UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
ESCOLA DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA
ANIMAL NOS TRÓPICOS
VICTOR DIOGENES AMARAL DA SILVA
CARACTERIZAÇÃO, ATRAVÉS DE MÉTODOS
BIOQUÍMICOS E BIOFÍSICOS, DE DANOS MITOCONDRIAIS
E VACUOLIZAÇÃO AUTOFÁGICA INDUZIDOS POR
ALCALOIDES DA PROSOPIS JULIFLORA EM CÉLULAS DO
SISTEMA NERVOSO CENTRAL
SALVADOR
2012
ii
VICTOR DIOGENES AMARAL DA SILVA
CARACTERIZAÇÃO, ATRAVÉS DE MÉTODOS BIOQUÍMICOS E BIOFÍSICOS,
DE DANOS MITOCONDRIAIS E VACUOLIZAÇÃO AUTOFÁGICA INDUZIDOS
POR ALCALOIDES DA PROSOPIS JULIFLORA EM CÉLULAS DO SISTEMA
NERVOSO CENTRAL
Tese apresentada à Escola de
Medicina Veterinária e Zootecnia
da Universidade Federal da Bahia,
como requisito para a obtenção do
título de Doutor em Ciência
Animal nos Trópicos.
Orientadora: Profª. Dra. Silvia Lima Costa
Co-orientador: Profº. Dr. Juan Segura-Aguilar
SALVADOR
2012
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
SILVA, Victor Diogenes Amaral da
Caracterização, através de métodos bioquímicos e biofísicos,
de danos mitocondriais e vacuolização autofágica induzidos por
alcaloides da Prosopis juliflora em células do sistema nervoso
central/ Victor Diogenes Amaral da Silva
Salvador. 2012.
(91)p.
Orientador: Profa. Dra. Silvia Lima Costa.
Tese (doutorado) – Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade Federal da Bahia, 2012.
1. Prosopis juliflora. 2. Alcaloides piperidínicos. 3. Neurônios. 4.
Células gliais. 5. Mitocôndria. 6. Vacúolos Autofágicos I. Costa,
Silvia Lima. II. Universidade Federal da Bahia. Escola de Medicina
Veterinária e Zootecnia. III. Título
iv
CARACTERIZAÇÃO, ATRAVÉS DE MÉTODOS
BIOQUÍMICOS E BIOFÍSICOS, DE DANOS MITOCONDRIAIS
E VACUOLIZAÇÃO AUTOFÁGICA INDUZIDOS POR
ALCALOIDES DA PROSOPIS JULIFLORA EM CÉLULAS DO
SISTEMA NERVOSO CENTRAL
VICTOR DIOGENES AMARAL DA SILVA
Tese defendida e aprovada para obtenção do grau de Doutor em Ciência Animal nos Trópicos
Salvador, 01 de novembro de 2012.
Comissão examinadora:
Prof. Dr. José Antonio Menezes Filho
Profa. Dra. Maria José Moreira Batatinha
Profa. Dra. Camila Alexandrina Viana
de Figueredo
Prof. Dr. Juan Segura-Aguilar
Profa. Dra. Silvia Lima Costa
v
A Fidelina Maria da Silva, minha avó
falecida em 12 de outubro de 1992,
analfabeta, como milhões de brasileiros
ainda são, que com seis filhos e ainda
dificuldades financeiras, não hesitava
em acolher familiares e amigos do
interior da Bahia, objetivando o
crescimento educacional da família.
vi
AGRADECIMENTOS
A Deus por ter me munido de assessores para que este trabalho fosse concluído.
A Silvia Lima Costa, pelo estímulo incessante para que eu me tronasse um
pesquisador. A nove anos atrás foi a responsável por minha inserção na pesquisa, e
ainda é um modelo exemplar de pesquisadora a ser seguido. As maiores lições que
aprendi com a minha orientadora foram a lealdade, coragem e perseverança, que sem
dúvidas fazem muita diferença para aqueles que são pesquisadores. Não poderia deixar
também de agradecê-la pelo fato dela ser uma excelente amiga, irmã e mãe, com
características marcantes de leonina, o que a torna muito especial na forma de educar e
proteger suas ¨crias¨.
Coincidência ou não, sou filho de uma leonina, Dalva de Jesus do Amaral da Silva, que
devo agradecer a bravura com que dedicou sua vida com muito amor e ainda hoje, junto
a Nilo da Silva, meu querido pai contribui muito para cada conquista minha.
A minha querida irmã, Daniela Amaral da Silva e seu noivo Jailton Andrade, que me
auxiliaram em muitos momentos a solucionar problemas que surgiram durante o
período de desenvolvimento deste trabalho. Ainda, ao suporte para equilíbrio emocional
que Daniela me dá, diante de qualquer dificuldade.
A terceira Leonina de grande importância para minha vida e esta tese, Cátia Suze
Ribeiro, pelo amor e confiança, que geram sempre palavras de muito incentivo que me
encorajaram nas tomadas de decisões durante o desenvolvimento deste trabalho.
A Aroldo José Borges Carneiro, pelo auxilio na coleta de folhas da Prosopis juliflora, nos
períodos iniciais dos estudos apresentados nesta Tese.
Aos amigos, Bruno Pitanga e Gustavo Rodrigues, pelo apoio nos primeiros anos de
construção desta tese.
Ao Professor Eudes da Silva Velozo e a querida equipe do LAPEM, em especial a
Railda, que me deu suporte técnico para extração dos alcaloides de folhas da Prosopis
juliflora.
Aos Professores Fátima Dias Costa e Ramon dos Santos El-Bachá, pela disposição a
auxilio e incentivo a pesquisa no Laboratório de Neuroquímica e Biologia Celular.
Aos queridos colegas e membros do Laboratório de Neuroquímica e Biologia Celular,
em especial a Ravena Pereira do nascimento e Luã Tainã Costa Reis, aos quais eu
confiei à posse das alícotas de alcaloides e continuaram as atividades no Brasil
enquanto estive no Chile. E aos demais pelo companheirismo e amizade.
Ao Professor Juan Segura-Aguilar, pelo convite, orientação e suporte em Doutorado
Sanduíche no Laboratório de Neurofarmacologia Celular y Molecular, da Universidade
do Chile.
vii
Aos colegas do Laboratório de Neurofarmacologia Celular y Molecular, da Universidade
do Chile, em especial a Carlos Cuevas, Patricia Munoz, Monica Villa, Ulises Ahumada e
Veronica Toro que me auxiliaram diretamente nos experimentos realizados durante
estadia neste laboratório. E aos demais pelo companheirismo e amizade.
Por fim aos familiares e amigos que me deram apoio durante todo o período de
doutoramente, em especial aqueles que contribuíram para a minha estabilidade
emocional durante estadia no exterior: Dulcinea Augusta de Jesus, Patrícia Silva
Santos, Moises Vasconcelos Costa, Luciano Pereira, Ilana Coutinho de Alencar, Jean
Cardozo, Till Hauswald, May-Lin Tay Morán, Pablo Seura, Lisis Hansen e toda a equipe
do Centro de Estudios Espírita Buena Nueva.
viii
“"Deus nos concede, a cada dia, uma página de vida nova no livro do tempo. Aquilo que
colocarmos nela, corre por nossa conta”.
(Chico Xavier)
ix
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATÚRAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
SUMMARY
1. INTRODUÇÃO
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. As plantas do gênero Prosopis
2.1.1. Prosopis juliflora
x
xii
xiv
xv
1
2
2
3
2.1.1.1 Introdução no Brasil
3
2.1.1.2. Uso da espécie e compostos bioativos
3
2.1.1.3. Intoxicações pelo consumo da Prosopis juliflora
6
2.2. Aspectos estruturais e funcionais dos principais
componentes celulares do SNC
2.3. A ação de alcaloides da Prosopis juliflora no SNC
3. ARTIGO CIENTÍFICO I:
Alcaloides piperidínicos da Prosopis juliflora induzem dano
mitocondrial e vacuolização citoplasmática.
3.1. Introdução
3.2. Materiais e Métodos
3.3. Resultados
3.4. Discussão
3.5 Agradecimentos
3.6 Referencias
4. ARTIGO CIENTÍFICO II:
Autofagia protege contra a morte celular induzida por alcaloides da
Prosopis juliflora em co-cultura de neurônios/células da gliais.
4.1. Introdução
4.2. Materiais e Métodos
4.3. Resultados
4.4. Discussão
4.5 Agradecimentos
4.6 Referencias
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
7. PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA
8. ANEXOS
8
12
14
16
17
23
26
31
32
48
50
51
55
57
59
60
72
73
92
94
x
LISTA DE ABREVIATURAS
ATP – Adenosina Trifosfato
DL50- Dose letal cinquenta (mata 50% dos indivíduos em teste de toxicidade).
DMEM – Meio de Eagle modificado por Dulbecco.
DMSO – Dimetilsulfóxido
EC50– Efeito citotóxico cinquenta (mata 50% das células contidas na amostra).
EDTA - Ácido etileno diamino tetracético
ETA - Extrato alcaloidal de folhas da P. juliflora
F29/30 - União da vigésima nona e trigésima fração alcaloidal, oriundas do ETA
F31/33 - União da trigésima primeira e trigésima terceira fração alcaloidal, oriunda
do ETA
F32 - Trigésima segunda fração alcaloidal, oriunda do ETA
F34/35 - União da trigésima quarta e trigésima quinta fração alcaloidal, oriunda do
ETA
GFAP – Proteína ácida fibrilar glial
GL-15 – Linhagem de células originada de glioblastoma multifoeme humano.
IFN - Interferon
LDH – Lactato desidrogenase.
MHC – Complexo maior de histocompatibilidade
MTT - Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio
xi
NO - Óxido Nitrico
PBS – Tampão fosfato salino
RMN – Resonância magnética nuclear
SFB – Soro fetal Bovino
SNC – Sistema nervoso central
TGF – Fator de crescimento tumoral
xii
LISTA DE FIGURAS
ARTIGO CIENTÍFICO I
Figura 1 – Estrutura química dos alcaloides piperidínicos juliprosina e
juliprosopina, presentes na fração F32.
40
Figura 2 – Análise do efeito dos alcaloides de P. julifora sobre
viabilidade dos neurônios e células gliais através do teste do MTT.
41
Figura 3 - Análise do efeito dos alcaloides de P. juliflora na morfologia
celular e indução de vacuolização de astrócitos em co-culturas de
neurônios/células gliais através da coloração com o agente pancrônico
de Rosenfeld.
42
Figura 4 - Análise do efeito dos alcaloides de P. juliflora na morfologia
de astrócitos e expressão GFAP em co-culturas de neurônios/células
gliais.
43
Figura 5 – Análise do efeito dos alcaloides de P. juliflora na morfologia
de neurônios e expressão β-III-tubulina em co-culturas de
neurônios/células gliais.
