INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS
Programa Integrado de Pós-Graduação em Biologia Tropical e Recursos
Naturais
Caracterização de locos microssatélites em duas espécies de abelhas
da região amazônica: Melipona compressipes e Melipona seminigra
(Hymenoptera: Apidae: Meliponina).
Maria de Fátima Ferreira da Costa Pinto
Manaus, Amazonas
Junho, 2007
ii
Maria de Fátima Ferreira da Costa Pinto
Caracterização de locos microssatélites em duas de abelhas espécies
da região amazônica: Melipona compressipes e Melipona seminigra
(Hymenoptera: Apidae: Meliponina).
Gislene Almeida Carvalho-Zilse
Dissertação apresentada ao PIPG-BTRN
como parte dos requisitos para obtenção
do titulo de Mestre em Ciências Biológicas
com ênfase em Genética, Conservação e
Biologia Evolutiva.
Manaus, Amazonas
Junho, 2007
iii
iv
Dedicatória
Dedico este trabalho,
A Deus;
Aos meus pais, Nelson e Vera;
Aos meus Irmãos, Nelson e Roberto;
E a todos que me incentivaram a
alcançar meus objetivos.
v
Agradecimentos
A Deus, pelo dom da vida e por ter permitido que tudo pudesse se realizar
conforme a sua vontade, sempre me iluminando e abençoando.
Aos meus pais, que com seu amor e carinho, me deram força e incentivo para
continuar realizando meus sonhos.
À minha grande orientadora Gislene Carvalho-Zilse pelos ensinamentos, pela
amizade, confiança e incentivo para continuar minha vida acadêmica.
Aos amigos Hélio Vilas-Boas e Klilton Barbosa, pelos ensinamentos, pela
amizade,
companheirismo,
pelas
brincadeiras,
por
contribuírem
para
o
desenvolvimento do trabalho, em especial na coleta dos espécimes e fotos cedidas
e por todos os bons momentos que tivemos juntos.
Ao meu grande amigo Márcio, pelo carinho, dedicação, zelo, pelas boas
comidas, boas conversas, por ser meu grande irmão.
Ao Luciano, que desde o início do mestrado foi meu amigo, confidente,
conselheiro. Agradeço pela força, incentivo, carinho, paciência, pelo amor e por
todos os inesquecíveis momentos que passamos juntos.
Ao Carlos Schneider, pela amizade, cooperação, companheirismo, troca de
informações e brincadeiras no laboratório.
Às amigas Naiara, Gisele e Rosa, por contribuírem para o desenvolvimento do
meu trabalho, pelas boas risadas no laboratório e pela amizade.
Ao Laboratório Temático de Biologia Molecular, em especial a Jaqueline Batista
e Kyara Formiga, por conceder apoio logístico e reagentes para a realização deste
trabalho.
Ao Professor Spartaco Astolfi Filho, por contribuir com este trabalho,
emprestando a cuba de eletroforese vertical.
Aos amigos Raimundo, Áureo, Stella e Tatiana pelos bons momentos, carinho e
amizade durante esses dois anos.
A Luzia e Terezinha, pelo cafezinho toda manhã, amizade e brincadeiras no
laboratório.
Ao Nelson Zilse, pela ajuda com fotos e computadores.
Ao Jonilson, Jamil, Adilson, Francisco por contribuírem com meu trabalho, em
especial nas coletas dos espécimes.
vi
Aos meliponicultores Valtino, Adilson, Francisco, Candango, João Bentes,
Paulo, Lobato, Itamar, Neuzilena, Paulinho, por cederem amostras de abelhas para
realização do trabalho.
Aos professores Vera Scarpassa, Joselita Santos, Alexander Sibayev, Ana
Waldschmidt e Tomas Hrbek pelas correções e sugestões feitas em meu plano de
trabalho.
Aos membros da banca julgadora do trabalho Drs. Ana Bonetti, Charles Roland
Clement, Maria Cristina Arias, Marco Antonio Del Lama e Lúcio Antonio de Oliveira
Campos.
Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, em especial ao Programa de
Genética, Conservação e Biologia Evolutiva, pelo apoio logístico e financeiro e pela
oportunidade de estudar, trabalhar e contribuir para a conservação desta magnífica
floresta.
Às agencias financiadoras FAPEAM, CNPq (bolsa de mestrado), SUFRAMA,
ProVárzea, INPA-LTBM e Acelera Amazônia pelo auxílio financeiro dos projetos que
deram suporte à realização deste trabalho.
A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste
trabalho.
vii
Resumo
As abelhas sem ferrão, além de serem as principais responsáveis pela
polinização da flora nativa, têm uma grande importância como fonte de renda para
muitas famílias ribeirinhas do Amazonas. A exploração extrativista das abelhas
jupará (Melipona compressipes) e jandaíra (M. seminigra) no estado vêm se
desenvolvendo há décadas sem nenhum plano de manejo e conservação para
populações naturais ou de cativeiro. A necessidade de conservação, manejo e
recuperação de populações degradadas requer uma abordagem que envolva não
somente aspectos demográficos e ecológicos, mas também a genética de
populações. O enfoque genético, pela caracterização da estrutura genética e do
tamanho efetivo, em populações com diferentes níveis de intervenção antrópica,
constitui uma ferramenta adequada para ser utilizada neste tipo de estudo. Visando
traçar planos de conservação e desenvolvimento sustentável, este trabalho objetivou
caracterizar locos microssatélites em M. compressipes e M. seminigra, analisar a
distribuição e as freqüências alélicas destes locos para ambas as espécies e
comparar a variabilidade genética entre colméias naturais e manejadas em
diferentes localidades dos municípios do Amazonas. Para caracterização dos locos,
foram amostradas 13 colméias (5 operárias/colméia) de M. compressipes nos
municípios de Jutaí, Manaus, Urucará e Parintins; e 18 colméias (5
operárias/colméia) de M. seminigra nos municípios de Alvarães, Manaus, Cacau
Pirera, Careiro Castanho e Urucará. Para comparação entre colméias naturais e
manejadas, foram amostradas 54 colméias (27 naturais e 27 manejadas) de M.
compressipes (2 indivíduos/colméia) e 18 (10 manejadas e 8 naturais) de M.
seminigra (5 indivíduos/colônia). Utilizando primers microssatélites heterólogos
desenvolvidos para M. bicolor, foram amplificados cinco locos em M. compressipes,
e quatro em M. seminigra. M. compressipes apresentou um total de 20 alelos
diferentes, variando entre três a sete alelos/loco enquanto M. seminigra teve 19
alelos variando entre quatro a seis alelos/loco. As freqüências e distribuição dos
alelos variaram tanto em nível inter quanto intracolonial para ambas as espécies,
com M. compressipes apresentando maiores índices de heterozigosidade observada
que M. seminigra. Percebeu-se uma clara hierarquia de variação genética: entre
localidades, dentro da localidade e dentro da colméia. Ou seja, as colméias
amostradas em uma mesma localidade apresentaram menor diversidade de alelos
que colméias amostradas em diferentes localidades. A curta distância de dispersão e
a presença de alelos exclusivos nas diferentes localidades, indicando um fluxo
gênico restrito, sugerem que esteja ocorrendo uma estruturação genética em ambas
as espécies no estado do Amazonas. M. compressipes apresentou um maior
diversidade genética nas colméias manejadas que nas colméias naturais, o que
pode ser reflexo de uma manipulação mais intensa das colméias por conta da troca
de caixas e rainhas entre os meliponicultores no estado do Amazonas, aumentando
a probabilidade de recombinações genotípicas e a heterozigosidade nas diferentes
colméias. Em M. seminigra, ambos os tipos de colméias apresentaram índices de
diversidade genética similares, indicando que a meliponicultura ainda tem pouca
influencia na genética desta espécie no Amazonas. Considera-se, no entanto, que a
exploração de seus recursos e as ações antrópicas (desmatamento, queimadas,
dentre outras) ainda têm pouca influencia sobre as colméias de meliponíneos
analisadas apesar de algumas colméias de M. seminigra apresentarem deficiência
de heterozigotos que pode ser reflexo do pequeno número de amostras ou da
presença de alelos nulos.
viii
Abstract
Stingless bees, besides be main pollinators of the forest, have a great importance as
source of income for many families in the Amazon. The exploration of stingless bees
jupará (Melipona compressipes) and jandaíra (M. seminigra) comes developing
without plan of handling and conservation for the species for decades. The necessity
of conservation, handling and recovery of degraded populations requires a boarding
that not only involves demographic and ecological aspects, but also the genetics
populations. The genetic approach, through the characterization of the genetic
structure in populations with different levels of intervention, constitutes a tool to be
used in this type of study. To make a characterization of microsatellites loci and view
allelic distribution and frequency of M. compressipes and M. seminigra in Amazon,
we collect workers 13 colonies (5 workers/colony) of M. compressipes in Jutaí,
Manaus, Urucará e Parintins; and 18 colonies (5 workers/colony) of M. seminigra in
Alvarães, Manaus, Cacau Pirera, Careiro Castanho e Urucará. To compare the
genetic divergence in natural and manipulated colonies, we collect 54 (27 naturals e
27 manipulated) of M. compressipes (2 workers/colony) and 18 (10 naturals e 8
manipulated) of M. seminigra (5 workers/colony). Using heterospecific primers
originally designed for Melipona bicolor, five loci had been amplified in M.
compressipes and four in M. seminigra. M. compressipes present 20 different alleles
(3 to 7 alleles/locus) and M. seminigra had 19 alleles ( 4 to 6 alleles/locus). The
frequencies and allele distribution varied among and within localities in both species,
with M. compressipes presenting higher observed heterozygosity that M. seminigra.
Both the species had presented greater intralocality genetic difference that
interlocality. Short dispersion distance and the presence of exclusive alleles in the
different localities, shows a restricted gene flow, suggest that a genetic structuration
can being occur in the Amazonas. M. compressipes presented greater genetic
variability in manipulated that natural colonies. It can be reflect of exchange of
genetic material (colonies) among beekeepers. However, in M. seminigra both the
types of beehives had presented similar genetic diversity, indicating that the
meliponiculture still has little influences in the genetics of this species. We
considered that resources exploration and antropic actions still have little influence on
the analyzed species, although some beehives of M. seminigra to present
heterozygous deficiency that can be reflected of the small number of samples
or the presence of null alleles.
ix
Sumário
Dedicatória ________________________________________________________ iv
Agradecimentos _____________________________________________________ v
Resumo __________________________________________________________ vii
Abstract _________________________________________________________ viii
Sumário __________________________________________________________ ix
Lista de Tabelas _____________________________________________________ x
Lista de Figuras ____________________________________________________ xi
1. Introdução______________________________________________________ 12
1.1 Caracterização das espécies ______________________________________ 14
14
1.1.2 Melipona seminigra ______________________________________________________ 16
1.1.1 Melipona compressipes __________________________________________________
1.2 Marcadores moleculares__________________________________________ 18
1.2.1 Microssatélites _______________________________________________
18
1.2.2 Estudos com microssatélites em abelhas ______________________________ 20
1.3 Estudos genético-populacionais e a conservação dos meliponíneos na Amazônia _ 22
2. Objetivo _______________________________________________________ 24
2.1 Objetivo geral _________________________________________________ 24
2.2 Objetivos específicos ____________________________________________ 24
3. Material e métodos _______________________________________________ 25
3.1 Coleta do material biológico ____________________________________________ 25
3.2 Extração de DNA _______________________________________________ 28
3.3 Amplificação dos locos microssatélites________________________________ 28
3.4 Análise de polimorfismo de DNA em regiões microssatélites ________________ 30
4. Resultados e discussão ___________________________________________ 31
4.1 Melipona compressipes __________________________________________ 36
4.2 Melipona seminigra _____________________________________________ 41
4.3 Comparação entre as espécies _____________________________________ 46
5. Conclusões _____________________________________________________ 49
6. Referências Bibliográficas _________________________________________ 50
7. Anexos ________________________________________________________ 59
Anexo A – Distancias geográficas entre localidades amostradas ________________ 59
Anexo B – Coordenadas geográficas das localidades amostradas _______________ 62
x
Lista de Tabelas
Tabela 1. Localização dos pontos de coleta dos espécimes de Melipona
compressipes e Melipona seminigra, o tipo de colméia e a quantidade de
ninhos amostrados para caracterização de locos microssatélites.
