BOLETIM TÉCNICO N° 58
JULHO/98
ISSN 0100-3054
VARIABILIDADE
GENÉTICA DA ALFAFA
MARCADORES
AGROMORFOLOGICOS E
MOLECULARES
Maria Lúcia Crochemore1
INSTITUTO AGRONÔMICO DO PARANÁ- LONDRINA-PR
1
Engª Agrª PhD, Pesquisadora da Área de Propagação Vegetal. IAPAR.
Caixa Postal 481. 86001-970. Londrina - PR.
INSTITUTO AGRONÔMICO DO PARANÁ
VINCULADO À SECRETARIA DE ESTADO DA AGRICULTURA E DO ABASTECIMENTO
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DIRETORIA EXECUTIVA
Florindo Dalberto
PRODUÇÃO
Arte-final e capa: Tadeu Kioshy Sakiyama
Coordenação Gráfica: Jentaro Lauro Fukahori
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Tiragem: 750 exemplares
Todos os direitos reservados ao Instituto Agronômico do Paraná.
É permitida a reprodução parcial, desde que citada a fonte.
É proibida a reprodução total desta obra.
C937v
Crochemore, Maria Lúcia
Variabilidade genética da alfafa: marcadores
agromorfológicos e moleculares / Maria Lúcia
Crochemore. Londrina:
IAPAR, 1998.
59p.
Ilust. (IAPAR. Boletim Técnico, 58)
1. Alfafa-Genética. 2. Leguminosas forrageiras.
I. Instituto Agronômico do Paraná,
Londrina, PR.
II. Título.
III. Série.
CDD
AGRIS
1953
633.31
F30
SUMÁRIO
Pág.
APRESENTAÇÃO ....................................................................................
5
RESUMO ..................................................................................................
7
ABSTRACT...............................................................................................
7
INTRODUÇÃO..........................................................................................
9
ORIGEM E DISTRIBUIÇÃO DO GÊNERO Medicago ...............................
11
GÊNERO Med/cago - TAXONOMIA................................. .......................
11
A PLOIDIA E O SISTEMA DE REPRODUÇÃO .........................................
13
O COMPLEXO M. sativa - ESPÉCIES ......................................................
14
Medicago sativa L,(M. sativa ssp. sativa L& L.)..................................
17
Medicago falcata L. (M. sativa ssp. falcata Arcangeli)..........................
17
Medicago glomerata Balb ....................................................................
18
Medicago glutinosa M. B. (M. sativa ssp. glutinosa)............................
19
Medicago prostrata Jacq......................................................................
19
O COMPLEXO Medicago sativa - SUBESPÉCIES HÍBRIDAS ..................
19
Medicago sativa ssp. X hemicycla Grossh. (2n=16,32).......................
20
Medicago sativa ssp. X var/a Martin (2n=16,32) .................................
20
Medicago sativa ssp. X tunetana Murbeck (2n=32) ............................
21
Medicago sativa ssp. X polychroa Grossh. (2n=32) ............................
21
EVOLUÇÃO DO COMPLEXO M. sativa-falcata ........................................
21
PROPAGAÇÃO E EVOLUÇÃO DAS ALFAFAS CULTIVADAS.................
23
REGIÕES DE CULTIVO......................................................................
24
A CARACTERIZAÇÃO E AS ESTRUTURAÇÕES ....................................
25
CARACTERES MORFOLÓGICOS E AGRONÓMICOS.......................
27
COR DAS FLORES .....................................................................
28
COMPORTAMENTO INVERNAL .................................................
29
PORTE DA PLANTA....................................................................
30
SISTEMA RADICULAR E O CARÁTER RIZOMATOSO...............
31
HASTES, ENTRENÓS E ÉPOCA DE FLORAÇÃO .....................
32
RELAÇÃO FOLHA/HASTE..........................................................
34
CLASSIFICAÇÕES OBTIDAS POR CARACTERES
AGROMORFOLÓGICOS.........................................................................
34
POPULAÇÕES NÃO-RESISTENTES AO FRIO..................................
35
POPULAÇÕES MAIS OU MENOS TOLERANTES AO FRIO..............
36
POPULAÇÕES DO TURQUESTÃO ...................................................
37
POPULAÇÕES COM FLORES MATIZADAS......................................
37
POPULAÇÕES COM FLORES AMARELAS.......................................
38
OS MARCADORES NEUTROS E AS CLASSIFICAÇÕES.......................
40
MARCADORES DO TIPO PROTEICO ...............................................
40
MARCADORES RFLP (RESTRICTION FRAGMENT LENGTH
POLYMORPHISM)..............................................................................
42
MARCADORES RAPD (RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC
DNA)...................................................................................................
43
CONCLUSÃO ..........................................................................................
48
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .........................................................
49
AGRADECIMENTOS...............................................................................
59
APRESENTAÇÃO
A alfafa é uma leguminosa forrageira cujo cultivo desperta
vários interesses como a fixação simbiótica do nitrogênio na fitomassa,
promove, graças ao seu forte sistema radicular, a mobilização de
nutrientes das camadas mais profundas do solo, boas qualidades
nutricionais para os animais e alta produtividade,'mesmo em condições
de seca, apresentando múltiplas utilizações: cobertura verde, pastagem,
forragem verde, feno, silagem, extração de proteínas e xantofilas,
produção de fibras para a indústria papeleira, etc.
A grande variabilidade genética que apresenta lhe permite
adaptação aos mais contrastantes climas, desde os mais quentes aos
mais frios e a inúmeros tipos de solos, com exceção dos muito ácidos ou
muito úmidos.
Sua utilização no Brasil restringe-se às regiões sul, sudeste e
centro-oeste onde existem alguns programas de pesquisa e
desenvolvimento visando explorar e valorizar mais o potencial dessa
leguminosa.
O estudo da variabilidade genética da alfafa, baseado na
utilização de caracteres morfológicos e agronômicos é uma contribuição
importante para o conhecimento da espécie. Recentemente, com o
desenvolvimento de marcadores moleculares, baseados nas diferenças
polimórficas entre moléculas de DNA, livres de efeitos ambientais,
abriu-se oportunidade ímpar de melhor caracterizar a divergência
genética existente.
O presente trabalho traz atualizações e informações úteis aos
interessados na cultura da alfafa, que desejem ampliar seus
conhecimentos agronômicos e científicos
Carlos Roberto Riede
Coordenador da Área de Melhoramento e Genética Vegetal
5
RESUMO
Esta revisão trata da caracterização da variabilidade genética de
Medicago saúva L. É abordada a taxonomia do gênero Medicago, a evolução
e diversificação do complexo Medicago sativa-falcata. São também
abordados os marcadores agromorfológicos e moleculares utilizados nas
caracterizações e classificações de populações de alfafa perene tetraplóide.
ABSTRACT
This review presents the genetic variation of perennial alfalfa
{Medicago sativa L.), the taxonomy of the Medicago gemjs, the evolution
and diversity of the Medicago sativa-falcata complex. The review describes
the morphological, agronomic and moleculares markers used in the
caracterisation of the tetraploid perennial alfalfa populations.
INTRODUÇÃO
Cultivada em quase todas as latitudes, a alfafa cobre aproximadamente
33 milhões de hectares e encontra seu maior desenvolvimento em regiões
temperadas quentes: Estados Unidos (9 a 10 milhões de hectares), Europa,
América do Sul, Ásia, Austrália, Japão, Nova Zelândia. Ela é também
encontrada na África e no Canadá (2 milhões de hectares).
Essa planta forrageira tem grande valor na alimentação dos animais seja
como feno, silagem, pellets desidratados para bovinos e ovinos, seja
incorporado nos alimentos compostos para monogástricos ou ainda, em
pastoreio, sobretudo na Argentina e na Austrália. Ainda que, atualmente, seu
papel volta a ser mais importante, a cultura da alfafa regrediu muito na Europa
Ocidental nas últimas décadas em razão do desenvolvimento do trinômio milhoazevém-soja na produção leiteira. A alfafa, freqüentemente associada a
gramíneas, é cultivada atualmente em 1.200.000 ha na Itália, 600.000 ha na
França, 350.000 ha na Espanha e 200.000 ha na Grécia.
Mais da metade das variedades e populações de alfafa cultivadas são
originárias do intercruzamento entre Medicago sativa ssp. saúva e Medicago
sativa ssp. falcata. Devido à alogamia e à estrutura autotetraplóide das formas
cultivadas deste complexo de subespécies, uma grande diversidade genética é
encontrada entre populações originárias de diferentes regiões geográficas e
também no interior destas populações. Os recursos genéticos disponíveis
atualmente compreendem, por um lado, as variedades inscritas nos catálogos
oficiais e, por outro, as populações selvagens, ecótipos e populações regionais
onde se encontra a maior amplitude de variabilidade genética. A erosão da
9
diversidade genética, encontrada essencialmente nas plantas cultivadas, leva a
procurar nas populações selvagens ou nas populações subespontâneas uma
fonte de variabilidade suplementar, que poderá ser salvaguardada e
posteriormente explorada em melhoramento genético. Assim, é indispensável
ter-se a maior amplitude possível de variação genética da espécie estudada.
