Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento – MAPA Secretaria de Defesa Agropecuária – SDA Coordenação Geral de Apoio Laboratorial - CGAL Manual de Métodos de Análises de Bebidas e Vinagres AÇÚCARES TOTAIS Destilados Método 08 1. MÉTODO Titulométrico (Método Eynon Lane). 2. PRINCÍPIO Os açúcares não redutores sofrem hidrólise prévia em meio ácido, dissociando os dissacarídeos em seus monossacarídeos, os quais reagem com os íons cúpricos da solução de Fehling, reduzindo-os a íons cuprosos, sob a ação do calor em meio alcalino. Ao reagir com os íons cúpricos, os açúcares sofrem oxidação, enquanto o Cu(II) é reduzido a Cu(I), formando-se um precipitado vermelho de óxido cuproso. 3. MATERIAL 3.1 EQUIPAMENTO a) Balança analítica. b) Chapa aquecedora ou bico de Bunsen. c) Banho-maria com termostato. d) Cronômetro. 3.2 REAGENTES E SOLUÇÕES a) Solução A de Fehling. Dissolver 34,639 g de sulfato de cobre pentaidratado (CuSO4.5H2O) p.a. em água destilada e diluir a 500 mL em balão volumétrico. b) Solução B de Fehling. Dissolver 173 g de tartarato duplo de sódio e potássio tetraidratado (C4H4KNaO6.4H2O) p.a. (sal de Rochelle) e 50 g de hidróxido de sódio em água destilada e diluir a 500 mL em balão volumétrico. c) Solução padrão de glicose anidra p. a. 0,5% (recém preparada). d) Solução de acetato neutro de chumbo a 20%. e) Solução azul de metileno 1%. f) Carvão ativo. g) Fosfato monoácido de sódio Na H2PO4 ou oxalato de potássio ou sódio p.a. h) Ácido clorídrico p.a. i) Solução de hidróxido de sódio 5 N. 3.3 VIDRARIA E OUTROS MATERIAIS a) Balão volumétrico de 100 mL. b) Bureta de 25 mL. c) Erlenmeyer de 250 mL. d) Pérolas de vidro para ebulição ou talco neutro. e) Pipetas volumétricas de 1, 5, 20 e 50 mL. f) Termômetro (0-100 °C). g) Funil. h) Papel de filtro. i) Pinça. j) Papel de tornassol. 4. PROCEDIMENTO Edição: 1 Revisão: 0 Página 1 de 3 Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento – MAPA Secretaria de Defesa Agropecuária – SDA Coordenação Geral de Apoio Laboratorial - CGAL Manual de Métodos de Análises de Bebidas e Vinagres AÇÚCARES TOTAIS Destilados Método 08 4.1 PREPARAÇÃO DA AMOSTRA Pipetar 50 mL da amostra (para amostras com alto teor de açúcares tomar alíquotas menores), desalcoolizar reduzindo para 25 mL. Transferir para um balão volumétrico de 100 mL, e completar o volume com água destilada. Se necessário, efetuar clarificação pipetando 50 mL da amostra desalcoolizada em um balão de 100 mL , adicionar 2 mL da solução de acetato neutro de chumbo (volume maior para produtos com alto teor de matérias corantes). Adicionar aproximadamente 0,5 g de carvão ativo (evitar excesso, pois poderá adsorver parte dos açúcares). Agitar bem e deixar em repouso por 10 minutos. Completar o volume com água destilada. Filtrar o conteúdo do balão volumétrico sobre 0,4 g de fosfato monoácido de sódio (ou 0,4 g de oxalato de sódio) por mililitro de solução de acetato neutro de chumbo utilizado, num erlenmeyer de 250 mL (a solução apresentará sedimentos em poucos minutos, deixando o líquido sobrenadante claro). Adicionar um pouco mais de fosfato (ou oxalato) para assegurar a completa precipitação do acetato de chumbo. Filtrar novamente, se necessário. Transferir 50 mL da amostra assim preparada para um balão volumétrico de 100 mL, adicionar 1 mL de ácido clorídrico concentrado e levar ao banho-maria, de modo que a solução mantenha uma temperatura entre 67 e 70 oC por 15 minutos. Esfriar à temperatura ambiente, neutralizar com hidróxido de sódio 5 N, usando papel de tornassol como indicador, e completar o volume com água destilada. 