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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE – UNESC
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE - PPGCS
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ANÁLISE DA ATIVIDADE DA CADEIA RESPIRATÓRIA MITOCONDRIAL E
PARÂMETROS DE ESTRESSE OXIDATIVO NA CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS
CUTÂNEAS TRATADAS COM MICROCORRENTE ASSOCIADA A
NANOPARTÍCULAS DE OURO
MIRELI VENÂNCIO MENDONÇA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
CRICIÚMA – SANTA CATARINA
2011
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MIRELI VENÂNCIO MENDONÇA
ANÁLISE DA ATIVIDADE DA CADEIA RESPIRATÓRIA MITOCONDRIAL E
PARÂMETROS DE ESTRESSE OXIDATIVO NA CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS
CUTÂNEAS TRATADAS COM MICROCORRENTE ASSOCIADA A
NANOPARTÍCULAS DE OURO
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências da Saúde da Universidade do
Extremo Sul Catarinense como requisito à obtenção do
Título de Mestre em Ciências da Saúde.
Orientador:
Prof. Dr. Marcos Marques da Silva Paula
CRICIÚMA – SANTA CATARINA
2011
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
M539a
Mendonça, Mireli Venâncio.
Análise da atividade da cadeia respiratória mitocondrial e
parâmetros de estresse oxidativo na cicatrização de feridas
cutâneas tratadas com microcorrente associada a nanopartículas
de ouro / Mireli Venâncio Mendonça; orientador: Marcos
Marques da Silva Paula. – Criciúma : Ed. do Autor, 2011.
61 f. : il. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado) - Universidade do Extremo Sul
Catarinense, Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde, Criciúma (SC), 2011.
1. Queimaduras - Tratamento. 2. Nanopatículas de ouro. 3.
Microcorrentes. 4. Estresse oxidativo. 5. Cicatrização de feridas.
I. Título.
CDD. 21ª ed. 617.11
Bibliotecária Rosângela Westrupp – CRB 364/14ª Biblioteca Central Prof. Eurico Back - UNESC
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Ao meu filho Luis Gabriel pelo amor incondicional.
Aos meus pais, Cida e Berto, pelo amor e dedicação
constantes, e por acreditar e me apoiar sempre.
Á minha avó Maurina pelo carinho e incentivo constante.
5
"A dúvida é o princípio da sabedoria".
(Aristóteles)
6
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao meu filho, Luis Gabriel, por estar sempre ao meu lado, me dando
carinho e incentivos nas horas mais inesperadas. Sendo o meu raio de luz, brilhando na
escuridão, nos dias difíceis. Eu te amo meu amor. Aos meus pais, Berto e Cida, muito
obrigada por sempre estarem ao meu lado, acreditando em meu esforço e trabalho, me dando
apoio e incentivos diários. Vocês são minha base e um espelho para minha vida, amo vocês.
Minha avó Maurina (Biza), obrigada pelas orações e incentivos, pela dedicação ao cuidar do
meu filho nas minhas ausências, te amo.
Agradeço ao meu orientador Prof Marcos Marques (Bocão) pela dedicação e
apoio durante esta trajetória de minha vida.
Agradeço ao Marcelo e a Luciana, pela dedicação, apoio e amizade, mostrando
sempre incansáveis em me ajudar. Marcelo, obrigada por iluminar meu caminho, me
indicando o rumo certo a seguir.
Agradeço ao Jonathann (Alemão) pela dedicação e apoio constantes. E ao Rodrigo
Zeferino pelo apoio durante as dificuldades. Obrigada Paulinha pela dedicação e amizade.
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RESUMO
Queimaduras de pele geram altas taxas de mortalidade e morbidade. A terapia de
microcorrente (MIC) e nanopartículas de ouro (GNP) vem como uma alternativa no
tratamento de lesões cutâneas, provando ser capaz de ter efeito sobre a atividade da cadeia
respiratória mitocondrial, parâmetros de estresse oxidativo e níveis de defesa antioxidante
enzimáticas. Foram utilizados 25 ratos wistar (250-300g) com 60 dias de vida. Estes animais
foram divididos em cinco grupos (N = 5) como: (i) controle sem lesão (sham), (ii) lesão,
animais controle não tratados (lesão), (iii) lesão tratada com microcorrente (MIC), (iv) lesão
tratada com nanopartículas de ouro (GNP), (v) lesão tratada com MIC + GNP. Tratamento
com MIC foi realizado por três dias consecutivos, com uma dosimetria de 300µA. Um
aumento significativo na atividade dos complexos I, II-III e IV foi observada, no grupo MIC
+ GNP em relação ao grupo tratado apenas com MIC. Uma redução significativa nos
parâmetros de dano oxidativo e um aumento significativo nos níveis de enzimas de defesa
antioxidante no grupo MIC + GNP comparado com o grupo tratado com MIC.
Palavras chave: microcorrente; nanopartículas de ouro; cadeia respiratória; dano oxidativo;
defesa antioxidante; cicatrização.
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ABSTRACT
Skin burns generate highs rate of mortality and morbidity. Microcurrent therapy and
nanoparticles come as an alternative in the treatment of cutaneous lesions, proving to be able
to have an effect on activity of the mitochondrial respiratory chain complexes, on parameters
of oxidative damage and on levels of enzymatic antioxidant defenses. 25 male wistar rats
(250-300g), with 60 days of life were used. These animals were divided into five groups (N =
5) as: (i) uninjured control (sham); (ii) injured, non-treated control rats (injury); (iii) injury
treated with microcurrent (MIC); (iv) injury treated with gold nanoparticles (GNP); and (v)
injury treated with an association of microcurrent plus gold nanoparticles (MIC+GNP).
Microcurrent treatment was applied for three consecutive days, with a dosimetry 300μA. A
significant increase in activity of complexes I, II-III and IV was observed, in the group
associated MIC + GNP in relation to the group treated just with MIC. A significant reduction
in oxidative damage parameters and a significant increase in the levels of antioxidant defense
enzymes in the group associated MIC + GNP compared with the group treated with MIC.
Keywords: microcurrent; gold nanoparticles; respiratory chain; healing; oxidative damage;
antioxidant protection.
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LISTA DE FIGURAS
Figura A. Representação esquemática das camadas da pele....................................................13
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Classificação das queimaduras.................................................................................15
11
LISTA DE ABREVIATURAS
ATP – adenosina trifosfato
CAT – catalase
DNA – ácido desoxirribonucléico
DMSO – dimetilsulfóxido
EROs – EROs
GNP – nanopartículas de ouro
ip – intraperitonial
µcorrente – microcorrente
RL – radicais livres
RNA – ácido ribonucléico
SOD – superóxido dismutase
SPSS – Statistical Package for the Social Sciences
TBARs – substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
USP – ultrassom pulsado
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SUMÁRIO
I INTRODUÇÃO....................................................................................................................13
1.1 Pele......................................................................................................................................13
1.2 Queimadura e Cicatrização..............................................................................................14
1.3 Microcorrente....................................................................................................................17
1.4 Nanopartículas de Ouro...................................................................................................19
II OBJETIVO..........................................................................................................................20
2.1 Objetivo Geral...................................................................................................................20
2.2 Objetivos Específicos........................................................................................................20
III RESULTADOS..................................................................................................................21
ARTIGO 1...............................................................................................................................21
ARTIGO 2 ..............................................................................................................................39
IV DISCUSSÃO......................................................................................................................55
CONCLUSÃO.........................................................................................................................58
REFERÊNCIAS.....................................................................................................................59
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I INTRODUÇÃO
1.1 Pele
A pele é indispensável para a vida, pois forma uma barreira entre os órgãos
internos e o ambiente externo protegendo-os de agentes agressores e, também, participa de
muitas funções vitais do organismo. A pele, por ser o maior órgão do corpo humano,
apresenta alterações constantes, já que possui características dinâmicas, sendo dotada de
grande capacidade renovadora e de regeneração celular (BRUNNER, 2005). A pele quando se
encontra íntegra torna-se a maior barreira contra infecções de microorganismos, porém em
uma queimadura cutânea ocorre um desequilíbrio homeostático facilitando o estabelecimento
e conseqüentemente, o crescimento bacteriano (AZEVEDO et al., 2002). O sistema
tegumentar é constituído pela pele e pelo tecido subcutâneo (figura A). O tegumento é
responsável por recobrir toda a superfície do corpo, sendo constituído pela porção epitelial; é
formado pela epiderme, sendo a camada mais externa, e uma camada média, formada pela
derme ou córnea. Logo abaixo da derme e em continuidade a mesma, encontra-se a
hipoderme, sendo a camada mais profunda apresentando a função de suporte e união da derme
com os órgãos subjacentes, além de permitir à pele uma considerável amplitude de
movimento (BRUNNER, 2005).
Fonte: http://www.afh.bio.br/tegumentar/tegumentar.asp > acesso em: 20 dez. 2010
Figura A – Representação esquemática das camadas da pele.
