ÓLEO DE FÍGADO DE BACALHAU OU COLESTEROL SOLÚVEL EM ÁGUA NO
DILUIDOR DE CONGELAÇÃO AUMENTAM A CRIORESISTÊNCIA DO
ESPERMATOZOIDE EQUINO?
Breno Fernandes Barreto Sampaio1, Edjalma Rodrigues da Silva-Junior2, Letícia
Pelisari Bortoletto2, Eliane Vianna da Costa e Silva3, Carmem Estefânia Serra Neto
Zúccari3
1 Doutorando do Programa de Pós Graduação em Ciência Animal da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul
2 Acadêmico da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade
Federal de Mato Grosso do Sul
3 Professora Doutora da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade Federal de Mato Grosso do Sul ([email protected]) Campo
Grande - Brasil
Recebido em: 31/03/2015 – Aprovado em: 15/05/2015 – Publicado em: 01/06/2015
RESUMO
O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da adição, ao diluidor de congelação, do
óleo de fígado de bacalhau (OFB; Experimento 1) ou do colesterol solúvel em água
(COL; Experimento 2), sobre a resistência do espermatozoide equino à congelação.
As variáveis estudadas foram motilidade, vigor, integridade das membranas
plasmática e acrossomais, atividade mitocondrial e nível de peroxidação lipídica,
analisadas nos momentos pós-colheita (PC) e pós-descongelação (PD). O OFB foi
testado nas concentrações de 25 µg / mL e 50 µg / mL. Os valores de motilidade,
vigor e viáveis foram significativamente superiores no momento PC quando
comparados àqueles PD e, após a descongelação, houve aumento do percentual de
espermatozoides mortos (p < 0,05). Não houve efeito dos tratamentos, nem dos
momentos avaliados sobre a peroxidação lipídica. No experimento 2 foi testada a
adição de COL nas concentrações de 1,5 mg/mL e 3,0 mg/mL. A motilidade foi
significativamente maior PC, não havendo diferença entre os tratamentos após a
descongelação. O percentual de espermatozoides vivos no grupo tratado com 1,5
mg/mL foi similar aos valores obtidos PC, contudo não houve diferença entre os
grupos PD. O nível de lipoperoxidação foi menor (p<0,05) no sêmen fresco, não
diferindo entre os tratamentos, após a descongelação. Ao se considerar apenas os
valores PD, não houve diferença significativa entre os tratamentos, para todas as
variáveis analisadas. Conclui-se que nas concentrações testadas o óleo de fígado
de bacalhau e o colesterol solúvel em água não foram eficazes em proporcionar
maior crioresistência ao sêmen de garanhões.
PALAVRAS-CHAVE: criopreservação, estresse oxidativo, garanhão, lipídeos,
sêmen
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ADDITION OF COD LIVER OIL AND WATER SOLUBLE CHOLESTEROL TO
FREEZING EXTENDER ON EQUINE SPERM CRYORESISTANCE
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate the effect of the addition, to the freezing
extender, of cod liver oil (CLO; Experiment 1) or water-soluble cholesterol (WSC;
Experiment 2) on the resistance of equine sperm to the freezing. The variables
studied were motility, vigor, integrity of plasmatic and acrosomal membranes,
mitochondrial activity and lipid peroxidation, analyzed in post-collection moment (PC)
and post-thawing (PT). The CLO was tested at concentrations of 25 mg/ml and 50
mg/ml. Motility, vigor and viable were significantly higher in PC time when compared
to those PT and, after thawing, there was an increase in the percentage of dead
sperm (p <0.05). No effects of treatments or of the times assessed on lipid
peroxidation. In experiment 2 was tested adding WSC at concentrations of 1.5 mg/ml
and 3.0 mg/ml. The motility was significantly higher PC, with no difference between
treatments after thawing. The percentage of live sperm in the group treated with 1.5
mg/ml was similar to the values obtained PC, however there was no difference
between the PT groups. The level of lipid peroxidation was lower (p <0.05) in fresh
semen and did not differ between treatments after thawing. When considering only
the PT values, there was no significant difference between treatments for all
variables. It was concluded that at the tested concentrations of cod liver oil and the
water soluble cholesterol there was no improving in cryoresistance of stallion semen.