Esta diversidade genética pode ser avaliada com a ajuda de vários
tipos de caracteres neutros ou selecionados. Em uma população, a diversidade
dos caracteres neutros é o resultado da deriva genética, da migração e de
mutações. Por outro lado, a variabilidade de uma população relativa aos
caracteres selecionados depende não somente destes eventos genéticos mas
também da influência do ambiente e do homem. Desde que a seleção seja
forte, ela pode mascarar a estruturação das populações. A descrição da
variabilidade genética através de marcadores neutros como as isoenzimas, ainda
que estas não sejam amplamente utilizadas em alfafa, permitiu classificações de
algumas populações do complexo Medicago sativa-falcata. Por outro lado,
análises diretas de fragmentos de DNA através das técnicas de RFLP
(Restriction Fragment Lenght Polymorphism) e RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNA) ainda são muito limitadas em número e amplitude na alfafa
perene.
Este trabalho inicia com uma revisão sobre a taxonomia do gênero
Medicago, apresentando a seguir a evolução e a diversificação do complexo
Medicago sativa-falcata. Aborda também os diferentes marcadores utilizados
nas caracterizações e classificações da alfafa perene tetraplóide.
10
ORIGEM E DISTRIBUIÇÃO DO GÊNERO Medicago
O gênero Medicago tem como centro de origem o Oriente-Médio (Quiros
& Bauchan, 1988) e teria se diferenciado durante a era terciária (Lesins &
Lesins, 1979). As formas mais antigas, perenes e preferencialmente alógamas
teriam como centro de origem a costa norte do Mediterrâneo. No Mioceno, o
fechamento intermitente do estreito de Gibraltar ligado à formação de montanhas
(Alpes, Pirineus, Apeninos etc.) teria transformado momentaneamente a Bacia
Mediterrânea em um deserto quente. A criação deste novo habitat favoreceu a
diferenciação de espécies anuais colonizadoras, de sementes dormentes e de
ciclo vegetativo curto, a partir das espécies perenes preexistentes. Ao mesmo
tempo em que as espécies se tornavam anuais, o caráter autógamo teria
aparecido como uma estratégia reprodutiva essencial devido ao isolamento
geográfico e da falta de polinizadores nos novos hábitat colonizados. A abertura
final do estreito de Gibraltar conduziu numerosas espécies à extinção. Como
estas espécies anuais surgiram após o fim deste processo geológico, seu estudo
não pode contribuir efetivamente para a compreensão da origem do gênero
(Quiros & Bauchan, 1988).
A distribuição do gênero teria em seguida progredido em direção da
Espanha e Ilhas Canárias a Oeste, da China a Leste, da Sibéria ao Norte e da
Península Arábica ao Sul.
GÊNERO Medicago - TAXONOMIA
O gênero Medicago pertence à ordem das Leguminosales, super família
das Leguminosas, família Fabacea.
A sistemática e a filogênese do gênero Medicago resultam dos trabalhos
de vários autores ao longo da história: Linnaeus, Urban, Taubert, Ascherson &
Graebner, Trabut, Hegi, Synskaya (Villax, 1963). No entanto, foi somente a
11
amarela, violeta ou mesclada de amarelo e violeta (yariegated). As vagens
são retas, em forma de foice ou em espiral, sem espinhos. As nervuras são
proeminentes. As vagens são membranosas e há uma fraca divisão (ou ausência
completa) entre as sementes (Lesins & Lesins, 1979).
A PLOIDIA E O SISTEMA DE REPRODUÇÃO
O número cromossômico de base do gênero é oito, exceção feita a
algumas espécies anuais: M. constricta, M. praecox, M. polymorpha, M.
rigidula e M. murex que têm um número de base de sete cromossomos (Lesins
& Lesins, 1979; Quiros & Bauchan, 1988).
Três níveis de ploidia são encontrados nas diferentes espécies do gênero:
diplóide (2x=l 6), tetraplóide (4x=32) e hexaplóide (6x=48) mas, a maioria
das espécies são diplóides. É possível que a base da evolução do gênero tenha
sido a diploidia e que as espécies tetraplóides tenham saído de uma não-redução
de gametas, o que originou indivíduos bastante vigorosos e heterozigotos aptos
a colonizar outros habitats e expandir assim a zona geográfica do gênero (Quiros
& Bauchan, 1988).
Algumas espécies perenes como M. sativa, M. falcata, M. prostrata,
M. papillosa ou M. arbórea podem apresentar níveis de ploidia diferentes de
2x/4x/6x, pouco ou nada interferíeis (Lesins & Lesins, 1979).
As espécies anuais de Medicago são autógamas graças à autofecundação
de suas flores. As perenes são alógamas com diferentes níveis de autoincompatibilidade. Às vezes é possível ocorrer a autofecundação em algumas
perenes alógamas, mas normalmente as plantas têm necessidade de insetos
para a polinização e fecundação. Devido a sua alogamia, estas plantas são
fortemente polimorfas (Quiros & Bauchan, 1988).
A existência de formas diplóides e tetraplóides em M. sativa e M.
falcata, assim como em outras espécies, sugere que a duplicação cromossômica
13
tenha ocorrido independentemente em cada espécie. As formas híbridas entre
os dois níveis de ploidia podem ser devido à duplicação de híbridos diplóides,
à hibridação de gametas 2n saídos de um genitor diplóide com gametas normais
2n saídos de outro genitor tetraplóide, ou mesmo, à união rara de dois gametas
provenientes de dois pais diplóides (Stanford et ai, 1972).
O COMPLEXO M. sativa - ESPÉCIES
Das 55 espécies de Medicago descritas por Lesins & Lesins (1979)
somente uma dezena é cultivada (Tabela 1). A maioria é encontrada nas
pastagens ou beiras de estradas, notadamente mediterrâneas (Prosperi et al.,
1995).
As espécies perenes cultivadas, exceto M. arbórea e M. lupulina,
pertencem à seção Falcago, subseção Falcatae: falcata, sativa, glomerata,
glutinosa eprostrata. Existem inúmeras possibilidades de intercruzamento
entre as formas diplóides e/ou tetraplóides destas espécies, que Lesins & Lesins
(1979) descrevem como um complexo de espécies, denominado em sentido
amplo, complexo Medicago sativa. Todas as espécies deste complexo podem
se hibridar com M. sativa mas, acima da metade dos ecótipos de alfafa
cultivados atualmente são originários do intercruzamento de formas perenes
tetraplóides alógamas de M. sativa com M. falcata (Lesins & Lesins, 1979).
Dentro deste complexo, alguns autores dão uma classificação em espécies
(Lesins & Lesins, 1979), outros em subespécies (Tutin, 1978; Gunn et al.,
1978; Quiros & Bauchan, 1988). A classificação em subespécies é justificada
pois não existem barreiras de hibridação. A única barreira para a troca de
genes entre as espécies do complexo M. sativa é a ploidia, mastesta barreira
pode ser suplantada pela produção de gametas diplóides não reduzidos (Quiros
& Bauchan, 1988). Assim, Lesins & Lesins (1979) admitem a classificação em
subespécies no que diz respeito à hereditariedade de caracteres, à fertilidade e
14
15
à sobrevida dos descendentes em condições experimentais.
Diferenças morfológicas sutis resultantes de recombinações genéticas
foram utilizadas para identificar novas espécies ou subespécies. Considerando
a grande variabilidade entre as espécies como M. sativa, M. faicata e M
glutinosa, pode-se dizer que com a recombinação de caracteres parentais,
inúmeros tipos de híbridos são produzidos (Quiros & Bauchan, 1988).
Gunn et ai. (1978) declaram nove subespécies do complexo M. sativa:
sativa (2n=16=32); praefalcata (2n=16,32); caerulea (2n=16,32);
glomerata (2n=16), X varia (2n=16, 32), ambigua (2n=l 6); hemicycla
(2n=16, 32), faicata (2n=16, 32) e viscosa (2n=32). Quiros & Bauchan
(1988), em uma revisão bibliográfica baseada essencialmente sobre a
classificação de Lesins & Lesins (1979) declaram oito subespécies no complexo
M. sativa: sativa (2n=32), coerulea (2n=16), falcata (2n=16, 32), X
varia (2n-32), X hemicycla (2n= 16), polychroa (2n=32), X tunetana
(2n=32), e glutinosa (2n=32). M. glomerata (2n=16) e M. prós trata (2n=16,
32) pertencem a outro complexo fechado. Para eles a praefalcata descrita
por Gunn et al. (1978) seria a subespécie glutinosa.