44
Figura 6 – Análise do efeito dos alcaloides de P. juliflora na ativação
da microglia em co-culturas de neurônios/células gliais após marcação
imunocitoquímica da proteína OX-42 e coloração com Rosenfeld.
45
Figura 7 – Medida da produção de nitrito (NaNO2) no meio de cultura
em condições de controle e após 24 h de tratamento com 1,5 - 3 µg/ml
de ETA ou F32.
46
Figura 8 – Análise por microscopia eletrônica de transmissão de
modificações ultraestruturais induzidas por alcaloides de P. juliflora em
co-culturas de neurônios/células gliais.
47
ARTIGO CIENTÍFICO II
Figura 1 - – Níveis de ATP por luminescência em condições controle
(0.1% DMSO) ou na presença de 30 µg/mL ETA ou 7,5 µg/mL F32, for
12 h. *p<0.001.
66
xiii
Figura 2 – Análise de alterações no potencial de membrana
mitocondrial por coloração com JC-1 em co-cultura de
neurônio/células gliais visualizada por microscopia confocal.
67
Figura 3 - Ativação de caspase-3 em co-culturas de neurônios/células
gliais em condições controle (0.1% DMSO) ou tratadas durante 16 h
com 30 µg/mL de ETA ou 7,5µg/mL de F32 foi determinada por
análises de western blotting (A).
68
Figura 4 - Determinação de vesículas de autofagossomos em coculturas de neurônios/células gliais transfectadas com GFP-LC3.
69
Figura 5 – O efeito da inibição ou indução de autofagia em células
expostas a 30 µg/mL de ETA (A) ou 7,5 µg/mL de F32 (B) por 24 h.
70
Figura 6 – Efeitos da inibição ou indução de autofagia na morfologia
de neurônios e células gliais co-cultivados expostos a 30 µg/mL de
ETA, 7,5 µg/mL de F32 ou condições controle durante 24h.
71
xiv
SILVA, Victor Diogenes Amaral da. Caracterização, através de métodos
bioquímicos e biofísicos, de danos mitocondriais e vacuolização autofágica
induzidos por alcaloides da Prosopis juliflora em células do sistema nervoso
central.. 2012. (91)p.Tese (Doutorado em Ciência Animal nos trópicos) - Escola de
Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2012.
RESUMO
As vagens da Prosopis juliflora são muito utilizadas para consumo animal e humano.
No entanto, a sua ingestão como base alimentar induz intoxicação em animais, que
se caracteriza por alterações neuromusculares cujos mecanismos ainda não são
bem esclarecidos. Nesta Tese são apresentados os resultados obtidos em estudos
sobre a caracterização in vitro de lesões celulares e ultraestruturais antes vistas em
animais intoxicados pelo consumo da P. juliflora e a investigação dos mecanismos
de neurotoxicidade de alcaloides piperidínicos desta planta em modelo de
co-culturas de neurônios/células gliais derivadas do córtex de ratos. Nos dois
capítulos apresentados, as células gliais e neurônios foram expostos a alcaloides
extraídos de folhas da P. juliflora testados na forma de extrato alcaloidal (ETA) e
uma fração de alcaloide (F32). No primeiro estudo a F32 foi caracterizada por RMN
como uma mistura dos alcaloides juliprosopina e juliprosina. ETA e F32
apresentaram atividade citotóxica e os valores de EC50 foram 31,07 µg/ml e 7,36
µg/ml, respectivamente. A exposição das células à concentrações subtóxicas induziu
vacuolização, alterações fenotípicas e mudanças ultraestruturais, caracterizadas
pela formação de vacúolos com dupla ou múltipla membranas e danos
mitocondriais. Ainda, nas culturas expostas a doses subtóxicas foi observada
microgliose. No segundo estudo foram utilizadas concentrações próximas à EC50 e
foi demonstrado que ETA e F32 induziram redução nos níveis de ATP, perturbação
do potencial de membrana mitocondrial e aumento significativo no número de
células LC3-positivas após 12 h de exposição, aumento na ativação da caspase-3,
após 16 h de exposição, e alteração drástica na morfologia de neurônios e de
células gliais e um aumento significativo na morte celular após 24 horas de
exposição. Curiosamente, pré-incubação com bafilomicina aumentou a morte celular
e alterações morfológicas induzidas pelo ETA, e privação de soro fetal bovino
reduziu a morte celular e alterações morfológicas induzidas por F32. Estes
resultados sugerem que os alcaloides juliprosopina e juliprosina são os responsáveis
primários pelos danos neurotóxicos observados em animais intoxicados pela P.
juliflora e que o mecanismo de morte neuronal e glial induzida por estes envolve
apoptose em resposta ao dano mitocondrial e inibição do fluxo da autofagia. Além
disso, a autofagia parece ser um mecanismo importante de proteção contra a morte
celular induzida por alcaloides da P. juliflora em co-cultura de neurônios/células
gliais.
Palavras-chave: Prosopis juliflora; alcaloides piperidínicos; neurônios; células gliais;
mitocôndria; vacúolos autofágicos.
xv
SILVA, Victor Diogenes Amaral da. Characterization of mitochondrial damages
and autophagic vacuolation induced by alkaloids of Prosopis juliflora in the
central nervous system cells using biochemical and biophysical methods.
2012. (91)p. Thesis (Ph.D., Animal Science in the Tropics) - School of Veterinary
Medicine and Zootechny, Federal University of Bahia, Salvador, 2012.
SUMMARY
Prosopis juliflora pods is largely used for animal and human consumption. However,
ingestion as sole substance has been shown to induce intoxication in animals, which
is characterized by neuromuscular alterations induced by mechanisms that are not
yet well understood. In this thesis we present the results obtained in two in vitro
studies conducted for characterization of cellular and ultrastructural damages
observed in intoxicated animals after P. juliflora consumption, and mechanisms of
neurotoxicity induced by alkaloids from this plant, using as a model cortical
neurons/glial cells co-cultures derived from rats. Cells were exposed to a total
alkaloidal (TAE) extract from leaves of P. juliflora and an alkaloidal fraction (F32). In
the first study F32 was characterized by NMR as a mixture of two piperidine alkaloids
juliprosopine and juliprosine. TAE and F32 were cytotoxic and the EC50 values were
31.07 µg/mL and 7.36 µg/mL, respectively. Exposure to sub-toxic concentration
induced vacuolation and phenotypic and ultra-structural changes, characterized by
formation of double or multi membrane vacuoles and mitochondrial damage. Even in
cultures exposed to sub-toxic doses microgliosis was also observed. In the second
study, conducted with TAE and F32 doses near the EC50 concentrations, we found
that both TAE and F32 induced reduction in ATP levels, disruption of mitochondrial
membrane potential and a significant increase in the number of autophagosome LC3
positives cells after 12 h exposure, and caspase-3 activation, a marker of apoptosis
after 16 h exposure, dramatic change on neuron and glial cells morphology and
significant cell death after 24 h. Interestingly pre-incubation with bafilomycin, an
inhibitor of autophagy, increased the cell death and morphologic changes induced by
TAE, and serum deprivation reduced the cell death and morphologic changes
induced by F32. These results suggest that juliprosopina and juliprosina alkaloids are
primarily responsible for the neurotoxic damage observed in animals intoxicated by
P. juliflora and that the mechanism of neuronal and glial cell death induced by these
involves apoptosis in response to mitochondrial damage and inhibition of the
autophagic flux. Furthermore, autophagy appears to be an important mechanism of
protection against cell death induced by alkaloids of P. juliflora in co-culture of
neuronal/glial cells.
Palavras-chave: Prosopis juliflora; piperidine alkaloids; neurons; glial cells;
mitochondria; autophagic vacuoles.
1. INTRODUCAO GERAL
Prosopis juliflora Sw. DC (algaroba) é um arbusto que foi introduzido no
nordeste do Brasil em 1940 (SPA, 1989). As vagens desta planta são ricas em
carboidratos e proteínas e têm sido uma fonte importante de alimento para humanos
e animais (CHOGE et al., 2007; SILVA et al., 2002a; SILVA et al., 2002b; STEIN et
al., 2005; PINHEIRO et al., 1986; ROSSI et al., 2009). No entanto, o consumo
destas vagens provoca uma enfermidade quando é a única fonte de alimento para o
animal (BACA et al, 1967; DOLLAHITE & ANTHONY, 1957). A enfermidade induzida
por esta planta em animais é denominada ''Cara torta" e caracteriza-se por
emagrecimento, alterações neuromusculares (incluindo atrofia muscular dos
masseteres), e lesões histológicas tais como espongiose, gliose, a perda da
substância de Nissl e vacuolização do pericário de neurônios do núcleo motor do
nervo trigêmeo (FIGUEIREDO et al., 1995, TABOSA et al., 2000a).
Extratos de vagens e folhas de algaroba têm demonstrado possuir várias
propriedades farmacológicas, atribuídas especialmente aos alcaloides piperidínicos
presentes em diversas partes desta planta (KANTHASAMY et al, 1989; CÁ-CERES
et al, 1995;. AL-SHAKH-HAMED & AL-JAMMAS, 1999; SATISH et al, 1999;
KANTHASAMY et al, 1989; KAUSHIK et al, 2002; CHOUDHARY et al. 2005;
BATATINHA et al., 2011). Estudos in vitro demonstraram que os alcaloides
presentes nas vagens e folhas da P. juliflora têm ação direta sobre células gliais
gerando efeitos tóxicos e inflamatórios e ainda sugerem que alcaloides que
compõem uma fração (F32) obtida por cromatografia do extrato total de alcaloides –
ETA são os que apresentam maior potencial biológico (HUGHES et al, 2006; SILVA
et al, 2007). No entanto ainda não se sabe quais os alcaloides presentes na fração
F32 e ainda se estes são capazes de induzir in vitro aquelas lesões neurohistológicas e ultraestruturais visualizadas em animais intoxicados pelo consumo da
P. juliflora (TABOSA et al, 2000a; TABOSA et al, 2006;. CÂMARA et al, 2009).
Assim, nesta Tese são apresentados os resultados obtidos em estudos
sobre a caracterização in vitro de lesões celulares e ultraestruturais antes vistas em
animais intoxicados pelo consumo da P. juliflora e na investigação dos mecanismos
1
de neurotoxicidade de alcaloides piperidínicos desta planta visando contribuir para
elucidar os impactos neurológicos observados em animais intoxicados e definir
aspectos da toxicologia dos alcaloides piperidínicos.