KEYWORDS: cryopreservation, lipids, oxidative stress, semen, stallion
INTRODUÇÃO
As biotécnicas da reprodução contribuem para o melhoramento genético dos
plantéis e permitem o maior aproveitamento de reprodutores elite (CANCIMANSI et
al., 2010). Algumas biotecnologias como a inseminação artificial (IA) e a
transferência de embriões fazem parte da rotina de diversos haras, o que coloca o
Brasil em destaque no cenário mundial (ALVARENGA, 2010).
A IA de éguas com sêmen congelado apresenta alguns entraves, como o
maior custo por prenhez e a baixa resistência do espermatozoide equino ao
processo de congelação (MURPHY et al., 2014). Desta forma, a busca por novos
diluentes ou o aprimoramento daqueles já existentes se mostram promissores, pois
a adição de substâncias que protejam a integridade estrutural e funcional do
espermatozoide, terá reflexos positivos sobre as taxas de gestação.
O choque térmico pelo frio pode ocasionar queda da motilidade espermática
(MORAN et al., 1992) devido à modificação na organização da membrana
plasmática (MP), quando o espermatozoide é exposto à baixas temperaturas
(HAMMERSTEDT et al., 1990). O grau de fluidez da MP é influenciado por sua
composição lipídica, pelo comprimento e grau de insaturação dos ácidos graxos,
pela concentração de colesterol e pela relação colesterol:fosfolipídeos (COL:FFL)
(GIRAUD et al., 2000). Portanto, a presença de ácidos graxos poli-insaturados
(poliunsaturated fatty acids – PUFA) pode tornar a MP mais fluida, protegendo a
célula durante o processo de congelação (DARNELL et al., 1990). Em contrapartida,
o alto conteúdo de PUFAs na MP do espermatozoide pode torná-lo vulnerável às
mudanças peroxidativas.
Os óleos de peixes de águas geladas são ricos em PUFAs e, o óleo de fígado
de bacalhau (OFB) se destaca por possuir em sua composição concentrações
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expressivas dos ácidos eicosapentaenoico, docosapentaenoico e docosahexaenoico
(PAULENZ et al., 1995).
Em algumas espécies, a suplementação in vitro com PUFAs protege o
espermatozoide contra os efeitos deletérios do choque térmico pelo frio. Em ovinos
foram observados maiores valores de motilidade e viabilidade espermática após a
descongelação do sêmen acrescido de ácido oleico-linoleico (PÉREZ-PÉ et al.,
2001) e, em bovinos, a adição de ácido linoleico resultou em maior motilidade após a
descongelação (TAKAHASHI et al., 2012).
A MP do espermatozoide equino inicia a transição de fase dos lipídeos, do
estado líquido cristalino para o estado gel, à temperatura de 19°C e a finaliza aos
8°C. Nesta faixa de temperatura o espermatozoide se torna bastante susceptível às
lesões, porém a adição de colesterol confere maior resistência à célula, por
aumentar a proporção COL:FFL (HARTWIG et al., 2014) e reduzir a temperatura na
qual os FFL passam pela transição de fase (KIRK et al., 2001), portanto, tendo um
efeito estabilizador.
O colesterol é uma molécula hidrofóbica que necessita de um complexo de
inclusão para sua incorporação na MP, que proporciona maior tolerância osmótica e
permeabilidade aos crioprotetores, aumentando, assim, a longevidade do
espermatozoide (MOCÉ et al., 2010). Porém, a obtenção do complexo de inclusão
com açúcares cíclicos é bastante trabalhosa, portanto, o colesterol solúvel em água
pode vir a ser uma alternativa vantajosa.
