Silva et al. (2002), obtendo aproximadamente
70% de taxa de germinação, e de Andrade (1998), no qual a
taxa de germinação foi por volta de 60%. Os autores usaram
como parâmetro de germinação a emissão de radículas.
Como em testes preliminares verificou-se que algumas
sementes emitiam a radícula, sem desenvolver a plântula
inteira, optou-se por avaliar também o surgimento de
cotilédones e ápices caulinares, outras fontes de explantes.
Após 28 dias de inoculação in vitro, verificou-se
que apenas para o tratamento de 10 minutos houve
diferença estatisticamente significativa entre as duas
concentrações das soluções de NaOCl (F < 0,05), em todas
as variáveis, exceto porcentagem de explantes com
protusão de radículas. Também se verificou que o
TABELA 1 Efeito do número de imersões de frutos-sementes de aroeira em solução de etanol 70% por 2 minutos e de
hipoclorito de sódio 2,5% por 15 minutos, sobre a porcentagem de explantes contaminados, com protusão da radícula,
surgimento de cotilédones e de ápices caulinares, 28 dias após a inoculação in vitro.
Número de
imersões
Contaminação
(%)
Protrusão de radículas
(%)
Surgimento de
cotilédones (%)
Surgimento de ápices
caulinares (%)
0
100,0 a
5,0 b
0,0 b
0,0 b
1
28,3 b
81,7 a
68,3 a
58,3 a
2
5,0 c
81,7 a
63,3 a
51,7 a
3
0,0 c
80,0 a
75,0 a
45,0 a
C.V. (%)
27,53
23,34
23,00
25,00
Médias na mesma coluna, seguidas pela mesma letra, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de significância.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 140-144, 2009
Desinfestação superficial de frutos-sementes...
tratamento de 5 minutos sempre diferiu estatisticamente
dos demais (Tabela 2).
Só foi observado um explante com calogênese na
base da plântula, no tratamento de 2,5% de NaOCl por 20
minutos, e somente um explante com contaminação
bacteriana, no tratamento de 2,5% de NaOCl por 15
minutos.
Nos tratamentos de 5,0% de NaOCl, ocorreu uma
diminuição numérica das porcentagens de protrusão de
radículas, do surgimento de cotilédones e de ápices
caulinares e no tratamento de 2,5% de hipoclorito, ocorreu
diminuição numérica somente no surgimento de ápices
caulinares. O excesso de NaOCl pode danificar o embrião,
prejudicando seu desenvolvimento, após a germinação,
conforme exemplificado nos trabalhos citados a seguir.
Takasaki (2005), ao variar as concentrações de NaOCl (1, 2,
4 e 8%), na descontaminação de sementes de Zephyra
elegans D.Don, verificou que a contaminação foi reduzida
à medida que se aumentou a concentração da solução
desinfestante, atingindo-se o menor valor a 8% de NaOCl,
mas elegendo o tratamento de hipoclorito a 4% como a
concentração da solução desinfestante usada na técnica
143
de assepsia para tais sementes, pois na dosagem mais
elevada, foram notados sinais de fitotoxicidade e queda na
porcentagem de germinação. Yildiz & Er (2002), estudando
o efeito de diferentes concentrações de cloro ativo (3%,
4% e 5%), sobre a germinação de sementes de linho (Linum
usitatissimum L.), verificaram que as maiores taxas de
germinação de sementes, crescimento das plântulas,
comprimento de hipocótilo e de radículas ocorreram no
tratamento de 3%. Por fim, na germinação de sementes de
mogno, variando-se a porcentagem de hipoclorito de sódio
(0, 2,5% ou 5,0%) e o tempo (10, 20, 30 ou 40 minutos) de
contato com a solução, Couto et al. (2004) verificaram que
os melhores tratamentos de hipoclorito foram 2,5% por 30
minutos ou 5,0% por 20 minutos.
Para a desinfestação superficial de frutos-sementes
de aroeira (Myracroduron urundeuva), recomenda-se lavar
cerca de 120 frutos-sementes por 10 minutos, em solução
diluída de detergente comercial a 25% e, a seguir, em câmara
de fluxo laminar, duas imersões na sequência de soluções
de etanol 70% por 2 minutos e hipoclorito de sódio 2,5%
por 10 minutos e, finalmente, três enxágues de 30 segundos
em água destilada autoclavada.
