POTENCIAL ANTIPROLIFERATIVO E GENOTÓXICO DE EXTRATOS DE
Allophylus edulis (A.St.-Hil., Cambess. & A. Juss.) Radlk. PELO TESTE DE
Allium cepa L.
Marina Pasqualli¹, Marília Tedesco², Solange Bosio Tedesco³
¹Mestranda do Programa Pós-graduação em Agrobiologia da Universidade Federal
de Santa Maria, Brasil. e-mail: [email protected]
²Mestranda do Programa Pós-graduação em Agrobiologia da Universidade Federal
de Santa Maria
³Professora Doutora do Programa de Pós-graduação em Agronomia da
Universidade Federal de Santa Maria
Recebido em: 31/03/2015 – Aprovado em: 15/05/2015 – Publicado em: 01/06/2015
RESUMO
Allophylus edulis (A.St.-Hil., Cambess. & A. Juss.) Radlk., conhecida popularmente
como vacum, chal-chal, fruta-de-pombo, murta-vermelha, entre outros, é utilizada na
medicina alternativa no tratamento de problemas digestórios e inflamatórios. Devido
ao intenso uso das plantas medicinais, estudos de genotoxicidade, que podem ser
conduzidos através do teste de Allium cepa L., são necessários por contribuírem
para sua utilização segura e eficaz. Assim, o presente trabalho teve por objetivo
avaliar a atividade antiproliferativa e genotóxica de extratos aquosos de folhas A.
edulis através do sistema teste de Allium cepa. Para o preparo dos extratos, foram
utilizadas folhas secas (infusão) e in natura (infusão e extrato cru), nas
concentrações de 4 g.L-1 e 16 g.L-1. A água destilada foi usada como controle
negativo e o glifosato 1% como controle positivo. Utilizaram-se oito grupos de quatro
bulbos de Allium cepa, cada grupo correspondendo a um tratamento. Os bulbos
foram enraizados em água destilada e então transferidos para os tratamentos, onde
permaneceram por 24 horas. As radículas foram coletadas, fixadas em etanol-ácido
acético por 24 horas e armazenadas em álcool 70%. As lâminas foram preparadas
pela técnica de esmagamento, sendo analisadas 4000 células por tratamento e
determinados os índices mitóticos. Os dados foram analisados pelo teste χ2. Os
resultados indicaram que os extratos aquosos de A. edulis possuem ação
antiproliferativa sobre o ciclo celular de Allium cepa. Além disso, a infusão das folhas
secas e o extrato cru das folhas in natura na concentração de 4 g.L-1 dessa planta
apresentam atividade genotóxica.
PALAVRAS-CHAVE: Chal-chal, genotoxicidade, planta medicinal, sistema teste
vegetal.
ANTIPROLIFERATIVE AND GENOTOXIC POTENTIAL OF Allophylus edulis
(A.St.-Hil., Cambess. & A. Juss.) Radlk. by the Allium cepa L. test
ABSTRACT
Allophylus edulis (A.St.-Hil., Cambess. & A. Juss.) Radlk., popularly known as
“vacum”, “chal-chal”, fruit-of-pigeon, red-myrtle, among others, is used in alternative
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medicine in treatment of inflammatory and digestive problems. Due to the intense
use of medicinal plants, genotoxicity studies, which can be conducted through the
Allium cepa L. test, are required for contributing to the safe and effective use. Thus,
this study aimed to evaluate the antiproliferative and genotoxic activity of aqueous
extracts of leaves of A. edulis through the Allium cepa test system. For the
preparation of the extracts, dry leaves (infusion) and fresh (infusion and crude
extract) were used at concentrations of 4 g L-1 and 16 g L-1. Distilled water was used
as a negative control and glyphosate 1% as a positive control. Eight groups of four
bulbs of Allium cepa were used, each group corresponding to a treatment. Bulbs
were grown in distilled water and transferred to the respective treatments for 24 h.
The root tips were collected, fixed in ethanol-acetic acid for 24 hours and stored in
70% alcohol. The slides were prepared by smashing technique, and analyzed 4000
cells per treatment and determined the mitotic index. Data were analyzed by the test
χ2. The results showed that the aqueous extracts of A. edulis have antiproliferative
action on the cell cycle of Allium cepa. Furthermore, infusion of dried leaves and the
crude extract of fresh leaves in a concentration of 4 g L-1 this plant have genotoxic
activity.
KEYWORDS: “Chal-chal”, genotoxicity, medicinal plant, plant test system.
INTRODUÇÃO
A utilização de plantas medicinais como tratamento primário de muitas
doenças é amplamente difundida em vários países, sendo em alguns casos a única
fonte de medicação disponível às populações de baixa renda. Dentre as espécies
nativas com potencial curativo está Allophylus edulis (A.St.-Hil., Cambess. & A.Juss.)
