Vivências: Revista Eletrônica de Extensão da URI
ISSN 1809-1636
EFICÁCIA DA ESPINHEIRA SANTA (MAYTENUS OFFICINALIS MABB.) NA
CICATRIZAÇÃO DE FERIDA CUTÂNEA EM RATOS
Effectiveness of Espinheira santa (Maytenus officinalis Mabb.) in the healing of skin wounds in rats
Morgana PISTORE ¹
Aline ROSSET ¹
Tanara Beatriz WEBER ¹
Silvane Souza ROMAN ²
RESUMO
Maytenus officinalis Mabb. é utilizada popularmente para distúrbios do estômago e amplamente
investigada devido à presença de fitocomplexos. Verificar a atividade cicatrizante cutânea do
extrato etanólico de Maytenus officinalis Mabb a 2% em ratos machos Wistar. Para este
experimento foram utilizados vinte e quatro ratos distribuídos aleatoriamente em três grupos de 8
animais cada: Grupo EXP (Maytenus officinalis), Grupo CTL+ (controle positivo) e Grupo CTL(controle negativo). O grupo EXP recebeu topicamente o extrato etanólico de Maytenus officinalis
Mabb à 2 %; grupo CTL- que foi manipulado igualmente sem receber nenhum tratamento e o grupo
CTL+ que recebeu aplicação tópica de Dersani®, uma droga de referência, obtida comercialmente.
O extrato de Maytenus officinalis foi obtido através de maceração e após rotaevaporado sob pressão
reduzida para retirada do álcool. Os animais foram submetidos a uma ferida cutânea por meio de
um “punch” metálico dermal, com este instrumento foi excisado o fragmento cutâneo de 1cm de
diâmetro até a fáscia muscular. O dia da lesão foi considerado o 0° dia pós-operatório (DPO) e os
animais foram sacrificados em câmara de CO2 no 14° DPO. Durante o período pós operatório, a
ferida foi analisada morfologicamente quanto a presença de crosta, reepitelização, esfacelo e
granulação. No dia 0° e 14°DPO foi realizada a medida da ferida com o paquímetro. No 14° DPO
coletou-se as feridas dos animais dos diferentes grupos para análise histológica. Na análise
histológica do 14°DPO, observou-se um aumento de folículos pilosos nos grupos EXP e CTL+
quando comparados ao CTL-, o que representa a eficácia do extrato na reparação epitelial. Além do
mais, a espessura da epiderme dos grupos EXP, CTL+ e o SEM LESÃO foi menor
significativamente quando comparados ao grupo CTL-, o que demonstra uma reorganização das
camadas da epiderme, retornando ao seu estado normal. Os dados morfológicos e histológicos
encontrados no 14°DPO corroboram com a evolução cicatricial. O tratamento tópico do extrato
etanólico de Maytenus officinalis 2 % no 14° dia pós-operatório favoreceu a reepitelização
estimulando a formação de camadas da epiderme com presença de folículos pilosos, porém não foi
eficaz nas camadas mais profunda da pele em ratos.
Palavras-chaves: Maytenus officinalis, Feridas, Histology, Ratos
¹ Acadêmica do curso de Farmácia. Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões – URI Erechim.
² Professor Titular do Departamento de Ciências da Saúde – Laboratório de Histologia - Universidade Regional
Integrada do Alto Uruguai e das Missões – URI Erechim.
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ABSTRACT
Maytenus officinalis Mabb. is popularly used for disorders of stomach and widely investigated due
to presence of fhyto-complex. To determine the wound healing activity of ethanolic extract of
Maytenus officinalis Mabb 2% in Wistar rats. Twenty-four rats were randomly distributed in three
groups the following: EXP (Maytenus officinalis) group; CTL+ (positive control) group and CTL(negative control) group. The EXP group topically received the ethanolic extract of Maytenus
officinalis Mabb 2%; The CTL- group was equally manipulated without receiving no treatment and
CTL+ group received Dersani®, a reference drug, commercially obtained. Maytenus officinalis
extract was obtained by maceration and evaporation route on reduced pressure to remove the
alcohol. The animals were subjected to a skin wound through a "punch" metallic dermal, with this
instrument was excised cutaneous fragment 1cm in diameter to the fascia. The day of the lesion was
considered the postoperative day 0 (PD) and the animals were sacrificed by CO2 chamber at 14 PD.