TABELA 2 Efeito de diferentes tempos de imersão de frutos-sementes de Myracrodruon urundeuva em soluções
desinfestantes de hipoclorito de sódio, nas concentrações de 2,5% e de 5,0%, sobre a porcentagem de explantes
contaminados, com protusão da radícula, com surgimento de cotilédones e de ápices caulinares, 28 dias após a
inoculação dos explantes in vitro.
Explantes
contaminados (%)
Concentrações de
NaOCl (%)
Explantes com protrusão
de radículas (%)
Explantes com
surgimento de
cotilédones (%)
Explantes com
surgimento de apices
caulinares (%)
2,5
5,0
2,5
5,0
2,5
5,0
2,5
5,0
5
76,67 aA
86,67 aA
23,33 bA
20,00 bA
23,33 bA
13,33 cA
16,67 bA
13,33 cA
10
20,00 bB
53,33 bA
80,00 aA
76,67 aA
80,00 aA
53,33 bB
73,33 aA
33,33 bcB
15
3,33 bA
0,00 cA
90,00 aA
100,00 aA
80,00 aA
90,00 aA
53,33 aA
70,00 aA
20
13,33 bA
0,00 cA
90,00 aA
80,00 aA
80,00 aA
70,00 abA
53,33 aA
46,67 abA
Tempos de
imersão (min)
C.V. (%)
30,39
21,10
19,05
21,78
Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna, ou maiúscula na linha, não diferem entre si pelo teste de Tukey
a 5% de significância.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 140-144, 2009
144
MORAIS, J. P. S. et al.
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em desenvolvimento e adulta. 2002. 215 p. Tese (Doutorado
em Química Orgânica) Universidade Federal do Ceará,
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LORENZI, H.; MATOS, F. J. de A. Plantas medicinais do
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MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid
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PAES, J. B.; MORAIS, V. M.; LIMA, C. R. de. Resistência
das madeiras de aroeira (Myracrodruon urundeuva),
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fungos e cupins xilófagos, em condições de laboratório.
Floresta e Ambiente, Seropédica, v. 9, n. 1, p. 135-144, 2002.
QUEIROZ, C. R. A. dos A.; MORAIS, S. A. L. de;
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SILVA, L. M. de M.; RODRIGUES, T. de J. D.; AGUIAR, I.
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SOARES, G. de A. Aspectos do cultivo in vitro do ingazeiro
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TAKASAKI, A. K. V. Creación de protocolos para la
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YILDIZ, M.; ER, C. The effect of sodium hypochlorite
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regeneration of flax (Linum usitatissimum).
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Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.2, p. 140-144, 2009
NORMAS PARA PUBLICAÇÃO DE ARTIGOS E COMUNICAÇÕES CIENTÍFICAS
A revista Plant Cell Culture & Micropropagation
é editada semestralmente pela Editora da Universidade
Federal de Lavras (Editora UFLA), publica artigos
científicos e comunicações científicas da área de cultura
de tecidos de plantas, elaborados por membros da
comunidade científica nacional e internacional. Não é
cobrada taxa para publicação de trabalhos, desde que um
dos autores seja sócio e esteja em dia com a ABCTP
(Associação de Cultura de Cultura de Tecidos de Plantas).
É condição fundamental que os artigos/comunicações
submetidos à apreciação da revista Plant Cell Culture &
Micropropagation não foram e nem serão publicados
simultaneamente em outro lugar. Com a aceitação do artigo
para publicação, os editores adquirem amplos e exclusivos
direitos sobre o artigo para todas as línguas e países. A
publicação de artigos/comunicações dependerá da
observância das Normas Editoriais, dos pareceres do Corpo
Editorial e da Comissão ad hoc. Todos os pareceres têm
caráter sigiloso e imparcial, e tanto os autores quanto os
membros do Corpo Editorial e/ou Comissão ad hoc não
obtêm informações identificadoras entre si.
Os conceitos e afirmações contidos nos artigos e
comunicações serão de inteira responsabilidade do(s)
autor(es).
1. SUBMISSÃO:
Cada trabalho deverá ter no máximo 14 páginas e
junto do mesmo deverá ser encaminhado ofício dirigido ao
Editor Chefe da revista, solicitando a publicação do artigo.
Esse ofício deverá conter o pedido de apreciação
na revista ao editor chefe, a declaração de ser um trabalho
original e não ter sido submetido a nenhuma outra revista,
ser assinado por todos os autores, constar o endereço
completo, telefone e e-mail de todos. Qualquer inclusão,
exclusão ou alteração na ordem dos autores, deverá ser
notificada mediante ofício assinado por todos os autores
(inclusive do autor excluído).