Radlk., a qual é utilizada tanto na forma de chá quanto na forma de extrato cru para
o tratamento de problemas digestórios e inflamatórios (FRANCO & FONTANA,2011).
Pertencente à família das Sapindaceae, é conhecida popularmente por
vacum, vacunzeiro, chal-chal, fruta-de-pombo, baga-de-morcego, murta-vermelha,
entre outros (LORENZI, 1998). É encontrada em boa parte da América do Sul
(Guiana, Brasil, Bolívia, Paraguai, Argentina e Uruguai), sendo que, em território
brasileiro, distribui-se pela região do Amazonas e nos Estados do Ceará, Bahia,
Mato Grosso, Minas Gerais, Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná, Santa Catarina e
Rio Grande do Sul (REITZ et al., 1988).
O período de frutificação ocorre de novembro a dezembro, sendo que os
frutos são comestíveis e adocicados, tornando-se atrativos aos animais, os quais
fazem a manutenção da fauna através da distribuição das sementes (SENEME et
al., 2006). Tanto os frutos quanto as folhas possuem propriedades terapêuticas. O
chá das folhas é empregado no tratamento de diabetes (DIAZ et al., 2008),
inflamações de garganta, problemas intestinais, diarreias e problemas digestivos
(ABREU et al., 2005). As folhas, quando cozidas, são utilizadas para limpeza de
ferimentos e no controle de pressão alta (FRANCO & FONTANA, 2011).
Tendo em vista a vasta utilização de plantas como agente curativo de
doenças, torna-se necessário ampliar estudos que identifiquem possíveis
consequências do uso descontrolado de algumas plantas na medicina alternativa. A
realização desse estudo é possível através da análise do índice mitótico e do índice
de replicação de células, que são usados como indicadores da proliferação
adequada das células (GADANO et al., 2002) e pode ser medido através do sistema
teste de Allium cepa.
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Diversos autores têm analisado o efeito dos extratos aquosos de plantas
medicinais sobre o ciclo celular de A. cepa, como por exemplo: TEDESCO et al.
(2012), ao estudarem a espécie Mentha pulegium L.; FRESCURA et al. (2013),
estudando as espécies Psychotria brachypoda (Müll. Arg.) Britton e P. birotula Smith
& Downs mut. Char.
O método de aberrações cromossômicas em raízes de Allium é validado pelo
programa internacional de segurança química (PISQ) e pelo Programa Ambiental
das Nações Unidas (PANU) demonstrando eficiência para análise e monitoramento
in situ da genotoxicidade de diversas substâncias (SILVA et al., 2004). Alguns
extratos aquosos de plantas medicinais, como Artemisia verlotorum Lam., Mikania
glomerata Spreng. e Mikania cordifolia (L. f.) Willd., estudadas por SOUZA et al.
(2010), DALLA NORA et al. (2010) e DIAS et al. (2014), respectivamente,
apresentaram efeito genotóxico através do teste de A. cepa.
Assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito antiproliferativo e
genotóxico dos extratos aquosos (infusões) e crus de Allophylus edulis sobre o ciclo
celular de Allium cepa submetidos a duas diferentes concentrações.
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta de material
As folhas de uma população de Allophylus edulis foram coletadas no Rio
Grande do Sul, Brasil, no munícipio de Nova Araçá (Latitude 28º 38’ 42’’ Sul e
Longitude 51º 43’ 37’’ Oeste), em área pertencente ao Viveiro municipal. Após a
coleta, as folhas que foram utilizadas para o tratamento in natura foram
armazenadas sob refrigeração por sete dias até o uso. O restante do material foi
desidratado de forma natural, à temperatura ambiente em torno de 25°C . O
experimento foi conduzido no laboratório de Citogenética Vegetal e Genotoxicidade,
Departamento de Biologia, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM).
Preparo das infusões e do extrato cru
As folhas secas e in natura de A. edulis utilizadas para o preparo das infusões
foram colocadas em água fervente, permanecendo em infusão por 10 minutos.
Essas infusões foram coadas, e resfriadas em temperatura ambiente e preparadas
em duas concentrações: 4g.L-1 e 16g.L-1. Os extratos crus (folhas in natura) foram
preparados nas mesmas concentrações das infusões, em liquidificador da marca
ULTRA, potência de 300W, permanecendo em agitação por um minuto. O herbicida
glifosato 1% foi utilizado como controle positivo.