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A pele apresenta diversas funções conforme sua filogenética, dentre elas:
proteção, hemorregulação, secreção, percepção, excreção e metabolização. A pele é um órgão
que tem a função de interagir com o meio externo, mantendo a temperatura corporal regulada
e prevenindo lesões caudas por agentes externos, isto ocorre devido às sensações transmitidas
pela imensa rede de sensores nervosos que este tecido possui. Além de funcionar como
revestimento natural, que mantém o universo líquido do corpo interno isolado do mundo
externo. A agressão celular produzida pelas queimaduras gera uma série de eventos, desde
produção de toxinas até alterações circulatórias, que conseqüentemente irão ocasionar uma
disfunção orgânica que pode até levar à morte (DO VALE, 2005).
1.2 Queimadura e Cicatrização
Queimadura é um quadro resultante de uma ação direta ou indireta da exposição
de tecidos orgânicos a diferentes formas de energias, sejam elas térmicas, químicas (ácidos/
álcalis) ou ionizantes (radiação atômica/raios X) (DO VALE, 2005).
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As queimaduras podem ser classificadas em 1º, 2º e 3º grau, conforme mostrado na tabela 1.
Queimadura
1º Grau
Queimadura
2º Grau
Queimadura
3º Grau
Compromete apenas a
epiderme
Compromete totalmente a epiderme
e parcialmente a derme
Destrói todas as camadas da pele,
atingindo até o subcutâneo,
podendo atingir tendões,
ligamentos, músculos e ossos
Apresenta eritema, calor e
dor
Apresenta dor, eritema, edema ou
bolhas, erosão ou ulceração
Causa lesão branca ou marrom,
seca, dura, inelástica
Não há formação de bolhas
Há regeneração espontânea
É indolor
Evolui com descamação em Ocorre reepitelização a partir dos
nexos cutâneos (folículos pilosos e
poucos dias
glândulas)
Regride sem deixar cicatrizes
Cicatrização mais lenta (2-4
semanas)
Pouca repercussão sistêmica
Pode deixar seqüelas: discromia
(superficial); cicatriz (profunda)
Não há regeneração espontânea,
necessitando de enxerto
Eventualmente pode cicatrizar,
porém com retração das bordas
Tabela 1. Classificação das queimaduras
As queimaduras são lesões muito freqüentes. Embora uma grande parte delas seja
devido a acidentes domésticos, um número considerável de pacientes apresenta lesões de tal
gravidade que põem em risco sua vida. As causas mais freqüentes das queimaduras são a
chama de fogo, o contato com água fervente ou outros líquidos quentes e o contato com
objetos aquecidos. Menos comuns são as queimaduras provocadas pela corrente elétrica. A
maioria dos casos de queimaduras em crianças ocorre em ambiente doméstico, ocasionado por
líquidos quentes sobre o corpo, sendo na maioria das vezes extensas, porém superficiais. Em
relação aos adultos, a principal causa de queimaduras é causada pela chama de fogo (DO
VALE, 2005; ANDRADE et al.,2010). No Brasil, a causa mais comum de queimaduras é por
álcool etílico líquido, tornando-se responsável pela maior parte dos casos de adolescentes e
crianças atendidas no Hospital de referência em urgência de Minas Gerais e também por 40%
das queimaduras de crianças entre sete e onze anos de idade em um Hospital-Escola no
16
Estado de São Paulo (ROSSI et al., 1998; DO VALE, 2005). No Reino Unido, ocorrem cerca
de 250 mil novos casos de pessoas com queimaduras a cada ano. No Brasil, segundo a
Sociedade Brasileira de Queimaduras, ocorre anualmente um milhão de novos casos de
queimaduras, sendo que destes, 200 mil são atendidos nos serviços de emergência, e 40 mil
ficam em hospitalização. As queimaduras encontram-se entre umas das principais causas
externas de morte registradas no Brasil, perdendo apenas para outras causas violentas. Um
estudo realizado no Distrito de Federal mostrou uma taxa de mortalidade de 6,2% entre os
queimados que ficaram hospitalizados em setores de emergência (MACEDO & ROSA, 2000;
DO VALE, 2005; GRAGNANI et al., 2005; ANDRADE et al., 2010).
A lesão causada pela queimadura, além de apresentar alto índice de mortalidade,
também é responsável por graves incapacidades em longo prazo. Portanto o tempo de
cicatrização de uma ferida cutânea é uma forte determinante para desenvolver muitas
complicações, dentre elas, infecções e seqüelas. A ocorrência de infecção em pacientes com
queimaduras varia de 7 a 20% e a taxa de letalidade entre 20% e 75%. A taxa de infecção da
corrente sangüínea, verificada na Unidade de Queimados de Brasília, durante o período 2001
a 2005, foi de 15,5% e a taxa de letalidade, 18,7% (DE MACEDO & SANTOS, 2006). O
tratamento para este tipo de lesão pode ir desde enxerto de pele precoce, bem como, controlar
e orientar de forma correta esta regeneração cicatricial. O grande potencial de falha das
terapêuticas ocorrem nas fases iniciais, acarretando conseqüentemente na alteração da síntese
de colágeno e diminuição de alguns elementos celulares. Além disso, inúmeros fatores
sistêmicos/locais podem interferir de forma direta ou indiretamente no processo de reparação
tecidual, desta forma, novas terapêuticas têm sido estudadas com o intuito de minimizar as
falhas no processo de cicatrização (DO VALE, 2005; ANDRADE et al., 2010; BUSNARDO
& BIONDO-SIMOES, 2010).
Em uma lesão cutânea ocorre uma cascata de eventos fisiológicos que são
essenciais para a manutenção celular, visando desta forma a proteção destes tecidos,
reduzindo assim a danos causados pela lesão. Porém se nesta fase estes eventos ocorrerem de
forma exacerbada irão causar efeitos deletérios para os tecidos evolvidos, ou seja, um tempo
menor da fase inflamatória implicaria em processo de reparo tecidual mais eficaz e com
tempo reduzido. Após a lesão tecidual, o organismo em resposta a este dano, desencadeia uma
vasodilatação local. Este aumento da permeabilidade vascular gera o extravasamento de
leucócitos para os sítios inflamados (DE MACEDO & SANTOS, 2006; TIAN, et al., 2007).
Ocorre também a ativação dos neutrófilos, em adição a fagocitose, podendo conduzir a
liberação de RL. Os neutrófilos contem enzimas e moléculas tóxicas em seus grânulos e
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podem ainda, gerar vários oxidantes como, anion superóxido, peróxido de hidrogênio e acido
hipoclorídrico (TOUMI & BEST, 2006). Esta reintrodução do sangue oxigenado nos tecidos
lesionados, além de poder gerar aumento na produção de EROs (EROs), também pode ser
capaz de reduzir drasticamente os mecanismos de defesa antioxidante, submetendo o paciente
queimado ao estresse oxidativo. Os radicais livres (RL) são necessário para a homeostase do
tecido, porém em uma lesão ocorre uma exacerbação deste mecanismo o qual se constitui em
fator perpetuante da resposta inflamatória sistêmica, levando à piora progressiva do estado
metabólico (BARBOSA et al., 2007). Outros estudos mostram que os aumento exacerbado
das EROs (EROs) podem causar dano celular (GORKTURK et al., 1995; HALLIWELLl &
GUTTERIDGE, 1999). Uma pesquisa sugere que o dano oxidativo é um dos mecanismos
responsáveis pelos acontecimentos, locais e distantes, fisiopatológicos observados após a
queimadura. Portanto devem-se buscar novas alternativas terapêuticas eficazes, visando
reparar os danos nos tecido acometidos pela queimadura (PARIHAR et al., 2008).
A lesão também pode gerar disfunção mitocondrial e danos na cadeia
transportadora de elétrons, afetando a síntese de ATP (BOEKEMA & BRAUN, 2007). No
nosso organismo, as mitocôndrias são organelas intracelulares indispensáveis na produção de
ATP, sendo crucial no processo de cicatrização. O ATP é a principal fonte de energia da
célula, necessários para controle das principais funções das células, porém tecidos lesionados
apresentam-se com deficiência de ATP (BOEKEMA & BRAUN, 2007; AVA & DOUG,
2005). A cadeia respiratória sintetiza 95% produção de ATP, suprindo as necessidades
energéticas celulares (BOEKEMA & BRAUN, 2007). Costa e colaboradores (2010)
demonstram que as nanopartículas de prata podem afetar diretamente a atividade dos
complexos da cadeia respiratória mitocondrial. Nosso objetivo é verificar se a terapia com
µcorrente pode ser potencializada pela incorporação de nanopartículas de ouro no gel base,
avaliando a atividade dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial e os parâmetros de
estresse oxidativos e níveis de defesas antioxidantes, em um modelo animal de lesão por
queimadura.