2. REVISAO DE LITERATURA
2.1. As plantas do gênero Prosopis
Plantas do gênero Prosopis, família Fabaceae (Leguminosae) e subfamília
Mimosoideae, conhecidas por diversos nomes vulgares dentre eles a Algaroba e
Mesquita são árvores ou arbustos com variados tamanhos, raramente sub-arbustos
e predominantemente xerófilos, aculeados, espinhosos ou raramente armados
(Anexo 2)
. As folhas são bipinadas, comumente com poucos pares de pinas opostas;
folíolos pequenos, numerosos, geralmente opostos, lineares, oblongos, fusiformes,
raramente grandes, da mesma cor em ambos os lados. Os frutos são lomentos
drupáceos, lineares, retos, falcados, anulares para espiralados; mesocarpo carnudo,
acurado ou fibroso; endocarpo dividido em compartimentos para uma semente,
segmentos coriáceos para lenhosos, fechados ou às vezes de fácil abertura,
longitudinais ou raramente seriados e transversos, com sementes ovóides,
achatadas com linha fissural nas faces, duras, amarronzadas, com endosperma
mucilaginoso circundando o embrião; cotilédones achatados, arredondados,
epígenos na germinação. As flores são pequenas, actinomorfas, hermafroditas, de
coloração branco-esverdeada, amarelada com a idade, polinizada por insetos
(BURKART, 1976; GARIBALDI, 2001).
Este gênero possivelmente originou-se na África Tropical, onde a P. africana
é a última espécie natural que ainda existe. Seguindo a teoria de que os continentes
eram ligados, os ancestrais das espécies americanas migraram da África para a
América e originaram dois polos de evolução: um na região México-Texana e outro
na região Argentina-Paraguai-Chile. Muitos fatores indicam que, na América, o
centro principal de dispersão de Prosopis é a Argentina (BURKART, 1976).
Atualmente este gênero compreende 44 espécies distribuídas por toda a Ásia
2
Ocidental, África e regiões áridas e semi-áridas das Américas, desde o sudoeste dos
Estados Unidos a região central do Chile e Argentina (SILVA et al., 1986a).
Burkart (1976) classificou o gênero Prosopis em cinco seções com base em
diferenças morfológicas observadas em distintos lugares, duas delas da África e da
Ásia: Prosopis e Anonychium; e três delas ocupando as Américas: Monilicarpa,
Strombocarpa e Algarobia, sendo esta última subdividida em cinco séries: Pallidae,
Humildes, Denundantes, Sericanthae e Chilenses, a qual faz parte a espécie
Prosopis juliflora. No entanto, estudos recentes de caracterização taxonômica
usando técnicas de biologia molecular, sugerem a necessidade de reclassificação
das espécies dentro das diferentes séries da seção Algarobia, por existirem
espécies nesta seção que não são geneticamente relacionadas (SHERRY et al.,
2011).
2.1.1. Prosopis juliflora
2.1.1.1 Introdução no Brasil
Esta espécie, atualmente, pode ser encontrada em todo o Nordeste e em
outras regiões do Brasil, com as maiores concentrações nos Estados de
Pernambuco (PE), Rio Grande do Norte, Minas Gerais e Paraíba (SILVA et al.,
1986a). Estudos de Lima & Silva (1991) demonstram que também há a presença da
P. affinis em Serra Talhada - PE e sugerem que o lote de sementes de P. juliflora
introduzida em 1942, continha mistura de sementes de P. affinis, ou sementes de
material híbrido das duas espécies.
A primeira introdução da P. juliflora no Nordeste Brasileiro ocorreu com
sementes procedentes do Peru (AZEVEDO, 1961; GOMES, 2007). Duas
introduções adicionais foram feitas em Angicos, Rio Grande do Norte: em 1947, com
sementes do Peru e, em 1948, com sementes oriundas do Sudão (AZEVEDO,
1955). A partir daí, sua expansão para os demais estados da federação ocorreu
através da regeneração natural e plantios.
2.1.1.2. Uso da espécie e compostos bioativos
O Brasil apresenta uma região caracterizada como semi árido que possui
precipitação pluviométrica média anual inferior a 800 milímetros, índice de aridez de
até 0,5 calculado pelo balanço hídrico que relaciona as precipitações e a
3
evapotranspiração potencial no período entre 1961 e 1990, e risco de seca maior
que 60%, tomando-se por base o período entre 1970 e 1990. Esta região engloba os
Estados de Alagoas, Bahia, Ceará, Minas Gerais, Paraíba, Pernambuco, Piauí, Rio
Grande do Norte e Sergipe, abrangendo um total de 1.133 municípios (PEREIRA
JR., 2007). No entanto, em 2012 os índices pluviométricos nesta região foram tão
baixos que, de acordo com o Ministério da Integração Nacional, 8,3 milhões de
brasileiros de 1.187 municípios foram afetados pela seca durante este ano (MIN,
2012). Em geral esta região apresenta uma vegetação denominada Caatinga, que
se caracteriza por uma baixa produtividade e pequena diversidade de espécies em
relação à floresta tropical úmida. A Caatinga se desenvolve em condições adversas,
como solos rasos, pedregosos ou arenosos, com pH neutro ou próximo de 7, pobre
em material orgânico e rico em sais minerais solúveis, especialmente cálcio e
potássio (MENDES, 1986a). Apesar destas condições adversas a algaroba é capaz
de se desenvolver plenamente, passando então a servir como recurso alternativo
para esta região pela sua alta resistência e adaptabilidade (MENDES, 1986b;
SANTOS & TERTULIANO, 1998; PEGADO et al., 2006).
Outro fator que tornou a algaroba extremamente importante para o nordeste
brasileiro foi o seu potencial em produzir vagens com alta palatabilidade e valor
nutricional, e que fizeram da planta uma fonte geradora de alimentos para o homem
e para os animais desta região (SILVA et al., 2008; MENDES, 1986b). Além das
vagens, as folhas também são usadas na alimentação animal. Juntas geram uma
capacidade produtiva de ração de 20 a 40 toneladas por hectare por ano (SILVA,
1986b; GARIBALDI, 2001).
Sabe-se que 100g da farinha de vagens possui 10 g de água, 25 g de
proteínas, 5,2 g de gorduras, 36,5 g de carboidratos, 20 g de fibra bruta e 3,3 g de
sais minerais. Os altos níveis de carboidratos fazem com que as vagens apresentem
sabor adocicado, e também torna possível a produção de álcool etílico a partir delas
(SILVA et al., 2003). Os níveis de macronutrientes em folhas novas e em folhas
velhas são respectivamente: N 2,59-1,90%; P 0,23-0,14%; K 1,93-2,04%; Ca 0,450,64%; Mg 0,49-0,63%; S 0,20-0,21% (HAAG et al., 1986).
4
Desta forma têm-se sugerido a utilização das vagens da P. juliflora como
suplemento ou parte integrante de rações na alimentação animal, objetivando-se a
substituição do milho ou de outra fonte de energia e proteínas nas dietas de
codornas (SILVA et al., 2002a), galinhas poedeiras (SILVA et al., 2002b) eqüinos
(STEIN et al.,
2005), suínos (PINHEIRO et al., 1986), ruminantes (BARROS e
QUEIROZ FILHO, 1982; RAVIKALA et al., 1995; MAHGOUB et al., 2005) e peixes
(BASTOS & FAÇANHA, 1985).
As espécies do gênero Prosopis têm sido uma fonte histórica de alimentos
para as populações humanas na América do Norte e América do Sul, pelos povos
indígenas, e ainda hoje as vagens e farinhas oriundas destas têm sido usadas para
o consumo humano como pães, biscoitos, geléias, doces e ainda para a produção
de água ardente e bebida substituta do café (SILVA, 1986b; VIEIRA et al, 1995;
SILVA et al., 2003; CHOGE et al, 2007).
Moléculas com potencial bioativo isoladas da P. juliflora incluem esteróides,
alcaloides, cumarinas, flavonóides, sesquiterpenos, ácido esteárico, proteínas do
pólen de ação alergênica e das sementes com ação inibidora de proteinases
(OLIVEIRA et al., 2002; KILLIAN & MCMICHAEL, 2004; ALMARAZ-ABARCA et al.,
2007).
Os principais alcaloides piperidínicos já caracterizados em diferentes partes
da P. juliflora são a juliprosopina (juliflorina); juliprosina, juliprosineno, julifloridina,
julifloricina, juliflorinina. A comparação da estrutura proposta para a juliprosopina,
com base nos dados espectrométricos da juliflorina, revelou que os dois alcaloides
são idênticos, por isso passaram a ser considerados sinônimos (AHMAD et al.,
1986). Ahmad & Mohammad (1979) buscaram elucidar a estrutura da juliprosopina
(C40H75N3O2) encontrando este composto também na P. glandulosa. Este mesmo
alcaloide (OTT-LONGONI et al., 1980) e a juliprosina (C40H72N3O2) (DAETWYLER et
al., 1981) foram isoladas das folhas da P. juliflora, obtidas como uma resina incolor e
um óleo, respectivamente. Ahmad et al. (1985) e Aqeel Ahmad et al. (1989)
concluíram, através de dados espectrométricos, que a juliprosopina e a julifloricina
são alcaloides isômeros. A estruturas dos alcaloides juliprosinina (C40H70N3O2) e
juliflorinina (C40H75N3O2), que possui a mesma configuração da juliflorina
5
(juliprosopina) foram determinadas por Ahmad e colaboradores, em 1989 e os
compostos caracterizados como um sal clorado, obtidos como uma resina.
Os alcaloides piperidinicos da P. juliflora têm a sua estrutura composta por
dois anéis de piperidínicos, que são ligados a um anel indolizidínico através de duas
cadeias alifáticas (AHMAD & MOHAMMAD et al, 1979;. AHMAD et al, 1985;.
AHMAD et al, 1986b,. AHMAD et al., 1989). Os alcaloides biologicamente ativos
juliprosina e juliprosopina apresentam grupos funcionais químicos (carbonilas e
hidroxilas) em carbonos 3 e 3' dos anéis de piperidínicos ou no carbono 3''' do anel
indolizidínico, respectivamente (NAKANO et al, 2004.; CHOUDHARY et al, 2005).
Diversas
propriedades
farmacológicas
têm
sido
demonstradas
para
compostos obtidos de folhas e frutos da P. juliflora tais como ação anti-bacteriana
(AQEEL AHMAD et al, 1989a; AQEEL AHMAD et al, 1986; AQEEL AHMAD et al,
1995, KANTHASAMY et al, 1989; CÁ-CERES et al, 1995; SATISH et al, 1999;
LAKSHMI et al., 2010), antifúngica (AQEEL AHMAD et al, 1989b; KANTHASAMY et
al, 1989, KAUSHIK et al, 2002), estimulante do sistema imunitário (AQEEL AHMAD
et al. 1992), e os inibidores da acetilcolinesterase, inibidora da butirilcolinesterase
com atividade de bloqueio de canais de Ca2+ (CHOUDHARY et al. 2005), e antihelmíntica (BATATINHA et al., 2011). Estas propriedades têm sido atribuídas aos
alcaloides piperidinicos existentes nas diversas partes desta planta (AQEEL AHMAD
et al., 1989; TABOSA et al., 2000a).