27
Tabela 2. Origem e seqüência dos primers testados para amplificação em
Melipona compressipes e Melipona seminigra.
29
Tabela 3 - Concentrações dos reagentes da PCR para amplificação de
locos microssatélites em Melipona compressipes e Melipona seminigra.
32
Tabela 4 - Temperaturas ótimas de anelamento dos primers heterólogos na
amplificação de DNA de Melipona compressipes e Melipona seminigra.
33
Tabela 5 - Número (N) e tamanho dos alelos em pares de bases (A)
amplificados em Melipona compressipes e M. seminigra e suas respectivas
heterozigosidades observadas (Ho) por loco comparadas a M. bicolor
(espécie de origem dos primers).
35
Tabela 6 - Tamanho de alelos em pares de bases (A) e freqüências alélicas
(Fa) nos locos analisados em todas as colméias de Melipona compressipes
no estado do Amazonas.
37
Tabela 7 - Heterozigosidade observada por loco microssatélite em
Melipona compressipes em cada localidade analisada no estado do
Amazonas.
38
Tabela 8 - Diversidade genética (valores médios), baseada no número de
diferentes alelo/loco e número de locos polomórficos microssatélites
encontrados nas localidades amostradas de Melipona compressipes (Mc) e
Melipona seminigra (Ms) no estado do Amazonas.
40
Tabela 9 – Tamanho de alelos em pares de base (A) e freqüências alélicas
(Fa) nos locos analisados em todas as colméias de Melipona seminigra no
estado do Amazonas.
43
Tabela 10 - Heterozigosidade observada por loco microssatélite em
Melipona seminigra nas localidades amostradas.
44
Tabela 11 - Heterozigosidade observada (Ho) e número de alelos (N) em
diferentes espécies de abelhas sem ferrão utilizando os mesmos primers
desenvolvidos para Melipona bicolor.
45
Tabela 12 - Distância geográficas (em Kilômetros) entre os pontos de
coleta de amostras das populações de Melipona compressipes no estado
do Amazonas.
Tabela 13 - Distâncias geográficas (em Kilometros) entre os pontos de
coleta de amostras das populações de Melipona seminigra nas localdiades
do estado do Amazonas.
59
60
xi
Lista de Figuras
Figura 1. Ninho de Melipona compressipes alojado em caixa de madeira.
15
Figura 2. Entrada característica do ninho de Melipona compressipes, com
operárias guardas.
15
Figura 3. Entrada característica do ninho de Melipona seminigra em caixa
de criação racional, com operárias guardas.
17
Figura 4. Vista interna de colméia de Melipona seminigra alojada em caixa
de criação racional.
17
Figura 5. Localização geográfica dos Municípios do Amazonas onde
foram coletadas as amostras de Melipona compressipes (1, 3, 6, 7) e
Melipona seminigra (2, 3, 4, 5, 6). 1 – Jutaí, 2 - Alvarães, 3 - Manaus, 4 Cacau Pirera, 5 - Careiro Castanho, 6 - Urucará, 7- Parintins.
25
Figura 6. Perfil de amplificação em gel de agarose 2% do loco Mbi 13 em
Melipona compressipes. M – Marcador de peso molecular de 100 pb; 1 a
8 – amostras de colméias de Candango (Parintins-AM).
32
Figura 7. Gel de poliacrilamida 10% indicando padrão de bandas (alelos)
dos produtos da PCR do loco Mbi 36 para Melipona compressipes. M –
marcador de 10pb. 1 a 10: amostras de colméias de Lobato (UrucaráAM).
Figura 8. Gel de poliacrilamida 10% mostrando polimorfismo intra e
intercolonial a partir da amplificação do loco Mbi 13 em Melipona
compressipes. 1 a 4: Candango (Parintins); 5 a 9: Bentes (Parintins); 10 a
14: Resex (Jutaí); 15 a 19: Klilton (Manaus). M – marcador de 10pb.
Figura 9. Gel de poliacrilamida 10% evidenciando o monomorfismo do
loco Mbi 28 , em Melipona compressipes. M - marcador de 10pb. 1 a 7:
amostras Klilton (Manaus).
Figura 10. Localidades amostradas para Melipona compressipes no
Município de Jutaí, no estado do Amazonas.
Figura 11. Localdiades amostradas para Melipona compressipes (Mc) e
Melipona seminigra (Ms) nos Municípios de Manaus (pontos 1 a 4) e
Cacau Pirera (ponto 5) no estado do Amazonas.
33
38
39
62
63
Figura 12.Localidades amostradas para Melipona seminigra no Município
de Careiro Castanho.
64
Figura 13. Localidades amostradas para Melipona compressipes e
Melipona seminigra no Município de Urucará.
65
Figura 14. Localidades amostradas para M. compressipes no Município
de Parintins.
66
12
1. Introdução
Há diversas razões para estudar e criar abelhas sem ferrão: são as principais
responsáveis pela polinização da flora nativa, conforme o ecossistema; das 300
espécies de meliponíneos, mais de 100 estão em perigo de extinção (Kerr, 2002b);
auxiliam diretamente nos programas de reflorestamento e de melhoria do pasto
apícola; contribuem para melhores rendimentos da fruta e de semente (ImperatrizFonseca et al., 2006); representam uma importante fonte de renda para o produtor
de pequeno porte, não só com a venda do mel, mas também com a reprodução e
venda de colméias (Carvalho et al., 2003) e podem ser utilizadas em programas de
educação ambiental (Kerr et al., 1996).
Com uma flora rica em espécies fornecedoras de néctar, pólen e resina e com
boa florada distribuída ao longo de quase todo o ano, a Amazônia é considerada a
área de maior potencial do planeta para a produção de mel, pólen e criação de
meliponíneos (Oliveira e Kerr, 2000). Nesta região, há um grande número de
espécies nativas de abelhas sem ferrão, que podem ser manejadas racionalmente,
contribuindo para o emprego de mão de obra familiar, uma vez que seus produtos
têm crescente espaço no mercado interno e externo. Sendo as abelhas sem ferrão
constituintes essenciais na manutenção da biodiversidade da floresta tropical da
Amazônia
como
agentes
polinizadores,
há
uma
grande
necessidade
de
implementação de projetos que visem a conservação dessas espécies em seu
habitat natural (Imperatriz-Fonseca et al., 2005).
As abelhas, assim como formigas e vespas, que pertencem à ordem
Hymenoptera, apresentam diversidade genética menor do que a maioria dos outros
insetos por serem organismos haplodiplóides (Graur, 1985; Pamilo e Crozier, 1981;
Pamilo et al., 1978; Shoemaker et al., 1992), onde os machos desenvolvem-se a
partir de ovos não fertilizados (indivíduos haplóides) e as fêmeas desenvolvem-se a
partir de ovos fertilizados (indivíduos diplóides). Os alelos em genomas haplóides
estão sujeitos a um maior nível de seleção, similar àqueles ligados aos alelos do
cromossomo X em outros organismos diplóides. O pequeno tamanho efetivo da
população resultante da haplodiploidia pode, também, conduzir à baixa variação
genética (Carvalho, 2001). Lu e Rank (1996) consideram que a estabilidade
ambiental conferida pelo microhabitat do ninho também pode ser a causa da baixa
variabilidade genética. Essa menor diversidade pode ter implicações na conservação
13
biológica, pois torna estes organismos mais sensíveis a perturbações ambientais
(Lasalle e Gauld, 1993).
Outro grande problema enfrentado por esses insetos é o desmatamento.
Embora a destruição de “habitats” ocorra em nível global, ambientes tropicais estão
sendo, particularmente, devastados devido à expansão da agropecuária, exploração
de madeira e as queimadas que ocasionam uma redução na disponibilidade de
alimento e de local para nidificação, além da destruição direta dos ninhos. Erwin
(1998) estimou que a Terra perde uma área de floresta tropical úmida do tamanho
de Honduras todo ano.
Entretanto, preservar remanescentes de “habitats” (em
parques e reservas) não implica que todas as espécies nativas sobreviverão, já que
a redução de 90% de um “habitat” poderá significar perda, em média, de 50% das
espécies que nele habitam (Lasalle e Gauld, 1993).
No Brasil, grande número de representantes de abelhas pertence à família
Apidae, subfamília Apinae, tribo Apini cuja subtribo Meliponina, com 192 espécies de
abelhas, apresenta com grande variação na preferência floral entre as espécies,
sendo essenciais para a manutenção da flora original (Silveira et al., 2002). De 30%
das espécies vegetais da caatinga e pantanal, até 90% em algumas manchas da
Mata Atlântica (Serra do Mar no Espírito Santo) e algumas partes da Amazônia,
necessitam dos meliponíneos para a polinização e frutificação (Kerr, 1997). As
abelhas dessa subtribo, denominadas vulgarmente meliponíneos, se diferenciam
das outras por características particulares como: atrofia de ferrão, redução e
fragilidade de venação e pela ausência de pêlos nos olhos, com exceção da
Trichotrigona extranea (Moure; 1961; Michener, 1990). Os meliponíneos possuem
distribuição Pantropical, com maior diversidade de formas nas regiões Neotropical
(principalmente na região da bacia Amazônica) e Indo-Malaia (Michener, 1990;
Camargo e Pedro, 1992).
O conhecimento e exploração dos produtos das abelhas sem ferrão são muito
antigos, tendo registros dessa prática desde os Maias. No Brasil, a prática começou
com os índios e, mais tarde, com os caboclos do nordeste brasileiro, sendo este, o
berço das duas espécies de meliponíneos primeiramente cultivadas no país:
Melipona compressipes fasciculata Smith, 1854 e Melipona scutellaris Latreille, 1811
(Kerr, 1996).
Dentre os meliponíneos, podemos destacar as abelhas do gênero Melipona,
que sendo abelhas sociais, têm divisão de tarefas bem definida. A rainha fecundada:
14
responsável pela postura dos ovos; as operárias: realizam a maioria dos trabalhos
dentro de uma colônia, desde a limpeza, ventilação, cuidado com as cria, defesa,
forrageamento, desidratação de néctar e, eventualmente, postura de óvulos que
originarão machos; e os machos: fecundam a rainha e realizam pequenas tarefas
em algumas espécies (Bustamante, 2006).
Assim como a maioria dos meliponíneos, as espécies do gênero Melipona
fazem seus ninhos, principalmente, em ocos de árvores velhas, podendo também
nidificar em cipós, bambus, ninhos de aves e formigas e no solo. Cada colônia é
composta de um conjunto de favos de cria dispostos em placas horizontais,
separados por pilastras de cera e protegidos por um invólucro. Os alimentos (pólen e
mel) são armazenados em potes de cera e as margens superior e inferior do ninho
são delimitadas com batume (barro e resina) (Kerr, 1996).
Duas espécies de meliponíneos, Melipona compressipes e Melipona
seminigra, se destacam na Amazônia Central por terem grande importância
ecológica como polinizadoras e dispersoras de sementes (Bacelar-Lima et al., 2006),
terem seus produtos (mel e pólen) utilizados na alimentação e na medicina popular e
ainda serem vendidos para complementação da renda familiar (Carvalho-Zilse,
2006).
Estas espécies vêm sendo criadas em cativeiro dentro de caixas de madeira
com dimensões específicas e técnicas adequadas. Esta atividade foi denominada
meliponicultura por Paulo Nogueira Neto em 1953, para diferenciar a criação racional
de abelhas sem ferrão do manejo extrativista e artesanal (Nogueira-Neto, 1997).