1.3 Microcorrente
A µcorrente (microcorrente) é eficaz em inúmeras patologias, por ser uma técnica
pouco invasiva quando comparada as demais técnicas empregando correntes terapêuticas. Ela
é uma corrente alternada que opera a uma intensidade muito baixa, gerando respostas
fisiológicas adaptativas em beneficio do tecido lesionado (MENDONÇA et al., 2009; LEE et
al., 2007). Embora a terapia por µcorrente atue também num plano profundo, ela age
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principalmente nas regiões cutâneas e subcutâneas, podendo atingir o tecido muscular e ósseo.
Estudos sugerem que o processo de cicatrização e regeneração dos tecidos é mediado por um
fluxo de corrente elétrica, porém quando este tecido encontra-se lesionado ocorre uma
diminuição deste fluxo (bioimpedância elétrica), contribuindo de forma negativa no processo
de reparação tecidual. Frentes a estas condicionantes, a µcorrente auxilia neste processo,
normalizando o fluxo de corrente endógena, o que conseqüentemente gera uma redução da
bioimpedância destes tecidos, restaurando a homeostase local (ALCAIDE & ALMEIDA,
2001). Os primeiros estudos realizados com µcorrentes, demonstraram um processo cicatricial
mais rápido com efeitos antibacterianos, em feridas, queimaduras e fraturas (WOLCOTT et
al., 1969; GAULT & GATENS, 1976). Outra pesquisa verificou os efeitos da µcorrente em
diversas intensidades, mostrando que intensidades de 100 a 500μA geram um aumento no
transporte de aminoácidos e, intensidades mais próximas de 500μA possibilita o aumento de
até 500% na síntese de ATP (Adenosina trifosfato). Quando ocorre aumento acima de
500μA, a geração de ATP torna-se diminuída ou até mesmo esgotada. Dados demonstram que
o ATP nas células ajuda a promover a síntese protéica e cicatrização, sendo que a lesão
tecidual resulta num decréscimo da produção de sódio e um acúmulo de metabólicos. O uso
de µcorrente na área lesada auxilia no re-estabelecimento dos níveis da corrente elétrica
biológica, aumentando a produção de ATP e promovendo uma melhor cicatrização (CHENG
et al., 1982). Um estudo demonstrou que muitos tratamentos realizados em lesões tendinosas
e ligamentares apresentam um tempo prolongado na reabilitação. Em contrapartida, o
tratamento com a µcorrente acelerou o processo de reabilitação em menos da metade do
tempo (STANISH, 1985).
Os tecidos em sua homeostase apresentam potenciais elétricos distintos, já que
alguns tecidos são mais excitáveis que outros. Por exemplo, os músculos e nervos são grandes
geradores de potencial elétrico. Os tecidos não excitáveis também apresentam potencial
elétrico, como a pele (DENDA & KUMAZAWA, 2002). Quando ocorre uma lesão no tecido,
o potencial elétrico é afetado, aumentando a resistência elétrica. Um estudo demonstrou que o
aumento desta resistência elétrica faz com que as membranas se torem menos permeáveis ao
fluxo de íons. Conseqüentemente ocorrerá diminuição da capacitância celular, podendo gerar
aumento exacerbado do processo inflamatório. Portanto a µcorrente apresenta a função de
restabelecer a bioeletricidade do tecido lesionado, acelerando o processo de cicatrização
(MERCOLA & KIRSCH, 1995).
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1.4 Nanopartículas de ouro
Os benefícios potenciais dos nanomateriais para a saúde humana são aceitos na
literatura. Devido à sua inércia química, o ouro tem sido usado internamente em humanos nos
últimos 50 anos, como em implantes dentários, além de apresentarem também propriedades
ópticas, eletrônicas, redox e catalíticas (DANIEL & ASTRUC, 2004; SOTO et al., 2006;
GHOSH et al., 2008; ZHOU et al., 2009;).
As nanopartículas de ouro (GNP) emergiram como sendo um excelente agente
capaz de se ligar a diversas proteínas, desde pequenas a grandes biomoléculas, portanto,
quanto mais eficaz for à distribuição destes agentes melhor será a sua ação terapêutica. A
penetração de nanopartículas em membranas celulares tornou-se muito interessante, podendo
ter muitas implicações destas nanopartículas nas aplicações biomédicas (GHOSH et al.,
2008). Num estudo visando avaliar a penetração de nanopartículas de ouro na pele e no
intestino, observou-se que nanomateriais são excelentes carreadores. Ainda quanto menor o
tamanho das partículas mais permeáveis elas se tornam, especialmente quando utilizados de
forma transcutânea (GHOSH et al., 2008; SONAVANE et al., 2008). Outro estudo contatou
interação de nanopartículas de prata na cadeia respiratória mitocondrial, mostrando que as
dimensões dos nanomateriais podem interferir na atividade dos complexos da cadeia
respiratória (COSTA et al., 2010). Devido às dimensões dos materiais nanoparticulados, estes
podem atravessar as membranas citoplasmáticas. Portanto, torna-se necessário determinar
quais os efeitos destes nanomateriais no sistema biológico, verificando sua interação com os
processos químicos vitais ao organismo.
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II OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar os efeitos da associação de nanopartículas de ouro e microcorrente na
cicatrização de lesões cutâneas causadas por queimaduras em modelo animal.
2.2 Objetivos Específicos
•
Avaliar os efeitos da associação da terapia por microcorrente com nanopartículas de
ouro incorporadas em gel na atividade do complexo I, II, II-III e IV da cadeia
respiratória mitocondrial;
•
Avaliar os efeitos da associação da terapia por microcorrente com nanopartículas de
ouro incorporadas em gel nos marcadores de peroxidação lipídica (TBARs);
•
Avaliar os efeitos da associação da terapia por microcorrente com nanopartículas de
ouro incorporadas em gel nos marcadores de danos oxidativos a proteínas
(CARBONIL);
•
Avaliar os efeitos da associação da terapia por microcorrente com nanopartículas de
ouro incorporadas em gel na atividade das enzimas de defesa antioxidantes (SOD e
Catalase).
21
III RESULTADOS
ARTIGO 1
ACTIVITY ANALYSIS OF MITOCHONDRIAL RESPIRATORY CHAIN IN THE
HEALING OF SKIN WOUNDS TREATED WITH ASSOCIATED MICROCURRENT
TO GOLD NANOPARTICLES
MIRELI V. MENDONÇA, MARCELO B. DOHNERT, LUCIANA H. DOHNERT,
JONATHANN C. POSSATO, GABRIELA K. FERREIRA, MILENA CARVALHOSILVA, LARA M. GOMES, EMILIO L STRECK, MARCOS M. S. PAULA
Artigo submetido no Journal of Nanoparticle Research
22
Mireli Venâncio Mendonçaa, Marcelo Baptista Dohnerta,c, Luciana H. Dohnertc, Jonathann Correa Possatoa,
Gabriela Kozuchovski Ferreirab, Milena Carvalho-Silvab, Lara Mezari Gomesb, Emilio Luiz Streckb, Marcos
Marques da Silva Paulaa*.
MITOCHONDRIAL RESPIRATORY CHAIN IN THE HEALING OF SKIN INJURY TREATED WITH
MICROCURRENT ASSOCIATED TO GOLD NANOPARTICLES
a
Laboratório de Síntese de Complexos Multifuncionais, Programa de Pós-graduação em
Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense, 88806-000 Criciúma, SC, Brazil;
b
Laboratório de Bioenergética, Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul
Catarinense, 88806-000 Criciúma, SC, Brazil;
c
Departamento de Fisioterapia, Universidade Luterana do Brasil – ULBRA, 95560-000
Torres, RS, Brazil
*Correspondence: Prof. Marcos Marques da Silva Paula, Laboratório de Síntese de Complexos Multifuncionais,
Universidade do Extremo Sul Catarinense 88806-000, Criciúma, SC, Brazil.
Phone: +55 48 3431-2577 Fax: +55 48 3341 2644 Email: [email protected]
23
ABSTRACT
Skin burns are responsible for high mortality and morbidity rates. Today, microcurrent therapy in association to
nanoparticles emerges as an alternative to treat these skin injuries, with positive effects on mitochondrial
respiratory chain. This study assesses the effects of microcurrent therapy associated to gold nanoparticles in gel
on the activity of the mitochondrial respiratory chain complexes. Twenty-five 60-day-old male Wistar rats (250300 g) were used. Injury was modeled by skin burning. Animals were divided in five groups (N = 5) as: (i)
uninjured control (sham); (ii) injured, non-treated control rats (ntC); (iii) injury treated with microcurrent (MIC);
(iv) injury treated with gold nanoparticles (GNP); and (v) injury treated with an association of microcurrent plus
gold nanoparticles (MIC+GNP). Microcurrent therapy was administered for three consecutive days at 300 µA.
Increased activity of complexes I, II, III and IV was observed in MIC and MIC+GNP, when compared to ntC.
When the three treated groups are compared, only MIC+GNP presented significant increase in mitochondrial
respiratory chain complexes levels. Gold nanoparticles may magnify the effects of microcurrent therapy.
