Fundação Universidade Estadual de Maringá
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
SIMONE APARECIDA GALERANI MOSSINI
EFEITOS DE EXTRATOS DE Azadirachta indica A. Juss (Meliaceae) NA
PRODUÇÃO DE MICOTOXINAS E NA MORFOLOGIA DE FUNGOS
TOXIGÊNICOS
Orientador: Prof. Dr. Carlos Kemmelmeier.
Maringá
2006
Simone Aparecida Galerani Mossini
EFEITOS DE EXTRATOS DE Azadirachta indica A. Juss (Meliaceae) NA
PRODUÇÃO DE MICOTOXINAS E NA MORFOLOGIA DE FUNGOS
TOXIGÊNICOS
Tese apresentada ao Curso de Pós-graduação em
Ciências Biológicas (Área de concentração em Biologia
Celular) da Universidade Estadual de Maringá, para
obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas.
Maringá – PR
2006
“Há um momento para tudo e um tempo para todo propósito debaixo do céu.
Tempo de nascer, e tempo de morrer; tempo de plantar e tempo de arrancar a
planta. Tempo de matar, e tempo de curar; tempo de destruir, e tempo de
construir. Tempo de chorar, e tempo de rir; tempo de gemer, e tempo de
dançar. Tempo de atirar pedras, e tempo de recolher pedras; tempo de
abraçar, e tempo de se separar. Tempo de buscar, e tempo de perder; tempo
de guardar, e tempo de jogar fora. Tempo de rasgar, e tempo de costurar;
tempo de calar, e tempo de falar. Tempo de amar e tempo de odiar; tempo de
guerra e tempo de paz".
Eclesiastes 3: 1-8.
Expresso, de maneira especial, o meu
profundo reconhecimento e gratidão:
Aos meus pais pelo amor, pelo incentivo,
pela dedicação, pela paciência e por
estarem sempre presentes.
Aos meus filhos, Guilherme e Fernanda,
pelo amor e pelas alegrias.
Ao Luís pelo amor, pela paciência,
compreensão e pelo incondicional apoio.
Ao Prof. CARLOS KEMMELMEIER, pelos
valiosos conselhos, ensinamentos, incentivo,
dedicação e solicitude com que sempre me
orientou e, sobretudo, pela amizade
demonstrada durante a realização deste
trabalho.
AGRADECIMENTOS
À minha amiga e colega Carla, pela companhia, colaboração, amizade e
paciência.
A Christiane, pela amizade e colaboração.
Aos colegas das disciplinas cursadas durante o curso, pela amizade.
Aos professores Dr. Oswaldo Ferrarese Filho e Dr a. Maria de Lourdes
Lucio Ferrarese (Departamento de Bioquímica), pela colaboração nas análises
por HPLC.
A Maria Aparecida Dantas Ramos e a Gisele Adriana Bubina, pela ajuda
com as análises por HPLC e pelos momentos de descontração e amizade.
À professora Dra. Jaqueline Nelisis Zanoni (Departamento de Ciências
Morfofisiológicas) e a Renata Vírginia Fernandes Pereira, pela ajuda com a
captura de imagens.
Aos professores, técnicos e colaboradores do Curso de Pós-graduação
em Ciências Biológicas pela colaboração e pelos ensinamentos ministrados, em
especial ao Armando Luiz de Sá Ravagnani pela ajuda com as revisões
gramaticais.
Aos colegas do Laboratório de Toxicologia, pela compreensão e ajuda
nesta etapa final.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq), pelo suporte financeiro.
A todos que tenham contribuído de uma forma direta ou indireta,
para a realização deste trabalho.
RESUMO
O Nim (Azadirachta indica A. Juss) é uma árvore milenar, nativa da Índia, que vem sendo utilizada
há séculos para o tratamento de doenças humanas e controle de pragas. A planta Nim vem
fascinando cientistas de várias áreas, à medida que seus biocompostos encontram uso na agricultura
e medicina. Um grande número de compostos biologicamente ativos tem sido isolado de toda a
planta, sendo assim comercialmente exploráveis. A pesquisa que envolve a planta vem crescendo
significativamente, uma vez que os seus princípios ativos podem desempenhar um papel importante
no manejo integrado de sistemas e na medicina alternativa. Compostos extraídos do Nim se
mostram seletivos, não-mutagênicos, rapidamente degradáveis, com baixa toxicidade para
organismos não-alvo e benéficos, com mínimos distúrbios ao ecossistema. A árvore possui mais de
135 compostos isolados e divididos em duas classes principais: isoprenóides e outros. Os
isoprenóides incluem diterpenóides e triterpenóides (nimbin, salanin e azadiractina). Os compostos
não-isoprenóides
incluem
proteínas,
carboidratos,
compostos
sulfurosos,
polifenólicos
(flavonóides), cumarinas e taninos, compostos alifáticos, etc. Azadiractina, o principal limonóide
isolado do Nim, tem demonstrado várias atividades biológicas, altamente eficientes no controle de
pragas. Várias preparações industriais e terapêuticas à base de Nim têm sido comercializadas para
controle de doenças fúngicas e outras pragas. O uso de extrato de folhas de Nim tem sido testado
em cultivo líquido contra fungos patógenos do solo, demonstrando inibição do crescimento de
algumas espécies dos gêneros Fusarium, Rhizoctonia, Sclerotium e Sclerotinia. O extrato aquoso de
folhas tem sido citado também por inibir patógenos foliares (Sarcocladium, Fusarium,
Phaeoisariopsis, Puccinia, e Aspergillus). O óleo de sementes reduziu o crescimento e a
esporulação dos fungos entomopatogênicos dos gêneros (Metarhizium, Beauveria and
Paecilomyces). Recentes pesquisas têm demonstrado a correlação entre o crescimento micelial, a
produção de micotoxinas em fungos toxigênicos e os compostos derivados do Nim. Estudos in vitro
e in vivo utilizando extrato aquoso de folhas de Nim contra Aspergillus flavus e A. parasiticus
demonstraram bloqueio da biossíntese de aflatoxina, mas o extrato não foi efetivo sobre o
crescimento fúngico. Estudos, in vitro e em maçãs, com Penicillium expansum relatam que o
extrato, apesar de não inibir o crescimento vegetativo do fungo, bloqueia a produção da micotoxina
patulina pelo fungo. A presença e o crescimento de fungos em alimentos podem causar deterioração
e resultar em redução na qualidade e na quantidade da produção. Fungos causam destruição
significativa de alimentos durante a estocagem, tornando-os impróprios para consumo humano por
reduzirem seu valor nutritivo e, em algumas ocasiões, produzirem micotoxinas. Conseqüentemente,
a presença de fungos toxigênicos e micotoxinas em alimentos e grãos representa um perigo
potencial à saúde humana e animal. Micotoxinas são metabólitos tóxicos fúngicos, de estrutura
química diversa e contaminantes comuns de ingredientes de alimento animal e humano. Esses
metabólitos secundários não são essenciais para o crescimento do microorganismo, mas são
sintetizados e secretados a partir de metabólitos primários, podendo exibir efeitos tóxicos em
organismos superiores, sendo produzidos por mais de 100 espécies fúngicas. Muitas delas têm sido
reconhecidas como produtos do metabolismo de espécies do gênero Aspergillus, Penicillium e
Fusarium. A via metabólica biossintética policetídica é uma rota comum para a formação de várias
micotoxinas, entre elas aflatoxina, patulina, citrinina e ocratoxina. Citrinina é uma micotoxina
produzida por vários fungos filamentosos do gênero Penicillium, Aspergillus e Monascus,
encontrados como contaminantes em grãos, frutas e derivados. Fungos produtores de citrinina
crescem em grãos e frutas estocados com alta umidade tão bem quanto em embutidos fermentados.
A micotoxina citrinina é hepatonefrotoxica e tem sido implicada em doenças agudas em animais e
humanos. Ocratoxina é um metabólito secundário perigoso produzido por espécies toxigênicas de
fungos do gênero Penicillium em alimentos e derivados. Essa toxina é carcinogênica e é capaz de
causar dano à saúde humana e animal. A prevenção e eliminação da produção de ocratoxina dos
produtos alimentícios é fonte importante para muitos pesquisadores nos últimos anos.
Aproximadamente, 25% do cultivo mundial são afetados, anualmente, pela presença de
micotoxinas. Alimentos contaminados por micotoxinas possuem sérias implicações na área da
toxicologia alimentar, na agricultura, para as criações de animais e aves, os manipuladores de grãos,
os processadores de alimentos, consumidores e, eventualmente, para a economia nacional. Vários
inibidores fúngicos químicos têm sido utilizados na preservação de grãos armazenados. Muitas
desvantagens (geração de resíduos tóxicos, desenvolvimento de resistência, de preço e de tempo
consumido na formulação) são associadas com seu uso e existe uma tendência mundial para reduzir
o seu uso em grãos, em frutas e em derivados. Assim, existe uma necessidade contínua para o
desenvolvimento de estratégias para o controle de fungos patógenos de plantas por meio do uso de
extratos naturais que preservem o meio ambiente, fornecendo um controle mais eficiente e
melhorando a qualidade e rendimento de cultivos. O uso de biopraguicidas naturais oferece uma
opção viável para o controle de pragas, eles são baratos e prontamente viáveis em muitas regiões do
terceiro mundo. Em muitos casos, não existe um método isolado que assegure a ausência completa
do contaminante. Dessa forma, o manejo integrado com a combinação de diferentes métodos pode
reduzir significativamente os riscos associados com a contaminação por micotoxinas e render
produtos seguros e aceitáveis para o consumo. Neste estudo, nós analisamos os efeitos do extrato de
folhas de Nim sobre o crescimento, morfologia e produção de citrinina em três isolados de
Penicillium citrinum, em cultura. Análises por cromatografia em camada delgada, ensaios
colorimétricos e análises por cromatografia líquida de alta eficiência demonstraram um bloqueio na
produção de citrinina. O crescimento fúngico não foi reduzido, entretanto houve diferenças entre as
características macroscópicas das colônias controle e tratadas. Investigamos também o efeito dos
extratos sobre o crescimento, a esporulação e produção de ocratoxina A por Penicillium verrucosum
e P. brevicompactum. Análises por cromatografia em camada delgada não demonstraram inibição
da produção de ocratoxina A, mas os estudos sobre o crescimento e a esporulação dos isolados
mostraram alterações significativas na presença dos extratos de Nim. Dessa forma, este trabalho
demonstra que os extratos de Nim possuem atividade fungitóxica, apesar de seu modo de ação não
ser ainda totalmente esclarecido. É possível que os diferentes compostos ou as diferentes
concentrações dos compostos extraídos da planta possuam efeitos variados em fungos. Existem
evidências, fornecidas por este e outros estudos, que fungos reagem diferentemente aos compostos
de Nim. Pesquisas adicionais são necessárias para determinarem os usos potenciais de produtos à
base de Nim em programas de controle de fungos, para avaliarem o uso em sistemas agrícolas e
estudarem a melhor forma de separarem, extraírem, formularem e aplicarem os produtos,
maximizando os seus benefícios.
