UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
CAMPUS DE SÃO JOSÉ DO RIO PRETO
Programa de Pós-Graduação em Genética
FELIPE RAFAEL TORRES
Estudo do polimorfismo de hemoglobinas e
do gene HFE em populações brasileiras de
áreas endêmicas de Malária
Tese apresentada para
obtenção do Título de
Doutor em Genética.
Orientadora: Profa. Dra. Claudia Regina Bonini-Domingos
São José do Rio Preto – SP
2005
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Torres, Felipe Rafael.
Estudo do polimorfismo de hemoglobinas e do gene HFE em
populações brasileiras de áreas endêmicas de Malária / Felipe
Rafael Torres – São José do Rio Preto: [s.n.], 2005
96 f.
Orientadora: Profa. Dra. Cláudia Regina Bonini-Domingos
Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista. Instituto de
Biociências, Letras e Ciências Exatas
1. Hemoglobinas. 2. Polimorfismo de hemoglobinas. 3. Malária.
4. Gene HFE. I. Bonini-Domingos, Cláudia Regina. II.
Universidade Estadual Paulista. Instituto de Biociências, Letras e
Ciências Exatas. III. Título.
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Felipe Rafael Torres
Estudo do polimorfismo de hemoglobinas e
do gene HFE em populações brasileiras de
áreas endêmicas de Malária
COMISSÃO JULGADORA
TESE PARA A OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTOR
Presidente e Orientador:..........................................................................
2°Examinador: ......................................................................................
3°Examinador: ......................................................................................
4°Examinador: ......................................................................................
5°Examinador: ......................................................................................
São José do Rio Preto, 02 de março de 2005
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Este trabalho foi realizado no Laboratório
de Hemoglobinas e Genética das Doenças
Hematológicas
(LHGDH),
do
Instituto
de
Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE)
de São José do Rio Preto, Universidade Estadual
Paulista (UNESP).
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À minha querida Juliana, que com carinho e imensurável amor
soube ser paciente e compreensiva, sempre presente ao meu lado,
minha maior conquista.
À Lara, meu tesouro e minha força propulsora,
minha maior realização.
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Agradecimentos
Agradeço a todas as pessoas que apoiaram e vivenciaram a realização deste
trabalho. Em especial agradeço:
À Prof ª Dra. Cláudia Regina Bonini Domingos não só pela orientação mas
pela amizade, dedicação, incentivo constante e por me receber de abraços abertos em
seu laboratório dando todo apoio para realização deste trabalho. “O espírito se
enriquece com aquilo que recebe, o coração com aquilo que dá” (Victor Hugo).
Aos professores Dr. Agnaldo Luiz Simões, Dr. Milton Artur Ruiz, Dr.
Haroldo Wilson Moreira e Dra. Agnes Cristina Fett Conte pela disponibilidade na
leitura e composição da banca examinadora.
Ao Prof. Dr.Ricardo Luiz Dantas Machado cuja motivação pela pesquisa
malárica incentivou a realização deste trabalho.
A todos os professores, cujos ensinamentos e conduta muito contribuíram
para a minha formação. Em especial agradeço aos professores Dra. Maria Tercília
Vilela de A. Oliveira, Dra. Cláudia Carareto e Dr. Carlos Ceron.
Às amigas incondicionais e companheiras de laboratório Paula Juliana
Zamaro, meu braço direito que na maioria das vezes antecipava meus pedidos de
ajuda, e Wanessa de Souza, a fiel escudeira, pois sem a sua participação a realização
deste trabalho seria muito difícil.
Aos colegas de laboratório, Ana Carolina, Viviane, Karina, Luciane Storti,
Ana Rosa, Luciana Ondei, Carlos Fabian e Ana Luiza pelo convívio fraternal e
proveitoso e que de uma forma ou de outra participaram da realização deste trabalho.
À Marcela Ortiz pela contribuição dos seus conhecimentos lingüísticos.
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Aos funcionários do Departamento de Biologia e Seção de Pós-Graduação
pelo suporte técnico-acadêmico.
À Bio-Rad Laboratórios Brasil, em especial à minha gerente e amiga Dra.
Ana Requejo, pela compreensão e suporte instrumental para realização deste projeto.
Ao Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São José do Rio
Preto, UNESP, por ter sido parte integrante e fundamental em minha vida nestes
últimos dez anos.
Aos meus grandes amigos Gustavo e Lilian que mesmo à distância se fizeram
presentes com palavras de incentivo, sempre compreendendo as minhas ausências.
Aos meus pais, Romualdo e Lúcia, que com muito amor, dedicação e
empenho possibilitaram a realização de mais esta etapa da minha vida.
À minha irmã Isabella pela amizade, paciência e revisão gramatical.
À minha esposa Juliana e à minha filha Lara, pelo amor incondicional sendo
fontes de inspiração constantes em minha vida.
Ao Deus Pai, todo poderoso, por ter me concedido o dom da vida, permitindo
que trilhasse com dignidade mais uma etapa da minha vida.
“Penso que cumprir a vida seja simplesmente
compreender a marcha, e ir tocando em frente...
Cada um de nós compõe a sua própria história, e
cada ser em si, carrega o dom de ser capaz...
De ser feliz”. (Renato Teixeira e Almir Sater)
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“A realização complexa de qualquer célula viva é parte e parcela do fato de
que qualquer célula representa um evento mais histórico que físico. Essas coisas
complexas não surgem todo dia por geração espontânea da matéria não viva; se o
fizessem,
elas realmente seriam fenômenos reprodutíveis e atemporais,
comparáveis à cristalização de uma solução e seriam um assunto pertinente à
física propriamente dita. Não, qualquer célula viva carrega consigo as
experiências de um bilhão de anos de experimentação pelos seus ancestrais. Não
se pode querer explicar uma entidade tão complexa em algumas simples
palavras”.
Max Delbrück
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RESUMO
TORRES, F.R. Estudo do polimorfismo de hemoglobinas em populações brasileiras
de áreas endêmicas de Malária. São José do Rio Preto, 2005. 157p. Tese (Doutorado
em Genética) – Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Universidade
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”.
Neste trabalho, através dos estudos com populações da região norte do país,
pretendeu-se relacionar a distribuição das hemoglobinopatias com a malária bem
como avaliar a freqüência das mutações H63D e C282Y do gene HFE, em dois
grupos de estudo: o grupo dos doadores de sangue, sem histórico de infecção
malárica, provenientes dos hemocentros de quatro estados da região norte do Brasil,
um grupo controle externo ao da Amazônia legal, e o grupo constituído por pacientes
maláricos. Os polimorfismos de hemoglobinas foram avaliados por HPLC e por
técnicas laboratoriais clássicas, e as duas mutações no gene HFE por PCR-RFLP. As
populações do norte do país apresentaram alta incidência de alfa talassemia, mas não
ocorreram diferenças significativas entre doadores e maláricos. Também não
ocorreram diferenças significativas nas médias de HbA2, porém para as médias de
HbF do Pará e Rondônia, as diferenças foram significativas entre os dois grupos,
sugerindo a influência do efeito malárico nestas populações. A média de
reticulócitos, significativamente reduzidos, nos doadores da região norte pode sugerir
uma estratégia adaptativa destas populações ao ataque parasitário do Plasmodium.
Quanto à análise do polimorfismo do gene HFE, a maioria dos indivíduos
apresentaram o alelo H63D em heterozigose em ambos os grupos de estudo. No
grupo de doadores a maior freqüência do alelo H63D ocorreu em indivíduos
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caucasóides de todos os estados avaliados. No grupo malárico, Rondônia apresentou
maior freqüência do alelo H63D entre os indivíduos não-caucasóides. Nos demais
estados e no grupo malárico, o alelo H63D foi o mais freqüente entre os indivíduos
caucasóides. Os resultados obtidos sugerem que a manutenção do polimorfismo das
mutações no gene HFE pode ser explicada por outros fatores seletivos, que não a
malária, ou por simples flutuação alélica ocorrida pelo constante fluxo entre os
grupos populacionais do Brasil.
Palavras-chave: polimorfismo de hemoglobinas; malária; reticulócitos; Hb F;
Hemocromatose hereditária (HH); polimorfismo do gene HFE; freqüência alélica;
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ABSTRACT
TORRES, F.R. Study of Hemoglobin polymorphism in Brazilian populational group
of endemic area. São José do Rio Preto, 2005. 157p. Tese (Doutorado em Genética)
– Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Universidade Estadual Paulista
“Júlio de Mesquita Filho”.
Through the studies with populations of the north area of the country, we intended to
relate the distribution of the eritrocytics diseases with malaria as well as to evaluate
the incidence of the mutations in the HFE gene H63D and C282Y, in two study
groups: the blood donor group, without report of malarica infection, from the blood
banks of four states in the north area of Brazil, a external control group to the
Amazonian legal area, and the group constituted by malaric patients. The
hemoglobins polymorphisms were obtained by HPLC and techniques laboratorial
and, the two mutations in the HFE gene by PCR - RFLP. The populations of the
north region presented high frequency of alpha talassemia but they didn't happen
significant differences between blood donors and malaric patients. They didn't also
happen significant differences in the averages of HbA2, however, for the averages of
HbF from Pará and Rondônia, the differences were significant among the two
groups, suggesting the influence of the malaric effect in these populations. The
reticulocytes average significantly reduced in the blood donors from north region can
suggest a adaptative strategy of these populations to the parasitic attack of
Plasmodium. Most of the individuals presented the alelo H63D in heterozigose for
the HFE gene in both study groups. In the blood donors group the largest frequency
of the alele H63D happened in caucasians of all the appraised states. In the malaric
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group, Rondônia presented high frequency of the H63D alele among the non
caucasians. For other states and in the group malárico, the H63D alele was the most
frequent among the caucasians. The results obtained suggest that the polymorphism
maintenance for the mutations in the gene HFE can be explained by other selective
factors, that no the malaria, or for simple alelic oscillation happened by the constant
flow among the population groups in Brazil.
Key words: hemoglobin polymorphism; malaria; reticulocytes; Hb F; hereditary
hemochromatosis (HH); polymorphism HFE gene; allelic frequency.
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SUMÁRIO
Capítulo 1 –Introdução..............................................................................................13
Capítulo 2 – Material e Métodos...............................................................................25
Capítulo 3 - Avaliação de Hb A2 E Hb F em doadores de sangue de região
malarígena da Amazônia Oriental Brasileira por HPLC ...........................................46
Capítulo 4 - Hemoglobinas humanas – hipótese malária ou efeito materno?...........52
Capítulo 5 - Estudo do polimorfismo de hemoglobinas em populações brasileiras de
áreas endêmicas para Malária.....................................................................................79
Capítulo 6 - Estudo do polimorfismo do gene HFE em grupos populacionais da
Amazônia brasileira..................................................................................................103
Capítulo 7 - Identificação de Hb B2 em dois caucasianos da região Amazônica
Legal por procedimentos eletroforéticos e cromatográficos.....................................122
Capítulo 8 - Hemoglobina I-Filadelfia [alfa 16 (A14) LYS→ GLU] em doador de
sangue do estado do Acre, Brasil..............................................................................131
Capítulo 9 – CONCLUSÕES..................................................................................139
Referências..............................................................................................................142
Anexo I.....................................................................................................................152
Anexo II....................................................................................................................154
AnexoIII .................................................................................................................156
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INTRODUÇÃO
Capítulo Um
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Introdução
As doenças infecciosas e parasitárias são um grande problema de saúde
pública, e sua prevalência, bem como os mecanismos de suscetibilidade aos
diferentes agentes infecciosos que acometem a população nacional, são pouco
conhecidos.
Vários estudos correlacionam a alta incidência das alterações hemoglobínicas
em determinadas áreas do mundo, principalmente na África, com os locais
endêmicos da malária, em um modelo evolutivo que indica a manutenção desses
polimorfismos nas populações humanas. No Brasil, pouco se conhece sobre a real
distribuição das alterações de hemoglobinas em áreas endêmicas da malária,
considerando a influência da intensa migração interna na flutuação das freqüências
de diferentes alterações de hemoglobinas em cada grupo populacional.
Portanto, através de estudos com populações da região norte do país, onde a
malária é endêmica, pretendeu-se relacionar a distribuição dessa doença com a
presença de polimorfismos de hemoglobinas e do gene HFE. Tais questões motivam
a investigação, uma vez que o conhecimento desses processos permite a criação de
estratégias efetivas de prevenção, controle e tratamento dessas doenças, contribuindo
para a melhoria da qualidade de vida dos grupos populacionais envolvidos e
conhecimento dos polimorfismos genéticos na população brasileira.
A hemoglobina é o pigmento que dá a coloração vermelha ao sangue,
representando mais de 95% das proteínas solúveis contidas nos eritrócitos. Sua
função primária é o transporte de oxigênio dos alvéolos capilares dos pulmões para
os tecidos (Weatherall e Clegg, 1999). A molécula da hemoglobina é uma proteína
globular composta por quatro globinas associadas a grupos heme, complexo formado
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por um átomo de ferro em uma estrutura porfirínica. As subunidades da hemoglobina
são codificadas por genes do tipo α e tipo β que são expressos seqüencialmente
durante o desenvolvimento. Os genes do agrupamento α estão localizados no braço
curto do cromossomo 16, enquanto os genes do agrupamento β localizam-se no
braço curto do cromossomo 11 (Antonarakis, et al., 1985).
Nos estágios embrionários iniciais o tetrâmero de hemoglobina Gower 1,
consiste de duas cadeia epsílon e duas zeta. Aproximadamente no início da oitava
semana de gestação estas cadeias são gradualmente substituídas pelas cadeias alfa
adulta e duas diferentes cadeias tipo beta, designadas Gã e Aã que diferem somente
na presença da glicina ou alanina na posição 136, respectivamente. Durante o
período de transição entre o estágio embrionário e fetais Hb Gower 2 (α2å2) e Hb
Portland (æ2ã2) são detectadas. A Hb F (α2ã2) torna-se a hemoglobina predominante
ao longo do período fetal restante. Após o nascimento, as cadeias gama globina são
gradualmente substituídas pelas cadeias beta e delta globínicas. Por volta do sexto
mês após o nascimento 97%-98% da hemoglobina é formada pelo tetrâmero α2β2
(Hb A), enquanto a Hb A2 (α2ä2) está presente em aproximadamente 2% a 3%.
Pequenas quantidades de Hb F também são encontradas no sangue adulto (Maniatis
et al., 1980).
As anormalidades resultantes de mutações nos genes das globinas são
tradicionalmente divididas em três principais categorias: variantes estruturais,
talassemias e persistência hereditária da hemoglobina fetal (PHHF). A maioria das
mutações pode ser facilmente classificada em um destes grupos, embora algumas
estejam associadas com características fenotípicas aplicadas a mais de uma categoria.
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Por exemplo, algumas das variantes estruturais e pelo menos uma forma de PHHF
são expressas hematologicamente como talassemias (Hardison et al., 2005).
Entre as mutações associadas com globinas estruturais, a maioria é devida ao
resultado de substituição de um único par de base, sendo que grande parte destas
mutações são expressas pela síntese anormal de cadeias globínicas pela substituição
de um dos seus aminoácidos. As variantes estruturais são divididas em três classes,
de acordo com o fenótipo clínico: variantes que causam anemia hemolítica, como por
exemplo, as hemoglobinas
S (Hb S) e C (Hb C); variantes com transporte de
oxigênio alterado, como a metahemoglobina (Hb M), e as hemoglobinas variantes
com fenótipos de talassemia, como por exemplo, hemoglobina E (Hb E).
Nas talassemias ocorre a redução na síntese de uma ou mais cadeias
globínicas, desequilibrando as quantidades relativas entre os tipos alfa e beta, e
levando a uma distorção na proporção de cadeias. A cadeia que é produzida em taxa
normal, está em excesso relativo, devido à ausência de uma cadeia complementar
com a qual possa formar um tetrâmero viável. As cadeias normais em excesso se
precipitam na célula, lesando a membrana e provocando destruição prematura da
hemácia. Os defeitos que originam talassemias podem ser decorrentes de mutações e
grandes deleções. (Thompson et al., 1991).
Várias deleções no gene β ou mutações pontuais nos promotores do gene ã
causam estado clínico benigno, denominado persistência hereditária da hemoglobina
fetal. Na PHHF a síntese das cadeias alfa e gama permanecem durante toda a fase
adulta em taxas aproximadamente iguais, aumentando os níveis de Hb F no sangue
periférico (Garner et al., 1998).
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Até 1998, 750 variantes de hemoglobinas estruturais tinham sido
identificadas. Mais de 75% delas devido a uma única substituição de aminoácido na
cadeia da alfa ou beta globina, representando cerca de 20% das 2.600 mudanças
teóricas que poderiam ocorrer nos genes das globinas (Hardison et al., 2005).
Algumas variantes estruturais das hemoglobinas são prejudiciais, devido à
substituição do aminoácido alterar a função ou estabilidade da molécula, resultando
em quadro clínico bem definido. As variantes de hemoglobinas mais freqüentes
observadas na população brasileira são as Hb S, Hb C e Hb D (Leoneli et al., 2000).