KEYWORDS: Microcurrent; Gold nanoparticles; Respiratory chain; Healing; Skin burn.
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INTRODUCTION
Skin burns have high mortality rates and are responsible for severe long-term incapacitation. Broadly speaking,
healing times of skin injury is an important determining factor in the progression of further complications,
among which infections and functional sequelae (Barbosa et al. 2007). In wound closure of a skin injury, tissue
repair involves chemical signaling, cellular organization as well as the extracellular matrix, aiming at a
functional and aesthetically acceptable scar (Singer and Clark 1999).
Among other approaches, microcurrent therapy has been used to treat skin injury. The technique is little
invasive, as compared to other approaches based on electrical current. The very low electrical current used
triggers adaptive responses that help healing the injured tissue (Mendonça et al. 2009; Lee et al. 2010). More
specifically, research demonstrates that dermal injury alters the human body’s endogenous electrical current,
which may be restored by applying a low electrical current at the injury site (Nordenstrom 1984). The first
studies on the therapeutic effects of microcurrent confirmed that the technique speeds up wound closure and
improves burn and fracture healing (Wolcott et al. 1969; Gault and Gatens 1976).
The healing process comprises a sequence of cell events linked to one another, affording the repair of
the injured tissue. In the human organism, mitochondria are intracellular organelles that play a crucial role in the
production of adenosine triphosphate (ATP), essential in the healing process. ATP is the main source of energy
for the cell, required in the control of main primary cell functions like sodium, potassium and magnesium
balance. It has been shown that injured tissues are deficient in ATP (Ava 2005; Boekema and Braun 2007). In
this sense, microcurrent therapy may improve the biologic electric flow, increasing ATP generation and
promoting healing (Nitz et al. 2006; De Nardi et al. 2004; Cheng et al. 1982). With increasing ATP levels,
nutrients begin to flow again into the injured tissue, while metabolites may leave the intracellular medium,
decreasing electrical resistance of this tissue and reestablishing electrical flow (Mercola and Kirsch 1995).
Previous studies conducted by our research group demonstrated that dimethylsulfoxide (DMSO)
enhanced the therapeutic effect of pulsed ultrasound in the healing process (Silveira et al. 2010). It is believed
that, similarly to DMSO, nanoparticles may enhance the therapeutic effect of microcurrent therapy. Another
study reported the influence of silver nanoparticles in the activity of mitochondrial respiration chain complexes
(Costa et al. 2010). In this scenario, we set out to analyze the efficacy of microcurrent therapy in association with
gold nanoparticles (GNP).
Nanotechnology is a relatively new field of study, which addresses materials and systems of a very
small scale and whose structures and components represent new challenges in terms of physical, chemical and
25
biological properties and phenomena (Duran et al. 2006). Penetration of nanoparticles in cell membranes has
lately become the object of considerable scientific interest, opening a wide filed of biomedical applications
(Ghosh et al. 2008). Concerning nanoparticled materials, due to the fact that it is a chemically inert metal with
low toxicity to organisms, gold has been increasingly used in internal treatment approaches in humans (Daniel et
al. 2004; Soto et al. 2006; Zhou et al 2009). Research demonstrates the role of zeta potential of GNP, a
characteristic imputably responsible for the stability of these particles inside the organism and for their affinity
for thiol and amino groups, which promotes reactions with tissue, proteins, DNA and RNA (Ghosh et al. 2008;
Zhou et al. 2009; Chwalibog et al. 2010).
The mitochondrial respiratory chain carries out 95% of ATP synthesis, supplying the cell’s energy
needs (Boekema and Braun 2007). In this sense, since mitochondrial dysfunction and damage to the electron
transport chain may occur in an injury, advancements in methods to restore mitochondrial homeostasis so as to
reduce oxidative stress represent important efforts in the development of new therapeutic strategies (Boekema
and Braun 2007). The present study measures the activity of mitochondrial respiratory chain complexes in an
animal model of injury by burn to investigate the possibility to enhance microcurrent therapy efficiency by
incorporating GNP in the base gel.
MATERIALS AND METHODS
Animals
Twenty-five male Wistar Rats (250-300 g) were obtained from the breeding colony of Universidade do Extremo
Sul Catarinense. Animals were kept in cages in a room at 23 ± 1 ºC with ad libitum access to water and food
under 12-h dark:light cycles. Animals were divided in five groups (N = 5) as: (i) uninjured control (sham); (ii)
injured, non-treated control rats (ntC); (iii) injury treated with microcurrent (MIC); (iv) injury treated with gold
nanoparticles (GNP); and (v) injury treated with an association of microcurrent plus gold nanoparticles
(MIC+GNP).
Skin injury protocol
Animals were anesthetized with an intraperioneal injection of ketamine 80 mg/kg and xylazine 20 mg/kg. Then,
the dorsal region was shaven. Burns were inflicted using a 20 x 10 x 10 mm copper plate as previously described
(Pereira et al. 1993) kept at 100ºC measured using a digital thermometer. Total contact time between plate and
skin was 15 s. Rats were given dipyrone 80 mg/kg every 8 h as painkiller Control animals underwent the same
26
anesthetic protocol but were not challenged with burns.
Preparation of gold nanoparticles
GNP were prepared as described by Turkevich et al. (1951). Nanoparticles were characterized by UV-Vis
spectroscopy and field emission gun-scanning electron microscopy (FEG-SEM) on a microscope (JSM-7401F,
JEOL).
Microcurrent therapy
Animals were anesthetized with ether to allow the correct placement of electrodes on the injury site.
Microcurrent was applied using an electrical stimulation device (Versalite AF7, Tonederm, Caxias do Sul, RS,
Brazil). Eight-minute microcurrent sessions were carried out daily, for three days. As described in the literature
(Agne 2009). Thus, the current applied using the electrode described was 300 µA/cm². GNP in gel applied on the
negative and positive electrodes were used as transmission medium.
Activities of mitochondrial respiratory chain enzymes
The samples were frozen and thawed in hypotonic assay buffer three times to fully expose the enzymes to
substrates and achieve maximal activities. NADH ehydrogenase (complex I) was evaluated according to the
method described by Cassina and Radi (1996), based on the rate of NADH dependent ferricyanide reduction at
420 nm. The activities of succinate:DCIP oxidoreductase (complex II) and succinate:cytochrome c
oxidoreductase (complex III) were determined according to the methods described by Fischer et al. (1985).
Complex II activity was measured using the decrease in absorbance at 600 nm due to the reduction in 2,6-DCIP
levels. Complex III activity was measured by cytochrome c reduction by succinate. The activity of cytochrome c
oxidase (complex IV) was assayed according to the method described by Rustin et al. (1994), measured as the
decrease in absorbance at 550 nm due to the oxidation of previously-reduced cytochrome c. The activities of the
mitochondrial respiratory chain complexes were expressed as nmol/min.mg protein.
Statistical analysis
Data were expressed as mean and standard error, and were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA)
followed by Tukey’s post hoc test using the Statistical Package for Social Sciences (SPSS) version 17.0.
Significance level was p < 0.01.
27
RESULTS
GNP characterization
The electronic spectrum of the GNP solution presents a resonant plasmon band at λ max = 520 nm, in accordance
with previous values observed in the literature (Uehara 2010). FEG-SEM inspection showed that GNP were
spheroid, with mean diameter of 35 nm.
Complex I
When compared to the sham group, activity of complex I was significantly lower in ntC, MIC and GNP groups
(p<0.01). In comparison to ntC, a significant increase in complex I activity was observed only in MIC and
MIC+GNP (p<0.01). Also, statistically significant increase was observed in MIC+GNP, in comparison to MIC
(p<0.01). No statistically significant difference was observed between MIC+GNP and sham (Fig. 1).
Complex II
When activity of complex II of mitochondrial respiratory chain measured for treatment groups was compared to
that of the sham group, values observed for ntC, MIC, GNP, and MIC+GNP (p<0.01) were statistically higher.
Yet, no statistical difference was seen between ntC and the other treatment groups (Fig. 2).
Complex II-III
ntC, MIC, GNP and MIC+GNP presented significantly lower complex II-III activity, when compared to sham
(p<0.01). However, in comparison to ntC, complex II-III activity was higher only in MIC and MIC+GNP
(p<0.01). Also, the parameter was significantly higher in MIC+GNP, when compared to MIC (p<0.01) (Fig. 3).
Complex IV
Activity of complex IV in the respiratory chain was significantly reduced in ntC, MIC and GNP, as compared to
sham (p<0.01). In turn, significantly higher complex IV activity was observed in MIC and MIC+GNP (p<0.01).
Also, MIC+GNP presented higher values of the parameter in comparison to MIC. No statistical difference was
observed in complex IV between MIC+GNP and sham (Fig. 4).