ABSTRACT
Neem (Azadirachta indica A. Juss) is a tree native to India where it has traditionally been
used for the treatment of human ailments and pest control. The Neem plant has interested
scientists from various fields of research since its active principles may be employed in
agriculture and medicine. Although several biologically active compounds have been
isolated from the Neem tree, each part has some biological property and is commercially
exploitable. Studies on the tree’s parts have increased significantly due to the fact that its
active principles may potentially be used in integrated pest management and alternative
medicine. Neem compounds seem to be selective, non-mutagenic, readily degradable, with
low toxicity to non-target and beneficial organisms, with minimal disruption to the
ecosystem. The tree has more than 135 isolated compounds subdivided into two major
classes: isoprenoids and non-isoprenoids. Whereas isoprenoids include diterpenoids and
triterpenoids (nimbin, salanin and azadirachtin), non-isoprenoids comprise proteins,
carbohydrates, sulphurous compounds, polyphenolics (flavonoids), coumarin and tannins,
aliphatic compounds, and other. Azadirachtin, a major limonoid constituent isolate from
Neem, has presented several biological activities among which were some highly effective
in pest control. Several therapeutically and industrially useful Neem-preparations have also
been marketed for control of fungal plant diseases and other pests. Whereas a number of
soilborne pathogens were tested in liquid culture using Neem leaf extracts, there was also
vegetative growth inhibition of several Fusarium, Rhizoctonia, Sclerotium and Sclerotinia
species. Aqueous leaf extract has also been reported to inhibit foliar pathogens
(Sarcocladium, Fusarium, Phaeoisariopsis, Puccinia, and Aspergillus). The sporulation
and growth of entomopathogens (Metarhizium, Beauveria and Paecilomyces) have been
reduced with oil from Neem seeds. Recent studies have demonstrated a correlation between
mycelial growth, mycotoxin production by toxigenic fungi and Neem derivates. In vitro and
in vivo studies with aqueous Neem leaf extract on Aspergillus flavus and A. parasiticus
showed aflatoxin biosynthesis blockage but no effect on fungus growth. In vitro studies and
in apples with Penicillium expansum showed that Neem extract did not inhibit fungal
vegetative growth, but impaired the production of patulin mycotoxins by fungus. The
presence and growth of fungi in food may cause spoilage and result in food quality and
quantity reduction. Fungi cause significant grain liabilities during storage, rendering it unfit
for human consumption by a decrease in its nutritive value and by frequent production of
mycotoxins. Therefore, the presence of toxigenic fungi and mycotoxins in food and grains
presents a potential hazard to human and animal health. Mycotoxins are toxic fungal
metabolites with different chemical structures, besides being common contaminants in the
ingredients that make up animal feed and human food. Although these secondary fungal
metabolites are not essential for the organism’s growth, they are biosynthesized from
primary metabolites and secreted. With over one hundred fungus species they may exhibit
toxic effects in higher organisms. Most of them have been recognized as metabolic
products of Aspergillus, Penicillium and Fusarium species. The biosynthetic polyketide
pathway is a common route for the formation of various mycotoxins, such as aflatoxin,
patulin, citrinin and ochratoxin. Citrinin, a mycotoxin produced by several filamentous
fungi of the genera Penicillium, Aspergillus and Monascus, has been found to be a natural
contaminant in grains, foods, foodstuff and fruits. Citrinin-producing fungi grow on grains
and fruits stored in humid places and on mould-fermented sausages. Citrinin is
hepatonephrotoxic and accountable for disease outbreaks in animals and human beings.
Ochratoxin is a secondary and hazardous fungus metabolite produced by toxigenic
Penicillium and Aspergillus strains in foods and foodstuffs. This toxin is a carcinogenic
compound and causes health hazards to human beings and animals. Prevention of
ochratoxin production and its elimination from food products has been recently of
paramount importance for many researchers. Approximately 25% of the world’s food crops
are affected each year by mycotoxins. Mycotoxin-contaminated food has serious safety
implications for toxicology, crop, livestock, and poultry producers; grain handlers; food and
feed processors; consumers worldwide, and eventually national economies. Various fungiinhibiting chemicals have been used for the preservation of stored grain. However, many
disadvantages (generation of toxic residues, development of resistance pathogens,
expensive and time-consuming to formulate) are associated with their usage, besides a
world trend towards reducing their use in grain, fruits and foodstuffs. There is therefore a
continuing need to develop strategies for controlling plant pathogen fungi with natural
extracts that preserve the environment and undertake a more efficient control of pathogenic
fungi. An improvement in crop yield and quality will result. The use of natural
biopesticides offers a viable option for pest control. Actually they are cheap and readily
available in many Third World regions, relatively safe and degradable. In most cases, there
is no single method that will ensure the complete removal of the contaminant. Thus,
integrated management with a combination of different methods may significantly reduce
risks associated with mycotoxin contamination and yield products that are safe and
acceptable for consumption. Current research deals with the effect of Neem leaf extract on
growth, morphology and citrinin production by three isolates of Penicillium citrinum in
culture. Analyses by thin layer chromatography, colorimetric assay and analyses by high
performance liquid chromatography demonstrated blockage of citrinin production.
Although fungus growth was not reduced, there were differences between colony
macroscopic characteristics on controls and treatments. The extract’s effects on growth,
sporulation and
ochratoxin
A production by Penicillium verrucosum
and
P.
brevicompactum were also investigated. Thin layer chromatography failed to show any
inhibited ochratoxin A production; however, Neem extracts affected growth rate and
sporulation of isolates. Assays show that Neem extracts have fungitoxic activity even
though their mode of action is still not fully understood. It is also quite possible that
different chemicals or different ratios of chemicals found in Neem trees have varied effects
on fungi. Evidence exists in current study and in others that fungi species react differently
to compounds from the Neem tree. Additional research is needed to determine the potential
usefulness of Neem products in fungi control programs, evaluating their use in many
agricultural systems and studying how best to separate, extract, formulate and use them to
maximize their benefit.
De acordo com as normas do Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, esta tese
é composta por três artigos: um de revisão (publicado) e dois elaborados na forma de
artigos científicos. O segundo artigo está sendo reconsiderado para resubmissão no Current
Microbiology, e o terceiro artigo, em preparação para submissão no Journal of Basic
Microbiology.
Acta Farm. Bonaerense 24 (1): 139-48 (2005) Revisiones Recibido el 9 de julio de 2004 Aceptado
el 12 de diciembre de 2004
A árvore Nim (Azadirachta indica A. Juss): Múltiplos Usos
Simone Aparecida Galerani MOSSINI e Carlos KEMMELMEIER*
1 Universidade Estadual de Maringá, Departamento de Bioquímica, Avenida Colombo, 5790, BR87020-900. Maringá, PR Brasil
RESUMO. O Nim é uma árvore milenar, nativa da Índia, que vem sendo utilizada há séculos
para os mais variados fins. Suas atividades medicinais e praguicidas têm sido fonte de grande
interesse na pesquisa científica. A planta fornece grande número de metabólitos secundários
com atividade biológica, sendo a azadiractina considerada de maior importância ecológica. A
pesquisa envolvendo a planta vem crescendo nos últimos anos, devido à procura por métodos
ambientalmente seguros no controle de pragas, sendo evidente que a árvore pode
desempenhar um papel importante no manejo integrado de sistemas, e também devido aos
seus comprovados efeitos medicinais.
SUMMARY. “The Neem tree (Azadirachta indica): wide-ranging uses”. Neem is a millenary tree
native to India where it has traditionally been used for centuries for treatment of human ailments
and pest control. The Neem tree has fascinated scientists from various fields of research as its
secondary metabolites find use in agriculture and medicine. A large number of biologically active
compounds have been isolated from it; the best known among them is azadirachtin, which is
considered to be of the most ecological importance. Studies on the various parts of the tree have
been increased significantly and its active principles have interesting potential for use in integrated
pest management and alternative medicines.
PALAVRAS CHAVE: Azadirachta indica, Nim, múltiplos usos. KEY WORDS: Azadirachta
indica, Neem, wide-ranging uses.
* Autor a quem dirigir correspondência. E-mail: [email protected]
INTRODUÇÃO
Azadirachta indica (sin. Antelaea azadirachta, Melia azadirachta), conhecida popular-mente
como Nim, tem sido usada por séculos no Oriente como: planta medicinal (no tratamento de
inflamações, infecções virais, hipertensão e febre), planta sombreadora, repelente, material para
1-3
construção, combustível, lubrificante, adubo e mais recentemente como praguicida . Embora os
praguicidas sintéticos ainda sejam o principal meio de proteção às culturas,
o uso de métodos alternativos tem aumentado, em função da necessidade atual de superar problemas como resistência e redução dos riscos de contaminação ambiental provocados pelos produtos sintéticos não-biodegradáveis. A procura por compostos naturais com potencial preventivo e
curativo, sem indesejáveis efeitos tóxicos, vem crescendo nas últimas décadas. Devido à baixa
toxicidade e larga distribuição na natureza, o Nim pode ser considerado como uma valiosa fonte
para uso na Medici-na tradicional e no desenvolvimento de drogas modernas. Em geral, os efeitos
benéficos de produtos naturais, como o Nim, podem ser atribuídos a um ou mais compostos
fitoquímicos, incluindo antioxidantes, flavonóides e outras substâncias.
A presente revisão tem por objetivo trazer as principais informações sobre as inúmeras qualidades e potencial do uso do Nim presentes na literatura científica nacional e internacional.
A planta Nim
4
A árvore Nim cresce bem em áreas de clima tropical e subtropical . É uma planta pertencente à
família Meliaceae, como o mogno, sendo hoje conhecida pelo nome botânico Azadirachta indica A.