A hemoglobina S, a mais freqüente das variantes, é formada pela substituição
de um aminoácido na cadeia beta, na posição seis, onde o glutamato (GAG) é
substituído pela valina (GTG). Em homozigose ambos os genes codificam as cadeias
beta S, e neste caso, Hb A não está presente devido à falta do alelo normal. O
portador apresenta sintomas clínicos evidentes. Os heterozigotos para Hb S têm um
único alelo alterado, o outro gene da cadeia beta codifica uma cadeia beta A normal,
resultando no traço falciforme, que geralmente são assintomáticos (Weatherall e
Clegg, 1999; Steinberg e Adams, 1978). A anemia falciforme é caracterizada por
uma notável variabilidade entre os indivíduos afetados. Fatores que modificam a
concentração intraeritrocitária da Hb S podem influenciar a expressão clínica da
doença, como a quantidade e composição da Hb F e a associação da Hb S com
outras variantes estruturais, talassemias do tipo alfa e beta, além de fatores
ambientais (Weatherall, 2001).
Estudos antropológicos associados às análises bio-moleculares sugerem que o
gene anormal para a síntese da globina S tenha primeiramente ocorrido entre os
períodos Paleolítico e Mesolítico, aproximadamente 50 a 100 mil anos, na região
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centro-oeste da África, Índia e leste da Ásia. Admite-se, portanto, que a origem da
HbS foi multirregional, atingindo populações com diferentes haplótipos e, por essa
razão, certamente é possível entender a diversidade clínica que se observa entre os
pacientes com a doença falciforme (Naoum e Bonini-Domingos, 1997).
Por meio de seis diferentes enzimas de restrição (Hinc I, Hinc III, Xnm I, Hinf
I, Hpa I e Bam HI) é possível identificar os cinco haplótipos para o gene βS,
classificados conforme a origem geográfica em: Asiático (ou Indiano-Asiático),
Senegal, Benin, Banto e Camarões. Tal prevalência geográfica dos genes βS
associados com os haplótipos específicos tem sugerido a origem independente das
mutações βS também no Brasil. A maioria dos cromossomos com o gene βS tem um
dos cinco haplótipos comuns, mas em alguns pacientes (5% - 10%) podem ser
encontrados haplótipos menos comuns usualmente denominados como haplótipos
atípicos. Estes haplótipos são provavelmente gerados por uma variedade de
mecanismos genéticos como mutações em ponto nos sítios de restrições, simples ou
duplas trocas entre dois haplótipos βS típicos ou, mais freqüentemente, associação
entre um haplótipo βs típico e um haplótipo βA diferente, que está presente na
população e ainda, por conversões gênicas (Zago et at., 2000).
A expressão fenotípica das hemoglobinas é influenciada por fatores
ambientais e/ou genéticos, co-herdados com os defeitos de hemoglobinas
(Weatherall e Clegg, 1999). Dentre os fatores genéticos que podem influenciar a
expressão fenotípica das variantes de hemoglobinas destacam-se a co-herança com
os mutantes de hemocromatose hereditária, C282Y e H63D, e a deficiência de
G6PD.
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A hemocromatose é caracterizada por excessiva absorção do ferro na dieta e
progressiva deposição deste metal no parênquima celular de órgãos como fígado,
pâncreas e coração. A hemocromatose hereditária é uma doença genética, hereditária,
freqüente na população caucasiana, atingindo uma pessoa em cada 10 na região do
Mediterrâneo. Quando não tratada, a hemocromatose pode levar a complicações
fisiológicas como diabetes mellitus, cardiopatia, cirrose hepática seguida de
carcinoma hepatocelular e morte precoce (Le Gac et al., 2000; Gochee e Poweel,
2001). A identificação do gene HFE para a hemocromatose hereditária, em 1996,
forneceu algumas hipóteses para essa patogênese e duas mutações foram
caracterizadas: C282Y e H63D. A mutação C282Y é uma transição G→ A, que altera
o aminoácido 282 de cisteína para tirosina e a mutação H63D é uma transversão
C→ G, que altera o aminoácido 63 de histidina para ácido aspártico.
A freqüência destas mutações tem sido avaliada em diferentes grupos
populacionais e relacionada ao aumento de suscetibilidade a algumas doenças infecto
parasitárias (Beutler et al, 2001). A hemocromatose hereditária pode interferir
também na sintomalogia dessas doenças, sendo que indivíduos portadores de
hemocromatose apresentam predisposição a certas infecções causadas por patógenos
como Listeria e o vírus da hepatite C. Para Moalem et al. (2001), os baixos níveis de
ferro nos macrófagos, em pacientes com hemocromatose hereditária, conferiria certa
resistência à infecção de determinadas doenças.
As freqüências das mutações H63D e C282Y em diferentes populações
também são associadas a alterações de hemoglobinas, como as talassemias (Pippard
e Wainscoat, 1987). Segundo Melis et al. (2002), indivíduos portadores de beta
talassemia, que são homozigotos para H63D, tem níveis de ferro aumentado quando
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comparados à indivíduos beta talassêmicos homozigotos normais (H/H), sugerindo
que a mutação H63D pode ter um efeito modulador na absorção de ferro.
As hemoglobinopatias têm provido uma das poucas demonstrações
convincentes da seleção, influenciando a freqüência de único gene na população
humana. A alta freqüência de desordens, tal como a anemia falciforme e a beta
talassemia, que ocorrem em áreas subtropicais ou tropicais dentro do cinturão da
malária, levou Haldane, a propor que a malária pode ser o agente seletivo
responsável, balanceando a perda dos genes para anemia falciforme e talassemias por
morte prematura dos homozigotos, com o aumento do valor adaptativo dos
heterozigotos no ambiente com malária (Flint et al., 1986). O valor adaptativo dos
indivíduos homozigotos para a anemia falciforme (Hb SS), diminuiria pela morte
associada com a presença das células falcêmicas. Os indivíduos homozigotos
normais (Hb AA) deveriam ser mais afetados que os indivíduos heterozigotos (Hb
AS), pelos efeitos da malária. Parece que a vantagem dos indivíduos com Hb AS
sobre os com Hb AA, na resistência à malária ocorre especialmente no início da
infância, antes da criança desenvolver imunidade para seu próprio anticorpo
(Edelstein, 1986).
Friedman e Trager (1981), fizeram uma revisão sobre o mecanismo que
envolve a resistência das células falcêmicas à malária. Segundo os autores, as células
Hb S infectadas pelo P. falciparum, desenvolvem modificações na membrana que as
levam a aderirem no endotélio dos pequenos vasos sangüíneos. Com a baixa
concentração de oxigênio nas células falcêmicas, ocorrem perfurações nas
membranas dos parasitas e das células vermelhas, devido à perda de potássio.
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A capacidade de proteção do hospedeiro frente à infecção malárica não é
determinada somente por mecanismos físicos e imunológicos, mas também por
características inatas, freqüentemente herdadas com padrão mendeliano. Entretanto,
sua freqüência não decorre da exposição individual à infecção. Em termos
evolutivos, a pressão seletiva dessa doença em populações humanas, afeta
profundamente a distribuição e a freqüência das características que conferem
resistência. A resistência inata para os estágios assexuais sangüíneos do parasita
pode atuar em nível de membrana eritrocítica, dentro do eritrócito ou no plasma,
limitando a capacidade de multiplicação do parasita (Milller e Carter, 1976).
A maioria dos genes selecionados pela malária é de defeitos hereditários das
células vermelhas, como a anemia falciforme, Hb C e Hb E, talassemias e deficiência
de G6PD (Nagel, 2002). Joishy et al. (1988) mostraram que a freqüência de malária
causada pelo P. falciparum na Índia, é menor em indivíduos com traço falciforme do
que em indivíduos normais. Chotivanich et al. (2002) encontraram parcial inibição
ao crescimento do parasita em indivíduos portadores de Hb E, sugerindo que
indivíduos homozigotos Hb EE e Hb E/ beta talassemia podem representar uma
alternativa anti - P. falciparum. In vitro, iniciando a parasitemia a 1%, o P.
falciparum invade preferencialmente eritrócitos com hemoglobinas normais quando
comparado com eritrócitos com hemoglobina anormais do tipo Hb AH, Hb AE, Hb
EE, Hb C/S e Hb E/beta talassemia (Chotivanich et al., 2002). Em termos evolutivos,
a exposição humana para malária é bastante recente e, é provável, que pacientes com
alterações hemoglobinícas em diferentes partes do mundo, tenham constituições
genéticas diferentes com respeito à suscetibilidade para a malária e uma gama
extensa de outros organismos (Weatherall, 2004).
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Nas áreas de alta transmissão para malária na África e Ásia, observa-se a
complexidade da imunidade, naturalmente adquirida pelo homem contra o plasmódio
e a dinâmica relação parasito-hospedeiro que se desenvolve nos indivíduos constante
e cronicamente expostos à doença. Nestas áreas, onde o P. falciparum é
predominante, os recém-nascidos são protegidos da malária grave durante os seis
primeiros meses de vida. A transferência de anticorpos maternos é considerada um
os fatores responsáveis pela resistência do recém-nascido, que pode também estar
envolvida com a presença de eritrócitos contendo grandes quantidades de Hb F,
gerando um microambiente desfavorável ao crescimento parasitário (Druilhe e
Perigon, 1994; Dubois e Pereira, 1995). Em ratos transgênicos a Hb F parece prover
uma proteção ao P. falciparum pelo retardo no crescimento do parasita (Shear et al.,
1993). Estudos in vitro (Pasvol et al., 1977) têm indicado que o crescimento do P.
falciparum em células contendo Hb F é retardado, mas a invasão é aumentada em
recém-nascidos. Hannah et al. (1998) também mostraram que a Hb F pode conferir
proteção ao P. Falciparum pelo retardo ao crescimento do parasita devido a alta
estabilidade do tetrâmero α2γ2.
Das quatro espécies de parasita que podem infectar seres humanos, o P. vivax
tem sido o mais freqüente nos últimos sete anos no Brasil (Machado e Póvoa, 2000).
Embora a proteína que circunda o esporozoíto (CSP) seja o principal alvo no
desenvolvimento de uma vacina, estes estudos necessitam de uma reavaliação,
devido à descoberta de variações na seqüência repetitiva da porção central da CSP.
Em 1989, foi descrita uma forma variante do P. vivax (VK247) na Tailândia, e
posteriormente foi reportada a presença de um parasita,
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P. vivax-like,
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morfologicamente semelhante ao P. vivax (VK210), mas com a seqüência repetitiva
da porção central da CSP diferente das duas formas descritas anteriormente.
Vários estudos têm mostrado a distribuição global destas variantes (Qari et
al., 1993) e, no Brasil, por meio de testes sorológicos, foram detectadas as três
formas em amostras do estado de São Paulo (Curado et al., 1997) e em comunidades
indígenas da Amazônia (Arruda et al., 1996). Machado e Póvoa (2000), por meio de
técnicas moleculares, também detectaram as três variantes genéticas deste parasita na
Amazônia brasileira, onde o VK210 foi encontrado em infecções simples e mistas
com as outras duas variantes, enquanto que o VK247 e o P. vivax-like foram
detectados apenas em infecções mistas. Observaram também, que o P. vivax-like está
correlacionado com parasitemias menores, e o VK210 com níveis aumentados de
parasitemia. A existência dessas variantes genéticas pode determinar diferentes
características na intensidade dos sintomas, na resposta ao tratamento e preferência
ao vetor, podendo gerar resistência a drogas e falhas nas medidas de controle tendo,
portanto, importante implicação para o diagnóstico (Curado et al., 1997).
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Objetivos
O presente trabalho teve como objetivo geral relacionar a freqüência dos
polimorfismos de hemoglobinas e do gene HFE em indivíduos com e sem malária da
região norte do Brasil.
Objetivos específicos:
1. Avaliar o polimorfismo de hemoglobinas obtido por cromatografia
Líquida de alta resolução (HPLC) e métodos laboratoriais clássicos;
confirmar os defeitos estruturais de Hb S e Hb C por PCR-RFLP.
2. Avaliar a freqüência dos mutantes C282Y e H63D para o gene HFE;
3. Comparar os resultados obtidos para os polimorfismos nos dois grupos de
estudo e traçar o perfil genotípico dos portadores de malária da região
Amazônica legal.
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MATERIAL E MÉTODOS
Capítulo Dois
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Material e métodos
1. Amostras
A coleta das amostras foi efetivada após explicação detalhada dos objetivos
do trabalho e assinatura em termo de consentimento (anexo 1) pelos participantes.
Uma ficha de identificação foi preenchida para cada indivíduo (anexo 2) contendo os
dados pessoais, história da infecção atual e registro de infecção pregressa. Foram
coletados 5 ml de sangue venoso em tubo contendo EDTA e sob refrigeração até o
envio ao LHGDH para análise, onde cada participante recebeu um código para
preservar sua identidade. O presente projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa da FAMERP e pela CONEP com registro número 5386/2002 (anexo 3).
Foram analisadas amostras de sangue de 397 doadores sem histórico de
infecção malárica confirmados por teste de gota espessa, provenientes dos
hemocentros de quatro cidades da região norte do Brasil, todas localizadas na
Amazônia Legal brasileira, sendo 99 no Acre, 99 Amapá, 99 Pará e 100 Rondônia.
Como grupo controle externo ao da Amazônia legal foram utilizadas amostras de 124
doadores de São José do Rio Preto (SP). Foram coletados 100 amostras de sangue em
pacientes maláricos, das regiões de Belém (PA) e Macapá (AP), 75 de Porto Velho
(RO) e 51 de Rio Branco (AC) totalizando 326 pacientes. No total foram avaliadas
847 amostras de sangue.
2. Testes de Triagem Laboratorial para Hemoglobinas
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Os procedimentos laboratoriais utilizados para avaliar os polimorfismos de
hemoglobinas foram realizados segundo protocolos estabelecidos no LHGDH,
destacados abaixo e disponíveis em www.lhgdh.ibilce.unesp.br.
2.1 Resistência Globular Osmótica em Cloreto de Sódio a 0,36% (Silvestroni e
Bianco, 1975)
Técnica utilizada para detectar talassemias do tipo beta principalmente na
forma heterozigota, pois nesses casos os eritrócitos microcíticos são mais resistentes
à hemólise nesta solução. A resistência globular não é específica para talassemia beta
heterozigota, já que resultados positivos são encontrados também em anemias
carenciais e outras hemoglobinopatias, como nos heterozigotos para hemoglobina C.
No entanto cerca de 97% dos portadores de talassemia beta heterozigota apresentam
positividade para esse teste.
Procedimento:
Em tubo de hemólise foram colocados 1,5 ml de solução de NaCl a 0,36% e
10µl de sangue total. Em seguida, o tubo foi agitado suavemente por inversão e
mantido em repouso por 10 minutos. Para a análise o tubo foi colocado em frente a
um papel branco com linha negras o que permitiu distinguir os testes positivos pela
opacidade da reação.
Reagentes:
Solução estoque - NaCl a 10% - pH 7,4
NaCl
9,0 g
Na2HPO4
1,36g
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NaH2PO4.H2O
0,28g
Água destilada q.s.p
100mL
Solução trabalho
NaCl 10%
36 mL
Água destilada q.s.p
1000mL
2.2. Análise, a Fresco, da Morfologia Eritrocitária (Bonini-Domingos, 1993)
Em esfregaço sanguíneo a fresco analisa-se o tamanho, a forma e a
quantidade de Hb nos eritrócitos. Os indivíduos portadores de talassemia beta
heterozigota
apresentam moderada
anisopoiquilocitose
com prevalência
de
microcitose e hipocromia, facilmente visualizadas ao microscópio óptico. Os
resultados podem ser divulgados da seguinte maneira, segundo padronização do
LHGDH para cada um dos parâmetros avaliados: alterações discretas (+), alterações
moderadas (++), alterações acentuadas (+++) e células normais (N).
2.3. Eletroforese em pH Alcalino (Marengo-Rowe, 1965, com modificações)
É uma técnica utilizada para qualificação e quantificação de hemoglobinas
normais e grande parte das anormais. As diferentes mobilidades eletroforéticas das
hemoglobinas anormais são originadas por alteração de carga elétrica, causada por
substituições de aminoácidos diferentes nas cadeias formadoras das moléculas. As
hemoglobinas anormais que se originam de mutações onde não ocorre mudança de
carga elétrica, migram na posição de Hb A. Nestes casos para a caracterização dessas
hemoglobinas, usam-se outros processos eletroforéticos.
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Procedimento:
Para a preparação da eletroforese em pH Alcalino foram colocadas iguais
quantidades de solução tampão em cada compartimento da cuba de eletroforese e as
fitas de acetato de celulose embebidas por 15 minutos em tampão TEB pH 8,5. Em
seguida, as fitas foram secas com papel absorvente e colocadas na cuba. As amostras
de hemoglobinas, previamente hemolisadas com saponina 1%, foram aplicadas a
1,0cm da extremidade da fita que está em contato com o pólo negativo e submetidas
a uma corrente de 300V por 40 minutos.
Após a análise da corrida eletroforética, sem coloração, as tiras foram
embebidas em Ponceau por 15 minutos e descoradas por 3 a 5 minutos e solução de
ácido acético 10%. A análise foi feita comparando-se o perfil de migração das
amostras com mapas de padrões específicos.
