Universidade Estadual do Ceará
Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Faculdade de Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
FAVIANO RICELLI DA COSTA E MOREIRA
DETERMINAÇÃO DE UM TEMPO DE EQUILÍBRIO E
GRADIENTE DE TEMPERATURA NO BENEFICIAMENTO
DO SÊMEN SUÍNO
Fortaleza, Ceará
Dezembro de 2002
Universidade Estadual do Ceará
Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Faculdade de Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
FAVIANO RICELLI DA COSTA E MOREIRA
DETERMINAÇÃO DE UM TEMPO DE EQUILÍBRIO E
GRADIENTE DE TEMPERATURA NO BENEFICIAMENTO
DO SÊMEN SUÍNO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
da Universidade Estadual do Ceará, como
requisito parcial para a obtenção do grau
de Mestre em Ciências Veterinárias.
Área de concentração: Reprodução e
Sanidade animal
Orientador: Dr. Ricardo Toniolli
Fortaleza, Ceará
Dezembro de 2002
Universidade Estadual do Ceará
Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Faculdade de Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
DETERMINAÇÃO DE UM TEMPO DE EQUILÍBRIO E
GRADIENTE DE TEMPERATURA NO BENEFICIAMENTO
DO SÊMEN SUÍNO
FAVIANO RICELLI DA COSTA E MOREIRA
Aprovada em 06/ 12/ 2002
Banca Examinadora:
___________________________
Prof. Dr. Ricardo Toniolli
Orientador
___________________________________
Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva
Co-orientadora/Examinadora
_______________________________
Profa. Dra. Edna Kotzias-Bandeira
Examinadora
Fortaleza, Ceará
Dezembro de 2002
DEDICATÓRIA
Aos meu pais, Fábio e Vilani, por
me darem o apoio e serem
exemplos de vida para que pudesse
alcançar mais esta vitória.
À minha namorada Paula Vivianne
pelas palavras de incentivo e
companheirismo.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter me concedido a existência, razão e a serenidade suficiente para
cumprir mais esta etapa na minha vida profissional.
Aos meus pais, Fábio e Vilani Moreira, por serem os meus maiores incentivadores,
sempre me orientado e indicando o melhor caminho a seguir.
Ao meu irmão, Fábio Jr., e demais familiares pelo apoio incondicional.
À Paula Vivianne, pela paciência, amizade e companheirismo em todos os
momentos.
Ao meu orientador e hoje amigo Ricardo Toniolli pela confiança e incentivos
recebidos.
Aos meus amigos, hoje Mestres, Ana Beatriz Graça Duarte e Jorge Luiz Ferreira
pelos conselhos e apoio.
À toda equipe do Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia do Sêmen: em
especial à Roberta Nogueira Chaves pelas horas e dias ajudando-me no trabalho e
Michelle Costa e Silva, sempre alegrando o ambiente. Sem esquecer de Rodrigo Morais
Fabrício Pessoa, Elton Vasconcelos, Paola Capibaribe, Cristina Vidal, Fabrícia
Vasconcelos, Fernanda Ribeiro, Mayrá Lobato, Daniel Barros, Camila Oliveira, Gabriela
Quieroga, Idsadora Machado e Dennis Diderot sempre postos ajudar.
Aos meus amigos Aníbal Ballarotti e José Luiz Castro Aguiar Filho pela
convivência harmoniosa, onde sempre que precisei pude contar com eles.
Ao departamento de Medicina Veterinária da Escola Superior de Agricultura de
Mossoró pelas inúmeras liberações para que pudesse concluir este mestrado.
Aos meus colegas do mestrado, em especial a Sâmia Nogueira, Ana Paula Moreira,
Jociery Vergara e Kenio Patrício sem esquecer de Isaac Neto, Rosa Patrícia Salles, Ana
Lourdes Vasconcelos, Regiane Rodrigues, Annira Aquino e Annice Aquino sempre
solícitos.
Aos amigos e colegas que consegui fazer em Fortaleza, por me ensinarem o valor
do companheirismo e da gratidão.
Aos funcionários do setor de suinocultura da UECE (Sra. Rocilda, Sr. Tabosa, Sr.
Raimundo, Alíssio e Dinho) pela disposição sempre em ajudar.
Por fim, aos animais, razão maior da nossa profissão, sempre nos ensinando o
verdadeiro valor e sentido da vida.
Muito obrigado.
RESUMO
O avanço tecnológico vivenciado pela suinocultura reflete-se no desenvolvimento de
técnicas de melhoramento das condições de criação dos animais, através da otimização
de variáveis produtivas e reprodutivas. Neste sentido, o presente trabalho buscou dentro
da biotécnica da inseminação artificial desenvolver uma tecnologia de conservação do
sêmen suíno, refrigerado a 17 ºC, a fim de manter a qualidade seminal do
espermatozóide.
Para
tanto,
foram
desenvolvidos
três
diferentes
protocolos
experimentais, com o intuito de haver uma continuidade, buscou-se trabalhar com a
incubação do sêmen após a diluição (Artigos 1 e 2) e antes da diluição (Artigo 3). Os
parâmetros qualitativos de análise foram o vigor (0-5), a motilidade (0-100%) e as
alterações acrossomais (0-100%) dos espermatozóides. Os dados foram analisados
através dos testes Mann-Whitney, para o vigor e a motilidade; e o teste “t” de student,
para as alterações morfológicas, todos ao nível de significância de 5%. Nos trabalhos
com incubação pós-diluição, evidenciou-se que a incubação do sêmen diluído não
aumentou o tempo de viabilidade dos espermatozóides. Porém, se o sêmen for utilizado
no dia de coleta, a incubação preserva um maior número de células com índices de
vigor e motilidade. Outra observação importante foi a determinação do momento da
diluição como o ponto crítico durante o processamento do sêmen suíno. No trabalho
com o sêmen in natura, evidenciaram-se resultados estatisticamente significativos da
influência positiva que a incubação dos espermatozóides no seu próprio plasma seminal
traz sobre a qualidade do ejaculado. Neste experimento, encontrou-se como melhor
resultado a incubação do sêmen puro no seu próprio plasma seminal a 25 ºC por 1 hora.
Os resultados obtidos nestes experimentos abrem como perspectivas a necessidade de
se delimitar com exatidão as modificações pelas quais os espermatozóides passam
durante o processo de incubação, principalmente com o sêmen in natura, a fim de que
se possa aumentar o tempo de conservação das doses inseminantes e difundir a
biotécnica de inseminação artificial no nordeste brasileiro.
Palavras-chave: Sêmen, in natura, suíno, incubação, refrigeração.
ABSTRACT
The growing advanced technology within pig raising reflects on the developing
techniques of improving the animal breeding conditions through the various improving
productions and reproductions. Therefore, this work searched in the biotechnique of
artificial insemination the development of a technology to preserve the swine semen cooled
at 17 ºC to maintain the seminal quality of the spermatozoa. Therefore, three different
registered experiments were made with the aim to have a continuity wich made the work
with the incubation of the semen after a dilution (Articles 1 and 2) and before the dilution
(Article 3). The qualitative parameters of analysis were the vigour (0-5), the motility (0100%) and the acrossome alterations (0-100%) of spermatozoa. The results were analyzed
through Mann-Whitney test (5%), for the vigor and the motility and the student test t about
the morphology alterations, all important level of 5%. When worked with incubation after
the dilution which showed that incubation of the diluted semen did not increase the time of
spermatozoa viability. However, if the semen is used on the day of collection, the
incubation preserve a larger numbers of cells with vigour and motility. Another important
observation was the determination of the dilution moment, which was the critical point
during the swine semen process. Working with the in natura semen, showed important
statistic results and positive influence that the quality of this semen incubation in its own
seminal plasma improved. This experiment, showed the best incubation of pure semen in its
own seminal fluid, at 25 ºC in one hour. The obtained results from these experiments open
perspectives and necessity, to label with precision, the modifications which the
spermatozoa pass during the incubation process, specialy, with the in natura semen, to
increase the preservation time of the inseminated doses, and spread the biotechnical
knowledge of artificial insemination to the northeastern brazilian.
Keywords: Semen, in natura,swine, incubation, cooling.
SUMÁRIO
Introdução
01
Revisão de literatura
03
1) Importância da inseminação artificial na cadeia produtiva suinícola
03
2) Estágio atual da inseminação artificial suína
03
3) Alterações da membrana plasmática espermática durante o resfriamento
05
4) A influência do resfriamento gradual sobre a qualidade espermática suína
08
5) A importância do plasma seminal no processo de incubação
11
Justificativa
13
Objetivos
14
Objetivo geral
14
Objetivos específicos
14
Experimentos realizados
Artigo 1
15
Artigo 2
23
Artigo 3
44
Conclusões
58
Perspectivas
59
Referências bibliográficas
60
Anexos
66
INTRODUÇÃO
A suinocultura brasileira apresenta potencial para um crescimento bastante
significativo, quando comparado a outros países, os quais não possuem o tamanho
territorial, o clima tropical e a aptidão natural ao desenvolvimento da agropecuária. Isto se
evidencia pelo fato da carne suína ser a mais consumida no mundo (DESCHAMPS et al.,
2000).
A suinocultura moderna dispõe de várias maneiras para otimizar a criação de
animais baseados em fatores e padrões produtivos e reprodutivos. Atualmente, as principais
tecnologias de produção são baseadas na moderna genética, nutrição separada por sexo e
por fase de crescimento, desmame precoce, controle informatizado da produção e a
inseminação artificial, onde esta última já é uma biotécnica reprodutiva bem estabelecida e
aplicada nas criações (SOBESTIANISKY et al., 1998).
Tal biotécnica está atualmente difundida em muitos países como uma ferramenta
de aplicação comercial, amplamente utilizada na suinocultura (BORTOLOZZO &
WENTZ, 2002). Pequenos, médios e grandes produtores recorrem a esta prática como
técnica usual de manejo reprodutivo, buscando elevar a eficiência do rebanho e otimizar o
retorno econômico da atividade pecuária, através da introdução de material genético de alto
valor, além de diminuir o risco de transmissão de doenças, reduzir os espaços e custos pela
diminuição do número de reprodutores (SOLTI & WEKERLE, 1995 e SCHEID, 1997),
aumentando a eficiência reprodutiva e diminuindo os custos por cobertura/fêmea
(DESCHAMPS et al., 2000). Atualmente, 24,1 milhões de matrizes são inseminadas no
mundo, o que representa 48 % das fêmeas alojadas (WEITZE, 2000).
A viabilidade do sêmen suíno é inferior àquela encontrada em outras espécies
animais (BWANGA et al., 1992). Isto se deve à sua sensibilidade, tanto ao envelhecimento
quanto ao choque térmico, devido à fragilidade do seu acrossomo (PURSEL et al., 1972 e
MIES FILHO, 1987). Vários trabalhos foram desenvolvidos no sentido da obtenção de um
diluidor e um método que viabilize e preserve o sêmen por um período superior a três dias
(WEITZE, 1990 a e b), mantendo ainda as suas condições qualitativas (vigor, motilidade e
morfologia) necessárias para a inseminação, bem como, taxas aceitáveis de fertilidade.
Dentre estas pesquisas para se aumentar o tempo de conservação da dose de
sêmen, está a incubação e a taxa de refrigeração do ejaculado, onde, diminuir-se-ia a
sensibilidade do espermatozóide ao choque térmico (frio - KOTZIAS-BANDEIRA, 1999),
através de um abaixamento lento da temperatura entre os patamares de 35 e 17 °C,
fornecendo ao espermatozóide uma maior resistência de quando diluídos e refrigerados de
maneira direta (WATSON & PLUMMER, 1990). A utilização deste abaixamento lento já é
realizada em protocolos de congelação do sêmen suína (PAQUIGNON et al., 1987), no
entanto, com relação ao sêmen refrigerado à temperatura de 17 °C, a utilização de um
abaixamento lento ainda não foi definida entre os pesquisadores.
A partir de agora será realizada uma breve revisão de literatura, onde serão
levantados pontos de interesse para um embasamento das discussões sobre o trabalho.
REVISÃO DE LITERATURA
1) IMPORTÂNCIA DA INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL NA CADEIA PRODUTIVA
SUINÍCOLA
Com o crescimento econômico, a necessidade de geração de maiores riquezas fez
com que o mundo inteiro se desenvolvesse. Na tentativa de reduzir os custos envolvidos
na cadeia produtiva, aumentar o padrão genético e a qualidade do produto, foi
introduzida a inseminação artificial (IA) na suinocultura (CASTAGNA et al., 2001). No
Brasil, a IA em escala comercial foi introduzida somente a partir de 1975,
principalmente na região sul do país, devido a uma forte concentração de criadores com
alto nível de tecnificação e taxas elevadas de produtividade (SCHEID, 1992). No país, o
uso desta biotécnica em grande escala é relativamente recente, sendo que
aproximadamente 50% das fêmeas alojadas em granjas tecnificadas são inseminadas
artificialmente (WENTZ et al., 2000).
O crescente aumento do uso da IA, particularmente desde 1990, deve-se ao fato de
que o maior domínio da técnica propicia uma maior demanda por suínos de alta
qualidade genética, fazendo com que estes animais possam ter uma maior
produtividade, principalmente, no beneficiamento de suas carcaças com índices cada
vez menores de gordura (Suíno Light) (JOHNSON et al., 2000). A utilização da IA
promove uma série de vantagens quando comparada com a monta natural. Dentre estas
vantagens, os ganhos advindos da melhoria genética são os que possuem a maior
importância. Como exemplo desta melhoria, é possível citar o maior rendimento de
carne e, conseqüente aumento na bonificação da carcaça, melhoria na eficiência
alimentar, maior ganho de peso e otimização de instalações (CASTAGNA et al., 2001).
2) ESTÁGIO ATUAL DA INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL SUÍNA
A qualidade espermática é essencial para o sucesso da IA, sendo também
influenciada por vários parâmetros genéticos e ambientais, tais como: idade,
individualidade, luminosidade (sêmen), temperatura (coleta e conservação), manejo,
nutrição, frequência de coleta e diluidores utilizados. O cuidado com estes parâmetros
está correlacionado com a presença de uma ou mais anormalidades no ejaculado
(BONET et al., 1993).
Atualmente, o diluidor mais rotineiramente utilizado na preservação do sêmen
suíno, e que apresenta os melhores resultados de vigor, motilidade e morfologia, além
de uma melhor relação custo-benefício é o diluidor de Beltsville (BTS - PAQUIGNON
et al., 1987; BLICHFELD et al., 1988; JOHNSON et al., 2000). Ele fornece um
ambiente nutritivo e adequado (acidez e osmolaridade), podendo o sêmen com ele
diluído ser utilizado por até 3 (três) dias após a coleta, quando conservado em
temperaturas entre 15-18 ºC (ALTHOUSE et al., 1998).
Apesar das inúmeras vantagens apresentadas sobre a IA, dentre as espécies de
interesse comercial, provavelmente, os suínos são os que apresentam as maiores
dificuldades quanto ao uso desta biotécnica (CASTAGNA et al., 2001). As principais
limitações enfrentadas para o uso da IA (quando comparadas às demais espécies
domésticas) podem ser resumidas em:
a)
O sêmen suíno é sensível a baixas temperaturas, fazendo com que o
armazenamento da dose seja comprometido;
b)
Devido à temperatura de armazenamento e aos componentes habituais dos
diluentes de sêmen, a dose inseminante pode se tornar fonte de crescimento
bacteriano;
c)
Baixo rendimento de doses inseminantes e fêmeas servidas por ejaculado;
d)
A meia vida espermática dentro do trato genital feminino é inferior a um dia;
e)
A variabilidade da duração do estro podendo ser de 12 a mais de 96 horas,
inviabiliza uma única inseminação;
f)
Existe uma grande variação no momento da ovulação, sendo que esta ocorre
normalmente dentro do estro, impossibilitando, no atual estágio de
conhecimento, a utilização de somente uma inseminação por cio.
3) ALTERAÇÕES DA MEMBRANA PLASMÁTICA ESPERMÁTICA DURANTE
O RESFRIAMENTO
Como com outras espécies animais, nas quais a conservação do sêmen é
rotineiramente realizada, a refrigeração do sêmen contribui na preservação da sua
longevidade pela diminuição da atividade metabólica da célula espermática, a qual leva a
uma significativa redução do consumo de energia (ALTHOUSE et al., 1998). O
espermatozóide suíno é particularmente sensível à refrigeração, com menor tolerância à
queda de temperatura do que é observado nos espermatozóides de outras espécies
domésticas, como o garanhão ou o touro. Esta sensibilidade ao choque térmico é
caracterizada por uma irreversível perda da permeabilidade seletiva e integridade da
membrana plasmática, levando a uma perturbação do metabolismo espermático e
conseqüente morte da célula (ALTHOUSE et al., 1998).
No choque térmico, o principal dano se dá na membrana plasmática, a qual sofre
alterações, resultando no extravasamento do conteúdo celular de forma irreversível. Esta é a
explicação para o fato do espermatozóide bovino ser menos sensível ao choque térmico que
o suíno, ou seja, a organização e composição da sua membrana celular externa torna a sua
membrana plasmática mais consistente (JOHNSON et al., 2000). Outras organelas como as
mitocôndrias e o acrossomo são afetados também pelo choque térmico (WATSON &
PLUMMER , 1990).
Vale salientar que ao se reportar aos efeitos do choque térmico sobre a organização
da membrana, entenda-se resfriamento e reaquecimento, os quais, comprometem as
associações lipídio-lipídio e lipídio-proteína, interferindo na função e integridade da mesma
(PARKS & GRAHAM, 1992).
A comunicação entre a célula e o meio externo é mediada pela membrana
plasmática. O modelo proposto do mosaico fluido demonstra que a comunicação poderia
ser afetada pela habilidade das moléculas dentro da membrana de interagir com cada outra
e com o citoplasma e/ou meio extracelular (CAVIN & BUHR, 1989).
A membrana plasmática é essencial para a célula, ela a envolve, define seus limites,
mantendo as diferenças entre o citosol e o meio extracelular. As propriedades biológicas e
biofísicas das membranas, incluindo a dos espermatozóides, são determinadas pela sua
composição molecular. A membrana plasmática é de especial interesse nas ciências clínica
e animal por causa da fusão de suas membranas durante o resfriamento e o congelamento
(PARKS & GRAHAM, 1992). Admite-se que as membranas dos espermatozóides ajustamse ao modelo do mosaico fluido, com proteínas integrais dispersas através de uma bicamada
de lipídios polares (SINGER & NICHOLSON, 1972; PARKS & GRAHAM, 1992).
Por serem estruturas dinâmicas e fluidas, a maior parte das moléculas da membrana
plasmática são capazes de mover-se no plano da mesma, com as moléculas lipídicas
dispostas como uma dupla camada contínua. Essa bicamada lipídica fornece a estrutura
básica da membrana e atua como barreira impermeável à passagem da maioria das
moléculas hidrossolúveis. As moléculas de proteínas dissolvidas na bicamada lipídica
intermediam a maioria das outras funções da membrana. As membranas celulares são
assimétricas, ou seja, a composição de lipídios e proteínas das faces externa e interna são
diferentes umas das outras (ALBERTS et al., 1997 apud NASCIMENTO et al., 1998).