4.2 TITULAÇÃO DO BRANCO Em erlenmeyer de 250 mL, adicionar 20 mL de solução de Soxhlet (10 mL de Felhing A + 10 mL de Felhing B), 50 mL de água destilada e 19 mL da solução padrão de glicose e algumas pérolas de vidro. Levar o frasco ao aquecimento, de modo que entre em ebulição dentro de 4 minutos. Iniciada a ebulição, adicionar 3 gotas de azul metileno. Decorrido um minuto do inicio da fervura, proceder a titulação até o desaparecimento da coloração azul. Repetir a operação até que os resultados em duplicata sejam iguais. Seja b o volume final de glicose gasto na titulação do branco. 4.3 TITULAÇÃO DA AMOSTRA 4.3.1 PRÉVIA Em erlenmeyer de 250 mL, adicionar 20 mL da solução de Soxhlet (10 mL de Felhing A + 10 mL de Felhing B), 40 mL de água destilada e 10 mL da amostra preparada (4.1). Levar o frasco ao aquecimento, de modo que entre em ebulição dentro de 4 minutos. Iniciada a ebulição, titular com a solução de glicose até o desaparecimento da coloração azul do sulfato de cobre. Adicionar 2 gotas de azul de metileno, após 1 minuto, continuar a titulação até o desaparecimento da coloração azul. Seja K o volume final de glicose gasto na titulação prévia da amostra. Nota: O valor de K será utilizado para nortear o volume final de glicose na titulação da amostra. 4.3.2 AMOSTRA Em erlenmeyer de 250 mL, adicionar 20 mL da solução de Soxhlet, 40 mL de água destilada e 10 mL da amostra preparada. Levar o frasco ao aquecimento, de modo que entre em ebulição dentro de 4 minutos, e imediatamente transferir (K-1) ml de glicose. Iniciada a fervura, adicionar Edição: 1 Revisão: 0 Página 2 de 3 Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento – MAPA Secretaria de Defesa Agropecuária – SDA Coordenação Geral de Apoio Laboratorial - CGAL Manual de Métodos de Análises de Bebidas e Vinagres AÇÚCARES TOTAIS Destilados Método 08 2 gotas de azul de metileno. Após 1 minuto, continuar a titulação até o desaparecimento do azul da solução, gastando no final da titulação aproximadamente o mesmo tempo gasto na determinação do branco. Repetir a operação até que os resultados em duplicata sejam iguais. Seja a o volume final de glicose gasto na titulação da amostra. 5. CÁLCULOS E EXPRESSÃO DO RESULTADO O teor de açúcares totais em gramas de sacarose por litro da amostra é dado pela fórmula abaixo: At = (b − a ) × 5 × f 1 × f 2 V Onde = Teor de açúcar total em sacarose (g/L). At = Volume da solução de glicose gasto na titulação do branco, em mL. b a = Volume da solução de glicose gasto na titulação da amostra, em mL. Fator que envolve todas as diluições e as grandezas de massa ou volume usadas na f1 = tomada da amostra. = Fator de conversão para expressão dos resultados em sacarose (0,96). f2 = Volume da amostra preparada usado na titulação, em mL. V Notas: a) Tempo de titulação não deverá ultrapassar 2 minutos, marcados a partir da adição da solução indicadora de azul de metileno. b) Solução de Soxhlet é a mistura das soluções A e B de Fehling em partes iguais. REFERENCIA BRASIL. Ministério da Agricultura. Portaria nº 76 de 26 de novembro de 1986. Dispõe sobre os métodos analíticos de bebidas e vinagre. Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Brasília, 28 nov. 1986. Seção 1, pt. 2. Edição: 1 Revisão: 0 Página 3 de 3