Ensaio Biológico
Foram utilizados oito grupos de quatro bulbos de Allium cepa, cada grupo
equivalendo a uma das concentrações. Todos os bulbos foram colocados em água
destilada para enraizamento e, posteriormente, os mesmos foram submetidos aos
extratos que estavam em temperatura ambiente, permanecendo por 24 horas (um
grupo permaneceu em água destilada, sendo utilizado como controle negativo). A
seguir, foram coletadas as radículas com aproximadamente 5-10mm de
comprimento e fixadas em etanol:ácido acético (3:1) por 24 horas, sendo mantidas
em etanol 70% e conservadas sob refrigeração até seu uso.
Efeito dos extratos sobre o ciclo celular de Allium cepa
Foram confeccionadas duas lâminas por bulbo de cada tratamento. No
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preparo das lâminas, as radículas foram hidrolisadas em HCl 1N por cinco minutos e
lavadas com água destilada. A região meristemática das radículas foi fragmentada
com auxílio de agulhas histológicas, corada com orceína acética 2%, esmagada com
um bastão de vidro e, sobre o material, colocada uma lamínula (GUERRA & SOUZA,
2002). Foi feita a análise de 1000 células por bulbo, totalizando 4000 células por
tratamento. As lâminas foram avaliadas com auxílio de microscópio óptico com a
objetiva de 40X, observando-se as células em interfase e em divisão celular (mitose)
para calcular o Índice Mitótico, bem como a ocorrência de aberrações
cromossômicas, como presença de pontes, cromossomos retardatários,
micronúcleos, células binucleadas, entre outras.
Análise estatística
A análise estatística dos dados foi realizada pelo teste x2 com nível de
probabilidade <0,05 através do programa BioEstat 5.3 (AYRES, 2007).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Utilizou-se para a realização deste trabalho o sistema teste vegetal de Allium
cepa como medida de avaliação dos efeitos dos extratos aquosos e crus de
Allophylus edulis. O sistema teste vegetal in vivo de Allium cepa é validado por
pesquisadores que realizaram de forma conjunta teste animal in vitro e os resultados
obtidos são similares (VICENTINI et al., 2001; TEIXEIRA et al., 2003).
Na Tabela 1 são apresentadas as células que foram observadas em interfase
e em diferentes fases da divisão celular durante o ciclo celular de Allium cepa.
Nessa mesma tabela mostra-se também os valores dos índices mitóticos, o número
de células com alterações e a proporção de células com alterações em relação ao
número de células em divisão.
TABELA 1. Células em interfase, divisão, índice mitótico, número e porcentagem de
Tratamentos
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
células com alterações em radículas de Allium cepa submetidas aos
diferentes tratamentos de Allophylus edulis (A.St.-Hil., Cambess. &
A.Juss.) Radlk.
Número de
Células
Células com
Células em Células em
Índice
com
alterações (%)
divisão
mitótico alterações
intérfase
3820
3944
3863
3993
3904
3978
3891
3883
180
56
139
7
96
22
109
117
4,5a*
1,4d
3,42abc
0,17f
2,4c
0,55e
2,72bc
1,7bc
0b*
4a
0b
0b
4a
0b
8a
0b
0
7,14
0
0
4,16
0
7,33
0
T1 – água destilada (controle negativo); T2 – glifosato 1% (controle positivo); T3 – extrato aquoso
-1
-1
-1
in natura 4 g.L ; T4 – extrato aquoso in natura 16 g.L ; T5 – extrato aquoso folhas secas 4 g.L ;
-1
-1
-1
T6 – extrato aquoso folhas secas 16 g.L ; T7 – extrato cru 4 g.L ; T8 – extrato cru 16 4 g.L .
*Médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si, pelo teste χ2, a um nível
de 5% de probabilidade de erro.
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Os resultados obtidos mostraram que os valores dos índices mitóticos
variaram de 4,5% para o controle em água destilada a 0,17% para a infusão de
folhas in natura na concentração de 16 g.L-1 (Tabela 1). Foram encontradas células
com alterações cromossômicas durante a divisão celular nos tratamentos T2
(glifosato 1%), T5 (infusão de folhas secas 4 g.L-1) e T7 (extrato cru de folhas in
natura 4 g.L-1) (Figura 1), diferindo significativamente dos demais tratamentos. Por
essa razão, verificou-se que a infusão de folhas secas na concentração de 4 g.L-1 e
o extrato cru de folhas in natura na concentração de 4 g.L-1 de A. edulis
apresentaram efeito genotóxico sobre as células meristemáticas de A. cepa. Outros
autores também avaliaram a atividade genotóxica de extratos de espécies
medicinais pelo teste de A. cepa, como DALLA NORA et al. (2010), SOUZA et al.