Throughout the postoperative days, the wound was morphologically examined by presence of crust,
epithelialization, granulation and slough. On 0 and 14 PD the wound area was measured by a
pachymeter. On 14 PD the wounds were collected of the different groups of animals for histological
analysis. Histological analysis showed increase of hair follicles in the EXP and CTL+ groups when
compared to the CTL- group on 14 PD, showing the effective action of the extract in the epithelial
repair. Moreover, the thickness of epidermis was significantly lower of the EXP, CTL+ and no
lesion groups when compared to the CTL- group, which shows a reorganization of epidermal layers,
returning to its normal state. Morphological and histological data found corroborate to healing
process on 14 PD. Topical treatment of ethanolic extract of Maytenus officinalis 2% favored to reepithelialization by stimulating the formation of layers of epidermis with the presence of hair
follicles, but was not effective in the deeper layers of the skin. on 14 postoperative day in rats.
Keywords: Maytenus officinalis, Wounds, Histology, Rats
INTRODUÇÃO
Durante muito tempo, o uso de plantas medicinais foi o principal recurso terapêutico
utilizado para tratar a saúde das pessoas e de suas famílias (BADKE; BUDÓ, 2011). Muitas
das propriedades terapêuticas das plantas são relatadas pela população, as quais são confirmadas
em sua maioria nos estudos científicos, comprovando a importância da pesquisa
etnofarmacológica. Tais propriedades propiciaram o desenvolvimento de vários medicamentos,
sejam estes obtidos por síntese a partir de molécula protótipo ou através de isolamento,
algumas vezes, biomonitorado. Devido a todos estes aspectos, vê-se um interesse crescente na
utilização e pesquisa de plantas medicinais, objetivando fins terapêuticos, aliadas à boa
aceitabilidade destes produtos no mercado farmacêutico (NOLDIN; ISAIAS; CHECHINEL,
2006). O uso da medicina popular está circunscrito aos problemas cotidianos das pessoas, como
dores e feridas. A reparação tecidual de feridas é um processo altamente complexo que envolve a
inflamação, proliferação celular e remodelação, com o intuito de restaurar a integridade
anatômica e funcional do tecido lesado (MARTINS, 2011).
Desde a antiguidade, o uso de produtos naturais tem sido empregado no reparo de feridas
cutâneas com o intuito de auxiliar o processo cicatricial (SHIMIZU, 2009). Os produtos naturais
constituem uma fonte inesgotável de substâncias potencialmente ativas e, portanto, devem ser
consideradas como matéria-prima, como ponto de partida para a descoberta de novas moléculas e
para o desenvolvimento de novos fitoterápicos (ESTEVÃO et al., 2011). Dentro deste contexto,
destaca-se a utilização inicialmente popular e atualmente comprovada cientificamente de Maytenus
officinalis Mabb na cicatrização de ulceras gástricas (CARLINI, 1988; COULAUD-CUNHA et al.,
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2004; CARVALHO et al., 2008). A Maytenus officinalis Mabb. é conhecida popularmente como
espinheira-santa, cancerosa, cancorosa-de-sete-espinhos e maiteno, dentre outros nomes
(BRANDÃO et al., 2006). Pertence à família Celastraceae, possuindo 55 gêneros e 850 espécies
espalhadas nas regiões trópicas e subtrópicas do mundo. No contexto brasileiro, onde seu
crescimento é nativo, a espécie M. officinalis é largamente utilizada na medicina popular
(MOSSI et al., 2004 apud OLIVEIRA; COLAÇO, 2009). Segundo o uso popular acredita-se que
a Maytenus officinalis Mabb. possa combater várias doenças, dentre as quais podem-se
destacar, gastrites e dispepsias. Possui ações tônicas, analgésicas, anti-sépticas, cicatrizantes,
diuréticas e laxativas (COIMBRA, 1958 apud OLIVEIRA; COLAÇO, 2009). Os estudos in
vivo já demonstraram a eficácia de Maytenus officinalis em modelos de lesão gástrica
induzidos por etanol e/ou indometacina (BERSANI-AMADO et al., 2000). Além da atividade
anti-ulcerogênica, estudos demonstraram que Maytenus officinalis apresenta atividade
antinociceptiva, anti-inflamatória e vasorelaxante (JORGE et al., 2004). De acordo com Lima et
al. (1969 apud OLIVEIRA, 2009), houve a demonstração da presença de vários grupos
fitoquímicos, destacando-se os terpenóides, taninos, alcalóides, macrólideos e flavonóides,
dentre outros (COULAUD-CUNHA et al., 2004; ESTEVAM, 2009). Pesquisas envolvendo
Maytenus officinalis Mabb geralmente estão voltadas para sua atividade anti-ulcerogênica, e são
escassos os estudos avaliando sua ação na reparação tecidual. A fim de contribuir na terapia
contra o dano da integridade tecidual, torna-se válido a realização deste estudo avaliando o efeito
cicatrizante desta planta.