1.1 Caracterização das espécies
1.1.1 Melipona compressipes
A espécie Melipona compressipes se destaca por ter sido, juntamente com
a Melipona scutellaris, a primeira a ser criada para produção de mel no Brasil. Esta
espécie tem uma ampla distribuição geográfica, ocorrendo desde o Panamá até o
estado do Maranhão (Kerr, 1996). Na Amazônia, M. compressipes é conhecida
popularmente como jupará ou jandaíra preta da Amazônia, podendo ser encontrada
desde Manaus, subindo o rio Branco até a Guiana Inglesa (Peralta et al., 1999). A
15
colônia dessa espécie é constituída, em média, por 5000 operárias, 250 machos e
uma rainha (Figura 1). As operárias medem cerca de 1,3 cm e são pouco
defensivas. A entrada do ninho desta espécie é feita de resina misturada com barro
endurecido de cor esbranquiçada (Kerr, 2002a) (Figura 2). Carvalho-Zilse (2006)
estima uma produtividade de 1 litro/colméia/ano em colméias racionais de M.
Foto de Nelson Zilse.
compressipes na região da Amazônia central.
Foto de Hélio C. Vilas
Figura 1. Ninho de Melipona compressipes alojado em caixa de madeira.
Figura 2. Entrada característica do ninho de Melipona compressipes, com operárias guardas.
16
Dentre as flores que geralmente atraem as campeiras de M. compressipes,
destacam-se
as
Myrtaceae
(maçãs,
Pitanga,
Goiaba),
Arecaceae
(côco),
Anacardiaceae (Tapirira), Caesalpiniaceae (Chuva de ouro), Euphorbiaceae (Mabea
sp.), Dilleniaceae (Doliocarpus sp.), Cochlospermaceae (Cochlorpermum sp.),
Fabaceae
(Jacarandá),
Lamiaceae
(Hyptes
sp.),
Lythraceae
(Murici),
Melastomataceae (Miconia myrianthera, Bellucoa grossularicides), Mimosaceae
(Ingá), Solanaceae (Solanum caavurana, S. juripeba), Cassia sp., Genipa
americana, Morus sp., Tapirira guianensis, Zanthoxylum sp., Thysodium sp.,
Stryphnodendron guianense, Psidium sp., Spondias mombin (Marques-Souza, 1996;
Marques-Souza et al., 2002).
1.1.2 Melipona seminigra
No Estado do Amazonas, a M. seminigra Cockerell, 1919 pode ser
encontrada desde Paricatuba (no baixo Purus), ao oeste até a região dos rios
Camanaú e Curiaú; na região de Manaus; e ao norte ao longo do rio Negro – porém
os limites não são conhecidos (Peralta et al., 1999).
Esta espécie faz a entrada do seu ninho em forma de trombeta radiada e
curta, dando uma característica bem peculiar à espécie, sendo conhecida
popularmente como uruçú-boca-de-renda ou jandaíra (Portugal-Araújo, 1978;
Peralta et al., 1999) (Figuras 3 e 4).
O número de indivíduos presentes na colônia é de, aproximadamente, 1300
indivíduos adultos, são pouco agressivas, produzem mel de ótima qualidade e
podem produzir até 3 litros mel/colméia/ano (Portugal-Araújo, 1978; Carvalho-Zilse,
2006).
Estudos apontam a M. seminigra como potencial polinizadora de várias
espécies vegetais, tais como tarumã (Vitex cymosa - Verbenaceae), Mouriria ulei
(Melastomataceae), Aparisthmium cordatum, Bellucia grossularioides, Cassia
grandis, Cecropia sp., Leucaena sp., Matayba sp., Miconia myrianthera, Myrcia
amazonica, Tapirira guianensis, Stryphnodendron guianensei, dentre outras
(Portugal-Araújo, 1978; Marques-Souza et al., 2002).
Foto de Hélio C. Vilas
Foto de Nelson Zilse.
Foto de Hélio C. Vilas
17
Foto de Victor Paolineli. Paolineti
Figura 3. Entrada característica do ninho de Melipona seminigra em caixa de criação
racional, com operárias guardas.
Figura 4. Vista interna de colméia de Melipona seminigra alojada em caixa de criação
racional.
Por ser uma espécie muito produtiva, é muito procurada por meleiros
(extrativistas) e pode ser eliminada rapidamente de nossa floresta. Segundo Kerr
(2002a), esta espécie é classificada como presumivelmente ameaçada de extinção,
merecendo atenção conservacionista, sendo a criação em cativeiro uma boa
estratégia para sua preservação.
18
1.2 Marcadores moleculares
Aspectos biológicos e morfológicos de muitas espécies de abelhas sociais
são conhecidos, entretanto, estudos sobre a organização de seu genoma foram
iniciados recentemente. Estudos filogenéticos, evolutivos e ecológicos, assim como
a citogenética, a bioquímica, a morfologia e, mais recentemente, a análise de DNA
constituem ferramentas de grande importância para o conhecimento biológico e
populacional das espécies (Waldschmidt, 1999).
Segundo Avise (1994) e Silva e Russo (2000), marcadores moleculares são
locos gênicos que apresentam variabilidade e podem ser utilizados para detectar
diferenças entre dois ou mais indivíduos, duas ou mais populações. Eles apresentam
altos níveis de polimorfismo, geralmente são marcadores neutros em relação a
efeitos fenotípicos e, na maioria das vezes, são co-dominantes, contendo maior
quantidade de informação genética por loco (Ferreira e Grattapaglia, 1998).
Entre os diversos marcadores genéticos existentes, os marcadores
microssatélites vêm sendo apontados como a classe de marcadores mais
informativa em estimativas de parâmetros genético-populacionais (Gao et al., 2002;
Conte, 2004).
1.2.1 Microssatélites
Os SSR (Simple Sequence Repeats), como também são conhecidos os
microssatélites, foram descobertos na década de 80 no genoma de eucariotos e,
mais recentemente, em genomas de procariotos, embora com menor freqüência.
São regiões constituídas por pequenas seqüências com 1 a 6 nucleotídeos de
comprimento repetidas consecutivamente (in tandem), raramente excedem 200
pares de base no comprimento total, estão distribuídas ao acaso no genoma e
possuem expressão co-dominante, isto é, ambos os alelos de um indivíduo
heterozigoto são visualizados em geral, apresentando níveis mais altos de
heterozigosidade que outros marcadores moleculares (Li et al., 2004).
Os SSRs são marcadores multialélicos, onde cada loco apresenta muitos
alelos, sendo considerados a classe mais polimórfica de marcadores moleculares
19
disponíveis hoje. Isso porque a taxa de mutação é mais freqüente em regiões de
DNA repetitivo do que em outras regiões, sendo, também, mais alta quando
comparada com a taxa de mutação pontual estimada em 10-9 a 10-10 (Goldstein e
Schlötterer, 1999). Tanto a taxa de mutação de SSR como o padrão de distribuição
deles diferem entre as espécies. Em Escherichia coli estima-se que a taxa de
mutação de microssatélites esteja em torno de 10-2 eventos/loco/replicação
(Levinson e Gutman, 1987), em leveduras essa taxa está entre 10-4 e 10-5
(Henderson
e
Petes,
1992),
em
humanos,
foi
sugerida
como
10-3
eventos/loco/geração (Weber e Wong, 1993) e em Drosophila, este valor é
relativamente baixo (se comparado com outras espécies), sendo 6x10-6 (Schung et
al., 1997).
Existem três hipóteses para explicar essa característica de muitos locos com
grande quantidade de alelos: 1. Elementos de transposição - que são seqüências
repetitivas dispersas no genoma cuja função é fazer cópias de si e reinseri-las no
genoma em posições aleatórias, como por exemplo, em uma região adjacente a ele
no genoma, formando um novo alelo com quantidade de repetições diferente (Nadir
et al., 1996); 2. Crossing-over desigual - no qual ocorre erro no emparelhamento
entre cromossomos homólogos causado pela grande quantidade de repetições,
cujas cromátides erradamente emparelhadas causarão alterações no número de
repetições de microssatélites em cada cromossomo. Essa hipótese justifica
variações muito grandes no tamanho dos microssatélites (Smith, 1976); 3. Slipped strand mispairing – um erro de pareamento causando um “escorregão” da DNA
polimerase da fita molde durante a replicação, que acaba por deixar de incorporar
“repeats” ou adicionar novos “repeats”, formando uma nova fita de DNA com
quantidade de repetições diferente da fita molde. Essa hipótese é a mais aceita pelo
fato de explicar o surgimento de variações pequenas no número de repetições entre
os diferentes alelos dentro do loco, o que é mais encontrado em regiões
microssatélites (Streisinger et al., 1966; Oliveira et al., 2006).
Os marcadores microssatélites apresentam vantagens tais como possuir o
mais elevado conteúdo de informação de polimorfismo, podendo ser utilizados para
estudos de ligação e mapeamento genético em toda e qualquer população
segregante; ser abundante e encontrado aleatoriamente, o que permite a mais
completa cobertura do genoma em eucariotos; permite a transferibilidade de primers
heteroespecíficos para amplificação de regiões SSR em espécies do mesmo gênero
20
ou de gêneros diferentes, uma vez que foi observada a conservação de sítios de
microssatélites entre espécies relacionadas (Ferreira e Grattapaglia, 1998).
1.2.2 Estudos com microssatélites em abelhas
Assim como em muitos organismos, microssatélites vem se mostrando
ótimos marcadores em estudos genéticos de populações de insetos como abelhas,
mosquitos, borboletas (Loxdale e Lushai, 1998). Vários marcadores microssatélites
foram desenvolvidos para este grupo, o que tem permitido a realização de estudos
de estrutura de populações, diversidade genética, teste de paternidade.
Os estudos genéticos em abelhas com marcadores microssatélites foram
iniciados com Estoup et al. (1993, 1995a 1995b) que desenvolveram vários primers
microssatélites para Apis mellifera e mamangava (Bombus terrestris). Nestes
estudos, os resultados apontaram os microssatélites dinucleotídeos (CT)n como os
mais comuns no grupo das abelhas, diferentemente dos dípteros que apresentam o
dinucleotídeo (GT)n como motifs mais comuns no grupo (Estoup et al., 1993;
Bonizzoni et al., 2000).
Em 1997, mais 18 primers microssatélites foram desenvolvidos para Apis
mellifera, dos quais sete se mostraram polimórficos (Rowe et al.,1997).
O gênero Apis tem sido bastante estudado por meio desses marcadores.
Estoup et al. (1995b) encontram de 7 a 30 alelos em 12 locos SSR, analisando 9
populações (um indivíduo por colônia) com sete subespécies diferentes. Neste
estudo, os autores observaram que as populações de abelhas africanas
apresentaram mais heterozigotos que as européias e sugeriam ausência de ligação
física entre os locos analisados.
De la Rúa et al. (2004) analisando 48 colônias (1 indivíduo / colônia) de
Apis mellifera iberica em 24 localidades, observaram alta diversidade genética e
desequilíbrio de Hardy-Weinberg (H-WE) nos seis locos SSR analisados e uma
grande afinidade genética entre as colônias provenientes do Norte e Oeste da África.
Os autores atribuíram tais resultados à forte manipulação dessas abelhas por parte
dos apicultores, com multiplicações sucessivas e introdução de rainhas e machos
em colônias recém formadas.
21
Em Apis dorsata foi encontrada alta diferenciação genética entre as
diferentes regiões da Tailândia (região norte-centro, Tailândia peninsular e Ilha
Samui) e altos níveis de diversidade molecular para esta espécie nesta região (Ho=
0,68 – 0,74), baseado em 3 locos SSR comparando 154 colônias (1 indivíduo /
colônia) (Insuan et al., 2007).
Os primeiros 25 primers microssatélites específicos para o gênero Melipona
foram desenhados por Peters et al. (1998) para a espécie M. bicolor. Destes, 18
locos se mostraram polimórficos para esta espécie.