Reagentes:
Tampão TRIS-EDTA-BORATO (TEB) pH 8,6
Tris hidroximetil aminometano
10,2 g
Ácido etilenodiaminotetracético
0,6 g
Ácido Bórico
3,2 g
Água destilada q.s.p
1000 mL
Conservar em geladeira
Corantes:
Ponceau
Ponceau S
0,5 g
Ácido tricloroacético
5,0 g
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Água destilada q.s.p
100 mL
Solução descorante:
Ácido acético glacial.
100 mL
Metanol
50 mL
Água destilada q.s.p
1000 mL
Reativo hemolisante:
Saponina P.A.
1g
Água destilada
100 mL
3. Testes Complementares
Os resultados obtidos nos testes de triagem determinaram os testes
complementares para caracterização das hemoglobinas segundo a suspeita, em
variantes ou talassemias.
3.1. Pesquisa de corpúsculos de Heinz e agregados de hemoglobina H
(Papayannopoulos e Stamatayannopoulos, 1974)
Os corpúsculos de inclusão de hemoglobina H são formados por cadeias beta
oriundas da desnaturação do tetrâmero. Após coloração esses corpúsculos
apresentam-se dispostos homogeneamente no interior dos eritrócitos como pequenos
pontos azulados.
Procedimento:
Foi colocado 50 µl de sangue total em tubo de ensaio, adicionado 50 µl de
solução de azul Cresil brilhante. Em seguida, o tubo foi agitado suavemente. O
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material foi incubado a 37ºC por 30 minutos e 60 minutos. Após este tempo, foram
realizados finos esfregaços em lâminas de vidro para exame em microscópio óptico
com objetiva de imersão.
Reagentes:
Solução salina:
Cloreto de sódio
Água destilada q.s.p.
0,9 g
100 mL
Solução citrato:
Citrato de sódio
Água destilada q.s.p.
2,2 g
100 mL
Solução de Azul Cresil Brilhante:
Azul Cresil brilhante
1,0 g
Solução salina
100 mL
Solução citrato
25 mL
3.2. Eletroforese em acetato de celulose pH neutro (Dacie e Lewis, 1985)
É uma técnica utilizada para identificação e quantificação das hemoglobinas
H e Bart’s, que apresentam perfil de migração em pH alcalino similar a proteínas
plasmáticas.
Procedimento:
As fitas de acetato de celulose foram embebidas por quinze minutos, em
tampão fosfato pH neutro e, após este período secas entre folhas de papel absorvente.
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Em seguida, foram conectadas com os compartimentos eletrolíticos da cuba com o
mesmo tampão de embebimento, através de tiras de papel mata borrão ou perfex.
As amostras de sangue hemolisadas foram aplicadas a 1,0cm da extremidade da fita
que estava em contato com o pólo negativo. A corrente utilizada foi de 300V por 30
minutos.
Reagentes:
Tampão fosfato pH neutro
KH2PO4
3,11 g
Na2HPO4
1,66 g
Água destilada q.s.p.
1000 mL
Conservar em geladeira
3.3. Eletroforese de diferenciação em ágar-fosfato, pH 6,2 (Vella, 1968)
A eletroforese em gel de ágar-fosfato pH 6,2 é específica para diferenciar
alguns tipos de hemoglobinas mais lentas que a Hb A, como por exemplo: Hb S e Hb
D; Hb C e Hb E que em eletroforese alcalina, migram em posições semelhantes,
dificultando a correta identificação. Por este método, as Hb S e Hb C se separam da
Hb A, enquanto as Hb D e Hb E migram na mesma posição da Hb A. Esse método
permite também a caracterização semi-quantitativa de hemoglobina fetal.
Procedimento:
Em um erlenmeyer de 250 mL foram aquecidos os componentes do gel de
ágar-fosfato até completa dissolução. Em seguida, foi pipetado 5,0 mL do gel em
lâminas de microscopia e gelificado à temperatura ambiente.
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As amostras foram aplicadas na porção média da lâmina, inserindo-se o
aplicador com cuidado para não partir totalmente o gel. As conexões com os
compartimentos eletrolíticos foi realizada com folhas duplas de papel de filtro. A
corrente aplicada foi de 100V por 30 minutos. A primeira análise foi realizada sem
coloração e, em seguida, a lâmina foi corada com Ponceau ou Negro de Amido.
Reagentes:
Tampão Fosfato pH 6,2 - Para uso nos compartimentos eletrolíticos e
confecção do gel.
Na2HPO4
2,02 g
NaH2PO4.H2O
7,66 g
Água destilada q.s.p
1000 mL
Conservar em geladeira
Gel de Ágar-Fosfato
Ágar-agar
500 mg
Tampão fosfato pH 6,2
25 mL
3.4. Contagem de Reticulócitos (Dacie e Lewis, 1985)
A fase jovem do eritrócito, indicativa de produção medular para reposição de
perdas fisiológicas ou não. Os valores percentuais expressam a atividade de
reposição. Foram utilizados os mesmos reagentes da pesquisa de corpos de Hb H e
Heinz, porém, a análise foi efetuada com 10 minutos de incubação, evidenciando
apenas os reticulócitos.
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3.5. Eletroforese de Cadeias Polipeptídicas
A caracterização estrutural das hemoglobinas anormais é realizada em
condições especiais, devido ao custo e às dificuldades inerentes aos métodos
utilizados. Para dar seqüência ao estudo de uma hemoglobina anormal não
identificável pelos métodos de qualificação e quantificação, utiliza-se a eletroforese
de cadeias polipeptídicas. A separação eletroforética de cadeias globínicas constitui
uma análise pré-molecular, muitas vezes conclusiva para o diagnóstico de
hemoglobina anormal, sem que haja necessidade de se aplicar métodos de disposição
bidimensional de peptídeos e análises de aminoácidos, ou biologia molecular.
3.5.1. Em pH Alcalino (Schneider, 1974, com modificações)
Reagentes:
Tampão Tris-EDTA-borato pH 8,6
Corante Negro de Amido
Uréia
2-mercaptoetanol
Procedimento:
-
No dia anterior ao teste preparar o tampão trabalho, misturando 36 g de
uréia e 70 mL de tampão Tris-EDTA-borato pH 8,6 (tampão Tris-uréia),
em um "becker". Deixar a solução homogeneizando em agitador
magnético, até o momento do uso, em temperatura ambiente. O tempo de
dissolução deve ser superior a 12 horas.
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-
Preparar as amostras misturando 50 mL do tampão Tris-uréia, 50 mL de
2-mercaptoetanol e 50 mL de hemolisado preparado com clorofórmio, em
um pequeno tubo. Deixar em repouso por 1hora à temperatura ambiente.
-
Adicionar 6,4 mL de 2-mercaptoetanol ao tampão Tris-uréia restante,
misturar bem e colocar a solução tampão Tris-uréia-mercaptoetanol nos
compartimentos eletrolíticos, reservar quantidade suficiente dessa solução
para embebimento do acetato de celulose por 1 hora.
-
Retirar o excesso da solução tampão do acetato entre duas folhas de papel
de filtro e colocá-lo bem esticado na cuba de eletroforese, fazendo
conexões com os compartimentos eletrolíticos com papel filtro duplo.
-
Aplicar as amostras na porção superior do acetato, próximo ao pólo
positivo da cuba.
-
Passar 110 volts por 40 minutos; após este tempo alterar a Voltagem para
220 volts e deixar por mais 20 minutos.
-
Corar as fitas com Negro de amido ou outro corante de proteínas. Colocar
em solução descorante.
3.5.2. Em pH Ácido (Alter et. al., 1980)
Segue o mesmo princípio da eletroforese de cadeias globínicas em pH
alcalino, permitindo a separação das frações de globinas por suas afinidades
diferenciadas em pH ácido. Permite boa visualização das globinas gama.
Metodologia bastante precisa para a separação de globinas, podendo também
ser utilizada para quantificação das frações.
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Reagentes:
Solução estoque gel poliacrilamida (60:0,4)
Acrilamida
15 g
Bis- acrilamida
0,1 g
H2O q.s.p.
25 mL
Uréia (8M)
Uréia
H2O q.s.p.
12 g
25 mL
2 – Mercaptoetanol (1M)
2 - Mercaptoetanol
H2O q.s.p.
35 mL
500 mL
Tampão para Corrida – Ácido acético (5%)
Ácido acético glacial
H2O q.s.p.
50 mL
1000 mL
Gel de poliacrilamida (12%)
Solução estoque
2,5 mL
Ácido acético
625 mL
Uréia 8M
Triton X-100
Persulfato de amônio (25%)
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9,375 mL
250 mL
30 mg
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TEMED
100 mL
Tampão de amostra
Uréia 8M
1,25 mL
Ácido acético glacial
125 mL
2- mercaptoetanol
125 mL
Pironina Y
1,0 mg
Preparação do gel de poliacrilamida:
-
Misturar a solução estoque de acrilamida-bisacrilamida (60:0,4%), uréia
8M, ácido acético glacial, persulfato de amônio, TEMED. Colocar a
solução do gel nas placas, previamente limpas e montadas utilizando
espassadores. Após este procedimento introduzir o molde para a formação
das canaletas. Aguardar 30 minutos para a polimerização em temperatura
aproximada de 30ºC.
-
Após polimerização do gel, submeter à 200Volts por 1 hora, com tampão
ácido acético 5% nos compartimentos eletrolíticos e o pólo positivo no
topo. Este procedimento é realizado para homogeneização do pH entre o
gel e o tampão.
-
Trocar o tampão de corrida dos compartimentos eletrolíticos, retirando o
excesso de tampão das canaletas, em seguida aplicar 10 mL de 2 –
mercaptoetanol 1M em cada canaleta e submeter o gel à 150 Volts por 1
hora.
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Preparação da amostra:
-
Centrifugar 100 mL de sangue com solução salina a 0,85%, a 1.500 rpm,
durante 5 minutos e desprezar o sobrenadante. Repetir no mínimo por 4
vezes. Ao volume de eritrócitos lavados, adicionar 10x o volume de água
destilada para romper os eritrócitos e liberar a hemoglobina.
-
Preparar as amostras para aplicação misturando 1,5 mL do hemolisado,
descrito acima, com 10 mL do tampão de amostra.
Procedimento:
-
Após a realização das pré-corridas trocar novamente o tampão de corrida,
aplicar as amostras e submeter a corrente constante de 50mA (200V) por
3 horas.
4. Cromatografia Líquida de Alta Resolução (HPLC) (Huisman, 1986)
A análise de hemoglobinas por HPLC utilizou o sistema automatizado
VARIANT da Bio-RAD e kit de diagnóstico para beta talassemia, que permitiu a
quantificação das Hb A2 e Hb F com precisão. O kit de diagnóstico para beta
talassemia heterozigota (BIO-RAD) utiliza os princípios de cromatografia líquida de
alta resolução (HPLC) associado à cromatografia de troca catiônica. As amostras
hemolisadas são mantidas a 12°± 2ºC em câmara automática, sendo seqüencialmente
injetadas no sistema de fluxo da análise em intervalos de 6,5 minutos.
As duas bombas de êmbolo duplo e uma mistura de tampões de eluição com
controles de gradientes pré-programados passam através da coluna analítica. Quando
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a força iônica da mistura aumenta, mais fortemente as hemoglobinas retidas na
coluna são eluídas .
Um fotômetro, de filtro de comprimento de onda duplo (415 e 690 nm),
monitora a eluição das hemoglobinas da coluna, detectando as alterações de
absorbância a 415 nm. O filtro secundário de 690 nm corrige a linha de base para
efeitos provocados pela mistura dos tampões com forças iônicas diferentes. As
mudanças na absorbância são monitoradas e exibidas no formato de um
cromatograma da absorbância versus tempo. Os dados de análise provenientes do
detector são processados por um integrador embutido e impressos no relatório de
amostras.
Para auxiliar na interpretação de resultados, janelas de eluição têm sido
estabelecidas para as hemoglobinas mais freqüentemente encontradas, baseadas nas
suas características de tempos de retenção. O tempo de retenção é o tempo
transcorrido da injeção da amostra até o ápice do pico de hemoglobina. Cada
hemoglobina tem um tempo de retenção característico. No final de cada análise da
amostra, uma cópia do cromatograma e os dados do relatório são automaticamente
impressos. O relatório inclui a porcentagem da área corrigida para as hemoglobinas
A2 e F de todas as amostras subseqüentes na rotina de trabalho. A interpretação dos
cromatogramas se faz por comparação com padrões fornecidos pelo fabricante.
5. Análises Moleculares
5.1. Protocolo para extração de DNA de glóbulos brancos utilizando método
fenol-clorofórmio (Pena et al., 1991, com modificações)
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O DNA genômico dos indivíduos foi obtido a partir de leucócitos de sangue
periférico, segundo técnica descrita por Pena et al., (1991), com modificações. A
extração foi realizada através de um composto fenol-clorofórmio e precipitação por
etanol, com segue abaixo:
1.Colocar 300 µL de sangue periférico, colhido com EDTA, em tubo tipo
eppendorf de 1,5 mL e completar o volume para 1000 µL com solução de
lise 1;
2. Deixar descansar por 15 minutos e centrifugar 6 minutos em velocidade
baixa;
3. Desprezar o sobrenadante;
4. Acrescentar ao pellet 450 µL de solução de lise 2, agitar no vórtex por 30
segundos, adicionar 25 µL de SDS à 10% e 5 µL de proteinase K 20
mg/mL e homogeneizar;
5. Manter em banho-maria a 37ºC overnight ou 42ºC por 3 horas;
6. Adicionar 500 µL de fenol equilibrado e homogeneizar;
7. Centrifugar 6 minutos a velocidade baixa;
8. Transferir a fase superior para outro tubo e adicionar 500 µL de
clorofórmio/álcool isoamílico na proporção de 24:1;
9. Homogeneizar e centrifugar por 6 minutos a 7.000 rpm;
10.Transferir a fase superior para outro tubo e adicionar novamente 500µL
da solução clorofórmio/álcool isoamílico e homogeneizar.
11. Centrifugar 6 minutos a 7.000 rpm;
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12. Colocar 50 µL de KCl 2M (gelado) em um tubo e transferir o
sobrenadante do outro tubo para este e adicionar 500 µL etanol 100%
(bem gelado). Inverter o tubo várias vezes até precipitar o DNA.
13. Centrifugar 6 minutos a 7.000 rpm;
14. Desprezar o sobrenadante e lavar o DNA, que ficou aderido ao tubo,
com 200 µL etanol 70% (gelado). Deixar secar por 15 minutos;
15. Colocar 25 µL de TBE ou água Mili-Q e manter em banho-maria a 37ºC
por 24 horas, para total solubilização do DNA;
16. Conservar em freezer -20ºC.
Reagentes:
Solução de lise 1 para extração de DNA (lise de células vermelhas)
Sacarose 0,32M
10,95 g
Tris HCl 10 mM
1 mL
MgCl2 5 mM
0,5 mL
Triton 1% (x100)
1 mL
Água mili-Q autoclavada q.s.p.
100 mL
Dissolver bem e armazenar em geladeira.
Solução de lise 2 para extração de DNA (lise de células brancas)
NaCl (0,075 M)
2,19 g
EDTA (0,02 M) (solução estoque pH 8,0)
20 mL
Água mili-Q q.s.p.
500 mL
Autoclavar e armazenar em geladeira.
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Proteinase K (20 mg/mL)
Proteinase K
20 mg
Água mili-Q q.s.p.
1 mL
Conservar em freezer.
Clorofórmio/álcool isoamílico 24:1 (Preparar na hora do uso)
Clorofórmio
Álcool isoamílico
24 mL
1 mL
SDS 20%
SDS
Água mili-Q q.s.p.
20 g
100 mL
5.2. Detecção de variantes hemoglobínicas por reação em cadeia da polimerase
(PCR)
5.2.1. PCR-RFLP para Hb S e C
Para confirmação das amostras com prováveis hemoglobinas S e C foram
realizadas amplificações do DNA genômico utilizando os primers sense P277 (5’
GGC AGA GCC ATC TAT TGC TTA 3’) e anti-sense P278 (5’ ACC TTA GGG
TTG CCC ATA AC 3’). A solução de amplificação continha 10 µM de primers, 1,25
mM de cada desoxinucleotídeo, 10 ng de DNA genômico, 2,0 mM MgCl2, 2,5 µl de
tampão (10x) e 1U de Taq Polimerase em um volume final de 25µl. Os reagentes
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foram submetidos a 94°C por 5 minutos para desnaturação inicial, seguidos de 35
ciclos a 94°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por 1 minuto e uma
extensão final de 72°C por 10 minutos. O produto de amplificação (5µl), foi
submetido à digestão por enzima DdeI para Hb S e BseRI para Hb C a temperatura
de 37°C por 7 horas. A análise do produto da digestão foi realizada em géis de
agarose-EDTA a 1,5% corados com brometo de etídio e visualizados em luz ultravioleta (UV) e fotografados em sistema digitalizado (DigiDoc / Bio-Rad).