A composição lipídica da membrana, quando sofre os efeitos do choque térmico, é
afetada através da alteração de sua fluidez. Com a temperatura baixa, há a restrição do
movimento lateral dos fosfolipídeos de membrana resultando numa transição da fase fluida
para a de gel (BUHR et al., 1994; WATSON, 1996 apud JOHNSON et al., 2000). Devido
às diferenças de temperatura de transição para os diferentes lipídeos de membrana,
separações de fase podem ocorrer, onde as proteínas tornar-se-iam agrupadas
irreversivelmente (DE LEEUW et al., 1990). A partir do relato das pesquisas, têm-se como
premissa que a resposta particular de cada membrana celular à baixa temperatura está
intrinsecamente relacionada com a composição da membrana de cada célula (JOHNSON et
al., 2000), já que existe mudança lipídica na membrana espermática durante o trânsito
epididimário e em eventos pré-fertilização. Por esta razão é que estas mudanças lipídicas
estão associadas com a sensibilidade do espermatozóide ao choque térmico (BUHR et al.,
1994), nas diversas espécies animais (JOHNSON et al., 2000).
Outro fator que influencia o comportamento termotrópico da membrana é a
percentagem de colesterol. A taxa de colesterol/fosfolipídios no espermatozóide suíno é
muito baixa, sendo ainda o colesterol distribuído de forma assimétrica, estando mais
presente na camada externa que na interna da membrana. Esta combinação poderia render,
especialmente na camada interna, uma maior vulnerabilidade ao choque térmico. A
reorganização
da
célula
pós-choque
interfere
no
aumento
da
permeabilidade
(extravasamento de cátions e enzimas), redução na atividade enzimática e difusão
controlada dos processos da membrana e mudanças no movimento lateral nos canais
iônicos (DE LEEUW et al., 1990).
As moléculas de colesterol aumentam as propriedades de barreira da membrana
plasmática, diminuindo a mobilidade de fosfolipídios, conseqüentemente a bicamada
lipídica fica menos deformável. Desse modo, o colesterol inibe possíveis transições de fase
(DARIN-BENNET & WHITE, 1978).
Um modelo de ação do colesterol é citado por CROSS (1998), onde, com a sua
ausência, ocorre a exposição de um receptor para manose na superfície espermática. Foi
proposto que o receptor funciona em uma interação com a zona pelúcida do óvulo. Isto,
devido ao fato de se saber que: 1) manose e proteínas manosiladas interferem com a união
do espermatozóide com a zona pelúcida, induzindo à reação acrossomal, e 2) a zona
pelúcida contém manose.
Ainda que os ácidos graxos e os fosfolipídios da membrana determinem o
comportamento da mesma, as diferenças mais marcantes estão no tipo de fosfolipídios
encontrados entre os espermatozóides do varrão e o touro, onde, no suíno encontra-se uma
baixa percentagem de fosfatidilcolina e altas percentagens de fosfatidiletanolamina e
esfingomielina (JOHNSON et al., 2000).
Em conseqüência do choque térmico, lesões irreversíveis são observadas
especialmente no acrossomo com desprendimento e perda de conteúdo (PURSEL et al.,
1972; NASCIMENTO, 2001). Quanto maior o desconforto, maior a percentagem de células
lesadas, especialmente quando se usa diluidores salinos como o BTS e o KIEW. O choque
térmico causa perda de proteínas, redução de motilidade e do metabolismo e aumento de
permeabilidade da membrana plasmática, acarretando desequilíbrio iônico, com maior
concentração dos íons Ca++, Na++ e Zn++ intracelularmente e uma perda de K++ e Mg++
(WATSON, 1996 apud NASCIMENTO, 2001; HUO et al., 2002). A membrana plasmática
da cabeça do espermatozóide suíno recém ejaculado mostra mudanças únicas na sua
fluidez, que são dependentes do Ca++ e da temperatura, onde, processos como a
criopreservação alteram esta característica (BUHR et al., 1994).
Segundo DE LEEUW et al. (1990), as principais alterações na célula espermática
devido ao resfriamento são:
1) Alterações morfológicas
a) Rompimento da membrana plasmática
b) Degeneração do acrossomo
c) Danos mitocondriais
2) Alterações bioquímicas
a) Perda da permeabilidade seletiva da membrana
a.1) Retenção intracelular de íons sódio e cálcio
a.2) Perdas de íons magnésio e potássio
a.3) Liberação de enzimas
a.4) Liberação de fosfolipídios
b) Decréscimo da atividade respiratória e da glicólise
b.1) Redução dos níveis de ATP
b.2) Perda da motilidade
c) Degeneração do DNA
Por outro lado, a viabilidade das células após o resfriamento e o reaquecimento é
determinada pela:
a) Taxa de resfriamento;
b) Duração da incubação durante a queda de temperatura;
c) A temperatura final atingida;
d) Aditivos;
e) Maturação espermática.
4) A INFLUÊNCIA DO RESFRIAMENTO GRADUAL SOBRE A QUALIDADE
ESPERMÁTICA SUÍNA
O sêmen suíno é caracterizado pela baixa viabilidade quando armazenado por um
período superior a cinco dias (JOHNSON et al., 2000; YOSHIDA, 2000). Neste sentido,
várias são as tentativas de se aumentar este tempo de conservação, entre as quais, pode-se
citar: a composição dos diluidores (FLOWERS, 1992; TONIOLLI, et al., 1996; KUSTER
& ALTHOUSE, 1999; MOREIRA et al., 2000), a temperatura de conservação (POLGE,
1956; PURSEL et al.,1973a), a taxa de diluição (PEREZ-MARCOS et al., 1991) e
diferentes curvas de abaixamento de temperatura empregadas entre a coleta e a conservação
do sêmen (BUHR et al., 1994; MOREIRA et al., 2001a). As quedas rápidas e diretas (sem
incubação em temperaturas intermediárias) da temperatura (35 à 17 ºC) causam perdas à
qualidade dos espermatozóides, enquanto que o abaixamento lento (com incubação em
temperaturas intermediárias) fornece resistência à célula espermática (WATSON &
PLUMMER, 1990).
A determinação da taxa de resfriamento para os espermatozóides de diversas
espécies é assunto importante para a sobrevivência espermática no sêmen diluído e
resfriado. O sêmen suíno diluído e mantido por várias horas a 37 ºC ou à temperatura
ambiente pode mostrar problemas que comprometem a sua fertilidade (NASCIMENTO et
al., 1998).
Segundo SILVA FILHO (1994) apud NASCIMENTO et al. (1998), o choque
térmico caracteriza-se pela presença de espermatozóides com movimentação atípica, perda
prematura de motilidade e energia, maior permeabilidade de membranas e perda de
moléculas e íons intracelulares.
A diferença entre espécies quanto à susceptibilidade já é fator conhecido. Além
disso, existem também diferenças entre indivíduos da mesma espécie, bem como entre
ejaculados do mesmo animal (PURSEL et al., 1973a)
O fato do espermatozóide suíno ser muito sensível ao choque térmico é bastante
conhecido, isto ocorre quando o ejaculado fresco é rápida e diretamente resfriado até a
temperatura de conservação (15 ºC), a qual resulta em perda da viabilidade de um número
maior de espermatozóides (JOHNSON et al., 2000). Os danos celulares resultantes da
rápida refrigeração são comuns, onde o sinal mais óbvio verificado no espermatozóide é
uma irreversível perda da sua motilidade (WATSON & PLUMMER, 1990).
No sêmen suíno, esta perda ou diminuição da motilidade é manifestada
imediatamente após a ejaculação, onde as células tornam-se progressivamente menos
sensíveis ao choque térmico por um período de poucas horas (PURSEL et al., 1972;
WATSON, 2000). O sêmen suíno incubado à temperatura ambiente no seu próprio plasma
seminal torna-se resistente ao choque térmico por até 16 horas pós-ejaculação (TAMULI &
WATSON, 1994 apud WATSON, 2000). POLGE (1956) relata que o espermatozóide da
fração rica do sêmen tolera uma refrigeração lenta e é mais resistente ao choque térmico do
que os espermatozóides no ejaculado total. O desenvolvimento da resistência durante a
incubação é influenciado pelo pH, diluição e composição do diluidor (BWANGA, 1991).
Segundo NASCIMENTO (2001), o dano ocasionado pelo choque térmico é mais
perceptível nos espermatozóides recém ejaculados, os quais são mais sensíveis ao choque
térrmico do que aqueles incubados a 30 ºC por um período de 4 a 7 horas. PURSEL et al.
(1972), também estudando o efeito do abaixamento gradual da temperatura, observaram
que os espermatozóides suínos incubados de 25 à 30 ºC por 12-14 horas tornam-se muito
mais resistentes a baixas temperaturas.
Assim como a resistência ao choque térmico, observou-se que a percentagem de
espermatozóides móveis e com integridade acrossômica foram maiores, nos ejaculados que
sofreram um resfriamento gradual em relação ao rápido (WEBER, 1989 apud WATSON &
PLUMMER, 1990). Neste mesmo raciocínio, WATSON & PLUMMER (1990) mostraram
que a proporção de células mostrando alterações morfológicas (membrana plasmática,
acrossomo) foi maior nos ejaculados que foram submetidos a um choque térmico mais
intenso. Pelos dados dos presentes autores, a partir de 30 ºC (temperatura de diluição), o
sêmen foi mantido a 24, 16, 8, 4 e 0 ºC, e nestas temperaturas a percentagem de membrana
plasmática intacta foi de 86; 73,5; 11; 0 e 0%, respectivamente, mostrando que no choque
térmico (rápido) há o decréscimo na qualidade seminal dos varrões.
É possível minimizar os efeitos do choque térmico, incubando o sêmen na diluição
de 1: 1 por 24 horas e a 15 ºC. Porém, deve-se levar em consideração que na incubação por
longo período há o envelhecimento dos espermatozóides e o aumento da atividade
metabólica
que
podem
comprometer
o
poder
fecundante
do
espermatozóide
(NASCIMENTO, 2001).
Portanto, o abaixamento gradual da temperatura até a faixa final de estabilização
(15-17 ºC) é uma situação que pode minimizar os malefícios provocados pelo choque
térmico. Segundo WEBER (1989) apud NASCIMENTO (2001), um rápido abaixamento
da temperatura do sêmen diluído, de 35 para 15 ºC, leva a uma significativa perda da
motilidade, enquanto que uma taxa de refrigeração lenta (volumes de 100ml) a passos de
10ºC confere uma resistência ao espermatozóide suíno contra o choque térmico. Ao mesmo
tempo, uma pré-incubação de pelo menos 24 h antes de um possível abaixamento da
temperatura a níveis abaixo de 15 ºC fornece, também, resistência ao choque térmico.
Segundo PETROUKINA et al. (1997), citado por JOHNSON et al. (2000), o estudo
da interação da membrana-meio-temperatura durante a incubação e conservação do sêmen
poderia aumentar os conhecimentos de como prevenir ou reduzir os efeitos da refrigeração.
5) A IMPORTÂNCIA DO PLASMA SEMINAL NO PROCESSO DE INCUBAÇÃO
Segundo MAXWELL & JOHNSON (1999), conseguiu-se gestação em ratas pela
monta natural, após a retirada da próstata ou das glândulas vesiculares, mas não através da
retirada de ambas as glândulas. Conforme os mesmos autores, sabe-se que durante algum
tempo, o plasma seminal possui uma função na promoção da fertilidade, à parte de sua
função como diluente e veículo para o espermatozóide, exercendo um efeito estimulante na
motilidade espermática no momento da ejaculação. Isto se deve à ativação do
espermatozóide pela presença de substâncias específicas nas diferentes secreções das
glândulas anexas.
A composição do plasma seminal inclui componentes inorgânicos, aminoácidos,
peptídeos, proteínas de alto e baixo peso molecular, variando com a espécie, intervalo entre
coletas e saúde do animal (MAXWELL & JOHNSON, 1999). As pesquisas de CATT et al.
(1997) apud MAXWELL & JOHNSON (1999) de que o BTS poderia manter a viabilidade
do espermatozóide do varrão e do carneiro, com ou sem a adição do plasma seminal, sugere
que simples componentes metabólicos ou iônicos e protéicos, podem se constituir nos mais
importantes componentes do plasma seminal, para a manutenção da viabilidade celular.
ASHWORTH et al. (1994) apud MAXWEEL & JOHNSON (1999) mostraram que
o espermatozóide do ovino morre rapidamente após extensiva diluição na ausência do
plasma seminal, mas que a motilidade é mantida quando o meio diluidor é suplementado
com uma quantidade de 10% de plasma seminal homólogo.
A afirmação de VISHWANATH & SHANNON (1997) e MAXWELL &
JOHNSON (1999) de que a função do plasma seminal como um meio de suporte para o
espermatozóide é pelo menos ambíguo se não contraditório, é devido aos vários trabalhos
na literatura que discorrem sobre a importância do plasma in vivo e in vitro.
Em algumas espécies, a fertilidade tem sido melhorada após a diluição com plasma
seminal (rato e coelho). Mudanças na composição do plasma seminal após a remoção das
glândulas sexuais acessórias podem ter uma ação negativa sobre a fertilidade (rato, hamster,
camundongo). Em contraste, alguns estudos demonstram uma redução na fertilidade após a
exposição do espermatozóide ao plasma seminal (suíno, bovino, caprino, ovino, eqüino,
coelho e humano). A variação da concentração de, provavelmente proteínas do plasma
seminal, está associada com a melhoria (rato e coelho) ou não (suíno, bovino, caprino,
ovino, eqüino, coelho e humano) da fertilidade espermática. O fato da maior parte do
plasma seminal não acompanhar o espermatozóide durante o seu trânsito até o local de
fecundação no trato reprodutivo feminino sugere que a remoção é necessária para a
aquisição da capacidade fertilizante, e isto pode ser um importante fator no processo de
capacitação (MAXWELL & JOHNSON, 1999).
O plasma seminal tem sido associado com a susceptibilidade ao choque térmico,
devido provavelmente, às ligações de proteínas básicas da membrana celular espermática,
onde os fatores de proteção e sensibilidade são apontados como funções do plasma
(BWANGA, 1991).
In vivo, o plasma seminal influencia a fisiologia dos espermatozóides, aumentando
a sua motilidade, sua estabilidade de membrana e sua capacidade para resistir à
descondensação prematura da cromatina. In vitro, a remoção do plasma seminal por
centrifugação, é praxe nos protocolos de criopreservação. Porém, com o sêmen na forma
refrigerada, esta assertiva parece não encontrar respaldo entre os pesquisadores (PURSEL
et al., 1972; TAMULI & WATSON, 1994 apud RODRIGUEZ-MARTINEZ &
ERIKSSON, 2000). Em ovinos, segundo BARRIUS et al. (2000), os danos estruturais na
membrana plasmática de espermatozóides causados pelo choque térmico parecem ser
revertidos após serem incubados com proteínas presentes no plasma seminal, tais proteínas
parecem
restaurar
as
características
funcionais
da
espermatozóides após serem submetidos ao choque térmico.
membrana
plasmática
dos
JUSTIFICATIVA
A redução de custos dentro de qualquer segmento econômico é uma meta
constantemente perseguida. A suinocultura, inserida no agronegócio brasileiro, é vista
como atividade altamente produtiva e tecnificada. A inseminação artificial, utilizada como
ferramenta para diminuir os custos da atividade e melhorar o rendimento dos animais busca
aliar as necessidades do setor produtivo com as pesquisas realizadas nos centros
universitários e de pesquisa.
O curto período de preservação da dose inseminante suína impede a disseminação
da biotécnica para regiões distantes das principais centrais produtoras de sêmen. Isto
ocorre, uma vez que, os protocolos atuais de preparo das doses utilizam como rotina o
abaixamento rápido ou direto do ejaculado entre as temperaturas de 37 e 15 ºC. O tempo de
estabilização gradual do sêmen, já utilizado quando se congela os espermatozóides, tende a
conservar por um período mais prolongado o poder fecundante do ejaculado suíno utilizado
na inseminação artificial, sendo este fato uma ferramenta suplementar para a difusão da
biotécnica entre os criadores do nordeste brasileiro, promovendo um melhoramento
genético do rebanho suíno. O melhor conhecimento das técnicas de beneficiamento do
sêmen contribuirá para uma maior expansão tecnológica da suinocultura, podendo
incrementar a produtividade numérica e ponderal do rebanho, propiciando ao sistema
produtivo e particularmente aos suinocultores cearenses, uma melhor estabilização da
relação custo/benefício.
OBJETIVOS
Geral
Desenvolver uma tecnologia de conservação do ejaculado suíno refrigerado a 17 ºC
que possa manter a qualidade seminal in vitro por um período superior a três dias.
Específicos
¾
Verificar quais as faixas de temperatura de maior sensibilidade para o
espermatozóide suíno;
¾
Identificar qual a melhor relação entre temperatura e tempo de estabilização
do sêmen suíno diluído, visando uma menor queda nos valores de vigor, motilidade
e alterações morfológicas;
¾
Avaliar a influência da incubação do sêmen “in natura” no processo de
conservação;
¾
Gerar condições para uma conservação mais prolongada de dose de sêmen,
sem prejuízo de sua qualidade in vitro;
ARTIGO 1
TEMPOS DE EQUILÍBRIO NO PROCESSAMENTO DO SÊMEN SUÍNO
Faviano Ricelli da Costa e Moreira; Ricardo Toniolli; Ana Beatriz Graça Duarte.
Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.25, n.3, p. 444-446, 2001.
TEMPOS DE EQUILÍBRIO NO PROCESSAMENTO DO SÊMEN SUÍNO
Moreira, F. R. C.; Toniolli, R.; Duarte, A. B. G.
Universidade Estadual do Ceará – UECE
E-mail: [email protected]
RESUMO
O espermatozóide suíno é bastante sensível ao envelhecimento e ao choque térmico e um
fator que pode torná-lo mais resistente é a utilização de uma técnica de abaixamento
gradual de temperatura. Portanto, o presente trabalho objetivou encontrar uma metodologia
de resfriamento gradual a fim de conservar o poder fecundante do espermatozóide. Para
tanto, foi utilizado o sêmen de quatro reprodutores, que foram divididos entre seis lotes.
Lote A: Sêmen diluído à 35 ºC e colocado à 17 ºC ; Lote B: Diluição à 35 ºC, 25 ºC por 30
min e posto à 17 ºC; Lote C: Diluição à 35 ºC, 25 ºC por 1 h e posto à 17 ºC; Lote D:
Diluição à 35 ºC, 25 ºC por 2 h e posto à 17 ºC; Lote E: Diluição à 35 ºC, 25 ºC por 4 h e
posto à 17 ºC; Lote F: Diluição à 35 ºC, 25 ºC por 6 horas e posto à 17 ºC. Após estes
tratamentos todos os lotes foram estocados durante sete dias, dos quais quatro foram de
análise (D0, D1, D4 e D7), onde a cada dia de análise, fizeram-se leituras de vigor e
motilidade aos 5 e 120 min. de incubação à 37 ºC. Não houve diferenças estatísticas entre
os lotes do experimento, porém, quando analisado o comportamento dos lotes, notou-se que
o lote E foi o que se apresentou de forma mais regular, porém, estes dados não
demonstraram significativamente que os períodos de incubação resultam em melhorias da
viabilidade espermática, apenas perspectivas para que novos experimentos possam
confirmar esta tendência de aumento da resistência.