2.1.1.3. Intoxicações pelo consumo da Prosopis juliflora
Desde a década de 50, esta planta tem sido descrita como causadora de
intoxicação em animais nos EUA (DOLLAHITE & ANTHONY, 1957), Peru (BACA et.
al., 1967). Mais tarde, no Brasil a doença em bovinos, provocada pela sua ingestão,
veio a ser chamada de doença da cara torta, caracterizada por edema, alterações
neuromusculares, incluindo atrofia do masseter e lesões histológicas como
espongiose, gliose, perda de substância de Nills e vacuolização de neurônio de
núcleo de nervo cranial (FIGUEIREDO et al, 1995).
Em caprinos, TABOSA et al. (2000a) demonstraram toxicidade para animais
após ingestão crônica de uma dieta composta de 60 a 90% de matéria seca de
6
vagens de P. juliflora. Os animais apresentaram sinais clínicos semelhantes àqueles
que foram previamente observados na intoxicação de bovinos pelo consumo de
vagens (FIGUEIREDO et al., 1995) e na microscopia, foram observadas lesões
histológicas caracterizadas por vacuolização dos neurônios do núcleo oculomotor do
nervo trigeminal, degeneração walleriana dos nervos mandibulares e trigeminais e
atrofia muscular por degeneração de nervos periféricos. A intoxicação experimental
em bovinos com dieta crônica de alta porção de vagens (> 50%) evidenciou além
dos sinais clínicos e alterações histológicas previamente evidenciadas, que estes
animais apresentavam em neurônios do núcleo trigeminal, mitocôndrias com cristas
dispersas perifericamente e desintegradas.
Casos de intoxicações espontâneas são atualmente relatados em região do
semi-árido brasileiro, em bovinos que pastejaram áreas invadidas pela Prosopis
juliflora ou que ingeriram as vagens como alimento concentrado (CÂMARA et al.,
2009).
Até então, pouco se sabe sobre os principios ativos presentes nas vagens desta
planta, mas alguns estudos foram pioneiros em apontar os alcaloides piperidínicos
como potencialmente tóxicos (AQUEEL AHMAD et al., 1991; BATATINHA, 1997).
Estudos de toxicidade em camundongos realizados por Tabosa e colaboradores
(2000b) sugerem que o efeito tóxico das vagens da algaroba esta relacionado a uma
ação sinérgica em uma fração da vagem (FAT) contendo os alcaloides juliprosopina,
juliprosina e juliprosineno. Estes pesquisadores chegaram a tal reflexão ao
compararem a DL50 da FAT (10,3 mg/Kg) com a DL50 do alcaloide juliprosopina
isolado (20,8 mg/Kg). A ação sinérgica de alcaloides piperidínicos de vagens da P.
juliflora, também foi demonstrada em culturas celulares por Batatinha (1997). O
extrato metanólico de vagens, a fração alcaloidal, bem como dois alcaloides isolados
(juliprosopina e juliprosina) foram testados quanto a sua citotoxicidade em culturas
de tumor epitelial humano (HeLa), tumor hepático (HepG2) e em dois modelos de
fibroblastos: cultura primária de fibroblasto epitelial humano (F26) e linhagem de
tumor sinovial (F57). Neste estudo foi verificado que todas as culturas sofreram
lesão em membrana células, como efeito citotóxico. Evidenciando que houve lesão
de membrana em mais de 90% das células tratadas com 3mg/mL do um extrato
7
metanólico, 3 a 300 µg/mL da uma fração alcaloidal ou 30 µg/mL dos alcaloides
juliprosina e juliprosopina, isolados.
2.2. Aspectos estruturais e funcionais dos principais componentes celulares
do SNC
O sistema nervoso central (SNC) é constituído de neurônio, unidade
sinalizadora; e de um conjunto polivalente de células chamado de neuroglia ou glia
(LENT, 2005). As células da glia dispõem-se circundando o corpo celular, axônio e
dendritos dos neurônios para interagir extensivamente, influenciando suas
atividades. Também estão envolvidas na detoxificação e manutenção da
homeostasia (FIELD & STEVENS-GRAHAM, 2002; LENT, 2005).
Como unidade fundamental do SNC, o neurônio é capaz de receber,
processar e enviar informações, e para tanto apresenta a particularidade de
apresentar processos polarizados especializados denominados de neuritos (axônios
e dendritos) capazes de propagar potenciais de ação, fazer junções sinápticas com
outros neurônios e células, formando locais de liberação para neurotransmissores
estocados em vesículas membranosas (MOREST & SILVER, 2003; LENT, 2005). O
citoesqueleto dos neurônios é constituído por duas estruturas principais: os
microtúbulos, presentes no corpo celular, alongado para os axônios e dendritos; e os
neurofilamentos, que são componentes constantes dos axônios, apresentando-se
raramente em dendritos (MACHADO & FIGUEREDO, 1996; SIEGEL et al., 1999).
Dentre os fatores que podem influenciar a composição proteica dos prolongamentos
neuronais, destaca-se o ambiente em que o mesmo está situado. Isso foi
comprovado por Sonderegger et al. (1985), que revelaram diferença em doze
proteínas componentes dos axônios, comparando neurônios cultivados na presença
de outras células do sistema nervoso central e periférico. Assim como os
constituintes proteicos do citoesqueleto são influenciados pelo meio em que o
neurônio se encontra, a quantidade e tamanho dos neuritos também podem sofrer
alterações. Isso foi demonstrado in vitro por WANG & CYNADER (1999), que
comparando
culturas
de
neurônios
cultivadas
sobre
diferentes
matrizes,
evidenciaram a importância das células gliais para constituição de um ambiente que
melhor proporciona o desenvolvimento e a sobrevida de neurônios.
8
As células gliais podem ser divididas em duas grandes classes: a macroglia e
a microglia. A macroglia, de origem embrionária neuroepitelial, inclui os
oligodendrócitos e os astrócitos. Os oligodendrócitos são responsáveis pela
mielinização dos axônios neuronais, com o intuito de promover a condução saltatória
do potencial de ação, impedindo que o impulso elétrico alastre-se para outras
células que não sejam o alvo, possibilitando assim maior eficiência e rapidez na
condução do impulso nervoso (KRIEGSTEIN & GÖTZ, 2003; LENT, 2005). Outras
propriedades biológicas têm sido atribuídas aos oligodendrócitos tais como a
atividade imunoefetora, pelo fato destas células expressarem moléculas de MHC
classe I e II em suas membranas plasmáticas (SIEGEL et al., 1999), e mais
recentemente a participação da nutrição de neurônios juntamente com os astrócitos
foi demonstrada (FÜNFSCHILLING et al., 2012).
Os astrócitos, assim denominados pela morfologia estrelada, constituem a
população mais numerosa do sistema nervoso central (COMBES et al., 2012). São
fundamentais para a captação de nutrientes e de oxigênio do sangue para os
neurônios, para a manutenção da homeostasia do SNC, compõem o arcabouço
tecidual que fornece sustentação ao SNC e participam ainda dos mecanismos de
defesa imunitária do tecido nervoso e dos fenômenos de detoxificação cerebral
(TARDY, 1991; LENT, 2005; TARDY, 2002). Estas células participam do processo
de eliminação de espécies reativas de oxigênio, predominantemente pela ação das
enzimas catalase e glutationa peroxidase (DRINGEN et al., 2005) e através de
moléculas receptoras nos pedículos das extremidades dos prolongamentos
astrocitários, rodeiam as sinapses centrais, para detoxificar o excedente de
neurotransmissores acumulados nas fendas sinápticas, tais como o ácido gamaaminobutírico (GABA) e o glutamato, que são metabolizados em glutamina. Este
aminoácido, por sua vez, pode ser disponibilizado para os neurônios e utilizado para
reformulação de neurotransmissores (CAJAL, 1995; KIRCHHOFF et al., 2001;
NAKASE & NAUS, 2004). Anteriormente achava-se que esta seria a única
participação dos astrócitos nas sinapses, atualmente têm sido propostas
comunicações diretas entre astrócitos e neurônios com o desenvolvimento do
conceito de gliotransmissores, que se refere à capacidade de os astrócitos para
libertar vários transmissores, tais como adenosina trifosfato (ATP), glutamato, Dserina, e GABA na vizinhança das sinapses (ACHOUR & PASCUAL, 2012). Os
9
astrócitos
também
representam
o
componente
principal
da
Barreira
Hematoencefálica gerando através dos chamados pés astrocitários (processos
citoplasmáticos) contato direto com as células endoteliais, importante para a defesa
contra agentes infecciosos (COMBES et al., 2012). Sendo também células
apresentadoras de antígeno, os astrócitos são capazes de exteriorizar em suas
membranas, antígenos e provocar uma resposta imunológica contra agentes
patogênicos (SIEGEL et al., 1999).
Estudos têm revelado que os astrócitos representam uma população celular
capaz de reagir a insultos químicos, constituindo um bom modelo de estudo para
neurotoxicidade de diversos agentes (COOKSON et al., 1994), dentre eles o ácido
caínico, cloreto de mercúrio, cloreto de alumínio, tolueno, etanol, dibutiril-cAMP,
trimetilestanho e aos próprios alcaloides de piperidinicos (RATABOUL et al., 1989;
COOKSON E PENTREATH, 1994; MEAD PENTREATH, 1998; HARRY et al.; 2002;
HUGHES et al, 2006; SILVA et al, 2007). Ainda, estudos têm revelado que os
astrócitos são a primeira linha de defesa contra xenobióticos e expressam níveis
elevados tanto de enzimas do metabolismo de fase I de drogas, o sistema citocromo
P450 (MEYER et al., 2007), que pode estar relacionado com a metabolização de
alcaloides no SNC (Para revisão ver PITANGA et al., 2012), quanto enzimas de fase
II do metabolismo de drogas, como as isoformas µ e π da glutationa-S-transferase
que podem estar associadas a mecanismos de resistência à fármacos que atuam no
SNC (SHANG et al., 2008).
A microglia, de origem embrionária hematopoiética, é composta por células
consideradas imuno-efetoras, as quais apresentam atividade fagocítica semelhante
à dos macrófagos (KANDEL, 2000) e que, portanto, realizam no SNC funções
similares àquelas desempenhadas pelos macrófagos em outros órgãos, incluindo
fagocitose, indução à inflamação e apresentação de antígenos, constituindo, dessa
maneira a primeira linha de defesa contra patógenos invasores (ALOISI, 2001;
CHANG et al., 2009). Estas células tanto podem facilitar a sobrevivência dos
neurônios, pela secreção de substâncias neurotróficas e ativação de astrócitos, até
mesmo pela modulação de enzimas astrogliais envolvidas no estresse oxidativo para
aumentar a resistência destas células à tais condições (GIULIAN et al., 1994;
ROOHL et al., 2008).