Evidências citológicas e genéticas baseadas em grande número de
populações diplóides_e tetraplóides de M. sativa e M. faicata mostram que
elas têm um ancestral comum recente. Esta evidência justifica a interpretação
de Gunn et al. (1978) de M. falcata como sendo M. sativa ssp. falcata. De
modo semelhante, estudos citológicos com M. glutinosa e M. sativa autorizam
a denominação M. sativa ssp. glutinosa (Quiros & Bauchan, 1988). Para
estes autores existem três principais subespécies dentro do complexo: sativa,
falcata, X varia e uma menos diversificada, a glutinosa. Todas estas
subespécies sofreram forte evolução genética no tempo e no espaço, devido a
uma grande diversificação proporcionada pela seleção natural e pelo homem.
A seguir é dada uma descrição das espécies que compõem o complexo
M. sativa, segundo a classificação de Lesins & Lesins (1979) e de Quiros &
16
Bauchan(1988).
Medicago sativa L. (M. sativa ssp. sativa L. & L.)
A forma diplóide é denominada M. sativa ssp. coerulea, já M. sativa
ssp. sativa é a forma tetraplóide. Esta subespécie é caracterizada por possuir
flores violetas ou azuis, uma raiz pivotante, um porte ereto, vagens espiraladas.
Ela é pouco dormente e tem uma tolerância variável ao frio.
A distribuição das duas formas, diplóides e tetraplóides, inclui os arredores
do Mediterrâneo, o Oriente Próximo e o Oriente Médio, o Cáucaso, o sul e o
centro da Ásia tom uma concentração nas montanhas e vales da Armênia,
Anatólia, Irã, Afeganistão, Ásia Central, Jamm e Cachemir.
O centro de origem de M. sativa é o Oriente Próximo, Ásia Menor,
Transcáucaso, Irã e as zonas altas do Turquemenistão (Michaud et al., 1988).
O centro geográfico mais mencionado é o Irã. Estas regiões são caracterizadas
por invernos frios e verões secos e quentes, onde os solos são bem drenados
e de pH quase neutro. Estas regiões seriam o centro de origem de algumas
populações que constituem toda ou parte da base de algumas variedades
europeias. Alguns autores acrescentam um segundo centro, a Ásia Central
(Synskaya, 1950; Bolton et al, 1972; Michaud et al, 1$88), caracterizada
por clima seco e invernos amenos, de onde seriam originárias as alfafas resistentes
a algumas doenças e insetos, apresentando bom crescimento em condições de
seca.
Medicago falcata L. (M. sativa ssp. falcata Arcangeli)
Tem flores amarelas, porte prostrado, raízes fasciculadas, vagens retas
ou em forma de foice, as vezes enroladas em uma espiral. É resistente ao frio e
é caracterizada por uma remarcável dormência invernal. Ocorrem formas
diplóides e tetraplóides que possuem características bioquímicas e morfológicas
17
variáveis. Considerando esta variabilidade, as formas diplóides têm recebido
diferentes denominações de espécie ou subespécie: borelis, românica,
altíssima, glandulosa, quasifalcata, difalcata, tenderensis e erecta.
M.falcata tem como centro de origem as regiões de estepes florestais
da Ásia e da Europa, estando distribuída em zonas de climas comparáveis que
vão da Europa do Norte à Sibéria (Synskaya, 1950; Bolton et ai., 1972;
Small& Jomphe, 1988; Michaud et al., 1988). uma espécie normalmente
espontânea. Ela é freqüente nas regiões de estepes desde a costa norte do
Mediterrâneo (Bulgária, Grécia, França) até o norte da Rússia (Prosperi et
al, 1995).
As formas diplóides estão distribuídas nas regiões que vão do oeste da
Alemanha a leste da Sibéria e da costa sul do Mar Negro até o norte de
Leningrado. Crescem de modo predominante na Europa do Norte (Small &
Brookes, 1984). É uma das espécies mais adaptadas à regiões frias e aos
verões secos (Quiros & Bauchan, 1988; Prosperi et ai, 1995). Ainda que as
formas tetraplóides de M.falcata sejam mais freqüentes que as diplóides nas
regiões de origem (Gunn et al., 1978; Lesins & Lesins, 1979), parece que
elas não são tão amplamente distribuídas quanto as diplóides. M.falcata foi
introduzida na Alemanha e no norte da França no século XVI (Synskaya,
1950).
Medicago glomerata Balb.
Esta espécie é caracterizada por flores de cor amarela brilhante e por
vagens espiraladas cobertas de pêlos glandulares. Formas diplóides foram
encontradas no sul da Europa, nos Alpes e na África do Norte. Na África do
Norte, formas tetraplátdes foram também encontradas. A classificação como
M. saúva ssp. glomerata dada por Gunn et al. (1978) não se justifica devido
à fraca fertilidade entre as duas subespécies (Quiros & Bauchan, 1988).
18
Medicago glutinosa M. B. (M. sativa ssp. glutinosa)
Esta é uma espécie tetraplóide caracterizada por uma corola de cor
amarela brilhante a creme. As vagens são espiraladas e cobertas de pêlos
glandulares. Ela é adaptada às regiões úmidas sub-alpinas do Cáucaso.
Segundo uma primeira hipótese, a ssp. glutinosa teria seus ancestrais
diplóides. Entretanto, estas formas ou não existem mais ou ainda não foram
encontradas. Duas outras hipóteses sugerem que a ssp. glutinosa seja o
resultado da hibridação de M. glomerata e M. sativa ssp. falcata ou que ela
seja originária da hibridação de M. sativa e M. falcata. Esta última hipótese é
pouco provável devido aos pêlos glandulares que cobrem as vagens da
subespécie glutinosa (Lesins & Lesins, 1979).
Medicago prostrata Jacq.
Formas diplóides e tetraplóides existem. Elas são caracterizadas por
possuírem flores amarelas e vagens espiraladas. As vagens são similares àquelas
da subespécie coerulea mas as flores se assemelham àquelas da subespécie
falcata. Esta espécie é originária de regiões costeiras secas e rochosas. Ela
esta distribuída do leste da Áustria e da Itália, ao longo da costa leste Adriática
até a Grécia (Lesins & Lesins, 1979).
O COMPLEXO M. sativa - SUBESPÉCIES
HÍBRIDAS
Devido ao grande polimorfismo que é encontrado na coloração da flor
e no número de espirais de suas vagens, estas subespécies são consideradas
como híbridos de M. sativa (subespécies sativa, coerulea, falcata,
glutinosa) e M. glomerata (Lesins, 1968).
19
Medicago sativa ssp. X hemicycla Grossh. (2n=16,32)
Ela apresenta uma corola de cor mesclada de 8-10 mm de comprimento.
Suas vagens são em forma de foice, raramente espiralada com um lúmen aberto.
Estas vagens têm 5-7 mm de comprimento, não são glandulares, são lisas ou
ligeiramente pubescentes. É nativa do Cáucaso (Gunn et al, 1978) e é possível
que seja o resultado do cruzamento entre a subespécie falcata e a subespécie
coerulea pois a variabilidade encontrada em híbridos artificiais destas duas
subespécies corresponde completamente à subespécie X hemicycla (Lesins
& Lesins, 1979).
Medicago sativa ssp. X varia Martin (2n=16,32)
A hibridação entre M. sativa ssp. sativa e M. sativa ssp. falcata resultou
em alfafas muito vigorosas de flores de cor mesclada, que permitiram a grande
expansão desta cultura na Europa do Norte e na América do Norte (Bolton et
al., 1972).
Estes híbridos se caracterizam por apresentar cor de flor que varia do
amarelo claro ao verde escuro passando por todas as tonalidades (do amarelo
ao violeta e ao marrom) e pela forma das vagens, mais espiraladas que
aquelas de M. falcata (Stebler, 1896). Segundo o mesmo autor, esta alfafa é
espontânea na Alemanha e no norte da França. Entretanto, para Mayer et al.
(1951) ela é encontrada em toda a França, e mais abundantemente no vale
do Rhône até Provence.
Estas populações têm características intermediárias entre as duas espécies
parentais o que torna difícil sua classificação. As vagens não glandulares são
em forma de foice a espiralada (1,5 espirais) com um lúmen aberto fazendo
um diâmetro de 7 a 12 mm e 5-12 mm de comprimento. Elas são caracterizadas
pela pilosidade, de densa à fraca (Gunn et al., 1978).
20
Medicago sativa ssp. X tunetana Murbeck (2n=32)
A forma tetraplóide de M. sativa ssp. tunetana poderia ser originária
de híbridos tetraploidizados entre as formas diplóides de M. sativa ssp.
coerulea e M. glomerata (Quiros & Bauchan, 1988). Para Lesins & Lesins
(1979), M. glomerata é um dos progenitores da subespécie. X tunetana.
Medicago sativa ssp. X polychroa Grossh (2n=32)
Esta subespécie está descrita como tetraplóide originária do cruzamento
entre as subespécies sativa e glutinosa, considerando que a variabilidade
encontrada na hibridação artificial entre estas duas subespécies corresponde
completamente à subespécie polychroa.
As subespécies tetraplóides do complexo são diferenciadas de suas
variantes diplóides por possuírem flores, vagens e sementes de tamanho maior.