O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da adição do óleo de fígado de
bacalhau ou do colesterol solúvel em água (COL) ao diluente de congelação, sobre
a motilidade/vigor, integridade das membranas plasmática e acrossomais, a
atividade mitocondrial e o nível de peroxidação lipídica do espermatozoide equino
submetido à criopreservação.
MATERIAL E MÉTODOS
Colheita de sêmen
Foram utilizados seis garanhões Quarto de Milha adultos e de fertilidade
conhecida. Os animais foram submetidos ao manejo adotado nas propriedades onde
se encontravam, localizadas no município de Campo Grande – MS (20º 26' 34" S;
54º 38' 47" W) e, a colheita de sêmen foi realizada em manequim, com o auxílio da
vagina artificial Modelo Botucatu® (Botupharma Biotecnologia Animal, Botucatu/SP,
Brasil), sendo colhido um ejaculado de cada garanhão.
Após a colheita do sêmen foram avaliadas as seguintes variáveis
espermáticas: motilidade/vigor, concentração, integridade das membranas
plasmática e acrossomais, atividade mitocondrial, nível de lipoperoxidação e
morfologia espermática, tendo sido utilizados apenas ejaculados que apresentavam
motilidade ≥ 70%, vigor ≥ 3 e ≥ 70% de espermatozoides com morfologia normal.
Experimento 1 - Adição de óleo de fígado de bacalhau ao sêmen equino
submetido à criopreservação
Após a colheita o sêmen foi diluído em meio à base de leite desnatado na
concentração de 50 x 106 espermatozoides / mL e as amostras centrifugadas a 600
G / 13 min. Após a centrifugação o sobrenadante foi descartado e o pellet
ressuspendido com diluente à base de gema de ovo na concentração de 200 x 106
células / mL.
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A solução mãe de OFB (Cod Liver Oil - Sigma Aldrich do Brasil) foi obtida pela
diluição em etanol e a partir dela preparada a solução de trabalho (10x), contendo 2
mg de DHA. Os grupos experimentais foram: C – controle, sem adição do OFB;
OFB-25 - 25 µg / mL de DHA e; OFB-50 - 50 µg / mL de DHA. A solução de trabalho
foi depositada em tubos cônicos, os quais foram mantidos a 60ºC, até a completa
evaporação do etanol e a adsorção do OFB à parede dos tubos.
O ejaculado foi fracionado em três alíquotas, contendo 500 x 106
espermatozoides, sendo cada uma delas depositada em tubo cônico previamente
preparado de acordo com os grupos experimentais e, a seguir, procedeu-se com a
incubação das amostras, em banho-seco, durante 30 min. à temperatura de 37°C.
Após o período de incubação foi realizado o envase do sêmen em palhetas de
0,5 mL, contendo 100 x 106 espermatozoides. As palhetas foram submetidas à
refrigeração a 5°C por 20 min., a seguir mantidas n o vapor de nitrogênio por 20 min.
e então mergulhadas no nitrogênio líquido. A avaliação das variáveis seminais foi
realizada após a descongelação em banho-maria a 38ºC / 30 seg.
Experimento 2 - Adição de colesterol solúvel em água ao sêmen equino
submetido à criopreservação
Após a colheita separou-se três alíquotas de sêmen, cada uma contendo 120
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x 10 espermatozoides, ajustando-se o volume final para 1 mL, pela adição de spTALP. Cada alíquota foi destinada a um dos seguintes grupos experimentais: C –
controle, sem adição de COL; COL-1,5 - adição de 1,5 mg/mL de COL e; COL-3,0 adição de 3 mg/mL de COL. Os grupos foram submetidos a incubação à 22ºC
durante 15 min.
Após o período de incubação as amostras foram diluídas em meio de
centrifugação a base de leite desnatado. A seguir o sêmen diluído foi centrifugado a
600 G / 13 min., o sobrenadante descartado e o pellet ressuspendido com diluente a
base de gema de ovo.