Juss. O porte da árvore pode variar de 15 a 20 m de altura, com tronco semi-reto a re-to, de 30 a 80
cm de diâmetro, relativamente curto e duro, com fissuras e escamas, de coloração marrom2
avermelhada. O diâmetro da copa varia de 8 a 12m, podendo atingir 15 m em árvores isoladas . São
árvores atrativas, com grande quantidade de folhas sempre verdes, do tipo imparipenadas,
alternadas, com folíolos de coloração ver-de-claro intenso, que caem somente em casos de seca
extrema. As raízes penetram profunda-mente no solo, onde o local permite, e quando sofrem algum
tipo de dano, produzem brotos. O sistema radicular da planta é composto por uma raiz pivotante,
sua principal sustentação, possibilitando a retirada de água e nutrientes de grandes profundidades e
de raízes laterais auxiliares. As flores são pequenas, brancas, bissexuadas, brotam em feixes axiais,
arranjando-se em inflorescências de cerca de 25 cm de comprimento; possuem um perfume
semelhante ao mel e atraem muitas abelhas. Os frutos são lisos, glabros, elipsóides, com 1,5 cm x 2
cm de comprimento, de cor amarelada quando maduros, com uma polpa doce envolvendo as
sementes, que são compostas por uma casca e um ou mais caroços. As sementes e as folhas são
2,3
usualmente empregadas no controle de pragas . A árvore normalmente começa a fornecer frutos
3
após 3-5 anos do plantio, com produção superando 25 kg/planta a partir do quinto ano . A produção
de frutos ocorre principalmente entre julho e setembro, podendo ocorrer uma segunda florada entre
novembro e janeiro. O Nim é facilmente propagado, tanto sexualmente quanto vegetativamente,
podendo ser plantado por meio de sementes, mudas, árvores novas, brotos de raiz ou tecido de
cultura. Entretanto, o crescimento se mostra melhor em áreas com chuvas anuais de 800 - 1800 mm,
2
solos arenosos, profundos e bem drenados, com pH entre 6,5 e 7,5 e temperaturas de 20 °C .
Apesar de possuir atividade inseticida, existem insetos que danificam a planta, como as formigas
cortadeiras, causadoras de desfolha do Nim, percevejos e cochonilhas. No Brasil, a doença ocorre
2
esporadicamente, não ocasionando danos significativos para caracterizá-las como pragasdoNim .
A química do Nim
Nim é capaz de se proteger contra grande número de pragas por meio de uma grande
quantidade de compostos bioativos. Seus principais elementos químicos são uma mistura de 3 ou 4
compostos correlatos, que podem ser modificados em mais de 20 outros menores, porém não menos
ativos. No geral, esses compostos pertencem à classe dos produtos naturais conhecidos por
triterpenos, mais especificamente limonóides. De fato, pelo menos 9 limonóides de Nim têm
demonstrado habilidade em bloquear o desenvolvimento de pragas agrícolas. Dentre esses, o
limonóide ou tetranortriterpenóide azadiractina é o mais estudado e mais potente. Apesar de os
compostos bioativos presentes no Nim serem encontrados em toda a planta, aqueles presentes
primeiramente nas sementes e folhas são os que possuem compostos mais concentrados e
acessíveis, facilmente obtidos por meio de processos de extração em água e solventes orgânicos
2,5
como hidrocarbonetos, álcoois, cetonas ou éteres .
Métodos de extração com solventes fornecem vários compostos biologicamente ativos e o
mais antigo e popular método utilizando água é extremamente eficaz. Por outro lado, o uso de
solventes não-polares fornece uma variedade de compostos químicos. Após a extração, métodos de
separação podem ser utilizados no isolamento e identificação dos compostos, como HPLC e
5
análises espectrofotométricas . Várias técnicas têm sido modificadas para tornar mais eficiente o
processo de extração dos compostos bioativos do Nim, com grande enfoque no composto aza6-8
diractina .
Paralelamente, grande número de novos triterpenóides com atividade biológica vem sendo
9-12
isolados de extratos de sementes e folhas do Nim
. Também têm sido identificados produtos
13,14
. Dos nove isômeros de azadiractina
derivados e produtos análogos do composto azadiractina
descritos na literatura, azadiractina A e B representam a maior concentração de metabólitos
presentes nas sementes e são consideradas importantes para a comercialização da planta como
15
biopesticida . A azadiractina se concentra principalmente nos frutos, aumentando ao longo do
desenvolvimento, sendo máxima no amadurecimento e durante o armazenamento, podendo sofrer
variações de acordo com o modo de colheita, armazenamento, teores de umidade, presença de luz,
2,3
temperatura e variações no pH .
16
Jain et al. detectaram que, quando a árvore está situada em solos ligeiramente alcalinos,
apresenta maior quantidade de nutrientes disponíveis, e que fatores ambientais, como latitude
geográfica, desempenham papel significativo no aumento de produtividade da planta. Outros estudos também relatam variações no conteúdo de azadiractina entre plantas provenientes de diferentes regiões e países, entretanto, tais variações não são atribuídas apenas às condições
climáticas, uma vez que ocorrem de forma individual entre as árvores de uma mesma região, mas
15
.
sim
devido
a
diferenças
genéticas
Efeitos praguicidas do Nim
Apesar de os efeitos de produtos à base de Nim serem bastante conhecidos no controle de
insetos, podem também influenciar outros organismos como os nematóides (uma das pragas mais
devastadoras na agricultura), caramujos (especialmente Biomphalaria glabrata, auxiliando no
controle da esquistossomose), crustáceos (que prejudicam culturas de arroz por utilizarem as
mesmas fontes de nitrogênio), viroses de plantas e fungos. Por outro lado, a planta contém
compostos que podem produzir um acréscimo na produção de certas espécies benéficas à
agricultura. Bons exemplos disso são aumentos em cerca de 25% na produção de minhocas (Eisenia
foetida) utilizadas no melhoramento de solos e de compostos que parecem ser benignos para
aranhas, borboletas, abelhas que polinizam plantações e árvores, joaninhas que consomem pulgões,
1,2
e vespas que atuam como parasitas em várias pestes agrícolas .
Há relatos na literatura sobre o efeito inseticida do Nim envolvendo principalmente, lagartas e
besouros, sendo várias espécies de lepidópteros, coleópteros, homópteros, dípteros e heterópteros
2
testadas com resultados positivos . Espécies de insetos reagem diferentemente aos compostos do
Nim. Estudos têm indicado que limonóides presentes na planta possuem diver-sos mecanismos e
17
2,3,17-24
25-27
sítios de ação , causando efeito antialimentar
, efeito repelente de postura de ovos
,
efeito regulador do crescimento2,3,17,19,28, interferência nas funções bioquímicas e fisiológicas
2,19,21,22
2,3,29
19,28-30
, efeitos sobre a reprodução
, e, em certos casos, a morte
. Outros estudos
17,19
demonstraram uma ação direta, inibindo a motilidade por meio de efeitos citotóxicos
, e
3
promovendo inibição da síntese de quitina . Estes resultados não são apenas dose-dependentes, há
um aumento do po-der de resposta com os primeiros estádios larvais. Entretanto, algumas espécies
2
reagem de maneira diferente, sofrendo ação do Nim apenas ao final da fase adulta .
Estudos relatam seu uso com finalidade repelente contra mosquitos dos gêneros Aedes, Culex,
31-33
34
. Rahman et al. demonstraram
Anopheles, demonstrando segurança e eficácia nas aplicações
35
efeito larvicida do Nim contra o mosquito Culex quinquefasciatus, enquanto Elhga et al.
verificaram efeito sobre a habilidade de eclosão dos ovos e desenvolvimento larval do mosquito
Culex pipiens, efeitos dependentes da dose e tempo de exposição. Produtos de Nim também
mostram potencial considerável no controle de pragas em grãos estocados, sen-do o efeito repelente
importante. Um bom exemplo é o tratamento com óleo de Nim em sacos de juta prevenindo a
3
penetração de pragas por vários meses .
2,26,36,37
A eficácia do Nim sobre ácaros e nematóides na agricultura
tem gerado interesse como
um meio efetivo de controle dessas pragas, principalmente devido à característica da planta de ser
37
inócua a organismos não-alvo .
A atividade moluscocida do Nim também ocorre de maneira dose e tempo-dependente, com
38
eficácia superior aos moluscocidas sintéticos . Estudos envolvendo a ação do extrato de óleo da
semente de Nim sobre lesmas comestíveis não mostraram efeitos nocivos, já extratos crus da casca,
raiz e folhas a 500 e 700 mg kg (-1) produziram mortalidade após 48h de exposição para
39
Limicolaria aurora e em 72h para Archachatina marginata .
O composto azadiractina se mostra eficaz na inibição da transmissão de Trypanosoma cruzi,
2
agente causal da Doença Chagas, mediante sua ação sobre o inseto barbeiro Rhodnius prolixus .
Testes envolvendo o uso de extratos de folhas em cultura líquida mostraram inibição do
crescimento vegetativo de Fusarium oxysporum f. sp. ciceri, Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii,
e Sclerotinia sclerotiorum. Há relatos da ação de extratos aquosos de folhas na inibição, em vários
graus, de certos patógenos foliares do arroz: Pyricularia oryza, Rhizoctonia solani, Curvularia
lunata, Aspergillus niger e Fusarium moniliforme, sendo o grau de atividade variável com o
organismo em teste; Sarcocladium oryzae e Fusarium oxysporum f. sp. cepae, Phaeoisariopsis
personata e Puccinia arachidis em amendoim, e Aspergillus niger e Aspergillus flavus também em
1,40
2,41-44
. Outros relatos têm confirmado a atividade antifúngica dos extratos
; efeitos
amendoim
45
45
fungitóxicos in vitro ; efeito fungistático sobre fungos fitopatogênicos, dentre eles Aspergillus
flavus, Diaporthe phascolorum, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium verticillioides e
47
Sclerotinia sclerotiorum ; atividade fungistática com inibição da produção de aflatoxina B1 em
48
cultura submersa de Aspergillus spp aflatoxigênica ; inibição da formação de aflatoxina em
49
Aspergillus parasiticus em níveis superiores a 90% com extrato de Nim 50% (v/v) . Análises por
cromatografia em camada delgada e cromatografia líquida de alta performance demonstram
inibição da produção de patulina pelo fungo Penicillium expansum em concentrações de extrato
50
aquoso 10%, superiores a 50 mg/ml, em meio de cultivo líquido .
51
Também de difícil controle, viroses de plantas se mostram suscetíveis à ação do Nim .
Usos na pecuária e veterinária
Além da ação repelente contra carrapato e mosca-do-chifre, o Nim vem sendo utilizado no
controle de pulgas e piolhos, na cicatrização e assepsia de ferimentos, na cura da sarna e como
2
vermífugo .
O uso da torta de Nim como suplemento alimentar vem sendo avaliado com resultados satisfatórios tanto do ponto de vista econômico, quanto da segurança, podendo até mesmo substituir a
52
53
ração em alguns casos . Rao et al. avaliaram a ação da torta de sementes de Nim adicionada à
alimentação de cabras e por meio de análises sanguíneas verificaram redução no conteúdo lipídico e
aumento de ácidos graxos insaturados, achados considerados benéficos na redução dos níveis de
colesterol, não afetando a qualidade da carne.