Estas subespécies selvagens têm grande potencial como fonte de resistência a
doenças, predadores e ao estresse ambiental (Quiros & Bauchan, 1988).
Populações tetraplóides são superiores às diplóides pelo tamanho de suas
folhas, pelo vigor e pela produção de forragem. Além disso, elas são mais
resistentes ao estresse e mais precoces na maturidade (Dunbier et al., 1975;
Arbi et al., 1979; Bingham et al., 1994).
EVOLUÇÃO DO COMPLEXO M. sativa-falcata
Formas diplóides de M. glomerata teriam colonizado vastos territórios
em direção leste até o Cáucaso, onde teriam provavelmente servido como
ancestrais às formas diplóides do complexo. Através de um isolamento espacial
21
durante a era terciária (Parathethys, que conectava o Mar Negro e o Mar
Cáspiano) duas populações ancestrais foram separadas: coerulea Qfalcata
(Quiros & Bauchan, 1988).
Ao sul, as populações coerulea perderam os carotenóides e as
populações falcata perderam as antocianinas de suas flores, após uma pressão
de seleção exercida pela competição entre polinizadores nas novas terras
isoladas. No norte, as populações da subespécie falcata adquiriram vagens
retilíneas devido à seleção natural. Este caráter pode ter sido favorecido pela
estepe, tipo de vegetação predominante nessa região. De fato, as vagens
espiraladas se dispersam mais facilmente em ambientes abertos e menos
facilmente em regiões de estepes.
Esses processos de diferenciação, ou seja, o isolamento geográfico e a
possibilidade de uma transição do nível diplóide ao tetraplóide pela não redução
de gametas, são provavelmente os mecanismos que permitem explicar a
evolução do complexo M. saúva. Um esquema possível da evolução
segundoLesins & Lesins (1979) é apresentado na Figura 1.
22
PROPAGAÇÃO E EVOLUÇÃO DAS ALFAFAS
CULTIVADAS
Estima-se que desde 4.000 anos a.C. a alfafa era cultivada nos arredores
do Mediterrâneo Ocidental (Bolton, 1962). Ela é encontrada em todo Oriente
Médio no primeiro milênio a.C, sendo introduzida na Grécia, Mesopotâmia
pelos medas 500 anos a.C. No século II a.C, ela chega na Itália e se propaga
em todo o Império Romano, sobretudo na Espanha, norte da África e França.
Com a invasão dos bárbaros e a queda do Império Romano (fim do século
IV) seu cultivo desaparece no sul da Europa. É possível que a alfafa tenha sido
reintroduzida do Oriente na Espanha e na França, via África do Norte a favor
das conquistas árabes nos séculos VII e VIII. Mas, na França, seu cultivo
somente se efetivou em torno dos anos 1550 (Michaud et al., 1988). Sua
presença na Holanda e na Bélgica é reportada em 1565, na Inglaterra em
1650, na Alemanha e Áustria em 1750, na Suécia em 1770 e na Rússia durante
o século XVIII.
Na Alemanha e no norte da França, a hibridação da subespécie sativa
com a subespécie falcata permitiu enorme evolução da alfafa cultivada. Este
híbrido se propagou em todo centro e norte da Europa, permitindo que a alfafa
se afastasse de seu habitat seco e quente para regiões mais frias (Lesins &
Lesins, 1979).
Durante o século XVI, com a colonização da América do Sul e da
América Central pelos espanhóis, a alfafa foi introduzida no México e no Peru.
A partir do Peru, ela chegou ao Chile, à Argentina e ao Uruguai,
aproximadamente em 1775. Sua introdução na América do Norte ocorreu
mais ou menos na metade do século XIX por duas vias: 1) no sul, ela veio do
Chile para a Califórnia e do México para o Colorado; 2) nas latitudes mais
nórdicas ela veio do norte da Europa (Michaud et al., 1988).
A subespécie sativa é relativamente rara no estado selvagem, exceto na
23
Península Ibérica onde encontram-se os "mielgas", ecótipos selvagens,
rizomatosos e de porte rasteiro. Entretanto, pode, eventualmente, ser
encontrada como planta isolada em acostamentos de estradas e em algumas
pequenas áreas cultivadas (Delgado-Enguita, 1989, Prosperi et al., 1995).
Em outras regiões mediterrâneas (sul da França, Itália, Grécia e África do
Norte) encontram-se, sobretudo, os híbridos naturais entre sativa e falcata.
A subespécie falcata, ao contrário, é quase unicamente espontânea. As mais
importantes características levadas por esta subespécie aos tipos cultivados
são a forte dormência no inverno, a resistência à seca (não confundir com
aptidão para crescer em condições secas) e às doenças e o porte rasteiro ou
rizomatoso (Michaud et al., 1988).
REGIÕES DE CULTIVO
Atualmente, no hemisfério norte, o cultivo da alfafa está concentrado
nos Estados Unidos, Canadá, Itália, França, China e sul da Rússia e, no
hemisfério sul, na Argentina, Chile, África do Sul, Austrália e Nova Zelândia.
Os Estados Unidos, Rússia e Argentina totalizam 70% da superfície total mundial
consagrada a alfafa (estimada em 33 milhões de hectares). A França, a Itália,
o Canadá e a China possuem 17% da superfície total (Michaud et al., 1988).
Na América do Sul, a grande concentração de alfafa está na região
centro-norte da Argentina, em cultivo puro e associados a gramíneas. Em torno
de 4,9 milhões de ha são cultivados na região pampeana que representa mais
de 90% da superfície com alfafa na Argentina (Hijano & Bacigalup, 1995).
Existe, no entanto, uma substancial produção no Chile, Bolívia, Colômbia,
Equador, Peru e Uruguai. No Brasil, a área total cultivada é de 26.000 ha
principalmente nos estados do sul e em São Paulo (Michaud et al., 1988).
Aproximadamente 80% desta área encontra-se no Rio Grande do Sul e atribuise aos colonizadores alemães e italianos a sua introdução, por volta de 1850
24
(Saibro, 1985). Apenas uma população foi introduzida e se adaptou muito
bem no sul e continua sendo cultivada: a alfafa Crioula (Oliveira et al., 1993).
Esta população tem superado as cultivares introduzidas em trabalhos de
avaliação, muito.embora em outros estados do Brasil, esta população não
mostre a superioridade marcante que ocorre no sul do País (Paim, 1994).
Com o objetivo de definir cultivares mais adaptadas, a rede nacional de
avaliação de cultivares de alfafa (RENACAL) vem avaliando novas introduções
nas regiões sul, sudeste e centro-oeste.
A CARACTERIZAÇÃO E AS ESTRUTURAÇÕES
O conhecimento da diversidade genética, indispensável a todo esquema
de melhoramento genético, pressupõe a medida de caracteres que revelem
esta diversidade e permitam a estruturação das populações. Em uma primeira
aproximação, pode-se considerar que quanto mais as populações se
assemelham através destes caracteres, mais seus parentescos são próximos.
Os caracteres podem ser de natureza morfológica, cromossômica,
bioquímica, fisiológica etc. Caracteres que definam o contexto ecológico,
geográfico e geológico onde se encontram as populações (Darlu & Tassy,
1993) podem servir de chave de interpretação (isolamento, seleção natural).
Assim, o conhecimento da origem geográfica das populações pode contribuir
para a interpretação da diversidade observada. É provável que ecótipos
geograficamente próximos tenham mais chance de serem estreitamente
aparentados que populações que estejam mais afastadas (Dudley & Davis,
1966; Lefort-Buson et al., 1988). Divergências e concordâncias podem ser
obtidas para esses diferentes caracteres. A utilização de um ou de outro vai
depender do nível do estudo ou da classificação desejada: evolução, taxonomia,
gestão e/ou exploração da variabilidade genética (Lefort-Buson & De Vienne,
1985).
25
A diversidade genética pode ser apreciada com a ajuda de caracteres
neutros ou selecionados. Em uma população, a diversidade dos caracteres
neutros é o resultado da deriva genética, da migração e da mutação (Hamrick
& Godt, 1989). A variabilidade de uma população, com base em caracteres
selecionados, no entanto, é submetida não somente a esses eventos genéticos
mas também à influência do ambiente. Quando a seleção natural é forte, ela
pode mascarar a deriva, a migração ou ainda a mutação. Portanto, esses
marcadores não permitem compreender o funcionamento das populações. Daí
o interesse de se utilizar marcadores neutros.
Os caracteres neutros são aqueles que não são submetidos à pressão
de seleção do ambiente. Esta propriedade lhes confere um grande poder
discriminante, amplamente utilizável em estudos de variabilidade genética,
sistemática e taxonomia. Estes caracteres são as proteínas (isoenzimas, proteínas
de reserva e proteínas desnaturadas) e as seqüências de DNA. Suas avaliações
são realizadas através de técnicas bioquímicas e de biologia molecular. Os
primeiros são medidos por eletroforese unidimensional e bidimensional no caso
de proteínas desnaturadas. Os segmentos de DNA são analisados pelas
técnicas RFLP (Polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição),
sondas-satélites e RAPD (Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso) entre
outras. Alguns caracteres morfológicos podem ser neutros em relação ao
ambiente.