10
Por outro lado as células microgliais também podem estar associadas a
doenças neurodegenerativas como mal de Alzheimer, doença de Parkinson,
esclerose múltipla e demência associada a AIDS (DICKSON et al., 1993). Quando
ativada a microglia libera moléculas inflamatórias que podem por sua vez ativar
astrócitos dentro de minutos e que pode resultar em aumento da liberação de
gliotransmissores, representando assim um passo importante na sequência inicial de
acontecimentos que contribuem para a hiperexcitabilidade, excitotoxicidade,
neurodegeneração e danos cerebrais (AGULHON et al., 2012).
As células microgliais assumem várias aparências morfológicas que podem
ser correlacionadas a estágios funcionais distintos de repouso e ativação. A ativação
da microglia tem sido caracterizada pela modificação da morfologia, passando de
uma forma ramificada (em repouso) para uma forma amebóide (ativada). Esta
ativação também é caracterizada pelo aumento da expressão de moléculas do
sistema principal de histocompatibilidade (MHC classe I e classe II), e de outras
moléculas de membrana como CD11B (receptor do fator 3 do sistema complemento
– OX-42), de forma que a imunomarcação destes receptores nos permite detectar a
ativação de microglia (GEHRMANN et al., 1995; BUTOVSKY et al., 2007). Além da
mudança morfológica, a ativação microglial altera seu comportamento proliferativo e
migratório, como também a produção de citocinas, tais como IL-1, IL-6, TNF-α, IFN-3
e TGF-β (GEHRMANN et al., 1995) e produção de fatores neurotóxicos, como óxido
nítrico (NO), que representa uma espécie reativa de oxigênio que medeia uma
variedade
de
funções
biológicas,
incluindo
homeostasia
vascular
e
neurotransmissão, mas que pode se combinar com o superóxido, produzindo
peroxinitrito altamente reativo (ABBAS et al., 2003; MANNING et al., 2001;
DAWSON & SNYDER 1994; SILVA et al., 2007; SILVA et al., 2008).
2.3. A ação de alcaloides da Prosopis juliflora no SNC
Testes com administração via oral de 62,5 mg/kg da fração de alcaloides
totais de vagens em camundongos demonstraram que os alcaloides da P. juliflora
apresentam atividade no SNC por
indução de alterações comportamentais
sugestivas de um possível efeito ansiogênico (QUINTANS-JÚNIOR et al., 2004).
11
Por outro lado, estudos in vitro têm demonstrado que alcaloides, presentes
nas vagens e folhas da P. juliflora apresentam ação direta em células do SNC.
Dentre eles destaca-se o estudo de Hughes et al. (2005), que revelou a ação
citotóxica dos mesmos, em células tumorais de origem glial humanas, da linhagem
GL-15, a partir de 24 horas de exposição a um extrato de alcaloides obtido de
vagens de P. juliflora, desde a concentração de 0,03 µg/mL. Este efeito foi
evidenciado pela redução dose-dependente da atividade mitocondrial e lesão de
membrana celular, com aumento da atividade da enzima lactato desidrogenase
(LDH), que é essencialmente citossólica, no meio de cultura das células, assim como
pela redução da quantidade de células capazes de excluir o corante azul de tripan,
por não apresentarem a membrana plasmática integra.
Outros testes in vitro, também desenvolvidos por Hughes et. al. (2006) em
cultura primária de astrócitos murinos revelaram que estas células são mais
resistentes aos efeitos tóxicos do extrato bruto contendo alcaloides obtidos de
vagens da P. juliflora. Este estudo demonstrou que os alcaloides presentes no
extrato total são capazes de induzir redução da atividade mitocondrial de astrócitos e
lesão em membrana celular, apenas em concentrações iguais ou superiores a 30
µg/mL.
Ainda, em um estudo desenvolvido por Silva et al. (2007), foi avaliado o efeito
citotóxico do extrato alcaloidal e de sete frações de alcaloides isolados de folhas de
P. juliflora em cultura de células gliais. Observou-se que, após 24 horas de
tratamento com o extrato alcaloidal (ETA), as células apresentaram redução de
atividade mitocondrial desde e lesão em membrana celular desde exposição à
concentração de 3 µg/mL. Por outro lado, observou-se a ativação da microglia
presente nas culturas tratadas com concentrações de 30 µg/mL. Contudo, nem
todas as frações de alcaloides obtidas a partir do ETA apresentaram o efeito
citotóxico, similar àquele observado em células expostas ao extrato bruto. No
entanto, outras frações, como as frações F29/30, F31/33, F32 e F34/35, revelaram
importante ação citotóxica. A fração 32 (F32) se destacou por ser a mais citotóxica,
e ainda induzir a produção de óxido nítrico (NO) em altos níveis pelas células gliais
(SILVA et al., 2007).
12
Considerando os aspectos toxicológicos da P. juliflora e efeitos neurotóxicos
em células gliais, em especial atribuídos aos alcaloides presentes nesta planta, torna
importante investigar os efeitos e mecanismos de ação de componentes alcaloidais
em sistemas mais complexos de interação de células SNC e determinação de alvos
celulares.
Nesse contexto, um estudo in vitro foi desenvolvido com o objetivo geral de
determinar os mecanismos de citotoxicidade de extrato e fração de alcaloides
extraídos de Prosopis juliflora sobre células gliais e neurais em sistema de co-cultivo.
Neste estudo foram objetivos específicos: 1) estudar as propriedades citotóxicas
através de modificações estruturais e ultraestruturais nas células do SNC induzidas
in vitro em um sistema de co-cultura primária de neurônios/células gliais; 2) elucidar
a resposta glial à neurotoxicidade induzida pelos alcaloides de P. juliflora
determinando ativação de astrócitos e microglia; 3) caracterizar alvos celulares de
alcaloides da P. juliflora através da análise de alterações funcionais e metabólicas. O
desenvolvimento deste estudo e os resultados obtidos serão apresentados nos
capítulos que se seguem.
13
3. ARTIGO CIENTÍFICO I
Alcaloides piperidínicos da Prosopis juliflora induzem dano mitocondrial e
vacuolização citoplasmática em co-cultura de células gliais e neurônios.
Artigo Submetido à Revista Toxicologic Pathology (SCHOLARONE)
(Vide anexo)
RESUMO
Prosopis juliflora é um arbusto muito utilizado para consumo animal e humano. No
entanto, a ingestão de suas vagens por animais induz intoxicação, que se
caracteriza por alterações neuromusculares induzidas por mecanismos que ainda
não são bem compreendidos. Neste estudo, foi investigada a neurotoxicidade de um
extrato alcaloidal (ETA) e uma fração de alcaloides (F32) obtidas de folhas da P.
juliflora em neurônios corticais de ratos e células gliais. Por RMN, a F32 foi
caracterizada como uma mistura dos alcaloides piperidínicos juliprosopina, como
constituintes majoritários, e em menor quantidade o alcaloide juliprosina. ETA e F32,
em concentrações entre 0,3 e 45 µg/ml foram testados por 24 h em co-culturas de
neurônios/células gliais. O teste de MTT revelou que ETA e F32 foram citotóxicos e
os valores de EC50 foram 31,07 µg/ml e 7,36 µg/ml, respectivamente. A exposição
das células à concentrações subtóxicas (0,3-3µg/ml) induziu vacuolização,
alterações fenotípicas e mudanças ultraestruturais, caracterizadas pela formação de
vacúolos com dupla ou múltipla membranas e danos mitocondriais. Ainda nas
culturas expostas a doses subtóxicas foi observada microgliose. Considerando que
F32 foi mais citotóxica do que ETA e que esta reproduz in vitro as alterações
morfológicas e ultraestruturais observadas após o consumo da planta por bovinos e
caprinos, podemos sugerir que os alcaloides juliprosopina e juliprosina são os
responsáveis primários
pelos danos neurotóxicos
observados em
animais
intoxicados pela P. juliflora.
Palavras-chave: Prosopis juliflora; alcaloides piperidínicos; neurônios; células gliais;
neurotoxicidade, mitocôndria.
14
Piperidine alkaloids from Prosopis juliflora induce mitochondrial damage and
cytoplasmic vacuolation on co-cultured glial cells and neurons.
SUMMARY
Prosopis juliflora is a shrub largely used for animal and human consumption.
However, ingestion has been shown to induce intoxication in animals, which is
characterized by neuromuscular alterations induced by mechanisms that are not yet
well understood. In this study, we investigated the neurotoxicity of total alkaloid
extract (TAE) and alkaloid fraction (F32) obtained from P. juliflora leaves on rat
cortical neurons and glial cells. NMR characterization of F32 showed that it is
composed by piperidine alkaloids juliprosopine, as the major constituent, and in
smaller amount juliprosine. TAE and F32 at concentrations between 0.3 and 45
µg/mL were tested for 24 h on neuron/glial cell primary co-cultures. MTT test
revealed that TAE and F32 were cytotoxic and the EC50 values were 31.07 µg/mL
and 7.36 µg/mL, respectively. Exposure to sub-toxic concentration (0.3-3 µg/mL)
induced
vacuolation,
phenotypic
changes,
and
ultra-structural
changes,
characterized by double or multi membrane vacuoles and mitochondrial damage.
Microglial proliferation was also observed. Considering that F32 was more cytotoxic
than TAE and that it reproduced in vitro the main morphologic and ultrastructural
changes observed after P. juliflora consumption, we can suggest that alkaloids
juliprosopine and juliprosine are the primarily responsible for the neurotoxic damage
observed in intoxicated animals.
Keywords: Prosopis juliflora; piperidine alkaloids; neuron; glial cells; neurotoxicity,
mitochondria.
15
3.1. Introdução
Espécies do gênero Prosopis originadas da América Central, África do Sul e
na Ásia foram distribuídos em torno das regiões secas de diversas partes do mundo
(BURKART, 1976). Prosopis juliflora Sw. DC (algaroba) é um arbusto que foi
introduzido no nordeste do Brasil em 1940 (SPA, 1989). As vagens desta planta são
ricas em carboidratos e proteínas e historicamente têm sido uma fonte importante de
alimentos para as populações humanas na América do Norte e América do Sul,
como farinha e outros produtos comestíveis. Atualmente a sua utilização para a
produção de alimentos tem sido discutida em outras regiões do mundo (CHOGE et
al., 2007). Devido à sua resistência a condições áridas, boa palatabilidade e valor
nutricional, as vagens de P. juliflora ou o seu farelo são habitualmente utilizados
para a alimentação de gado de leite e carne (SILVA, 1981). No entanto, o consumo
desta planta provoca uma enfermidade quando é a única fonte de alimento para o
animal (BACA et al, 1967; DOLLAHITE & ANTHONY, 1957). A enfermidade induzida
por esta planta em animais é denominada ''Cara torta" e caracteriza-se por
emagrecimento, alterações neuromusculares (incluindo atrofia muscular dos
masseteres), e lesões histológicas tais como espongiose, gliose, a perda da
substância de Nissl e vacuolização do pericário de neurônios do núcleo motor do
nervo trigêmeo (FIGUEIREDO et al., 1995; TABOSA et al., 2000a). Alterações
neuromusculares foram observadas em caprinos e bovinos alimentados com rações
contendo altas concentrações de vagens da P. juliflora (> 50%), especialmente após
exposição crônica (> 200 dias). As lesões histológicas também foram caracterizadas
por vacuolização fina do pericário de neurônios, astrócitos reativos e perda de
neurônios no núcleo motor do trigêmeo (TABOSA et al., 2006). Ocasionalmente,
danos em neurônios do núcleo oculomotor e degeneração walleriana nos nervos
mandibulares e trigêmeos foram observados (TABOSA et al, 2000a; TABOSA et al,
2006).