5.2.1 Identificação dos mutantes C282Y e H63D para o gene HFE por PCRRFLP
Foram realizadas amplificações para o gene da hemocromatose hereditária
utilizando os primers sense R63 (5’ ATC CCC AGC CTT GTT AAC TG 3’) e o
anti-sense L63 (5’ ACA TGG TTA AGG CCT GTT GC 3’) para a mutação H63D e
os primers sense R282 (5’ CTC AGG CAC TCC TCT CAA CC 3’) e o anti-sense
L282 (5’ GGG TAT TTC CTT CCT CCA ACC 3’) para a mutação C282Y. A
solução de amplificação continha 18 µM de primers, 1,25 mM de cada
desoxinucleotídeo, 10 ng de DNA genômico, 2,0 mM MgCl2, 2,5 µl de tampão (1x)
e 1U de Taq Polimerase em um volume final de 25µl. O mix de amplificação foi
submetido a 94°C por 5 minutos para desnaturação inicial, seguidos de 30 ciclos a
94°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, 72°C por 1 minuto e uma extensão
final de 72°C por 10 minutos. A análise dos produtos amplificados foram realizados
em géis de agarose a 1,5% em tampão TAE e corrida eletroforética a 80V por 12
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minutos. A visualização foi feita com brometo de etídio em luz ultra-violeta (UV) em
sistema DigiDoc/Bio-Rad.
Após a amplificação, os produtos foram submetidos à digestão enzimática
com as enzimas BclI para a mutação H63D e RsaI para a mutação C282Y. As
condições de digestão foram as seguintes para ambas enzimas: 12µl de H2O mili Q
autoclavada, 2,1µl de tampão, 0,7µl (15-10 U/µl) de enzima e 5µl de DNA por 07
horas ou overnight. A temperatura de digestão para BclI foi de 50°C e para RsaI foi
de 37°C. O produto de digestão (10µl) foi aplicado em gel de agarose a 3%. A
corrente aplicada foi de 80V por 30’, com 1,0µl de brometo de etídio, 2µl de tampão
TAE e 3,5µl de padrão eletroforético. A identificação dos alelos mutantes se deu
segundo identificação dos fragmentos como ilustrados na figura 1.
6. Análises Estatísticas
Para avaliar as diferenças nas médias dentro e entre os grupos de estudo foi
utilizado o Teste t de Student e, para comparação das frequências, foi realizado o
teste de proporção (teste binomial). As análises estatísticas foram realizadas no
programa BioEstat 2.0 com nível de significância de 5%.
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PCR-RFLP para a mutação C282Y
441 pb
Amplificado
Digestão com Rsa I a 37o C
Alelo Normal
Alelo Mutante
296 pb
145 pb
296 pb
29 pb
116 pb
PCR-RFLP para a mutação H63D
Amplificado
496 pb
Digestão com BCl I a 50o C
Alelo Normal
358 pb
138 pb
Não digere
Alelo Mutante
496 pb
Figura 1. Padrão de digestão enzimática para as mutações H63D e C282Y do gene para
hemocromatose hereditária.
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AVALIAÇÃO DE Hb A2 E Hb F EM
DOADORES DE SANGUE DE REGIÃO
MALARÍGENA DA AMAZÔNIA
ORIENTAL BRASILEIRA POR HPLC
Capítulo Três
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HEMOGLOBINAS HUMANAS –
HIPÓTESE MALÁRIA OU EFEITO
MATERNO?
Capítulo Quatro
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HEMOGLOBINAS HUMANAS – HIPÓTESE MALÁRIA
OU EFEITO MATERNO?
HUMAN HEMOGLOBINS - MALARIA HYPOTHESIS
OR MATERNAL EFFECT?
MSc. Felipe Rafael Torres – Biólogo, Mestre em Genética1
Prof. Dra. Claudia R. Bonini-Domingos – Bióloga, Doutora em Ciências Biológicas1
1Laboratório de Hemoglobinas e Genética das Doenças Hematológicas –
Departamento de Biologia – UNESP, São José do Rio Preto – SP.
Resumo
As hemoglobinopatias têm provido uma das poucas demonstrações convincentes da
seleção, influenciando a freqüência de único gene na população humana. A alta taxa
de desordens, tais como a anemia falciforme e a beta-talassemia, ocorridas em áreas
subtropicais ou tropicais dentro do cinturão da malária, levou Haldane a propor que a
malária pode ser o agente seletivo responsável que balanceia a perda dos genes para a
talassemia e a anemia falciforme, por morte prematura dos homozigotos a partir do
aumento do valor adaptativo de heterozigotos no ambiente com malária. Mas uma
nova proposta surgiu para explicar a manutenção deste polimorfismo, baseada na
fertilidade diferencial ou efeito parental. Alguns autores observaram uma distorção
favorecendo a transmissão de alelos mutantes em áreas não endêmicas de malária.
Com base nestas observações, esses autores propuseram um efeito materno para
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explicar tais distorções. Este estudo tem como objetivo apresentar uma revisão destes
mecanismos envolvidos na manutenção do polimorfismo de hemoglobinopatias,
desde seu modelo clássico até hipóteses alternativas que surgiram recentemente na
literatura.
Palavras-chave:
hemoglobinopatias;
malária;
polimorfismo
genético;
efeito
materno.
Abstract
The hemoglobinopathies have been providing one of the few convincing
demonstrations of the selection, influencing the frequency of only gene in the human
population. The high rate of disorders, such as the sickle cell anemia and the betathalassemia, happened in areas subtropical or tropical inside of the belt of the
malaria, it took Haldane to propose that the malaria can be the responsible selective
agent that balances the loss of the genes for the thalassemia and the sickle cell
anemia, for premature death of the homozygosity starting from the increase of the
value the fitness heterozygosity in the areas with malaria. But a new proposal
appeared to explain the maintenance of this polymorphisms, based on the differential
fertility or parental effect. Some authors observed a distortion favoring the
transmission of alelles mutants in areas no endemic of malaria. With base in these
observations, those authors proposed a maternal effect to explain such distortions.
This study has as objective presents a revision of these mechanisms involved in the
maintenance of the polymorphisms of hemoglobinopathies, from classic model to
alternative hypotheses that appeared recently in the literature.
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Palavras-chave: hemoglobinopathies; malaria; genetic polymorphism; maternal
effect.
Introdução
Cerca de 10% da população mundial é portadora assintomática de dois tipos
importantes de anemia hereditária: doença falciforme e talassemias. Ambas
apresentam distribuição geográfica bastante diversificada na África, Ásia, Europa e
América, apesar de originalmente estarem confinadas nas regiões tropicais e
subtropicais. Desde a década de 50 tem sido discutido que as altas prevalências
dessas duas anemias hereditárias, assim como a causada pela deficiência de glicose6-fosfato desidrogenase, se deve à proteção seletiva de seus heterozigotos contra os
efeitos letais das infecções causadas pelo Plasmodium falciparum.1
As clássicas teorias de Haldane,1949 e Allison,1954 sobre a vantagem
seletiva do heterozigoto são tradicionalmente aceitas, especialmente a do gene de
anemia falciforme onde as áreas maláricas são endêmicas.
Uma similaridade entre a distribuição geográfica da β-talassemia e a
incidência de malária em algumas áreas também tem sido demonstrada, entretanto,
os mecanismos de proteção dos heterozigotos talassêmicos não são completamente
compreendidos. 2
Apesar de décadas de estudos epidemiológicos e especulações, o modo de
seleção que favorece o gene da hemoglobina S continua pouco conhecido. Lisa et al.
(1994) 3 propôs que a fertilidade diferencial seria uma explicação para a manutenção
do polimorfismo de hemoglobinopatias em algumas populações.
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Malária: casuística e infecção
De acordo com a Organização Mundial de Saúde, a malária é a doença
tropical e parasitária que mais causa problemas sociais e econômicos no mundo,
sendo somente suplantada pela Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA).
Também conhecida como paludismo, a malária é considerada problema de saúde
pública em mais de 90 países, nos quais cerca de 2,4 bilhões de pessoas (40% da
população mundial) convivem com os risco de contágio. Anualmente, sobretudo no
Continente Africano, cerca de 500 a 300 milhões da população é infectada, e desta,
cerca de um milhão morre em conseqüência da doença. No Brasil, principalmente na
região amazônica, apesar do registro de 500 mil casos por ano, a letalidade da
moléstia é baixa e não chega a 0,1% do número total de enfermos.4
A malária é causada por protozoários do gênero Plasmodium e cada uma de
suas espécies determina aspectos clínicos diferentes para a enfermidade, sendo três
espécies os de maiores ocorrências: P. falciparum, P. vivax e P. malarie. O
protozoário é transmitido ao homem pelo sangue, geralmente por mosquitos do
gênero Anopheles ou, mais raramente, por outro meio que coloque o sangue de uma
pessoa infectada em contato com o de uma sadia como por exemplo, o
compartilhamento de seringas (consumidores de drogas), transfusão de sangue ou até
mesmo de mãe para feto, na gravidez. Apesar do Plasmodium poder infectar animais
como aves e répteis, o tipo humano não infecta outras espécies. Mesmo sem
comprovação, há a suspeita de que certos tipos de malária possam ser transmitidos de
macacos para humanos via mosquito. 5
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Comumente, todas as espécies de Plasmodium atacam células do fígado e
glóbulos vermelhos, que são destruídos ao serem utilizados para reprodução do
protozoário. A destruição das hemácias pelo parasita da malária parece ser vital e
maciça durante o desenvolvimento intraeritrocitário. Um eficiente caminho
metabólico permite a degradação da hemoglobina em aminoácidos que serão
utilizados como fonte de nutrientes pelo parasita. 6 O rompimento das células
vermelhas pelos parasitas converte as hemoglobinas em metahemoglobinas
(MetaHb). Uko et al. (2003) 7 demonstraram que o nível de MetaHb encontrados em
pacientes maláricos está relacionado com o grau de parasitemia, facilitando assim, o
diagnóstico dos pacientes.
Ao inocular o homem, o Anopheles introduz em sua corrente sangüínea, por
meio de sua saliva, uma forma ativa do Plasmodium denominada esporozoíta, que
faz parte de uma de suas fases de vida. Uma vez no sangue, os esporozoítas rumam
para o fígado, onde penetram as células hepáticas se multiplicando e dando origem à
outra fase de vida chamada merozoíta. Uma parte dos merozoítas permanece no
fígado e continua a se reproduzir em suas células, a outra cai novamente na corrente
sangüínea e adentra as hemácias para seguir o processo reprodutivo. As hemácias
parasitadas também são destruídas e originam ora outros merozoítas, ora
gametócitos, células precursoras dos gametas do parasita, sendo tanto femininas
quanto masculinas. 5
O mosquito Anopheles torna-se vetor da malária no momento em que ingere
gametócitos de um indivíduo infectado. Dentro do mosquito, estes gametócitos
tornam-se gametas e fecundam-se, originando o zigoto, que atravessa a parede do
estômago do inseto e transforma-se em oocisto, tipo de célula-ovo. Após algum
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tempo, o oocisto se rompe e libera novos esporozoítos que migram para as glândulas
salivares do mosquito estando desta forma, prontos para infectar um novo indivíduo.
O mais agressivo dos parasitas é o P. falciparum, que se multiplica mais
rapidamente e, conseqüentemente, invade e destrói mais hemácias que as outras
espécies, causando um quadro de anemia mais imediato. Além disso, os glóbulos
vermelhos parasitados pelo P. falciparum sofrem alterações em sua estrutura, o que
os tornam mais adesivos entre si e às paredes dos vasos sangüíneos, causando
pequenos coágulos que podem gerar problemas cardíacos como tromboses e
embolias. Geralmente após a picada do mosquito transmissor, o P. falciparum
permanece incubado no corpo do indivíduo infectado por 12 dias. A seguir, surge um
quadro clínico variável, que inclui calafrios, febre alta (no início contínua e depois
com freqüência de três em três dias), dores de cabeça e musculares, taquicardia,
aumento do baço e, por vezes, delírios. No caso de infecção por P. falciparum,
também existe uma chance em dez de se desenvolver o que se chama de malária
cerebral, responsável por cerca de 80% dos casos letais da doença. Além dos
sintomas correntes, aparece também ligeira rigidez na nuca, perturbações sensoriais,
desorientação, sonolência, excitação, convulsões, vômitos e dores de cabeça,
podendo o paciente chegar ao coma. Por vezes o quadro da malária cerebral lembra o
da meningite ou do tétano, da epilepsia, do alcoolismo dentre outras enfermidades
neurológicas. 8
Suscetibilidade e imunidade
A princípio, todo ser humano é suscetível à malária, mesmo aqueles que já a
contraíram por diversas vezes, pois a imunidade induzida pela presença do parasita
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nunca chega a conferir proteção total. Em situações em que o indivíduo já apresentou
dezenas de episódios da doença, o que é bastante comum acontecer na África, poderá
ser observado um abrandamento dos sintomas. Também há casos em que
características individuais podem levar a uma resistência natural à doença, como por
exemplo a ausência de antígeno Duffy nos glóbulos vermelhos, que os tornaria
refratários à invasão pelo P. vivax; hemoglobinopatia (HbS) em que a invasão pelo P.
falciparum é bastante reduzida 9,10,11 e as enzimopatias, como a deficiência de
glicose-6-fosfato desidrogenasse,12 em que os parasitas não apresentariam um bom
desenvolvimento no interior das hemácias. Nota-se que todas representam formas de
proteção parcial, mas suficientes para evitar quadros mais graves da doença.
Hemoglobinopatias
A molécula da hemoglobina é uma proteína globular composta por quatro
globinas associadas a grupos heme, complexo formado por um átomo de ferro em
uma estrutura porfirinica. As subunidades da hemoglobina são codificadas por um
pequeno grupo de genes (α e β) que são expressos seqüencialmente durante o
desenvolvimento. Os genes do cluster α estão agrupados no braço curto do
cromossomo 16, enquanto os genes do cluster β estão agrupados no braço curto do
cromossomo 11.13
Nos estágios embrionários iniciais o tetrâmero de hemoglobina Gower 1
consiste de duas cadeias å (cluster β) e duas æ (cluster α). Aproximadamente no
início da oitava semana de gestação as cadeias produzidas são gradualmente
substituídas pela cadeia α adulta e duas diferentes cadeias fetais, designadas Gã e Aã.
As cadeias ã diferem somente na presença da glicina ou alanina na posição 136,
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respectivamente. Durante o período de transição entre o estágio embrionário e fetal
as hemoglobinas Hb Gower 2 (α2å2) e Hb Portland (æ2ã2) são detectadas. A Hb F
(α2ã2) torna-se a hemoglobina predominante ao longo do período fetal restante. Após
o nascimento, as cadeia ã gradualmente são substituídas pelas cadeias β e ä. Por volta
do sexto mês após o nascimento 97% - 98% da hemoblobina é formada pelo
tetrâmero α2β2 (Hb A), enquanto Hb A2 (α2ä 2) está presente em aproximadamente
2% a 3%. Pequenas quantidades de Hb F são também encontradas no sangue
adulto.14
Entre as mutações associadas às globinas estruturais anormais, a maioria se
dá pelo resultado de substituições de um único par de bases, sendo que grande parte
destas mutações é expressas pela síntese anormal de cadeias globínicas dada pela
substituição de um dos seus aminoácidos. As variantes estruturais são divididas em
três classes, de acordo com o fenótipo clínico: variantes que causam anemia
hemolítica, por exemplo a hemoglobina falcêmica (Hb S) e hemoglobina C (Hb C),
variantes com transporte de oxigênio alterado, tal como a metemoglobina (Hb M), e
as hemoglobinas variantes com fenótipos de talassemia, como por exemplo a
hemoglobina E (Hb E).
Nas talassemias ocorre a redução da síntese de uma ou mais cadeias de
globina, desequilibrando as quantidades relativas destas. A mutação reduz o nível de
síntese da cadeia α e β, e esta redução produz uma distorção da proporção de cadeia.