Foi realizado o envase do sêmen em palhetas de 0,5 mL, contendo 24 x 106
espermatozoides. As palhetas foram submetidas à refrigeração a 5°C por 20 min., a
seguir mantidas no vapor de nitrogênio por 20 min. e então mergulhadas no
nitrogênio líquido. A avaliação das variáveis seminais foi realizada após
descongelação em banho-maria a 38ºC / 30 seg.
Motilidade e vigor
A avaliação da motilidade e vigor foi do tipo cega e realizada pelo mesmo
técnico, depositando-se 10 µl de sêmen entre lâmina e lamínula, mantidas sobre
placa e platina aquecedora, sob a microscopia de campo claro, com objetivas de 10
e 40x. O resultado foi expresso em percentagem, conforme a proporção total de
espermatozoides móveis, e, o vigor, segundo escala padronizada de zero a cinco (05).
Concentração espermática
A concentração foi estimada em Câmara de Neubauer, usando-se taxa de
diluição de 1:100. Após a colheita do sêmen realizou-se a contagem do número de
espermatozoides, sob a microscopia de campo claro, com objetiva de 40x, sendo os
valores expressos em x 106 de espermatozoides / mL.
Viabilidade espermática
A viabilidade espermática e o status acrossomal foram avaliados
empregando-se a técnica de dupla coloração (trypan blue/ Giemsa - TBG) descrita
por DIDION et al., (1989). Foram contadas 200 células em microscopia de campo
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claro, em objetiva de 100x e os espermatozoides classificados como: vivos (V);
mortos (M); reação do acrossomo verdadeira (RAV) - espermatozoides vivos, sem
acrossomo e; reação do acrossomo falsa (RAF) - espermatozoides mortos, sem
acrossomo.
Atividade mitocondrial
A atividade mitocondrial foi avaliada pela coloração com 3,3’diaminobenzidina (DAB), conforme descrito por HRUDKA (1987). Foram contadas
200 células, em microscopia de contraste de fase, com objetiva de 100x. As células
foram classificadas de acordo com a deposição de DAB na peça intermediária: DAB
I - 100% da peça intermediária corada; DAB II - > 50% da peça intermediária corada;
DAB III - < 50% da peça intermediária corada; DAB IV - peça intermediária não
corada.
Peroxidação lipídica
A avaliação da peroxidação lipídica foi feita através da mensuração da
concentração de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), de acordo com o
protocolo descrito por NICHI et al., (2007). A leitura foi feita por espectrofotometria,
em comprimento de onda de 532 nm e os resultados foram comparados com uma
curva padrão, previamente estabelecida, de malondialdeído. A concentração do
TBARS foi determinada utilizando um coeficiente de extinção molar do
malondialdeído (1,56 x105 x M / mL), e expressa em nanogramas de malondialdeído
(MDA) por 1x108 de espermatozoides.
Morfologia espermática
Para a análise da morfologia espermática utilizou-se a microscopia de
contraste de fase, em aumento de 100x, sendo contadas 200 células/lâmina e
classificadas em defeitos maiores, defeitos menores e defeitos totais.
Análise estatística
À análise estatística as variáveis expressas em porcentagem foram
transformadas em arcoseno (X/100) de acordo com o sugerido por SAMPAIO
(2007). A variável TBARS foi transformada em log10. Os dados foram submetidos à
análise de variância, pelo procedimento GLM do Programa Estatístico SAS (2001),
considerando os efeitos fixos dos tratamentos e momentos de avaliação. As médias
foram comparadas pelo teste de Duncan, em nível de 5% de significância.
RESULTADOS
Os valores médios das variáveis espermáticas pós-colheita (PC), foram:
motilidade - 70,0 ± 0,0%; vigor - 3,3 ± 0,5; vivos - 71,6 ± 10,8%; mortos - 27,9 ±
10,9%; RAV - 0,2 ± 0,3%; RAF - 0,3 ± 0,8%; alta atividade mitocondrial (DAB I) 48,5 ± 31,3% e peroxidação lipídica 1.099,6 ± 763,2 ng de MDA/108
espermatozoides.
Experimento 1
Na Tabela 1 são apresentados os valores médios das variáveis espermáticas
pós-descongelação (PD), não sendo observada diferença significativa entre os
tratamentos.