Palavras Chaves: Sêmen, Suíno, Tempos de equilíbrio
EQUILIBRIUM TIME ON SWINE SEMEN MANAGEMENT
SUMMARY
The swine spermatozoa is sensible to cold shock and aging and a factor that can become the
spermatozoa more resistant is the utilization of a slower cooling, therefore the aim of this
study was find a metodology of slower cooling to conserv the spermatozoa fecundant
potential. For this, the semen from four boars was utilized, and divided in six treatments
(Trial A: Semen extended at 35 ºC and stored at 17 ºC; Trial B: Semen extended at 35 ºC,
30 min at 25 ºC and stored at 17 ºC; Trial C: Semen extended at 35 ºC, 1h at 25 ºC and
stored at 17 ºC; Trial D: Semen extended at 35 ºC, 2h at 25 ºC and stored at 17 ºC, Trial E:
Semen extended at 35 ºC, 4h at 25 ºC and stored at 17 ºC; Trial F: Semen extended at
35 ºC, 6 h at 25 ºC and stored at 17 ºC). After this treatments, all trials was stored for seven
days, and each day of analysis(D0, D1, D4, and D7), the vigor and motility was measured
at 5 and 120 min. of incubation at 37 ºC. No statisticals differences was found, but was
observed that behavior of trials with incubation, in special, the Trial E showed more regular
behavior. The datas presented here didn´t shown that incubation periods result in better
viability of spermatozoa, only perspectives that new experiments could confirm this
tendency of a increase of resistance.
Key Words: Semen, Swine, Equilibrium Time
INTRODUÇÃO
A suinocultura moderna dispõe de várias maneiras para otimizar a criação de
animais baseados em padrões produtivos e reprodutivos. Na vanguarda das tecnologias
utilizadas está a inseminação artificial, a qual já é uma biotécnica bem estabelecida e
aplicada (Sobestiansky et al, 1998), apesar da menor viabilidade do sêmen suíno em
relação a outras espécies (Bwanga et al., 1992). Isto se deve ao fato do espermatozóide do
varrão ser muito sensível ao envelhecimento e ao choque térmico, principalmente devido à
fragilidade do seu acrossomo (Mies Filho, 1987; Pursel et al., 1972). Esta é a razão pela
qual a inseminação artificial suína é realizada em sua grande maioria com o sêmen na
forma líquida à temperatura entre 15 e 20 ºC, conservado por até 5 dias (Johnson et al,
2000).
Porém, quando o processamento do sêmen é realizado por várias horas, o
espermatozóide adquire uma resistência gradual ao choque térmico (Pursel et al., 1973a).
O abaixamento de temperatura (35 para 15 ºC) do sêmen leva a uma significativa perda da
motilidade, enquanto que a refrigeração lenta fornece uma resistência ao ejaculado
(Johnson et al., 2000). O presente trabalho teve por objetivo estabelecer um protocolo de
abaixamento de temperatura no processamento do ejaculado suíno a fim de conservar o seu
poder fecundante.
MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi executado no Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia do
Sêmen (LRSTS) da Universidade Estadual do Ceará – UECE.
Foram utilizados 22
ejaculados coletados pela técnica da mão enluvada, sendo o ejaculado diluído em no
diluidor de Beltsville (BTS) e dividido entre 6 lotes: Lote A: Constituiu-se o lote controle,
onde o sêmen diluído em BTS à 35 ºC → geladeira à 17 ºC; Lote B: Sêmen diluído em
BTS à 35 ºC → 25 ºC por 30 minutos → geladeira à 17ºC; Lote C: Sêmen diluído em BTS
à 35ºC → 25 ºC por 1 hora → geladeira à 17ºC; Lote D: Sêmen diluído em BTS à 35 ºC →
25 ºC por 2 horas → geladeira à 17 ºC; Lote E: Sêmen diluído em BTS à 35 ºC → 25 ºC
por 4 horas → geladeira 17 ºC; Lote F: Sêmen diluído em BTS à 35 ºC → 25 ºC por 6
horas → geladeira à 17 ºC.
Cada lote foi repartido em 4 tubos de ensaio com capacidade para 5 ml. Cada tubo
teve um total de 70 x106 sptz em 2 ml de volume (diluidor mais sêmen). De acordo com a
concentração de cada ejaculado, volumes diferentes de diluidor foram utilizados para
completar os 8 ml que é o volume final de cada lote, respeitando-se a mesma concentração
em cada lote. O dia de coleta foi considerado dia zero (D0), sendo o sêmen conservado por
7 dias, dos quais quatro foram de análise (D0, D1, D4 e D7). A cada dia de análise foram
retirados os tubos equivalentes a cada lote e incubados em “banho-maria” à 37 ºC. Após 5 e
120 minutos foram feitas análises do vigor (0-5) e motilidade espermática (%). A análise
estatística foi feita através do cálculo das médias e desvios-padrões, nos quais foi utilizado
o teste de Mann Whitney (5%) através do programa estatístico STAT VIEW.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os dados com relação ao vigor espermático, tanto aos 5 quanto aos 120 minutos de
incubação, não mostraram diferenças estatísticas entre as médias dentro de cada dia de
análise (Tabelas 1 e 2), exceto no D1, onde, aos 120 minutos de análise o lote D
apresentou, estatisticamente, melhores resultados. No entanto ao se analisar o
comportamento do sêmen obtido pela diferença dos valores no primeiro dia de análise (D0)
e o último dia (D7), observa-se que, principalmente aos 5 minutos, as amostras que tiveram
um abaixamento de temperatura durante 4 (Lote E) e 6 horas (Lote F), demonstraram uma
queda de valores de forma mais gradual quando comparado com os dados do lote A ou
controle. Isto evidencia que este abaixamento gradual permite um ganho de resistência ao
espermatozóide suíno, embora no D7, os valores obtidos tenham sido semelhantes, porém,
o modo como os lotes chegaram ao último dia de análise demonstra uma melhor resistência
adquirida dos Lotes E e F. Já para a motilidade, esta situação aparece de maneira mais
evidente (Tabelas 3 e 4), embora, também, não tenha havido diferenças significativas,
exceto no D1, onde o lote D mostrou, estatisticamente, resultados mais favoráveis que os
demais e no D4, onde, o lote E apresentou-se melhor que os demais, ambos para as leituras
efetuadas aos 120 minutos de análise. A ausência de diferenças significativas também pode
ser atribuída ao alto desvio padrão encontrado nas amostras. Zou e Yang (2000), ao
estudarem a resistência do sêmen suíno frente a diferentes temperaturas, observaram que o
espermatozóide, mantido a temperaturas de 20 e 15 ºC, conservam a motilidade quando
submetidos a tempos de até oito horas, o que também vem corroborar os dados obtidos
neste trabalho, embora a temperatura de estabilização utilizada tenha sido de 25 ºC. Uma
importante questão é que mesmo não havendo diferenças estatísticas, observou-se que os
lotes com incubação de 2 e 4 horas, foram os que apresentaram maior regularidade e
melhores resultados com relação ao comportamento médio da motilidade e do vigor
espermático. Baseados nos dados, pode-se concluir que a técnica de abaixamento gradual
da temperatura de conservação do sêmen suíno não alterou, estatisticamente, os valores de
viabilidade espermática. No entanto estudos mais aprofundados fazem-se necessários para
que se possa estabelecer uma real relação entre a curva de abaixamento de temperatura e a
resistência adquirida pelos espermatozóides.
TABELA 1. Vigor espermático aos 5 minutos de incubação em diferentes tempos
de equilíbrio.
D0
D1
D4
D7
Média
Diferenças
(D0 – D7)
Lote A
3,2 ± 0,6a
2,9 ± 1,1a
1,8 ± 1,4a
1,8 ± 1,4a
2,4
1,4
Lote B
3,1 ± 0,8a
2,4 ± 1,5a
2,5 ± 1,2a
1,9 ± 1,2a
2,5
1,2
Lote C
3,2 ± 0,8a
2,6 ± 1,1a
2 ± 1,5a
1,8 ± 1,4a
2,4
1,4
Lote D
2,9 ± 0,9a
3 ± 0,6a
2,3 ± 1,2a
1,8 ± 1,4a
2,5
1,1
Lote E
2,8 ± 1,0a
3 ± 0,7a
2,6 ± 0,9a
1,8 ± 1,4a
2,6
1,0
Lote F
2,8 ± 0,9a
2,4 ± 1,3a
2,3 ± 1,2a
2,1 ± 1,2a
2,4
0,7
Letras diferentes demonstram diferenças significativas nas colunas ( p < 0,05)
TABELA 2. Vigor espermático aos 120 minutos de incubação em diferentes
tempos de equilíbrio.
D0
D1
D4
D7
Média
Diferenças
(D0 – D7)
Lote A
2,8 ± 0,9a
2,5 ± 1,2a
1,5 ± 1,2a
1,7 ± 1,3a
2,1
1,1
Lote B
2,6 ± 1,1a
2 ± 1,4a
2,1 ± 1,1a
1,7 ± 1,3a
2,1
0,9
Lote C
2,8 ± 0,9a
2,2 ± 1,0a
1,8 ± 1,2a
1,6 ± 1,3a
2,1
2,2
Lote D
2,6 ± 1,1a
2,7 ± 0,8b
2,1 ± 1,1a
1,7 ± 1,2a
2,3
0,9
Lote E
2,5 ± 1,1a
2,4 ± 1,0a
2,2 ± 1,0a
1,6 ± 1,4a
2,2
0,9
Lote F
2,6 ± 1,2a
2 ± 1,3a
2,0 ± 1,2a
1,7 ± 1,3a
2,1
0,9
Letras diferentes demonstram diferenças significativas nas colunas ( p < 0,05)
TABELA 3. Motilidade espermática aos 5 minutos de incubação em
diferentes tempos de equilíbrio.
D0
D1
D4
D7
Média
Diferenças
(D0 – D7)
Lote A 68 ± 15a 60 ± 28a 33 ± 33a 34 ± 30a
49
34
Lote B 67 ± 19a 50 ± 34a 48 ± 29a 36 ± 28a
50
31
Lote C 67 ± 19a 53 ± 27a 38 ± 31a 37 ± 31a
49
31
Lote D 62 ± 22a 65 ± 15a 49 ± 29a 37 ± 33a
53
25
Lote E 57 ± 25a 65 ± 23a 51 ± 25a 35 ± 31a
52
22
61 ± 23a 50 ± 32a 48 ± 30a 40 ± 29a
50
21
Lote F
Letras diferentes demonstram diferenças significativas nas colunas ( p <
0,05)
TABELA 4. Motilidade espermática aos 120 minutos de incubação em
diferentes tempos de equilíbrio.
D0
D1
D4
D7
Média
Diferenças
(D0 – D7)
Lote A 60 ± 21a 54 ± 29a 29 ± 29a 35 ± 29a
45
23
Lote B 56 ± 27a 43 ± 32a 44 ± 29a 37 ± 29a
45
19
Lote C 62 ± 22a 47 ± 29a 37 ± 28a 33 ± 29a
45
29
Lote D 57 ± 27a 56 ± 23b 43 ± 27a 33 ± 27a
47
24
Lote E 51 ± 26a 53 ± 27a 50 ± 26b 33 ± 30a
47
18
55 ± 27a 40 ± 29a 44 ± 30a 33 ± 32a
43
22
Lote F
Letras diferentes demonstram diferenças significativas nas colunas ( p <
0,05)
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BWANGA C. O., MWANGA A; ROFRIGUEZ-MARTINEZ H
Post thaw
motility, acrosome morphology and fertility of deep-frozen boar semen
package in plastic puc-bags. In: Cong. Anim. Reprod., The Hagne, 420-422,
1992.
JOHNSON, L. A ., WEITZE, K. F., FISER, P., MAXWELL, W. M. C. Storage of
boar semen. Anim. Rep. Sci., 62: 143-172, 2000.
MIES FILHO, A. Inseminação artificial. 6º ed. Porto Alegre. Sulina, v.2, 1987
PURSEL, V. G., JOHNSON, L. A., RAMPACEK, G. B. Acrossome morfology of
boar spermatozoa incubated before cold shock. J. Anim. Sci., v.34 n.2, p.278283, 1972.
PURSEL, V. G., JOHNSON, L. A., SCHUMAN, L. L. Fertilizing capacity of boar
semen stored at 15ºC. J. Anim. Sci., v.37, n.2, 1973.
SOBESTIANSKY, J., WENTZ, I., SILVEIRA, P. R. S., SESTI, L. A . C.
Suinocultura Intensiva: Produção , manejo e saúde do rebanho. Brasília :
Embrapa-SPI, 388 p. il., 1998
ZOU, C. X., YANG, Z. M. Evaluation on sperm quality of freshly ejaculeted boar
semen during in vitro storage under different temperatures. Theriogenology,
53: 1477-1488, 2000.
ARTIGO 2
SÊMEN SUÍNO REFRIGERADO À 17 ºC EM DIFERENTES TEMPOS E
TEMPERATURAS DE EQUILÍBRIO
Faviano Ricelli da Costa e Moreira1,2, Ricardo Toniolli1, Roberta Nogueira
Chaves1, Ana Beatriz Graça Duarte1, Jorge Luiz Ferreira 1
1
Escola Superior de Agricultura de Mossoró, Departamento de Medicina
Veterinária, Mossoró-RN.
2
Universidade Estadual do Ceará, Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia
do Sêmen, Fortaleza-CE.
Este artigo será submetido ao periódico Arquivo Brasileiro de Medicina
Veterinária e Zootecnia
SÊMEN SUÍNO REFRIGERADO A 17 ºC EM DIFERENTES TEMPOS E
TEMPERATURAS DE EQUILÍBRIO
Moreira, F.R.C.1,2, Toniolli, R.1, Chaves, R.N. 1, Duarte, A.B.G. 1, Ferreira, J.L. 1
1
Escola Superior de Agricultura de Mossoró, Departamento de Medicina Veterinária, Mossoró-RN.
2
Universidade Estadual do Ceará, Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia do Sêmen,
Fortaleza-CE.
RESUMO
A qualidade seminal do ejaculado suíno varia de acordo com o tempo e a temperatura em
que o sêmen permanece antes de atingir a faixa final de estabilização (17 ºC). Portanto, o
presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito da incubação do sêmen sobre a
qualidade espermática, bem como, verificar quais as faixas de temperatura de maior
sensibilidade para o espermatozóide suíno. Foram utilizados 57 ejaculados, provenientes de
06 varrões, que foram divididos em 05 tratamentos a seguir: Tratamento A: Sêmen foi
diluído a 35 ºC e levado a 17 ºC por 11 dias (controle); Tratamento B: Sêmen diluído a 35
ºC, em seguida a 30 ºC por 4 horas e após este período a 17 ºC por 11 dias; Tratamento C:
Sêmen diluído à 35 ºC, em seguida à 25 ºC por 4 horas e após este período a 17 ºC por 11
dias; Tratamento D: Sêmen diluído a 35 ºC, em seguida a 30 ºC por 1 hora,
posteriormente a 25 ºC por 4 horas e após este período a 17 ºC por 11 dias; Tratamento E:
Sêmen diluído a 35 ºC, a 30 ºC por 1 hora, posteriormente à 25 ºC por 1 hora, e ainda a 20
ºC por 4 horas e após este período a 17 ºC por 11 dias. Foram analisadas as características
de vigor, motilidade e morfologia, com resultados comparados pelos testes de MannWhitney (vigor e motilidade) e “t” de Student (morfologia), todos a 5% de probabilidade.
Os resultados obtidos mostraram que tanto para o vigor, quanto para a motilidade, houve
um comportamento similar, onde no D0, o Tratamento E foi o que apresentou melhores
resultados em relação ao tratamento controle (p<0,05). Nos D5 e D9, o tratamento A foi
estatisticamente superior ao tratamento E (p<0,05), não havendo alterações nos outros dias.
Para a característica morfologia, não houve diferenças entre os tratamentos com e sem
incubação. Em todos os tratamentos analisados, encontrou-se queda significativa entre os
momentos de análise do sêmen puro e a diluição, e entre a diluição e as análises
subseqüentes. Portanto, concluiu-se que a incubação não aumentou o tempo de conservação
do sêmen, quando se utilizou a temperatura final de 17 ºC e que o momento da diluição é o
momento mais crítico dentro do processamento do sêmen refrigerado.
Palavras-chave: Sêmen, Suíno, Incubação, Refrigeração
ABSTRACT
SWINE SEMEN REFRIGERATED AT 17 ºC IN DIFFERENT TIMES AND
TEMPERATURES OF EQUILIBRIUM
The quality of the inseminated pig semen vary according to the time and temperature in
which the semen stays before reaching the final stage and stabilize (17 ºC); therefore this
work had the purpose to determine the effect on the incubation of the semen and the
quality, and also verify which temperatures have the most sensibility to the pig
spermatozoa. There were used 57, from 06 boars, which were divided in five following
treatments: Treatment A: The semen was diluted at 35 ºC and brought down to 17 ºC in 11
days (control); Treatment B: Semen diluted at 35 ºC and brought down to 30 ºC in 4
hours, after this period brought to 17 ºC in 11 days; Treatment C: Semen diluted at 35 ºC
and right after brought down to 25 ºC in 4 hours and after this to 17 ºC in 11 days;
Treatment D: Semen diluted at 35 ºC then down to 30 ºC in 1 hour then to 25 ºC in 4
hours and after this period to 17 ºC in 11 days; Treatment E: Semen diluted at 35 ºC, down
to 30 ºC in 1 hour after that to 25 ºC in 1 hour and still to 20 ºC in 4 hours and after this
period to 17 ºC in 11 days. The vigor, motility and morphology characteristics were
analyzed and the results were compared with the Mann-Whitney tests (vigor and motility)
and the “t” test of Student (morphology) all at 5% probability. The obtained results showed
not only the vigor but also motility a similar behaviour, where in D0, the treatment E was
the one which showed the best results about the control treatment (p <0,05). In D5 and D9
treatment A was statistically superior to treatment E (p <0,05) and did not have alterations
the other days. For the morphology characteristics there were not any differences between
treatments with and without incubation. In all the analyzed treatments were found an
important drop between the moment of the analyzed pure semen and the dilution, and
between the dilution and the following analyses. Therefore conclusions is, that incubation
did not increase the time of semen preservation when used at final temperature of 17 ºC and
that dilution moment is the most critical in the cooling process of the semen.
Key Words: Semen, pig, incubation, cooling
INTRODUÇÃO
A sensibilidade ao choque térmico do espermatozóide suíno apresenta variações de
acordo com o tempo e temperatura de resfriamento, podendo adquirir um grau significativo
de resistência ao choque térmico após sua manutenção à temperatura ambiente antes de ser
submetido ao resfriamento. Estas células espermáticas são extremamente sensíveis logo
após a ejaculação e não resistem ao resfriamento lento em temperaturas abaixo de 15 ºC,
entretanto, podem adquirir resistência após um período de incubação. Aproximadamente 4
a 7 horas após a ejaculação, 50-80% das células espermáticas adquirem resistência, a julgar
por sua motilidade e morfologia, influenciada pelo pH e composição do diluidor (Pursel &
Johnson, 1970; Pursel et al., 1972, 1973a).
O período de incubação do sêmen após a coleta também é utilizado nas centrais de
inseminação artificial de suínos, a fim de melhorar os índices de fertilidade com o sêmen
resfriado entre 15 e 18 ºC, bem como na tentativa de prolongar o tempo de armazenamento
do ejaculado. Tem sido relatado ainda, que a incubação prévia do sêmen em temperaturas
acima de 15 ºC, pode aumentar a viabilidade do sêmen armazenado em temperaturas abaixo
de 15 ºC (Pursel et al., 1973a; Katzer et al., 2001a e b).
O tempo de incubação também aumenta a proporção dos espermatozóides com
acrossomo intacto tanto a 15 quanto a 5 ºC, quando comparados com lotes controle sem
incubação (Maxwell & Johnson, 1997).
A resistência ao choque térmico parece aumentar quando o tempo de incubação é
prolongado de 16 até 24 horas, com melhores resultados obtidos com 20 horas de
incubação, entretanto estes resultados são dependentes da temperatura utilizada (5 ou 12ºC)
(Eriksson et al., 2001; Katzer et al., 2001a e b).