A cadeia, que é produzida na taxa normal, está em excesso dada a ausência de uma
cadeia complementar com a qual possa formar um tetrâmero. As cadeias normais em
excesso precipitam-se na célula, lesando a membrana e provocando destruição
prematura da hemácia.15
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Até 1998, 750 variantes de hemoglobinas estruturais tinham sido
identificadas, sendo mais de 75% delas dadas por uma única substituição de
aminoácido na cadeia da α ou β globina, representando cerca de 20% das 2.600
mudanças teóricas que poderiam ocorrer nos genes das globinas. Algumas
variantes estruturais das hemoglobinas são prejudiciais, uma vez que a
substituição do aminoácido altera a função ou
a estabilidade da molécula de
hemoglobina, resultando em um quadro clínico bem definido. As variantes de
hemoglobinas mais freqüentemente observadas nas populações brasileiras são Hb
S, Hb C e Hb D.16
A hemoglobina S é formada pela substituição de um aminoácido na cadeia
beta, na posição seis, onde o glutamato (GAG) é substituído pela valina (GTG). Em
homozigose ambos os genes codificam as cadeias betas S, e neste caso, Hb A não
está presente em decorrência da falta do alelo normal para cadeias beta. O portador
apresenta sintomas clínicos evidentes. Os heterozigotos para Hb S têm um único
alelo alterado, o outro gene da cadeia beta codifica uma cadeia beta A normal,
resultando no traço falciforme, geralmente assintomático.17,18
A anemia falciforme é caracterizada por uma notável variabilidade entre os
indivíduos afetados. Fatores que modificam a concentração intraeritrocitária da
hemogoblina S podem influenciar a expressão clínica da doença assim como a
quantidade e composição da hemoglobina F e sua associação com outras variantes
estruturais ou talassemias do tipo α e β, além de fatores ambientais.19,20
Estudos antropológicos associados às análises bio-moleculares sugerem que o
alelo anormal, para a síntese da globina S, tenha surgido entre os períodos Paleolítico
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e Mesolítico, aproximadamente há 50 ou 100 mil anos na região centro-oeste da
África, Índia e leste da Ásia.1
Por meio de seis diferentes enzimas de restrição (Hinc I, Hinc III, Xnm I, Hinf
I, Hpa I e Bam HI) foi possível identificar cinco haplótipos para o gene ·s
denominado conforme a origem geográfica: Asiático (ou Indiano-Asiático), Senegal,
Benin, Banto e Camarões. Tal prevalência geográfica dos genes βs associados com os
haplótipos específicos tem sugerido origens independentes das mutações βs nestas
regiões.21 A maioria dos cromossomos com o gene βs tem um dos cinco haplótipos
comuns, mas em alguns pacientes (5% - 10%) podem ser encontrados haplótipos
menos comuns usualmente denominados como haplótipos atípicos. Estes haplótipos
são provavelmente gerados por uma variedade de mecanismos genéticos como
mutações em ponto nos sítios de restrições, simples ou duplas trocas entre dois
típicos haplótipos βs ou mais freqüentemente entre um típico haplótipo βs e um
diferente haplótipo βA associado que está presente na população e conversões
gênicas.21
Atualmente, a presença dos genes βs em diferentes partes do Continente
Americano e Europeu são originários da África, e a proporção de haplótipos
associados está relacionada com as várias migrações de populações africanas para
estes continentes. O polimorfismo associado ao gene βs tem comportamentos
notavelmente diferentes na expressão clínica da anemia falciforme, bem como nas
variações de respostas às drogas.20
A hipótese de haldane: vantagem dos heterozigotos
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As hemoglobinopatias têm provido uma das poucas demonstrações
convincentes da seleção, influenciando a freqüência de único gene na população
humana. A alta taxa de desordens, tais como a anemia falciforme e a beta-talassemia,
ocorridas em áreas subtropicais ou tropicais dentro do cinturão da malária, levou
Haldane a propor que a malária pode ser o agente seletivo responsável que balanceia
a perda dos genes para a talassemia e a anemia falciforme, por morte prematura dos
homozigotos e aumento do valor adaptativo de heterozigotos no ambiente com
malária.22
Portanto, o valor adaptativo reprodutivo dos indivíduos homozigotos para a
anemia falciforme (SS) diminuiria pela morte associado com a presença das células
falcêmicas. Os indivíduos homozigotos normais (Hb AA) seriam desta forma mais
afetados que os indivíduos heterozigotos para traços falcêmicos (Hb AS) pelos
efeitos da malária. Evidencia-se que há vantagem dos indivíduos Hb AS sobre os Hb
AA na resistência à malária, especialmente no início da infância, antes da criança
desenvolver uma auto-imunidade contra a infecção malárica.23
A maioria dos alelos selecionada pela malária é de defeitos hereditários das
células vermelhas, como anemia falciforme, Hb C, deficiência G-6PD e Hb E.24
Joishy et al. (1988)25 mostraram que a freqüência de malária causada pelo P.
falciparum na Índia é menor em indivíduos com traço falciforme que em indivíduos
normais sem a presença do traço falciforme. Chotivanich et al.(2002)26 encontraram
parcial inibição do/no crescimento do parasita em indivíduos portadores de Hb E,
sugerindo assim que indivíduos homozigotos Hb EE e HbE/talassemia-beta podem
apresentar uma alternativa anti- P. falciparum. In vitro, iniciando parasitemia a 1%, o
P. falciparum invade preferencialmente eritrócitos com hemoglobinas normais (Hb
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AA) quando comparado com eritrócitos com hemoglobina anormais Hb H, Hb AE,
Hb EE, Hb SC e Hb E/talassemia-beta.26
A hemoglobina E concentrada em parte do sudoeste da Ásia onde a malária é
endêmica, sugere que os indivíduos portadores de Hb AE apresentam uma proteção
natural contra o P. falciparum.27
Estudos in vitro28 têm indicado que o crescimento do P. falciparum em
células contendo Hb F é retardado, mas a invasão é aumentada em recém-nascidos.
Hannah et al (1998)29 também mostraram que a Hb F pode conferir proteção ao P.
falciparum pelo retardo do crescimento do parasita devido a baixa estabilidade do
tetrâmero α2γ2.
Alguns estudos têm testado a associação entre hemoglobina C (Hb C) e a
resistência clinica à malária. Modiano et al. (2001)30 realizaram um amplo estudo
em Burkina Faso e detectou uma forte associação entre resistência clínica à malária e
Hb C em heterozigotos e homozigotos. Em outro estudo realizado em Burkina Faso
foi mostrado que os portadores de Hb S ou Hb C estão menos propensos a
desenvolverem malária que os indivíduos Hb AA, e a parasitemia é altamente
reduzida em indivíduos Hb AS e Hb AC.31
Na Sardenha tal estudo foi realizado com indivíduos, observando-se uma alta
freqüência de heterozigose para talassemias e deficiência G6PD associado à
resistência e morbidade pela malária.3 Segundo o mesmo autor, o nível de
endemicidade na área pode ter contribuído para o aumento ou diminuição do valor
adaptativo, influenciando diretamente a manutenção do polimorfismo.
Relação parasita / hemoglobinopatias
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O parasita da malária utiliza moléculas presentes na superfície de células
vermelhas não infectadas para a invasão das hemácias e a formação das células em
roseta.32 A invasão das células vermelhas pelo P. falciparum depende de múltiplas
interações moleculares entre os receptores eritrocitários e os receptores de membrana
do parasita. Vários estudos com parasitas em cultura demonstraram haver uma
heterogeneidade
de
receptores
heterogeneidade
reflete
o
mas
arsenal
nenhum
de
deles
demonstrou
possibilidades
de
se
esta
invasão
do
parasita.33,34,35,36 Lobo et al. (2004),37 encontraram quatro receptores distintos
para a invasão parasitária in vitro, demonstrando a alta heterogeneidade para a
invasão das células vermelhas.
Friedman e Trager (1981)38 fizeram uma revisão do mecanismo de
resistência das células falcêmicas à malária. Segundo eles, as células infectadas pelo
P. falciparum desenvolvem modificações de membranas que as levam a aderirem ao
endotélio de pequenos vasos sangüíneos. Devido à baixa concentração de oxigênio
das células falcêmicas ocorrem perfurações nas membranas dos parasitas como
resultado de prejuízos físicos e na membrana das células vermelhas devido à perda
de potássio. Para Hebbel (2003)39, a proteção deriva da instabilidade da célula
falcêmica, na qual proteínas de membranas ao reconhecer a invasão, aceleram o
processo de remoção das células por fagocitose.
Eteng (2002)40 realizou um estudo comparativo da suscetibilidade dos
genótipos Hb AA e Hb AS ao P. falciparum, baseado na freqüência de ocorrência da
parasitemia e nas mudanças hematológicas ocorridas nos indivíduos infectados. O
autor constatou que o grupo Hb AA parasitêmico apresentava um significativo
aumento de saturação de transferrina quando comparado ao grupo controle Hb AA.
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No grupo parasitêmico Hb AS a porcentagem de transferrina foi significativamente
menor. O autor sugere que o aumento da suscetibilidade do genótipo Hb AA esteja
relacionada com a resistência da membrana à invasão do parasita e ao ambiente não
hapóxico dentro das células vermelhas.
A capacidade de proteção do hospedeiro frente à infecção malárica não é
determinada somente por mecanismos imunológicos, mas também por características
inatas, freqüentemente herdadas com padrão mendeliano. Entretanto, sua freqüência
não ocorre como resultado direto da exposição individual a infecção. Em termos
evolutivos, a pressão seletiva dessa doença em populações humanas, afeta
profundamente a distribuição e a freqüência das características que conferem
resistência. A resistência inata para os estágios assexuais sangüíneos pode atuar em
nível de membrana eritrocítica, dentro do eritrócito ou no plasma, limitando a
capacidade do parasita se multiplicar.38
Nas áreas de alta transmissão da África e Ásia observa-se a complexidade da
imunidade naturalmente adquirida pelo homem contra o plasmódio, e a dinâmica
relação parasita-hospedeiro que se desenvolve nos indivíduos constantes e
cronicamente expostos à doença. Nestas áreas, onde o P. falciparum é predominante,
os recém-nascidos são protegidos de malária grave durante os seis primeiros meses
de vida.
A transferência de anticorpos maternos é considerada um dos fatores
responsáveis pela resistência do recém-nascido, e pode também estar envolvida com
a presença de eritrócitos contendo grandes quantidades de HbF, gerando um
microambiente desfavorável ao crescimento parasitário.41,42 Em ratos transgênicos
infectados com parasitas, a Hb F parece prover uma proteção ao P. falciparum pelo
retardo do crescimento do parasita.43
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Na África sub-Saariana, a malária congênita é rara devido ao fato de poucos
recém- nascidos desenvolverem os sintomas clínicos durante os primeiros meses de
vida. É bastante comum encontrar a imunoglobulina M (IgM) e anticorpos IgE antiPlasmodium falciparum no cordão umbilical de recém-nascidos.44 A presença destas
imunoglobulinas sugere que o feto foi infectado no útero levando a ativação das
células B. Alternativamente, antígenos maláricos, talvez complexos imunes, tenham
cruzado a barreira placentária e estimulado a resposta.45
Esta proteção pode envolver sensibilização pré-natal e reação imunológica em
receptores de membranas que participam do processo de invasão parasitária.46 Os
anticorpos antimaláricos específicos produzidos pelo feto são desconhecidos, mas
podem ser limitados devido ao repertório das células B fetais reduzidos quando
comparado ao de adultos. Como resultado, é possível que no feto seja produzido um
número limitado de anticorpos para antígenos maláricos. É importante determinar a
extensão de reconhecimento antigênico no útero, porque a imunização precoce
impactará diretamente no desenvolvimento da resposta imune quando os recémnascidos forem infectados em outras fases da vida.47
Efeito materno
Apesar de décadas de estudos epidemiológicos e especulações, o modo de
favorecimento do gene S e outras variantes hemoglobínicas permanece pouco
esclarecido.
Lisa et al. (1994)3 propuseram a fertilidade diferencial como mecanismo de
manutenção do polimorfismo das hemoglobinopatias em algumas populações.
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Portanto, uma distorção favorecendo a transmissão do alelo mutante por efeito
materno ou efeito paterno, por exemplo, é também uma hipótese atrativa.2
O efeito materno tem sido freqüentemente observado na natureza. Tal efeito
ocorre quando o genótipo materno ou o ambiente materno influencia o
desenvolvimento embrionário. Vários modelos de efeito materno têm sido descritos
na natureza e algumas pesquisas têm indicado que existe um componente genético
para o efeito materno e, que em alguns casos, este efeito leva a traços inesperados na
descendência.48
A segregação paterna favorecendo a transmissão de alelos mutantes no loco
do gene RB1 para retinoblastoma foi mostrada por Munier et al. (1994).49 Estes
autores encontraram que a freqüência de transmissão do loco RB1 é influenciada
pelo sexo parental, apesar das diferenças não serem estatisticamente significativas.
Quando o transmissor era o pai 49,1% da progênie era afetada, e quando a mãe era a
transmissora, 44,3%. Os autores sugerem que as recombinações meióticas criariam
clones de espermatogônias que seriam homozigotas para o alelo RB1 levando a
distorção da razão mendeliana.
Outro efeito paterno em humanos foi descrito por Orioli (1995)50 estudando
o alelo mutante causador da polidactilia postaxial. Orioli demonstrou que existe uma
distorção que favorece a transmissão paterna em 44% dos casos contra 31% da
transmissão materna, e que tal distorção poderia ser interpretada como efeito de um
gene recessivo modificador ligado ao sexo atuando durante a gametogênese no gene
autossômico da polidactilia. Esta modificação na razão mendeliana, segundo o autor,
ocorreria mais freqüentemente em populações africanas.
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Embora a genética das hemoglobinopatias ser aceita como típica herança
Mendeliana, alguns resultados têm sugerido um desvio materno, principalmente para
a anemia falciforme e outros mutantes de cadeia beta. Os genes que controlam a
síntese da cadeia beta das hemoglobinas A, S e C são alélicos e herdados como
autossômicos codominantes sem nenhuma diferença na prevalência dos genótipos
entre os sexos.51 Contudo, observou-se uma preponderância do traço falcêmico em
mulheres no Panamá e em Uganda. No Panamá, a prevalência de traço falcêmico em
mulheres foi de 11,35% e 7,2% em homens. Em Uganda observou-se 27,0% de traço
falcêmico em mulheres e 20,9% em homens.52
Kramer (1978)52 encontrou uma diferença na razão sexual 1,29:1 entre
mulheres e homens portadores do traço falcêmico. Segundo este, estas diferenças
podem refletir a natureza heterogênea do diagnóstico clínico, pressões seletivas ou
um possível erro amostral. Explicações para tais achados não são claras, devido à
pequena porcentagem de Hb S no útero, não parece ser razoável que fetos
masculinos sejam selecionados por esta hemoglobina. A mais parcimoniosa
explicação, segundo Kramer (1978)52, mas altamente especulativa, é a de que Hb S
conferiria uma vantagem seletiva no útero sendo o feto feminino o mais favorecido.
Outra possibilidade é que a presença da Hb S favoreceria a fertilização do
espermatozóide contendo o cromossomo X.
A hipótese do efeito parental (materno ou paterno) no mecanismo de
manutenção do polimorfismo balanceado da hemoglobina S e β-talassemia tem sido
testada em áreas não maláricas do Sudeste do Brasil por Duchovni-Silva e Ramalho
(1986),53 que mostraram existir uma distorção na segregação o que favorece a
transmissão da Hb S e dos alelos da β-talassemia.
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Dos dados do trabalho de Duchovni-Silva e Ramalho (2003),2 provém uma
evidência estatística significativa do efeito materno favorecendo a transmissão da
hemoglobina S e β-talassemia em doadores do banco de sangue da Universidade de
Campinas (UNICAMP). Uma proporção Mendeliana foi confirmada na progênie do
probando masculino, rejeitando um efeito paterno. As diferenças entre os padrões de
herança materno e paterno foram confirmadas pelo teste de heterogeneidade BrandtSnedecor para a hemoglobina S, mas não para a β-talassemia.
No trabalho de Duchovni-Silva e Ramalho (2003)2 foram estudados 201
casais sendo que um dos cônjuges era portador do alelo S, gerando uma progênie de
437 indivíduos. Quando a mulher era portadora do alelo S, a diferença entre filhos
portadores (Hb AS) e filhos homozigotos dominantes (Hb AA) foi significativa, mas
quando o pai era o portador as diferenças na progênie não foram significativas. A
quantidade de abortos entre mulheres portadoras do alelo S foi de 8,23% contra
0,45% da taxa de aborto quando o pai era o portador. Para a β-talassemia foram
estudados 138 famílias onde um dos cônjuges era portador do alelo talassêmico. A
progênie gerada foi de 282 crianças. A mulher portadora gerou filhos heterozigotos
em um número significativamente maior que os homozigotos. Esta diferença não foi
observada na progênie do probando masculino. A taxa de abortos espontâneos
também foi maior em mulheres portadora (7,96%) do que quando o pai era o
portador (1,88%).
As taxas de abortos espontâneos foram significativas para as mães Hb AS e
Hb AT e estes resultados evidenciam a fase do desenvolvimento embrionário, não
podendo entretanto ser ignorados os mecanismos pré-zigóticos e pós-zigóticos.2
Baseado em levantamentos realizados na literatura, Nascimento (2000)54, mostrou
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que nas gestações de mulheres heterozigotas Hb AS, cujos parceiros foram Hb AA,
existiu um maior número de gestações de fetos Hb AS, do que de fetos Hb AA,
indicando desta forma a existência de um efeito materno na transmissão hereditária
dos traços falciforme e talassêmicos beta e que deve existir um abortamento
preferencial dos embriões Hb AA pelas mães heterozigotas.
Hook (1996)55 acredita que os resultados observados para β-talassemia não
se devem a uma distorção de segregação gamética, mas a uma seleção embrionária
da mãe portadora pelo feto heterozigoto.
Estudos na Itália têm demonstrado o mesmo efeito materno na herança de
algumas alterações de hemoglobina. Astolfi et al (1999)56 encontraram um alto
número de nascimentos de crianças heterozigotas entre mulheres portadoras do traço
talassêmico e sustentam a hipótese de que o genótipo da mulher contribui para a
manutenção da talassemia.
Zei et al (1990)57 mostraram que existe uma correlação positiva entre a
quantidade de filhos por mulheres com a freqüência de filhos heterozigotos.
O efeito materno observado pode ser independente do produto primário do
gene β-globina, pelo fato de que, na fase embrionária, há o predomínio das
hemoglobinas Gower I (å2æ2), Gower II (α2å2) e Portland (ä2æ2) e de que durante a
fase fetal a hemoglobina F (α2ã2) é a predominante. Portanto, o efeito materno
provavelmente se dá por mecanismos moleculares envolvidos com a implantação no
útero, hormônios placentários ou a fatores imunológicos.2 O efeito da imunidade e
herança adquirida,
assim como as compensações reprodutivas podem ser os
mecanismos envolvidos no quais a malária e as hemoglobinopatias influenciam a
fertilidade.56
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O mecanismo genético envolvido no efeito materno é pouco compreendido e
deve ser analisado em cada fase do desenvolvimento embrionário.48 Um problema
importante durante a gravidez é a comunicação entre a mãe e a progênie.