Originais: quatro vias impressas e uma via em CDR, com
texto e ilustrações e gráficos. Das 4 vias impressas apenas
1 deve conter os nomes completos dos autores e rodapé
na primeira página.
Processador de texto: Word for Windows (version 98, 2000,
XP ou 2003)
Redigido em português, inglês ou espanhol
Espaçamento do texto: Duplo. Margens: esquerda (3cm),
direita (2cm), inferior e superiores (2,5cm). Cabeçalho e
Rodapé (2,5cm).
Papel: formato A4
Fonte: Times New Roman, tamanho 12
Número de páginas: até 14 páginas, numeradas
consecutivamente, incluindo as ilustrações
Tabelas: devem fazer parte do corpo do artigo e ser
apresentadas no módulo tabela do Word. O título deve
ficar acima.
Gráficos, Figuras e Fotografias: devem ser apresentados
em preto e branco, nítidos e com contraste, escaneados,
inseridos no texto após a citação dos mesmos e também
em um arquivo à parte, salvos em extensão tif ou jpg ,
com resolução de 300 dpi. Os gráficos devem vir também
em excel, com letra Times New Roman, tamanho 10, sem
negrito, sem caixa de textos e agrupados, em arquivo à
parte.
Símbolos e Fórmulas Químicas: deverão ser feitos em
processador que possibilite a formatação para o programa
Page Maker, sem perda de suas formas originais.
2. ESTRUTURA E ORGANIZAÇÃO
2.1. O artigo científico deve ser apresentado na seguinte
seqüência:
TÍTULO
Suficientemente claro, conciso e completo,
evitando-se palavras supérfulas, em letras maiúsculas,
centralizado, em negrito, em português e inglês.
AUTORES
Máximo de 6 autores
Nomes completos sem abreviação, com chamada para nota
de rodapé da primeira página em apenas 1 das 4 vias do
manuscrito
Rodapé deve conter: titulação instituição a que o autor
está filiado endereço da instituição CEP cidade, estado
endereço de e-mail, do respectivo autor.
RESUMO
Deve condensar, em um único parágrafo, o
conteúdo, expondo objetivos, materiais e métodos, os
principais resultados e conclusões em não mais do que
250 palavras. De acordo com as normas da NBR6028
Termos para indexação : no mínimo de três e máximo de
cinco. Não devem repetir os termos que se acham no título,
podem ser constituídas de expressões curtas e não só de
palavras e devem ser separadas por vírgula. Se possível,
extraídas do vocabulário: Thesagro Thesaurus Agrícola
Nacional, desenvolvido pela CENAGRI (indicação da
revista Plant Cell Culture & Micropropagation para
evitar o uso de vários sinônimos como termos de indexação)
ABSTRACT
Além de seguir as recomendações do resumo, não
ultrapassando 250 palavras, deve ser uma tradução próxima
do resumo.
Index terms: representam a tradução das palavras-chave
para a língua inglesa.
INTRODUÇÃO
Deve apresentar uma visão concisa do estado atual
do conhecimento sobre o assunto, que o manuscrito
aborda e enfatizar a relevância do estudo, sem constituirse em extensa revisão e, na parte final, os objetivos da
pesquisa. Deve incluir a revisão de literatura.
MATERIAL E MÉTODOS
Esta seção pode ser dividida em subtítulos,
indicados em negrito.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Podem ser divididas em subseções, com subtítulos
concisos e descritivos, e conter tabelas e figuras.
CONCLUSÕES
Finalizar com os resultados de acordo com os
objetivos do trabalho
AGRADECIMENTOS
Se for o caso ao fim do texto, e antes das Referências
Bibliográficas, a pessoas ou instituições. O estilo, também
aqui, deve ser sóbrio e claro, indicando as razões pelas
quais se fazem os agradecimentos
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Devem seguir as normas para citação no texto e na
seção própria.
2.2. A comunicação científica deve ser apresentada na
seguinte seqüência:
TÍTULO
Suficientemente claro, conciso e completo,
evitando-se palavras supérfluas, em letras maiúsculas,
centralizado, em negrito, em português e inglês.