Os caracteres morfológicos e agronômicos, apesar de sua sensibilidade
às condições do meio, são os mais utilizados nas classificações. Embora
estes caracteres não sejam "poderosos" para estudos genéticos, eles são
fundamentais quando estudos da adaptação das populações a diferentes
ambientes são desejados. A adaptação significa a evolução da estrutura da
população em função do valor seletivo de seus constituintes (Birouk, 1987). A
avaliação agronômica não tem nenhum valor universal e somente pode ser
considerada se ela for realizada nas condições ecológicas do projeto de
melhoramento de plantas (Lourd et al., 1984). A gestão dos recursos genéticos
26
não deve visar somente marcadores neutros mas igualmente analisar a
diversidade adaptativa das populações (tolerância ao estresse, capacidade de
crescimento etc.) (Charmet et al., 1993).
CARACTERES MORFOLÓGICOS E AGRONÔMICOS
A maioria dos trabalhos que visam uma estruturação da alfafa perene
cultivada estão baseados na caracterização morfológica e agronômica das
populações (Mayer et al., 1951; Demarly, 1957;Villax, 1963; Yamada
& Suzuki, 1972; Barnes et al., 1977). É desta forma que foram
estudadas e estruturadas as populações mielgas e outras alfafas cultivadas
na Espanha (Delgado-Enguita, 1989), populações do Marrocos (Small &
Brookes, 1984; Birouk, 1987; Birouk et al., 1989; Birouk,
1993;Rumbaugh et al., 1988), as alfafas norte-africanas e da Arábia
(Smith et al., 1991),) as alfafas não dormentes da índia e do Oriente-Médio
(Warburton & Smith, 1993), algumas populações do complexo M. sativa
na França (Julier et al., 1995, 1996). Mas as populações naturais francesas
foram descritas sobretudo por Mayer et al. (1951), Demarly (1957)
eClavier (1964).
Os recursos genéticos da alfafa são constituídos, por uma parte, pelas
variedades inscritas nos catálogos oficiais e, por outra parte, pelas populações
selvagens, ecótipos e populações regionais onde encontra-se a maior gama de
diversidade.
Os diferentes sistemas de classificação dos ecótipos e das variedades
de alfafa são baseados sobre numerosos caracteres morfológicos (cor da flor,
forma de vagens e de sementes, sistema radicular etc), agronômicos e
fisiológicos (dormência invernal, precocidade de floração, porte, rebrote após
o corte, resistência à doenças e a predadores, qualidade de forragem etc.) e
sobre a origem geográfica do material. A seguir são apresentados os caracteres
agromorfológicos mais utilizados.
27
COR DAS FLORES
A cor da flor do gênero Medicago é
amarela mais ou menos intensa, exceção
feita a M. sativa e M. daghestanica que
têm flores violetas (Lesins & Lesins, 1979).
A cor amarela é produzida pela presença
de pigmentos flavonóides e carotenóides e
a coloração violeta devido à presença de
pigmentos antociânicos (Demarly, 1954;
Lesins & Lesins, 1979).
O cruzamento da subespécie sativa
(flores violetas) com a subespécie falcata
(flores amarelas) produz plantas com flores
matizadas, que vão do verde, verdeamarelo ao azul e que tornam difícil a
classificação fenotípica dos descendentes
(Mayer et al., 1951; Barnes, 1966;
Lesins & Lesins, 1979). O
matiz da flor é uma das
características da presença da
subespécie
falcata
na
população. A tonalidade vai
depender do conteúdo de
pigmentos presentes e estes
mudam com a idade da planta (Lesins &
Lesins, 1979; Barnes et al., 1972).
Durante a abertura da flor, a tonalidade
violeta do botão pode passar a violeta
28
Fig. 2 - Flores da alfafa perene:
a) M. sativa ssp. falcata;
b) M. sativa ssp. sativa;
c) no destaque, flores mati
zadas resultantes do cruza
mento entre as subespécies
sativa (flor violeta) e falcata
(flor amarela).
azulado e mesmo a azul esverdeado quando a flor já está bem aberta (Demarly,
1954). Isto deve-se a modificação no nível de flavonóides, pois foi constatado
que o conteúdo de carotenóides tanto em plantas jovens como em plantas mais
velhas é o mesmo. Quanto às antocianinas, pode-se eventualmente encontrar
um aumento do violeta nas flores murchas (Lesins & Lesins, 1979).
O matizado da flor nas alfafas norte-européias é tradicionalmente descrito.
Os tipos flamengos (flemish) como a variedade Europa, assim como alguns
tipos mediterrâneos como Romagnola, Provence e Ampurdan, podem
apresentar este matizado em diferentes proporções e ele esta praticamente
ausente nos mielgas (Delgado-Enguita, 1989).
COMPORTAMENTO INVERNAL
As populações e variedades de alfafa
têm comportamentos invernais variáveis. A
resistência ao frio é caracterizada pela
faculdade da planta paralisar seu
crescimento sob regime de dias curtos
(Demarly, 1957). A diminuição do
crescimento da alfafa em dias curtos é
característica das variedades dormentes no
inverno. A elongação dos entrenós é
reduzida (Christian, 1977).
Os tipos mediterrâneos mais
próximos da subespécie saúva, como as
populações de Provence (sul da França),
Itália, Espanha, Argentina e Peru.
apresentam a característica fisiológica de
serem pouco sensíveis ao fotoperíodo. Elas
têm bom crescimento invernal e as
Fig. 3 - Rebrote no inverno.
a) Tipos nórdicos (flemish);
b) Tipos mediterrâneos.
29
conseqüências do frio são bastante marcantes nas folhas e no colo da planta.
Por outro lado, as variedades que têm uma forte introgressão da subespécie
falcata entram em estado de repouso assim que termina o outono e resistem
mais aos desgastes do inverno (Heinrichs et al. 1960; Heinrichs & Morley.
1960).
PORTE DA PLANTA
É, em parte, condicionado ao
ambiente e também pela seleção induzida
pelos métodos de cultivo. A pastagem e o
pisoteio produzem um porte mais prostrado
e resultam provavelmente de uma evolução
genética das populações. O porte ereto foi
nitidamente selecionado na domesticação.
Como o modo de colheita clássico tem sido
Fig. 4 - Porte da planta,: a) M. saiiva
ssp. saiiva, M. saliva ssp.
falcata; b) M. sativa ssp.
sativa; c) M. sativa ssp. falcata
(ecótipos
selvagens
da
subespécie sativa também
apresentam este porte
prostado).
30
o corte e a fenação, um porte prostrado é encontrado na maioria das alfafas
selvagens (Small & Brookes, 1984). Assim, tanto os ecótipos selvagens da
subespécie sativa como os falcata selvagens têm o porte prostrado (DelgadoEnguita. 1989).
Existe uma forte correlação entre a altura, o porte e a resistência das
plantas ao frio. As plantas mais baixas, de porte mais prostrado ou rasteiras
são mais resistentes ao frio (Larson & Smith, 1963; Smith, 1962). Isto devese à presença da subespécie falcata entre os progenitores.
SISTEMA RADICULAR E O CARÁTER RIZOMATOSO
As raízes da
alfafa
são
compostas
de
uma raiz principal e
de
numerosas
raízes
secundárias. Na subespécie sativa, a
raiz principal é
robusta e pivotante , com maior
Fig. 5 - Sistema radicular. subespécie falcata apresenta r a i z
f a s c i c u l a d a e subespécie sativa apresenta r a i z pivotante.
desenvolvimento
que aquele das raízes secundarias. Na subespécie falcata. as raízes são
fasciculadas e mais superficiais. Não existe uma dominância remarcada da raiz
principal. Nas variedades cultivadas encontra-se uma proporção variável de
plantas com raízes pivotantes (Mayer et al., 1951; Villax. 1963; Heinrichs,
i963;DelPozo. 1983).
Ainda que o sistema fasciculado de algumas alfafas seja ò resultado de
31
uma tendência da planta ramificar-se horizontalmente, esta ramificação se
restringe à parte superior da coroa. Segundo Heinrichs (1963), existem dois
tipos de sistema radicular nas alfafas que se ramificam horizontalmente: o sistema
radicular rizomatoso e o sistema radicular rasteiro. A diferença entre os dois
tipos não é muito nítida.
Nas alfafas rizomatosas, as hastes originárias da raiz principal se afastam
lateralmente da coroa e emergem do solo como hastes vegetativas e depois
reprodutivas. Estas hastes enterradas são os rizomas. As plantas rizomatosas
têm uma expansão em largura e seu número de hastes é mais elevado por
unidade de área.