Utilizando esses primers, Paxton et al. (1999) derrubaram a teoria de
monandria no grupo dos meliponíneos. A análise de sete locos microssatélites,
evidenciaram freqüências de acasalamento com um a três machos para Melipona
beecheii e de um a seis machos para Scaptotrigona postica, demonstrando
poliandria no grupo dos meliponíneos. Soares (2001), analisando 7 locos,
corroborou a poliandria também em M. scutellaris, evidenciando que mais de um
macho se acasala com a rainha nesta espécie.
Carvalho-Zilse e Kerr (2006) otimizaram a amplificação em M. scutellaris de
10 locos microssatélites desenvolvidos para M. bicolor, sendo sete usados para a
análise genética. A partir deles foi observada uma boa frequência de heterozigotos,
refletindo o comportamento de migração a curtas distâncias nesta espécie.
Francisco (2002), a partir de sete locos polimorficos para M. bicolor e S.
postica analisou 72 colônias (1 individuo / colônia), identificando uma moderada
estruturação genética em Plebeia remota (Fst=0,239) entre as populações de Cunha
(SP) e Prudentópolis (PR), sugerindo unidades evolutivas independentes.
Shao et al. (2004), analisando populações de Bombus ignitus provenientes
da China, Coréia do Sul e Japão, por meio de microssatélites, encontraram uma
variação intrapopulacional muito maior que entre as populações, mostrando
homogeneização gênica entre as diferentes populações, talvez pela alta capacidade
de migração desta espécie a longas distâncias.
Brito (2005), analisando 58 indivíduos (1 individuo / colônia) com nove locos
microssatélites, revelou baixa variabilidade genética e uma moderada estruturação
populacional em Partamona helleri e em P. mulata não relacionado com distribuição
geográfica. A autora sugere que estes resultados sejam conseqüência da migração
de machos entre populações, ou por isolamento recente das populações pela
fragmentação de habitat devido a rápida degradação do cerrado e Mata Atlântica, ou
22
por alelos nulos causados pelo uso de primers heteroespecíficos. Neste mesmo
estudo, Brito sugeriu monandria em P. mulata e poliandria em P. helleri.
1.3 Estudos genético-populacionais e a conservação dos meliponíneos na
Amazônia
Tanto o extrativismo indiscriminado em colméias de meliponíneos praticado
há muitos anos por toda a Amazônia, como o desmatamento, a destruição de locais
de nidificação, a ação dos meleiros que apenas retiram o mel e jogam fora o resto da
colméia e o uso de inseticida em áreas agrícolas próximas à floresta vem fazendo
com que haja diminuição no número de populações de abelhas sem ferrão na região
(Kerr et al., 2001).
Brown e Albrecht (2001), fizeram um estudo em Rondônia (no Sudeste da
bacia Amazônica) para saber se o desmatamento afeta a incidência de melíponas
na floresta Amazônica. Estudando sete espécies de melíponas, os autores
revelaram que a riqueza e a abundância dos meliponíneos está diretamente
relacionada com a área de cobertura vegetal e inversamente proporcional ao
tamanho da área desmatada.
O pequeno número de colméias nas florestas e em meliponários contribuem
significativamente para a extinção de populações de abelhas, uma vez que as
rainhas de meliponíneos se acasalam com um ou poucos machos e têm seu sistema
complementar de determinação sexual baseado no gene csd (Complementary Sex
Determiner). Quando, na população, decresce o número de alelos, há excesso de
nascimento de machos que são homozigotos para este loco, os quais são estéreis e
são eliminados pelas operárias que, também, podem matar a rainha fecundada,
levando a colônia à morte. Esse fato evidencia a necessidade da manutenção de
uma quantidade mínima de 44 colméias em populações naturais e em meliponários,
assim como a introdução de rainhas inseminadas em colméias órfãs para que possa
ser mantida a variabilidade genética dos alelos do gene csd nas populações e evitar
o nascimento dos machos diplóides (Kerr e Vencovisky, 1982; Carvalho, 2001).
Essa característica peculiar dos meliponíneos, aliada às ações antrópicas
causam alterações das freqüências alélicas e da variabilidade genética dentro e
entre populações, conseqüentemente, afetando a estrutura das populações, o que
23
pode levar ao desaparecimento destas espécies em poucas gerações (Carvalho,
2001).
A necessidade de conservação, manejo e recuperação de populações
degradadas requerem uma abordagem que envolva não somente aspectos
demográficos e ecológicos, mas também a genética de populações. O enfoque
genético, pela caracterização da estrutura genética e do tamanho efetivo, em
populações com diferentes níveis de intervenção antrópica, constitui uma
abordagem adequada para ser utilizada neste tipo de estudo (Kageyama, 1987;
Moran et al., 1989; Hall et al., 1996 e Nason e Hamrick, 1997).
Um estudo feito por Moyle et al. (2003) nos Estados Unidos, mostrou que o
grupo dos invertebrados é muito pouco estudado tanto geneticamente quanto
demograficamente, sugerindo uma particular necessidade de mais pesquisas
básicas, sendo este o caso das abelhas nativas sem ferrão, incluindo as espécies
Melipona compressipes e Melipona seminigra.
24
2. Objetivo
2.1 Objetivo geral
Caracterizar locos microssatélites nas espécies de abelhas sem ferrão
Melipona compressipes e Melipona seminigra do estado do Amazonas.
2.2 Objetivos específicos
- Otimizar a amplificação de primers microssatélites desenvolvidos para
M. bicolor e Apis mellifera em M. compressipes e M. seminigra;
-
Caracterizar os locos microssatélites quanto ao número de alelos,
número de locos polimórficos e heterozigosidade observada e esperada nas duas
espécies;
- Analisar a distribuição alélica e calcular suas freqüências em diferentes
localidades dos municípios do Amazonas: Jutaí, Alvarães, Manaus, Cacau Pirera,
Careiro Castanho, Urucará e Parintins;
- Comparar a variabilidade genética entre colméias naturais e colméias
manejadas dessas espécies.
25
3. Material e métodos
3.1 Coleta do material biológico
Para caracterização dos locos microssatélites, foram coletados cinco
indivíduos adultos (operárias) de cada colônia de M. compressipes e M. seminigra,
amostradas em 17 localidades dos Municípios do Amazonas: Jutaí, Alvarães,
Manaus, Cacau Pirera, Careiro Castanho, Urucará e Parintins (Tabela 1, Figura 5).
Fonte: www.cdbrasil.cnpm.embrapa.br
Figura 5. Localização geográfica dos Municípios do Amazonas onde foram coletadas as
amostras de Melipona compressipes (1, 3, 6, 7) e Melipona seminigra (2, 3, 4, 5, 6). 1 – Jutaí,
2 - Alvarães, 3 - Manaus, 4 - Cacau Pirera, 5 - Careiro Castanho, 6 - Urucará, 7- Parintins.
As abelhas foram coletadas com rede entomológica na entrada de ninhos,
alojados em árvores vivas ou em troncos de árvores mortas mantidas em
propriedades rurais, que não haviam sofrido nenhum tipo de manejo caracterizando
colméias naturais; e em caixas de criação racional (meliponários) cujas colméias
26
haviam recebido material genético de outras colméias por cruzamento induzido ou
troca de rainhas e discos de cria, caracterizando colméias manejadas.
As amostras de Jutaí, Cacau Pirera e Urucará foram coletadas em
propriedades particulares, cujas colméias estavam alojadas em troncos recém
tirados da mata, sem nenhum tipo de manejo. As amostras de Parintins foram
retiradas de tronco de árvore viva diretamente na mata (árvore em área de igapó) ou
de ninhos recém transferidos para caixas de criação racionais, também sem
sofrerem nenhum tipo de manejo. As amostras de Alvarães e Careiro Castanho
foram retiradas de caixas racionais em meliponários recentes, com pouca
manipulação. As amostras de Manaus (Klilton e Tarumã) foram coletadas de caixas
intensamente manipuladas (troca de rainhas com outros meliponicultores e
transporte das caixas órfãs para cruzamento da rainha virgem com machos de
outras localidades, dentro do mesmo município; além de multiplicações induzidas).
A amostra de Monte Pascoal foi proveniente de um fragmento de mata (bairro Monte
Pascoal) dentro da cidade de Manaus e a de São Geraldo, de uma caixa de criação
racional mantida há dez anos, sem manipulação, em local próximo a fragmento de
mata na cidade de Manaus.
Para análise comparativa dos índices de diversidade genética entre colméias
naturais e manejadas foram amostradas 54 colônias (27 naturais e 27 manejadas)
de M. compressipes (2 indivíduos/colônia) e 18 (10 manejadas e 8 naturais) de M.
seminigra (5 indivíduos/colônia).
As amostras de M. compressipes foram provenientes de 27 colméias
manejadas do meliponário GPA (Grupo de Pesquisas em Abelhas / INPA) em
Manaus e de 27 colméias naturais (em cortiços) em Parintins (2 de Candango, 3 de
Álvaro, 3 de Bentes, 4 de Bigode, 2 de Ademir, 2 de Nilton Cezar, 2 de Enoqui, 2 de
J. Félix, 4 do Abacateiro, 3 da Piranheira).
Para M. seminigra, as amostras de colméias manejadas foram coletadas em
Alvarães (2 colônias de Marajaí), em Manaus (2 de Klilton) e em Careiro Castanho (3
de Neuzilena, 2 de Paulinho, 1 de Panelão) e as colméias naturais vieram de
Manaus (1 de São Geraldo e 1 de Monte Pascoal), de Cacau Pirera (3 de Valtino) e
de Urucará (2 de Lobato e de 1 Paulo).
27
Tabela 1. Localização dos pontos de coleta dos espécimes de Melipona compressipes e
Melipona seminigra, o tipo de colméia e a quantidade de ninhos amostrados para
caracterização dos locos microssatélites.
Município
Jutaí
Alvarães
Manaus
Cacau Pirera
Careiro
Castanho
Urucará
Parintins
Tipo de
M. compressipes
M. seminigra
colméia
N (C)
N (C)
Nova Esperança
Natural
5 (1)
-
São Sebastião
Natural
5 (1)
-
Resex
Natural
5 (1)
-
Marajaí
Manejada
-
10 (2)
Klilton
Manejada
5 (1)
10 (2)
Tarumã
Manejada
5 (1)
-
São Geraldo
Natural
5 (1)
5 (1)
Monte Pascoal
Natural
-
5 (1)
Valtino
Natural
-
5 (3)
Neuzilena
Manejada
-
15 (3)
Paulinho
Manejada
10 (2)
Panelão
Manejada
5 (1)
Lobato
Natural
5 (1)
10 (2)
Paulo
Natural
10 (2)
5 (1)
Candango
Natural
10 (2)
-
Bentes
Natural
5 (1)
-
Piranheira
Natural
5 (1)
-
65 (13)
100 (18)
Localidade
Total de indivíduos e colônias amostradas
N = numero de indivíduos analisados por colméia;
C = número de colméias amostradas por localidade.
28
3.2 Extração de DNA
As extrações de DNA foram realizadas no Laboratório Temático de Biologia
Molecular do INPA. O DNA foi extraído segundo o protocolo usado por Carvalho
(2000), como segue:
O tórax dos adultos foi macerado, após congelamento, dentro de microtubos
de 1,5mL e adicionado 500µL de tampão SET (NaCl 0,15M; Tris 0,02M; EDTA 1mM
pH 8,0), 18µL de proteinase K e 22µL de SDS (25%), invertendo os tubos por três
vezes. As amostras foram, então, incubadas em banho maria por 2 horas a 55ºC,
agitou-se levemente a cada 30 minutos e, posteriormente à adição de 2µL de RNAse
(1µg/ µL), foram incubadas novamente a 37ºC durante 1 hora. Foi adicionado 430µL
de NaCl 5M, invertendo os tubos delicadamente e centrifugando-os por 10 minutos a
13.000rpm. Os sobrenadantes foram transferidos para novos microtubos de 1,5mL, e
adicionados 215µL de Tris-HCl (0,01M pH 8,0) – invertendo os tubos por três vezes.