AUTORES
Máximo de 6 autores
Nomes completos sem abreviação, com chamada para nota
de rodapé da primeira página em apenas 1 das 4 vias do
manuscrito
Rodapé deve conter: titulação instituição a que o autor
está filiado endereço da instituição CEP cidade, estado
endereço de e-mail, do respectivo autor.
RESUMO
Deve condensar, em um único parágrafo, o
conteúdo, expondo objetivos, materiais e métodos, os
principais resultados e conclusões em não mais do que
250 palavras. De acordo com as normas da NBR6028
Termos para indexação : no mínimo de três e máximo de
cinco. Não devem repetir os termos que se acham no título,
podem ser constituídas de expressões curtas e não só de
palavras e devem ser separadas por vírgula. Se possível,
extraídas do vocabulário: Thesagro Thesaurus Agrícola
Nacional, desenvolvido pela CENAGRI (indicação da
revista Plant Cell Culture & Micropropagation para
evitar o uso de vários sinônimos como termos de indexação)
ABSTRACT
Além de seguir as recomendações do resumo, não
ultrapassando 250 palavras, deve ser uma tradução próxima
do resumo.
Index terms: representam a tradução das palavras-chave
para a língua inglesa.
Texto: sem subdivisão, porém com introdução, material e
métodos, resultados e discussão (podendo conter tabelas
e gráficos e conclusão subentendidas.
AGRADECIMENTOS
Se for o caso ao fim do texto, e antes das Referências
Bibliográficas, a pessoas ou instituições. O estilo, também
aqui, deve ser sóbrio e claro, indicando as razões pelas
quais se fazem os agradecimentos.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Devem seguir as normas para citação no texto e na seção
própria.
3. CASO O ARTIGO CONTENHA FOTOGRAFIAS,
GRÁFICOS, FIGURAS, SÍMBOLOS E FÓRMULAS,
ESSAS DEVERÃO OBEDECER ÀS SEGUINTES
NORMAS:
3.1. Fotografias deverão ser apresentadas em preto e branco,
nítidas e com contraste, inseridas no texto após a citação
das mesmas e também em um arquivo à parte, salvas em
extensão TIFF ou JPEG com resolução de 300 dpi.
3.2. Figuras deverão ser apresentadas em preto e branco,
nítidas e com contraste, inseridas no texto após a citação
das mesmas e também em um arquivo à parte, salvas em
extensão TIFF ou JPEG com resolução de 300 dpi.
As figuras deverão ser elaboradas com letra Times New
Roman, tamanho 10, sem negrito; sem caixa de textos e
agrupadas.
3.3. Gráficos deverão ser inseridos após citação dos
mesmos, dentro do próprio texto, elaborado
preferencialmente em Excel, com letra Times New Roman,
tamanho 10, sem negrito; sem caixa de textos e agrupadas.
3.4. Símbolos e Fórmulas Químicas deverão ser feitas em
processador que possibilite a formatação para o programa
Page Maker (ex: MathType, Equation), sem perda de suas
formas originais.
OBS: A formatação correta é parte imprescindível para que
o trabalho seja devidamente protocolado. Caso este não
esteja nas normas, o mesmo será recusado.
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: as referências
bibliográficas devem ser citadas conforme a NBR6023/2002
da ABNT.
A exatidão das referências constantes da listagem e a
correta citação no texto são de responsabilidade do(s)
autor(es) do artigo.
4.1. Orientações gerais:
- Deve-se apresentar todos os autores do documento
científico (fonte);
- O nome do periódico deve ser descrito por extenso, não
deve ser abreviado;
- Em todas as referências deve-se apresentar o local de
publicação (cidade), a ser descrito no lugar adequado para
cada tipo de documento;
- As referências devem ser ordenadas alfabeticamente.
4.2. Exemplificação (tipos mais comuns):
ARTIGO DE PERIÓDICO:
VIEIRA, R. F.; RESENDE, M. A. V. de. Épocas de plantio de
ervilha em Patos de Minas, Uberaba e Janaúba, Minas
Gerais. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 24, n. 1, p. 7480, jan./mar. 2000.
LIVRO:
a) livro no todo:
STEEL, R. G. D.; TORRIE, J. H. Principles and
procedures of statistics. New York: McGraw-Hill Book,
l960. 481 p.
b) Parte de livro com autoria específica:
FLEURY, J. A. Análise ao nível de empresa dos impactos
da automação sobre a organização da produção de trabalho.