O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito incubação do sêmen antes de
levá-lo à temperatura final de estabilização (17 ºC), bem como, verificar quais as faixas de
temperatura de maior sensibilidade para o espermatozóide suíno.
MATERIAL E MÉTODOS
Local do experimento
O experimento foi realizado no Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia de
Sêmen (LRSTS) da Faculdade de Veterinária (FAVET) da Universidade Estadual do Ceará
(UECE).
Animais e coleta do sêmen
Foram utilizados 06 animais pertencentes ao LRSTS, sendo três reprodutores puros
(Duroc =2 e Landrace =1) e três híbridos (Dalland =2 e Agroceres =1). Os animais tinham
idade variando entre 1,5 e 2,5 anos sendo mantidos em instalações convencionais para a
criação de suínos. Os reprodutores foram alimentados com 2 kg de ração por dia em dois
arraçoamentos, contendo 3.340 Kcal e 12% PB. Os ejaculados foram coletados pela técnica
da mão enluvada (Johnson et al., 2000), sempre às segundas e quintas-feiras pela manhã
(6:30) por um funcionário experiente e treinado, em sala apropriada com manequim. O
sêmen foi coletado em copo coletor com capacidade para 500 ml, previamente aquecido à
39 ºC, coberto por uma gaze especial e protegido por envoltório isotérmico.
Foi
aproveitado o ejaculado total de cada reprodutor após separação da parte gelatinosa. Após a
coleta, o ejaculado foi analisado quanto à sua temperatura (ºC), concentração espermática
(sptz /ml), volume (ml) e total de espermatozóides (x 109 sptz). Em seguida, foi levado para
microscópio óptico com contraste de fase colocando-VH XPD JRWD GH O HQWUH Oâmina e
lamínula pré-aquecidas a 39 ºC para a leitura do vigor e motilidade espermáticas. Apenas os
ejaculados com um mínimo de vigor 3,0 e motilidade 70% (CBRA, 1998), foram utilizados
no experimento.
Parâmetros dos movimentos espermáticos
Para a avaliação das características de vigor espermático (notas de 0 a 5) e
motilidade espermática (valores de 0 a 100% - Martin Rillo et al., 1996), o sêmen foi
incubado em “banho-maria” à 39 °C e as leituras foram feitas após 5 minutos de incubação,
segundo parâmetros apresentados por Toniolli et al., (1996), como pode ser visto nos
anexos nos quadros 1a, 1b e 1c. As análises de vigor são consideradas qualitativas,
avaliando-se o tipo de movimento realizado pelo espermatozóide. Já para a motilidade, a
avaliação é quantitativa, observando-se a proporção de células espermáticas móveis em
relação ao total de células do campo microscópico. Para cada ejaculado analisado, foram
percorridos pelo menos três campos microscópicos, com todas as análises sendo realizadas
a um aumento de 320x.
Avaliação morfológica da célula espermática
Para a avaliação morfológica, foi retirada de cada tratamento, após 5 minutos de
incubação a 39 ºC com BTS, uma alíquota de 0,1 ml de sêmen e diluído em 0,1 ml de
solução salina 0,9% formolizada (formol a uma concentração de 0,1% - CBRA, 1998), para
avaliação do percentual de células espermáticas morfologicamente normais e com
alterações (Pursel et al.,1972; Johnson et al., 2000). As análises foram realizadas (após a
homogeinização) através da colocação de uma gota (15 µl) do sêmen diluído na solução
salina formolizada entre uma lâmina e lamínula, onde foram contadas 200 células por
amostra (lâmina - Vale Filho, 1980). As análises foram realizadas, através de microscopia
óptica com contraste de fase a um aumento de 1000x. As análises morfológicas
compreenderam os principais defeitos de acrossomo (Kumus, 1993).
As classificações para o acrossomo, seguiram os dados de Pursel et al., 1972:
1) Espermatozóides com acrossomo normal (NAR): células com contornos nítidos,
regulares, com superfície lisa e de forma arredondada;
2) Espermatozóides com perda de acrossomo (PAR): células com superfície
fracamente
visualizada,
vesiculada,
transparente,
com
acrossomo
em
degeneração, mas ainda aderido ao núcleo;
3) Espermatozóides com edema de acrossomo (EAR): células com um inchaço na
região acrossômica;
4) Espermatozóides com acrossomo danificado (DAR): células com superfície
acrossômica bem visível, porém irregular, com invaginações ou evaginações;
5) Espermatozóides sem acrossomo (SAR): células com acrossomo não visualizado,
e coma região equatorial bem definida, caracterizando a perda total do capuz
acrossômico.
Foram eleitos quatro momentos por tratamento para se retirar amostras para a
morfologia espermática: 1) logo após a diluição, 2) após 1 hora em que cada ejaculado de
cada tratamento permaneceu à 17 ºC (D0) , 3) no quinto dia de conservação a 17 ºC (D5) e
4) no no décimo-primeiro dia de conservação a 17 ºC (D11). As amostras foram retiradas
somente após o tempo de 5 minutos de incubação em banho-maria a 39 ºC.
Conservação do sêmen pós-coleta
Cada ejaculado foi diluído e conservado a uma temperatura de 17 °C (Pursel et al.,
1973a), sendo mantido em tubos de ensaio com capacidade de 5 ml. A cada dia de análise,
foram retirados os tubos de ensaio referentes a cada macho e cada tratamento, incubados
em “banho-maria” à 39 ºC, por 5 minutos, para as análises. As amostras destinadas às
avaliações foram conservadas em tubos de ensaios fechados.
Análise estatística
Os testes utilizados foram os de Mann-Whitney, para o vigor e a motilidade, e o
teste “t” de student para a morfologia. Em ambos os testes, foi utilizado um nível de
significância de 5%. A análise das diferenças entre médias foi realizada através de uma
variância multifatorial através do programa de estatística STAT VIEW (versão de 1994).
Formação dos tratamentos experimentais
Foram utilizados 57 ejaculados, retirando-se de cada um deles um total de 4,375
x109 sptz, divididos entre os 5 diferentes tratamentos (875 x106 sptz/tratamento), sendo
repartido em 10 tubos de ensaio (cada tubo correspondendo aos dias de análise), contendo
um total de 87,5 x106 sptz/tubo em 2,5 ml de volume (diluidor mais sêmen). De acordo
com a concentração de cada ejaculado, volumes diferentes de diluidor (BTS) foram
utilizados para completar os 25 ml, volume final de cada tratamento. As diluições foram
feitas respeitando-se concentração de 35 x106 sptz/ml. O dia de coleta foi considerado dia
zero (D0) sendo o sêmen conservado em geladeira a 17 ºC por até 11 dias (D11), durante os
quais foram realizados dez dias de análise (D0, D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7, D9 e D11)
para o vigor (0-5) e a motilidade espermática (%). Para as análises de morfologia, foram
utilizadas amostras provenientes dos ejaculados logo após a diluição, nos dias D0, D5 e
D11. O ejaculado de cada reprodutor foi repartido nos 5 tratamentos a seguir:
Tratamento A (TA): Após a coleta, o sêmen foi diluído em BTS a 35 ºC e levado
direto para geladeira a 17 ºC (Controle), como pode ser visto no gráfico 6 nos
anexos;
Tratamento B (TB): Após a coleta, o sêmen foi diluído em BTS a 35 ºC, levado
para um banho-maria com temperatura de 30 ºC por 4 horas e, posteriormente,
levado para geladeira a 17 ºC – TC, como pode ser visto no gráfico 7 nos anexos;
Tratamento C (TC): Após a coleta, o sêmen foi diluído em BTS a 35 ºC, levado
para banho-maria com temperatura de 25 ºC durante 4 horas e, posteriormente,
levado para geladeira a 17 ºC, como pode ser visto no gráfico 8 nos anexos;
Tratamento D (TD): Após a coleta, o sêmen foi diluído em BTS a 35 ºC, levado
para banho-maria com temperatura de 30 ºC por 1 hora e, posteriormente, a 25 ºC
por 4 horas e, em seguida, levado para geladeira a 17 ºC, como pode ser visto no
gráfico 9 nos anexos;
Tratamento E (TE): Após a coleta, o sêmen foi diluído em BTS à 35 ºC, levado
para um banho-maria com temperatura de 30 ºC por 1 hora, depois para outro à
25ºC por 1 hora e, finalmente, para um terceiro à 20 ºC por 4 horas e,
posteriormente, levado para geladeira a 17 ºC, como pode ser visto no gráfico 10
nos anexos.
Entre todas as quedas de temperatura, considerou-se sempre o tempo de 1 hora para
que o ejaculado chegasse à temperatura de estabilização. Contando-se a partir daí o real
tempo de incubação.
Análises do sêmen no dia de coleta (D0)
No dia da coleta (DO), foram realizadas análises seqüenciais em todos os
tratamentos. De cada ejaculado, foi retirado um total de 962,5 x106 sptz, onde o volume
final foi de 27,5 ml. A cada hora e durante 11 horas, foi retirada uma amostra de 2,5 ml e
colocada em banho-maria a 39 ºC por 5 minutos. Decorrido este tempo, uma alíquota de
15µl foi colocada entre lâmina e lamínula para análise das características do vigor e da
motilidade espermática. A análise destas amostras teve por finalidade, a mensuração da
sensibilidade dos espermatozóides durante o período de abaixamento gradual da
temperatura até a estocagem das doses em geladeira a 17 ºC. Estas análises foram feitas de
acordo com o esquema a seguir:
a) Sêmen puro, b) Logo após a diluição a 35 ºC, c) 1
hora após a diluição, d) 2 horas após a diluição, e) 3 horas após a diluição, f) 4 horas após a
diluição, g) 5 horas após a diluição, h) 6 horas após a diluição, i) 7 horas após a diluição, j)
8 horas após a diluição, l) 9 horas após a diluição, m) 10 horas após a diluição e n) 11 horas
após a diluição.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Avaliação dos parâmetros de movimento durante 11 dias de conservação nos 5 diferentes
tratamentos
Efeito Tratamento
Nos dados apresentados na tabela 1 referente ao vigor espermático, os diversos
tratamentos mostram comportamentos semelhantes em todos os dias analisados, exceto nos
dias D0, D5 e D9. Para o D0, o único tratamento que apresentou diferença estatística em
relação ao TA (controle) (2,2) foi o TE (2,5) (p<0,05). Este comportamento a partir do D1
não foi mantido, ou seja, entre o D1 e o D4, não houve diferenças significativas entre todos
os diferentes tratamentos (p<0,05). Contudo, em D5, houve uma inversão entre os
tratamentos com melhores resultados, o TA apresentou o melhor resultado em relação ao
TE (1,9 vs. 1,5) (p<0,05), não havendo diferenças entre os demais tratamentos testados
(p>0,05). Nos dias D6 e D7 de conservação, mais uma vez, estas diferenças deixam de
existir, voltando a ocorrer em D9 o mesmo resultado encontrado em D5, entretanto, com
valores mais baixos (TA =1,0 e TE =0,8). No último dia de conservação do sêmen (D11),
mais uma vez, as diferenças entre tratamentos deixaram de existir (p>0,05).
A motilidade espermática (tabela 2) apresentou o mesmo comportamento do vigor
espermático entre os diferentes tratamentos durante todo o período de conservação do
sêmen, ou seja, no D0, o TE (56%) foi o que apresentou melhores resultados com relação
ao tratamento controle (47%) (p<0,05). No D5, o TA (40%) foi estatisticamente superior ao
TE (29%) (p<0,05). O mesmo ocorreu no D9, onde o TA (19%) apresentou melhores
resultados que o TE (11%) (p<0,05).
O efeito benéfico da incubação antes da conservação final do sêmen tem sido
reportado, porém, tais efeitos estão ligados à qualidade do sêmen descongelado (Pursel et
al., 1972; Courtens & Paquignon, 1990; Bwanga, 1991; Maxwell & Johnon, 1997; Eriksson
et al., 2001; Medrano et al., 2002), ou com o sêmen refrigerado a 5 ou 12 ºC (Pursel et
aL.,1973b; Nascimento et al., 1998; Kotzias-Bandeira, 1999; Katzer et al., 2001a, b e c).
Para os ejaculados que possuem temperatura final de conservação a 17 ºC, a literatura não
fornece muitos dados (Zou & Yang, 2000).
O fato de no D0 ter existido uma superioridade do TE em relação ao TA, tanto para
o vigor quanto para a motilidade, pode ser explicado pala fato de que os ejaculados quando
são submetidos a períodos de incubação em temperaturas superiores às da conservação, as
células espermáticas adquirem uma maior capacidade de rearranjo de suas membranas
plasmáticas. Desta forma, nos tratamentos em que o sêmen foi submetido à incubação, os
espermatozóides conseguiram se adaptar melhor ao meio ambiente a despeito do choque
térmico provocado pelo abaixamento da temperatura (Buhr, 1990). A inversão dos valores a
partir do D1 podem ser atribuídos ao fato de que os espermatozóides dos tratamentos com
incubação permaneceram um maior tempo com uma taxa metabólica mais alta, muito
embora não tenha sido realizados testes bioquímicos para se aferir o consumo de
substâncias tais como o O2. Este comportamento ocorreu devido ao fato dos tratamentos
com incubação levarem entre 5 e 9 horas a mais para alcançarem a temperatura de 17 ºC e
com isto diminuírem o seu metabolismo e conseqüente gasto de energia, aumentando o
tempo de conservação. Este tipo de resultado foi também evidenciado por Zou & Yang
(2000), os quais demonstraram que em temperaturas mais altas (39 ºC) ocorre uma perda
significativa da qualidade espermática em uma conservação de 48 horas, quando
comparado a temperaturas de 20 a 15 ºC.
Ainda não se obteve um consenso dos motivos causadores da alta variação dos
resultados da conservação do sêmen suíno. Maxwell & Johnson (1997) afirmam que ainda
não está claro quais são as mudanças em que a célula espermática passa durante o período
de incubação, mas Watson (1996) sugere que a composição lipídica da bicamada da
membrana plasmática afeta a sua fluidez, mas não a capacidade fertilizante das células. De
qualquer maneira, segundo o mesmo autor, é claro que o tempo de incubação à temperatura
de 15 ºC pode inibir, pelo menos parcialmente, a desestabilização da membrana quando se
utiliza sêmen para a criopreservação.
Efeito Conservação
Na tabela 1, para o vigor espermático, observa-se que dentro de cada tratamento
houve diferenças estatísticas entre a análise do sêmen puro e o diluído e entre este e a
análise no DO. Entre as análises no D0 e o D5, somente o TA conseguiu manter o mesmo
vigor (p>0,05), os demais lotes demonstraram quedas significativas (p<0,05). Entre o D5 e
D11 todos os tratamentos apresentaram quedas significativas (p<0,05).
As respostas dos ejaculados dentro de cada tratamento, para a característica
motilidade, também variaram seguindo o mesmo comportamento do vigor, isto é, houve
diferenças significativas entre as análises do sêmen puro e o diluído e entre este e o sêmen
analisado no D0. Entre o D0 e o D5, somente o TA manteve o percentual de motilidade
(p>0,05), nos outros lotes houve diferenças estatísticas (p<0,05). Entre o D5 e o D11, todos
os tratamentos apresentaram quedas estatísticas (p<0,05).
A queda dos valores tanto do vigor, quanto da motilidade já era esperada em todos
os tratamentos durante a conservação, porém somente o TA conseguir manter os índices
entre o D0 e o D5. Segundo Zou & Yang (2000), este comportamento é esperado, uma vez
que o tratamento sem incubação consegue conservar mais energia a despeito do choque
térmico ocasionado. Althouse et al., (1998) ao encontrarem que a temperatura crítica
durante o processamento do sêmen suíno é de 12 ºC, fornece a informação de que talvez
protocolos de refrigeração do sêmen suíno que possuam como temperatura final valores
acima, como 17 ºC, não necessitem de resfriamento gradual para se aumentar o tempo de
conservação.
Além desta questão existem outros fatores que podem influenciar os resultados da
conservação do sêmen. Um destes fatores é citado por Eriksson et al. (2001), onde os
diversos comportamentos existentes entre os diferentes ejaculados ou de um mesmo
ejaculado dentro de várias curvas de abaixamento da temperatura, pode ter como causa a
variabilidade individual de cada varrão e, que talvez um modelo de abaixamento de
temperatura para um varrão individual possa trazer respostas sobre as mudanças da
motilidade dentro de uma curva padrão de abaixamento.
Avaliações Morfológicas durante 11 dias de conservação
Os resultados expressos na tabela 3, para o D0, mostram que a partir do percentual
de células com acrossomo normais na diluição (98,5%), somente os TA (97,0%) e TB
(97,5%) mantiveram valores estatisticamente iguais (p>0,05). Quando a comparação é
realizada somente entre os tratamentos, nota-se que não houve diferenças (p>0,05). O TE
que obteve um percentual de 94,5%, ainda assim, possui um índice de acrossomos normais
que está dentro das normas de utilização preconizadas pelo CBRA (1998). A ausência de
diferenças entre os tratamentos também foi encontrada no D5 e no D11.
Os resultados aqui encontrados estão em acordo com Maxwell & Johnson (1997) e
Althouse et al. (1998) que não encontraram alterações, porém segundo estes últimos
autores isto foi devido à adição da albumina sérica bovina no diluidor utilizado, o que
conferiu uma maior resistência à célula espermática. Outros autores encontraram efeitos
benéficos da incubação do sêmen sobre as alterações morfológicas (Pursel et al., 1972;
Bamba & Cran, 1988). Kommisrud et al., (2002) analisando a integridade acrossomal dos
espermatozóides conservados à temperatura entre 16 e 18 ºC durante 6, 30, 54, 78 e 102
horas, encontrou 93,9%, 90,6%, 88%, 84,8% e 78,2% respectivamente de acrossomos
normais. Estes dados estão relativamente abaixo dos aqui encontrados, provavelmente,
devido a influências do próprio varrão, ressaltando neste ponto a individualidade do macho
doador de sêmen.
Com relação à taxa de resfriamento, Watson & Plummer (1990), observaram que
um índice de resfriamento de 10 a 15 °C por minuto ocasionou lesões no gameta masculino
de maneira ireversível. Butler & Roberts (1975) apud Nascimento et al. (1998) assinalam
que a incubação a uma temperatura de 30 °C por quatro a sete horas aumenta sensivelmente
a resistência dos espermatozóides ao choque térmico, de modo que 70 a 80% deles não
apresentem alterações na motilidade e mantenham a integridade acrossômica.
Os dados encontrados neste trabalho para as alterações espermáticas estão de acordo
com HUO et al. (2002), que encontraram aos 11 dias de conservação uma percentagem de
79,83% de acrossomos normais, o que vem a ser muito semelhante aos dados encontrados
neste trabalho que variaram de 80 a 83,5%, independente do tratamento.
Muito embora Watson (2000) afirme que há uma forte correlação entre o dano à
membrana plasmática durante a refrigeração e reação acrossomal, onde uma inicia a
desorganização da outra, neste trabalho não se encontrou diferenças, provavelmente devido
ao fato do sêmen suíno não ter atingido sua temperatura crítica (12 ºC – Althouse et al.,
1998), e conseqüentemente não possuir um grande número de alterações morfológicas, para
que os processos de incubação seminal pudessem aumentar a resistência da célula
espermática ao choque térmico.