Outros estudos indicam que o uso da torta de semente de Nim tratada com uréia em substituição
à torta de amendoim na alimentação de ovelhas é uma excelente fonte protéica, com resultados
positivos em relação ao ganho de peso, economia e segurança; entretanto pode ocorrer formação de
54
microcálculos nos rins .
As propriedades anti-helmínticas foram avaliadas contra Heligmosomoides polygyrus em ratos,
55
não demonstrando efeito biológico significativo nesse modelo . Estudos envolvendo atividade
anti-helmíntica em cordeiros também não mostraram eficácia quando comparado ao
56
compostodereferência .
Usos na agricultura
Produtos à base de Nim têm sido aplicados em culturas, por meio de polvilhamento do pó de
sementes e folhas, para controle de pragas como a lagarta e mediante pulverização de extratos
aquosos ou de soluções de óleo emulsionável para controle de insetos e outras pragas foliares. A
incorporação de folhas, frescas ou se-cas, no solo tem reduzido a população de nematóides, sendo
que a ação do produto aumenta à medida que vai se decompondo. Cultivos de tomate, berinjela,
repolho e couve-flor conduzidos em plantio intercalado com Nim têm demonstrado redução nas
2
infestações por nematóides .
Um dos principais problemas do uso de Nim é a durabilidade do composto azadiractina. Nas
condições do campo, a atividade dos compostos se reduz rapidamente permanecendo por 4 a 8 dias,
devido a fotodegradação provocada pela luz ultravioleta, baixa de pH e chuvas, havendo a
3,4,57
necessidade de muitas aplicações por estação
. Por outro lado, a derivação do produto natural
4
estabiliza a azadiractina aumentando sua atividade residual .
Três formulações básicas têm sido preconizadas para uso no manejo de pragas: extrato aquoso,
óleo da semente e pó da semente, sen-do as soluções aquosas empregadas na pulverização de
58
culturas no campo e as formulações em óleo ou pó na preservação de grãos estocados .
Aplicações de suspensão aquosa de extratos de Nim, por meio de pulverização foliar, sobre
tomate e pimenta, em casa de vegetação e no campo, não só reduziram a incidência de doença como
também aumentaram o rendimento, produzindo frutos mais saudáveis sem causar efeitos fitotóxicos
59. Estudos comparando a eficácia de produtos à base de Nim em relação ao praguicida hexacloro
benzeno (BHC) demonstraram superioridade significativa na redução da oviposição, eclosão e do
60
desenvolvimento larvar em Caryedon serratus Olivier . Nim tem sido aplicado em plantios
hidropônicos, demonstrando controle eficiente contra ataques por insetos, sendo que o efeito é con61
centração e tempo dependente . Também o uso de produtos à base de Nim no manejo de pragas do
algodão tem sido visto com potencial para ser empregado em larga escala, por ser efetivo,
62
econômico e ambientalmente seguro . Pesquisadores utilizando extratos de semen-tes puderam
demonstrar inibição significativa da nitrificação, promovendo a imobilização do sulfato de amônia e
63
64
aumentando a eficiência do uso de N em diferentes tipos de solo . Segundo Majumdar et al. ,
produtos à base de Nim são úteis no processo de inibição da nitrificação e podem ser utilizados em
adição ao composto dicyandiamide (DCD) para reduzir a emissão de N2O a partir do cultivo de
arroz. Experimentos empregando Nimin (extrato etanólico de Nim) em cultura de menta japonesa
–
(Mentha arvensis) demonstraram eficácia comparável ao DCD na redução da formação de NO3 no
65
solo, além de aumentar a produção da erva e o rendimento de óleos essenciais a partir do cultivo .
66
Gajalakshmi & Abbasi investigaram o uso de folhas de Nim como substrato para produção de
vermifertilizante. Neste modelo, as minhocas se alimentavam do fertilizante de Nim com uma taxa
de conversão em vermifertilizante superior a 7% ao dia. Segundo o estudo, a planta pode fornecer
um fertilizante que funciona também como pesticida.
67
Xuan et al. demonstraram o efeito alelopático proveniente de compostos fenólicos presentes na
casca e folhas do Nim sobre a germinação e crescimento de alfafa (Medicago sativa L.), feijão
(Vigna angularis), cenoura (Daucus carota L.), rabanete (Raphanus sativus L.), arroz (Oryza sativa
L.), sesame (Sesamum indicum L.) e ervas-daninhas Echinochloa crus-galli, Monochoria vaginalis
e Aeschynomene indica L. em laboratório e no solo.
68
Chaturvedi et al. procurando aumentar e melhorar a produção da planta realizaram estudos,
69
inicialmente envolvendo a produção do Nim em cultura e posteriormente utilizando a propagação
clonal de árvores de Nim, escolhidas pelo conteúdo em azadiractina, e verificaram que a seleção
promovia considerável melhoria na produção do composto, além de acelerar consideravelmente a
produção
do
material
para
o
plantio.
Usos na biorremediação
Nim tem sido utilizado na descoloração de corantes têxteis sintéticos: o resíduo da casca de Nim
(rico em lignina e outros compostos fenólicos) é empregado para produção de lignina peroxidase
70
por Phanerochaete chrysosporium sob fermentação sólida . Pó de folhas de Nim tem sido
utilizado com eficácia para remoção do corante Verde Brilhante presente em soluções aquosas,
71
como uma alternativa ao uso de carvão ativado .
2+
2+
O comportamento da casca de Nim como bioabsorvente dos metais pesados tóxicos Cd , Hg ,
3+
e Cr , em submicro concentrações, na remediação ambiental a partir de lixo aquoso tem sido
72
investigado com resultados positivos . Produtos de Nim também têm sido utilizados na remoção
73
de amônia a partir de água salobra .
A casca da árvore é também utilizada no preparo de corantes, usados no tingimento de tecidos
finos. Nim se mostra resistente aos gases poluentes, tolerante à seca e ao dióxido de enxofre e atua
74
como indicador da presença de pó e fumaça, na redução da erosão do solo e purificando o ar .
Efeitos medicinais do Nim
Grandes variedades de atividades farmacológicas e aplicações medicinais são conhecidas a partir
de várias partes da planta. Relatos na literatura têm exibido grande diversidade de funções
biológicas a partir de um grupo de compostos presentes na planta. Apesar da exata composição do
extrato de Nim ser ainda indeterminada, os componentes da folha solúveis em água têm provado ser
75,76
eficazes no controle de várias doenças, incluindo câncer
. Na literatura, têm sido descritas
atividades anti-sépti-cas, curativas, antiúlcera, antiinflamatória, antifertilidade, hipolipidêmica e
77
hepatoprotetora . Dentre essas atividades, o efeito hepatoprotetor das folhas de Nim foi
demonstrado por meio de sua administração como pré-tratamento antes do uso de paracetamol. O
extrato estabilizou os níveis séricos das enzimas marcadoras de dano hepático, resultados
78
confirmados pelas análises histopatológicas realizadas . Extrato aquoso de folhas de A. indica tem
demonstrado capacidade em prevenir e reverter significativamente o dano hepatotóxico induzido
79
por drogas antituberculares em ratos .
Estudos envolvendo o uso de extrato de folhas de Nim em formulações de gel dental mos-tram
redução da placa bacteriana; folhas têm si-do utilizadas no tratamento de gengivites e periodontites
80
. Azadirachta indica mostrou atividade antiinflamatória, mediante a supressão da capacidade do
patógeno Propionibacterium acnes de induzir espécies oxigênio reativas e citocinas pró81
inflamatórias . A ação antibacteriana do óleo de Nim também foi demonstrada in vitro contra
82
bactérias patogênicas por meio da inibição da síntese da membrana celular bacteriana .
Efeitos gastroprotetores (anti-secretor e antiúlcera) têm sido observados com o uso de extrato da
83
casca, eqüipotentes à ranitidina e ao omeprazol , assim como significante inibição da ulceração
84
gástrica induzida por indometacina em ratos . Atividades hipoglicemiantes foram investigadas em
85,86
ratos normais e diabéticos, revelando redução significativa nos níveis de glicose sanguínea
;
atividades sobre o sistema cardiovascular de gatos e rãs, resultando em efeitos hipotensivos e
redutores da atividade cardíaca com o uso de extrato hidroalcoólico de folhas, também têm sido
87
relatadas . Estudos avaliando o papel protetor de extratos de sementes em ratos com diabetes
(induzida por estreptozotocina) indicam prevenção do estresse oxidativo no coração e eritrócitos,
88
protegendo os animais do dano cardíaco .
89-91
Produtos à base de óleo de Nim têm demonstrado efeitos antifertilidade
, ação espermicida
91
direta e atividade antimicrobiana significativa contra patógenos sexualmente transmissíveis .
92
Killare & Shrivastan realizaram estudos sobre o efeito do extrato de folhas em espermatozóides
humanos e constataram potente ação espermicida, sendo que aproximadamente 3 mg de extrato são
necessários para imobilizar e matar 100% de 1 milhão de espermatozóides em 20 segundos.
Sementes e folhas administradas oralmente possuem imunomoduladores que induzem reações
imunocelulares, causando interrupção completa da gestação antes do estágio de implantação em
roedores e primatas, de forma reversível, sendo a fertilidade restaurada nos ciclos subseqüentes. Os
efeitos imunomoduladores têm recebido grande atenção, devido às suas propriedades diuréticas,
93,94
antimicrobianas, antiinflamatórias, antipiréticas, anti-tumorais, e indutoras de interferon
.
95
Potente atividade citotóxica contra um grupo de células humanas cancerígenas foi obtida in vitro .
O efeito contraceptivo pós-coital do óleo de Nim não envolve estrogênio ou progesterona, podendo
ser considerado como efeito não-hormonal, portanto, não ocasionando os efeitos colaterais dos
96
contraceptivos esteróides . Em adição à ação contraceptiva, têm sido descritas ações
antimicrobianas associadas (antibacteriana, antifúngica e antiviral), úteis na prevenção contra
94
doenças .
Extrato de folhas administrado em hamsters, com carcinoma bucal induzido por 7,12-dimetilbenz[a]antraceno (DMBA) promoveu supressão do câncer. Estudos sugerem mecanismo de ação
76
por meio de modulação da peroxidação lipídica, antioxidantes e sistemas de detoxificação . Resultados de investigações envolvendo a ação quimiopreventiva, possivelmente mediada pela
modulação da peroxidação lipídica, antioxidantes e detoxificação de enzimas, são altamente
promissores na terapia do câncer, incrementando os mecanismos antioxidantes de defesa do
76,97-99
. Flavonas isoladas de flores de Nim mostraram efeitos antimutagênicos baseados
hospedeiro
100
na inibição da ativação enzimática de aminas heterocíclicas .