Na comparação entre os momentos houve diminuição da motilidade e da
porcentagem de espermatozoides vivos, com consequente aumento de
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espermatozoides mortos (p < 0,05). Os grupos do OFB apresentaram queda do
vigor, em relação ao momento PC, no entanto essa diferença não foi observada na
comparação com o grupo controle, que, por sua vez, não diferiu dos outros
tratamentos PD. As variáveis RAV, RAF, alta atividade mitocondrial e peroxidação
lipídica não apresentaram diferença significativa entre os momentos estudados. A
morfologia espermática não diferiu entre os momentos nem entre os tratamentos,
quando comparada ao grupo controle.
TABELA 1. Média (± desvio padrão) das variáveis seminais de garanhões Quarto de Milha (n=6),
Tratamentos
Controle
OFB 25 µg/mL
OFB 50 µg/mL
após a descongelação, de acordo com as concentrações de óleo de fígado de
bacalhau (OFB) adicionadas ao diluidor de congelação.
Variáveis Espermáticas
TBARS
Trypan
Blue / Giemsa (%)
Motilidade
Vigor
8
DAB I (%)
(ng MDA x 10
(%)
(0-5)
Vivo
Morto
RAV
RAF
sptz)
43,3 ± 12,1
3,0 ± 0,0 51,3 ± 10,9 46,2 ± 10,6 0,8 ± 0,5
1,7 ± 1,8
53,5 ± 5,4 1.384,3 ± 841,0
41,7 ± 11,7
2,3 ± 0,5 54,9 ± 13,2 44,0 ± 13,1 0,3 ± 0,4
0,8 ± 1,1 52,5 ± 13,9 1.338,4 ± 735,6
41,7 ± 14,7
2,2 ± 0,8 50,8 ± 15,9 47,6 ± 15,7 0,6 ± 0,6
1,0 ± 1,1 55,6 ± 14,4 1.759,8 ± 955,9
RAV = reação do acrossomo verdadeira; RAF = reação do acrossomo falsa; TBARS = espécies
reativas ao ácido tiobarbitúrico; sptz = espermatozoide
Experimento 2
Os valores médios pós-descongelação das variáveis do sêmen acrescido de
COL constam na Tabela 2. Após a colheita do sêmen as variáveis motilidade e
peroxidação lipídica foram superiores aos valores encontrados PD. O percentual de
espermatozoides vivos PC foi superior aos grupos controle e COL-3,0 após a
descongelação, no entanto, foi semelhante ao grupo COL-1,5; que por sua vez não
diferiu dos demais tratamentos. No momento PD não foi observada diferença
significativa entre os tratamentos para nenhuma das variáveis analisadas. Não
houve diferença entre momentos e entre tratamentos (p > 0,05), para a variável
morfologia espermática, quando comparada ao grupo controle.
TABELA 2. Média (± desvio padrão) das variáveis seminais de garanhões Quarto de Milha (n=6),
Tratamentos
Motilidade
(%)
Controle
COL 1,5
mg/mL
COL 3,0
mg/mL
48,3 ± 14,7
após a descongelação, de acordo com as concentrações de colesterol solúvel em
água (COL) adicionadas ao diluidor de congelação
Variáveis Espermáticas
TBARS
Trypan
Blue / Giemsa (%)
Vigor
8
DAB I (%)
(ng MDA x 10
(0-5)
Vivo
Morto
RAV
RAF
sptz)
2,8 ± 0,4 49,8 ± 15,6 47,6 ± 15,0 1,3 ± 0,8
1,3 ± 2,0 59,2 ± 14,3
2.828,0 ± 869,3
38,3 ± 14,7
2,5 ± 0,5
55,9 ± 9,5
41,3 ± 9,0
1,6 ± 2,3
1,3 ± 1,0
59,0 ± 8,2
3.792,3 ± 1.795,1
41,7 ± 23,2
2,2 ± 1,2
39,9 ± 22,7
56,8 ± 24,9
1,8 ± 2,0
1,5 ± 1,4
56,0 ± 17,0
3.598,8 ± 1.261,7
RAV = reação do acrossomo verdadeira; RAF = reação do acrossomo falsa; TBARS = espécies
reativas ao ácido tiobarbitúrico; sptz = espermatozoide
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DISCUSSÃO
O processo de congelação leva a uma perda de aproximadamente 50% da
viabilidade espermática (VISHWANATH & SHANNON, 2000), devido a danos
celulares decorrentes de mudanças morfológicas na organização, fluidez,
permeabilidade, composição lipídica e até mesmo a ruptura das membranas
espermáticas (HOLT, 2000). Essas lesões, associadas a danos correspondentes na
capacidade funcional dos espermatozoides sobreviventes são responsáveis pelo
decréscimo da fertilidade do sêmen congelado (WATSON, 2000).