Completou-se o volume dos microtubos com etanol absoluto (gelado) para
precipitação do DNA em freezer a –20ºC durante toda a noite. Depois de
centrifugado e lavado com etanol 70%, os pellets foram ressuspendidos em 100µL
de TE (Tris 10mM, EDTA 1mM) e estocados em freezer a - 20ºC.
A integridade e pureza dos DNAs extraídos foram verificados em gel de
agarose 0,8%, corados com brometo de etídeo e fotodocumentados no sistema
Eagle Eye II .
A quantificação foi baseada na intensidade de banda quando comparadas
com um marcador de peso molecular de DNA fago Lambda de 50 ng, em gel de
agarose 0,8%.
3.3 Amplificação dos locos microssatélites
Inicialmente, utilizando cinco indivíduos de cada espécie provenientes do
meliponário do GPA/INPA, foi testada a amplificação de DNA usando-se dez primers
de regiões microssatélites, variando a temperatura de anelamento, e as
concentrações dos reagentes na reação em cadeia da polimerase (PCR) (Mullis e
Fallona, 1987). Os primers escolhidos para teste, 8 desenvolvidos para M. bicolor e
2 para Apis mellifera (Tabela 2) já haviam sido utilizados para amplificação em
29
outras espécies que não as de origem, e se mostraram polimórficos (Peters et al.,
1998; Carvalho-Zilse e Kerr, 2006; Francisco et al., 2006).
Tabela 2. Origem e seqüência dos primers testados para amplificação em Melipona
compressipes e Melipona seminigra.
Loco
Primers (5' → 3')
Origem do primer
Mbi 11
CGTTCGTTCTTCCCAAT
GATCGAATTTAACCGGC
M. bicolor 1
Mbi 13
CCCCTAACAGCCAAAGCTAT
CGATGCCCACTTTCGAC
M. bicolor 1
Mbi 28
TTTTATCGCTCCTATCCTCC
AATCCAACAGGACGGTGT
M. bicolor 1
Mbi 32
CTTTATCCGGTGCGTCGAA
GAAGGCATTCCGGGTTGTT
M. bicolor 1
Mbi 36
GCATCGGCGTCAGCCAG
GCGTGTCAGGCGGTGAAG
M. bicolor 1
Mbi 88
GCCGCCGTACGTTCTGA
GCGCTCGAGCAGCGTT
M. bicolor 1
Mbi 103
CCCCACAGTGTAACCAGAAAG
TTATGGTGATAAACGGCGAAG
M. bicolor 1
Mbi 213
CCCTCATCCCTTCGTTTCTT
CGTGAACAGGAAGTCCGTCTAA
M. bicolor 1
A 76
GCCAATACTCTCGAACAATCG
GTCCAATTCACATGTCGACATG
A. mellifera 2
A 107
CCGTGGGAGGTTTATTGTCG
GGTTCGTAACGGATGACAACC
A. mellifera 2
1. Peters et al., 1998
2. Estoup et al., 1993
Os locos microssatélites foram amplificados por PCR, em termociclador
Eppendorf Gradiente. Os produtos das amplificações foram submetidos à
eletroforese em gel de agarose 2%, a 120V, utilizando 3 µL de amostra adicionado a
3 µL de load (azul de bromofenol + xileno cianol) e para determinação do tamanho
dos fragmentos amplificados, usou-se um marcador molecular Ladder de 100pb.
Após a separação eletroforética, os géis foram corados com brometo de etídeo, em
banho, por 20 minutos e fotografados em sistema de fotodocumentação digital.
A partir das amplificações positivas, visualizadas em gel de agarose,
procedeu-se à corrida destes produtos (2µL de amostra adicionado a 3 µL de load
30
juntamente com marcador de peso molecular de 10pb (3µL) em gel de poliacrilamida
(19:1) 15% a 80V por 16 horas. Em seguida os géis foram corados com nitrato de
prata usando-se o protocolo: imersão do gel na solução I (etanol 10% + ácido
acético 0,5%) por 20 minutos. Após descartar a solução I, colocou-se o gel na
solução II (nitrato de prata 0,17%) por 30 minutos. O gel foi lavado com água
destilada por 2 minutos e colocado em solução III (NaOH 3% + formaldeído 0,1%),
mexendo suave e continuamente até aparecerem as bandas. Após o processo de
coloração, a reação foi neutralizada com ácido acético 10%.
3.4 Análise de polimorfismo de DNA em regiões microssatélites
A determinação do tamanho dos alelos foi feita a partir da digitalização dos
géis com scanner de mesa, e medição usando-se o programa ImageJ 1.36b por
comparação com o marcador de peso molecular Ladder de 10 pb. Conhecendo o
tamanho dos alelos, foi construída uma matriz com as informações dos genótipos
dos indivíduos de todos os locos para proceder as análises de polimorfismo.
A caracterização de locos microssatélites envolveu a quantificação do número
de alelos por loco e o cálculo da heterozigosidade observada (Ho = No. de
indivíduos heterozigotos / No. total de indivíduos analisados).
O estudo de polimorfismo genético foi baseado na análise da distribuição dos
alelos e no cálculo das freqüências gênicas, e o índice de diversidade molecular no
número de diferentes alelos dentro de cada colméia.
Estas análises foram feitas por meio do programa estatístico Arlequin
desenvolvido por Schneider et al. (2000).
31
4. Resultados e discussão
A conservação de sítios que flanqueiam os microssatélites entre espécies
relacionadas permite a transferência destes marcadores entre espécies ou mesmo
gêneros diferentes utilizando-se primers heterólogos. A transferibilidade de primers
facilita o uso deste marcador, pois reduz o tempo de execução e o custo do trabalho
(Ferreira e Grattapaglia, 1998).
Atualmente, muitos marcadores microssatélites estão disponíveis na literatura
para as mais diversas espécies de animais e vegetais. Trabalhos abordando
aspectos da biologia das espécies, comportamento reprodutivo, dinâmica de
populações, evolução, análise, parentesco, variação intraespecífica, hibridização e
mapeamento genético envolvendo regiões microssatélites, tem sido realizados a
partir da utilização de primers heterólogos. Colevati et al. (1999) conseguiram
transferibilidade em 100% dos dez locos SSR desenvolvidos para Caryocar
brasiliense em cinco outras espécies do mesmo gênero, indicando alto nível de
homologia do genoma entre as espécies deste gênero, permitindo estudos
comparativos de estrutura genética nas espécies do gênero. Primers desenvolvidos
para Eucalyptus spp. (Brondani et al., 1998) foram transferidos para Eugenia
dysenterica (Zucchi et al., 2002), sendo espécies da mesma família, porém de
gêneros diferentes.
Em animais, Kuehn et al. (2003) avaliaram a estrutura genética de populações
de cervos ameaçados de extinção na Bavária por meio de 19 locos microssatélites
oriundos de carneiros e bovinos. Luís et al. (2002), por meio de otimização de
amplificação de primers heterólogos, realizaram análise de parentesco para cavalos,
separando três raças a partir de seis loci SSR heteroespecíficos.
Em abelhas, muitos trabalhos vem sendo realizados por transferência de
primers microssatélites (Paxton et al., 1999; Soares, 2001; Francisco, 2002; Shao et
al., 2004; Carvalho-Zilse e Kerr, 2006; Arias et al., 2006; Insuan et al., 2007) para
caracterização de locos microssatélites, determinação da estrutura genética de
populações e estudo de paternidade.
Porém, a utilização deles está sujeita a contratempos como a não
amplificação e a amplificação de bandas inespecíficas. Ambos os casos ocorreram
durante este trabalho para amplificação dos locos nas duas espécies.
32
Dos dez primers testados, cinco foram escolhidos para M. compressipes e
quatro para M. seminigra, pela qualidade dos produtos apresentados permitindo seu
uso no presente estudo (Figura 6).
M 1 2
3 4
5 6 7 8
100pb →
Figura 6. Perfil de amplificação em gel de agarose 2% do loco Mbi 13 em Melipona
compressipes. M – Marcador de peso molecular de 100 pb; 1 a 8 – amostras de colméias de
Candango (Parintins-AM).
As concentrações ótimas dos reagentes para a PCR de todos os locos foram
idênticas para M. compressipes e M. seminigra (Tabela 3), à exceção das
temperaturas de anelamento dos primers (Tabela 4).
Tabela 3 - Concentrações dos reagentes da PCR para amplificação de locos microssatélites
em Melipona compressipes e Melipona seminigra.
Reagentes
Concentração
Tampão da enzima Taq
1X
Cloreto de Magnésio (MgCl2)
2 mM
Enzima Taq DNA polimerase
1 unidade
deoxinucleotídeos (dNTPs)
300 µM
Primers (Foward e Reverse)
3 pmol
DNA molde
50 ng
33
Tabela 4 - Temperaturas ótimas de anelamento dos primers heterólogos na amplificação de
DNA de Melipona compressipes e Melipona seminigra.
Temperaturas de anelamento
Primers
M. compressipes
M. seminigra
Mbi 11
49,6ºC
51ºC
Mbi 13
56ºC
57ºC
Mbi 28
54,5ºC
-
Mbi 32
59ºC
58ºC
Mbi 36
58ºC
-
Mbi 213
-
57ºC
Para M. compressipes os primers Mbi11, 13, 28, 32 e 36 amplificaram
satisfatoriamente (Figura 7). No entanto, os primers Mbi103, Mbi213, A76 e A107
não amplificaram e o Mbi88 apresentou bandas inespecíficas.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
M
← 100pb
Figura 7. Gel de poliacrilamida 10% indicando padrão de bandas (alelos) dos produtos da
PCR do loco Mbi 36 para Melipona compressipes. M – marcador de 10pb. 1 a 10: amostras
de colméias de Lobato (Urucará-AM).
Para M. seminigra os locos Mbi11, 13, 32 e 213 apresentaram padrões de
bandas considerados satisfatórios para análise. Os locos Mbi28 e 36 apresentaram
bandas inespecíficas quando analisadas em gel de poliacrilamida 10%; e os locos
Mbi 88, Mbi 103, A107 e A76 não amplificaram.
O sucesso de amplificação declina de acordo com a distancia genética entre os
taxa (Primmer e Merilä, 2000), ou seja, a proximidade filogenética é o principal fator
no sucesso da transferência para uso de primers heterólogos. Porém, outros fatores
34
como o tamanho e a complexidade do genoma e a localização do microssatélite (se
está em região codificante ou não) também influenciam no processo de
transferibilidade (Oliveira et al., 2006).
Tentativa
de
amplificação
de
regiões
microssatélites
com
primers
desenvolvidos para o gênero Apis também foi fracassada para M. scutellaris
(Carvalho-Zilse e Kerr, 2006). Porém, Francisco et al. (2006) e Brito (2005)
conseguiram amplificar locos microssatélites em abelhas do gênero Partamona com
primers de Melipona e Scaptotrigona.
Os locos microssatélites analisados, com base na amostragem de 65
indivíduos de 13 colméias oriundas de 11 localidades para M. compressipes e 100
indivíduos de 18 colméias oriundas de 10 localidades para M. seminigra geraram
alelos de tamanhos diferentes em M. compressipes e M. seminigra, variando de
86pb a 225pb e 100pb a 142pb, respectivamente (Tabela 5).
A utilização de primers heterólogos pode resultar em amplificações de locos
de seqüências com tamanho e/ou composição diferentes de bases entre as
espécies. Locos com alelos de tamanhos diferentes para as mesmas regiões
microssatélites também foram encontrados nas espécies M. quadrifasciata,
Tetragonisca clavipes e Scaptotrigona postica (Peters et al., 1998), M. scutellaris
(Carvalho-Zilse e Kerr, 2006), Plebeia remota (Francisco, 2002), Partamona mulata e
Partamona helleri (Brito, 2005).
Os alelos microssatélites encontrados nas espécies estudadas neste trabalho
serão submetidos a sequenciamento, para confirmar esta questão.