As alfafas rasteiras resultam do aparecimento de brotos em intervalos
regulares sobre as raízes horizontais. Têm expansão subterrânea e produzem
rebrotes adventícios nas raízes laterais (Rodrigues & Smith, 1989). Entretanto,
a dormência e o fraco rebrote após o corte são as características da maioria
das alfafas rasteiras. Plantas rasteiras ou rizomatosas são encontradas mais
freqüentemente em M. sativa ssp. falcata (Heinrichs, 1963). Vários trabalhos
foram realizados para transferir esta característica (rasteiro) às populações
não-dormentes nas regiões onde estas são mais adaptadas (Daday, 1962; Edye
& Haydock, 1967), mas este caráter se transmite mal nas descendências
originadas de cruzamentos entre fontes rasteiras e não-rasteiras e sua expressão
é muito lenta (Daday, 1962; Heinrichs, 1963). Sobre este assunto (Prosperi,
inf. pes.) mostraram que há um efeito materno remarcável sobre a
hereditariedade do caráter e uma forte dominância do tipo ereto sobre o
rasteiro.
HASTES, ENTRENÓS E ÉPOCA DE FLORAÇÃO
A haste é o resultado da atividade meristemática do ápice. Ela é definida
longitudinalmente pelos nós e entrenós e lateralmente pelas folhas, ramificações
32
axilares e flores. O desenvolvimento da flor
em alfafa é obtido pela transição do
crescimento vegetativo em crescimento
reprodutivo de alguns brotos. Esta transição,
na primavera se produz no 10-14 nó da
haste e no verão, no 6-10 nó. Esta transição é
reconhecida por uma protuberância do
tecido meristemático na axila do primórdio
foliar mais próximo do ápice. O crescimento
do ápice da haste é normalmente
indeterminado e o ápice continua a
diferenciar os órgãos vegetativos e florais
(Barnes.e/a/., 1972).
Fig. 6 - Aspecto das hastes de uma
população de M. sativa ssp.
Diferenças entre as variedades para o
sativa em plena floração.
número de entrenós e comprimento da haste
principal no início da floração foram mostradas por Shendan & McRee
(1968). A posição da primeira inflorescência varia segundo o genótipo e o
comprimento do dia (Christian, 1977). Em um estudo com 9 clones dormentes,
a posição sobre o 14 ou 15 nó está associada a dias longos ao passo que em
regime de dias curtos, a primeira inflorescência aparece no 10 nó.
Canal (1993) mostrou que existe uma grande variabilidade genética
dentro do complexo M. sativa-falcata no que diz respeito a capacidade das
plantas de manterem o crescimento das hastes sob baixas temperaturas no
outono. O grupo denominado "não-dormentes" se distingue dos outros
genótipos estudados pela capacidade das hastes crescerem em comprimento
durante o outono e inverno, enquanto que os "dormentes" crescem menos
durante o inverno.
Existe ampla variabilidade genotípica de alfafa para a sensibilidade ao
fotoperiodismo e à temperatura (McLaughlin & Christie, 1980; Fick et ai,
33
1988). Temperaturas elevadas provocam crescimento mais rápido e floração
mais precoce. Elas aumentam o número de inflorescências mas diminuem o
número de flores por inflorescência (Guy et al.t 1971). Para McLaughlin &
Christie (1980), no Canadá, os genótipos com bom rendimento em temperaturas
mais elevadas seriam do tipo precoce, mas produziriam poucas hastes. Ao
contrário, aqueles que se comportariam melhor em baixas temperaturas seriam
mais tardios e produziriam mais hastes.
RELAÇÃO FOLHA/HASTE
O valor alimentar da alfafa é primeiramente determinado por sua
morfologia e em particular pela relação folha/haste. As folhas contêm mais
proteínas e menos fibras que as hastes (Titgemeyer et ai., 1992) e são mais
digestíveis. A diminuição da qualidade da forragem observada a medida que
se aproxima a maturidade está principalmente associada à diminuição da relação
folha/haste e ao aumento do teor em fibras das hastes (Sheaffer et ai., 1988).
Para uma dada variedade, o estado fenológico de desenvolvimento no momento
da colheita da forragem é um fator fundamental na determinação da produção,
da digestibilidade e da concentração de proteínas (Lenssen et ai., 1991).
A evolução desta relação no decorrer do rebrote está ligada à dinâmica
de crescimento que é condicionada pela temperatura e irradiação. As baixas
temperaturas têm tendência de limitar mais fortemente o crescimento das hastes
que o crescimento das folhas (Lemaire & Allirand, 1993). Assim, no outono, a
relação folha/haste é mais elevada que durante o verão e primavera.
CLASSIFICAÇÕES OBTIDAS POR CARACTERES
AGROMORFOLÓGICOS
As classificações normalmente se apoiam na ampla estruturação dada
por Villax (1963), que, baseando-se na cor da flor, resistência ao frio, rebrote
34
após o corte e porte da planta, entre outros caracteres, classificou as
populações de alfafa (variedades cultivadas e ecótipos selvagens) em cinco
grupos, discutidos a seguir.
POPULAÇÕES NÃO-RESISTENTES AO FRIO
Compreendem os ecótipos distribuídos na região meridional. Estas
variedades não têm um período de repouso após o corte e rebrotam sempre
rapidamente. No outono, após o último corte, elas rebrotam imediatamente e
fornecem um bom rendimento no inverno. Elas têm um porte ereto e as flores
são uniformemente violetas. Este grupo compreende as variedades:
1) de origem africana;
2) de origem indiana;
3) de origem peruana - Estas variedades são bastante pubescentes, mas existem
também tipos glabros. Elas contêm somente genitores subespécie saúva.
Assemelham-se mais às introduções espanholas originais do que àquelas do
Chile, introduzidas também pelos espanhóis.
Além do contínuo crescimento invernal (não-dormentes), fraca tolerância
ao frio e baixa perenidade são também observadas nas populações de origem
peruana, indiana, de regiões de oásis do Iraque ou do Marrocos (Yamada &
Suzuki, 1972; Prosperi et ai, 1994a). Uma melhor aptidão ao rebrote no
outono das populações mediterrâneas em relação aos tipos nórdicos-europeus
e selvagens é mostrada por Julier et ai. (1995).
Alfafas indianas e africanas são consideradas as principais fontes de
diversidade não-dormentes (Barneseíí//., 1977). Para Smith et ai. (1990),
estes materiais descendem de um número limitado de introduções do OrienteMédio e da índia. As populações do norte da índia são mais tolerantes ao frio
e mais produtivas do que aquelas do oeste, geralmente semelhantes às
populações do Oriente-Médio (Warbuton & Smith, 1993). As populações do
35
oeste e do sul da Arábia são fenotipicamente diferentes; as do sul mostram um
rebrote mais rápido após o corte. Estes autores diferenciaram seis grupos
de material não-dormente nos materiais norte- africanos, arábicos e indianos
que são: 1) as populações do nordeste da África (que incluem os vales irrigados
do Egito e do Sudão); 2) aquelas do oeste da Arábia Saudita; 3) aquelas
do centro e do leste da Arábia Saudita, de Bahrein e do sul do Iraque; 4)
aquelas do sul da Arábia (regiões de baixa altitude entre o Yemen e Oman); 5)
aquelas do noroeste da índia (regiões de baixa altitude que incluem o
Rajasthan) e 6) aquelas do oeste da índia.
Avaliações agromorfológicas realizadas por Smith et ai. (1991) com
ecótipos provenientes do norte da África e da Península Arábica, e com algumas
populações ou variedades norte-americanas cuja base genética é africana,
mostraram uma grande divergência principalmente eíltre as variedades
americanas e as populações do sul da Arábia, o que sugere que somente uma
pequena amplitude da variabilidade da alfafa do Oriente-Médio é utilizada em
seleção na América do Norte. Alfafas originárias de regiões subtropicais do
sul da Arábia são interessantes para o melhoramento em regiões mais quentes
(Smith et ai., 1995).
POPULAÇÕES MAIS OU MENOS TOLERANTES AO FRIO
Estas variedades originárias do sul da Europa são caracterizadas por
possuírem um porte ereto ou semi-ereto, flores violetas com diferentes
tonalidades. As raízes são pivotantes. Estas variedades rebrotam rapidamente.
Se o inverno é ameno, elas podem se desenvolver durante todo o ano. Neste
grupo podem ser classificadas algumas variedades da Espanha (Yamada &
Suzuki, 1972; Delgado-Enguita, 1989), de Provence (sul da França), da Itália,
da Hungria, da România, do Chile, da Argentina e da África do Sul.
36
POPULAÇÕES DO TURQUESTÃO
Estas variedades se distinguem pelo seu pequeno tamanho e seu porte
mais prostrado. Suas flores são violetas. Elas exigem um período de
repouso após o corte de outono e ficam por muito tempo em estado de roseta.
Alguns ecótipos são mais tolerantes ao frio que outros. Após um estudo com
ecótipos do Turquestão introduzidos nos Estados-Unidos, Barnes et ai. (1977)
concluem que eles são cultivados no sul da Rússia, no Irã, no Afeganistão e na
Turquia e acrescentam que eles têm uma fraca produção sementeira, são
sensíveis às doenças foliares mas, são resistentes a vários insetos e doenças
radiculares.