Folhas de Nim podem atuar como mediador na ativação da resposta imune. Baral & Chatto75
padhyay , estudando em ratos o efeito profilático e terapêutico das folhas sobre carcinoma de
Ehrlich e melanoma B16, verificaram que o extrato é capaz de proteger o animal contra o
crescimento do tumor e assim atuar como agente quimiopreventivo, mediante a ativação imune e/ou
outros mecanismos de defesa do hospedeiro.
Existem vários relatos quanto à eficácia da atividade do extrato aquoso de folhas contra grande
94
número de viroses como poxvírus, poliomielite, herpesvírus . O composto azadiractina e o extrato
aquoso de folhas também demonstram ação inibitória in vitro e in vivo sobre a replicação do vírus
101
da Dengue tipo 2, confirmada por ensaios de inibição viral e RT-PCR . A planta possui efeito
102
antiviral contra o grupo Coxsackie B in vitro, segundo estudos realizados por Badan et al. .
Nim tem sido descrito como possuindo atividade antimalárica: estudos relatam efeitos do extrato
de sementes sobre o crescimento e desenvolvimento dos estágios sexual e assexual do parasita
humano da malária Plasmodium falciparum. O efeito anti-plasmodial ocorre também sobre
parasitas já resistentes a outras drogas antimaláricas (cloroquina e pirimetamina), sendo ativo não
apenas contra as formas do parasita responsáveis pelos aspectos clínicos da doença, mas também
103-105
106
contra as formas responsáveis pela transmissão da malária
. Isah et al.
avaliaram as
propriedades antimaláricas e a padronização do uso de tabletes de Nim em ratos, evidenciando a
existência de atividade antimalárica em tabletes preparados a partir da casca e folhas.
O componente bioativo azadiractina tem demonstrado afetar o desenvolvimento do protozoário
103,107
parasita Trypanosoma cruzi em diferentes espécies do vetor triatomíneo
.
Nim tem demonstrado atividade antidermatofítica in vitro contra os dermatófitos Trichophyton
rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton violaceum, Microsporum nanum,
108
Epidermophyton
floccosum
.
Toxicidade
Testes de toxicidade em mamíferos, utilizando produtos à base de Nim, não causaram mortalidade nas doses máximas por via oral aguda, dermal ou por inalação. Extrato aquoso de folhas a
10%, administrado via oral por 24 horas, mostrou leve efeito diurético. Em cães, a administração
intravenosa causou diurese, já a administração intramuscular não teve efeito. Atividades
mutagênicas e relacionadas a possíveis danos cromossômicos, investigadas in vivo e in vitro,
2,3
forneceram resultados negativos . A DL50/24h do óleo de Nim foi estabelecida como 14 ml/kg
109
em ratos e 24 ml/kg em coelhos . Testes avaliando irritação ocular e cutânea primárias, inalação
aguda, resposta imune e sensibilização não forneceram resultados preocupantes do ponto de vista
3
toxicológico .
110
revelam ausência de efeitos adversos com administração de azadiractina 12%
Raizada et al.
via oral, a ratos machos e fêmeas até 1500 mg/ Kg/dia por 90 dias, não produzindo sinais de toxicidade, mortalidade, alterações de peso ou dos parâmetros sanguíneos.
Estudos toxicológicos com óleo de Nim não demonstraram presença de efeitos adversos nos
parâmetros reprodutivos em ratos monitorados por três gerações, podendo ser recomendado para
111
uso humano .
Efeitos do extrato aquoso foram investigados em Tilapia zilli (Gervais), em condições de la112
boratório por um período de 96 horas, demonstrando toxicidade aguda ao animal .
Extratos podem causar fitotoxicidade quando em altas concentrações, dependendo da espécie,
idade e fase de desenvolvimento da planta sobre a qual são aplicados. Todavia, quando utilizados
no campo, nas doses recomendadas, não têm demonstrado tal efeito. Além disso, a azadiractina é
2
totalmente biodegradável e sua meia vida no solo é de cerca de 20 dias .
Produtos à base de Nim não mostram toxicidade a abelhas produtoras de mel na faixa de 500
ppm; minhocas têm se beneficiado com a aplicação de extratos no solo, com aumento de peso e
multiplicação; aranhas, borboletas e formigas não apresentam efeitos prejudiciais a partir da
2,3,113
exposição aos extratos
.
Em estudos sobre a função tireoidiana em ratos machos, o extrato de folhas exibiu diferentes
efeitos: em altas doses se mostrou não-seguro quanto à função tireoidiana [decréscimo dos níveis
séricos de triiodotironina (T3) e aumento dos níveis de tiroxina (T4)]; promoveu aumento na
peroxidação lipídica hepática e decréscimo na atividade da glicose-6-fosfatase; já em doses baixas
114
nenhum efeito foi observado .
Estudos investigando o efeito do produto Vepacide (praguicida à base de Nim) sobre as enzimas
fostatase ácida e alcalina em diferentes tecidos de ratos albinos Wistar machos e fêmeas, indicam
aumentos significativos das enzimas no soro, rins, pulmões e tecido hepático. As alterações
enzimáticas se mostraram dose e tempo dependentes, reversíveis com a remoção do toxicante e
115
passíveis de serem utilizadas como biomarcadores de exposição ao produto .
84
Raji et al. verificaram que a administração intraperitonial de Azadirachta indica (1000 mg/kg
de extrato) não produziu sinal de toxicidade em ratos, nem alteração significante no peso corpóreo
ou de órgãos durante 3 semanas após aplicação, não sendo observados sintomas de diarréia,
comportamento estereotípico ou morte durante esse período. Entretanto, a administração oral de
3200 mg/kg de extrato causou 100% de mortalidade.
116
Segundo estudos realizados por Khan & Awasthy
o composto azadiractina pode ser
considerado como um carcinógeno genotóxico devido à presença da seqüência (-O-CH=) na
estrutura em meio anel furano do composto, como ocorre em muitos carcinógenos, incluindo
aflatoxinas. Além disso, a eletronegatividade do composto é da mesma magnitude que ocorre nas
moléculas de DNA. A alta incidência de alterações sinápticas e variações numéricas em
cromossomos confirmam a citotoxidade do extrato, em concordância com observações realizadas
em cromossomos mitóticos. O estudo revela também um aumento na freqüência de espermatozóides aberrantes, juntamente com diminuição da contagem. Dessa forma, os danos potenciais
do extrato não podem ser ignorados, tendo em vista o longo período de risco genético ao homem.
117
Kasturi et al.
verificaram alterações ultraestruturais, induzidas pelo uso de folhas de Nim, nos
testículos de ratos albinos, mediante propriedades antiespermatogênicas e antiandrogênicas,
afetando assim a espermatogênese.
Pesquisas realizadas com o produto Nimbo-kil-60 EC (inseticida à base de óleo de semente de
Nim) para determinação de toxicidade em mamíferos revelaram ausência de efeitos adversos ou
doença nos animais testados. A LD50 foi estabelecida em 16 ml/kg, com ausência de alterações
118
histológicas em órgãos vitais .
110
Raizada et al.
realizaram estudos toxicológicos administrando azadiractina via oral a ratos
machos e fêmeas nas doses de 500, 1000 e 1500 mg/kg/dia por 90 dias. Não foram observados
sinais de toxicidade, mortalidade, alterações patológicas ou séricas, sendo a dose de 1500 mg/kg
indicada como dose basal para determinação do nível de ausência de efeitos do composto para
calcular
sua
margem
de
segurança.
CONCLUSÃO
O uso da planta Nim vem se tornando importante na terapia herbal alternativa, graças aos já
comprovados efeitos curativos. A planta é uma constante fonte de novos e únicos compostos
fitoquímicos utilizados no desenvolvimento de novos fármacos contra várias doenças humanas.
Produtos à base da planta estão sendo estudados para o desenvolvimento de drogas seguras e
agentes agroquímicos humana e ambientalmente seguros.
Muitas vezes, o foco das pesquisas tem sido
o desenvolvimento de métodos de controle de pragas, em que estas não tenham que ser mortas
instantaneamente, desde que suas populações possam ser incapacitadas, tornando-se inofensivas às
pessoas. Os efeitos precisos de vários tipos de extratos da árvore Nim, quanto ao controle de pragas,
são freqüentemente difíceis de serem apontados, uma vez que a complexidade dos compostos e seus
diversos modos de ação dificultam a elucidação dos mecanismos envolvidos.
O composto azadiractina exibe boa eficácia contra importantes pragas na agricultura, possui
mínimo ou nenhum impacto sobre organismos não-alvo, é compatível com outros agentes de
controle biológico e mostra boa adaptação aos programas de manejo integrado de pragas. Já vida
residual relativamente curta dos princípios ativos presentes nos extratos de Nim pode ser
considerada uma desvantagem do ponto de vista econômico, entretanto, ecologicamente, produtos
com tais características não perturbam o ecossistema nem causam o aparecimento de novas pragas.
Os extratos podem ser utilizados quando os métodos de manejo da lavoura não forem suficientes
para se evitar perdas, sendo bastante promissores para implementação em programas de controle
alternativo de pragas, pois a planta apresenta características importantes como ser rústica, não
invasora, perene, não necessitar ser destruída para obtenção dos extratos, ter alto te-or de compostos
ativos solúveis em água e de fácil extração com baixo custo.
Produtos à base de Nim possuem diferentes efeitos sobre insetos, sendo que os efeitos sobre
multiplicação e crescimento são os mais intensos contra grande número de pragas e de grande
interesse para o manejo de cultivares. Outros efeitos secundários têm sido observados, incluindo
repelência, antioviposição, esterilidade, redução da fecundidade, perda da habilidade de vôo,
perturbação da comunicação sexual e redução da motilidade intestinal.
Embora esses produtos possuam algumas falhas, funcionam bem como ferramenta no mane-jo
integrado de pragas, são uma alternativa ambientalmente segura aos químicos sintéticos, têm efeitos
significativos sobre pragas sem prejudicarem organismos benéficos aos plantios, e os estudos
toxicológicos têm indicado segurança para os mamíferos. Entretanto, achados envolvendo
toxicidade aguda em peixes sob condições laboratoriais devem ter suas implicações sobre o
meioambiente, discutidas e reavaliadas.