M. compressipes apresentou um total de 20 alelos diferentes, variando entre
três a sete alelos por loco enquanto M. seminigra teve 19 alelos variando entre
quatro a seis alelos por loco. M. scutellaris apresentou uma maior variação no
número de alelos (2 a 10) para os mesmos locos analisados (Carvalho-Zilse e Kerr,
2006), o que sugere uma maior homologia nas seqüências de DNA entre M. bicolor
e M. scutellaris. Quando comparamos o número de alelos amplificados com os
mesmos locos em espécies de outros gêneros, o número de alelos encontrados para
elas é menor. Por exemplo, Francisco et al. (2006) encontraram apenas 1 alelo para
o loco Mbi 28 em P. mulata e P. helleri; para o loco Mbi 32 encontraram 1 e 2 alelos,
respectivamente; e para P. remota não houve amplificações positivas.
35
Tabela 5 - Número (N) e tamanho dos alelos em pares de bases (A) amplificados em
Melipona compressipes e M. seminigra e suas respectivas heterozigosidades observadas
(Ho) por loco comparadas a M. bicolor (espécie de origem dos primers).
Loco
Mbi 11
Mbi 13
Mbi 28
M. compressipes
A
Ho
225
192
4
0,55
186
164
171
165
153
7
150
0,38
144
120
105
92
3
89
0,11
86
N
Mbi 32
3
166
154
145
Mbi 36
3
171
159
108
Mbi 213
-
-
Heterozigosidade média
* Peters et al. (1998)
M. seminigra
A
Ho
142
139
4
0,00
136
133
N
N
M. bicolor*
A
Ho
5
152
0,63
6
121
115
109
106
103
100
0,42
4
129
0,88
-
-
-
3
108
0,25
0,16
4
154
0,63
0,39
5
129
126
123
117
102
0,42
-
-
-
5
125
0,75
4
132
129
126
123
0,52
6
123
0,75
0,37
0,28
0,65
É interessante notar que os alelos apresentados para M. seminigra foram
sempre de menor tamanho quando comparados aos alelos em M. compressipes e
M.
bicolor.
Nessa
espécie
também
se
observou
menores
índices
de
heterozigosidade para a maioria dos locos analisados.
O loco Mbi 13 apresentou o maior número de alelos nas duas espécies: sete
em M. compressipes e seis em M. seminigra (Tabela 5). Sendo considerado um
microssatélite perfeito - (GTC)10 - na espécie de origem e extrapolando essa
característica para as duas espécies em estudo, este dado reforça a idéia de que
microssatélites perfeitos tendem a ter mais alelos que os imperfeitos e interrompidos.
Isto porque as bases que interrompem o microssatélite diminuem a possibilidade de
erro na leitura da polimerase durante a replicação do DNA, dando maior estabilidade
ao mesmo (Webber, 1990; Chung et al., 1993).
36
Carvalho-Zilse e Kerr (2006) encontraram, em M. scutellaris, seis alelos para o
loco Mbi 13 e o maior número de alelos (dez) foi encontrado no loco Mbi 213, outro
microssatélite considerado perfeito - (CTT)8
-
na espécie de origem (M. bicolor).
Porém, estes mesmos autores encontraram oito alelos para o loco Mbi 28 e
Francisco et al. (2006) também encontraram os maiores números de alelos (seis)
nos locos Mbi 259 e Mbi 278 em Plebeia remota, todos microssatélites imperfeitos
em M. bicolor.
4.1 Melipona compressipes
As freqüências e distribuição dos alelos variaram tanto em nível inter quanto
intracolonial, com as colméias de Parintins (extremo leste do Amazonas) sendo as
mais polimórficas para a maioria dos locos e as colméias de Jutaí (quase extremo
oeste do estado) as menos polimórficas, apresentando apenas um alelo para o loco
Mbi 28 (Tabela 6).
No loco Mbi 11, o alelo 186pb está presente na maioria das colméias naturais
(Parintins, Urucará, Jutaí) com alta freqüência (> 0,40). O alelo 225pb apareceu
apenas em Bentes e Piranheira (Parintins) e de Paulo e Lobato (Urucará), situadas
na margem esquerda do rio Amazonas. O alelo 192pb foi exclusivo de Resex (Jutaí),
situada no lado direito do rio Amazonas, e de São Geraldo (Manaus) (Tabela 6).
Também é válido destacar que o índice de heterozigosidade observada neste
loco variou de Ho=1,00 para as colméias Bentes e Piranheira (Parintins) e Paulo
(Urucará) a Ho=0,00 para as colméias da Resex (Jutaí) e de Klilton e São Geraldo
(Manaus) (Tabela 7).
O Loco Mbi 13 foi o mais polimórfico dentre os locos analisados (Figura 8)
apresentando maior número de alelos (sete) sendo que três (171pb, 165pb e 105pb)
foram exclusivos das localidades de Parintins, com 100% de heterozigotos (Tabelas
6 e 7). Apesar do maior número de alelos encontrados neste loco, todos os
indivíduos das colméias de Tarumã e São Geraldo (Manaus), Lobato e Paulo
(Urucará), Nova Esperança e São Sebastião (Jutaí) se mostraram homozigotos.
O loco Mbi28, com apenas três alelos, apresentou-se monomórfico em todas as
localidades (Figura 9) exceto em Parintins (quatro indivíduos heterozigotos em
Candango, um em Bentes e dois na Piranheira) e Urucará (1 indivíduo heterozigoto
em Lobato) (Tabela 7). O alelo 86pb foi exclusivo das colméias de Jutaí (Tabela 6).
37
Tabela 6 - Tamanho de alelos em pares de bases (A) e freqüências alélicas (Fa) nos locos analisados em todas as colméias de
Melipona compressipes no estado do Amazonas.
Município
Localidade
Candango
(2) natural
Parintins
(4)
Bentes
(1) natural
Piranheira
(1) natural
Klilton
(1) manejada
Manaus
(3)
Tarumã
(1) manejada
São Geraldo
(1) natural
Paulo
Urucará
(2)
(2) natural
Lobato
(1) natural
N. Esperança
(1) natural
Jutaí
(3)
S. Sebastião
(1) natural
Resex
(1) natural
Mbi 11 (4 alelos)
A
Fa
Mbi 13 (7 alelos)
A
Fa
171
0,05
165
0,20
150
0,25
144
0,25
120
0,25
171
0,20
165
0,30
150
0,20
144
0,30
150
0,50
105
0,50
153
0,10
150
0,20
144
0,60
120
0,10
186
164
0,83
0,16
225
186
0,50
0,50
225
186
0,50
0,50
164
1,00
186
164
0,80
0,20
144
192
1,00
225
186
164
225
186
186
164
186
164
0,30
0,50
0,20
0,50
0,50
0,50
0,50
0,40
0,60
192
1,00
(N) número de colméias amostradas
Mbi 28 (3 alelos)
A
Fa
Mbi 32 (3 alelos)
A
Fa
Mbi 36 (3 alelos)
A
Fa
92
89
0,23
0,77
154
145
0,50
0,50
171
108
0,50
0,50
92
89
0,10
0,90
154
145
0,50
0,50
171
1,00
92
89
0,20
0,80
154
145
0,60
0,40
171
1,00
89
1,00
166
154
0,25
0,75
171
108
0,70
0,30
1,00
89
1,00
0,50
0,50
1,00
89
1,00
171
1,00
120
1,00
89
1,00
171
159
0,50
0,50
153
1,00
92
89
0,77
0,23
159
1,00
120
1,00
86
1,00
120
1,00
86
1,00
0,50
0,50
0,30
0,70
0,55
0,25
0,20
0,60
0,40
0,90
0,10
0,20
0,80
171
108
144
166
154
166
154
166
154
145
166
145
154
145
154
145
171
108
171
108
0,50
0,50
0,50
0,50
150
144
120
0,30
0,40
0,30
86
1,00
154
1,00
171
1,00
38
Tabela 7 - Heterozigosidade observada por loco microssatélite em Melipona compressipes
em cada localidade analisada no estado do Amazonas.
Município
Localidade
1,00
0,44
0,60
1,00
Bentes
1,00
1,00
0,20
1,00
0,00
Piranheira
1,00
1,00
0,40
0,00
0,00
Klilton
0,00
0,60
0,00
0,00
0,60
Tarumã
0,60
0,00
0,00
1,00
1,00
São Geraldo
0,00
0,00
0,00
0,20
0,00
Paulo
1,00
0,00
0,00
0,66
0,00
Lobato
0,20
0,00
0,20
0,40
0,00
N. Esperança
1,00
0,00
0,00
0,20
1,00
S. Sebastião
0,40
0,00
0,00
0,20
1,00
Resex
0,00
0,60
0,00
0,00
0,00
0,51
0,38
0,11
0,39
0,42
Urucará
Ho média
2
Mbi 36
0,44
Manaus
1
Heterozigosidade observada
Mbi 13
Mbi 28
Mbi 32
Candango
Parintins
Jutaí
Mbi 11
3
4
5
6
7
8
9 M 10 11 12 13 14
15 16 17 18 19
100pb
Figura 8. Gel de poliacrilamida 10% mostrando polimorfismo intra e intercolonial a partir da
amplificação do loco Mbi 13 em Melipona compressipes. 1 a 4: Candango (Parintins); 5 a 9:
Bentes (Parintins); 10 a 14: Resex (Jutaí); 15 a 19: Klilton (Manaus). M – marcador de 10pb.
39
M
7
1
2
3
4
5
6
7
100p
b
Figura 9. Gel de poliacrilamida 10% evidenciando o monomorfismo do loco Mbi 28 , em
Melipona compressipes. M - marcador de 10pb. 1 a 7: amostras Klilton (Manaus).
O alelo 154pb foi encontrado em todas as colméias de M. compressipes,
exceto na localidade de Lobato (Urucará) para o loco Mbi 32, quase sempre com alta
freqüência (Tabela 6). Também o alelo 145pb se mostrou freqüente em todas as
colméias amostradas, exceto as de Manaus, porém com freqüências variadas. Não
foram encontrados heterozigotos para este loco nas localidades de Piranheira
(Parintins), Klilton (Manaus) e Resex (Jutaí) (Tabela 7).
Para o loco Mbi 36, o alelo 171pb, que não foi observado apenas em Lobato
(Urucará), apresentou altas freqüências nas demais localidades. O alelo 159pb
apareceu apenas nas colméias de Lobato e Paulo (100% de homozigotos) (Tabelas
6 e 7).
A variação genética encontrada dentro e entre as localidades, com base na
distribuição dos alelos nos diferentes locos, sugere que esteja ocorrendo uma
estruturação genética em M. compressipes no estado do Amazonas. Percebe-se
uma clara hierarquia de variação genética: entre localidades, dentro da localidade e
dentro da colméia. Ou seja, as colméias amostradas em uma mesma localidade
apresentam menor diversidade de alelos que colméias amostradas em diferentes
localidades, provavelmente refletindo a migração a curtas distancias em Melipona
(Carvalho-Zilse e Kerr, 2004).
Analisando cada localidade separadamente, as colméias de Parintins
apresentaram número de indivíduos heterozigotos observados maior que o esperado
para todos os locos, variando de Ho = 1,00 a Ho = 0,20 (Tabela 7) e maior
diversidade genética (0,48) (Tabela 8).
40
Tabela 8 - Diversidade genética (valores médios), baseada no número de diferentes
alelos/loco e número de locos polimórficos microssatélites encontrados nas localidades
amostradas de Melipona compressipes (Mc) e Melipona seminigra (Ms) no estado do
Amazonas.