DISCUSSION
Microcurrent therapy replaces the natural electron flow of the organism, diminished in the site of an injury
28
(Cheng 1982; Chapman-Jones and Hill 2002; Craft and Landers 1998). The present study assessed the ability of
microcurrent therapy to restore electron flux in burned skin. We observed increased activity of mitochondrial
respiratory chain complexes I, II, II-III and V in the group treated with microcurrent in combination with GNP,
in comparison to the group treated with microcurrent alone. No significant difference was observed in complex
II activity between MIC+GNP and MIC, though no study on the effects of the combined use of gold
nanoparticles and microcurrent were found in the literature. Similarly, there is a paucity of articles on the effects
this kind of intervention exerts on mitochondrial respiratory chain complexes.
Skin injury may increase electrical resistance and reduce the electric capacity of the injured tissue,
decreasing electron migration through the cell membrane and decreasing substrate oxidation. Microcurrent
therapy aims at reestablishing the electron flux in tissues, improving membrane permeability and accelerating the
healing process (Mercola and Kirsch 1995; El-Husseini et al. 2007). In the injury site, proteins and amino acids
present in the intra- and extracellular media are unstable, worsening the production of reactive oxygen species
(ROS). Research has demonstrated that increased ROS levels side by side with decreased antioxidant levels slow
down the healing process (Anamika and Ranik 2000; Paolisso and Giugliano 1996; Sen et al. 2002). In this
sense, a recent study reported the efficiency of microcurrent therapy to improve tissue regeneration, by reducing
ROS levels (Lee et al. 2010). Also, other studies revealed that microcurrent may promote mitochondrial stability
by increasing ATP production (Lee et al. 2010; Mercola and Kirsh 1995; Ter Haar 1999).
In the present study, no difference was observed in complex II activity between the rats challenged with
untreated skin burns and the rats treated with microcurrent, gold nanoparticles and a combination thereof (MIC,
GNP and MIC+GNP). Previous studies have shown ROS are detrimental to the respiratory chain, and that high
levels of these species are present in injuries (Adami-Vizi 2005; Navarro and Boveris 2007). Additionally, other
papers have demonstrated that, depending on the type of injured tissue and on the treatment conditions
prescribed, different biological outcomes may be possible (Passarella et al. 1984; Silveira et al. 2007).
Here, 300-µA current was used. Frequency of the current was less than 5 Hz. A previous study revealed
that microcurrent therapy at intensities of up to 500 µA improves amino acid transport and increases ATP
synthesis (Cheng et al. 1982). Previously published data also reveal that ATP promotes protein synthesis and
healing of cells. The therapeutic application of microcurrent increases protein inflow to the lymphatic system,
speeding up the absorption of liquids into the interstitial space and contributing for faster tissue repair
((Mendonça et al. 2009; Cheng et al. 1982; Mercola and Kirsch 1995; (El-Husseini et al. 2007).
The therapeutic action of microcurrent is enhanced when the technique is combined with GNP in gel. It
29
is believed that microcurrent increases electron flux in GNP (Mercola and Kirsch 1995; Ghosh et al. 2008;
Denda and Kumazawa 2002). Therefore, GNP may improve the active transport of proteins and amino acids, or
even stabilize some of these proteins, preventing oxidative stress that may lead to DNA damage (Ghosh et al.
2008; Anamika and Rasik 2000; Paliosso and Giugliano 1996; Sen et al. 2002; Demir et al. 2004; Selvakannan et
al. 2003). Our present results suggest that GNP attraction for thiol and amino groups enhanced the therapeutic
action of microcurrent, increasing membrane permeability and restoring mitochondrial function. Also, increased
levels of ATP improve the healing process. Nevertheless, new studies should be carried out to confirm present
data and enlarge the knowledge on the action of GNP in microcurrent therapy.
CONCLUSIONS
Our results are the first to report the improved effects of the association of microcurrent to GNP in
terms of the activity of mitochondrial respiratory chain complexes in a rat model of skin burn.
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33
FIGURE CAPTIONS
Fig. 1 Effect of microcurrent associated to GNP on activity of complex I of mitochondrial respiratory chain after
3-day treatment. Data expressed as mean ± SD, N = 5
# p < 0.01 in comparison to sham
* p < 0.01 in comparison to non-treated injury group
$ p < 0.01 in comparison to microcurrent therapy
Sham: uninjured control; ntC: non-treated injured control rats; MIC: injured rats treated with microcurrent; GNP:
injured rats treated with gold nanoparticles; MIC+GNP: injured rats treated with microcurrent in association with
gold nanoparticles
Fig. 2 Effect of microcurrent associated to GNP on activity of complex II of mitochondrial respiratory chain
after 3-day treatment. Data expressed as mean ± SD, N = 5
# p < 0.01 in comparison to sham
Sham: uninjured control; ntC: non-treated injured control rats; MIC: injured rats treated with microcurrent; GNP:
injured rats treated with gold nanoparticles; MIC+GNP: injured rats treated with microcurrent in association with
gold nanoparticles
Fig. 3 Effect of microcurrent associated to GNP on activity of complex II-III of mitochondrial respiratory chain
after 3-day treatment. Data expressed as mean ± SD, N = 5
# p < 0.01 in comparison to sham
* p < 0.01 in comparison to non-treated injury group
$ p < 0.01 in comparison to microcurrent therapy
Sham: uninjured control; ntC: non-treated injured control rats; MIC: injured rats treated with microcurrent; GNP:
injured rats treated with gold nanoparticles; MIC+GNP: injured rats treated with microcurrent in association with
gold nanoparticles
Fig. 4 Effect of microcurrent associated to GNP on activity of complex IV of mitochondrial respiratory chain
after 3-day treatment. Data expressed as mean ± SD, N = 5
# p < 0.01 in comparison to sham
* p < 0.01 in comparison to non-treated injury group
$ p < 0.01 in comparison to microcurrent therapy
Sham: uninjured control; ntC: non-treated injured control rats; MIC: injured rats treated with microcurrent; GNP:
injured rats treated with gold nanoparticles; MIC+GNP: injured rats treated with microcurrent in association with
34
gold nanoparticles
35
Fig. 1
36
Fig. 2
37
Fig. 3
38
Fig, 4
39
ARTIGO 2
ANÁLISE DE PARÂMETROS DE ESTRESSE OXIDATIVO NA CICATRIZAÇÃO
DE FERIDAS CUTÂNEAS TRATADAS COM MICROCORRENTE ASSOCIADAA
NANOPARTÍCULAS DE OURO
MIRELI V. MENDONÇA, MARCELO B. DOHNERT, LUCIANA H. DOHNERT,
JONATHANN C. POSSATO, FRANCIELE F. VUOLO, FELIPE DAL-PIZZOL, MARCOS
M. S. PAULA
Artigo em preparação
40
ANÁLISE DE PARÂMETROS DE ESTRESSE OXIDATIVO NA CICATRIZAÇÃO
DE FERIDAS CUTÂNEAS TRATADAS COM MICROCORRENTE ASSOCIADA A
NANOPARTÍCULAS DE OURO
MIRELI V. MENDONÇA1, MARCELO B. DOHNERT1,2, LUCIANA H. DOHNERT2,
JONATHANN C. POSSATO1, FRANCIELE F. VUOLO1, FELIPE DAL-PIZZOL1,
MARCOS M. S. PAULA1
1
Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul
Catarinense, Criciúma, SC – Brasil.
2
Departamento de Fisioterapia, Universidade Luterana do Brasil – ULBRA, Torres – RS –
Brasil.
*Correspondência para o autor: Paula, MMS
Laboratório
de
Síntese
de
Compostos
Multifuncionais/UNESC
Av Universitária, n 1105 - Bloco S - Térreo, Sala 3 CEP: 88805-000 - Criciúma, SC, Brasil.
Telefone: (48) 3431-2577
e-mail: [email protected]
41
RESUMO
Lesões por queimaduras podem gerar problemas graves, causando alta taxa de mortalidade e
morbidade. A associação da microcorrente e nanopartículas de ouro apresenta o intuito de
acelerar o processo de cicatrização lesões. Objetivo desta pesquisa foi analisar os feitos da
associação da terapia por microcorrente e nanopartículas de ouro nos parâmetros de estresse
oxidativo. Utilizamos 25 ratos wistar, machos (250-300g), com 60 dias de vida. Os animais
foram divididos em cinco grupos: Grupo controle (Sham) – controle sem lesão; Grupo lesão –
controle lesão sem tratamento; Grupo MIC – grupo lesão tratada com microcorrente; Grupo
GNP – lesão tratada com nanopartículas de ouro; Grupo MIC + GNP – lesão tratada com
associação de microcorrente + nanopartículas de ouro. Foi realizado um modelo de lesão
cutânea por queimadura. O tratamento foi aplicado por três dias consecutivos, com uma
dosimetria de 300µA. Verificamos uma redução significativa nos parâmetros de estresse
oxidativo, e um aumento significativo das defesas antioxidantes enzimático, no grupo tratado
com associação da MIC + GNP em relação ao grupo tratado com MIC. Observamos que
apenas o grupo que associou MIC + GNP não obteve diferença significativa quando
comparado ao grupo sham. Mostrando que a associação de MIC + GNP conseguiu reparar
parcial ou totalmente os danos oxidativos.