“Imprinting” genômicos ilustram forças seletivas que podem atuar em genes
diferentes de um indivíduo, levando-os em diferentes direções e resultando em um
conflito genético interno.58
Considerações Finais
A relação entre as hemoglobinopatias e a malária, principalmente a anemia
falciforme, sempre foi alvo de especulações. Vários estudos correlacionam a alta
incidência das alterações hemoglobínicas em determinadas áreas do mundo, como
por exemplo na África, com os locais endêmicos de malária, resultando num modelo
evolutivo que indica a manutenção desses polimorfismos nas populações humanas.
A hipótese de Haldane (1949) para a manutenção do polimorfismo nas
populações africanas devido à proteção dos heterozigotos é amplamente aceita, e
considerada um modelo clássico para o entendimento do efeito heterótico da seleção
balanceada.
Apesar dos poucos dados literários sobre o efeito parental em humanos,
principalmente no que concerne aos genes relacionados à proteção a malária, a
hipótese baseada em uma eventual distorção no padrão mendeliano, que favoreça a
transmissão do alelo mutante, é plausível, porém algumas considerações devem ser
feitas.
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Primeiramente deve-se levar em conta o efeito clínico que o traço falcêmico
tem sobre as gestantes portadoras. O traço falcêmico causa uma série de distúrbios
vaso-oclusivos, de infecções recorrentes e de seqüestros esplênicos, que são
complicações adicionais durante o período gestacional, podendo assim aumentar os
riscos durante a gravidez. Estes fatores, próprios do traço falcêmico, explicaria com
maior clareza o grande número de abortos em mães gestantes portadoras do traço.
Outro aspecto que deveria ser evidenciado é o do genótipo dos fetos
abortados. Uma análise genotípica que confirme um maior número de fetos
abortados pertencentes ao genótipo homozigoto (AA), reforçaria a hipótese do efeito
materno. Porém, assumir que a quantidade de fetos abortados pertença ao genótipo
AA, sem uma prévia análise, não possibilita reforçar tal hipótese, mas apenas
demonstraria uma desvantagem nas gestações de mulheres falcêmicas.
As interações gênicas, observadas em alguns trabalhos, também devem ser
consideradas nas explicações das diferenças dos padrões mendelianos, tais como:
epistasia, influências citoplasmáticas, interações entre genes e produtos gênicos
primários.
Entretanto, é preciso que outras explicações e hipóteses sejam debatidas,
antes de uma teorização definitiva, pois até mesmo os erros de amostragem devem
ser considerados.
Os mecanismos envolvidos na proteção à malária em populações onde a
parasitemia é endêmica ainda são pouco compreendidos, mas certamente novos
estudos surgirão para complementar e auxiliar a compreensão de tais mecanismos
envolvidos nestas relações.
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Estudo do polimorfismo de hemoglobinas
em populações brasileiras de áreas
endêmicas para Malária
Capítulo Cinco
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Estudo do polimorfismo de hemoglobinas em populações
brasileiras de áreas endêmicas para Malária
(Study of hemoglobin polymorphism in brazilian
populational group of malaria endemic area)
Msc. Felipe Rafael Torres1
Profa. Dra. Cláudia Regina Bonini-Domingos1
1- Universidade Estadual Paulista (UNESP) – Instituto de Biociências, Letras e
Ciências Exatas – Departamento de Biologia – Laboratório de Hemoglobinas e
Genética das Doenças Hematológicas – LHGDH.
Correspondência para:
Felipe Rafael Torres - Laboratório de Hemoglobinas e Genética das Doenças
Hematológicas – LHGDH. – IBILCE-UNESP; Rua Cristóvão Colombo, 2265;
São José do Rio Preto, SP.
e-mail: [email protected]
Resumo:
A alta incidência das alterações hemoglobínicas em determinadas áreas do
mundo, principalmente na África, está relacionada com os locais endêmicos da
malária, em um modelo evolutivo que indica a manutenção de polimorfismos nas
populações humanas. No Brasil pouco se conhece sobre a distribuição das doenças
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eritrocíticas, bem como sua relação e incidência em áreas endêmicas para malária.
Através de estudos com populações da região norte do país onde a malária é
endêmica, pretendeu-se entender e relacionar esta distribuição. Assim, foram
analisadas amostras de sangue de 847 indivíduos divididos em dois grupos de estudo:
o grupo dos doadores de sangue sem histórico de infecção malárica provenientes dos
hemocentros de quatro estados da região norte do Brasil, um grupo controle externo
ao da Amazônia legal, e o grupo constituído por pacientes maláricos. Os
polimorfismos de hemoglobinas foram avaliados por HPLC e por técnicas
laboratoriais clássicas. As populações do norte do país apresentaram alta incidência
de alfa talassemia, mas não ocorreu diferenças significativas entre doadores e
maláricos. Também não houve diferenças significativas nas médias de HbA2, porém
para as médias de HbF do Pará e Rondônia, as diferenças foram significativas
(p<0,05) entre os dois grupos, o que sugere a influência do efeito malárico nestas
populações. A média de reticulócitos significativamente reduzidos (p<0,05) nos
doadores da região norte sugere uma estratégia adaptativa destas populações ao
ataque parasitário do Plasmodium.
Palavras-chave: polimorfismo de hemoglobinas; malária; reticulócitos; Hb F.
Abstract:
The high incidence of hemoglobinopathies in certain areas of the world, mainly in
Africa, is related to the endemic places of the malaria, in an evolutionary model
that indicates the maintenance of those polimorphism in the human populations.
In Brazil, a little is known about the distribution of the diseases as well as the
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relationship and incidence in the malaria endemic areas. Through the studies with
populations of the north region of the country where the malaria is endemic, we
intended to understand and relate this distribution. Blood samples of 847
individuals were analyzed, divided in two study groups: the blood donor group
without report of malaria infection from the blood banks of four cities in the north
region of Brazil, an external control group of the Amazonian legal region, and the
group of malaria patients. The hemoglobin polymorphisms were appraised for
HPLC and by classic laboratorial techniques. The populations of the north region
presented high alfatalassemia incidence but they didn't show significant
differences among the groups. They also didn’t show significant differences in
the average of HbA2 among the groups. The average of HbF from Pará and
Rondonia presented significant differences (p <0,05) between the two groups,
suggesting the malaric effect in these populations. The reticulocytes average was
significantly reduced (p <0,05) in the north region blood donor and, it can suggest
an adaptative strategy of these populations to the parasitic attack of Plasmodium.
Key words: hemoglobin polymorphism; malaria; reticulocytes; Hb F.
Introdução
De acordo com a Organização Mundial de Saúde, hoje em dia a malária é de
longe a doença tropical e parasitária que mais causa problemas sociais e econômicos
no mundo, sendo somente suplantada pela Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
(SIDA) 1.
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Também conhecida como paludismo, a malária é considerada um problema
de saúde pública em mais de 90 países, nos quais cerca de 2,4 bilhões de pessoas
(40% da população mundial) convivem com os risco de contágio. Anualmente,
sobretudo no Continente Africano, cerca de 500 a 300 milhões da população é
infectada, e desta, cerca de um milhão morre em conseqüência da doença. No Brasil,
principalmente na região amazônica, apesar do registro de 500 mil casos por ano, a
letalidade da moléstia é baixa e não chega a 0,1% do número total de enfermos.1
A malária é causada por protozoários do gênero Plasmodium e cada uma de
suas espécies determina aspectos clínicos diferentes para a enfermidade, sendo três
espécies as de maiores ocorrências: P. falciparum, P. vivax e P. malarie. O
protozoário é transmitido ao homem pelo sangue, geralmente por mosquitos do
gênero Anopheles ou, mais raramente, por outro meio que coloque o sangue de uma
pessoa infectada em contato com o de uma sadia como o compartilhamento de
seringas, a transfusão de sangue ou até mesmo de mãe para feto, na gravidez. Apesar
do Plasmodium poder infectar animais como aves e répteis, o tipo humano não
infecta outras espécies. Mesmo sem comprovação, há a suspeita de que certos tipos
de malária possam ser transmitidos de macacos para humanos via mosquito. 2
Das quatro espécies de parasita que podem infectar seres humanos, o P. vivax
é o mais frequente nos últimos sete anos no Brasil3.
A princípio todo ser humano é suscetível à malária, mesmo aqueles que já a
contraíram por diversas vezes, pois a imunidade induzida pela presença do parasita
nunca chega a conferir proteção total. Em situações em que o indivíduo já apresentou
dezenas de episódios da doença, o que é bastante comum acontecer na África, podese observar um abrandamento dos sintomas. Também há casos em que características
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individuais podem levar a uma resistência natural à doença, como por exemplo a
ausência de antígeno Duffy nos glóbulos vermelhos, o que os tornaria refratários à
invasão pelo P. vivax; hemoglobinopatia (HbS) em que a invasão pelo P. falciparum
é bastante reduzida4, 5, 6 e as enzimopatias, como a deficiência de glicose-6-fosfato
desidrogenasse,7 em que os parasitas não apresentariam um bom desenvolvimento
no interior das hemácias. Nota-se que todas representam formas de proteção parcial,
mas suficientes para evitar quadros mais graves da doença.
As hemoglobinopatias têm provido uma das poucas demonstrações
convincentes da seleção, influenciando a freqüência de um único gene na população
humana. A alta freqüência de desordens, tal como a anemia falciforme e a beta
talassemia, que ocorrem em áreas subtropicais ou tropicais dentro do cinturão da
malária, permitiu à Haldane propor que a malária pode ser o agente seletivo
responsável, balanceando a perda dos genes para anemia falciforme e talassemias por
morte prematura dos homozigotos com o aumento do valor adaptativo dos
heterozigotos no ambiente com malária8.
Portanto, o valor adaptativo reprodutivo dos indivíduos homozigotos para a
anemia falciforme (Hb SS) deveria ser diminuído pela morte, associado com a
presença das células falcêmicas. Os indivíduos homozigotos normais (Hb AA)
deveriam ser mais afetados que os indivíduos heterozigotos (Hb AS) pelos efeitos da
malária. Talvez a vantagem dos indivíduos com Hb AS sobre os com Hb AA na
resistência à malária, pode ocorrer especialmente no início da infância, antes da
criança desenvolver o próprio anticorpo9.
A maioria dos genes selecionados pela malária é de defeitos hereditários das
células vermelhas, como a anemia falciforme, Hb C e Hb E, talassemias e deficiência
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de G6PD10. Joishy et al.11 mostraram que a freqüência de malária causada pelo P.
falciparum na Índia é menor em indivíduos com traço falciforme que em indivíduos
normais.
Estudos in vitro12 têm indicado que o crescimento do P. falciparum em
células contendo Hb F é retardado, mas a invasão é aumentada em recém-nascidos.
Hannah et al.13 também mostraram que a Hb F pode conferir proteção ao P.
falciparum pelo retardo ao crescimento do parasita devido à alta estabilidade do
tetrâmero α2γ2.
No Brasil, pouco se conhece sobre a real distribuição das alterações de
hemoglobinas em áreas endêmicas da malária, considerando-se a intensa migração
interna e a flutuação das freqüências de diferentes alterações de hemoglobinas em
cada grupo populacional dentro do Brasil.
O presente trabalho teve como objetivo relacionar a incidência de
polimorfismos de hemoglobinas com a infecção por malária, comparando os
resultados obtidos para os polimorfismos nos dois grupos de estudo e traçar o perfil
fenotípico dos portadores de malária da região Amazônica legal.
Material e métodos
A coleta das amostras foi efetivada após explicação detalhada dos objetivos
do trabalho e assinatura em termo de consentimento pelos participantes. Uma ficha
de identificação foi preenchida para cada indivíduo contendo os dados pessoais e, no
caso dos doentes, a história da infecção atual e o registro de infecção pregressa.
Foram coletados 5 ml de sangue venoso em tubo contendo EDTA e mantidos sob
refrigeração até o envio ao LHGDH para análise, onde cada participante recebeu um
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código para preservar sua identidade. O presente projeto foi aprovado pelo Comitê de
Ética em Pesquisa da FAMERP e pela CONEP.
Foram analisadas amostras de sangue de 847 indivíduos, divididos nos
seguintes grupos de estudo: o grupo dos doadores sem histórico de infecção malárica,
provenientes dos hemocentros de quatro estados da região norte do Brasil, todos
localizados na Amazônia Legal brasileira, sendo 99 indivíduos do Pará, 99 do
Amapá, 100 de Rondônia e 99 do Acre; um grupo externo ao da Amazônia legal com
124 doadores de São José do Rio Preto (SP), totalizando 521 controles; e o grupo
formado por pacientes maláricos com 100 amostras de sangue do Amapá e Pará, 75
de Rondônia e 51 do Acre, totalizando 326 pacientes.
Os seguintes procedimentos laboratoriais foram utilizados para avaliar os
polimorfismos de Hemoglobinas: resistência globular osmótica em cloreto de sódio a
0,36%14,
análise, à fresco, da morfologia eritrocitária15, eletroforese em pH
alcalino16, pesquisa de corpúsculos de Heinz e agregados de hemoglobina H,
eletroforese em acetato de celulose pH neutro17, eletroforese de diferenciação em
ágar-fosfato, ph 6,218 e contagem de Reticulócitos17. A quantidade de HbA2 e Hb F
foi avaliada por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC)19 utilizado o
equipamento Variant I (Bio-Rad).
Para confirmação das amostras com prováveis hemoglobinas S e C foram
realizadas amplificações do DNA genômico obtido a partir de leucócitos de sangue
periférico, por meio da técnica de fenol-clorofórmio e precipitação por etanol20. As
amplificações foram realizadas utilizando os primers sense P277 (5’ GGC AGA
GCC ATC TAT TGC TTA 3’) e anti-sense P278 (5’ ACC TTA GGG TTG CCC
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ATA AC 3’). A solução de amplificação continha 10 µM de primers, 1,25 mM de
cada desoxinucleotídeo, 10 ng de DNA genômico, 2,0 mM MgCl2, 2,5 µl de tampão
(1x) e 1U de Taq Polimerase em um volume final de 25µl. Os reagentes foram
submetidos a 94°C por 5 minutos para desnaturação inicial, seguidos de 35 ciclos a
94°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por 1 minuto e uma extensão
final de 72°C por 10 minutos. O produto de amplificação (5µl) foi submetido à
digestão por enzima DdeI para Hb S e BseRI para Hb C a temperatura de 37°C por 7
horas. A análise do produto da digestão foi realizada em géis de agarose-EDTA a
1,5% corados com brometo de etídio e visualizados em luz ultra-violeta (UV). Para o
diagnóstico de malária foi utilizado a análise da amostra em gota espessa e para a
identificação das espécies de Plasmodium, a técnica de semi-aninhado de PCR3.
Para avaliar as diferenças nas médias, dentro e entre os grupos de estudo foi
utilizado o Teste t de Student e, para a comparação das frequências, foi realizado o
teste de proporção (teste binomial). As análises estatísticas foram realizadas no
programa BioEstat 2.0 com nível de significância de 5%.
Resultados
A Tabela 1 mostra o número de indivíduos doadores e maláricos de cada
localidade classificados por etnias segundo declaração da própria pessoa no
momento do preenchimento dos formulários de consentimento. A maior parte dos
doadores eram homens (80%) e pertencentes ao grupo étnico caucasiano (62%). No
grupo malárico os homens representaram 73% e a maioria dos pacientes eram não
caucasianos (44%).
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A triagem laboratorial permitiu distinguir padrões indicativos de alterações
hemoglobínicas em diversos indivíduos nas áreas analisadas. A figura 1 mostra os
resultados globais do grupo de doadores e do grupo malárico. A alteração
hemoglobínica mais freqüente foi a alfa talassemia. No Pará observamos uma
freqüência de 35% de alfa talassemia entre os doadores, e 44% entre os maláricos. O
Amapá apresentou 42% de indivíduos com alfa talassemia entre os doadores e 43%
entre os maláricos. Rondônia foi a área endêmica de malária que apresentou o menor
número de indivíduos com alfa talassemia, tanto entre os doadores, quanto entre os
maláricos, com 27% e 37% respectivamente. O Acre apresentou 42% dos indivíduos
com alfa talassemia entre os doadores, e 41% entre os maláricos. O grupo externo de
doadores de Rio Preto apresentou um a freqüência de alfa talassemia de 36%.
O teste de proporções não mostrou nenhuma diferença significativa para alfa
talassemia entre o grupo de doadores e o grupo malárico.
A freqüência de beta talassemia foi muito baixa, apenas 02 indivíduos no
Acre e 01 em Rio Preto entre os doadores, e 02 indivíduos no Amapá e 01 no Pará
entre os maláricos.
Apenas nos doadores do Acre observamos variantes hemoglobínicas, em um
indivíduo com o genótipo AS, em um indivíduo com genótipo AB2 e em um
indivíduo com Hb I-Filadélfia. Entre os indivíduos maláricos observamos 02 no Pará
e 03 no Amapá com o genótipo AS, um indivíduo com o genótipo AC no Acre, e um
indivíduo AB2 no Pará. A interação mais observada foi ASH sendo 05 em doadores,
04 do Amapá e 01 do Acre, e 02 em maláricos do Amapá. A interação ASF foi
observada em um indivíduo malárico de Rondônia e α/β-talassemia em dois
indivíduos, um doador do Amapá e outro malárico do Pará.