Município
Jutaí
Alvarães
Manaus
Cacau Pirera
Careiro
Castanho
Urucará
Parintins
Média /
Ms
Localidade
Mc
N. Esperança
0,26
S. Sebastião
0,18
Resex
0,15
Marajaí
-
Klilton
0,27
Tarumã
0,32
São Geraldo
0,09
0,31
Monte Pascoal
-
0,05
Valtino
-
Neuzilena
-
Paulinho
-
Panelão
-
Lobato
0,28
localidade
localidade
0,19
-
-
-
0,34
0,34
0,37
0,23
-
-
0,49
0,24
0,49
0,34
-
0,35
0,29
0,18
0,24
0,19
Paulo
0,20
Candango
0,65
Bentes
0,40
Piranheira
0,40
-
0,29
0,32
Média geral
Média /
0,53
0,36
0,48
-
-
(-) localidades não amostradas
O menor índice médio de diversidade (0,19) foi obtido em Jutaí. Porém,
analisando cada colméia separadamente, São Geraldo (Manaus) foi a que
apresentou o menor índice de diversidade (0,09), com grande deficiência de
heterozigotos: quatro dos cinco locos analisados foram monomórficos e apenas o
loco Mbi 32 apresentou um indivíduo heterozigoto (Ho=0,20). A colméia de São
Geraldo foi mantida isolada, sem nenhum tipo de manejo, dentro da cidade de
Manaus por mais de dez anos. Possivelmente, esta colônia esteja sofrendo processo
de depressão endogâmica por conseqüência de acasalamento entre irmãos.
Comparando-se os índices de polimorfismo entre colméias naturais e
manejadas de jupará no Amazonas para as quais se analisou os locos Mbi 13 e 32,
41
as colméias manejadas apresentaram maiores índices de Ho (Ho=0,31 para o loco
Mbi 13 e Ho=0,63 para Mbi 32) e de diversidade genética (0,31) que as colméias
naturais (Ho=0,27 para Mbi 13 e Ho=0,47 para Mbi 32; diversidade genética=0,00).
Este resultado pode ser justificado pelo fato das colônias manejadas serem
provenientes do meliponário do GPA que foi fundado em 1999 por colônias de
diferentes localidades e desde então recebem manejo intenso com trocas de rainhas
e discos de cria entre colméias do próprio meliponário e de outros meliponários de
Manaus e de municípios do Amazonas. Já as colônias naturais, oriundas de
Parintins, nunca haviam sido manejadas e, portanto podem estar representando a
estabilidade dos seus microhabitats.
Numa análise geral, M. compressipes apresentou nível de diversidade genética
razoável (0,29) no estado do Amazonas, tendo seus alelos bem distribuídos entre as
colônias e entre as localidades e com índices de heterozigosidades observadas
entre os maiores valores quando comparados a outras espécies de melíponas
(Tabela 11).
4.2 Melipona seminigra
As abelhas jandaíra apresentaram padrão de distribuição e freqüência de
alelos variáveis entre as colméias, tendo alguns alelos exclusivos e/ou fixados em
determinadas localidades do estado do Amazonas (Tabela 9). A exemplo, temos
para o loco Mbi 11 a fixação do alelo 133pb em Marajaí (Alvarães) e Paulo (Urucará)
e a presença do alelo 142pb exclusivo em São Geraldo (Manaus) para o mesmo
loco. Na maioria das colméias foi encontrado apenas um alelo (dos 4 presentes
neste loco), exceto Valtino (Cacau Pirera) e Neuzilena (Carreiro Castanho) onde
apareceram dois alelos. Em nenhuma colônia foram encontrados indivíduos
heterozigotos para este loco.
Alelos exclusivos também foram encontrados para o loco Mbi 13 em Marajaí
(Alvarães) (121pb) e Valtino (Cacau Pirera) (103 pb). Apenas em Monte Pascoal
(Manaus) encontrou-se alelo (106pb). A exemplo de M. compressipes, este loco
apresentou o maior número de alelos (seis) dentre os locos analisados. A maioria
das localidades apresentou Ho > 0,20, exceto Monte Pascoal (Manaus) e Paulinho
(C. Castanho) (Tabela 10).
42
Também, para o loco Mbi 32 observou-se alelos exclusivos de 117pb em
Marajaí (Alvarães) e de 102pb em Urucará. O alelo 126pb foi o único comum a todas
as localidades exceto Panelão (C. Castanho) e S. Geraldo (Manaus). Mesmo com
cinco alelos presentes neste loco, a maioria das colméias apresentou Ho=0,00.
O loco Mbi 213 (4 alelos) foi o mais polimórfico para as abelhas jandaíra,
tendo a maior heterozigosidade média observada (Ho=0,52) em relação aos outros
locos analisados para a espécie (Tabela 10), porém menor que em M. bicolor
(Tabela 11). As colméias de Manaus (São Geraldo e Klilton) foram diferenciadas
para este loco, sendo as únicas em que apareceu o alelo 132 pb.
A análise por localidade indicou que, a exemplo de jupará, jandaíra
apresentou uma maior variação de alelos entre as localidades que dentro de cada
localidade. As colméias de Cacau Pirera apresentaram o maior nível de diversidade
genética (0,49) enquanto em Manaus foi encontrada a menor diversidade genética
(0,24), com o menor índice na colméia de Monte Pascoal (0,05) (Tabela 8).
Uma análise conjunta das colméias amostradas de M. seminigra no
Amazonas, mostrou que a maioria dos locos apresentaram menor número de
indivíduos heterozigotos que os encontrados em M. compressipes e em M. bicolor
para os mesmos locos (Tabela 11).
Buscando saber se a exploração comercial da jandaíra vem afetando a
variabilidade genética desta espécie no estado, baseado nos resultados de
heterozigosidade e diversidade genética nos locos Mbi 13 e 32, os resultados da
comparação entre colméias naturais e manejadas para a M. seminigra mostraram
níveis de Ho média e diversidade genética semelhantes. As colméias naturais
apresentaram Ho média= 0,276 e diversidade genética= 0,618 e as colméias
manejadas, Ho média= 0,284 e diversidade genética= 0,612. Este resultado sugere
que as técnicas de manejo na meliponicultura ainda não afetaram a diversidade
genética da jandaíra, seja promovendo a homogeneização gênica por seleção de
colméias mais produtivas e sucessivas multiplicações, seja aumentando a
variabilidade por troca de rainhas e discos de cria entre os meliponicultores.
43
Tabela 9 – Tamanho de alelos em pares de base (A) e freqüências alélicas (Fa) nos locos analisados em todas as colméias de Melipona
seminigra no estado do Amazonas.
Município
Localidade
Alvarães
(2)
(2) manejada
Marajaí
S. Geraldo
(1) natural
Manaus
(4)
Klilton
(2) manejada
M.Pascoal
(1) natural
C. Pirera
(3)
Valtino
(3) natural
Neuzilena
(3) manejada
C. Castanho
(6)
Paulinho
(2) manejada
Panelão
(1) manejada
Paulo
Urucará
(3)
(1) natural
Lobato
(2) natural
Mbi11 (4 alelos)
A
Fa
Mbi 13 (6 alelos)
A
Fa
121
0,40
109
0,60
Mbi 32 (5 alelos)
A
Fa
126
0,70
117
0,30
133
1,00
142
1,00
106
100
0,60
0,40
123
1,00
139
1,00
115
106
0,25
0,75
126
123
0,50
0,50
136
1,00
106
1,00
126
1,00
136
133
0,33
0,66
115
106
103
0,07
0,60
0,33
126
123
0,33
0,66
139
133
0,33
0,66
109
100
0,60
0,40
126
1,00
136
1,00
109
106
0,50
0,50
129
126
0,50
0,50
136
1,00
109
100
0,40
0,60
129
1,00
133
1,00
136
1,00
109
100
115
109
100
0,90
0,10
0,20
0,70
0,10
126
102
126
123
102
0,80
0,20
0,30
0,40
0,30
(N) número de colméias amostradas
Mbi 213 (4 alelos)
A
Fa
129
0,70
123
0,30
132
0,30
129
0,50
126
0,20
132
0,15
129
0,50
126
0,20
129
0,10
126
0,90
129
0,36
126
0,60
123
0,04
129
0,20
126
0,75
123
0,05
129
0,80
126
0,20
129
0,50
126
0,40
123
0,10
126
0,60
123
0,40
126
123
0,80
0,20
44
Tabela 10 - Heterozigosidade observada por loco microssatélite em Melipona seminigra nas
localidades amostradas.
Heterozigosidade Observada
Município
Alvarães
Manaus
C. Pirera
C. Castanho
Localidade
Mbi 11
Mbi 13
Mbi 32
Mbi 213
Marajaí
0,00
0,80
0,60
0,50
S. Geraldo
0,00
0,80
0,00
0,60
Klilton
0,00
0,50
0,00
0,40
M. Pascoal
0,00
0,00
0,00
0,20
Valtino
0,00
0,20
0,00
0,60
Neuzilena
0,00
0,35
0,00
0,33
Paulinho
0,00
0,00
0,00
0,42
Panelão
0,00
0,80
0,00
1,00
Paulo
0,00
0,20
0,40
0,75
Lobato
0,00
0,60
0,60
0,40
0,00
0,42
0,16
0,52
Urucará
Ho média
45
Tabela 11 - Heterozigosidade observada (Ho) e número de alelos (N) em diferentes espécies de abelhas sem ferrão utilizando os mesmos
primers desenvolvidos para Melipona bicolor.
Loco
Ho (N)
Melipona
scutellaris**
0,14 (2)
Mbi 11
Melipona
seminigra
0,00 (4)
Melipona
compressipes
0,51 (4)
Melipona
bicolor*
0,63 (5)
Melipona
quadrifasciata*
0,00 (2)
Mbi 13
0,42 (6)
0,38 (7)
0,88 (4)
_
0,11 (6)
Mbi 28
_
0,11 (3)
0,25 (3)
0,00 (1)
0,95 (8)
0,00 (1)
Mbi 32
0,16 (5)
0,38 (3)
0,63 (4)
0,00 (1)
0,06 (2)
Mbi 36
_
0,42 (3)
0,75 (5)
_
Mbi 213
0,52 (4)
_
0,75 (6)
Ho média
0,27 (19)
0,37 (20)
0,65 (27)
* Peters et al. (1998)
** Carvalho-Zilse e Kerr (2006)
*** Franscisco et al. (2006)
Scaptotrigona Plebeia
postica*
remota***
0,00 (1)
_
_
_
Partamona
mulata***
_
Partamona
helleri***
_
_
_
_
0,00 (1)
0,00 (1)
0,00 (1)
_
0,00 (1)
0,04 (2)
0,00 (2)
_
_
_
_
_
0,51 (10)
_
_
_
_
0,00 (4)
0,29 (30)
0,00 (3)
0,00 (2)
0,02 (3)
46
4.3 Comparação entre as espécies
Dentre as espécies de melíponas estudadas, até o momento, cujos locos
foram amplificados com primers heterólogos de M. bicolor, todos os índices de Ho se
mostraram menores que da espécie de origem dos primers (Ho= 0,65) (Tabela 11).
Em ordem decrescente, M. compressipes apresentou maior índice de Ho média
(=0,37) seguida por M. scutellaris (Ho=0,30) (Carvalho-Zilse e Kerr, 2006), M.
seminigra (Ho=0,27) e M. quadrifasciata (Ho=0,00) (Peters et al., 1998).
Os índices de polimorfismo não são idênticos entre as espécies após o
processo de transferibilidade de primers. As principais causas para tal fato são a
presença de alelos nulos (a não amplificação dos alelos devido à mutação na
seqüência do DNA) e a homoplasia de tamanho de fragmentos (amplificação de
fragmentos diferentes, porém de mesmo tamanho).
Outro fato a ser considerado é que, segundo Kerr (1946) e Velthius et al.
(2006), Melipona bicolor é a única espécie em que se observou a presença de até 5
rainhas fisogástricas ativas na colméia. Isto promove variabilidade genética dentro
da colônia já que significa a distribuição de alelos de, pelo menos, cinco diferentes
machos (considerando o acasalamento de cada rainha com apenas um macho)
entre as operárias filhas.
O índice de Ho em Apis mellifera, é ainda maior (Ho=0,69) (Estoup et al.,
1993). Sabe-se que as rainhas de Apis podem cruzar com 15 a 17 machos (Adams
et al., 1977; Lobo e Kerr, 1993), o que implica no aumento de diferentes alelos
microssatélites (de origem paterna) presentes na população de operárias da
colméia.