Em relação aos usos medicinais da planta, pode-se destacar suas atividades antimicrobianas,
antivirais e antifúngicas, associadas à atividade contraceptiva pós-coital de natureza nãohormonal,
portanto, com efeitos colaterais menores que os provocados pelos contraceptivos esteróides, além
de promover e manter a saúde dos órgãos sexuais femininos. Já a ação sobre o sistema reprodutor
masculino deve ser vista com cautela e necessita de maiores estudos. Quanto às atividades
antivirais, o uso de novos agentes antivirais de origem natural, não-tóxi-cos, de fácil uso e mais
baratos, podem ser um grande auxílio às populações de regiões tropicais e subtropicais, mais pobres
e mais acometidas pelas doenças.
Dados sugerindo o uso da planta no controle dos níveis sanguíneos de glicose são promissores
em direção à prevenção e controle do diabetes, assim como relatos sobre os efeitos quimiopreventivos e antitumorais são valiosos para o desenvolvimento de novas e modernas drogas.
Em relação aos resultados de estudos toxicológicos, os efeitos dos extratos parecem depender da
quantidade consumida, enquanto baixas doses não são tóxicas, altas doses exibem disfunção
tireoidiana e efeitos hepatotóxicos.
Agradecimentos. Nós gostaríamos de agradecer a Prof.ª Maria Aparecida Neri Galerani e ao
Armando Luiz de Sá Ravagnani pela revisão gramatical do manuscrito e ao CNPq pelo suporte
financeiro desse trabalho.
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INHIBITION OF CITRININ SYNTHESIS IN Penicillium citrinum BY Azadirachta
indica A. Juss (Meliaceae) IN CULTURE.
Simone Aparecida Galerani Mossini and Carlos Kemmelmeier1
Departamento de Bioquímica, Universidade Estadual de Maringá, Maringá – PR, Brasil.
Abstract. The efficacy of different concentrations of the aqueous extract of neem leaf (3.12,
6.25, 12.5, 25 and 50 mg/ml) on growth and citrinin production in three isolates of
Penicillium citrinum was investigated in laboratory conditions. Mycotoxin production by the
isolates was suppressed depending on the concentration of the plant extract added to culture
media at the time of spore inoculation. Citrinin production in fungal mycelia grown for 21
days in culture media containing 3.12 mg/ml was inhibited by approximately 80% in three
isolates of P. citrinum. High-performance liquid chromatography was applied to the analyses.
Vegetative growth was assessed, but neem extract failed to inhibit it. Neem leaf extract
showed fungitoxic activity against pathogenic fungi tested, without it did not cause retardation
in fungal growth.
Key words: Penicillium citrinum, citrinin inhibition, Azadirachta indica, neem.
Title Running Head: Inhibition of citrinin production by neem extracts
Introduction
Due to the widespread nature of fungus in the environment, mycotoxins are considered
unavoidable contaminants in foods and feeds. Citrinin contamination by P. citrinum has been
reported in agricultural commodities, food and feedstuffs [1].
Recently there has been considerable interest on the preservation of grains by using natural
products to retard growth and mycotoxin production effectively. Owing to health and
economic concerns, several searches were undertaken to discover compounds that would
safely be used as substitutes for fungicides to inhibit fungus growth or mycotoxin production.
A tree, Azadirachta indica A. Juss (Meliaceae), called neem, has had excellent results, and is
one of the main sources of potentially active metabolites on a wide spectrum of pests and low
toxicity to non-target organisms [2, 3, 4]. One of the main feature of neem extracts,
particularly those from leaves, is that they do not cause retardation in fungal growth, but
inhibit aflatoxin production [5]. In vitro investigations confirmed the inhibitory effects of
neem on aflatoxin [6, 7] and patulin production [8]. Current research investigates
effectiveness of water extracts of neem leaves on citrinin production and growth of isolates of
P. citrinum.
Material and Methods
Microorganisms. Three citrinin-producing isolates of Penicillium citrinum (K1, K4 and K8),
from the culture collection of the Laboratory of Chemistry and Physiology of
Microorganisms (Department of Biochemistry, State University of Maringá – Pr) and stored
in silica, were used.
Preparation of neem leaf extract (NLE): Leaves of Azadirachta indica A. Juss (Meliaceae)
were obtained from the Agricultural Institute of the State of Paraná (IAPAR) in Londrina PR
Brazil. A 10% water NLE was prepared as described by Mossini [8].
Cultures conditions for citrinin production and extraction. Citrinin was produced in
liquid potato-dextrose medium (PD) as described by Wu et al [9]. PD was used in controls
and in an extract of neem leaves. Inocula containing 105 spores of each strain of P. citrinum
were added to 3 ml of PD medium in 25 ml flasks (20X100mm) Pyrex® and incubated at
26±0.5°C for 21 days. Treatments in four replicates consisted of 10% freeze-dried aqueous
NLE at concentrations 3.12, 6.25, 12.5, 25 and 50 mg/ml. On parallel, dry weights were
obtained by freeze-drying of cultures (controls and treatments): the flasks were weighed prior
to the addition of medium, inocula and neem extract, and posterior to the incubation period, in
four replicates. Remaining number of spores after incubation period in controls and in
treatments was obtained by a haematocytometer. Cultures were extracted three times with 10
ml of chloroform and treated with anhydrous sodium sulfate [10], filtered through filter paper
and evaporated to dryness. Residues were dissolved in 0.1 ml of chloroform.
Mycelium inhibition test. Effects of NLE on radial growth and colony characteristics of P.
citrinum isolates were determined by growth on PDA medium containing 12.5 mg/ml of NLE
and on an extract-free medium, according to the poisoned plate technique [11]. Media PDA
and PDA-extract were inoculated at the center of the plate by holding it in an inverted
position [12]. Plates were incubated for 7 days at 25oC. Four replicates were performed for
each medium in two separate experiments. The radial growth of fungi was measured on each
plate and compared, as described by Amandioha [13]. The macroscopic and microscopic
morphological features of the colonies were determined by visual comparison and by 0.1%
Lactofuchsin staining [12].
Citrinin determination.
Analyses were performed according to Betina [10]. Citrinin
(Sigma®) standard was prepared in ethanol (1 mg/ml) and stored at 4oC. Extracts (dissolved
in chloroform) and standard, underwent TLC on 20 x 20 cm Aluminium plates (Silica gel 60
– G. Merck®), with toluene : ethyl acetate : formic acid (6 : 4: 0.5, v/v). After development
the plates were exposed to 365nm ultraviolet light (UV). Citrinin appears as a fluorescent
yellow spot. Phenolic group in citrinin has been estimated by Folin-Phenol reagent [14], with
linear function of the concentration for a range of 5-100 µg/ml.
HPLC analysis was performed to confirm espectrofotometer results. Residues were dissolved
in an appropriate volume of mobile phase (1ml for all samples, except for K8 control (5ml),
filtered through a 0.45 µm disposable syringe filter (Micro Filtration Systems®) prior to
injection into the chromatograph. Aliquots of 20 µl were injected on HPLC column and
analysis were accomplished using a Shimadzu® Liquid Chromatograph, equipped with an LC10AD pump, a Rheodine® injector, an SPD-10A UV detector, a CBM-101 Communications
Bus Module, and a Class-CR10 Workstation system. A reverse-phase Shimpack® GLC-ODS
(M) column (150 x 4.6 mm, 5 µm) was used, at room temperature, together with the same
type of pre-column (10 x 4.6 mm). The mobile phase was acetonitrile-isopropanol-8.10–2 M
phosphoric acid (35:10:55) with a flow rate of 0.8 ml/min for an isocratic run of 30 min.
Absorbance of samples and standard was detected at 360 nm. Retention times and peak areas
were calculated by Class-CR10 software. Comparison of sample retention times with that of
the standard identified the presence of citrinin in the samples. The relationships between peak
height and area and the amount injected were linear over the ranges 2.5-50 ng. The detection
limit was 10 ng/g for citrinin. All solvents used were of analytical and chromatograph grade.
Recovery Experiments. Extraction procedure for espectrofotometer experiments was
validated by the addition of citrinin standard (1mg/ml of ethanol: 10, 25 and 50 µl) to liquid
PD (3 ml), extracted, spotted on plates and analyzed, as has been described for samples.
Known aliquots of citrinin (5-50µg) were also spotted, developed, detected, eluted, and
estimated as samples to check on their recovery from plates. The percentage of added citrinin
recovery in PD medium varied between 38% (to 10 µg) and 52% (to 50 µg), while recovery of
known amounts of citrinin from plates averaged 98.4%.
Statistical Analysis. Statistical significance between control and experimental rates was
calculated according to Turkey’s Test using the Graph Pad Prisma program V.3 (Graph Pad
Software).
Results and Discussion
Figure 1 shows the effects of different concentrations of NLE extract on P. citrinum isolates,
grown on PD. Although fungus growth was maintained low at the initial concentration of
NLE, fungal growth increased in neem concentrations up to 12.5 mg/ml. At low
concentrations an initial antifungal activity occurred. However, when the fungus began to
grow, it reached and superseded the controls’ growth rate. No complete growth inhibition
exists and mycelium weight increases with an increase of NLE. Similar growth inhibition
results, were obtained by other authors, working with P. citrinum [15, 16]. The growth
inhibition patterns were similar to growth of P. expansum [8] and consistent with the findings
of other authors studying neem extracts in Aspergillus, in which the formation of toxins was
prevented but not fungal growth [5, 6, 7]. The ability of the NLE to affect mycelium
production varied among isolates. Although Fig. 1 shows no complete inhibition of spores
amount after the incubation time, different patterns among isolates may be observed: there is a
significant decrease (p<0.05) on number of K4 spores when 3.12 mg/ml of neem extract was
added to medium and maintained for the next concentrations. There was no significant
difference (p>0.05) at 3.12 mg/ml of neem extract in isolate K1; however, a significant
decrease (p<0.05) at 6.25 mg/ml, an increase at 12.5 mg/ml and another decrease at 50mg/ml
occurred. Isolate K8 decreased significantly (p<0.05) at 12.5 mg/ml without alteration for the
next concentrations of neem extract (Values have been calculated by Turkey’s Test).
Direct contact of fungus with NLE on PDA surface resulted in differences between
macroscopic colonies features but not at microscopic ones. Colonies grown on PDA-neem
(Fig. 2) were not only bigger in size than control colonies but their appearance differed too:
colonies were radially sulcate, moderately deep and produced exudates. The anterior part of
colonies on PDA-neem was more intensely green with irregular margins. Microscopic
observations revealed same sized conidia and conidiophore diameter; no alteration in asexual
reproduction development, typical branching of conidiophores and normal conidiophore
appearance; typical size and morphology of spores (results not shown). Comparisons were
also made with the morphologic features of P. citrinum described in the literature [17].