In: SOARES, R. M. S. M. Gestão da empresa. Brasília: IPEA/
IPLAN, 1980. p. 149-159.
c) Parte de livro sem autoria específica:
MARTIM, L. C. T. Nutrição de bovino de corte em
confinamento. In: ______. Confinamento de bovino de
corte. 2. ed. São Paulo: Nobel, 1986. cap. 3, p. 29-89.
DISSERTAÇÃO E TESE:
GONÇALVES, R. A. Preservação da qualidade tecnológica
de trigo (Triticum aestivum L.) e controle de Rhyzopertha
dominica (F.) durante o armazenamento em atmosfera
controlada com Co2 e N2. 1997. 52 f. Dissertação (Mestrado
em Ciência dos Alimentos) Universidade Federal de
Lavras, Lavras, 1997.
MATIOLI, G. P. Influência do leite proveniente de vacas
mastíticas no rendimento de queijo frescal. 2000. 55 p.
Dissertação (Mestrado em Ciências dos Alimentos) Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2000.
Nota: A folha é composta de duas páginas: anverso e
verso. Alguns trabalhos, como teses e dissertações são
impressos apenas no anverso e, neste caso, indica-se f.
(ABNT, NBR6023/2002, p. 18).
TRABALHOS DE CONGRESSO E OUTROS EVENTOS:
SILVA, J. N. M. Possibilidades de produção sustentada de
madeira em floresta densa de terra firme da Amazônia
brasileira. In: CONGRESSO FLORESTAL BRASILEIRO, 6.,
1990, Campos do Jordão. Anais... Campos do Jordão: SBS/
SBEF, 1990. p. 39-45.
DOCUMENTOS ELETRÔNICOS:
As obras consultadas online são referenciadas conforme
normas específicas para cada tipo de documento
(monografia no todo e em parte, trabalho apresentado em
evento, artigo de periódico, artigo de jornal, etc.),
acrescidas de informações sobre o endereço eletrônico
apresentado entre braquetes (< >), precedido da expressão
Disponível em: e da data de acesso ao documento,
precedida da expressão Acesso em: .
Nota: Não se recomenda referenciar material eletrônico de
curta duração nas redes (ABNT, NBR6023/2000, p. 4).
Segundo padrões internacionais, a divisão de endereço
eletrônico, no fim da linha, deve ocorrer sempre após barra (/).
Monografia (acesso online):
a) livro no todo
TAKAHASHI, T. (Coord.). Tecnologia em foco. Brasília:
Socinfo/MCT, 2000. 90 p. Disponível em: <http//
www.socinfo.org.br>. Acesso em: 22 ago. 2000.
b) parte de livro
TAKAHASHI, T. Mercado, trabalho e oportunidades. In:
______. Sociedade da informação no Brasil: livro verde.
Brasília: Socinfo/MCT, 2000. cap. 2, p. 13-24. Disponível
em: <http://www.socinfo.gov.br>. Acesso em: 22 ago. 2000.
c) Parte de congresso, seminário, etc.
GIESBRECHT, H. O. Avaliação de desempenho de
institutos de pesquisa tecnológica: a experiência de
projeto excelência na pesquisa tecnológica. In:
CONGRESSO ABIPTI, 2000, Fortaleza. Gestão de
institutos de pesquisa tecnológica. Fortaleza: Nutec, 2000.
Disponível em: <http://www.abipti.org.br>. Acesso em:
01 dez. 2000.
d) Tese
SILVA, E. M. Arbitrariedade do signo: a língua brasileira
de sinais (LIBRAS). 1997. 144 p. Dissertação (Mestrado
em Lingüística Aplicada e Estudo de Língua) - Pontifícia
Universidade Católica de São Paulo, São Paulo, 1997.
Disponível em: <http://www.terra.com.br/virtualbooks/
freebook/port/did/ teses.htm>. Acesso em: 28 nov. 2000.
O INFORMARÁ SOBRE SUA PUBLICAÇÃO. OS
ARTIGOS QUE NECESSITAREM DE MODIFICAÇÕES
SERÃO DEVOLVIDOS AO AUTOR PARA A DEVIDA
REVISÃO.
Artigo de periódico (acesso online):
7. OS ARTIGOS SERÃO PUBLICADOS EM ORDEM
DE APROVAÇÃO.
RESENDE, A. M. G. Hipertexto: tramas e trilhas de um
conceito contemporâneo. Informação e Sociedade, Recife,
v. 10, n. 1, 2000. Seção Educação. Disponível em: <http://
www.informaçãoesociedade.ufpb.br/>. Acesso em: 30 nov.