Estudos in vitro demonstraram que os alcaloides de vagens e folhas da P.
juliflora têm uma ação direta sobre células gliais gerando efeitos tóxicos e
inflamatórios e ainda sugerem que os alcaloides que compõem uma fração (F32)
obtida por cromatografia em sílica gel do um extrato rico em alcaloides (extrato
alcaloidal – ETA) são os que apresentam maior potencial biológico (HUGHES et al,
16
2006; SILVA et al, 2007). No entanto ainda não se sabia quais os alcaloides estão
presentes na fração F32 e ainda se estes são capazes de induzir in vitro aquelas
lesões neuro-histológicas e ultraestruturais visualizadas em animais intoxicados pelo
consumo da P. juliflora (TABOSA et al, 2000a; TABOSA et al, 2006; CÂMARA et al,
2009).
Vacuolização neuronal não é um achado específico de intoxicação por P.
juliflora e ocorre em outras doenças de herbívoros provocadas pela ingestão plantas
do gênero Solanum (PIENAAR et al., 1976, MENZIES et al. 1979, BOURKE 1997,
PORTER et al. 2003), Swainsona, Oxytropis, Astragalus (SUMMERS et al., 1995) e
Ipomoea (VAN DER LUGT., 2002). Muitas dessas plantas, a exemplo de Solanum
fastigiatum, induzem vacúolos no citoplasma de neurônios como resultado do
acúmulo de substratos não metabolizados em lisossomos, que caracteriza a doença
de depósito lisossomal (DSL). Outras, como a P. juliflora, ainda que induzam a
formação de vacúolos, estes últimos ainda não foram caracterizados, o que poderia
constituir uma informação importante para a compreensão do mecanismo de ação
dos compostos tóxicos destas plantas.
Este estudo complementa os estudos in vitro anteriores do nosso grupo, que
sugerem os alcaloides como os agentes tóxicos da intoxicação animal por P.
juliflora. Nós caracterizamos os alcaloides presentes na fração mais bioativa (F32)
obtida de folhas da P. juliflora, e estudamos in vitro as alterações morfológicas e
ultraestruturais induzidas por esta fração e o extrato alcaloidal (ETA) em modelo de
co-cultura primária de neurônios/células gliais.
3.2. Materiais e métodos
Extração e caracterização de alcaloides
Folhas de P. juliflora foram colhidas em Salvador (BA) na Escola de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal da Bahia (UFBA). O extrato
alcaloidal foi obtido através do método ácido/base de extração, tal como descrito por
OTT-LONGONI et al. (1980), com pequenas modificações (SILVA et al, 2007). As
folhas foram secas em estufa a 50° C. Para eliminar componentes não-polares o
material seco e triturado (874 g) sofreu três extrações com hexano (2,0 L/kg) durante
48 h à temperatura ambiente, cada extração, com agitação ocasional. O extrato foi,
17
em seguida, filtrado, e o resíduo foi submetido a nova extração com metanol (1,5
L/kg), utilizando o mesmo processo descrito acima. O extrato metanólico foi
concentrado num sistema de evaporação rotativa a 40° C, e a este resíduo foi
adicionado solução de HCl 0,2N, mantido sob agitação durante 16 h e seguido por
filtração. A solução foi agitada com clorofórmio para remover o material não-básico.
Para obtenção dos constituintes nitrogenados, a camada aquosa foi basificada com
hidróxido de amônio até atingir pH 11 e foi então extraída com clorofórmio. A fase de
clorofórmio foi evaporada, levando à produção do extrato alcaloidal (ETA). Este
extrato foi fracionado por cromatografia em coluna de sílica gel utilizando
clorofórmio/ metanol (99:1 a 1:1) como fase móvel, com uma eluição subsequente
em metanol a 100%. As trinta e seis frações obtidas a partir do ETA foram testada
para a presença de alcaloides utilizando o teste de Dragendorf (WAGNER et al.,
1983). Considerando que nossos experimentos anteriores apontaram a F32 como a
fração mais tóxica para as células da glia (SILVA et al., 2007), neste estudo
investigamos o efeito citotóxico do ETA e F32 em neurônios e células gliais. Ainda,
caracterizamos a composição da F32 por ressonância magnética nuclear de H1 (500
MHz, CD3OD) e C13 RMN (125 MHz, CD3OD).
Tratamentos
Para os tratamentos, o ETA e a F32 foram dissolvidos em dimetilsulfóxido
(DMSO, Sigma, St. Louis, MO), para gerar soluções de estoque em concentrações
de 30 mg/mL, que foram armazenadas a -20° C. As células foram tratadas com
concentrações variando entre 0,3 - 45 µg/mL, durante 24 h. O grupo de controlo
negativo foi tratado com DMSO diluído em meio de cultura, considerando o maior
volume equivalente usado nos grupos tratados (0,1%) e não mostrou nenhum efeito
significativo nos parâmetros analisados em comparação com células que não
receberam o diluente.
Culturas de células
As culturas celulares foram preparadas a partir de hemisférios cerebrais de
ratos Wistar, obtidos junto ao Departamento de Biorregulação do Instituto de
Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia (Salvador, BA, Brasil) e
realizada de acordo com o Comitê Local de Ética em Experimentação Animal.
18
Co-culturas primárias de neurônios/células gliais
Culturas primárias das células da glia foram preparadas de acordo com
método descrito por COOKSON & PENTREATH (1994). Resumidamente, os
hemisférios cerebrais de crias de ratos Wistar de um dia de idade pós-natal foram
isolados assepticamente e as meninges foram removidas com auxilio de lupa para
posterior dissecção do tecido cortical. Em seguidas, as células foram suspensas em
meio DMEM/HAM-F12 (Cultilab, SP, Brasil), suplementado com 100 UI/mL de
penicilina G, estreptomicina 100 µg/mL, 2 mM de L-glutamina, 0,011 g/L de piruvato,
10% de SFB, 3,6 mg/L Hepes e 33 mM de glicose (Cultilab, SP, Brasil) e cultivadas
em placas de 100 milímetros Ø em uma atmosfera úmida com 5% de CO 2 a 37° C.
O meio de cultura foi mudado a cada dois dias, e as células foram cultivadas durante
15 dias, para serem então tripsinizadas (tripsina-EDTA) e plaqueadas a uma
densidade de 670 células/mm2 e mantidos por 48 h em uma atmosfera úmida com
5% de CO2 a 37° C para estabilização da cultura. Neste momento, neurônios de
hemisférios cerebrais de embriões de ratos Wistar com 15-18 dias de idade
gestacional, foram obtidos através do mesmo método descrito acima para a cultura
da
glia.
As células
neuronais em
suspensão
no
meio
DMEM/HAM-F12
suplementado foram semeadas sobre a monocamada astroglial numa proporção de
1:2 células gliais (335 células/mm2). As células gliais e neuronais juntas foram
incubadas em atmosfera úmida com 5% de CO2 a 37° C durante 8 dias, quando os
tratamentos foram realizados.
Viabilidade celular - Curvas de dose-resposta
Curvas de dose-resposta foram alcançadas pelo teste do brometo de 3-(4,5dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT, Sigma, St. Louis, MO). O experimento foi
realizado em placas de 96 poços (TPP Suíça) com co-culturas de neurônios/células
gliais. As células foram incubadas com 1,5 - 45 µg/mL de ETA, F32 ou 0,1% de
DMSO (controle) durante 24 h. A viabilidade celular foi quantificada pelo índice de
conversão do MTT (cor amarela) por desidrogenases mitocondriais de células vivas
a formazan (cor púrpura) (HANSEN et al., 1989). As células em condições controle e
tratadas foram incubadas com MTT a uma concentração final de 1 mg/mL, durante 2
h. Em seguida, as células foram lisadas com 20% (peso/volume) de dodecil sulfato
de sódio (SDS) e 50% (v/v) de dimetilformamida (DMF) (pH 4,7). As placas foram
incubadas durante a noite a 37º C para dissolver os cristais de formazan. A
19
densidade óptica de cada amostra foi medida a 492 nm utilizando um
espectrofotómetro (Thermo-Plate Reader). Três experimentos independentes foram
realizados com oito poços duplicados para cada análise. Os resultados do teste de
MTT foram expressos como percentuais de viabilidade dos grupos tratados em
comparação com os grupos controle. A regressão não linear foi realizada usando o
software Graphpad Prism 3.0, para realização de análises estatísticas e para
calcular a EC50 do ETA e F32, que representam as concentrações eficazes para
matar 50% das células.
Analise de alterações morfológicas
Coloração de Rosenfeld
Alterações morfológicas e vacuolização foram primeiramente avaliadas por
coloração de Rosenfeld. O experimento foi realizado em placas de 3,5 Ø (TPP
Suíça). As células foram lavadas três vezes com PBS e fixadas durante 10 min com
metanol a -20° C. As células fixas foram então coradas. Para tanto, o reagente de
Rosenfeld (1 mL) foi adicionado e incubado durante 20 min à temperatura ambiente.
Em seguida, as placas foram lavadas com água, secas ao ar, analisadas num
microscópio óptico (Olympus BX70) e fotografadas utilizando uma câmara digital (CE
Roper Scientific). A vacuolização foi quantificada em dez campos fotografados,
conforme predeterminação que os astrócitos com mais de 10 vacúolos no
citoplasma eram considerados em processo de vacuolização (ISOBE et al., 2003).