Os danos causados pela congelação podem ser reduzidos por modificações
nos protocolos rotineiramente usados, em geral, pela adição de substâncias ao meio
diluidor, dentre elas, PUFAs (PÉREZ-PÉ et al., 2001) e lipídeos exógenos
selecionados (HE et al., 2001).
Em ovinos, a adição de ácido oleico-linoleico conferiu maior resistência à
célula espermática frente os efeitos deletérios do choque térmico, mostrando um
número maior de células viáveis após a incubação com essa associação de PUFAs
(PÉREZ-PÉ et al., 2001). O acréscimo de DHA no diluidor de congelação do sêmen
suíno demonstrou que esse PUFA conferiu maior integridade à membrana
plasmática e aumento da motilidade progressiva na avaliação pós-descongelação
(KAEOKET et al., 2010).
A suplementação in vitro com PUFAs no meio diluidor de sêmen bovino com
baixa resistência à congelação resultou em melhora da motilidade progressiva após
a descongelação (TAKAHASHI et al., 2012). No entanto, existem diferenças quanto
ao protocolo de congelação entre as espécies equina e bovina, e o período de
equilíbrio utilizado pelos pesquisadores foi de 30 horas a 4°C, o que os levou a
supor que a melhora da qualidade seminal foi devida à incorporação do ácido
linoleico na MP. Contudo, no presente estudo, a porcentagem de células vivas não
diferiu, portanto os resultados demonstraram que os lipídeos testados em ambos os
experimentos não foram eficazes em manter a integridade estrutural da membrana
plasmática.
A congelação promove perdas de aproximadamente 28% do conteúdo de
colesterol presente na membrana plasmática do espermatozoide. Tal fato contribui
para a ocorrência de reação acrossomal prematura e, consequentemente,
diminuição da viabilidade espermática pós-descongelação (MOORE et al., 2005). O
efeito estabilizador do colesterol sobre a membrana plasmática melhora a
congelabilidade do sêmen de bovinos (MOCÉ & GRAHAM, 2006), equinos
(SPIZZIRI et al., 2010) e caprinos (KONYALI et al., 2013). Além disso,
PAMORNSAKDA et al. (2011) constataram que a adição de 1,5 mg de colesterol em
120 x 106 espermatozoides recuperados do epidídimo resultou em maior motilidade
e viabilidade após a descongelação.
A maior quantidade de colesterol no diluente modifica a proporção molar de
colesterol:fosfolipídeos da MP do espermatozoide, podendo chegar próximo ao
encontrado em espécies que possuem maior resistência ao choque térmico pelo frio,
como coelho e humano (MOCÉ et al., 2010). No experimento 2 não houve diferença
entre o grupo tratado com 1,5 mg de colesterol solúvel em água após a
descongelação e a amostra avaliada após a colheita para o porcentual de vivos, o
que leva a constatação de que este composto não exerceu efeito protetor sobre o
espermatozoide equino.