Este trabalho tem como objetivo verificar a atividade cicatrizante cutânea do extrato
etanólico de Maytenus officinalis Mabb a 2%, no 14° dia pós operatório (DPO) após lesão
mecanicamente induzida por “punch” metálico dermal, em ratos machos Wistar realizando análise
morfológica, morfométrica e histológica.
MATERIAIS E MÉTODOS
Obtenção do extrato
As folhas recém-colhidas foram submetidas à secagem em estufa de ar circulante à 35 ºC,
até completa desidratação. Em seguida o material vegetal foi moído em moinho de facas e
macerado em frascos âmbar com auxílio de etanol 96 ºGL, por 72 horas. Após esse período, a
solução foi filtrada com auxílio de bomba a vácuo e o filtrado foi concentrado em evaporador
rotatório, sob pressão reduzida à temperatura menor que 40 ºC, até eliminação do etanol. O
solvente recuperado foi adicionado novamente ao mesmo material vegetal triturado e submetido a
uma nova maceração por igual período, sendo novamente filtrado e evaporado. Este
procedimento foi novamente repetido por mais duas vezes. Os concentrados foram
transferidos para placas de Petri e secos em estufa de ar circulante com temperatura inferior
a 35ºC. Após, foram ressuspensos em água, para determinação das doses.
Animais de experimentação
Para o experimento foram utilizados 24 ratos machos da linhagem Wistar, entre 60 e 90
dias de idade, provenientes e mantidos no Laboratório de Experimentação Animal da URI –
Campus de Erechim. Os animais foram acondicionados em caixas separadas, sob condições de
temperatura de 22±2 ºC e um ciclo de 12 h luz/12 h escuro, com acesso à água e
alimentação à vontade. Todos os protocolos utilizados neste experimento foram aprovados pelo
Comitê de Ética em Pesquisa da URI Campus de Erechim, sob o número 021/PIA/2011 e foram
seguidos os Princípios Éticos de Experimentação Animal estabelecidos pela Sociedade
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Brasileira de Ciências em Animais de Laboratório (SBCAL) e Lei Arouca (11794/08). No final
das análises os animais foram eutanasiados em câmara de dióxido de carbono (CO2) e após foram
incinerados.
Atividade cicatrizante
Vinte e quatro ratos machos da linhagem Wistar foram distribuídos aleatoriamente em
três grupos de 8 animais cada: Grupo EXP (Maytenus officinalis), Grupo CTL+ (controle positivo)
e Grupo CTL- (controle negativo). Para a análise histológica foi utilizado um grupo denominado
SEM LESÃO (quarto grupo), o qual foi utilizado um fragmento de pele sem ferimento dos próprios
animais dos três grupos já descritos. Para a indução da lesão tecidual, os ratos foram
submetidos à anestesia intramuscular com Zoletil®50 (50mg/kg) e considerados anestesiados
pela imobilidade do corpo. A seguir realizou-se a tricotomia e anti-sepsia com álcool iodado
a 2%. A indução da lesão tecidual foi na região dorsal por meio de punch metálico dermal
circular. Com este instrumento foi excisado o fragmento cutâneo de 1cm de diâmetro, no centro da
área depilada, até a exposição da fáscia muscular dorsal (cicatrização de segunda intenção) e o dia
da lesão foi considerado o dia 0 (zero) pós operatório. A hemostasia foi realizada por
compressão digital, utilizando-se gaze esterilizada.
Logo após a cirurgia, os animais foram recondicionados nas caixas específicas e
individualizados, de acordo com o seu respectivo grupo, e realizou-se a primeira aplicação
tópica de 0,02mL do extrato etanólico de Maytenus officinalis 2 % para o grupo EXP (Maytenus
officinalis), 0,02mL de Dersani® para o Grupo CTL+ (controle positivo), ambos aplicados
com pipeta automática, na lesão cutânea dos ratos. O grupo CTL- (controle negativo) foi
manipulado igualmente, porém não recebeu nenhum tratamento. O tratamento foi repetido
diariamente, até o 14° dia de pós operatório.