Em melíponas, até 1999 se acreditava, com base na comparação do número
de espermatozóides produzidos pelo macho e o encontrado na espermateca da
rainha, que a rainha de meliponíneos se acasalava com um único macho. No
entanto, Paxton et al. (1999) usando microssatélites, demonstraram a existência de
poliandria em M. beecheii (cruzamento com 1 a 3 machos) e Scaptotrigona postica
(1 a 6). Também Carvalho (2001), com base em análise de progênie, confirmou que
34,5% dos acasalamentos em M. scutellaris ocorrem com pelo menos dois machos e
65,5% com apenas um macho.
47
Analisando as freqüências dos alelos de M. compressipes e M. seminigra nos
diferentes locos entre as colméias, pode-se notar que alguns alelos estão presentes
em todas ou na maioria das colméias amostradas com altas freqüências. CarvalhoZilse e Kerr (2006) também encontraram alelos com alta freqüência em todos as
colméias analisadas de M. scutellaris. Apesar de locos microssatélites estarem em
regiões intergênicas e serem considerados marcadores neutros, esses dados
reforçam a idéia de que estes locos parecem estar ligados a genes importantes à
sobrevivência das espécies, como genes de adaptação ao ambiente ou ao
metabolismo.
Também de observa a baixa freqüência de alguns alelos pouco comuns em
ambas as espécies, o que sugerem duas situações: que estes estejam sendo
eliminados ou podem ser alelos novos, sendo mais recentes dentro da colméia.
Foi possível detectar a presença de alelos exclusivos com altas freqüências
em algumas colméias tanto em M. compressipes como em M. seminigra. A presença
de alelos exclusivos pode indicar um fluxo gênico restrito entre as colméias, levando
a uma divergência genética devido à seleção ou deriva genética.
Segundo Kerr (1996), a distância de dispersão das colônias de meliponíneos
se dá pela soma do raio de vôo dos machos em busca de rainhas virgens, e do raio
de enxameagem do novo ninho. Essa enxameagem ocorre em curtas distâncias
devido à dependência da colônia-filha em cera e alimento da colônia-mãe. Conforme
Carvalho-Zilse e Kerr (2004) para M. compressipes fasciculata e M. scutellaris, a
distância de enxameagem é de, aproximadamente, 200 metros e o raio de vôo dos
machos é de 1000 metros (menor que o raio de vôo das operárias), totalizando
1.200m de distância de migração. Sabe-se que a distância de vôo para
forrageamento é maior que a distância de enxameagem para M. compressipes
fasciculata, segundo Kerr (1996), que registrou 2.500m e 200m, respectivamente.
Considerando que a distância máxima de vôo das operárias de jupará e da
jandaíra é de 1.100m e 750m, respectivamente (Nunes e Carvalho-Zilse, 2005), e
extrapolando a distância de vôo do macho de M. scutellaris para estas espécies,
chegamos que a distância de dispersão deve ser, no máximo, de 2.100m para M.
compressipes e 1.750m para M. seminigra.
Os pontos de coleta entre as colméias amostradas neste trabalho distam no
mínimo, de 5.400m para M. compressipes (Anexo A – Tabela 12) e de 1.700m para
M. seminigra (Anexo A – Tabela 13), limitando, assim, o fluxo gênico entre indivíduos
48
de tais colméias. Portanto, a variação de alelos encontrada entre as colméias de
diferentes localidades parece estar relacionada à estabilidade regional (estabilidade
ambiental do microhabitat) de cada localidade. Isto concorda com Futuyma (1992)
que afirma que a estruturação espacial ocorre por limitação física de cruzamento ou
por tendência de cruzamentos entre indivíduos próximos, formando demes
panmíticas. Além disso, as variações ambientais existentes podem agir a favor da
seleção de alguns alelos ligados a genes com maior valor adaptativo local (Conte,
2004).
Além das comparações entre colméias, buscou-se entender se há diferença
significativa quanto à variabilidade genética (referente ao número de diferentes
alelos microssatélites) quando se compara as amostras de colméias naturais (sem
nenhum tipo de manipulação) e colméias manejadas (manejadas em meliponários).
Os resultados mostraram que em M. compressipes, as colméias manejadas
apresentaram maior diversidade genética que as colméias naturais. Isto pode ser
reflexo de uma manipulação mais intensa das colméias por multiplicações
sucessivas das colméias e troca de caixas e rainhas entre os meliponicultores no
estado do Amazonas, aumentando a probabilidade de recombinações genotípicas e
a heterozigosidade nas diferentes colméias, o que não se dá na mesma velocidade
em colônias naturais, já que se espera apenas um evento de substituição natural de
rainha, com conseqüente acasalamento da nova rainha eleita, em Melipona a cada
22 meses (Carvalho-Zilse e Kerr, 2004). Em M. seminigra, os índices de diversidade
genética foram semelhantes, indicando que a meliponicultura ainda não afetou a
variabilidade genética das colméias desta espécie no Amazonas.
Em geral os índices de Ho e freqüência dos alelos mostraram satisfatórios
para as duas espécies no estado do Amazonas. Isto sugere que a exploração de
seus recursos e as ações antrópicas (desmatamento, queimadas, dentre outras)
ainda tem pouca influencia sobre as colméias de meliponíneos analisadas apesar de
algumas colméias de M. seminigra apresentarem deficiência de heterozigotos. Vale
salientar que este é o primeiro trabalho registrado para estas espécies no Amazonas
cujos dados podem refletir o tamanho amostral ou a presença de alelos nulos.
Dando continuidade a este trabalho, outro projeto já está em andamento no GPA a
fim de aumentar o numero de colméias amostradas, o número de locos para
comparação entre colméias manejadas e naturais, bem como sequenciar os alelos
encontrados a fim de pesquisar estas hipóteses.
49
5. Conclusões
Assim como para outras espécies, foi possível amplificar regiões
microssatélites em M. compressipes e M. seminigra com o uso de primers
heterólogos, sendo indicados para uso como marcador em estudos genéticos
dessas espécies;
O loco Mbi 13 foi o mais polimórfico em M. compressipes e o Mbi 213 em
M. seminigra;
O loco Mbi 11 foi o único 100% monomórfico em M. seminigra, todos os
demais mostraram-se polimórficos em ambas as espécies;
Verificou-se a existência de alelos exclusivos e/ou fixados em ambas as
espécies para todos os locos analisados;
Houve uma menor variação de alelos dentro da colméia, que entre
colméias e entre localidades em ambas as espécies;
Há uma evidente estruturação genética em M. compressipes e M.
seminigra no Amazonas, ocasionada, possivelmente, pelo limitado fluxo gênico entre
as colméias como conseqüência de baixas distâncias de dispersão destas espécies;
As duas espécies apresentaram variabilidade genética, revelando que os
efeitos da exploração de seus recursos e as ações antrópicas tiveram pouca
influencia até o momento sobre as freqüências alélicas e níveis de heterozigosidade.
As colméias manejadas apresentaram maior variabilidade genética que
as colméias naturais em M. compressipes, o que pode ser reflexo da ação antrópica
atuando quanto a troca de material genético entre os colméias. Em M. seminigra, as
ações antrópicas ainda não estão alterando a variabilidade genética nas colméias
manejadas.
50
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59
7. Anexo
Anexo A – Distancias geográficas entre as localidades
60
Tabela 12 - Distâncias geográficas (em Kilômetros) entre os pontos de coleta de amostras das populações de Melipona compressipes
nas localidades do estado do Amazonas.
Candango Bentes
Candango
Piranheira Klilton
Tarumã S.Geraldo Paulo
Lobato
N.Esperança S.Sebastião RESEX
0
Bentes
7,09
0
Piranheira
6,82
5,6
0
Klilton
400,9
395,4
394,1
0
Taruma
404,2
397,8
395,4
10,3
0
398,75
393,2
391,8
5,4
15,4
0
Paulo
142,6
135,8
135,2
260,8
261,9
258,8
0
Lobato
141,1
134,3
134,6
263,1
264,1
261,8
7,46
0
N.Esperança
1.124,60
1.114,70
1.118,10
730,2
726,3
732,9
982,6
983,4
0
S.Sebastião
1.121,30
1.123,40
1.114,80
727,4
723,50
730,90
979,5
980,4
7,42
0
RESEX
1.187,10
1.181,30
1.180,50
788,90
786,40
791,70 1.045,10 1.046,80
86,19
93,4
S. Geraldo
0
61
Tabela 13 - Distâncias geográficas (em Kilometros) entre os pontos de coleta de amostras das populações de Melipona seminigra nas
localdiades do estado do Amazonas.
Marajaí
Marajaí
S. Geraldo Klilton
M.Pascoal C.Pirera
Neuzilena Paulinho Panelão
Paulo
Lobato
0,0
S. Geraldo
533,3
0,0
Klilton
530,6
5,4
0,0
M.Pascoal
536,7
11,9
9,1
0,0
C.Pirera
526,8
7,8
9,9
18,7
0,0
Neuzilena
496,2
89,5
92,6
101,8
82,6
0,0
Paulinho
500,5
85,5
88,6
97,9
78,7
5,4
0,0
Panelão
500,7
86,9
90,2
99,4
80,3
5,2
1,7
0,0
Paulo
787,4
258,8
260,8
254,3
267,0
326,1
320,5
321,2
0,0
Lobato
789,2
261,8
263,1
256,2
269,2
329,9
324,8
325,4
7,46
0,0
62
ANEXO B – Coordenadas geográficas das localidades amostradas.
1
2
3
Figura 10. Localidades amostradas para Melipona compressipes no Município de Jutaí, no
estado do Amazonas.
1 - Comunidade São Sebastião (propriedade do Sr. Davi) (2° 29' 31.67" S; 66° 34' 51.28"
W),
2 - Comunidade Nova Esperança do Genipapo (2° 33' 13.97" S; 66° 36' 36.00" W),
3- Resex (Reserva Extrativista) (3° 6' 13.68" S; 67° 9' 37.37" W).
63
1
2
3
4
5
Figura 11. Localidades amostradas para Melipona compressipes (Mc) e Melipona seminigra
(Ms) nos Municípios de Manaus (pontos 1 a 4) e Cacau Pirera (ponto 5) no estado do
Amazonas.
1 - Tarumã (Mc) (02º 58’ 14.35” S; 60º 5’ 8.89” W),
2 - Monte Pascoal (Ms) (3° 0' 28.43" S; 60° 0' 2.19" W),
3 - Klilton (Mc e Ms) (3° 4' 11.09" S; 60° 3' 13.50" W),
4 - São Geraldo (Mc e Ms) (3° 6' 45.19" S; 60° 1' 43.26" W),
5 - Propriedade do Sr. Valtino (Município de Cacau Pirera) (Ms) (3° 9' 9.79" S; 60° 5'
11.80" W).
64
1
3
2
Figura 12. Localidades amostradas para Melipona seminigra no Município de Careiro
Castanho.
1 - Paulinho (Propriedade do Sr. Paulo) (3° 48' 33.00" S; 60° 21' 45.70" W),
2 - Comunidade do Panelão (3° 49' 28.61" S; 60° 21' 44.22" W),
3 - Neuzilena (Propriedade da Sra. Neuzilena) ( 3° 49' 23.59" S; 60° 24' 34.38" W).
65
1
2
Figura 13. Localidades amostradas para Melipona compressipes e Melipona seminigra no
Município de Urucará.
1 - Propriedade do Sr. Lobato (2° 28' 27.90" S; 57° 45' 19.37" W ),
2 - Propriedade do Sr. Paulo (2° 32' 26.09" S; 57° 45' 56.90" W).
66
1
3
2
Figura 14. Localidades amostradas para M. compressipes no Município de Parintins.
1 - Bentes (Comunidade Menino Deus) (2° 29' 23.50" S; 56° 32' 22.99" W),
2 - Piranheira (2° 32' 24.29" S; 56° 32' 38.33" W),
3 - Candango (2° 31' 22.30" S; 56° 29' 6.18" W).