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Apesar da melhora na congelabilidade do espermatozoide, o uso do complexo
de inclusão colesterol:ciclodextrina pode reduzir a taxa de gestação, requerendo um
tempo maior no trato reprodutivo feminino para que ocorra a reação do acrossomo
(MOCÉ et al., 2010). Quando o sêmen suplementado com colesterol é exposto a um
meio rico em ciclodextrina, ocorre uma redução da quantidade de colesterol na MP
(OLIVEIRA et al., 2010), permitindo a ocorrência da capacitação espermática e
aumentando a habilidade de ligação do espermatozoide à zona pelúcida
(BROMFIELD et al., 2014). Contudo, as doses testadas no presente experimento
não alteraram a taxa de espermatozoides apresentando reação do acrossomo
verdadeira ou falsa após a congelação, ratificando a hipótese da falta de
incorporação do colesterol solúvel em água à membrana plasmática.
A análise da atividade mitocondrial através da coloração com 3,3´diaminobenzidina, tem como função avaliar a capacidade de produção de ATP e
está correlacionada positivamente com a motilidade e a viabilidade celular
(GARNER et al., 1997). Além disso, a atividade mitocondrial está relacionada com a
produção de espécies reativas de oxigênio (reactive oxigen species - ROS) que em
níveis fisiológicos participam de eventos associados à fecundação como a
capacitação espermática, reação do acrossomo e interação entre o espermatozoide
e o ovócito (AMARAL et al., 2013). No presente trabalho a adição de lipídeos não
aumentou a porcentagem de espermatozoides com alta atividade mitocondrial.
Quando a produção de ROS excede a capacidade antioxidante do sêmen,
ocorre o fenômeno denominado estresse oxidativo, que se mostra deletério à
membrana plasmática e resulta na produção de metabólitos tais como o
malondialdeído (AITKEN et al., 2012). O processo de criopreservação aumenta a
peroxidação lipídica e pode causar um rearranjo irreversível dos lipídeos da
membrana, fatores que comprometem a capacidade fecundante do espermatozoide
(RICKER et al., 2006). A incorporação de ácidos graxos poli-insaturados na MP,
apesar de aumentar sua flexibilidade, pode torná-la mais susceptível à peroxidação
lipídica, diminuindo a viabilidade espermática (TOWHIDI & PARKS, 2012). No
entanto, esse efeito deletério não foi observado neste experimento à adição do OFB,
não havendo diferença significativa entre os níveis de peroxidação lipídica PC e PD,
no experimento 1. O OFB é um composto rico em DHA, que possui 22 átomos de
carbono e seis duplas ligações, sendo rapidamente incorporado pela MP (WASSALL
& STILLWELL, 2009), com grande afinidade pela fosfatidiletanolamina, acumulandose, preferencialmente, no folheto interno da bicamada lipídica (STILLWELL &
WASSAL, 2003). Esse PUFA pode atuar tanto como pró-oxidante, através da
predisposição em perder um elétron para os radicais livres nas duplas ligações entre
carbonos, ou como antioxidante (YAVIN, 2006), apesar desse efeito não estar
totalmente elucidado quanto a sua forma de atuação (GREEN et al., 2001).
No experimento 2, o nível de peroxidação lipídica diferiu entre os momentos
PC e PD (p < 0,05), porém, os valores encontrados parecem não ter atingido o limiar
do estresse oxidativo, visto que não houve diferença significativa para as variáveis
mortos, RAV, RAF e DAB I.
Mais pesquisas são necessárias para avaliar diferentes períodos e
temperaturas de incubação do sêmen equino com lipídeos exógenos, assim como
realizar a quantificação dos lipídeos para constatar se os mesmos foram ou não
incorporados à MP do espermatozoide. Além disso, diferentes concentrações do
óleo de fígado de bacalhau e do colesterol solúvel em água devem ser testadas,
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bem como devem ser avaliados seus efeitos sobre a fertilidade in vivo.
CONCLUSÕES
De acordo com os resultados obtidos conclui-se que o óleo de fígado de
bacalhau e o colesterol solúvel em água, nas concentrações testadas, não foram
eficazes em proporcionar maior crioresistência ao sêmen equino.
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