Nos dias 0, e 14°de pós-operatórios, a área lesa da de todos os animais foram analisadas
morfologicamente e morfometricamente. A análise morfométrica consistiu na medida do diâmetro
maior e do diâmetro menor da ferida, com auxílio de paquímetro, para posterior cálculo da
área, utilizando-se a equação matemática: A = π x R x r , onde A representa a área, R o raio maior e
r o raio menor da ferida.
Para a análise morfológica, utilizou-se o método de avaliação do processo cicatricial,
segundo Santos et al. (2005), denominado push (Pressure Ulcer Scale for Healing), que considera os
parâmetros: presença de crosta, reepitelização, esfacelo e granulação. Os resultados foram
transformados em escores de 0 a 4, de acordo com a intensidade do parâmetro avaliado.
No 14° de pós-operatório os ratos foram eutanasiados em câmara de dióxido de carbono
(CO2) e em seguida foram fixados à mesa cirúrgica para a coleta do espécime cirúrgico. A
ferida foi excisada com profundidade até a fáscia muscular. Cada peça foi identificada de
acordo com o grupo a que pertencia, fixada em papel filtro e colocada em solução de formalina a
10% para seguida confecção das lâminas. As quais foram coradas em hematoxilina-eosina,
para avaliação global dos fragmentos de tecido, e em Tricrômico de Mallory, para avaliar da
presença de fibras colágenas, seguida da avaliação histológica em microscopia de luz.
Para a análise microscópica das lesões teciduais coradas em hematoxilina-eosina os
parâmetros avaliados na epiderme foram: presença de crosta, reepitelização e queratinazação;
e na derme: hemorragia, vasodilatação, neovascularização, anexos (folículo piloso, glândula
sebácea e glândula sudorípara) e colagenização (Tricrômico de Mallory).
Os dados obtidos para esses parâmetros acima foram classificados de acordo com a
intensidade em que foram encontrados e transformados em escores: ausente – até 15% (0), muito
pouco – até 20% (1), pouco – até 50% (2), moderado – até 80% (3) e muito intenso – até 100% (4),
de acordo com o seu aspecto histológico.
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Utilizando o sistema de captura Leica IM 50 acoplado ao microscópio (Lambda Lqt – 3),
as imagens histológicas das lesões teciduais foram processadas no software Motic Images Plus
2.0, para que a espessura da epiderme fosse medida. Considerou-se a escala em milímetros (mm).
Análise Estatística
Para análise estatística da morfometria das lesões, utilizou-se o teste não paramétrico de
Mann Witney do ANOVA seguido de Duncan quando necessário. A análise estatística dos dados
referentes à morfologia e histologia foi realizada pelo teste de distribuição não paramétrica de
Kruskal-Wallis, seguido do teste Student – Newmam - Keuls do Bioestat 5.0.
As diferenças entre os grupos foram consideradas estatisticamente significativas quando
p<0,05.
RESULTADOS
Ao longo do período analisado os animais dos diferentes grupos não sofreram quaisquer
complicações ou óbitos e não apresentaram sinais que evidenciassem infecção secundária,
apresentando uma boa recuperação após anestesia.
Análise morfométrica e morfológica da área lesada
Figura 1: Área (mm2) de feridas cutâneas de ratos dos grupos controle negativo, controle
negativo e experimental no 14° DPO. Os dados estão expressos em médias ± desvio padrão.
Tabela 1: Análise morfológica das feridas dos animais dos grupos controle e experimental,
no 14°DPO.
Parâmetro/ Grupos
CTL CTL +
EXP
Valor de p
0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4
Presença de crosta 7 1 0 0 0 7 1 0 0 0 8 0 0 0 0 0,886
0 0 0 1 7 0 0 0 0 8 0 0 0 0 8 0,367
Reepitelização
8 0 0 0 0 8 0 0 0 0 8 0 0 0 0 1,000
Esfacelo
7 1 0 0 0 7 1 0 0 0 8 0 0 0 0 0,886
Granulação
Análise histológica
Tabela 2: Intensidade da reparação tecidual da epiderme e da derme dos diferentes grupos
avaliados no 14°DPO.
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Parâmetros/
Grupos
Epiderme
Derme
CLT +
CTL -
EXP
Valor de p
01234
01234
01234
Presença de crosta
62000
71000
80000
0,69
Reepitelização
00017
00008
00008
0,36
Queratina
04400
01340
00215
0,12
Vasodilatação
80000
71000
80000
0,88
Hemorragia
80000
80000
80000
1,00
Neovascularização
80000
80000
71000
0,88
Folículo Piloso
00620
04400
05210
0,03*
Glândula Sebácea
02600
01610
01700
0,56
Glândula Sudorípara
04310
04400
05300
0,78
04400
26000
01340
53000
00 215
62000
0,12
0,17
Queratina
Colágeno maduro
* Diferença significativa em relação ao grupo CTL -, quando p < 0,05.