(2010) e KUHN et al. (2015), os quais encontraram atividade genotóxica em extratos
de Mikania glomerata, Artemisia verlotorum e Eugenia uniflora, respectivamente.
FIGURA 1. Células com alterações cromossômicas submetidas aos extratos
de Allophylus edulis (A.St.-Hil. Cambess. & A.Juss.) Radlk. A)
seta indicando ponte anafásica em célula de raiz submetida ao
tratamento com infusão de folhas secas 4 g.L-1; B) seta indicando
ponte anafásica em célula de raiz submetida ao tratamento com
extrato cru 4 g.L-1. Escala: 10 µm.
No presente trabalho foram encontradas alterações cromossômicas nas
células de raízes de Allium cepa tratadas com a infusão de folhas secas e o extrato
cru das folhas in natura de Allophylus edulis na menor concentração utilizada (4g.L1
), demonstrando que esses tratamentos possuem atividade genotóxica. O mesmo
foi constatado por COELHO (2013), que avaliou duas concentrações (6 g.L-1 e 24
g.L-1) de extratos aquosos de Echinodorus grandiflorus, demonstrando que a menor
concentração possui um efeito genotóxico.
Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que os extratos de A.
edulis diminuíram significativamente a divisão celular em ambas as concentrações
estudadas, tanto com as folhas secas quanto com as folhas in natura, com exceção
do tratamento T3 (infusão de folhas in natura 4g.L-1), onde não foi observada
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diferença significativa quando comparado com o controle negativo em água (T1).
Foi observado que houve decréscimo nos valores dos índices mitóticos para
todos os tratamentos testados em relação ao controle negativo (T1), sendo que a
maior diminuição ocorreu no tratamento por infusão das folhas in natura na
concentração de 16 g.L-1. Houve diferença significativa entre o controle positivo e o
controle negativo, mas somente os tratamentos com a maior concentração (16 g.L-1)
em infusões de folhas secas e in natura apresentaram valores menores que os
observados no controle positivo (T2), com índices mitóticos de 0,17% e 0,55%,
respectivamente. Além disso, os extratos nas maiores concentrações (16g.L-1)
apresentaram uma inibição do índice mitótico maior do que aquela observada nos
extratos de menor concentração (4 g.L-1), tanto para as folhas secas, quanto in
natura. Devido a diminuição da divisão celular observada nos tratamentos através
dos valores dos índices mitóticos, demonstra-se que os extratos aquosos das folhas
de A. edulis apresentam atividade antiproliferativa.
Resultados semelhantes foram observados por DIAS et al., (2014), estudando
a espécie Mikania cordifolia, onde observaram que os índices mitóticos de duas
populações variaram de 3,4% a 0,84% na população 1 e de 2,16% a 0,28% na
população 2. LACERDA et al., (2014), em estudo com Hymenaea stigonocarpa,
também observaram efeito antiproliferativo para esta espécie em todas as
concentrações testadas (0,082 g.mL-1, 0, 164 g.mL-1 e 0,328 g.mL-1), inclusive a
concentração utilizada comumente pela população (0,082 g.mL-1). De acordo com
NEVES et al., (2014) os índices mitóticos encontrados para os extratos aquosos de
Phyllanthus niruri também diminuíram significativamente para todas as
concentrações testadas (0,02 mg.mL-1, 0,04 mg.mL-1, 0,06 mg.mL-1 e 0,08 mg.mL-1).
Em um estudo realizado por FRESCURA et al. (2012), os autores observaram
que os extratos aquosos das folhas (6 e 30 g.L-1) e cascas do caule (32 e 160 g.L-1)
da espécie Luehea divaricata Mart. provocaram uma diminuição nos valores dos
índices mitóticos de A. cepa. Ainda, semelhantemente ao que ocorreu com os
extratos de Allophylus edulis, essa diminuição foi mais acentuada à medida que se
aumentava a concentração dos extratos.
Os resultados obtidos nesse trabalho estão de acordo com os estudos
realizados por YAGÍA et al. (1999), que avaliaram os extratos aquosos de Allophylus
edulis nas concentrações de 0,75 g.L-1, 1,5 g.L-1, 3 g.L-1,6 g.L-1 e 12 g.L-1 através do
teste de Allium cepa, sendo observada atividade antiproliferativa e genotóxica
nesses extratos.
CONCLUSÃO
Verificou-se nesse estudo que os extratos aquosos das folhas secas e in
natura preparados por infusão e os extratos crus das folhas in natura de Allophylus
edulis possuem potencial antiproliferativo sobre o ciclo celular de Allium cepa. Além
disso, a infusão das folhas secas e o extrato cru das folhas in natura na
concentração de 4g.L-1 apresentaram atividade genotóxica.
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