2000.
CITAÇÃO: PELO SISTEMA ALFABÉTICO (AUTORDATA) (conforme ABNT, NBR10520/2002)
Dois autores - Steel & Torrie (1960) ou (STEEL & TORRIE,
1960).
Três ou mais autores - Valle et al. (l945) ou (VALLE et al.,
1945).
Obs.: Quando forem citados dois autores de uma mesma
obra deve-se separá-los pelo sinal & (comercial).
5. O EDITOR CHEFE NOTIFICARÁ O AUTOR DO
RECEBIMENTO DO ORIGINAL E, POSTERIORMENTE,
6. OS ARTIGOS NÃO APROVADOS SERÃO
DEVOLVIDOS.
8. O NÃO-CUMPRIMENTO DESSAS NORMAS
IMPLICARÁ NA DEVOLUÇÃO DO ARTIGO AO
AUTOR.
9. OS CASOS OMISSOS SERÃO RESOLVIDOS PELA
COMISSÃO EDITORIAL.
10. O ARTIGO DEVERÁ SER ENVIADO PARA:
ABCTP
Plant Cell Culture & Micropropagation
Universidade Federal de Lavras
Departamento de Biologia/Setor de Fisiologia Vegetal
Caixa Postal: 3037
CEP 37200-000
Lavras MG
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS
Plant Cell Culture & Micropropagation , a
semestral journal edited by Editora UFLA of the
Universidade Federal de Lavras, publishes scientific
articles and communications in the area of plant tissue
culture, elaborated by researchers of the national and
international scientific community. One of the authors must
be associated and have paid all charges required by the
ABCTP (Plant Tissue Culture Association) in order to be
tax free for publication in Plant Cell Culture &
Micropropagation. Submission of a manuscript implies that
it is neither under consideration for publication elsewhere
nor has appeared previously in part or in whole. On
acceptance for publication, authors assign to the Editors
full copyright of the manuscript in all languages and
countries. Publications will depend on editorial rules and
on the review of experts and ad hoc commission. Reviewer
and editorial opinions will be anonymously communicated
to authors.
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communications are of the entire responsibility of the
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1. SUBMISSION
The manuscript must present a maximum of 14
pages. At the time of submission, a cover letter must be
sent with the manuscript copies to the Editor requesting
publication of the article. This cover letter must be signed
by all authors and also contain the full address,
telephone number and e-mail of the authors. Any
inclusion, exclusion or alteration in the authors order must
be notified and signed by all authors including the one
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Only one of the 4 printed copies must contain the full
names of the authors and footnote in the first page.
Format: Word for Windows (version 98, 2000, XP ou 2003)
Spacing of the text: Double. Margin on the left hand side
and 2.0 cm margin on the right hand side, 2.5 cm upper and
lower margin, 2.5 cm for the heading and 2.,5 cm for the
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Paper: A4 format
Source: Times New Roman, size 12
Number of pages: up to 14 pages, including the illustrations
Tables: Tables should be part of the body of the paper and
they must be presented in Word or Excel. The title should
be above and be presented in the language in which the
article was written and in English. The vertical lines
separating the columns should not appear.
Graphs/Figures/Photographs: must be presented in black
and white, clear and with contrast, scanned, inserted in
the text after citation and also in a separate file (on the
same diskette as the article) saved in extension tif or
jpg , with resolution of 300 dpi. The title should be below
and presented in the language in which the article was
written and in English.
Symbols and Chemical Formula: must be presented using
a word processor that permits a format Page Maker.
2. STRUCTURE AND ORGANIZATION
2.1. The article should be presented in the following
sequence:
TITLE
In English language, containing no more than 15 words in
capital letters and bold.
AUTHORS
Maximum of 6 authors
Full names, with call for baseboard note with the following
information on first page only 1 copys.They should come
in the footnote of the first page in only one of the four
printed copies. :
Footnote: titulation name of the institution to which the
authors belong address of institution ZIP CODE city,
state mail address.
ABSTRACT
should be informative and condensed and should
explain the objectives, material and methods, results and
conclusion of the work in a maximum of 250 words all written
in one paragraph.
For articles written in English the abstract should also be
presented in Portuguese.
Key words: minimum of three and maximum of five. They
should not repeat words that are already in the title. These
may include phrases as well as individual words and should
be separate by commas.