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A tabela 2 mostra os valores médios e os desvios para Hb A2, Hb F e
reticulócitos em cada área e grupo estudados. Entre os doadores a maior média de Hb
A2 foi no Acre com 2,93% e a menor em Rondônia e Rio Preto. O teste t mostrou
uma diferença estatisticamente significativa entre as médias de Hb A2 dos doadores
do Pará (t=-2,6; p<0,05), Rondônia (t=3,3; p<0,05) e Rio Preto (t=3,27; p<0,05) com
a média de A2 dos doadores do Acre. A média de Hb A2 entre os maláricos foi
maior no Pará com 2,95% e menor em Rondônia com 2,84% e, com exceção do
Acre, o grupo malárico apresentou médias superiores de Hb A2 quando comparado
com as médias dos doadores. O teste t mostrou diferenças significativas entre as
médias de Hb A2 nos grupos de doadores e nos grupos maláricos do Pará (t=-3,24;
p<0,05) e Amapá (t=-2,05; p<0,05).
A maior média de hemoglobina fetal entre os doadores foi no Amapá com
0,54%, e a menor em Rio Preto com 0,25%. A freqüência de indivíduos com HbF
aumentada foi de 3% no Pará, 14% no Amapá, 1% em Rondônia, 4% no Acre e 6%
em Rio Preto. A média no Amapá foi estatisticamente diferente (p<0,05) de todas as
área do grupo de doadores.
No grupo malárico a maior média foi no Pará com 0,50% e a menor no Acre
com 0,31%. A freqüência de indivíduos com HbF aumentada foi de 13% no Pará,
10% no Amapá, 15% em Rondônia e 15% no Acre. Na comparação estatística entre
os grupos as diferenças foram significativas no Pará (t=-2,12; p<0,05) e em
Rondônia (t=-2,54; p<0,05).
Uma acentuada redução na média de reticulócitos foi observada no grupo de
doadores das áreas endêmicas de malária. A média de reticulócitos no Pará foi de
0,51%, no Amapá de 0,56%, em Rondônia de 0,56% e no Acre 0,48%. Em Rio
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Preto, região externa ao grupo malarígeno, a média foi de 0,71%. Esta diferença
entre as áreas malarígenas e Rio Preto foram significativamente diferentes (p<0,05)
(tabela 3) mostrando assim um perfil distinto de reticulócitos nestas populações de
doadores.
No grupo malárico as médias de reticulócitos foram maiores. A média no
Pará foi de 0,59%, no Amapá de 0,82%, em Rondônia de 0,81% e no Acre de 1,11%.
Dentre os maláricos, o Pará com a menor média, apresentou diferenças significativas
(p<0,05) de todas as outras áreas e o Acre, com a maior, também apresentou média
significativamente diferente (p<0,05) em relação às médias do Amapá e Rondônia.
Ao comparar os dois grupos, observamos que as médias do grupo malárico
são significativamente maiores que as do grupo de doadores em todas as áreas (tabela
3).
A presença de corpos de Heinz também foi maior entre os maláricos. No
Pará, no grupo de doadores, observamos a presença de corpos de Heinz em 6% dos
indivíduos contra 14% no grupo malárico. No Amapá, apenas 5% apresentaram
corpos de Heinz no grupo de doadores, enquanto 37% apresentaram no grupo
malárico. Em Rondônia, a diferença foi de 9% nos doadores para 28% nos maláricos,
e no Acre de 12% nos doadores para 45% nos maláricos. Diferenças significativas
foram observadas no Amapá (Z=-5,52; p<0,05), Rondônia (Z=-3,3; p<0,05) e Acre
(Z=-4,52; p<0,05).
Duas espécies de parasitas estiveram presentes entre os indivíduos maláricos,
Plasmodium vivax e Plasmodium falciparum. A maior infestão parasitária foi do
Plasmodium vivax com freqüências 86% no Pará, 62% no Amapá, 71% em Rondônia
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e 69% no Acre. Não foi encontrada nenhuma relação entre o tipo de parasita e a
presença de corpos de Heinz, apesar dos valores relativamente aumentados.
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Tabela 1. Classificação dos indivíduos por sexo, etnia e idade amostrados nas áreas de
estudos do grupo de doadores e maláricos.
Doadores
Sexo
Etnia
Idade
Localidade
M
F
C
NC
NE
Mínima Máxima
Média
Pará
86
13
25
0
74
18
51
30,88
Amapá
69
30
42
0
57
18
53
28,89
Rondônia
92
08
37
0
63
18
58
24,44
Acre
88
11
98
0
01
18
52
27,07
Rio Preto
84
40
122
0
02
19
62
35,14
419
102
324
0
197
Maláricos
Sexo
Etnia
Idade
Localidade
M
F
C
NC
NE
Mínima Máxima
Média
Pará
77
23
28
71
01
08
59
26,11
Amapá
65
35
10
22
68
01
61
25,36
Rondônia
65
10
12
37
26
01
76
29,79
Acre
31
20
14
13
24
08
82
29,58
238
88
64
143
119
M: sexo masculino; F: sexo feminino: C: indivíduo caucasiano; NC: indivíduo não-caucasiano; NE:
indivíduo não especificado.
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A
0.45
0.4
0.35
0.3
alfa talassemia
beta talassemia
Variantes
Interações
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
Pará
B
Amapá
Rondônia
Acre
Rio Preto
0.45
0.4
0.35
0.3
alfa talassemia
beta talassemia
Variantes
Interações
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
Pará
Amapá
Rondônia
Acre
Figura 1A-B – Freqüência relativa das alterações hemoglobínicas observadas nos
grupos de doadores (A) e nos grupos maláricos (B).
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Tabela 2. Médias (Med.) e desvio padrão (Desv.) de HbA2, HbF e reticulócitos nos grupos dos
doadores e maláricos.
Doadores
HbA2
Maláricos
HbF
Reticulócitos
HbA2
HbF
Reticulócitos
Med.
Desv.
Med.
Desv.
Med. Desv.
Med. Desv. Med.
Desv.
Med.
Desv.
PA
2,78
0,36
0,36
0,39
0,51
0,34
2,95
0,35
0,50
0,53
0,59
0,17
AP
2,84
0,35
0,54
0,72
0,56
0,20
2,94
0,30
0,38
0,70
0,82
0,48
RO
2,76
0,33
0,29
0,23
0,56
0,17
2,82
0,24
0,46
0,63
0,81
0,46
AC
2,93
0,40
0,30
0,40
0,48
0,09
2,90
0,27
0,31
0,47
1,11
0,78
RP
2,76
0,37
0,25
0,38
0,71
0,40
PA: Pará; AP: Amapá; RO: Rondônia; AC: Acre; RP: São José do Rio Preto
Tabela 3. Teste t (Student) para comparação das médias de reticulócitos nas áreas de Pará
(PA), Amapá (AP), Rondônia (RO), Acre (AC) e Rio Preto (RP).
PA
AP
RO
AC
RP
PA
-2,14*
-
-
-
-4,03*
AP
-
-4,90*
-
-
-3,51*
RO
-
-
-5,03*
-
-3,74*
AC
-
-
-
-8,0*
-5,87*
*: teste significativo ao nível de significância de 5%.
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Discussão
Cerca de 40% da população mundial vive em áreas com risco de transmissão
de malária, resultando em nada menos que 300 milhões de pessoas infectadas no
mundo a cada ano. A transmissão ocorre em países da América Central, América do
Sul, América do Norte (México), África sub-saariana, Índia, Sudeste da Ásia, do
Oriente Médio, e da Oceania. Entretanto, mais de 90% dos casos ocorrem em países
africanos, com um número de mortes entre 1 e 1,5 milhões10. No Brasil, em 1999,
foram registrados 630.747 mil casos de malária, sendo 629.000 na Amazônia3.
A alta taxa de desordens, tais como a anemia falciforme e a beta talassemia,
que ocorrem em áreas subtropicais ou tropicais dentro do cinturão da malária, levou
Haldane a propor que a malária pode ser o agente seletivo responsável, balanceando
a perda dos genes para talassemia e anemia falciforme por morte prematura dos
homozigotos, com o aumento do valor adaptativo de heterozigotos no ambiente com
malária8.
Segundo Nagel10 , a maioria dos genes selecionados pela malária é defeito
hereditário das células vermelhas como anemia falciforme, Hb C, deficiência G-6PD
e Hb E.
No presente trabalho observamos um elevado número de doadores e
maláricos com alfa talassemia, mas não observamos nenhuma diferença significativa
entre eles e portanto, não podemos relacionar o aumento de alfa talassemia com
resistência à malária. A freqüência dessas alterações de hemoglobinas nas áreas
endêmicas foi similar à encontrada em Rio Preto descaracterizando o efeito malárico
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na prevalência desta desordem. No Brasil, a freqüência de alfa talassemia varia de
20% a 25% entre os afro-descendentes.
Borges et al.21 encontraram uma freqüência de 49,9% de alfa talassemia em
pacientes da região sudeste. No Nordeste a freqüência de alfa talassemia é igual a
21,7% para heterozigotos e 0,9% para homozigotos. Estas freqüências variam
amplamente de acordo com o grau de miscigenação22. Desta forma, a composição
étnica resultantes da miscegenação entre brancos e negros africanos nestas áreas,
poderia explicar a alta incidência de alfa talassemia.
Willcox et al.23 mostrou que a média de Hb A2 em crianças que vivem em
áreas de alta endemicidade de malária foi significativamente mais baixa que de outro
grupo onde a malária é controlada. Embora não seja evidente de que maneira a
malária reduz Hb A2, observa-se que a malária crônica induz a deficiência de ferro e,
por conseqüência, pode reduzir os níveis de Hb A223.
Níveis médios reduzidos de HbA2 foram observados entre os doadores com
exceção de Rondônia. Diferenças significativas foram observadas entre doadores e
maláricos no Pará e no Amapá. Como em outros trabalhos24, 25, não foi possível
relacionar os níveis de Hb A2 com a malária. Novamente as diferenças parecem
refletir as condições de formação das populações, e os valores observados no Pará e
Amapá, podem ser resultado da presença dos indivíduos com beta talassemia, uma
vez que o aumento de Hb A2 é diagnóstico da mesma.
Os dados obtidos até o presente momento mostram níveis de Hb F aumentada
em doadores do Amapá e uma diferença significativa na média de Hb F do Amapá
com o Pará, Rondônia, Acre e Rio Preto. Estas diferenças poderiam sugerir uma
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proteção às infecções maláricas mas, ao comparar as médias de HbF entre doadores e
maláricos do Amapá, não observamos diferenças significativas. Estas foram
observadas entre os grupos do Pará e de Rondônia, onde os níveis de HbF estava
aumentado nos maláricos de ambas as regiões. Alguns autores mostraram que níveis
elevados de Hb F em células vermelhas infectadas pelo Plasmodium falciparum
interferem no desenvolvimento do parasita 26 dando, assim, aos indivíduos
portadores de Hb F, resistência à Malária. Em regiões malarígenas da África,
observou-se resistência à infecção pelo Plasmodium em crianças até os seis meses de
vida, quando a hemoglobina fetal (Hb F) encontra-se com valores aumentados 27.
Segundo Shear et al. 26, a Hb F impediria o crescimento do mezoroíto, mas as
propriedades do tetrâmero envolvido em tal proteção permanecem desconhecidas.
Outros trabalhos indicam que valores aumentados de hemoglobina Hb A2 e
Hb F podem ser encontrados em portadores de Doença de Chagas e doadores de
sangue 28. O aumento de Hb F em doadores de sangue poderia estar associado à
necessidade de suprir a falta de Hb A causado por algum motivo fisiológico e/ou
ambiental. Neste caso, o aumento significativo no Pará e em Rondônia poderia ser
explicado pela presença da infecção malárica, mas não estando relacionado com o
nível de parasitemia, já que o maior número de infectados no Pará e em Rondônia foi
por P. vivax, que é menos agressivo que o P. flaciparum 3.
Os doadores da região norte apresentaram baixos níveis de reticulócitos
quando comparados com a população de S. J. do Rio Preto, grupo externo à região. O
teste t mostrou que estas diferenças são estatisticamente significativas. Várias das
alterações hemoglobínicas que podem ser observadas em doadores da região
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malárica, podem ocorrer devida à presença de outras parasitemias abundantes nestas
áreas. Ao utilizar doadores de S. J. do Rio Preto como controle pudemos comparar
áreas onde a incidência de doenças tropicais é baixa, e o índice nutricional da
população é maior. Deste modo, ao observar o índice de reticulócitos em S. J. do Rio
Preto, vemos que os valores observados são bastante inferiores no Pará, Amapá,
Rondônia e Acre. Isto pode sugerir que a baixa produção de reticulócitos nos
indivíduos do Pará e Rondônia deve-se a algum tipo de deficiência nutricional ou a
alguma característica da população desta região.
Para o grupo malárico, em todas as áreas, os níveis de reticulócitos estavam
significativamente aumentados, este aumento é reflexo da invasão parasitária que
aumenta a destruição dos eritrócitos e, por consequinte, o aumento dos reticulócitos
para reposição celular. A presença dos corpos de Heinz pode estar associada com a
presença parasitária, que causa a destruição das células vermelhas, e com o aumento
observado no grupo malárico, o que comprova a ação parasitária na destruição das
células vermelhas.
Os baixos níveis de reticulócitos entre os doadores em todas as áreas pode ser
uma característica populacional, mas também pode ser uma resposta da população à
infecções maláricas. Como o parasita necessita de eritrócitos para a reprodução
assexuada, e sua proliferação, os baixos níveis de reticulócitos poderiam conferir
uma proteção contra a infecção. Sem a presença de um grande número de eritrócitos
a infecção parasitária e a sua proliferação poderiam ficar comprometidas.
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Conclusões
O presente trabalho
tentou
identificar as possíveis relações entre
hemoglobinopatias em populações brasileiras com a malária. O estudo mostrou que
os níveis de alfa talassemia nas populações da região norte não diferem do restante
do país e que a presença aumentada Hb A2 pode refletir as condições de formação
destas populações. O aumento de Hb F em pacientes maláricos do Pará e Rondônia
pode ser uma resposta à infecção já observada em outros estudos, mas não pode ser
relacionado com efeito protetor. Os baixos níveis de reticulócitos observados nos
grupos de doadores das áreas endêmicas podem ser indicativos de uma estratégia
evolutiva destas populações em resposta às infecções maláricas, conferindo assim
uma proteção prévia aos seus portadores.
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Malária
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Estudo do polimorfismo do gene HFE em
grupos populacionais da Amazônia
brasileira
Capítulo Seis
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Estudo do polimorfismo do gene HFE em grupos populacionais
da Amazônia brasileira
(Study of HFE gene polymorphism in populational
groups from Brazilian Amazon)
Msc. Felipe Rafael Torres1
2
Bióloga - Wanessa Christina de Souza
Prof. Dr. Ricardo Luiz Dantas Machado
2
Profa. Dra. Cláudia Regina Bonini-Domingos1
1- Universidade Estadual Paulista (UNESP) – Instituto de Biociências, Letras e
Ciências Exatas – Departamento de Biologia – Laboratório de Hemoglobinas e
Genética das Doenças Hematológicas – LHGDH.
2-Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP) – Departamento de
Doenças Infecciosas, Dermatológicas e Parasitárias – Centro de Investigação de
Microorganismos – CIM.
Correspondência para:
Felipe Rafael Torres - Laboratório de Hemoglobinas e Genética das Doenças
Hematológicas – LHGDH. – IBILCE-UNESP; Rua Cristóvão Colombo, 2265;
São José do Rio Preto, SP.
e-mail: [email protected]
Resumo:
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A hemocromatose é uma doença comum em populações originárias do norte
da Europa, afetando aproximadamente um em cada 300 indivíduos caucasóides.
Duas mutações têm sido comumente descritas no gene HFE, uma transição G→ A na
posição 845 do gene conhecida com C282Y e uma transversão C→ G na posição 187
do gene conhecida como H63D. A distribuição das freqüências dessas duas mutações
tem demonstrado estar intimamente relacionada com os grupos caucasóides do norte
europeu e seus descendentes. Suas freqüências são raras em populações nãocaucasóides, como nas africanas e asiáticas. As freqüências destas mutações em
grupos brasileiros são pouco conhecidas, principalmente a incidência em áreas onde
a malária é endêmica. O presente estudo teve por finalidade avaliar a incidência das
duas mutações na região da Amazônia legal, comparando os achados entre um grupo
de doadores de sangue, sem histórico de malária, com um grupo malárico por meio
de PCR-RFLP. A freqüência do alelo H63D (8,6%) foi superior a freqüência de
C282Y (0,2%). A maioria dos indivíduos apresentaram o alelo H63D em
heterozigose em ambos os grupos doadores (18%) e maláricos (13%), no grupo de
doadores a maior freqüência do alelo H63D ocorreu em indivíduos caucasóides de
todos os estados avaliados, já no grupo malárico, Rondônia apresentou maior
freqüência do alelo H63D entre os indivíduos não-caucasóides. Nos demais estados e
no grupo malárico, o alelo H63D foi o mais freqüente entre os indivíduos
caucasóides. Não houve diferenças estatisticamente significativas (teste Z; p<0,05)
entre os grupo de doadores e maláricos. Os resultados obtidos sugerem que a
manutenção do polimorfismo das mutações no gene HFE pode ser explicada por
outros fatores seletivos, que não a malária, ou por simples flutuação alélica ocorrida
pelo constante fluxo entre os grupos populacionais do Brasil.