Palavras chave: microcorrente; nanopartículas de ouro; estresse oxidativo; cicatrização.
42
INTRODUÇÃO
Lesão causada por queimadura acarreta em alto índice de mortalidade, e também
pode gerar graves incapacidades em longo prazo. Numa ferida cutânea, o tempo de
cicatrização é determinante para o desenvolvimento de complicações1. Segundo a Sociedade
Brasileira de Queimaduras, ocorre anualmente um milhão de novos casos de queimaduras por
ano, sendo uma das principais causas externas de morte registradas no Brasil2-5. O processo de
cicatrização de queimaduras pode elevar drasticamente os níveis de espécies reativas de
oxigênio (EROs) também pode reduzir os mecanismos de defesas antioxidantes enzimático,
submetendo o paciente queimado ao estresse oxidativo. O tecido cutâneo sem a presença de
lesão apresenta baixos níveis de RL e EROs, porém a lesão gera uma exacerbação dos
parâmetros de estresse oxidativo resultando na perpetuação da resposta inflamatória sistêmica,
levando a um decréscimo da atividade metabólica6. As EROs impõem dano tecidual/celular
através da peroxidação lipídica, modificação de proteínas, clivagem da fita DNA e
modificação da base oxidativa7-8. Um estudo demonstra que o dano oxidativo é um dos
mecanismos responsáveis pelos eventos fisiopatológicos observados após a queimadura9.
Outras pesquisas observaram que na lesão ocorre aumento exacerbado das EROs e
diminuição dos antioxidantes, que são mecanismos de defesa das organelas celulares e
enzimas. Estes estudos perceberam um atraso do processo de cicatrização de feridas10-12.
A terapia com Microcorrente vem sendo uma alternativa eficaz no processo de
cicatrização de feridas cutâneas. Apresenta uma corrente de baixa intensidade, que gera
respostas fisiológicas adaptativas para o tecido lesionado13-14. Uma pesquisa demonstrou que
a terapia com microcorrente acelerou o processo de cicatrização de feridas por queimaduras e
fraturas15-16. Parihar e colegas (2008) observaram que a microcorrente melhorou o processo de
regeneração tecidual, sugerindo um poder antioxidante desta modalidade terapêutica nos
tecidos lesionado, reduzindo os níveis de EROs9. Pesquisa demonstra que técnicas
terapêuticas, como a utilização do Ultrassom pulsado (USP), podem ser potencializadas pela
associação de agentes que exibem propriedades biológicas17. Em nossa pesquisa analisamos o
efeito da terapia por Microcorrente associada à nanopartículas de ouro. Os nanomateriais
exibem propriedades e fenômenos físicos, químicos e/ou biológicos relativamente novos
devido a sua escala nanométrica. Devido à inércia química do ouro e a pouca toxidade celular,
o ouro vem sendo utilizado em humanos há mais de 50 anos18-20. Além disto, devido ao
potencial zeta, as nanopartículas de ouro tendem a permanecer estáveis no organismo, se
agregando a diversas proteínas e aminoácidos através das ligações com grupos tióis e aminos
43
presentes nas mesmas. A afinidade das GNP pelos grupos tióis e aminos, podem estar
estabilizando algumas proteínas, prevenindo o aumento exacerbado de EROs que podem
causar danos mitocondriais20-22. Nosso objetivo é verificar se a terapia com Microcorrente
pode ser potencializada pela incorporação de nanopartículas de ouro no gel base, analisando
os parâmetros de estresse oxidativo e defesas antioxidantes, em um modelo animal de lesão
por queimadura.
MATERAIS E MÉTODOS
Animais
Foram utilizados 25 ratos Wistar (250-300 g) obtidos do Biotério Central da
Universidade do Extremo Sul Catarinense. Eles foram dividos em cinco grupos, com acesso
gratuito a água e comida e foram mantidos em um ciclo de 12 h claro/escuro em uma
temperatura de 23oC ± 1oC.
Protocolo de Lesão Cutânea
Antes de serem submetidos à lesão, os animais foram anestesiados com Ketamina (80 mg/kg)
e Xilazina (20 mg/kg) via ip . Após foi realizada a tricotomia da região dorsal do animal. A
queimadura foi causada por uma placa de cobre medindo 20mm x 10mm x 1mm, sendo
aquecida por 100ºC, medida por termômetro digital, conforme descrito anteriormente23. Logo
após utilizamos a Dipirona Sódica como (80mg/Kg) como analgésico, sendo administrado por
8/8h. Os animais controle foram anestesiados assegurando a padronização, sendo expostos á
técnica cirúrgica, porém sem a lesão cutânea.
Preparação de GNP
Nanopartículas de ouro foram preparadas conforme descrito por Turkevich et al24. Toda
vidraria foi previamente lavada com água-régia e enxaguada com água ultrapura. Foi utilizado
50 ml de solução de água ultrapura com 2mM de ácido auroclorídrico aquecidos suavemente
até atingir 90 ºC. Após foi adicionado 5ml de citrato de sódio, 39 mM. O meio reacional foi,
então, refluxado durante 20 minutos sob forte agitação. Logo após foi resfriado à temperatura
ambiente, a solução foi centrifugada a 7000 rpm por 30 minutos e as nanopartículas foram
coletadas.
Tratamento com Microcorrente
44
Os animais foram anestesiados com éter para permitir a correta fixação dos eletrodos sobre o
local da lesão. Utilizamos o equipamento VERSALITE AF7 da marca TONDERM
previamente calibrado. Os animais foram submetidos a três sessões diárias de microcorrente,
com duração de oito minutos, através de correntes de baixa intensidade e freqüências
inferiores a 5Hz . Foram utilizados eletrodos de 1,5 cm2 resultando na dosimetria de
aproximadamente 300µA25. O tratamento foi iniciado uma hora após a produção da lesão,
utilizando nanopartículas de ouro incorporadas em gel no eletrodo negativo e positivo.
Medida do Dano Oxidativo em Proteínas (Carbonil) – Oxidação de Proteínas
O dano oxidativo às proteínas foi medido pela determinação de grupos carbonil baseados na
reação com dinitrofenilhidrazina (DNPH), previamente descrito por Levine et al. (1990)26.
Proteínas foram precipitadas pela adição de 20% ácido tricloroacético e reagiu com DNPH. O
conteúdo de carbonil foi determinado espectrofotometricamente em λ=370nm considerando
um coeficiente de absortividade molar de 22.0000. Resultados foram expressos como
conteúdo de carbonil (nmol/mg proteína).
Medida de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARs) – Peroxidação Lipídica
O índice de peroxidação lipídica foi verificado através da formação de ácido tiobarbitúricoreativas (TBARS) durante uma reação de aquecimento do TBA como descrito por Draper e
Hadley (1990)27. Resumidamente, as amostras foram misturadas com 1mL de ácido
tricloroacético 10% e 1mL de ácido tiobarbitúrico 0,67%. Posteriormente, foram aquecidos
em banho-maria por 30min. Nível de TBARs foram determinados pela absorbância a 532nm
usando 1,1,3,3 tetrametoxipropano como um padrão externo. Resultados foram expressos
como TBARs (nmol/mg proteína).
Determinação das Defesas Antioxidantes Enzimáticas
Atividade da SOD
Atividade da SOD foi determinada medindo-se a inibição da auto-oxidação da adrenalina
como absorbância a 480nm, conforme descrito anteriormente por Bannister e Calabrese
(1987) e os resultados foram expressos em Unidade/mg Proteína28.
Atividade da CAT
45
Atividade da Catalase foi medida pela taxa de redução na absorbância do peróxido de
hidrogênio a 240nm (Aebi, 1984) e os resultados foram expressos em Unidade/mg Proteína29.
Análise Estatística
Os dados foram expressos em média e erro padrão médio, e analisados estatisticamente pela
análise de variância (ANOVA) one-way, seguido pelo teste post hoc Tukey. O nível de
significância estabelecido para o teste estatístico foi de p<0,01. Foi utilizado o SPSS
(Statistical Package for the Social Sciences) versão 17.0 como pacote estatístico.
RESULTADOS
Caracterização das GNP
O espectro eletrônico de uma solução de GNP apresentou uma banda de plasmon ressonante
com λmax=520 nm. Caracterizando as nanopartículas de ouro, conforme descrito anteriormente
na literatura28. A análise microscópica por FEG revelou GNP de formato esferoidal com
diâmetro médio de 35nm.