Figure 3 shows the effects of NLE on citrinin production by P. citrinum isolates in PD broth,
determinated by espectrofotometer experiments. After 21 days, quantitative determination
[14] of the extracts from liquid culture media demonstrated inhibition of citrinin production
by three isolates of P. citrinum on media with NLE. Inhibition of citrinin production does not
appear to be simply a function of mycelia weight reduction. Citrinin concentration was
reduced in cultures in which growth was not inhibited. Actually, concentrations of NLE
higher than 3.12 mg/ml inhibit citrinin production as showed by HPLC analysis. The
quantification of citrinin was done by comparing the retention times of the culture extracts
with that of an authentic sample of citrinin. Standard and citrinin from samples were eluted
between 5 to 6 min., as seen in Fig. 4. Neem extracts reached 87.16% inhibition on K4
citrinin production at NLE 3.12 mg/ml, 85.86% inhibition on K1 citrinin production at NLE
6.25 mg/ml, and 94.86% inhibition on K8 citrinin production at NLE 6.25 mg/ml (Table 1).
HPLC results confirmed espectrofotometer and TLC experiments, showing the higher
sensitivity hoped.
Generally, toxin production decreases as mycelium formation decreases. However, citrinin’s
neem extract inhibition was more significant than mycelial alteration. It has also been found
that the standard deviations of mean values for toxin production were much higher than the
deviations of mean values for mycelium with the three isolates.
Other authors [4, 5, 6, 18, 19] reported a blocking on aflatoxin production with an apparently
normal fungus growth and demonstrated that antifungal potentiality against growth may not
coincide with the inhibitory potential of toxin production. Current analysis also revealed that
although the NLE delayed the citrinin production, later the three isolates regained their
toxicogenic capacity when re-cultivated without NLE (results not shown).
Current research offers the possibility of developing methods for controlling mycotoxin
production by fungi coupled to novel environmentally safe agrochemicals of plant origin.
Acknowledgments. We would like to thank Dr. Maria de Lourdes Lucio Ferrarese and Dr.
Oswaldo Ferrarese Filho (Department of Biochemistry, State University of Maringá, Maringá
PR Brazil) for HPLC analysis; Dr.Thomas Bonnici for grammatical revision of the
manuscript; CNPq for financial support.
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ISOLATE K4
ISOLATE K1
ISOLATE K8
Figure 1. Effect of neem extracts added on PD medium on dry weight (A) and on spore
numbers (B) of P citrinum (isolates K1, K4 and K8). Bars indicate standard deviation for
experiments carried out in quadruplicate.
FRONT
REVERSE
ISOLATE K1
ISOLATE K4
ISOLATE K8
PDA-Neem
PDA
PDA-Neem
PDA
Figure 2. P. citrinum isolates (isolates K1, K4 and K8) grown on PDA and on PDA-neem
extract as described in ‘Materials and Methods’.
Citrinin µg
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Isolate K4
Isolate K1
Isolate K8
0.00
3.12
6.25
12.50 25.00 50.00
Neem concentrations (mg/ml)
Figure 3. Citrinin production from P. citrinum isolates determined by colorimetric assay
described in materials and methods. Bars indicate standard deviation for experiments carried
out in quadruplicate.
Table 1.
Effect of neem extracts (mg/ml) treatment on citrinin production (ng/ml) by
Penicillium citrinum a (isolates K1, K4 and K8).
Treatment b (neem extracts) mg/ml
Citrinin (ng) c
Reduction (%)
Control (K1)
1.23 x 104
-
3.12 (K1)
0.175 x 104
85.86%
Control (K4)
3.28 x 104
-
3.12 (K4)
0.42 x 104
87.16%
Control (K8)
10.7 x 104
-
6.25 (K8)
0.55 x 104
94.86%
Experimental details are as described in ´Materials and methods`.
a
The results are the means of 2 experiments with 4 replicates each, determined 21 days after
incubation.
b
c
Neem extracts were prepared as described in ‘Material and Methods’.
Values obtained by HPLC analyses are means of 4 replicates.
Figure 4. HPLC elution profiles from P. citrinum isolates, as described in ‘Materials and
Methods’.(P) citrinin standard; (K1C), (K4C), (K8C-dil.1/5) controls of citrinin production
by P. citrinum isolates grown on PD without addition of neem extract; (K1 (3.12), K4 (3.12)
citrinin from P. citrinum isolates grown on PD with neem extracts (3.12 mg/ml) and (K8
(6.25) citrinin from P. citrinum isolates grown on PD with neem extracts (6.25 mg/ml);
(NLE) neem leaf extract at 12.5 mg/ml.
EFFECT OF NEEM LEAF EXTRACT AND NEEM OIL ON Penicillium GROWTH,
SPORULATION, MORPHOLOGY AND OCHRATOXIN PRODUCTION.
Simone Aparecida Galerani Mossini and Carlos Kemmelmeier1
Departamento de Bioquímica, Universidade Estadual de Maringá, Maringá PR Brazil.
ABSTRACT
In vitro trials were conducted to evaluate the effect of Azadirachta indica (Neem) on
mycelial growth, sporulation and ochratoxin A production by P. verrucosum and P.
brevicompactum. The effect of Neem leaf extract was verified at 6.25 and 12.5 mg/ml of YES
medium. Neem oil extract from seeds was evaluated at 0.125; 0.25 and 0.5% on the same
medium. Ochratoxin A production was evaluated by thin-layer chromatography technique.
Oil extracts exhibited significant (p≤ 0.05) reduction of growth and sporulation of the fungi.
There were major alterations on macroscopic morphology and sporulation when Neem leaf
extract rather than Neem oil was used. No inhibition was observed in ochratoxin A
production. With the accessibility of compounds and low cost, Neem oil could be
implemented as part of a sustainable integrated pest management strategy for plant disease, at
once Neem oil has been shown to be fungitoxic to growth and sporulation.
Key words: sporulation, ochratoxin, Azadirachta indica, antifungal activity.
*Corresponding author. Mailing address: Universidade Estadual de Maringá, Departamento
de Bioquímica, Avenida Colombo, 5790; 87020-900. Maringá PR Brazil. Fax: (+5544) 32633655. E-mail: [email protected]
INTRODUCTION
The presence and growth of fungi in food and feeds may cause spoilage and result in a
reduction in quality and quantity. Fungi produce a variety of secondary metabolites as a
product of their metabolism; mycotoxins are metabolites that have deleterious effects on other
organisms. Ochratoxin A, a potent mycotoxin produced by certain species of Aspergillus and
Penicillium, originally associated with mouldy legumes, fruits, meat and cereal products, is at
present receiving increasing attention for its nephrotoxic effects and its potential carcinogenic
activity (1; 2; 3). Cereal products are the major group of food commodities in which the above
toxin is of high impact. Search is required for control techniques that are cheap, ecologically
sound and environmentally safe to eliminate or reduce the incidence of economically
important pathogens.
In recent years much attention has been given to the preservation of grains by natural
products so that the growth and mycotoxin production may be effectively retarded. Nonchemical systems with plant extracts for the treatment of cultures have played important role
in the inhibition of pathogen growth s and quality improvement (4).
Neem extract is one of the most important plant compounds which inhibit mycotoxin
production. Azadirachta indica A. Juss (Meliaceae) Neem plant comprises several parts, such
as fruit, seed, leaf and oil, with several active compounds (5; 6). The ability to cause
retardation of fungus growth is the basic mode of action of a number of classical antifungal
agents. However, Neem leaf constituents are known to potentially inhibit aflatoxin production
in Aspergillus parasiticus without affecting fungal growth (7). According to RazzaghiAbyaneh et al. (8), the main feature of Neem extracts, particularly those derived from leaves,
is that they do not retard fungal growth, but interfere with aflatoxin production.
Current study evaluates the effects of Neem leaf extract and oil from Neem seeds on
the growth, sporulation and ability to produce ochratoxin A by Penicillium verrucosum and P.
brevicompactum.
MATERIALS AND METHODS
Mycotoxigenic fungi
Three ochratoxin-producing isolates of Penicillium verrucosum (K11 and K13) and
Penicillium brevicompactum (K20), maintained in silica storage, at the culture collection of
the Laboratory of Chemistry and Physiology of Microorganisms (Department of
Biochemistry. State University of Maringá – Pr), were used as test organisms.
Preparation of Neem extracts
Leaves of Azadirachta indica A. Juss (Meliaceae) were hand-collected from healthy mature
trees at the Agricultural Institute of the State of Paraná (IAPAR) in Londrina PR Brazil. A
10% water extract from dried Neem leaves (NL) was prepared by maceration. Oil from Neem
seeds (NO) was obtained from DalNeem Co., Brazil.
Cultures conditions for production of ochratoxin
Yeast Extract Sucrose (YES), recommended for extracellular mycotoxins (9), was the liquid
medium used for ochratoxin production. Inocula containing 105 spores of each strain of P.
verrucosum and P.brevicompactum were added to 3 ml of YES medium in 25 ml flasks (20 X
100mm) Pyrex® and incubated at 26 ± 0.5°C, for 7 days, without shaking. Treatments in four
replicates consisted of 10% freeze-dried aqueous Neem leaf extract (NL) at 6.25, 12.5 mg/ml
and 0.125, 0.25, 0.5% (v/v) of Neem oil (NO) added to YES medium. Mould growth was
reported visually throughout incubation and mycelial growth was measured daily until the end
of the incubation period. Dry weights were obtained after extraction; mycelia were separated
from the broth culture and transferred to preweighed filter paper, dried at 60°C until constant
weight, to determine the amount of growth. Ochratoxin A was extracted from the broth by
procedures according to Scott et al (10). Chloroform extracts were combined and dried by
filtering through anhydrous sodium sulfate to remove water. Chloroform was evaporated to
dryness and residue dissolved in chloroform.
Mycelial and sporulation inhibition test
The effects of NL and NO on radial growth, colony characteristics and sporulation of P.
verrucosum and P. brevicompactum were determined by growing on YES agar in absence
(control) and presence (treatments) of the Neem compounds. These media were needle-(single
spore) inoculated at the center by a sterile loop. Fungi were previously cultured in YES agar
in petri dishes, for producing isolated colonies. Cultures were subsequently incubated at 25°C,
for 7 days. Treatments consisting of NL (6.25 and 12.5 mg/ml) and NO (0.125, 0.25 and
0.5%) were added to the solid media. Radial growth was measured daily until incubation time,
compared and mean values taken, as described by Amandioha, A. C. (12). Macroscopic and
microscopic morphological features [0.1% Lactofuchsin staining (11)] were taken and
analyzed. Sporulation was measured according to Gusman-de-Pena & Herrera (13). Briefly,
mycelium grown in solid media was removed, transferred to a flask containing a sterile 0.1%
Tween 80 solution (10ml) and stirred with a vortex mixer for two minutes to free the spores.