Avaliações durante o dia de coleta
Para o vigor como pode ser observado na tabela 4 não houve diferenças estatísticas
significativas entre os tratamentos em todos os dias analisados (p>0,05). As diferenças
ocorreram quando foram comparados dentro de cada tratamento os diferentes momentos
analisados. Neste caso, elas ocorreram no TD, onde a única diferença significativa foi entre
o sêmen analisado a 1 hora (2,2) com o sêmen analisado à 5 horas (2,5) (p<,05). O TE
também apresentou diferenças, com os momentos de análises 10 e 11 horas pós-diluição,
apresentando os melhores resultados, e estes diferiram significativamente dos resultados
obtidos nas duas primeiras horas pós-diluição (p<0,05). O que foi observado, independente
do tratamento, foram quedas significativas da qualidade do ejaculado entre o sêmen puro
(4,5) e a diluição (3,0) e entre a diluição e os momentos de análises subseqüentes (1h, ...,
11h) (p<0,05).
O comportamento dos ejaculados para a característica da motilidade (tabela 5)
também não diferiu estatisticamente (p<0,05) entre os tratamentos em todas as horas
analisadas. Mais uma vez as diferenças ocorreram dentro da cada tratamento (A e E) em
relação aos momentos analisados. No TA, as diferenças ocorreram de maneira significativa
apenas entre as análises efetuadas na quinta hora pós-diluição (54%) e as análises efetuadas
na segunda hora pós-diluição (47%) (p<0,05). No TE, as diferenças ocorreram nas análises
efetuadas às 11 horas pós-diluição (56%) com as análises efetuadas na 1ª (48%) e 2ª (48%)
horas pós-diluição (p<0,05). O que foi observado, independente do tratamento, foram
quedas significativas da qualidade do ejaculado entre o sêmen puro (94%) e a diluição
(68%) e entre a diluição e os momentos de análises subseqüentes (1h, ..., 11h) (p<0,05).
Para a percentagem de espermatozóides com acrossomos morfologicamente
normais (NAR) no dia de coleta (D0) (tabela 3), não houve diferenças entre os tratamentos
(TA=TB=TC=TD=TE). Porém, quando as análises são realizadas entre o momento da
diluição e a análise no D0 em cada tratamento a 17 ºC, foram encontradas diferenças
significativas (P<0,05). Estas foram observadas entre a diluição (98,5%) e os tratamentos C
(97,0%), D (97,0%) e E ( 94,5%) (p<0,05).
O comportamento do ejaculado, independendo do tratamento utilizado, mostra que
dentro do processamento do sêmen suíno além de temperaturas críticas (12 ºC) (Althouse et
al., 1998) em que há desarranjo da membrana plasmática espermática, existe também o
momento da diluição como ponto crítico para que a qualidade seminal seja mantida. A
temperatura de diluição (35 e 25 ºC) neste experimento não alterou a qualidade das doses
seminais.
Todas as discussões sobre o período de incubação levam em consideração o tempo
que o sêmen permanece em equilíbrio até atingir a temperatura final de estabilização. O
fato dos efeitos benéficos que a literatura se reporta está ligado à velocidade do
resfriamento, onde no presente trabalho foi de: 0h, 5h, 5h, 7h e 9h para os tratamentos A, B,
C, D e E, respectivamente. Polge (1956) cita que o sêmen mantido à temperatura corpórea
sobreviveu até 6-8 horas de incubação. Katzer et al. (2001a e c) ressaltam que uma
incubação de 24 h a 17 ºC, antes de armazenar o sêmen a 12 ºC, permite a manutenção da
viabilidade espermática da mesma forma que a 17 ºC, porém, quando a temperatura final
utilizada foi a de 5 ºC, a incubação diminuiu a sensibilidade ao resfriamento, mas não
permitiu a manutenção da viabilidade espermática da mesma forma que o armazenamento a
17 ºC.
Os dados de Weber (1989) apud Nascimento et al. (1998) mostram que quando se
efetua um resfriamento gradual ao invés do direto, ocorre um aumento dos valores de
motilidade e de alterações morfológicas. Pelos dados do presente autor, quando se resfriou
rapidamente o sêmen a 5 ºC, a motilidade foi de 12,0 ± 0,9% e a integridade do acrossomo
de 44,9 ± 14,9%. Entretanto, quando o resfriamento foi realizado mais lentamente, a
motilidade foi 48,3 ± 11,3% e a integridade do acrossomo de 68,4 ± 10,4%. Esta mesma
situação foi encontrada por Eriksson et al. (2001), ao estudarem o tipos de movimento
espermático (linear, circular), encontraram que a 32 ºC, não foram encontradas diferenças
estatísticas entre os períodos de incubação para qualquer um dos parâmetros acima
analisados (movimento linear e circular). Por outro lado, um significativo decréscimo
(p<0,05) ocorreu na percentagem de espermatozóides com movimento linear, e um
significativo aumento nos espermatozóides com movimento circular, entre as temperaturas
de 15 e 5 ºC comparado com 32 ºC.
Em todos os lotes, foi observado durante o dia de coleta um aumento da motilidade
e do vigor. Segundo Johnson et al. (2000), isto se deve ao tipo de resposta que os
espermatozóides dos mamíferos possuem à diluição, isto é, ocorre um aumento inicial da
atividade seguido por um aumento dos danos à membrana. Puschel, 1974 apud Mariano et
al., 1992, citam que o sêmen suíno apresenta quedas dos valores de motilidade e aumento
das alterações morfológicas quando o ejaculado líquido é armazenado por um período de
24 horas, isto foi evidenciado neste trabalho, onde houve quedas significativas, tanto no
vigor, quanto na motilidade entre o momento da diluição e a análise 24 horas após, ou seja,
no D1.
Pode-se concluir que o protocolo de incubação do sêmen suíno diluído não forneceu
condições para a utilização do ejaculado em condições de conservação mais prolongada do
sêmen, porém com o uso do sêmen durante o dia de coleta pode-se obter ganhos na
produtividade de uma central de inseminação artificial/granja. Contudo, encontrou-se ainda
um forte efeito da diluição na qualidade seminal, o qual constitui-se como ponto crítico no
processamento do sêmen suíno e que ainda necessita de maiores informações para se
entender realmente o que ocorre com o espermatozóide durante este fenômeno e o que pode
ser feito para tentar minimizar os seus efeitos.
Tabela 1. Vigor espermático do sêmen suíno conservado a 17 ºC durante 11 dias.
PURO
DILUÍDO
D0
D1
D2
D3
D4
D5
3,0B
2,2Ca
2,6a
2,6a
2,3a
1,9a
1,9Ca
TA 4,5A
3,0B
2,3Cab
2,4a
2,3a
2,1a
1,8a
1,6 Dab
TB 4,5A
A
B
Cab
a
a
a
a
3,0
2,4
2,5
2,4
2,1
1,7
1,6Dab
TC 4,5
A
B
Cab
a
a
a
a
3,0
2,4
2,5
2,3
2,0
1,9
1,7Dab
TD 4,5
3,0B
2,5Cb
2,4a
2,4a
2,1a
1,8a
1,5Db
TE 4,5A
Letras minúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre as linhas ( p < 0,05)
D6
D7
D9
D11
1,6a
1,3a
1,4a
1,4a
1,4a
1,4a
1,2a
1,0a
1,1a
1,1a
1,0a
0,8ab
0,7ab
0,7ab
0,8b
0,5Da
0,3Ea
0,4Ea
0,4Ea
0,5Ea
Letras maiúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre as colunas, apenas entre os momentos Puro,
diluído, D0, D5 e D11 (p<0,05).
Tabela 2. Percentagem de espermatozóides móveis no sêmen suíno conservado a 17 ºC durante 11 dias
PURO
DILUÍDO
D0
D1
D2
D3
D4
D5
D6
D7
D9
D11
94 A
68 B
47 Ca
57a
55a
47a
40a
40Ca
32a
TA
A
B
Ca
a
a
a
a
Dab
94
68
51
53
50
42
38
33
26a
TB
94 A
68 B
53Cab
53a
48a
42a
34a
32Dab
27a
TC
A
B
Cab
a
a
a
a
Dab
94
68
51
53
49
42
37
33
28a
TD
94 A
68 B
56Cb
54a
48a
42a
36a
29Db
28a
TE
Letras minúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre as linhas ( p < 0,05)
28a
22a
20a
21a
20a
19a
14ab
13ab
11ab
11b
7Da
6Ea
5Ea
8Ea
7Ea
Letras maiúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre as colunas, apenas entre os momentos Puro,
diluído, D0, D5 e D11 (p<0,05).
Tabela 3. Percentual de células com acrossomos
morfologicamente normais (NAR) no sêmen diluído e
conservado por 11 dias a 17 ºC.
Dil
TA
TB
TC
TD
TE
D0
D5
D11
98,5% a
97,0% ab
97,5% ab
97,0% b
97,0% b
94,5% b
91,5% a
90,0% a
92,0% a
92,0% a
91,0% a
80,0% a
81,5% a
83,0% a
83,0% a
83,5% a
Letras diferentes demonstram diferenças significativas entre
linhas ( p < 0,05)
Tabela 4. Avaliação do vigor espermático do ejaculado suíno durante o dia de coleta (D0) analisado seqüencialmente durante 11 horas
pós-coleta
FRESCO
DILUÍDO
1h
2h
3h
4h
5h
6h
7h
3,0B
2,3 Ca 2,2 Ca
2,4Ca
2,3Ca
2,4Ca
2,4Ca
2,5Ca
TA 4,5A
A
B
Ca
Ca
Ca
Ca
Ca
Ca
3,0
2,2
2,2
2,4
2,3
2,3
2,3
2,3 Ca
TB 4,5
A
B
Ca
Ca
Ca
Ca
Ca
Ca
3,0
2,2
2,2
2,3
2,3
2,3
2,4
2,3 Ca
TC 4,5
3,0B
2,2 Ca 2,2 CDa 2,4 CDa
2,4 CDa
2,5 Da
2,4 CDa
2,4 CDa
TD 4,5A
A
B
Ca
CDa
CDEa
CDEa
CDEa
CDEa
3,0
2,1
2,2
2,4
2,4
2,4
2,4
2,4 CDEa
TE 4,5
Letras minúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre as linhas ( p < 0,05)
8h
9h
10h
11h
2,3Ca
2,4 Ca
2,3 Ca
2,3 CDa
2,4 CDEa
2,2Ca
2,3 Ca
2,4 Ca
2,4 CDa
2,4 CDEa
2,3 Ca
2,3 Ca
2,4 Ca
2,4 CDa
2,5 DEa
2,3 Ca
2,4 Ca
2,4 Ca
2,4 CDa
2,5Ea
Letras maiúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre as colunas (p < 0,05)
Tabela 5. Avaliação da motilidade espermática do ejaculado suíno durante o dia de coleta (D0) analisado seqüencialmente
durante 11 horas pós-coleta
FRESCO
DILUÍDO
1h
2h
3h
4h
5h
6h
7h
94A
68B
51CDa 47Ca 51CDa 51CDa 54Da 51CDa 53CDa
TA
94A
68B
48Ca 48Ca
52Ca
50Ca
51Ca
51Ca
50Ca
TB
A
B
Ca
Ca
Ca
Ca
Ca
Ca
94
68
48
49
50
49
50
53
50Ca
TC
94A
68B
48Ca 49Ca
52Ca
51Ca
55Ca
54Ca
52Ca
TD
A
B
Ca
Ca
CDa
CDa
CDa
CDa
94
68
48
48
52
50
53
52
53CDa
TE
Letras minúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre linhas (p < 0,05)
Letras maiúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre colunas (p < 0,05)
8h
9h
10h
11h
50CDa
51Ca
48Ca
51Ca
53CDa
49CDa
51Ca
52Ca
51Ca
52CDa
52CDa
53Ca
53Ca
53Ca
54CDa
49CDa
53Ca
53Ca
52Ca
56Da
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALTHOUSE, G. C., WILSON, M. E., KUSTER, C., PARSLEY, M. Characterization of
lower temperature storage limitations of fresh-extended porcine semen. Theriogenology,
50, p.535:543, 1998.
BAMBA, K., CRAN, D. G. Further studies on rapid dilution and warming of boar semen. J.
reprod. Fert., 82, p. 509-518, 1988.
BUHR, M.M. Preservation of boar sperm alters membrane molecular dynamics.
Proceeding in 2th Int. Conf. on Boar Semen Pres., Beltsville-USA, p 81-93, 1990.
BWANGA, C. O. Cryopreservation of boar sperm. Acta Vet. Scand., 32, p.431-453, 1991.
COLÉGIO BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL. Manual para exame andrológico
e avaliação de sêmen animal, 2º ed., Belo Horizonte, 1998.
COURTENS, J.L. & PAQUIGNON, M. Ultraestructure of fresh, frozen, and frozen-thawd
spermatozoa of the boar. Proceeding in 2th Int. Conf. on Boar Semen Pres., BeltsvilleUSA, p.61-87, 1990.
ERIKSSON, B.M., VAZQUEZ, J.M., MARTINEZ, E.A., ROCA, J., LUCAS, X.,
RODRÍGUEZ-MARTINEZ, H. Effects oh holding time during cooling and of type of
package on plasma membrane integrity, motility and in vitro oocyte penetration ability of
frozen-thawed boar spermatozoa. Theriogenology 55 : 1593-1605, 2001.
HUO, L. MA, X., YANG, Z. Assessment of sperm viability, mitochondrial activity,
capacitation and acrossome intactness in extended boar semen during long-term storage.
Theriogenology, 8632, p, 1-12. 2002.
JOHNSON, L. A ., WEITZE, K. F., FISER, P., MAXWELL, W. M. C. Storage of boar
semen. Anim. Rep. Sci., 62: 143-172, 2000.
KATZER, L.H., BORTOLOZZO, F.P., WENTZ, I., BERNARDI, M.L., PEIXOTO, C.H.,
VIDOR, R.M. Viabilidade do sêmen suíno armazenado a 12 ºC e 5 ºC após incubação a 17
ºC. In: X CONGRESSO BRASILEIRO DE VETERINÁRIOS ESPECIALISTAS EM
SUÍNOS, Anais,v.2, Porto Alegre-RS, p.241-242, 2001a.
KATZER, L.H., BERNARDI, M.L., PADILHA, A.P., BORTOLOZZO, F.P., WENTZ, I.,
COSTI, G., DIEHL, G.N. Diferentes temperaturas e diluentes no resfriamento do sêmen
suíno. In: X CONGRESSO BRASILEIRO DE VETERINÁRIOS ESPECIALISTAS EM
SUÍNOS, Anais,v.2, Porto Alegre-RS, p.243-244, 2001b.
KATZER, L.H., BORTOLOZZO, F.P., WENTZ, I., POSTAL, A.T., PADILHA, A.P.,
LECZNIESKI, L.F.BERNARDI, M.L. Armazenamento de sêmen suíno a 5 ºC de acordo
com o período de incubação e a taxa de resfriamento. In: X CONGRESSO BRASILEIRO
DE VETERINÁRIOS ESPECIALISTAS EM SUÍNOS, Anais,v.2,
Porto Alegre-RS,
p.245-246, 2001c.
KOMMISRUD, E., PAULENZ, H., SEHESTED, E. GREVLE, I.S. Influence of boar and
semen parameters on motility and acrossome integrity in liquid boar semen stored for five
days. Acta Vetrinaria Scandinavica, 43 (1), 49 –55 , 2002.
KOTZIAS-BANDEIRA, E. Influência de diferntes diluentes e temperaturas de refrigeração
sobre a qualidade de sêmen suíno. Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci., v.36, n.4. São Paulo, 1999.
KUMUS S.A. (Ed.) Manual de inseminácion artificial porcina. Madrid (Espanha), 1993.
81p.
MARIANO, M.S., WENTZ, I., GUIDON, A.L., MEINCKE,W. Sêmen suíno com
diferentes resistências à conservação no estado liquido e ao congelamento: Características
biológicas. Rev. Bras. Reprod. Anim., 16 (3-4): 149-160, 1992.
MARTIN RILLO, S., MARTINEZ, E., GARCIA ANTIGA, C., DE ALBA, C. Boar Semen
evaluation in practise. Reprod. Dom. Anim., v.31, p.519-526, Berlim, 1996.
MAXWELL, W.M.C., JOHNSON, L. A. Membrane status of boar spermatozoa after
cooling or cryopreservation. Theriogenology, 48, 209-219, 1997.
MEDRANO, A., WATSON, A., HOLT, W.V. Importance of cooling rate and animal
variability for boar sperm cryopreservation: insights from the cryomicroscope.
Reproduction, 123 (2), 315-322, 2002.
NASCIMENTO, E. F., VALE FILHO, V. R., SILVA FILHO, J. M., NASCIMENTO, J. F.
K. Efeito da taca de resfriamento sobre a motilidade, sobrevivência e morfologia
espermática de varrões. Arq. Brás. Méd. Vet. Zootec., v.50, n.6, p.691-694, 1998.
POLGE, C. Artificial insemination in Pigs. Vet. Rec., v.68, n.4, p.62-75, 1956
PURSEL V. G., JOHNSON L. A. Distribution of glutamic oxaloacetic transaminase
dehydrogenase activities in boar semen after cold shock and freezing. Cryobiology. v. 7, p.
141-144, 1970.
PURSEL, V. G., JOHNSON, L. A., RAMPACEK, G. B. Acrossome morfology of boar
spermatozoa incubated before cold shock. J. Anim. Sci., v.34 n.2, p.278-283, 1972.
PURSEL, V. G., JOHNSON, L. A., SCHUMAN, L. L. Fertilizing capacity of boar semen
stored at 15 ºC. J. Anim. Sci., v.37, n.2, 1973a.
PURSEL, V.G., SCULMAN, L.L., JOHNSON, L.A. Effect of holding time on storage of
boar spermatozoa at 5 ºC. J. Anim. Sci., v.37, n.3, 1973b.
TONIOLLI, R., BUSSIERE, J., COUROT, M. MAGISTRINI, M. COMBORNAUS, Y.
Effect of indole-3-acetic (plant auxin) on the preservation at 15 ºC of boar semen for
artificial insemination. Rep. Nut. Devel., v.36, p.503-511, 1996.
VALE FILHO, V. R. Patologia do sêmen-diagnóstico andrológico e classificação do Bos
Taurus e Bos Indicus quanto à fertilidade para uso como reprodutor em condições de
Brasil. De um estudo de 1088 touros. UFMG – Escola de veterinária, 2ºed., 1980.
WATSON, P. F. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Anim. Reprod.
Scie., 60-61, p.481-492, 2000.
WATSON, P.F. Cooling of spermatozoa and fertilizing capacity. Reprod. Dom. Anim. 31 :
135- 140, 1996.
WATSON, P. F., PLUMMER, J. M. The responses of boar sperm membranes to cold shock
and cooling. Proceeding in 2th Int. Conf. on Boar Semen Pres., Beltsville-USA, p.187-196,
1990.
ZOU, C. X., YANG, Z. M. Evaluation on sperm quality of freshly ejaculeted boar semen
during in vitro storage under different temperatures. Theriogenology, 53: 1477-1488, 2000.
ARTIGO 3
INCUBAÇÃO DO SÊMEN SUÍNO IN NATURA
Faviano Ricelli da Costa e Moreira1,2, Ricardo Toniolli1, Roberta Nogueira
Chaves1, Michelle Costa e Silva1, Ana Beatriz Graça Duarte1, Jorge Luiz Ferreira 1
1
Escola Superior de Agricultura de Mossoró, Departamento de Medicina
Veterinária, Mossoró-RN.
2
Universidade Estadual do Ceará, Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia
do Sêmen, Fortaleza-CE.