46
Medida do Dano Oxidativo em Proteínas (Carbonil)
Analisando os parâmetros de danos em proteínas (Figura 1), verificamos que houve um
aumento significativo nos grupos lesão sem tratamento, microcorrente e GNP em relação ao
grupo controle sem lesão (p<0,01). Avaliamos que houve uma redução significativa dos
grupos microcorrente, GNP e microcorrente + GNP quando comparados com o grupo lesão
sem tratamento (p<0,01). Observamos que grupo tratado com microcorrente + GNP
apresentou diferença significativa em relação ao grupo tratado apenas com Microcorrente
(p<0,01). Não observamos diferença significativa entre o grupo tratado com microcorrente +
GNP em relação ao grupo controle sham.
FIGURA 1. Efeito da Microcorrente associada à GNP, nos danos oxidativos a proteínas, em
um modelo animal de lesão por queimadura, após três dias de tratamento. Dados foram
expressos em média ± DP, N = 5.
# p<0,01 em relação ao grupo sham.
* p<0,01 em relação ao grupo lesão.
$ p<0,01 em relação ao grupo tratado com MIC.
Controle Sham – Grupo controle sem lesão; Lesão – Grupo lesão sem tratamento; MIC –
Grupo lesão + tratamento com microcorrente; GNP – Grupo lesão + tratamento com
nanopartículas de ouro; MIC + GNP – Grupo lesão + microcorrente + nanopartículas de ouro.
47
Medida de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARs)
Analisando os parâmetros de danos em lipídios (Figura 2), verificamos que houve um
aumento significativo nos grupos lesão sem tratamento, microcorrente e GNP em relação ao
grupo sham (p<0,01). Observamos que houve uma redução significativa dos grupos
microcorrente, GNP e microcorrente + GNP quando comparados com o grupo lesão (p<0,01).
O grupo tratado com microcorrente + GNP apresentou diferença significativa em relação ao
grupo tratado apenas com microcorrente (p<0,01). Não observamos diferença significativa
entre o grupo tratado com microcorrente + GNP em relação ao grupo sham.
FIGURA 2. Efeito da Microcorrente associada à GNP, nos danos oxidativos a lipídios, em
um modelo animal de lesão por queimadura, após três dias de tratamento. Dados foram
expressos em média ± DP, N = 5.
# p<0,01 em relação ao grupo sham.
* p<0,01 em relação ao grupo lesão.
$ p<0,01 em relação ao grupo tratado com MIC.
Controle Sham – Grupo controle sem lesão; Lesão – Grupo lesão sem tratamento; MIC –
Grupo lesão + tratamento com microcorrente; GNP – Grupo lesão + tratamento com
nanopartículas de ouro; MIC + GNP – Grupo lesão + microcorrente + nanopartículas de ouro.
48
Atividade da Catalase
Analisando a atividade enzimática da catalase (Figura 3), observamos que houve uma redução
significativa nos grupos lesão, microcorrente e GNP em relação ao grupo controle sem lesão
(p<0,01). Observamos que houve um aumento significativo dos grupos microcorrente, GNP e
microcorrente + GNP quando comparados com o grupo lesão sem tratamento (p<0,01). O
grupo tratado com microcorrente + GNP apresentou diferença significativa em relação ao
grupo tratado apenas com microcorrente (p<0,01). Não houve diferença significativa entre o
grupo tratado com microcorrente + GNP em relação ao grupo controle sem lesão.
FIGURA 3. Efeito da Microcorrente associada à GNP, na atividade enzimática da catalase,
em um modelo animal de lesão por queimadura, após três dias de tratamento Dados foram
expressos em média ± DP, N = 5.
# p<0,01 em relação ao grupo sham.
* p<0,01 em relação ao grupo lesão.
$ p<0,01 em relação ao grupo tratado com MIC.
Controle Sham – Grupo controle sem lesão; Lesão – Grupo lesão sem tratamento; MIC –
Grupo lesão + tratamento com microcorrente; GNP – Grupo lesão + tratamento com
nanopartículas de ouro; MIC + GNP – Grupo lesão + microcorrente + nanopartículas de ouro.
49
Atividade da Superóxido dismutase
Analisando a atividade enzimática da superóxido dismutase (SOD) (Figura 4), verificamos
que houve uma redução significativa nos grupos lesão sem tratamento, microcorrente, GNP e
microcorrente + GNP em relação ao grupo controle sem lesão (p<0,01). Avaliamos que houve
um aumento significativo dos grupos microcorrente e microcorrente + GNP quando
comparados com o grupo lesão sem tratamento (p<0,01). O grupo tratado com microcorrente
+ GNP apresentou diferença significativa em relação ao grupo tratado apenas com
microcorrente (p<0,01).
FIGURA 4. Efeito da Microcorrente associada à GNP, na atividade enzimática da superóxido
dismutase, em um modelo animal de lesão por queimadura, após três dias de tratamento
Dados foram expressos em média ± DP, N = 5.
# p<0,01 em relação ao grupo sham.
* p<0,01 em relação ao grupo lesão.
$ p<0,01 em relação ao grupo tratado com MIC.
Controle Sham – Grupo controle sem lesão; Lesão – Grupo lesão sem tratamento; MIC –
Grupo lesão + tratamento com microcorrente; GNP – Grupo lesão + tratamento com
nanopartículas de ouro; MIC + GNP – Grupo lesão + microcorrente + nanopartículas de ouro.
50
DISCUSSÃO
A terapia por microcorrente visa suprir as necessidades bioelétricas do tecido
lesionado, sendo similar a corrente endógena do organismo, desta foram acredita-se que ela
pode ser capaz de restaurar os sinais bioelétricos quando ocorre uma lesão 30-32. Em nosso
estudo utilizamos a microcorrente associada à nanopartículas de ouro incorporadas em gel
base. Nossa pesquisa observou que houve uma redução significativa nos parâmetros de dano
oxidativos no grupo que associou MIC + GNP, restaurando parcialmente a lesão, e um
aumento significativo dos resultados dos níveis de defesas antioxidantes enzimático no grupo
tratado com a associação da MIC + GNP, ambos comparados com o grupo tratado apenas
com microcorrente. Contudo, não foram encontradas na literatura pesquisas utilizando a
associação da terapia por MIC com GNP. Também não foram encontrados estudos avaliando
esta modalidade terapêutica nos parâmetros de estresse oxidativo.
EROs podem ser geradas nos processos inflamatórios, sendo produzidas na cadeia
respiratória mitocondrial33. Porém as defesas antioxidantes, enzimáticas e não-enzimáticas,
atuam contra a toxicidade dessas espécies, sendo responsáveis pelo controle entre a
eliminação e produção de EROs. Porém na lesão ocorre o aumento exacerbado destas
espécies, ultrapassando a capacidade antioxidante normal do organismo e pode até mesmo
gerar um déficit das defesas antioxidantes, favorecendo o aumento do estresse oxidativo34.
Pesquisas mostram que numa lesão, a combinação do aumento exacerbado das
EROs e uma diminuição dos antioxidantes geram atraso no processo de cicatrização de
feridas, portanto a lesão deve ser restaurada o mais rapidamente6-7,30. Estudos observaram que
na lesão ocorre ativação dos neutrófilos devido à fagocitose, amplificando este processo
inflamatório, podendo conduzir a liberação de RL de oxigênio. Neutrófilos contem enzimas
hidrolíticas e moléculas toxicas em seus grânulos que podem gerar vários oxidantes35.
Pesquisa demonstra que a produção exacerbada de RL causa dano nas membranas lipídicas e
produz necrose nas células36 Estudos demonstram que as EROs, quando exacerbadas, podem
gerar danos celular, prejudicando o processo de cicatrização de feridas7-8. Outras pesquisas
observaram que uma resposta inflamatória aguda abreviada e menos intensa, gera uma melhor
regeneração tecidual, e diminui os eventos de estresse oxidativo que se encontram
aumentados na lesão. Desta forma favorece e restaura os níveis de defesas antioxidantes 6,37-38.
Silveira et al (2010) observou que a associação do DMSO com a modalidade terapêutica do
USP, pode potencializar o processo de cicatrização na lesão17. Acredita-se que assim como o
DMSO, as GNP pode potencializar a terapia por microcorrente, na lesão por queimadura.
51
A penetração de nanopartículas em membranas celulares é facilitada por sua
escala nanométrica, podendo ser utilizada em diferentes aplicações biomédicas21. Estudos
vêm demonstrando que estabilidade das nanopartículas de ouro está relacionada com seu
potencial zeta, interagindo com diversas proteínas e aminoácidos, DNA e RNA, associação
com fármacos, através da sua afinidade das GNP por grupos tióis e aminos, presentes nestes
componentes químicos 21,19-20. Pode-se supor que o aumento do fluxo de elétrons gerado pela
microcorrente aumentou a permeabilidade da membrana, na lesão, facilitando a entrada das
GNP. Devido atração química das GNP por grupos aminos e tióis, presentes em proteínas e
aminoácidos, potencializaram a ação terapêutica da microcorrente, restaurando a estabilidade
de algumas proteínas e aminoácidos, prevenindo o aumento exacerbado das EROs. Porém,
novos estudos devem ser realizados visando o aprofundamento e confirmação dos achados
encontrados nesta pesquisa.