Imunocitoquímica
Alterações morfológicas em astrócitos e neurónios foram também estudadas
por imunocitoquímica para as proteínas do citoesqueleto, GFAP e βIII-tubulina,
respectivamente. Células em condições controle e tratadas foram semeadas em
placas de 3,5 Ø (TPP Suíça) e após tratamento de 24h foram lavadas três vezes
com PBS e fixadas com metanol frio a -20 º C durante 10 minutos. A ligação não
específica do anticorpo foi bloqueada por pré-incubação das placas com 3% de
albumina de soro bovino (BSA) em PBS. Para marcação de neurônios, as células
foram incubadas com anticorpo monoclonal de camundongo anti-βIII-tubulina
conjugado com CY3, por 2h (1:500 em PBS, Sigma, EUA). E para marcação de
astrócitos, as células foram incubadas com anticorpo policlonal de coelho anti-GFAP
(1:100 em PBS, DAKO, EUA) overnight e, em seguida, incubadas com anticorpo de
20
cabra anti-IgG de coelho conjugado com isotiocianato de tetrametilrodamina (1:250
em PBS, Sigma) durante 30 min à temperatura ambiente. A cromatina nuclear das
células fixadas foram coradas com o corante fluorescente DAPI, a uma
concentração final de 5 µg/mL em PBS, durante 10 min à temperatura ambiente em
câmara escura. Em seguida, as células foram analisadas por microscopia de
fluorescência (Olympus BX70) e fotografadas utilizando uma câmara digital (CE
Roper Scientific).
Para
identificar
microglia
ativada
em
células
fixadas
foi
realizada
imunocitoquímica para OX-42 (CD11b) antes da coloração de Rosenfeld. Primeiro, a
atividade da peroxidase endógena foi bloqueada durante 10 minutos com peróxido
de hidrogênio a 3%. A co-cultura foi incubada durante 1 h com o anticorpo
monoclonal de camundongo anti OX-42 (CD11b/c (1:200), Caltag, Burlingame, CA).
As células foram então incubadas com anticorpo de cabra anti-IgG de camundongo
conjugado com peroxidase (1:1000, Sigma) durante 1 h. As células microgliais foram
identificadas pela cor castanho após a incubação com o substrato, 0,3% de 4-Clalfanaftol/solução de metanol diluído em tampão PBS (1:5) mais H 2O2 (0,33 mL/mL),
à temperatura ambiente durante 30 min. E após coloração de Rosenfeld as mesmas
foram identificadas com uma cor preta. Estas células foram analisadas (Olympus
BX70) e fotografadas (CE Roper Scientific) num microscópio de fase óptica de luz
utilizando uma câmara digital. O número de células imunorreactivas foram contadas
sob o microscópio usando 20X de ampliação num campo 0,29 mm2. Dez campos
representativos aleatorizados foram analisados, e a proporção de células OX-42positivas foi apresentada como a percentagem de células marcadas entre o número
total de células contadas.
Ensaio de proteína e western blot
A expressão de GFAP foi investigada por Western blot e imunodetecção.
Após o tratamento, as células foram lavadas duas vezes com PBS, lisadas e
coletadas em 2% (peso/volume) de SDS, 2 mmol/L de EGTA, 4 mol/L de ureia, 0,5%
(v/v) de Triton X-100, e 62,5 mmol/L Tris-HCl (pH 6,8) suplementado com 0,1% (v/v)
de um coquetel de inibidores de protease (Sigma). O teor de proteína total foi
determinado através de um método de LOWRY et al. (1951) adaptado em kit de
reagente de proteína (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Para este ensaio, 50 µg de
21
proteínas totais, preparada conforme descrito acima, foi depositada em gel de
empilhamento a 4% de poliacrilamida e corrido em gel a 8% de poliacrilamida. A
eletroforese foi realizada a 200 V durante 45 min. As proteínas foram então
transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF, Immobilon-P,
Millipore), a 100 V durante 1 h. A padronização na quantidade de proteína
depositada foi confirmada por coloração das membranas com vermelho Ponceau
(Sigma). Em seguida, as membranas foram bloqueadas durante 1 h à temperatura
ambiente, em 20 mmol/l Tris-solução salina tamponada (pH 7,5), contendo 0,05% de
Tween 20 (TBS-T) e 5% de leite desnatado em pó. Subsequentemente, as
membranas foram incubadas com anticorpo de coelho anti-GFAP (1:5000, DAKO,
EUA), diluído em TBS-T contendo 1% de leite desnatado em pó, durante a noite. Em
sequencia foram lavadas com TBS-T e incubadas anticorpo secundário de cabra
anti-IgG de coelho conjugado com fosfatase alcalina (1:5000 em TBS-T, Bio-Rad).
Bandas imunorreativas foram visualizadas utilizando o kit de substrato de APconjugado (Bio-Rad), de acordo com as instruções do fabricante.
Dosagem de nitrito
A produção de óxido nítrico (NO) foi avaliada como o acúmulo de nitrito no
meio de cultura por meio de teste colorimétrico, que envolve o uso do reagente de
Griess (WANG et al., 2002). Amostras (50 µL) foram recolhidas após 24 horas de
tratamento. Volumes iguais de sobrenadante de cultura e de reagente de Griess
(sulfanilamida 1%, 0,1% de N-(1-naftil)-etileno diamina, ácido fosfórico a 2%) foram
misturados. A mistura foi incubada durante 10 min à temperatura ambiente, e a
absorvância a 560 nm foi medida num leitor de microplacas (Thermo Placa TPReader). As concentrações de nitrito nas amostras foram determinadas com base
numa curva padrão de nitrito de sódio (NaNO2, 1,26-100 pg/mL).
Análise ultraestrutural do citoplasma
Alterações ultraestruturais foram avaliadas por microscopia eletrônica de
transmissão. O experimento foi realizado em placas de 3,5 Ø (TPP Switzerland) com
co-culturas de neurônios/ células gliais incubadas com 3 µg/mL de ETA, F32 ou
0,1% de DMSO. As células foram fixadas com glutaraldeído a 2,5% (Sigma.) em 0,1
M de tampão de cacodilato (pH 7,2) durante duas horas à temperatura ambiente, e
lavadas em tampão de cacodilato 0,1 M e pós-fixadas com tetróxido de ósmio a 1%
22
e ferrocianeto de potássio a 0,8% e 5 mM de CaCl2 no mesmo tampão durante 1 h à
temperatura ambiente. As células foram então raspadas, desidratadas numa série
de soluções de acetona e embebidas em resina Polybed. Cortes finos foram corados
com acetato de uranila e citrato de chumbo e observadas em um microscópio
eletrônico de transmissão Zeiss EM109.
Análise estatística
Os resultados são expressos em média ± desvio-padrão. One-way ANOVA
seguido pelo pós-teste de Student-Newmann-Keuls para determinar as diferenças
estatísticas entre os grupos que diferem em apenas um parâmetro. Teste t de
Student foi utilizado para as comparações entre dois grupos. Valores de p <0,05
foram considerados significativos.
3.3. Resultados
Caracterização dos alcaloides na F32
A F32 foi obtida do extrato alcaloidal de folhas de P. juliflora como uma goma
escura. Os espectros 1H (500 MHz, CD3OD),
13
C de RMN (125 MHz, CD3OD) e
DEPT 135 apresentaram uma mistura de 1, 2, 3, 5, 8, 8a-hexahidroindolizina e 2, 3dihidro-1H-indolizina heterocíclica. A porção hexahidroindolizina pôde ser observada
através dos hidrogênios δH-1’’’’ 1.56 (m); δH-2’’’’ 2.44 (m); δH-3 ’’’’’ 3.10 – 2.40 (m)δH-5’’’’’
3.10 (m); δH-6’’’’’ 2.50 (m); δH-7”” 5.59 (s) δH-8’’’’ 1.71 (m); δH-8a’’’’ 1.82 (m) e os carbonos
δc-1”” 33.8 (CH2); δc-2’’’’ 22,2 (CH2); δc-3’’’’ 52,7; δc-5’’’’ 52,7 (CH2); δc-6’’’’ 134.0 (C); δc-7’’’’
125,7 (CH); δc-8’’’’ 52,7 and δc-8a’’’’ 66.1 (CH). Os hidrogênios dos núcleos
indolizidínicos aparecem em δH-1’’’’ 2.80 (m); δH-2’’’’ 2.51(m); δH-5’’’’ 8.62(s) e δH-7””
8.16(s), e os carbonos em δc-1’’’’ 34.5 (CH2); δc-2’’’’ 20.0 (CH2); δc-3’’’’ 52.8 (CH2); δc-5’’’’
138.9 (CH); δc-6’’’’ 140.8 (C); δc-7’’’’ 145.9 (CH) e δc-8”” 143,0 (C). Sinais como δc-7,
7’
14.5 (CH3); δc-3,3’ 65.9 (CH); e δc-6,6’’ 47.7 (CH) foram distintos no anel piperidínico.
Os metilenos da porção alifática estão em δ 29.6 – 28.8. A presença de um único
grupo metal substituinte em δ 14.5 denota o mesmo esterioquímico em C7, 7’ para
ambas estruturas. Análise desses dados em comparação com a literatura permitiu
deduzir-se que esta fração é composta por uma mistura dos alcaloides juliprosopina,
como constituinte majoritário, e em menor quantidade juliprosina (Fig. 1) (TABOSA et
al., 2000b; SAMOYLENKO et al., 2009).
23
Curvas de dose-resposta
Os efeitos tóxicos de ETA e F32 obtidos a partir de folhas de P. juliflora sobre
a viabilidade das células foram avaliados por teste MTT, que mede a redução do sal
de tetrazólio (MTT) a formazan de cor púrpura pelas enzimas desidrogenases de
células vivas. Depois de vinte e quatro horas de exposição a 1,5 - 45 µg/ml de ETA
ou F32 em co-culturas de neurónios/ células gliais foi visualizada uma diminuição
dose-dependente da atividade das desidrogenases (Figura 2). As concentrações
inibitórias médias (valores de EC50) foram 31,07 µg/mL (ETA) e 7,36 µg /mL (F32).
Para tornar possível a análise de alterações morfológicas e ultraestruturais,
utilizaram-se doses subtóxica (1,5 µg/mL e 3 µg/mL) para a realização dos demais
testes.
Efeito dos alcaloides sobre morfologia das células da glia e neuronal.
Para investigar os efeitos dos alcaloides da P. juliflora sobre a morfologia
celular, coloração de Rosenfeld e imunocitoquímicas para GFAP, βIII-tubulina e OX42 foram realizadas em co-culturas de neurônios/células gliais. A coloração de
Rosenfeld nas células em condições controle revelou neurônios homogeneamente
distribuídos ao longo da monocamada densa de astrócitos, com estes apresentando
um fenótipo plano/poligonal (Fig. 3 A). Em culturas expostas a 1,5 µg/mL de ETA, a
rede de neuritos foi mantida, mas alguns astrócitos apresentaram vacuolização
citoplasmática (Fig. 3 B). No entanto, em culturas expostas a 3 µg/ml de ETA, a
proporção
de
astrócitos
com
vacuolização
citoplasmática
aumentou
significativamente (Fig. 3 C e G), com a redução da integridade da rede de neuritos,
alguns astrócitos gigantes também foram observados. A exposição de células a 1,5
µg/mL de F32 foi suficiente para perturbar a monocamada de astrócitos e a rede de
neuritos. Vacuolização citoplasmática intensa nos astrócitos e vacúolos em neurites
também foram observadas (Fig. 3 D, E e H). Estes efeitos foram amplificados em
culturas tratadas com 3 µg/mL de F32 (Fig. 3 F e H), no entanto, nesta concentração
adotada não foi possível quantificar os astrócitos em processo de vacuolização,
devido a pouca quantidade de células aderentes nesta condição de tratamento.