POPULAÇÕES COM FLORES MATIZADAS
São os híbridos entre a subespécie saúva e a subespécie falcata
originárias de diversos ambientes. São ecótipos mais tardios na floração; mais
de 50% dos indivíduos ficam em estado de roseta durante o inverno (Mayer,
1949), citado por Villax (1963). A proporção de tipos característicos de dias
curtos aumenta à medida que se vai em direção norte. Estes híbridos são
freqüentes no norte da Europa e da América; são ecótipos com forte.dormência
invernal, produtivos e perenes (Yamada & Suzuki, 1972; Prosperi et ai, 1994b).
Neste grupo encontram-se as populações francesas que são classificadas
em três tipos, segundo as proporções de saúva e de falcata, estimadas de
acordo com os caracteres morfológicos (matizado das flores, forma das vagens
e das sementes, grossura das hastes, porte e sistema radicular) e fisiológicos
(precocidade na floração, crescimento invernal e resistência ao frio) (Mayer et
a/., 1951):
1) alfafas de Provence - na região mediterrânea;
2) alfafas do oeste - alfafas de Poitou e alfafas de Marais de Vendée que se
diferenciaram pelo seu sistema radicular. Rebischung (1954) e Demarly (1957)
37
identificaram 3 subgrupos no oeste da França: alfafa de Poitou, alfaia de Marais
de Luçon (Marais Sud, Marais Poitevin) e alfafa de Marais de Challans (Marais
Nord).
3) alfafas do norte - alfafas de hastes altas, população Flamande e um tipo de
alfafa d'Ormelong que se diferenciam pelo seu sistema radicular.
As alfafas de Provence em razão de sua semi-dormência e da baixa taxa
de flores matizadas seriam preferencialmente classificadas no grupo 'Variedades
mais ou menos resistentes ao frio" seguindo o raciocínio de Villax.
POPULAÇÕEvS COM FLORES AMARELAS
Todas as populações que pertencem a este grupo são da subespécie
falcata e a maioria é selvagem. Elas são conhecidas pela sua extrema
tolerância ao frio, seu porte rasteiro e sua resistência a algumas doenças foliares
(Barnes £/«/., 1977).
As populações cultivadas (subespécie saúva) são facilmente distinguíveis
das selvagens da subespécie saliva e subespécie falcata pelo porte ereto,
rebrote rápido após o corte, altura elevada e superior rendimento. Somente a
cor das flores permitiu distinguir as populações selvagens saúva da Espanha
("mielga") de flores violetas das populaçõesfalcata de flores amarelas (Julier
et ai., 1995). Para Delgado-Enguita (1989), os "mielgas" deveriam ser incluídos
no grupo de alfafas rizomatosas. Elas são dormentes no inverno, têm um porte
prostrado, hastes finas, uma forte relação folha/haste, tolerantes às viroses,
alto teor em sementes duras e tolerância ao estresse hídrico e aos solos
calcáreos.
Barnes et ai. (1977) descrevem nove fontes diferentes de variabilidade
genética introduzidas nos Estados Unidos entre 1850 e 1947 e utilizam como
critérios a origem geográfica, a dormência e o matizado da flor. Para eles,
38
representam a maior parte da diversidade genética das variedades cultivadas
atualmente. Por ordem decrescente de resistência ao frio, elas são: M.falcata,
Ladak, M. varia, do Turquestão, Flamengas, Chilenas. Peruanas, Indianas e
Africanas. Observa-se efetivamente que esta classificação recobre aquela de
Villax (1963). M.falcata corresponde ao grupo "variedades de flores amarelas".
Ladak é uma fonte particular, originária do Cachemir, do norte da índia, muito
utilizada na América do Norte: As flores amarelas e a dormência invernal
sugerem que a subespécie falcata é o componente maior na sua ascendência
Fig. 7 - Vagens de Medicago saíiva. Vagens retas e em forma de foice de M. sativa ssp. falcata
e vagens espiraladas de M. sativa ssp. sativa.
genética. M. varia corresponde ao grupo "variedades matizadas" de Villax,
que incluem também as Flamengas. As fontes do Chile, Peru, índia e África
correspondem ao tipo mediterrâneo, variedades não dormentes, não tolerantes
ao frio.
Estas classificações, realizadas em condições climáticas diferentes, trazem
informações específicas. No entanto, elas são concordantes no que diz respeito
39
ao valor discriminante de alguns caracteres como: dormência, tolerância ao
frio, longevidade e cor da flor.
OS MARCADORES NEUTROS E AS
CLASSIFICAÇÕES
Entre os marcadores neutros, serão descritos aqueles do tipo proteico e
os do polimorfismo de fragmentos de DNA (RFLP e RAPD) ainda que os
marcadores moleculares não tenham sido, até o momento, largamente estudados
no complexo M. sativa-falcata.
MARCADORES DO TIPO PROTÉICO
Os métodos bioquímicos, como a análise de proteínas e de isoenzimas,
foram amplamente utilizados no estudo do polimorfismo de várias espécies.
Entretanto, a principal limitação destas técnicas é o limitado polimorfismo que
elas são capazes de detectar entre populações próximas. Numerosos estudos
do polimorfismo enzimático mostram que para alguns lócus, as populações
parecem bastante polimorfas (caso das esterases e peroxidases), enquanto
que para outros, elas parecem muito homogêneas ou pouco variáveis (Pernès
&Lourd, 1984).
As isoenzimas foram os primeiros marcadores bioquímicos utilizados
em estudos de genética de populações (Hedrick et ai., 1976; Lefort-Buson et
ai., 1988). No entanto, a neutralidade das isoenzimas frente aos efeitos da
seleção do meio ambiente tem sido questionada, pois frequentemente
encontram-se associações entre variação morfológica e variação isoenzimática
devido a ligações entre genes (Lefort-Buson et ai, 1988) e, sobretudo, devido
a correlações entre freqüência de alguns alelos e dados climáticos como foi
mostrado por Lumaret (1984) em Dactyle. Mas, para Chaulet (1995), na
maioria dos casos nenhuma correlação existe entre os dados enzimáticos e os
40
parâmetros morfológicos.
Os primeiros estudos de proteínas com algumas espécies de Medicago
foram realizados por Przybylska & Hurich (1971), depois outros estudos se
seguiram com algumas espécies anuais e/ou perenes (Bingham & Yet, 1971;
Damerval, 1983;Quiros, 1980,1982,1983). Marcadores protéicos permitiram
igualmente a identificação de diferentes híbridos: M. sativa - M.falcata (Miller
et ai., 1972), M. sativa - M. glutinosa (Mariani et ai., 1978). Por outro lado,
eles foram também utilizados em estudos de filogenia. Mariani et ai. (1978)
mostraram a existência de um ancestral comum entre M. sativa e M. glutinosa.
Quiros (1983) pesquisou ancestrais de variedades de alfafa do complexo M.
sativa-falcata. De Vienne (1978), em um estudo sobre a variabilidade de
várias famílias tetraplóides de M. sativa, mostrou que a análise enzimática do
pólen discrimina melhor as famílias aparentadas que os marcadores biométricos.
O determinismo genético de sistemas enzimáticos de M. sativa ssp. coerulea
e M. sativa ssp. sativa foi estudado por Brunel (1982).
Estes marcadores também foram amplamente utilizados em estudos de
diversidade genética. As avaliações realizadas por isoenzimas sugerem que os
genótipos Africanos, Chilenos e Flamengos têm tanto M. sativa ssp. sativa
como M. sativa ssp. falcata entre seus genitores (Quiros, 1983).
Em um estudo com 20 populações tradicionais de alfafa do Marrocos,
de cinco origens geográficas diferentes, Birouk & Dattée (1989) mostraram
que a variedade Europe é diferente de um grupo de materiais mediterrâneos
(africanas, Moapa, Provence e populações marroquinas) e se aproxima de
dois ecótipos espanhóis do tipo "mielga". As variedades Moapa e as africanas
se diferenciam das populações marroquinas, Birouk (1993) estudou o
polimorfismo enzimático de três sistemas (-amilase, leucina-amido-peptidase e
peroxidase) correspondendo a cinco locus. Ele mostrou que dois grupos
correspondiam a dois pools gênicos diferentes. O primeiro, composto por
populações de Demnate e o outro por populações provenientes de oásis e de
montanhas. Aumentando o número de locus estudado para mais três outros
41
sistemas (fosfoglucomutase, fosfoglucoisomerase e isocitrato desidrogenase),
ele pode comparar estas populações com outras originárias sobretudo da África
do Norte e concluir que as populações de Demnate seriam mais aparentadas
às origens européias e que as populações de montanha e oásis seriam mais
representativas do tipo africana.