CONCLUSÃO
Nossos resultados são pioneiros, em analisar os efeitos da associação da terapia
por microcorrente com nanopartículas de ouro incorporadas em gel, nos parâmetros de danos
oxidativos, em um modelo animal de lesão por queimadura. Este estudo observou que as
nanopartículas de ouro potencializaram o efeito da microcorrente.
AGRADECIMENTOS
Esta pesquisa foi financiada por doações do Conselho Nacional de Pesquisa e
Desenvolvimento (CNPq), Fundação de Apoio à Pesquisa Científica e Tecnológica do Estado
de Santa Catarina (FAPESC), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) e Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC).
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55
IV DISCUSSÃO
A terapia por µcorrente apresenta o intuito de ser similar a corrente endógena do
organismo e ser capaz de ampliar os sinais bioelétricos quando ocorre uma lesão. Desta forma
fornece o aporte bioelétrico necessário para compensar a diminuição da corrente elétrica no
tecido lesionado (CHAPMAN-JONES & HILL, 2002; CHENG et al., 1982; CRAFT &
LANDERS, 1998). Jaffer e Vanbler (1984) constataram que as células dos mamíferos
(humanos e cobaias) podem apresentar potencial elétrico transcutânea de até 80mV e corrente
com intensidades de 1µA/mm2 na área da lesão.
Em nossa pesquisa utilizamos a terapia por µcorrente com o objetivo de restaurar
a bioeletricidade do tecido cutâneo acometido pela queimadura. Verificamos o aumento
significativo dos complexos I, II-III e IV da cadeia respiratória, no grupo que associou
microcorrente + GNP gel, em relação ao grupo que utilizou apenas a microcorrente.
Observamos também que no grupo que associou microcorrente com nanopartículas de ouro,
houve uma redução significativa dos danos oxidativos analisando TBARs e Carbonil, e um
aumento significativo das defesas antioxidantes enzimático, através da análise da SOD e
Catalase, quando comparados com o grupo tratado apenas com microcorrente. Porém, não há
relatos na literatura sobre a incorporação de nanopartículas de ouro em gel na modalidade
terapêutica da microcorrente. Também não foram encontrados estudos analisando os
complexos da cadeia respiratória, os parâmetros de danos oxidativos e defesas antioxidantes
com este tipo de intervenção.
Um estudo utilizando a µcorrente observou melhora na regeneração tecidual,
reduzindo os níveis de EROs. Neste caso a µcorrente visou à entrega de elétrons para as
mitocôndrias (LEE et al., 2010). Estudos demonstraram que a µcorrente pode auxiliar na
estabilidade mitocondrial, aumentando desta forma, a síntese de ATP e consequentemente o
transporte ativo de proteínas e aminoácidos (LEE et al., 2010; TER HARR, 1999; CHENG et
al., 1982). Proteínas e aminoácidos que são importantes para manter a homeostase celular,
presentes no meio intra e extracelulares, tendem a estar instáveis na lesão exacerbando o
processo de produção de EROs. Neste contexto, as GNP são atraídas por grupos tióis e
aminas, ambos encontrados em algumas destas proteínas e aminoácidos do nosso organismo
(SOTO et al., 2006; ANAMIKA & RASIK, 2000). Nosso estudo demonstra que no complexo
II não houve reversão após a intervenção terapêutica. Pesquisas apontam que a cadeia
respiratória torna-se vulnerável as EROs, que se encontram aumentadas na lesão (NAVARRO
& BOVERIS, 2007; ADAM-VIZI, 2005). Outras pesquisas mostram que dependendo do
56
tecido lesionado e das condições de tratamentos condicionados, podem apresentar diferentes
efeitos biológicos (SILVEIRA et al., 2007; PASSARELA et al., 1984).
Acredita-se que as GNP podem atravessar a membrana mais rapidamente, devido
ao seu tamanho nanométrico, podendo ser influenciadas pela corrente elétrica da µcorrente e
posteriormente, no interior da célula, estabilizar algumas proteínas e aminoácidos ou auxiliar
no transporte ativo das mesmas, prevenindo o stress oxidativo que podem causar danos no
DNA e RNA (GHOSH et al., 2008; DEMIR et al., 2004; SELVAKANNA et al., 2003;
PAOLISSO & GIUGLIANO, 1996). Pesquisas mostram que numa lesão, a combinação do
aumento exacerbado das EROs e uma diminuição dos antioxidantes atrasam o processo de
cicatrização de feridas, sendo que os antioxidantes são mecanismos de defesa das organelas
celulares e enzimas auxiliando na melhora da cicatrização (SEN et al., 2002; ANAMIKA &
RASIK, 2000; PAOLISSO & GIUGLIANO, 1996). EROs podem causar dano tecidual
através da peroxidação lipídica e modificações nas proteínas (GORKTURK et al., 1995;
HALLIWELLl & GUTTERIDGE, 1999). Outra pesquisa sugere que o dano oxidativo é um
dos mecanismos responsáveis pelos acontecimentos locais e distantes fisiopatológicos
observados após a queimadura (PARIHAR et al., 2008).
Em nossos estudos utilizamos uma corrente que varia constantemente sua
polaridade, com uma intensidade de 300µA. Cheng e colaboradores (1982) verificaram os
efeitos da µcorrente em diversas intensidades, mostrando que intensidades de 100 a 500μA
geram um aumento no transporte de aminoácidos. Observaram ainda que intensidades mais
próximas de 500μA possibilitam o aumento de até 500% na síntese de ATP. A µcorrente é
uma corrente que trabalha com uma freqüência modulada inferior a 5Hz, e com uma
intensidade de corrente muito baixa, gerando respostas fisiológicas adaptativas em beneficio
do tecido lesionado (LEE et al., 2010; MENDONÇA et al., 2009). Um estudo demonstra que
a colocação do anodo de corrente contínua no tecido lesionado, aumentou os níveis
inflamatórios, enquanto que com o catodo na região da lesão ocorreu uma maior produção de
fibroblastos e fibras de colágeno. Frente a estes resultados encontrados verificou-se uma
melhor resposta do processo cicatricial, quando ocorre uma alternância constante de cargas
nos eletrodos (DEMIR et al., 2004). Em nossa pesquisa utilizamos nanopartículas
incorporadas em gel no eletrodo positivo e negativo.
As GNP podem estar potencializando a ação terapêutica da microcorrente. Estudo
prévio demonstrou que um agente com propriedade terapêutica, no caso o DMSO
(dimetilsulfóxido) potencializou o efeito terapêutico do Ultrassom pulsado na cicatrização de
feridas. Em outra pesquisa observamos a atuação das nanopartículas de prata na atividade dos
57
complexos da cadeia respiratória (SILVEIRA et al., 2010; COSTA et al., 2010). Em nosso
estudo acreditamos que, assim como o DMSO, as GNP potencializam o efeito da
microcorrente em um modelo de queimadura, interferindo nos complexos da cadeia
respiratória mitocondrial. Um estudo analisou os efeitos antiinflamatórios de nanopartículas
de ouro em lesões cerebrais, o resultado mostrou que o tratamento reduziu de forma
significativa os níveis cerebrais dano oxidativo no DNA e de marcadores pró-apoptose
(DANIEL & ASTRUC, 2004; SWAN, 1999). Outra pesquisa demonstrou que devido a forte
ligação entre nanopartículas de ouro e os grupos tióis e aminas, estas GNP apresentaram a
capacidade de inibir a proliferação endotelial do VEGF165 , pela interação dos grupos
enxofre/aminas, induzidos em modelos de tumor de ouvido e de ovários em ratos
(SONAVANE et al., 2008). Num estudo foi avaliado a entrega de GNP em atrite reumatóide
através da via intra-articular, os resultados mostraram que GNP inibiram a proliferação e
migração celular, além dos níveis de infiltração de macrófagos (TSAI et al., 2007). Sugere-se
que as diversas propriedades terapêuticas das GNP podem contribuir no processo de
cicatrização de feridas cutâneas.
Acredita-se que as GNP por apresentarem potencial zeta negativo e por serem
atraídas por grupos aminos e tióis, potencializaram a ação terapêutica da µcorrente. Sendo que
a associação da microcorrente com GNP pode restaurar o fluxo elétrico existente em uma
lesão, reduzir os níveis de danos oxidativos, acelerando o processo de cicatrização. Contudo,
novos estudos devem ser realizados com o intuito de aprofundar e confirmar os achados
encontrados nesta pesquisa.
58
CONCLUSÃO
Nossos resultados são os primeiros em demonstrar os efeitos da associação da
terapia por Microcorrente com a incorporação de nanopartículas de ouro em gel, na atividade
dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial e nos parâmetros de estresse oxidativo e
defesas antioxidantes. Esta pesquisa observou que as nanopartículas de ouro potencializaram
o efeito da µcorrente, em um modelo animal de lesão por queimadura.
59
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