After mycelium sedimentation, the supernatant containing the spores was recovered and
counted using a Neubauer counting chamber. Sporulation data were recorded by spores/cm2
of colony. Percentage inhibition of mycelial growth and sporulation by leaf extracts and oil
were calculated as by Amandioha, A. C. (12). Spores diameter was analyzed for
morphometric analysis by biological optic microscope, 40x lens, equipped with an IPPWINDCAM image-taking kit. An area (µ m2) of 200 spores of each isolate (control and treatments)
was measured by Image-Pro-Plus 3.0.1 software of image analysis. Values were analyzed by
Turkey’s test (PRISMA software) and significance level was set at p< 0.05. Data were
reported as mean (M) ± standard error (SE) for the indicated number of observations (n). Two
experiments were performed with six replicates per treatment and with one control per
experiment.
Ochratoxin detection
Ochratoxin A (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) standard solution was prepared in ethanol
(1 mg/ml) and stored at 4oC. Residues dissolved in chloroform and standard were spotted on
TLC plates (20 x 20 cm Aluminum sheets Silica gel 60 – G. Merck) by using toluene: ethyl
acetate: formic acid (5:4:1; v/v), as reported by Scott and Hand (14), followed by exposure of
plate to ammonia fumes (15). Ochratoxin-ammonia derivative appeared as light-blue
fluorescing spot under ultraviolet light. All solvents used were analytically graded.
Statistical Analysis
All statistical analyses were performed by Turkey’s honest significant difference multiple
comparison test to segregate treatments which were significantly different (PRISMA
software). Analysis of variance (ANOVA) tests were performed for significant (p≤ 0.05)
differences between experiments.
RESULTS AND DISCUSSION
Neem seed oil (NO) and Neem leaf extracts (NL) did not show the same effects on
fungi. Direct contact of fungus with NL and NO on YES medium resulted in differences
between macroscopic colonies features but not in microscopic ones. Colonies of fungi grown
on YES-NO had practically the same size and appearance as those of controls (YES): white
color, radially sulcate, moderately deep and produced exudates (Fig. 1). Fungi colonies grown
on YES-NL were not only bigger in size than control (YES), but their appearance differed
too: green color, radially sulcate, lightly deep and produced more exsudates (Fig. 2).
Microscopic observations revealed same size of conidia and conidiophores; there was no
alteration in asexual reproduction development, typical branching and appearance of
conidiophores (results not shown). Comparisons were also made with morphologic features of
P. verrucosum and P. brevicompactum described in literature (16).
There was no difference in spore area between K11 control and K11 treatments (p ≥
0.05). For isolate K13 and K20, all groups, when compared, were significantly different
(p<0.001). However, there was no similar alteration of the spore area in the isolates. Whereas
in K13 the NO extracts increased their spore area, NL extracts decreased theirs; in K20 the
NO and NL extracts decreased their spore area (Table 1).
The ability of Neem extracts to inhibit growth and sporulation varied widely. Results
(Table 1 and Figure 3) shows that NO extract was effective for reducing fungal growth at all
levels (p ≤ 0.05), however, NL extract was not only ineffective but showed a stimulatory
effect on isolate K11. At 0.125% NO inhibited diameter growth of K11, K13 and K20 by
48.30%, 33.50% and 30.43%, respectively. At 0.25%, NO extract inhibited diameter growth
of K11, K13 and K20 by 49.71%, 39% and 36.14%, respectively. Finally, at 0.5%, NO extract
inhibited growth of K11, K13 and K20 by 51.55%, 38.4% and 38.85%, respectively.
Inhibition of mycelial growth was generally associated with the inhibition of
sporulation. However, Neem extracts enhanced or increased sporulation depends on extract´s
concentration, without showed the same associated effect on mycelial growth. NO extract
significantly (p≤ 0.05) inhibited the sporulation of all fungi at 0.125%, by 47.24%, 82.6% and
80.1% (K11, K13 and K20, respectively). NO (0.25%) inhibited (p≤ 0.05) the isolates K13
(75.6%) and K20 (82.58%) and had a stimulatory effect on sporulation of isolate K11. NO
(0.5%) significantly (p ≤ 0.05) inhibited the fungus K13 (51.2%) and stimulated K11. NL
extract did not inhibit the sporulation of the fungus but showed a stimulatory effect on all
isolates. The effect of extracts on dry weight was also variable: NO decreased in all isolates;
NL increased weight in K11 weight and decreased in K13 and K20 (Table 1).
The extracts’ different effects on radial growth, sporulation and mycotoxin production
may be either due to the solubility of the active compounds or inherent to fungus metabolism.
NO extracts showed higher inhibitory effects than NL, probably owing to the presence of
azadirachtin at its highest concentration in the mature seeds (17; 18).
Toxin production generally decreases as mycelium formation decreases, but research
has shown that antifungal potentiality against growth may not coincide with the inhibitory
potential of toxin production. (6; 7; 19; 20; 21; 22). Current analyses revealed inhibitory
potential of NO extracts on sporulation and mycelium growth of fungi, but not on ochratoxin
A production. Inhibition of this toxin production does not appear to be simply a function of
mycelium weight or sporulation reduction. Although sporulation is typically accompanied by
mycotoxin production, this is not always true, because mycotoxins may be produced at high
levels in growth conditions where sporulation is inhibited (23). Our investigations showed
that the efficacy of Neem extracts against fungi was not similar in all species, since extracts
affected growth and sporulation at different rates and failed to inhibit mycotoxin production in
the fungi.
Current research has therefore shown that Neem oil could be implemented as part of a
sustainable integrated pest management strategy for plant disease, at once Neem oil has been
shown to be fungitoxic to growth and sporulation of the fungi tested.
ACKNOWLEDGMENTS
We would like to thank Dr. THOMAS BONNICI for the grammatical review of the
manuscript and to CNPq for its support of this research.
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Isolate K11
Isolate K13
Isolate K20
YES
YES-NO 0.125%
YES-NO 0.25%
YES-NO 0.5%
Fig. 1 – P. verrucosum (isolates K11, K13) and P. brevicompactum (isolate K20) on YES
and on YES-Neem Oil (YES-NO) as described in ‘Materials and Methods’.
Isolate K11
Isolate K13
Isolate K20
YES
YES-NL 6.25mg/ml
YES-NL 12.5mg/ml
Fig. 2 - P. verrucosum (isolates K11, K13) and P. brevicompactum (isolate K20) on YES
and on YES-Neem Leaf Extracts (YES-NL) as described in ‘Materials and Methods’.
B
A
Isolate K11
Isolate K13
Isolate k20
Spores/cm2
4.0×10 08
3.0×10 08
2.0×10 08
1.0×10 08
0.0
0.000 0.125 0.250 0.500 6.250 12.500
NO (% v/v)
Neem extracts
NL (mg/ml)
Diameter (cm)
5.0×10
08
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Isolate K11
Isolate K13
Isolate k20
0.000 0.125 0.250 0.500 6.250 12.500
NO (% v/v)
NL (mg/ml)
Neem extracts
Fig.3. Effect of Neem extracts on sporulation (A) and on colony diameter (B) of
Penicillium (isolates K11, K13 and K20) on YES medium, determinated as described in
‘Materials and Methods’. Bars standard deviation for experiments carried out in 6
replicates.
Table 1. Effects of Neem extracts on Penicillium species (isolates K11, K13 and K20).
FUNGUS
K11
K13
K20
Dw (g)a
Dw –R (%)
D (mm)a
D – R (%)
S (cm2)a (x107)
S – R (%)
Sa (µm2)b
Sa-R (%)
OTAa
Dw (g)a
Dw –R (%)
D (mm)a
D – R (%)
S (cm2)a (x107)
S – R (%)
Sa (µm2)b
Sa-R (%)
OTAa
Dw (g)a
Dw –R (%)
D (mm)a
D – R (%)
S (cm2)a (x107)
S – R (%)
Sa (µm2)b
Sa-R (%)
OTAa
Controla
NO 0.125%a
0.094±0.001
7.08±0.52
1.3±0.15
10.48±0.20
+
0.098±0.001
4.06±0.08
2.8±0.14
4.73±0.23
+
0.13±0.001
3.68±0.07
4.0±0.31
11.5±0.18
+
0.079±0.001
15.95%*
3.66±0.08
48.30%**
0.7±0.04
47.24%**
NA
+
0.077±0.002
21.42%*
2.7±0.16
33.5%**
0.5±0.04
82.6%**
NA
+
0.09±0.001
30.76%*
2.56±0.02
30.43%**
0.8±0.12
80.09%**
NA
+
NEEM EXTRACTS
Neem Oil (NO)
NO 0.25%a
NO 0.5%a
0.082±0.002
12.76%*
3.56±0.20
49.71%**
2.1±0.11
0%
10.32±0.21
4.79%
+
0.069±0.002
29.59%*
2.48±0.04
39%**
0.7±0.04
75.6%**
7.23±0.19
0%
+
0.089±0.001
31.53%*
2.35±0.02
36.14%**
0.7±0.09
82.58%**
6.66±0.20
42.03%**
+
0.073±0.002
22.34%*
3.43±0.16
51.55%**
2.9±0.2
0%
NA
+
0.083±0.001
15.30%*
2.5±0.08
38.4%**
1.4±0.08
51.2%**
NA
+
0.068±0.001
47.69%*
2.25±0.05
38.85%**
4.0±0.20
0.24%
NA
+
Neem Leaf Extract (NL)
NL 6.25
NL 12.5
mg/mla
mg/mla
0.143±0.001 0.119±0.001
0%
0%
8.75±0.24
8.16±0.54
0%
0%
7,3±1.05
19.7±1.5
0%
0%
NA
10.58±0.18
2.39%
+
+
0.101±0.002
0.086±0.002
0%
12.24%
3.71±0.14
3.62±0.09
8.62%
10.8%*
11±0.17
13±0.28
0%
0%
NA
3.11±0.11
34.29%**
+
+
0.111±0.00
0.109±0.00
15.38%*
16,15%*
3.4±0.18
3.41±0.07
7.60%
7.33%
33±1.58
43±2.87
0%
0%
NA
9.14±0.13
20.45%**
+
+
Experimental details are as described in ´Materials and methods`.
Dw: dry weight; Dw-R (%): dry weight reduction %;
D: diameter; D-R (%): diameter reduction %;
S: spores number; S-R (%): spores number reduction %;
Sa: spores area; Sa-R (%): spores area reduction %;
OTA: Ochratoxin;
NA: not analysed.
R (%) were determined by: (mean control – mean treatment)/(mean control) x 100%.
a
Values, average ± standard error (n=6).
b
Values , average ± standard error (n=200).
*
Significant at p < 0.05.
**
Significant at p < 0.001.