Este artigo será submetido ao periódico Revista Brasileira de Reprodução Animal
INCUBAÇÃO DO SÊMEN SUÍNO IN NATURA
Moreira, F.R.C.1,2,Toniolli, R.1, Chaves, R.N. 1,Silva, M.C., Duarte, A.B.G. 1,
Ferreira, J.L. 1
1
Universidade Estadual do Ceará, Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia
do Sêmen, Fortaleza-CE. 2 Escola Superior de Agricultura de Mossoró, Departamento de
Medicina Veterinária, Mossoró-RN.
RESUMO
O plasma seminal possui diferentes funções sobre o processo de conservação do sêmen.
Neste sentido, o presente trabalho buscou avaliar a influência da incubação do sêmen in
natura, ou seja, no seu próprio plasma seminal sobre a qualidade espermática do ejaculado
utilizado no dia de coleta e conservado à temperatura final de 17 ºC. Foram utilizados 30
ejaculados, provenientes de 05 varrões, os quais foram divididos em 7 tratamentos a seguir:
Tratamento A: Sêmen diluído a 35 ºC e conservado a 17 ºC por 6 horas (controle);
Tratamento B: Sêmen incubado in natura por 1 hora a 35 ºC, diluído a mesma
temperatura e conservado a 17 ºC por 6 horas; Tratamento C Sêmen incubado in natura
por 2 horas a 35 ºC, diluído a mesma temperatura e conservado a 17 ºC por 6 horas;
Tratamento D: Sêmen incubado in natura por 3 horas a 35 ºC, diluído a mesma
temperatura e conservado a 17 ºC por 6 horas; Tratamento E: Sêmen incubado in natura
por 1 hora a 25 ºC, diluído a mesma temperatura e conservado a 17 ºC por 6 horas;
Tratamento F: Sêmen incubado in natura por 2 horas a 25 ºC, diluído a mesma
temperatura e conservado a 17 ºC por 6 horas; Tratamento G: Sêmen incubado in natura
por 3 horas a 25 ºC, diluído a mesma temperatura e conservado a 17 ºC por 6 horas. Foram
analisadas as características de vigor, motilidade e morfologia, onde os testes utilizados
foram os de Mann-Whitney (vigor e motilidade) e teste t de Student (morfologia) a 5%. Os
resultados obtidos mostram que tanto, para o vigor, quanto para a motilidade, houve um
comportamento similar, onde o momento da diluição é o momento crítico para a qualidade
seminal, porém, o TE conseguiu minimizar estes efeitos prejudiciais da diluição,
apresentando os melhores resultados comparados com tratamento controle. Para a
morfologia, tanto na diluição, quanto na análise às 6 horas, o tratamento E apresentou os
melhores resultados em relação ao TA (controle) (p<0,05). Conclui-se que a incubação do
sêmen puro no seu próprio plasma seminal a 25 ºC por 1 hora traz efeitos positivos,
aumentando a resistência da célula espermática ao choque térmico.
Palavras-chave: Sêmen, in natura, suíno, incubação, refrigeração, plasma seminal
ABSTRACT
IN NATURA SWINE SEMEN INCUBATION
The seminal plasma has different functions about the semen preservation process, therefore
this work searched to determine the influence on the incubation of the in natura semen,
about the quality of the seminal plasma used on the day of collection and preserved at final
temperature 17 ºC. There were used 30 ejaculated, from 05 boars, and divided in the
following 7 treatments: Treatment A: Semen diluted at 35 ºC and preserved at 17 ºC for 6
hours (control); Treatment B: Semen incubated in natura for 1 hour at 35 ºC, diluted at 35
ºC and preserved at 17 ºC for 6 hours; Treatment C: Semen incubated in natura for 2
hours at 35 ºC, diluted at 35 ºC and preserved at 17 ºC for 6 hours; Treatment D: Semen
incubated in natura for 3 hours at 35 ºC, diluted at 35 ºC and preserved at 17 ºC for 6
hours; Treatment E: Semen incubated in natura for 1 hour at 25 ºC, diluted at 25 ºC and
preserved at 17 ºC for 6 hours; Treatment F: Semen incubated in natura for 2 hours at 25
ºC, diluted at 25 ºC and preserved at 17 ºC for 6 hours; Treatment G: Semen incubated in
natura for 3 hours at 25 ºC, diluted at 25 ºC and preserved at 17 ºC for 6 hours. The vigor,
motility and morphology characteristics were analyzed, where the used tests were the
MANN-WHITNEY (vigor and motility) and the “t” test of Student (morphology) at 5%.
The obtained results showed that not only for vigor but also for motility were a similar
behavior, where the dilution moment is the critical moment for the seminal quality.
Therefore the treatment E managed to minimize these harmful effects of dilution, showing
the best results compared with treatment control. Not only for the morphology but also the
dilution in the analysis at the 6 hours, the treatment E showed the best results about the
treatment A (control) (p <0,05). Conclusion is that incubation of the pure semen in its own
seminal plasma at 25 ºC for 1 hour brings positive effects, increasing the resistance to
thermo shock of the sperm cell.
Word-key: Semen, in natura, swine, incubation, cooling, seminal plasma
INTRODUÇÃO
O pleno desenvolvimento da inseminação artificial na espécie suína, a exemplo do
que já ocorre em outras espécies animais de exploração econômica depende basicamente da
solução dos problemas relacionados com a conservação do sêmen (Mariano et al., 1992).
Quando os espermatozóides são diluídos com fluidos seminais provenientes das
glândulas acessórias do sistema genital, sua motilidade é mantida por poucas horas
(Johnson et al., 2000). O significado funcional do plasma seminal é bastante questionado
no processo de prenhez, uma vez que se consegue gestação com espermatozóides do
epidídimo (Hafez & Hafez, 2000) e originando estudos conflitantes sobre a sua real função
nos processos in vitro (Maxwell & Johnson, 1999; Barrius et al., 2000). O efeito do plasma
na capacidade fertilizante do espermatozóide necessita ser considerado separadamente das
características da motilidade (Maxwell & Johnson, 1999).
Para Barrius et al. (2000), o plasma seminal contém uma variedade de componentes
bioquímicos, alguns dos quais de relativa especificidade para a regulação espermática e a
sua viabilidade. Segundo Metz et al. (1990) apud Barrius et al. (2000), o espermatozóide
suíno, através de sua membrana plasmática, absorve uma grande quantidade de proteínas do
plasma seminal, o que necessariamente interfere nos processos de pré-fecundação.
Durante processos como a criopreservação, a utilização da incubação do sêmen in
natura no seu próprio plasma, vêm demonstrando resultados favoráveis (Pursel et al.,
1973b), onde para estes autores, um período de pré-congelação, durante 2 a 7 horas,
permite ao espermatozóide desenvolver uma resistência ao choque térmico. Estes mesmos
autores, em 1975, afirmam que para a utilização do sêmen congelado, o plasma seminal
deve ser retirado a fim de evitar efeitos tóxicos. Há evidências de que a remoção do plasma
seminal
durante
os
processos
de
diluição,
incubação,
refrigeração
e
congelação/descongelação alteram a função espermática (Maxwell & Johnson, 1999).
O presente trabalho teve por objetivo avaliar a influência da incubação do sêmen in
natura sobre a qualidade espermática do ejaculado utilizado no dia de coleta e conservado à
temperatura final de 17 ºC.
MATERIAL E MÉTODOS
Local do experimento e Animais
O experimento foi realizado no Laboratório de Reprodução Suína e Tecnologia de
Sêmen (LRSTS) da Faculdade de Veterinária (FAVET) da Universidade Estadual do Ceará
(UECE), onde foram utilizados 05 reprodutores pertencentes ao LRSTS, sendo três
reprodutores puros (Duroc =2 e Landrace =1) e dois híbridos (Dalland =2). Os animais
tinham idade variando entre 1,5 e 2,5 anos e foram mantidos em instalações convencionais
para a criação de suínos.
Coleta de sêmen
Os ejaculados foram coletados pela técnica da mão enluvada (Johnson et al., 2000)
em copo coletor com capacidade para 500 ml, previamente aquecido à 37ºC. Foi
aproveitado o ejaculado total de cada reprodutor após separação da parte gelatinosa.
Apenas os ejaculados com um mínimo de vigor 3,0 e motilidade 70% (CBRA,1998), foram
aproveitados para o experimento.
Parâmetros dos movimentos espermáticos
Para a avaliação das características de vigor espermático (notas de 0 a 5) e
motilidade espermática (valores de 0 a 100% - Martin Rillo et al., 1996), o sêmen foi
incubado em banho-maria a 39 °C e as leituras foram feitas após 5 minutos de incubação (
vide quadros 1a, 1b e 1c, nos anexos).
Avaliação morfológica da célula espermática
Para a avaliação morfológica, foi retirada de cada tratamento, 5 minutos após a
incubação a 39 ºC com BTS, uma alíquota de 0,1 ml de sêmen e diluída em 0,1 ml de
solução salina 0,9% formolizada (formol a uma concentração de 0,1%) (CBRA, 1998), para
avaliação do percentual de células espermáticas morfologicamente normais e com
alterações (Pursel et al.,1972; Johnson et al., 2000), foram contadas 200 células por
amostra (lâmina - Vale Filho, 1980). As análises morfológicas compreenderam os
principais defeitos de acrossomo (Kumus, 1993) As classificações para o acrossomo,
seguiram os dados de Pursel et al., 1972.
Foram eleitos dois momentos por tratamento para se retirar amostras para a análise
morfológica espermática: 1) logo após a diluição, 2) após 6 horas de conservação a 17 ºC
para cada tratamento.
Conservação do sêmen pós-coleta
Cada ejaculado foi diluído (35 ou 25 ºC) e conservado a uma temperatura de 17 °C
(Pursel et al., 1973a), sendo mantidos em tubos de ensaio com capacidade par 5ml. A cada
momento de análise, foram retirados os tubos de ensaio referentes a cada macho e cada
tratamento, incubados em banho-maria a 39 ºC, por 5 minutos, para as análises. As
amostras destinadas às avaliações foram conservadas em tubos de ensaios fechados.
Análise estatística
O teste utilizado foi o de Mann-Whitney (5%), para o vigor e a motilidade. Para a
morfologia utilizou-se o teste “t” de student (5%). A análise das diferenças entre médias foi
realizada através do programa de estatística STAT VIEW (versão de 1994).
Formação dos tratamentos experimentais
Foram utilizados 30 ejaculados divididos em sete tratamentos. Retirou-se de cada
ejaculado um total de 4,9 x 109 sptz, onde este total foi diluído com diluidor de Beltsville
(BTS), perfazendo um volume final de 140 ml (o volume de sêmen utilizado variou de
acordo com a concentração de cada macho, respeitando-se a concentração final de 35 x 106
sptz/ml).
O sêmen foi conservado em geladeira a 17 ºC por até 6 horas após a diluição,
durante os quais foram realizadas até três análises no sêmen in natura incubado e quatro
análises no sêmen diluído (0h, 1h, 3h e 6h) para o vigor e a motilidade espermática. Para as
análises morfológicas (alterações acrossomais) foram utilizados os ejaculados provenientes
dos momentos 0 e 6h. O ejaculado de cada macho foi repartido nos 7 tratamentos, como
pode ser observado no esquema a seguir:
Tratamento A: Após a coleta, o sêmen foi diluído em BTS a 35 ºC e levado direto
para geladeira a 17 ºC por 6 horas (Controle) – TA, vide gráfico 11;
Tratamento B: Após a coleta, o sêmen foi mantido a 35 ºC durante 1 hora, diluído
à mesma temperatura e levado para geladeira a 17 ºC por 6 horas - TB, vide gráfico 12;
Tratamento C: Após a coleta, o sêmen foi mantido a 35 ºC durante 2 horas, diluído
à mesma temperatura e levado para geladeira a 17 ºC por 6 horas - TC, vide gráfico 13;
Tratamento D: Após a coleta, o sêmen foi mantido a 35 ºC durante 3 horas, diluído
à mesma temperatura e levado para geladeira a 17 ºC por 6 horas - TD, vide gráfico 14;
Tratamento E: Após a coleta, o sêmen foi mantido a 25 ºC durante 1 hora, diluído
à mesma temperatura e levado para geladeira a 17 ºC por 6 horas - TE, vide gráfico 15;
Tratamento F: Após a coleta, o sêmen foi mantido a 25 ºC durante 2 horas, diluído
à mesma temperatura e levado para geladeira a 17 ºC por 6 horas - TF, vide gráfico 16;
Tratamento G: Após a coleta, o sêmen foi mantido a 25 ºC durante 3 horas, diluído
à mesma temperatura e levado para geladeira a 17 ºC por 6 horas - TG, vide gráfico 17.
Foram realizadas análises seqüenciais em todos os tratamentos, dos quais foram
retiradas amostras seminais, colocadas em banho-maria a 39 ºC por 5 minutos para
avaliação das características do vigor e da motilidade. Estas análises tiveram por finalidade,
a mensuração da sensibilidade dos espermatozóides durante o período de incubação do
sêmen até a estocagem das doses em geladeira a 17 ºC.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Avaliação dos parâmetros de movimento espermático
As primeiras observações foram realizadas dentro de cada tratamento, onde para a
característica do vigor, como pode ser observado na tabela 1, houve diferenças
significativas entre a análise do sêmen puro e a análise do sêmen diluído, em todos os
tratamentos (p<0,05). Com relação às análises no sêmen diluído e as análises efetuadas na
primeira hora pós-diluição, encontrou-se que apenas nos tratamentos A e D, houve
diferenças significativas entre estas análises (p<0,05). Outra consideração a ser feita, com
relação às análises efetuadas entre a 1ª e a 6ª hora, é que somente nos TD e TG houve
diferenças significativas (p<0,05).
Quando a comparação foi realizada entre os diferentes tratamentos, percebeu-se que
na análise do vigor para o sêmen in natura (tabela 1), o tratamento A ou controle foi
estatisticamente superior aos demais tratamentos. Para a análise no sêmen diluído, o
tratamento controle (3,3) foi diferente estatisticamente apenas para o tratamento D (2,6)
(p<0,05). Na análise do sêmen à primeira hora da diluição, os tratamentos B (3,1), D (3,2),
E (3,1) e G (3,3) foram estatisticamente superiores ao tratamento controle (2,7). Na terceira
hora de análise pós-diluição, ocorreu uma intensificação deste comportamento, onde o
tratamento controle, foi estatisticamente inferior a todos os tratamentos (p<0,05). Na sexta
hora, ocorre uma estabilização dos resultados, com todos os tratamentos não apresentando
diferenças estatísticas (p>0,05).
Para a motilidade espermática (tabela 2), o comportamento de todos os tratamentos
ocorre de maneira semelhante ao vigor, isto é, existem diferenças entre a análise do sêmen
in natura com o momento da diluição em todos os tratamentos. Entre as análises da
diluição com a primeira hora subseqüente, com exceção dos tratamentos A e D, não houve
diferenças significativas nos valores de motilidade. Entre a primeira e a sexta hora não
houve variação nos percentuais de motilidade, com exceção do tratamento G, onde a
análise da primeira hora (69%) foi estatisticamente superior à da sexta hora (63%)
(p<0,05).
Ainda com relação à motilidade, quando a comparação foi realizada entre os
tratamentos, percebeu-se mais uma vez que no momento da análise do sêmen in natura, o
tratamento controle apresentou os melhores percentuais (p<0,05). Para o momento da
diluição, o tratamento A (69%) continua como o melhor, porém ele difere estatisticamente
apenas para o tratamento D (53%) (p<0,05). Para a análise na primeira hora pós-diluição, o
tratamento controle (60%), desta vez, é o que apresenta os resultados menos favoráveis,
porém apenas para os lotes D (66%), E (65%) e G (69%) houve diferenças significativas
(p<0,05). Para a terceira hora de análise, o tratamento controle (57%) continua com os
resultados menos favoráveis, diferindo estatisticamente de todos os outros tratamentos, com
exceção do tratamento G (64%) (p<0,05). Na sexta hora, não houve diferenças estatísticas
entre os tratamentos (p<0,05).
A motilidade (93%) para o lote controle é muito similar (92%) à encontrada por Zou
& Yang (2000). Os resultados encontrados neste trabalho, tanto em relação ao vigor, quanto
à motilidade, principalmente com relação às quedas dos valores entre o momento do
sêmen puro e a diluição, vêm mostrar como o efeito diluição influencia na qualidade
espermática. Esta situação é evidenciada por outros autores (Bamba & Cran, 1988, Perez
Marcos et al., 1991, Johnson et. al., 2000).
A utilização de período de incubação antes de se chegar à temperatura final de
conservação (17 ºC) não é utilizada de maneira rotineira nas centrais de inseminação
artificial. Segundo Moreira (2001), a incubação do sêmen suíno diluído, durante o dia de
coleta, não conseguiu aumentar as características de vigor e motilidade do ejaculado, e foi
identificado como ponto crítico para a determinação da qualidade seminal, o momento da
diluição. Vários autores (Pursel et al., 1972; Weitze et al., 1990; Bwanga, 1991; Maxwell
& Johnson, 1999; Rodríguez-Martinez & Eriksson, 2000; Barrius et al., 2000) teceram
considerações sobre a importância e utilização do plasma seminal na qualidade
espermática, porém, sempre utilizando o processamento do sêmen para a congelação ou
para a refrigeração à temperatura de 5 ºC.
As variações existentes no comportamento do sêmen durante as seis horas de
conservação pós-diluição nos diferentes tratamentos mostra que a célula espermática
necessita de um período de adaptação a um novo ambiente.
Avaliações Morfológicas
Para o percentual de alterações acrossomais (tabela 3) encontradas, dentro da cada
tratamento, houve uma redução significativa no número de acrossomos normais em quase
todos os tratamentos entre o momento da diluição e a análise efetuada 6 horas após C (98
vs. 96,5%), D (98 vs. 96,5%), E (98,5 vs. 97%) e F (98,5 vs. 96,5%). Mais uma vez,
evidencia-se o efeito diluição sobre a qualidade espermática.
O comparativo entre os tratamentos mostrou que a incubação, no momento da
diluição, de 1 (E) e 2 horas (F) à 25 ºC foram estatisticamente superiores ao tratamento
controle (A). Na análise realizada 6 horas após, apenas o tratamento E (97%) conservou um
maior número de células morfologicamente normais com relação ao tratamento controle
(95,5%) e ao tratamento B (95%) (p<0,05).
A incubação do sêmen in natura aumenta a resistência da célula espermática
devido às características do plasma seminal de estar associado com a susceptibilidade ao
choque térmico (Bwanga, 1991), provavelmente devido a ligações às proteínas básicas da
membrana da célula espermática (Moore et al., 1976 apud Bwanga, 1991).
Rodriguez-Martinez & Eriksson (2000) citam que uma variedade de proteínas do
plasma seminal tem sido identificada como capazes de influenciar a habilidade fecundante
dos espermatozóides e, por conseguinte serem preditoras de fertilidade. Entre estas
proteínas, encontram-se as espermoadesinas, que secretadas pelas vesículas seminais,
aderem-se a porção rostral do acrossomo durante a ejaculação e seguem o espermatozóide
tanto in vitro quanto in vivo. Em geral, o plasma seminal contém proteínas específicas que
são capazes de inibir a desestabilização inata da membrana fluida do espermatozóide
(Ollero et al.,1998 apud Rodriguez-Martinez & Eriksson, 2000).
Bamba & Cran (1988), através da integridade acrossomal, mostraram que os
ejaculados diluídos às temperaturas de 5, 15 ou 25 ºC possuem resultados estatisticamente
superiores para aqueles ejaculados diluídos à 39 ºC, principalmente no momento da análise
pós-descongelação. Já Zou & Yang (2000) utilizando um processo de incubação do sêmen
à 39 ºC, teve uma queda para 95,6 % e 89,1% de espermatozóides com acrossomo normal
por 1 e 4 horas, respectivamente, utilizando o corante azul de comassie. Os dados deste
trabalho foram ligeiramente superiores, mesmo com um tempo de 35 ºC por 3 horas (98%).