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Palavras-chave: Hemocromatose hereditária (HH); polimorfismo do gene HFE;
freqüência alélica; malária.
Abstract
The hemochromatosis is a common disorder in populations from the north Europe,
affecting approximately one among 300 caucasians. Two mutations have been
commonly described in the HFE gene, a transition G A in the position 845 of the
gene known as C282Y and the transversion C G in the position 187 of the gene
known as H63D. The
frequencies distribution of these two mutations has
demonstrated to be intimately related with the north European caucasians and their
descendants. Their frequencies are rare in no- caucasians populations as Africans and
Asians. These mutations frequency in Brazilian groups are few known, mainly its
incidence in areas where the malaria is endemic. The purpose of the present study
was evaluate the incidence of these two mutations in the Amazonian legal area
comparing what was discovered between a blood donors group, without malaria, and
a group with malaria, by PCR-RFLP. The frequency of the H63D alele (8,6%) was
superior from the C282Y (0,2%) frequency. The most of individuals presented the
H63D alele in heterozigose in both groups, malaric (13%) and blood donors (18%).
In the blood donors group the largest frequency of the H63D alele happened in
caucasians of all stats that were studied. In the malaric group, in Rondônia was
presented the higher frequency of the H63D alele among non caucasians individuals.
In the other stats evalueted, and in the malaric group, the H63D alele was the most
frequent among the caucasians. There were no significant differences (tests Z; p
<0,05) between the blood donors group and the malaric group. The results obtained
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suggest that the maintenance of these polymorphism in the HFE gene can be
explained by other selective factors, that is not malaria, or by simple alelic oscillation
happened by the constant flow among Brazil’s populational groups.
Key words: hereditary hemochromatosis (HH); polymorphisms HFE gene; allelic
frequency; malaria.
Introdução:
A hemocromatose hereditária (HH) é uma doença autossômica recessiva
caracterizada pela absorção excessiva de ferro pelo intestino. Indivíduos com
manifestações clínicas da doença acumulam ferro por muitos anos durante a vida
com um progressivo dano nos tecidos, resultando em cirrose, diabetes e
cardiomiopatias1. A descoberta das mutações no gene HFE, que estão presentes na
maioria dos pacientes com hemocromatose, tem possibilitado um diagnóstico
precoce antes do acúmulo excessivo do ferro1.
O gene da hemocromatose hereditária (HFE) possui aproximadamente 10Kb
e está localizado no braço curto do cromossomo 6 (6p21,3) e seu produto está
associado ao complexo de histocompatibilidade2. A função da proteína normal
produzida pelo gene HFE, quando associada à β2 microglobulina, é regular os níveis
de ferro no organismo pela diminuição da afinidade do receptor transferrina pelo
ferro3. Duas mutações têm sido descritas no gene HFE, uma transição G→ A na
posição 845 do gene, resultando em uma substituição de cisteína por tirosina na
posição 282 da cadeia polipeptídica (845 G→ A; C282Y) e uma transversão C→ G na
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posição 187 do gene, resultando em uma substituição de histinina por ácido áspartico
(187 C→ G; H63D) 4. A mutação C282Y altera a conformação da proteína HFE
impedindo sua expressão na superfície celular e a associação com a β2
microglobulina, dessa forma, a célula fica impossibilitada de controlar a entrada de
ferro no seu interior, ocasionando o acúmulo progressivo do metal no organismo5. A
mutação H63D não impede a associação da proteína com a β2 microglobulina e nem
sua expressão na superfície celular, entretanto, esta dificulta a interação do receptor
transferritina com o ferro 6.
Anemias causadas por doenças parasitárias e/ou dietas alimentares com
deficiência de ferro poderiam ser fatores seletivos que explicariam a vantagem e a
manutenção do polimorfismo, pois a perda seria compensada, principalmente nos
heterozigotos, pela absorção excessiva de ferro7.
A hemocromatose é uma doença comum em populações originárias do norte
da Europa, afetando aproximadamente um em cada 300 indivíduos caucasóides 8.
Calcula-se em torno de 85% dos casos de pacientes com HH associados à mutação
C282Y em homozigose, enquanto que menos de 6% são heterozigotos para C282Y e
H63D9.
Desde 1996 vários estudos têm sido realizados para avaliar as freqüência das
mutações H63D e C282Y em diferentes populações e fornecer informações sobre sua
distribuição. A freqüência do alelo H63D varia de 11% a 14% em populações do
norte da Europa, 12% a 20% em populações do sul da Europa, 0% a 1,9% em
populações africanas e 0% a 2,8% em populações asiáticas10. A freqüência do alelo
C282Y é menor que a de H63D, sendo de 1,3% a 9,9% em populações européias e
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extremamente rara (inferior a 1%) em populações não-caucasianas na África, Ásia e
América Central10. A prevalência das duas mutações em pacientes brasileiros ainda é
pouco conhecida11. Agostinho et al.12 estudando populações do sudeste, nordeste e
norte do Brasil, encontraram uma freqüência alélica de 16,3% e 1,4% em
caucasianos, 7,5% e 1,1% em afro-descendentes, 9,8% e 1,1% em indivíduos
miscigenados e 0% em ameríngios nativos da Amazônia, respectivamente para as
mutações H63D e C282Y.
O presente estudo teve por objetivo avaliar a freqüência das mutações H63D
e C282Y por PCR-RFLP em grupos populacionais da Amazônia brasileira e
relacioná-la com a presença de infecções malarígenas, identificando assim, fatores
que justificassem a manutenção dos polimorfismos nestes grupos.
Material e métodos
Amostragem
Foram analisadas amostras de sangue de 521 indivíduos em um grupo de
doadores que não possuíam histórico de infecção malárica, provenientes dos
hemocentros de quatro estados da região norte do Brasil, todos localizados na
Amazônia Legal brasileira, sendo: Amapá (AP), Acre (AC), Pará (PA) e Rondônia
(RO); 124 doadores de São José do Rio Preto (RP) utilizados como grupo controle
externo ao da Amazônia; 326 pacientes maláricos com infecções por P. vivax ou P.
falciparum, sendo 100 pacientes dos estados do Amapá (AP) e Pará (PA), 75 de
Rondônia (RO) e 51 do Acre (AC).
Foram coletados 5 ml de sangue venoso em tubo contendo EDTA e sob
refrigeração até o envio ao Laboratório de Hemoglobinas e Genética das Doenças
Hematológicas (LHGDH) para análise, onde cada participante recebeu um código. O
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presente projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FAMERP e
CONEP, e teve as amostras colhidas após consentimento informado.
Extração e Amplificação
O DNA genômico dos indivíduos foi obtido a partir de leucócitos de sangue
periférico pela técnica de fenol-clorofórmio e precipitação por etanol13.
Foram realizadas amplificações para hemocromatose hereditária utilizando
os primers sense R63 (5’ ATC CCC AGC CTT GTT AAC TG 3’) e o anti-sense
L63 (5’ ACA TGG TTA AGG CCT GTT GC 3’) para a mutação H63D e os primers
sense R282 (5’ CTC AGG CAC TCC TCT CAA CC 3’) e o anti-sense L282 (5’
GGG TAT TTC CTT CCT CCA ACC 3’) para a mutação C282Y. O mix de
amplificação continha 18 µM de primers, 1,25 mM de cada desoxinucleotídeo, 10 ng
de DNA genômico, 2,0 mM MgCl2, 2,5 µl de tampão (1x) e 1U de Taq Polimerase
em um volume final de 25µl. A reação foi submetida a 94°C por 5 minutos para
desnaturação inicial, seguidas de 30 ciclos a 94°C por 30 segundos, 60°C por 30
segundos, 72°C por 1 minuto e uma extensão final de 72°C por 10 minutos. A
análise dos produtos amplificados foi realizada em géis de agarose a 1,5% em
tampão TEB (1X) e corrida eletroforética a 80V por 12 minutos. A visualização foi
realizada com brometo de etídio em luz ultra-violeta (UV).
Digestão Enzimática
Após a amplificação os produtos foram submetidos à digestão enzimática
com as enzimas BclI para a mutação H63D, e RsaI para a mutação C282Y. As
condições de digestão para ambas as enzimas foram as seguintes: 12µl de água ultra
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pura autoclavada, 2,1µl de tampão (33mM Tris-Acetato pH 7,9, 10mM de acetato de
magnésio, 66mM de acetato de potássio e 0,1mg/ml BSA), 0,7µl (15-10 U/µl) de
enzima e 5µl do produto de amplificação por 07 horas ou overnight. A temperatura
de digestão para BclI foi de 50°C e para RsaI foi de 37°C. O produto de digestão
(10µl) foi aplicado em gel de agarose a 3% em tampão TEB (1X), com corrente de
80V por 30 minutos. O gel foi visualizado com brometo de etídio em luz ultra-violeta
(UV) 14.
Análise Estatística
Foram realizadas comparações das freqüências de H63D e C282Y entre os
grupos de doadores da região da Amazônia, doadores de São José do Rio Preto e
maláricos, utilizando-se o teste Z de comparação entre proporções segundo
15
Callegari-Jacques . As análises estatísticas foram realizadas no programa BioEstat
2.0 com nível de significância de 5%.
Resultados
As freqüências genotípicas e alélicas de H63D e C282Y encontradas em
indivíduos do grupo de doadores e do grupo de maláricos estão na tabela 1. Nenhum
indivíduo apresentou as duas mutações simultâneamente. A maioria dos indivíduos
foram heterozigotos para H63D com freqüências variando de 9% (maláricos / Pará) a
24% (doadores / Rio Preto). A freqüência de homozigotos foi baixa em ambos os
grupos, com 02 indivíduos em Rondônia, 01 no Acre e 01 no Amapá, no grupo dos
doadores, e apenas 01 do grupo malárico no Amapá. A freqüência alélica entre os
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doadores foi de 7% no Acre e Pará, 10,5% em Rondônia, 11,5% no Amapá e 12%
em Rio Preto. A freqüência alélica no grupo malárico foi um pouco menor com 4,5%
no Pará, 7,5% em Rondônia e 8% no Acre e Amapá. Não foi encontrada nenhuma
diferença estatisticamente significativa entre as freqüências dos grupos de doadores e
do grupo de doadores externo, e nem mesmo entre o grupo de doadores e os grupos
maláricos.
A freqüência de C282Y foi baixa em todas as populações, tanto nos doadores
quanto nos maláricos. Foram encontrados apenas 04 indivíduos heterozigostos para
C282Y, 01 no grupo de doadores e 03 no grupo malárico, todos no Pará. A
freqüência do genótipo heterozigoto para C282Y no grupo doadores do Pará foi de
apenas 1% com freqüência alélica de 0,5%. No grupo malárico, a freqüência de
heterozigotos para C282Y foi de 3% com freqüência alélica de 1,5%.
A tabela 2 mostra as freqüências genotípicas e alélicas de H63D e C282Y
divididas entre os grupos étnicos. Como a definição do grupo étnico pertencente foi
relatada pelos próprios indivíduos, muitos, principalmente no grupo de doadores, não
quiseram declarar a etnia. Desta forma, ocorreram algumas distorções, como por
exemplo, a ausência de indivíduos declarados como não-caucasóides no grupo
controle. A presença de heterozigotos para a mutação no grupo de doadores ficou
entre 12% (Amapá) e 24% (Rondônia). A presença de homozigotos H63D/H63D foi
de 3,1% e 2% em caucasóides nas respectivas áreas: Rondônia, Acre e Amapá. A
freqüência alélica entre os doadores caucasóide foi maior em Rondônia com 15% e a
menor no Acre com 7%.
No grupo malárico foram observadas diferentes freqüências para a mutação
H63D entre os indivíduos caucasóides e não-caucasóides. Em Rondônia nenhum
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indivíduo declarado caucasóide apresentou a mutação H63D, e 14% declarados nãocaucasóides foram heterozigotos para a mutação. No Acre observou-se o oposto,
14% dos caucasóides foram heterozigotos para H63D e nenhum indivíduo nãocaucasóide apresentou a mutação. A presença em heterozigose da mutação H63D foi
de 10% entre os caucasóides e 5% entre os não-caucasóide no Amapá, e 11% e 8%,
respectivamente para caucasóides e não caucasóides, no Pará. O único homozigoto
para a mutação H63D entre os maláricos pertencente a Macapá, não declarou o grupo
étnico ao qual acredita pertencer.
Dos quatro indivíduos do Pará que apresentaram a mutação C282Y em
heterozigose, um era caucasiano e os outros três não-caucasianos.
Discussão
A maioria dos pacientes caucasianos de origem européia com hemocromatose
são homozigotos para a mutação C282Y, enquanto menos de 6% são heterozigotos
para C282Y e H63D, o que torna a mutação C282Y a mais frequente nas populações
do norte europeu, com valores de 5% a 10%, e rara em grupos étnicos da Ásia e
África16.
Segundo Agostinho et al. 12 a freqüência de C282Y é 3 a 8 vezes menor em
brasileiros quando comparados aos caucasianos do norte da Europa, enquanto que a
freqüência alélica de H63D é praticamente similar. Esta baixa freqüência vem sendo
observada em populações não-caucasianas, ou que possuem origem étnica bastante
diversificada. Sendo que a hemocromatose herereditária afeta predominantemente
caucasianos de descendência européia, e pode ter surgido em uma população
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ancestral céltica com subseqüente migração, que explicaria a distribuição geográfica
da desordem 17.
Os resultados apresentados neste trabalho demonstraram que a freqüência
alélica de H63D e C282Y é similar a outros trabalhos em regiões asiáticas e do norte
e sul da África 10, 17, 18 em estudos populacionais. A maioria dos indivíduos foram
heterozigotos para H63D, a freqüência de C282Y foi baixa e não foi encontrado
nenhum indivíduo com as duas mutações simultâneas.
Segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) 19 a
população do norte do país é constituída de 28,4% de caucasóides e 71,6% de nãocaucasóides (negros, pardos, ameríngeos e asiáticos). A freqüência alélica de H63D
foi superior entre os caucasóides e baixa entre os não-caucasóides, com exceção de
Rondônia, onde a mutação esteve em maior freqüência nos não-caucasóide. Dos
quatro indivíduos que apresentaram mutação C282Y em heterozigose, três declaramse não-caucasianos, situação rara para esta mutação. Estes resultados demostram a
existência de componentes europeus na formação das populações da região norte do
país. A baixa freqüência de C282Y reforça a menor dispersão da mutação pelo
mundo. Em São José do Rio Preto, onde o componente europeu na formação da
população é maior, não foi encontrada nenhuma mutação C282Y. Os grandes fluxos
migratórios do país e a miscigenação podem ter alterado a incidência destas
mutações. A região Amazônica é uma área rica para exploração comercial e
financeira, o que atrai migrantes desde do início do século. Este fato poderia explicar
as incidências destas mutações nos grupos avaliados.
Segundo Burt et al. 20 a alta freqüência e os efeitos das mutações H63D e
C282Y sugerem que estas duas possuam papel importante no controle do ferro nas
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populações de descendência européia. A quantidade de ferro aumentada pode ser
importante para outras doenças e em associações com esquemias cardíacas e
respostas à hepatite C20. Pelo fato das mutações no gene HFE causarem pouca
desvantagem seletiva, tanto em homozigose quanto em heterozigose, assume-se que
estas mutações confeririam uma vantagem seletiva na prevenção da deficiência de
ferro; incluindo a proteção contra anemia devido à infestações por vermes
nematóides, malária, múltiplas gestações, dieta com baixa quantidade de ferro, ou à
combinação destes fatores 7,21.
Não encontramos neste trabalho nenhuma associação que justificasse a
manutenção dos polimorfismos para H63D e C282Y nas áreas estudas onde a
malária é endêmica. As freqüências das duas mutações foram bastante similares às
encontradas em outras áreas do mundo onde a malária não é endêmica10. Nenhum
dos grupos de doadores da região Amazônica apresentou diferenças significativas
quando comparados ao grupo externo de São José do Rio Preto. A incidência das
mutações no grupo malárico foi estatisticamente similar à encontrada no grupo de
doadores avaliados.
Assim, a manutenção do polimorfismo das mutações do gene HFE pode ser
explicada por outros fatores seletivos que não a malária, como por simples flutuação
alélica ocorrida pelo constante fluxo entre as populações. Essa hipótese pode ser
sustentada pelo fato que, na maioria dos casos, as mutações são assintomáticas não
trazendo uma aparente desvantagem seletiva ao indivíduo portador.
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Conclusão
Desta forma, encontramos uma freqüência alélica de mutações H63D maior
do que C282Y em populações do norte e sudeste do país, sendo que a maioria dos
indivíduos portadores pertencem ao grupo étnico caucasiano. A incidência das
mutações pode não estar associada com a vantagem dos indivíduos com infecções
maláricas.
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