A análise de 60 variedades de diversas origens através de isoenzimas
mostrou uma boa estruturação, exceto algumas variedades do tipo Flamenga e
Chilena que revelaram possuir somente progenitores da ssp. sativa e a presença
de alelos característicos de M. sativa ssp. falcata em algumas alfafas africanas
(Barnes et ai, 1977). Estes resultados podem parecer surpreendentes pois
M. sativa ssp. falcata é conhecida como uma subespécie originária do norte.
MARCADORES RFLP {RESTRICTION FRAGMENT LENGTH
POLYMORPHISM)
A técnica RFLP (Polimorfismo no comprimento de fragmentos de
restrição) se resume em duas etapas principais: a digestão do DNA por uma
enzima endonuclease que reconhece as seqüências específicas de DNA (sítio
de restrição) seguida de uma hibridização com a ajuda de uma sonda marcada.
O polimorfismo é definido pela dupla enzima-sonda. Este polimorfismo pode
ser devido a mutações pontuais, adições, deleções ou recombinações de
fragmentos de DNA terminando seja na perda de um sítio de restrição seja na
criação de um novo sítio de restrição (Soller & Beckman, 1983; Beckman &
Soller, 1986; Thormann & Osborn, 1992).
Os RFLPs são utilizados na construção de mapas genômicos, na pesquisa
de grupos de ligação, no desenvolvimento de árvores filogenéticas e na
etiquetagem cromossômica. Estes marcadores têm a vantagem de serem codominantes e muito polimorfos. Ainda que estes marcadores foram por muito
tempo considerados como marcadores neutros, hoje sabe-se que eles podem
42
igualmente marcar caracteres agronômicos que podem ser selecionados.
Entretanto, a técnica RFLP é laboriosa e por muito tempo exigiu a utilização
de material radioativo. A marcação com sondas "frias" é relativamente recente.
Em alfafa, esta técnica foi sobretudo utilizada na construção de mapas
genéticos de diplóides: a partir de populações segregantes em Fl obtidas pela
hibridação entre M. sativa ssp. quasifalcata e M. sativa ssp. coerulea (Kiss
et ai, 1993), entre M. sativa ssp. sativa e M. sativa ssp. coerulea (Brummer
et ai., 1993), a partir de uma população diplóide retrocruzada originárias de
genitores não aparentados (Echt et ai., 1993).
Esta técnica tem servido, igualmente, aos estudos de variabilidade
genética. Brummer et ai. (1991) mostraram em populações diplóides de M
sativa ssp. falcata e ssp. coerulea e em algumas variedades tetraplóides da
ssp. sativa (Florida 77, Apollo, Spredor2), que a variabilidade intra-populações
era superior à variabilidade interpopulações.
Sobre os nove germoplasmas introduzidos nos Estados Unidos, descritos
por Barnes et ai. (1977), Kidwell et ai (1994) estudaram a diversidade
genética no interior e entre as populações. As análises mostraram um forte
polimorfismo no interior dos ecótipos, entretanto muito pouco polimorfismo foi
encontrado entre os ecótipos. Ainda que os indivíduos de M. falcata e dos
Peruanos tenham formado grupos distintos, os genótipos dos outros materiais
não foram claramente distinguidos.
MARCADORES RAPD {RANDOM AMPLIFIED
POLYMORPHIC DNA)
Os marcadores RAPD foram propostos por Welsh & McClelland (1990)
e Williams et ai. (1990). Eles são derivados da técnica PCR - Polymerase
Chain Reaction (Mullis et ai., 1986; Saiki et ai., 1988) e são amplamente
utilizados no estudo do polimorfismo do genoma (Caetano-Anollés et ai., 1991;
Thormann & Osborn, 1992). O fundamento do RAPD é a amplificação de
43
fragmentos de DNA de 100 a 2000 pb utilizando-se primers de pequeno
tamanho (8 a 10 nucleotídeos), de seqüência aleatória e uma DNA polimerase
de origem bacteriana (Taq).
O principal inconveniente dos marcadores RAPD reside no fato de tratarse de marcadores dominantes que não mostram o estado heterozigoto: os
indivíduos contendo duas cópias de um dado alelo não são distinguíveis daqueles
que contenham somente uma cópia do alelo (Williams et ai., 1990; Michelmore
et ai, 1991).
Em razão dos limites da técnica RAPD, quando um grande número de
indivíduos deve ser examinado, análises RAPD sobre DNA reagrupado (mistura
de DNA de vários indivíduos) foram utilizados (Michelmore et ai, 1991; Yu
& Pauis, 1993c). Para Sweeney & Danneberger (1994), os produtos
amplificados obtidos áepools de DNA não refletem a diversidade no interior
das populações. De fato, níveis elevados de variabilidade genética são
encontrados no interior de populações de espécies alógamas, perenes,
amplamente difundidas e com alta taxa de fecundidade (Lovelles & Hamrick,
1984).
No género Medicago, marcadores RAPD foram utilizados para a
construção de mapas genômicos de diplóides (Echt et ai, 1991; Echt et ai.,
1993; Kiss et ai., 1993), em análise da variabilidade genética de espécies
diplóides anuais (Brummer et ai., 1995; Bonina ai, 1996) e na caracterização
de espécies lenhosas (Chebbi et ai., 1995). A utilização destes marcadores
em tetraplóides é mais rara. Eles são encontrados na marcação de genes (Yu
& Pauis, 1993a), na construção de mapa genômico (Yu & Pauis, 1993b), na
avaliação das relações genéticas entre algumas populações cultivadas (Yu &
Pauis, 1993 c) e no estudo da variabilidade genética de algumas populações
selvagens e cultivadas (Crochemore et ai., 1996).
No que concerne a variabilidade genética de populações tetraplóides
do complexo M. sativa, poucos trabalhos foram publicados até a presente
44
Fig. 8 - Ilustração do perfil eletroforético do DNA amplificado pela técnica RAPD de
30 indivíduos da variedade Sabre
45
Fig. 9 - Percentagem de plântulas de algumas variedades de alfafa perene
(Medicago sativa L.) apresentando diferentes marcadores RAPD
46
data. Yu & Pauis (1993c) trabalharam com três variedades (Du Puits, Peace,
Anik) e quatro populações em seleção (VO, V3. PO, P3), utilizando misturas
de DNA de 5 a 7 plantas. Dos 100 primers testados. 25 mostraram bandas
polimórficas intra e inter populações. Cada primer gerou de uma a 12 bandas.
O tamanho dos fragmentos amplificados variaram de 300 pb a 3500 pb. As
distâncias entre as populações mostraram que .Anik (100% falcatd) é muito
diferente de Du Puits e de Peace ou VO que têm sativa e falcata na sua
composição genética.
Crochemore et ai. (1996) avaliaram, através da técnica RAPD, a
variabilidade genética de 26 populações selvagens e cultivadas originárias de
diferentes regiões geográficas, tipos nórdicos e mediterrâneos. A análise do
polimorfismo efetuada sobre 737 indivíduos provenientes daquelas populações,
através de quatro primers revelaram uma forte variabilidade intrapopulação
que representa mais de 50% da variação total. As subespécies foram facilmente
caracterizadas e a origem geográfica das populações fracamente detectada.
Estes caracteres neutros mostraram que populações com forte introgressão
da subespécies falcata têm uma variação intra mais forte. Estes autores
declaram que o método RAPD é eficiente na distinção e estruturação dos
recursos genéticos da alfafa perene.
47
CONCLUSÃO
Existe enorme reservatório de diversidade genética disponível em alfafa
perene tetraplóide, onde uma forte variação intra e interpopulações é observada. As prospecções, portanto, devem também abranger a variabilidade que
existe no interior das populações. Ecótipos oriundos do sul da Europa (Espanha,
França, Itália), de origem africana, indiana, chilena e peruana, de porte ereto,
de contínuo crescimento invernal (não dormentes), de bom rendimento, que
rebrotam rapidamente após o corte constituem-se em importante fonte de
recurso genético para a seleção, melhoramento e desenvolvimento da alfafa no
Brasil.
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with somatic embryogenesis in alfalfa. Plant Mol. Biol., 22:269277, 1993c.
AGRADECIMENTOS
A autora agradece ao Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico o apoio recebido para a condução deste
trabalho.
59
BASES FÍSICAS DO IAPAR
ANTONINA
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APUCARANA
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CAMPO M0URÃ0
Laboratório de Análise de Solos
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JOAQUIM TÁVORA
PINHAIS
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(Região Metropolitana de Curitiba)
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Pólo Regional de Pesquisa
J. Távora • Cx. Postal 60 • CEP86550000
Laboratório de Apoio à Pesquisa
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LAPA
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BR 476 (sentido LapalSão Mateus do Sul), a
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5,3 km do trevo principal de Lapa, Cx. Postal
131 CEP 83750-000 Fone/Fax: (041) 8221457
LARANJEIRAS DO SUL
PLANALTO
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Apoio á Pesquisa Estação
Agrometeorológica Laboratório de
Análise de Solos Rod. Celso Garcia Cid,
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Fax:(043)376 2101
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Fazenda Modelo
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CEP 85809-030 Fone: (045) 223 0445
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MARILÂNDIA DO SUL
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