Estas diferenças podem ser devido ao método de avaliação utilizado para se aferir esta
percentagem de alterações. Zou & Yang (2000), também testando métodos de avaliação
para se aferir a percentagem de alterações espermáticas, encontrou, através da avaliação
pela aglutinina de amendoim um percentual de 68,4 e 54,8% de espermatozóides normais
para uma temperatura de 39 ºC por um tempo de 1 e 4 horas respectivamente.
Esta dependência da temperatura e do momento de diluição é sugestivo de uma
mudança na permeabilidade da membrana acrossomal, onde, em temperaturas mais baixas
(25ºC), consegue-se diminuir esta permeabilidade e, conseqüentemente preservar um maior
numero de células espermáticas morfologicamente normais (Bamba & Cran, 1988). O que
vem de acordo com os dados do nosso trabalho, onde o TE, que utilizou como temperatura
de diluição a de 25 ºC, foi o que apresentou as menores percentagens de alterações
acrossomais com relação ao tratamento controle (p<0,05).
Como considerações finais do trabalho encontrou-se que a diluição continua sendo
um obstáculo à melhoria da qualidade seminal dentro do processamento do sêmen suíno, o
que dificulta a expansão da biotécnica da inseminação artificial em regiões como o nordeste
brasileiro. Por outro lado, os resultados aqui apresentados com relação à incubação do
sêmen in natura mostram que o efeito positivo do contato prolongado do espermatozóide
com seu próprio plasma seminal pode fornecer respostas para se aumentar a qualidade dos
ejaculados utilizados no dia de coleta.
Tabela 1. Análise do vigor espermático do sêmen suíno
no dia de coleta durante 6 horas de conservação após uma
incubação de até 3 horas do sêmen in natura.
Tratamentos Puro
A
B
C
D
E
F
G
Dil
1h
4,4aA 3,3aB
2,7aC
3,9bA 3,0aB 3,1bB
3,8bcA 2,8abB 2,9abB
3,5cA 2,6bB 3,2bC
4,0bA 3,1aB 3,1bB
4,1bA 3,1aB 3,0abB
3,9bcA 3,0abBC 3,3bB
3h
6h
2,6aC
3,1bB
3,0bB
3,0bBC
3,0bB
3,0bB
3,0bBC
2,9aC
2,9aB
2,9aB
2,8aB
3,0aB
2,8aB
2,8aC
Letras minúsculas diferentes indicam diferenças significativas
entre linhas ( p < 0,05)
Letras maiúsculas diferentes indicam diferenças significativas
entre colunas ( p < 0,05)
Tabela 2. Motilidade espermática do sêmen suíno no dia
de coleta durante 6 horas de conservação após uma
incubação de até 3 horas do sêmen in natura.
Tratamentos Puro
A
B
C
D
E
F
G
93aA
84bA
84bA
76cA
85bA
84bA
82bcA
Dil
1h
3h
6h
69aB
65aB
57abB
53bB
65aB
64aB
62abBC
60aC
64abB
63abB
66bC
65bB
63abB
69bB
57aC
65bB
65bB
67bC
66bB
65bB
64abBC
62aBC
63aB
63aB
63aBC
64aB
63aB
63aC
Letras minúsculas diferentes indicam diferenças significativas
entre linhas ( p < 0,05)
Letras maiúsculas diferentes indicam diferenças significativas
entre colunas ( p < 0,05)
Tabela
3.
Análise
morfológica
do
espermatozóide suíno no dia de coleta durante
6 horas de conservação após uma incubação
de até 3 horas do sêmen in natura.
Tratamentos
A
B
C
D
E
F
G
DIL
96,0%aA
96,0%aA
98,0%abA
98,0%abA
98,5%bA
98,5%bA
97,5%abA
6h
95,5%aA
95,0%aA
96,5%abB
96,5%abB
97,0%bB
96,5%abB
97,0%abA
Letras minúsculas diferentes indicam diferenças
significativas entre linhas (p < 0,05)
Letras maiúsculas diferentes indicam diferenças
significativas entre colunas ( p < 0,05)
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BAMBA, K., CRAN, D. G. Further studies on rapid dilution and warming of boar semen. J.
reprod. Fert., 82, p. 509-518, 1988.
BARRIUS, B., PÉREZ-PÉ, R., GALLEGO, M., TATO, A., OSADA, J., MUINÔBLANCO, T., CEBRIÁN-PÉREZ, J. A., Seminal plasma proteins revert the cold-shock
damage on ram sperm membrane, Biology of reproduction, 63, 1531-1537, 2000.
BWANGA, C. O. Cryopreservation of boar sperm. Acta Vet. Scand., 32, p.431-453, 1991.
COLÉGIO BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL. Manual para exame andrológico
e avaliação de sêmen animal., 2º ed., Belo Horizonte, 1998.
HAFEZ, E.S.E., HAFEZ, B. Reproduction in farm animals. 7th. Ed. Lippincott Williams &
Wilkins. 509p., 2000.
JOHNSON, L. A ., WEITZE, K. F., FISER, P., MAXWELL, W. M. C. Storage of boar
semen. Anim. Rep. Sci., 62: 143-172, 2000.
KUMUS S.A. (Ed.) Manual de inseminácion artificial porcina. Madrid (Espanha), 1993.
81p.
MARIANO, M.S., WENTZ, I., GUIDON, A.L., MEINCKE,W. Sêmen suíno com
diferentes resistências à conservação no estado liquido e ao congelamento: Características
biológicas. Rev. Bras. Reprod. Anim., 16 (3-4): 149-160, 1992.
MARTIN RILLO, S., MARTINEZ, E., GARCIA ANTIGA, C., DE ALBA, C. Boar Semen
evaluation in practise. Reprod. Dom. Anim., v.31, p.519-526, Berlim, 1996.
MAXWELL, W. M. C., JOHNSON, L. A. Phisiology of spermatozoa at high dilution rates:
the influence of seminal plasma. Theriogenology, 52, 1353-1362, 1999.
MOREIRA, F.R.C., TONIOLLI, R., DUARTE, A.B.G., CHAVES, R.N. Comportamento
do sêmen suíno diluído durante o dia de coleta frente a vários tempos e temperaturas de
incubação. IN: VI SEMANA UNIVERSITÁRIA DA UNIVERSIDADE ESTADUAL DO
CEARÁ, Fortaleza/Ceará, 2001.
PEREZ MARCOS, C., SANCHEZ, R., PALACIO, M., PURSEL, V.G., PEREZ GARCIA,
T., MARTIN RILLO, S. Effects of dilution on the motility and acrosome morphology of
boar spermatozoa stored at 15 ºC. Reprod. Dom. Anim., 26, 112-116, 1991.
PURSEL, V. G., JOHNSON, L. A., RAMPACEK, G. B. Acrossome morfology of boar
spermatozoa incubated before cold shock. J. Anim. Sci., v.34 n.2, p.278-283, 1972.
PURSEL, V. G., JOHNSON, L. A., SCHUMAN, L. L. Fertilizing capacity of boar semen
stored at 15 ºC. J. Anim. Sci., v.37, n.2, 1973a.
PURSEL, V.G., JOHNSON, L.A., SCHULMAN, L.L., Effect of dilution, seminal plasma,
and incubation period on cold shock susceptibility of boar spermatozoa. J. Anim.Sci., v.37,
528-531, 1973b.
PURSEL V. G., JOHNSON L. A., SCHULMAN L. L. Freezing of boar spermatozoa:
fertilizing capacity with concentrated semen and a new thawing procedure. J. Anim. Sci. v.
40, p. 99-102, 1975.
RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ, H., ERIKSSON, B. Evaluación del semen de verraco y su
relación con fertilidad. In: SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE INSEMINAÇÃO
ARTIFICIAL EM SUÍNOS, Anais. Flores da Cunha-RS, 2000, p.13-33
TONIOLLI, R., BUSSIERE, J., COUROT, M. MAGISTRINI, M. COMBORNAUS, Y.
Effect of indole-3-acetic (plant auxin) on the preservation at 15 ºC of boar semen for
artificial insemination. Rep. Nut. Devel., v.36, p.503-511, 1996.
VALE FILHO, V. R. Patologia do sêmen-diagnóstico andrológico e classificação do Bos
Taurus e Bos Indicus quanto à fertilidade para uso como reprodutor em condições de
Brasil. De um estudo de 1088 touros. UFMG – Escola de veterinária, 2ºed., 1980.
WEITZE, K.F., STAMPA, E., RITCHER, L., WILLMEN, T., WABERSKI, D. Fertility of
frozen boar semen: influence of packaging, number of inseminations, and seminal plasma.
Proceeding in 2th Int. Conf. on Boar Semen Pres., Beltsville-USA, p.139-142, 1990.
ZOU, C. X., YANG, Z. M. Evaluation on sperm quality of freshly ejaculeted boar semen
during in vitro storage under different temperatures. Theriogenology, 53: 1477-1488, 2000.
CONCLUSÕES
Pode-se concluir que o protocolo de incubação do sêmen suíno diluído não forneceu
condições para a utilização do ejaculado em condições de conservação mais prolongada
do sêmen, porém com o uso do sêmen durante o dia de coleta pode-se obter ganhos na
produtividade de uma central de inseminação artificial/granja. Contudo, encontrou-se
ainda um forte efeito negativo da diluição na qualidade seminal, o qual constitui-se
como ponto crítico no processamento do sêmen suíno e que ainda necessita de mais
informações para se entender realmente o que ocorre com o espermatozóide durante
este fenômeno e o que pode ser feito para tentar minimizar os seus efeitos. Uma
possibilidade testada foi a pré-incubação antes da diluição do sêmen no seu próprio
plasma seminal, os resultados aqui apresentados com relação à incubação do sêmen in
natura mostram que, o efeito positivo do contato prolongado do espermatozóide com
seu próprio plasma seminal pode fornecer respostas para se manter a qualidade dos
ejaculados utilizados no dia de coleta. Entretanto, a diluição continua sendo um
obstáculo à manutenção da qualidade seminal dentro do beneficiamento do sêmen
suíno, o que dificulta a expansão da biotécnica da inseminação artificial.
PERSPECTIVAS
Existe a necessidade do aprofundamento das pesquisas referentes à conservação do
sêmen do varrão a fim de que se possa a médio prazo expandir a IA, principalmente para
regiões não tradicionais da suinocultura e distantes de centrais de inseminação artificial,
como é o caso da região nordeste. Através da busca de métodos de diluição e/ou
conservação da dose seminal pode-se compensar a sensibilidade do sptz suíno aos
processos de abaixamento da temperatura e conseqüentemente aumentar o tempo de
conservação da dose inseminante.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALTHOUSE, G. C., WILSON, M. E., KUSTER, C., PARSLEY, M. Characterization of
lower temperature storage limitations of fresh-extended porcine semen. Theriogenology,
50, p.535:543, 1998.
BAMBA, K., CRAN, D. G. Further studies on rapid dilution and warming of boar semen. J.
reprod. Fert., 82, p. 509-518, 1988.
BARRIUS, B., PÉREZ-PÉ, R., GALLEGO, M., TATO, A., OSADA, J., MUINÔBLANCO, T., CEBRIÁN-PÉREZ, J. A., Seminal plasma proteins revert the cold-shock
damage on ram sperm membrane, Biology of reproduction, 63, 1531-1537, 2000.
BUHR, M.M. Preservation of boar sperm alters membrane molecular dynamics.
Proceeding in 2th Int. Conf. on Boar Semen Pres., Beltsville-USA, p 81-93, 1990.
BUHR, M. M., CURTIS, E. F., SOMNAPAN KAKUDA, N. Composition and behavior oh
head membrane lipids of fresh and cryopreserved boar sperm. Cryobiology, 31, p. 224-238,
1994.
BLICHFELD, T., ALMLID, T., STAVNE, S. E. Liquid preservation of boar semen in Kiev
or BTS - A field comparasion. Proceeding of 11th Int. Cong. Anim. Reprod. and Artif.
Insem., Dublin, p.229-231, 1988.
BONET, S., BRIZ, M., FRADERA, A. Ultraestructural abnormalites of boar spermatozoa.
Theriogenolgy, v.40, p.383-396, 1993
BORTOLOZZO, F. P., WENTZ, I. Avanços na Inseminação artificial em suínos. In: I
Congresso Nordestino de Suinocultura, Anais. Fortaleza-CE, 2002, p. 56-62.
BWANGA, C. O. Cryopreservation of boar sperm. Acta Vet. Scand., 32, p.431-453, 1991.
BWANGA C. O., MWANGA A; ROFRIGUEZ-MARTINEZ H
Post thaw
motility,
acrosome morphology and fertility of deep-frozen boar semen package in plastic puc-bags.
In: Cong. Anim. Reprod., The Hagne, 420-422, 1992.
CASTAGNA, C. D., BORTOLOZZO, F. P., WENTZ, I. Estratégias de inseminação
artificial
na
suinocultura
moderna.
In:
X
CONGRESSO
BRASILEIRO
DE
VETERINÁRIOS ESPECIALISTAS EM SUÍNOS, Anais. Porto Alegre-RS, v. 1, p.143150, 2001.
CAVIN, A. T., BUHR, M. M. Effect of temperature on the fluidity of boar sperm
membranes. J. Reprod. Fert., 85, 533-540, 1989.
COLÉGIO BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL. Manual para exame andrológico
e avaliação de sêmen animal., 2º ed., Belo Horizonte, 1998.
COURTENS, J.L. & PAQUIGNON, M. Ultraestructure of fresh, frozen, and frozen-thawd
spermatozoa of the boar. Proceeding in 2th Int. Conf. on Boar Semen Pres., BeltsvilleUSA, p.61-87, 1990.
CROSS, N. L. Role of cholesterol in sperm capacitation. Biology of Reproduction, 59, 711, 1998
DARIN-BENNETT, A., WHITE, I. G. Influence of the cholesterol content of mammalian
spermatozoa on susceptibility to cold-shock. Animal Breeding Abstracts, v.46, n.4, p.197,
1978.
DE LEEUW, F. E., COLENBRANDER, B., VERKLEIJ, A. J. The role membrane damage
plays in cold shock and freezing injury. Reprod. Domest. Anim. (suppl. 1), 95-104, 1990.
DESCHAMPS, J. C., LUCIA JR., T., CORRÊA, M. N., MACEDO JR., M. C.,
RHEIREGANTZ, M. G. T. Otimização da eficiência de produção a partir do uso de
biotécnicas reprodutivas. Rev. Bras. Repro. Anim., v.24, n.1, p.21-29, 2000.
ERIKSSON, B.M., VAZQUEZ, J.M., MARTINEZ, E.A., ROCA, J., LUCAS, X.,
RODRÍGUEZ-MARTINEZ, H. Effects oh holding time during cooling and of type of
package on plasma membrane integrity, motility and in vitro oocyte penetration ability of
frozen-thawed boar spermatozoa. Theriogenology 55 : 1593-1605, 2001.
FLOWERS, W. L. Artificial insemination in swine, Agri-pratice, v.13, n. 2, p.36-40, 1992.
HAFEZ, E.S.E., HAFEZ, B. Reproduction in farm animals. 7th. Ed. Lippincott Williams &
Wilkins. 509p., 2000.
HUO, L., MA, X., YANG, Z. Assessment of sperm viability, mitochondrial activity,
capacitation and acrossome intactness in extended boar semen during long-term storage.
Theriogenology, p. 1-12, 2002.
JOHNSON, L. A ., WEITZE, K. F., FISER, P., MAXWELL, W. M. C. Storage of boar
semen. Anim. Rep. Sci., 62: 143-172, 2000.
KATZER, L.H., BORTOLOZZO, F.P., WENTZ, I., BERNARDI, M.L., PEIXOTO, C.H.,
VIDOR, R.M. Viabilidade do sêmen suíno armazenado a 12 ºC e 5 ºC após incubação a 17
ºC. In: X CONGRESSO BRASILEIRO DE VETERINÁRIOS ESPECIALISTAS EM
SUÍNOS, Anais,v.2, Porto Alegre-RS, p.241-242, 2001a.
KATZER, L.H., BERNARDI, M.L., PADILHA, A.P., BORTOLOZZO, F.P., WENTZ, I.,
COSTI, G., DIEHL, G.N. Diferentes temperaturas e diluentes no resfriamento do sêmen
suíno. In: X CONGRESSO BRASILEIRO DE VETERINÁRIOS ESPECIALISTAS EM
SUÍNOS, Anais,v.2, Porto Alegre-RS, p.243-244, 2001b.
KATZER, L.H., BORTOLOZZO, F.P., WENTZ, I., POSTAL, A.T., PADILHA, A.P.,
LECZNIESKI, L.F.BERNARDI, M.L. Armazenamento de sêmen suíno a 5 ºC de acordo
com o período de incubação e a taxa de resfriamento. In: X CONGRESSO BRASILEIRO
DE VETERINÁRIOS ESPECIALISTAS EM SUÍNOS, Anais,v.2,
Porto Alegre-RS,
p.245-246, 2001c.
KOMMISRUD, E., PAULENZ, H., SEHESTED, E. GREVLE, I.S. Influence of boar and
semen parameters on motility and acrossome integrity in liquid boar semen stored for five
days. Acta Vetrinaria Scandinavica, 43 (1), 49 –55 , 2002.
KOTZIAS-BANDEIRA, E. Influência de diferntes diluentes e temperaturas de refrigeração
sobre a qualidade de sêmen suíno. Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci., v.36, n.4. São Paulo, 1999.
KUMUS S.A. (Ed.) Manual de inseminácion artificial porcina. Madrid (Espanha), 1993.
81p.
KUSTER, C. E. & ALTHOUSE, G. C. The fecundity of porcine semen stored for 2 to 6
days in Androhep® and x- cell™ extenders. Theriogenology, v.52, p.365-376, 1999.
MARIANO, M.S., WENTZ, I., GUIDON, A.L., MEINCKE,W. Sêmen suíno com
diferentes resistências à conservação no estado liquido e ao congelamento: Características
biológicas. Rev. Bras. Reprod. Anim., 16 (3-4): 149-160, 1992.
MARTIN RILLO, S., MARTINEZ, E., GARCIA ANTIGA, C., DE ALBA, C. Boar Semen
evaluation in practise. Reprod. Dom. Anim., v.31, p.519-526, Berlim, 1996.
MAXWELL, W.M.C., JOHNSON, L. A. Membrane status of boar spermatozoa after
cooling or cryopreservation. Theriogenology, 48, 209-219, 1997.
MAXWELL, W. M. C., JOHSSON, L. A. Phisiology of spermatozoa at high dilution rates:
the influence of seminal plasma. Theriogenology, 52, 1353-1362, 1999.
MEDRANO, A., WATSON, A., HOLT, W.V. Importance of cooling rate and animal
variability for boar sperm cryopreservation: insights from the cryomicroscope.
Reproduction, 123 (2), 315-322, 2002.
MIES FILHO, A. Inseminação artificial. 6º ed. Porto Alegre. Sulina, v.2, 1987.
MOREIRA, F. R. C., TONIOLLI, R. JATAHY, P. C., SANTOS, B.S. Estudo de diferentes
diluidores na utilização do sêmen do varrão. Rev. Ciências e Tecnologia/UECE, v.2, n.2,
Fortaleza-Ce, 2000.