For articles written in English the key-words should also
be presented in Portuguese.
INTRODUCTION
Should present a concise vision of the current level of
knowledge that has been achieved within the subject area
that the paper will discuss. It should neither give an
extensive review nor should it include details about the
results and discussion. It should clearly indicate the
objectives of the research that was carried out.
MATERIALAND METHODS
This section can contain subdivisions, with subtitles in
bold print.
RESULTS AND DISCUSSION
This section can have subsection which begins with
concise, descriptive titles in bold print.
CONCLUSIONS
Finishing agree of objectives of work
ACKNOWLEDGEMENTS
If applicable
BIBLIOGRAPHICAL REFERENCES
They should follow citation norms both in the text and in
the appropriated section.
2.2 The Communication should be presented in the
following sequence
TITLE
Sufficiently clear, conspicuous and complete, without
superfluous words. It is recommended to initiate with the
term that represent the most important aspect, with other
terms in decreasing of importance
TITLE IN PORTUGUESE;
FULL NAME(S) OF THE AUTHOR(S)
Maximum of 6 authors
Full names, with call for baseboard note with the following
information on first page only 1 copys.They should come
in the footnote of the first page in only one of the four
printed copies.
Footnote: titulation name of the institution to which the
authors belong address of institution ZIP CODE city,
state mail address.
ABSTRACT
Written continuously without paragraph. It must
not exceed 250 words. Index terms must be enclosed after
the abstract using terms different from those used in the
title and separated by comma.
Index terms: (3 to 5) must be described in capital and small
letters, and express the content of the article
ABSTRACT AND INDEX TERMS IN PORTUGUESE
Text: with no division but must include introduction,
material and methods, results and discussion and
conclusion (it may include tables and figures)
ACKNOWLEDGEMENTS
If applicable
BIBLIOGRAPHICAL REFERENCES
They should follow citation norms both in the text and in
the appropriated section.
3. PHOTOGRAPHS, GRAPHS, FIGURES, SYMBOLS
OR FORMULA CONTAINED IN THE ARTICLE SHOULD
OBEY THE FOLLOWING RULES:
3.1. Photographs must be presented in black and white,
clear and with contrast, inserted in the text after their citation
and also in a separate file (on the same diskette as the
article) saved in extension TIFF or JPEG with
resolution of 300 dpi.
3.2. Figures must be presented in black and white, clear
and with contrast, inserted in the text after their citation and
also in a separate file (on the same diskette as the article)
saved in extension TIFF or JPEG with resolution of
300 dpi. They must be elaborated using Times New Roman
font, size 10, without bold, without text box and arranged.
3.3. Graphs must be inserted in the text after their citation,
elaborated preferentially in Excel, using Times New Roman
font, size 10, without bold.
3.4. Symbols and Chemical Formula must be presented
using a word processor that permits a format for Page Maker
(ex: MathType, Equation) without loss of its original form.
4. REFERENCES: references must be cited according to
NBR6023/2002 of ABNT. All references and their correct
citation in the text are of the entire responsibility of the
author(s).
5. THE BRAZILIAN ASSOCIATION OF PLANT TISSUE
CULTURE (ABCTP) WILL INFORM THE AUTHOR THE
RECEIPT OF THE ORIGINAL MANUSCRIPT AND
EVENTUALLY IT WILLALSO SEND INFORMATION
REGARDING ITS PUBLICATION. MANUSCRIPTS
THAT REQUIRE MODIFICATIONS WILL BE
RETURNED TO THE AUTHOR FOR THE RESPECTIVE
REVISION ANDCORRECTIONS.
6. MANUSCRIPTS NOT APPROVED WON T BE
RETURNED TO THE AUTHOR.
7. ARTICLES WILL BE PUBLISHED ACCORDING TO
THE ORDER OF RECEIPTAND APPROVAL.
8. IFANY OFTHESE RULES ARE NOTATTENDED THE
MANUSCRIPTWILL BE RETURNED TO THE AUTHOR.
9. THE NEGLECTFUL CASES WILL BE SOLVED BY
THE EDITORIAL COMMITTEE.
10. MANUSCRIPTS SHOULD BE SENT TO THE
FOLLOWINGADDRESS:
ABCTP
Plant Cell Culture & Micropropagation
Universidade Federal de Lavras
Depto. de Biologia - Setor de Fisiologia Vegetal
Caixa Postal: 3037
37200-000 Lavras MG BRAZIL