Análise da espessura da epiderme
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Figura 2: Espessura (mm) da epiderme de lesões cutâneas de ratos dos diferentes grupos
aos 14° dias pós operatório (DPO). Os dados são expressos em médias ± desvio padrão, avaliados
pelo teste de variância ANOVA, seguida de Duncan (n=8). Considera-se como diferença
significativa quando p < 0,05. a diferença significativa em relação ao grupo CTL-
DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
Na análise morfométrica da área da ferida não foram verificadas diferenças significativas
entre os grupos experimentais em relação aos grupos controles, como mostra a Figura 1.
As lesões de todos os grupos avaliados apresentaram completa reparação tecidual,
exibindo cicatriz com bordos evidentes, porém não mostraram diferenças significativas na
avaliação morfológica (Tabela 1).
A análise histológica das lesões dos animais tratados com o extrato de M. officinalis e com a
droga de referência (CTL+), nos 14 dias de pós-operatório, mostrou um aumento de folículos
pilosos na derme e redução da espessura da epiderme, quando comparadas às lesões dos animais
do grupo controle negativo, o que caracteriza um avanço do processo cicatricial.
O avanço na reepitelização induz consequentemente ao aparecimento de anexos cutâneos, já
que o aparecimento de pelos tem total relação com a epiderme, visto que, os pelos são delgadas
estruturas queratinizadas que se desenvolvem a partir de uma invaginação da epiderme
(JUNQUEIRA, 2011). Considerando a avaliação das lesões dos animais tratados com o extrato de
M. officinalis, a reparação tecidual já estava completa até o 14° dia pós-operatório, pelo fato da
epiderme apresentar-se totalmente reconstituída e a derme possuir intensa presença de folículo
piloso.
Já os outros parâmetros histológicos avaliados não mostraram resultados significativos para
o grupo EXP em relação aos grupos controles (Tabela 2).
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Os grupos CTL+, EXP e o sem lesão apresentaram redução significativa na espessura
da epiderme quando comparados ao grupo de animais pertencentes ao grupo CTL-, o que supõe
uma reorganização das camadas da pele, retornando ao seu estado normal (Figura 2).
Para Shimizu et al. (2009), os taninos, presentes nas folhas de Maytenus officinalis,
possuem a propriedade de precipitar as proteínas de um tecido lesado, formando um
revestimento protetor à ferida, que facilita a cicatrização. Ao precipitar proteínas, os taninos
propiciam um feito antimicrobiano e antifúngico (MONTEIRO, 2005). Embora não tenha sido
realizada a análise fitoquímica do extrato etanólico de Maytenus officinalis Mabb., Oliveira et al.
(2009) já descreve a presença de taninos nas folhas da planta. Este constituinte influenciou
significativamente na reepitelização encontrada no grupo EXP no 14° DPO e consequentemente a
formação de folículos pilosos.
De acordo com alguns estudos a M. officinalis apresenta ação contra úlcera péptica
(CARLINI, 1988; COULAUD-CUNHA et al., 2004; CARVALHO et al., 2008). Baseado nesses
estudos esperava-se a possível atividade cicatrizante desta droga nas lesões cutâneas em ratos.
Carlini (1998) relaciona a ação anti-ulcerogênica da M. officinalis com sua riqueza em taninos e a
identificação de epigalocatequina nos extratos utilizados. Demonstrou ainda, que vários desses
taninos inibem a ATPase de membrana potássio-dependente das células da mucosa gástrica
responsáveis pela secreção de ácido clorídrico no estômago. Segundo Annuk et al. (1999) há um
outro mecanismo de ação anti-úlcerogênica da M. officinalis, relacionado contra a Helicobacter
pylori, frequentemente envolvida em quadros de inflamação e ulceração da mucosa gástrica.
Através desses estudos, verifica-se que os mecanismos envolvidos na atividade contra úlcera, são
diferentes dos mecanismos presentes no processo de reparação tecidual.
CONCLUSÃO
O tratamento tópico do extrato etanólico de Maytenus officinalis 2 % no 14° dia pósoperatório favoreceu a reepitelização estimulando a formação de camadas da epiderme com
presença de folículos pilosos, porém não se mostrou eficaz nas camadas mais profunda da pele.
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