MOREIRA, F.R.C., TONIOLLI,R., DUARTE, A. B.G. Tempos de equilíbrio no
processamento do sêmen suíno. Rev. Bras. Rep. Anim., v.25, n.3, p. 444-446, 2001a.
MOREIRA, F.R.C., TONIOLLI, R., DUARTE, A.B.G., CHAVES, R.N. Comportamento
do sêmen suíno diluído durante o dia de coleta frente a vários tempos e temperaturas de
incubação. IN: VI SEMANA UNIVERSITÁRIA DA UNIVERSIDADE ESTADUAL DO
CEARÁ, Fortaleza/Ceará, 2001.
NASCIMENTO, E. F., VALE FILHO, V. R., SILVA FILHO, J. M., NASCIMENTO, J. F.
K. Efeito da taca de resfriamento sobre a motilidade, sobrevivência e morfologia
espermática de varrões. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.50, n.6, p.691-694, 1998.
NASCIMENTO,
E.
F.
Diluidores
e
resfriamento
do
sêmen
suíno.
Disponível:http://www.suino.com.br/suino_product.asp?pf_id=31214&dept_id03140.
Acesso em 03.jul.2001
PAQUIGNON, M., BUSSIERE, J., BARITEAU, F. Résultats recents en matiére de
technologie de la conservation de la semence de verrat. Journées Rech. Porc. en France,
v.19, p.63-78, 1987.
PARKS, J. E., GRAHAM, J. K.
Effects of cryopreservation procedures on sperm
membranes. Theriogenology, v.38, n.2, p.209-222, 1992.
PEREZ MARCOS, C., SANCHEZ, R., PALACIO, M., PURSEL, V.G., PEREZ GARCIA,
T., MARTIN RILLO, S. Effects of dilution on the motility and acrosome morphology of
boar spermatozoa stored at 15 ºC. Reprod. Dom. Anim., 26, 112-116, 1991.
POLGE, C. Artificial insemination in Pigs. Vet. Rec., v.68, n.4, p.62-75, 1956
PURSEL V. G., JOHNSON L. A. Distribution of glutamic oxaloacetic transaminase
dehydrogenase activities in boar semen after cold shock and freezing. Cryobiology. v. 7, p.
141-144, 1970.
PURSEL, V. G., JOHNSON, L. A., RAMPACEK, G. B. Acrossome morfology of boar
spermatozoa incubated before cold shock. J. Anim. Sci., v.34 n.2, p.278-283, 1972.
PURSEL, V. G., JOHNSON, L. A., SCHUMAN, L. L. Fertilizing capacity of boar semen
stored at 15 ºC. J. Anim. Sci., v.37, n.2, 1973a.
PURSEL, V.G., SCHULMAN, L.L., JOHNSON, L.A. Effect of holding time on storage of
boar spermatozoa at 5 ºC. J. Anim. Sci., v.37, n.3, 1973b.
PURSEL, V.G., JOHNSON, L.A., SCHULMAN, L.L., Effect of dilution, seminal plasma,
and incubation period on cold shock susceptibility of boar spermatozoa. J. Anim.Sci., v.37,
528-531, 1973c.
PURSEL V. G., JOHNSON L. A., SCHULMAN L. L. Freezing of boar spermatozoa:
fertilizing capacity with concentrated semen and a new thawing procedure. J. Anim. Sci. v.
40, p. 99-102, 1975.
RODRÍGUEZ-MARTÍNEZ, H., ERIKSSON, B. Evaluación del semen de verraco y su
relación con fertilidad. In: SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE INSEMINAÇÃO
ARTIFICIAL EM SUÍNOS, Anais. Flores da Cunha-RS, 2000, p.13-33
SCHEID, I. R. Commercial swine artificial insemination in Brazil: Development and
current use. Reprod. Domest. Anim., v.26, p.299-301, 1992.
SCHEID, I. R. O papel da inseminação artificial na produção de suínos. Ciênc. Anim.
Fortaleza, v.7, n.2, 1997.
SINGER, S. J., NICHOLSON, G. L., The flui mosaic of the structure of cell membranes.
Science, v.175, n.4023, p.720-731, 1972.
SOBESTIANSKY, J., WENTZ, I., SILVEIRA, P. R. S., SESTI, L. A . C. Suinocultura
Intensiva: Produção , manejo e saúde do rebanho. Brasília : Embrapa-SPI, 388 p. il., 1998.
SOLTI, L., WEKERLE, L. Problems of short and long term preservation of boar semen.
XXIX Simposio Internazional di zootecnia . Animal Production & biotechnology, Milan,
p.133-136, 1995.
TONIOLLI, R., BUSSIERE, J., COUROT, M. MAGISTRINI, M. COMBORNAUS, Y.
Effect of indole-3-acetic (plant auxin) on the preservation at 15 ºC of boar semen for
artificial insemination. Rep. Nut. Devel., v.36, p.503-511, 1996.
VALE FILHO, V. R. Patologia do sêmen-diagnóstico andrológico e classificação do Bos
Taurus e Bos Indicus quanto à fertilidade para uso como reprodutor em condições de
Brasil. De um estudo de 1088 touros. UFMG – Escola de veterinária, 2ºed., 1980.
VISHWANATH, R., SHANNON, P. Do sperm cells age? A review of the physiological
changes in sperm during stotage at ambient temperature. Reprod. Fertil. Dev., 9, 321-331,
1997.
WATSON, P. F., PLUMMER, J. M. The responses of boar sperm membranes to cold shock
and cooling. Proceeding in 2th Int. Conf. on Boar Semen Pres., Beltsville-USA, p.187-196,
1990.
WATSON, P.F. Cooling of spermatozoa and fertilizing capacity. Reprod. Dom. Anim. 31 :
135- 140, 1996.
WATSON, P. F. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Anim. Reprod.
Scie., 60-61, p.481-492, 2000.
WEITZE, K. F. Long-term Storage of extended boar semen. Proceeding in 2th Int. Conf. on
Boar Semen Pres., Beltsville-USA, p.187-196, 1990a.
WEITZE, K. F. The use of “Long-term extender” in Pig AI- A view of the international
Situation. Pig News and information, v.11, n.1, p. 23-26, 1990b.
WEITZE, K.F., STAMPA, E., RITCHER, L., WILLMEN, T., WABERSKI, D. Fertility of
frozen boar semen: influence of packaging, number of inseminations, and seminal plasma.
Proceeding in 2th Int. Conf. on Boar Semen Pres., Beltsville-USA, p.139-142, 1990c.
WEITZE, K. F. Reação imune do útero de porcas à inseminação e suas conseqüências na
fecundação. In: Simpósio Internacional de Inseminação Artificial em Suínos, Anais. Flores
da cunha, RS, 2000, p.5-12.
WENTZ, I., VARGAS, A. J., BORTOLOZZO, F. P., CASTAGNA, C. D. Situação atual da
inseminação artificial em suínos no Brasil e viabilização econômica do emprego dessa
biotécnica. In: SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM
SUÍNOS, Anais. Flores da Cunha-RS, 2000, p.5-12.
YOSHIDA, M. Conservation of sperms: current status and new trends. Anim. Repro.
Science, 60-61, p. 349-355, 2000.
ZOU, C. X., YANG, Z. M. Evaluation on sperm quality of freshly ejaculeted boar semen
during in vitro storage under different temperatures. Theriogenology, 53: 1477-1488, 2000.
ANEXOS
ÍNDICE
Páginas
Quadro 1a : : Características do vigor espermático no sêmen suíno
68
Quadro 1b: Tipo de movimento apresentado pelos espermatozóides
69
Quadro 1c: Definições qualitativas dos movimentos espermáticos
69
Quadro 2: Parâmetros de morfologia espermática
70
Composição da Solução Formol-salina
71
Composição do diluidor de Beltsville - BTS
72
Gráficos Artigo 1
Gráfico 1 – Tratamento A
73
Gráfico 2 – Tratamento B
74
Gráfico 3 – Tratamento C
75
Gráfico 4 – Tratamento D
76
Gráfico 5 – Tratamento E
77
Gráficos Artigo 2
Gráfico 6 – Tratamento A
78
Gráfico 7 – Tratamento B
79
Gráfico 8 – Tratamento C
80
Gráfico 9 – Tratamento D
81
Gráfico 10 – Tratamento E
82
Gráficos Artigo 3
Gráfico 11 – Tratamento A
83
Gráfico 12 – Tratamento B
84
Gráfico 13 – Tratamento C
85
Gráfico 14 – Tratamento D
86
Gráfico 15 – Tratamento E
87
Gráfico 16 – Tratamento F
88
Gráfico 17 – Tratamento G
89
Nota
Características
0,0
Todos os espermatozóides estão imóveis;
0,5
Movimentos esporádicos, fracos e sem deslocamento;
1,0
Movimentos circulares contínuos
e fracos. Deslocamento muito
lento ou sem deslocamento; tremores do espermatozóide e fracas
oscilações do flagelo de eficácia nula;
1,5
Movimentos circulares
fracos com deslocamento (± 50%),
espermatozóides não saem do campo microscópico;
2,0
Movimentos circulares fracos e desorganizados com deslocamento
sem
sair
do
campo
microscópico.
Tremores
com
alguns
espermatozóides se deslocando mais rapidamente. Oscilações fracas
do flagelo;
2,5
Movimentos
circulares/retilíneos,
médios
com
deslocamento,
espermatozóides saem do campo;
3,0
Movimentos retilíneos, alguns curvilíneos sem tremores e com raio
bem mais importante (fortes) com oscilações intensas do flagelo;
espermatozóides saem do campo microscópico (± 60 à 70%);
3,5
Movimentos retilíneos fortes e intensos, espermatozóides saem do
campo microscópico (± 70 à 90%);
4,0
Movimentos retilíneos a alguns circulares, fortes e intensos com
deslocamento, espermatozóides saem do campo (± 95%); oscilações
fortes do flagelo;
4,5
Movimentos
retilíneos
flechantes,
fortes
em
>
90%
dos
espermatozóides;
5,0
Movimentos retilíneos flechantes muito fortes, espermatozóides
saem do campo microscópico (> 95%); oscilações muito fortes do
flagelo.
Quadro 1a: Características do vigor espermático no sêmen suíno (Toniolli et al., 1996)
(A)
Nota
(B)
Deslocam.
MOVIMENTOS (C)
Vigor
Não Progressivo
Rotativo
Circular
Progressivo
Circular
Retilíneo
0,0
-
-
0,5
-
±
1,0
±
+
*
1,5
+
+
*
2,0
++
+
*
2,5
++
++
*
3,0
+++
++
*
3,5
+++
+++
*
4,0
++++
+++
*
4,5
++++
++++
*
5,0
+++++
++++
Flechante
*
*
*
*
Quadro 1b: Tipo de movimento apresentado pelos espermatozóides (Toniolli et al., 1996)
A) Deslocamento : Presente (+), ausente(-), presença de um número fraco de
espermatozóides com leve movimento (±). A classificação varia de 1 a 5 cruzes, segundo a
velocidade de deslocamento.
B) Vigor : É a frequência de batimentos do flagelo, classificado de 0 (-) a 4 cruzes (+).
C) Movimentos : A presença de um (*), indica o tipo de movimento efetuado pelo
espermatozóide.
MOVIMENTOS
Rotativos : Movimentos de rotação em torno de si mesmo sem deslocamento
Circulares : Movimentos inscritos dentro de um círculo de raio pequeno (sem
deslocamento) ou de raio grande (com deslocamento).
Retilíneos : Deslocamento em linha reta
Flechantes : Deslocamento em linha reta com grande velocidade.
Quadro 1c: Definições qualitativas dos movimentos espermáticos (Toniolli et al., 1996)
Defeitos de acrossomo
SAR: Sem acrossomo
PAR: Acrossomo em processo de perda
EAR: Edema de acrossomo
DAR: Invaginações/Evaginações do acrossomo
Defeitos de cabeça
Macrocefalia
Microcefalia
Pontiaguda
Dupla
Piriforme
Normal livre
Danificada livre
Defeitos de peça intermediária
Gota citoplasmática proximal
Espessada
Dobrada
Dupla
Defeitos de cauda
Dupla
Tripla
Enrolada
Gota citoplasmática distal
Quadro 2: Parâmetros de morfologia espermática (Kumus, 1993)
Solução Formol-salina (Colégio Brasileiro de Reprodução Animal, 1998)
* Solução estoque de NaCl
NaCl – 0,901g
Água destilada – 50 ml
* Solução estoque tampão
Solução 1
Solução 2
Na2HPO4 – 2,168 g
KH2PO4 – 1,113 g
Água destilada – 50 ml
Água destilada – 50 ml
Solução tampão final : Adicionar 20 ml da Solução 1 em 8 ml da Solução 2
* Solução Formol-salina
Solução estoque de NaCl – 15 ml
Solução tampão final
- 10 ml
Formol 40%
- 6,25 ml
Água destilada
- 50 ml
___________
TOTAL
81,25 ml
COMPOSIÇÃO DO DILUIDOR DE BELTSVILLE (MINITUBE)
Ingredientes
Para cada 100g
Glicose
78,40g
EDTA
2,65g
Citrato de sódio
12,71g
Bicarbonato de sódio
2,65g
Cloreto de potássio
1,59g
Sulfato de gentamicina
0,40g
GRÁFICOS ARTIGO 1
Gráfico 1 - Tratamento A
Sêmen suíno incubado a 25 ºC durante 0,5 hora e posteriormente a 17 ºC por sete
dias
40
Temperatura (ºC)
35
30
25
20
15
10
5
0
PURO
DILUIÇÃO
Dil 0,5 h
Dil 2,5 h
Dil 24 h
Momentos de análise
Dil 96 h
Dil 148 h
Gráfico 2 - Tratamento B
Sêmen suíno incubado a 25 ºC por 1 hora e posteriormente a 17 ºC por sete dias
40
Temperatura (ºC)
35
30
25
20
15
10
5
0
PURO
DILUIÇÃO
Dil 1 h
Dil 3h
Dil 24 h
Momentos de análise
Dil 96 h
Dil 148 h
Gráfico 3 - Tratamento C
Sêmen suíno incubado a 25 ºC por 2 horas e posteriormente a 17 ºC por sete dias
40
35
Temperatura
30
25
20
15
10
5
0
PURO
DILUIÇÃO
Dil 2 h
Dil 2 h
Dil 4 h
Momentos de análise
Dil 24 h
Dil 96 h
Dil 148 h
Gráfico 4 - Tratamento D
Momentos de análise
D
il
14
8
h
h
D
il
96
h
24
il
D
6h
il
D
h
D
il
4
h
D
il
4
h
4
il
D
4
il
D
R
O
h
40
35
30
25
20
15
10
5
0
PU
Temperatura (ºC)
Sêmen suíno incubado a 25 ºC por 4 horas e posteriormente a 17 ºC por sete dias
Gráfico 5 -Tratamento E
Momentos de análise
D
il
14
8
h
h
D
il
96
h
24
il
D
8h
il
D
h
D
il
6
h
D
il
6
h
D
il
6
h
D
il
6
h
6
il
D
6
il
D
R
O
h
40
35
30
25
20
15
10
5
0
PU
Temperatura (ºC)
Sêmen suíno incubado a 25 ºC por 6 horas e posteriormente a 17 ºC por sete dias
ARTIGO 2 – GRÁFICOS
Gráfico 6 –Tratamento A
Momentos de análise
10
h
9h
8h
7h
6h
5h
4h
3h
2h
1h
40
35
30
25
20
15
10
5
0
PU
R
O
Temperatura (ºC)
Sêmen suíno incubado durante 11 horas a 17 ºC
Gráfico 7 -Tratamento B
Momentos de análise
11
h
10
h
9h
8h
7h
6h
5h
4h
3h
2h
1h
40
35
30
25
20
15
10
5
0
PU
R
O
Temperatura (ºC)
Sêmen suíno incubado a 25 ºC por 4 horas e, posteriormente, a 17 ºC por 5 horas
Gráfico 8 - Tratamento C
Momentos de análise
11
h
10
h
9h
8h
7h
6h
5h
4h
3h
2h
1h
40
35
30
25
20
15
10
5
0
PU
R
O
Temperatura (ºC)
Sêmen suíno incubado a 30 ºC por 4 horas e, posteriormente, a 17 ºC por 5 horas
Gráfico 9 -Tratamento D
Momentos de análise
11
h
10
h
9h
8h
7h
6h
5h
4h
3h
2h
1h
40
35
30
25
20
15
10
5
0
PU
R
O
Temperatura (ºC)
Sêmen suíno incubado a 30 ºC por 1 hora, a 25 ºC por 4 horas e, posteriormente, a
17 ºC por 3 horas
Gráfico 10 - Tratamento E
Momentos de análise
11
h
10
h
9h
8h
7h
6h
5h
4h
3h
2h
1h
40
35
30
25
20
15
10
5
0
PU
R
O
Temperatura (ºC)
Sêmen suíno incubado a 30 ºC por 1 hora, a 25 ºC por 1 hora, por 20 ºC por 4 horas
e, posteriormente, a 17 ºC por 1 hora
ARTIGO 3 – GRÁFICOS
Gráfico 11 - Tratamento A
Sêmen suíno diluído a 35ºC e conservado durante o dia de coleta
40
Temperatura (ºC)
35
30
25
20
15
10
5
0
PURO
DILUIÇÃO
Dil 1h
Momentos de análise
Dil 3h
Dil 6h
Gráfico 12 -Tratamento B
Sêmen suíno incubado "in natura" durante 1 hora a 35 ºC e, posteriormente,
diluído e conservado a 17 ºC no dia de coleta
40
Temperatura (ºC)
35
30
25
20
15
10
5
0
PURO
P 1h
DILUIÇÃO
Dil 1h
Momentos de análise
Dil 3h
Dil 6h
Gráfico 13 -Tratamento C
Sêmen suíno incubado "in natura" durante 2 horas a 35 ºC e, posteriormente,
diluído e conservado a 17 ºC no dia de coleta
40
Temperatura (ºC)
35
30
25
20
15
10
5
0
PURO
P 1h
P 2h
DILUIÇÃO
Dil 1h
Momentos de análise
Dil 3h
Dil 6h
Gráfico 14 - Tratamento D
Sêmen suíno incubado "in natura" durante 3 horas a 35 ºC e, posteriormente,
diluído e conservado a 17 ºC durante o dia de coleta
40
Temperatura (ºC)
35
30
25
20
15
10
5
0
PURO
P 1h
P 2h
P 3h
DILUIÇÃO
Momentos de análise
Dil 1h
Dil 3h
Dil 6h
Gráfico 15 - Tratamento E
Sêmen suíno incubado "in natura" a 25 ºC e, posteriormente, diluído e
conservado a 17 ºC durante o dia de coleta
40
Temperatura (ºC)
35
30
25
20
15
10
5
0
PURO
P 1h
DILUIÇÃO
Dil 1h
Momentos de análise
Dil 3h
Dil 6h
Gráfico 16 - Tratamento F
Sêmen suíno incubado "in natura" a 25 ºC por 2 horas e, posteriormente, diluído
e conservado a 17 ºC durante o dia de coleta
40
35
Temperatura
30
25
20
15
10
5
0
PURO
P 1h
P 2h
DILUIÇÃO
Dil 1h
Momentos de análise
Dil 3h
Dil 6h
Gráfico 17 - Tratamento G
Sêmen suíno incubado "in natura" a 25 ºC por 3 horas e, posteriormente, diluído
e conservado a 17 ºC durante o dia de coleta
40
35
Temperatura
30
25
20
15
10
5
0
PURO
P 1h
P 2h
P 3h
DILUIÇÃO
Momentos de análise
Dil 1h
Dil 3h
Dil 6h