Culturas analisadas por imunocitoquímica para a GFAP, proteína do
citoesqueleto de astrócitos, mostraram uma monocamada de células grandes com
24
morfologia plana/poligonal, com estas proteínas distribuídas ao longo dos corpos
celulares (Fig. 4). No entanto, mudanças na morfologia dos astrócitos foram apenas
observados em culturas tratadas com 3 µg/mL de F32. Nestas condições, os
astrócitos remanescentes apresentaram finos e multipolares filamentos positivos
para GFAP (Fig. 4 C), sugerindo a ativação de astrócitos. Análises por western blot
revelaram que os níveis de GFAP em condições controle e culturas tratadas com 1,5
- 3 µg/mL de ETA e 1,5 µg/mL de F32 permaneceram semelhantes, como
determinado por uma banda imunorreativa de 49kDa. No entanto, em culturas
expostas a 3 µg/mL de F32, uma mudança no padrão de migração da GFAP foi
observada. A GFAP apareceu como uma banda de proteína prolongada de pesos
moleculares muito semelhantes, sugerindo uma degradação desta proteína (Fig. 4
C).
As análises realizadas por imunocitoquímica para βIII-tubulina revelaram que
os neurônios exibiram polimerização disfuncional desta proteína em culturas
tratadas com 3 µg/mL de F32, quando comparadas com células em condições
controle que apresentaram a expressão desta proteína por todo o corpo celular e
neuritos (Fig. 5).
Poucas células microgliais ativadas marcadas para OX-42 (1,3%) apareceram
como pequenas células redondas, de cor preta em condições de controle (Fig. 6 A).
No entanto, a exposição a 1,5 - 3 µg/mL de ETA ou F32 aumentou a proporção de
células microgliais OX-42-positivas em até cinco vezes (Fig. 6 BE). Em condições
controle, o sobrenadante do meio de culturas tratadas com veículo DMSO (0,1%)
mostraram níveis baixos de nitrito: 35,5 ± 4,5 pg/mL. O sobrenadante do meio de
culturas tratadas com 1,5 µg/mL de ETA, 3 µg/mL de ETA ou 1,5 µg/mL de F32
apresentaram níveis semelhantes de nitrito, com valores de 31,3 ± 6,3; 34,7 ± 4,3 e
36,1 ± 3,6, respectivamente (Fig. 7). No entanto, a exposição das células a 3 µg/mL
de F32 induziu um aumento significativo no nível de nitrito em meio de cultura, para
44,9 ± 4,8 pg/mL (Fig. 7 B).
Análise ultraestrutural do citoplasma
A análise ultraestrutural revelou que as células em condições controle (DMSO
a 0,1%) (Fig. 8 A) apresentaram uma morfologia normal do citoplasma, mitocôndrias
25
e núcleos. No entanto, as células tratadas durante 24 h com 3 µg/mL de ETA
apresentaram alterações na morfologia e tamanho mitocondrial. Estas alterações na
morfologia mitocondrial foram sugestivas de uma fusão mitocondrial. Além disso, as
células tratadas durante 24 h com 3 µg/mL de F32, apresentaram mitocôndrias com
cristas desintegradas, e vacúolos citoplasmáticos caracterizados por dupla ou
multimembranas. Estas morfologias dos vacúolos citoplasmáticos foram sugestivas
de um processo autofágico (Fig. 8B e C).
3.4. Discussão
Em nossos estudos anteriores, demonstramos que o extrato alcaloidal (ETA)
e algumas frações de alcaloides das folhas de Prosopis juliflora foram citotóxicas e
induziram ativação de células gliais em culturas primárias (SILVA et al., 2007). As
células da glia têm funções importantes que impactam na saúde e integridade de
células neuronais (COYLE & SCHWARCZ, 2000). Considerando-se cada vez mais
evidências de que os astrócitos e microglia desempenham papéis importantes na
fisiologia do sistema nervoso central e nos mecanismos da patogênese de várias
doenças neurológicas (CHANG et al., 2000, GEBICKE-HAERTER, 2001 e CHANG
et al., 2009), é importante investigar as reações de células gliais que interagem com
os neurônios a vários estímulos, incluindo agentes químicos. Neste estudo,
investigamos os efeitos do ETA e da fração de alcaloides mais citotóxica para as
células da glia (fração F32, para revisão ver SILVA et al., 2007) em um sistema de
neurônio/células gliais em um sistema de co-cultivo para induzir e caracterizar
alterações morfológicas e ultra-estruturais visualizadas em células do sistema
nervoso central na ¨Doença da cara torta¨. A caracterização da F32 por RMN
mostrou que esta fração é composta por uma mistura de dois alcaloides
juliprosopina, como constituinte majoritário, e em menor quantidade juliprosina. Em
uma investigação fitoquímica das vagens de Prosopis juliflora cultivadas na região
semiárida do Estado da Paraíba do Brasil, TABOSA et al. (2000b) observaram que a
atividade tóxica, observada em animais de laboratório, é quimicamente relacionada
com os alcaloides piperidínicos juliprosopina e juliprosina.
Em nosso estudo, as concentrações citotóxicas de ETA e F32 em co-culturas
de neurônios/células gliais foram determinadas pelo teste de MTT. O brometo de 3(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio é um sal de tetrazólio solúvel em água, o
26
qual é convertido para formazan insolúvel de cor púrpura pela clivagem do anel de
tetrazólio pela enzima succinato desidrogenase no interior da mitocôndria de células
saudáveis (MOSMAN, 1983, SHEARMAN et al., 1995). Evidências mais recentes
sugerem que a redução de MTT pode também ser mediada por succinato, NADH ou
NADPH como substrato no interior das células e fora da mitocôndria (Berridge e Tan,
1993). Observou-se pelo teste de MTT, que após 24 h de exposição a baixas
concentrações de alcaloides da F32 e ETA (3 µg/mL), estas não foram suficientes
para reduzir a atividade de desidrogenases no sistema de cultura adotado. No
entanto, esta concentração subtóxica induziu distúrbios mitocondriais visualizados
por microscopia eletrônica. Pelo teste MTT, apenas concentrações mais elevadas de
F32 (7,5 µg/ml) e ETA (30 µg/ml) demonstraram induzir redução da atividade da
succinato desidrogenase.
Vacuolização citoplasmática após a exposição a uma variedade de produtos
químicos e substâncias bioativas tem sido extensivamente relatada (para revisão ver
AKI et al., 2012). Observou-se também, após coloração com Rosenfeld, que a
exposição de neurônios e células gliais aos alcaloides induziu em astrócitos
mudanças estruturais e vacuolização dose-dependente do citoplasma. Além disso,
uma perturbação na rede de neuritos e vacuolização intensa em neuritos foram
observadas. No campo da patologia celular, deteriorações celulares caracterizadas
por vacuolização citoplasmática são chamadas degenerações vacuolares (COTRAN
et al., 1999), e a vacuolização induzida por alcaloides de P. juliflora em co-cultura de
neurônios/células gliais podem ser um tipo de degeneração vacuolar. Semelhantes
alterações morfológicas em células do sistema nervoso central foram relatadas em
ingestão experimental e espontânea de P. juliflora por bovinos. Tabosa et al. (2006)
e Câmara et al. (2009) observaram gliose, vacuolização e perda neuronal em
núcleos motor do nervo trigêmeo e outros núcleos de nervos cranianos como as
principais lesões histológicas após intoxicação P. juliflora.
Autolisossomos não são vacúolos verdadeiros, que às vezes se expandem
para encher o citoplasma e, portanto, muitas vezes são referidos como vacúolos
autofágicos, que podem ser observados sob microscopia de fase (AKI et al., 2012).
A análise ultraestrutural sugere a formação de vacúolos autofágico nas células
tratadas durante 24 h com 3 µg/mL de F32. A autofagia é um processo pelo qual há
27
a degradação intracelular de proteínas, e em que organelas citoplasmáticas são
degradadas e recicladas através de lisossomos. Ela desempenha um papel
importante na eliminação das organelas danificadas, tais como mitocôndrias e pode
constituir um mecanismo de proteção contra a morte celular programada induzida
por disfunção mitocondrial em células neuronais (PARIS et al, 2011). Além disso, as
células tratadas durante 24 h com 3 µg/ml de F32 apresentaram mitocôndrias com
cristas desintegradas. No entanto, as células tratadas durante 24 h com 3 µg/ml de
ETA apresentaram alterações na morfologia mitocondrial que sugeriam uma fusão
mitocondrial, que caracteriza a combinação de duas mitocôndrias em uma única
organela (ARDUINO et al., 2011). Estudos indicam que a fusão está relacionada a
mudanças na função mitocondrial, e protege a mitocôndria da degradação
autofagossomal (ARDUINO et al, 2011; RAMBOLD et al, 2011).
Filamentos intermediários (FI) são estruturas que, em conjunto com os
microtúbulos e microfilamentos, formam o citoesqueleto, que está presente em
quase todas as células eucarióticas. A principal proteína FI dos astrócitos é proteína
acída fibrilar glial (GFAP). Estudos recentes revelaram a presença de múltiplas
isoformas de GFAP, que podem ser diferencialmente expressas em astrócitos
reativos e astrócitos em repouso (para revisão ver LIEM & MESSING, 2009).
Alterações na expressão de GFAP indicam a reatividade astroglial (astrogliose). Os
astrócitos reagiram à dose mais elevada testada do F32 (3 µg/mL) para a análise da
expressão desta proteína, com uma forte retração do corpo celular e emissão de
processos de fina espessura e ramificados. Este fenômeno foi associado com o
aparecimento de duas bandas imunorreativas-GFAP (como revelado por western
blot), sugerindo instabilidade proteica. Em nossos estudos anteriores, em culturas de
células da glia, observou-se que os astrócitos expostos a 3 µg/mL de ETA
desenvolveram corpos celulares compactos, com muitos processos superexpressando GFAP, mas a exposição a 3 µg/mL de F32 induziu ruptura na
expressão da GFAP (SILVA et al., 2007) . Embora um aumento na produção de
GFAP possa ser um sinal de astrogliose reativa a lesão, e até mesmo a
neurodegeneração (COSTA et al 2002; COYLE & SCHWARCZ, 2000, TARDY,
1991), uma redução nos seus níveis podem significar sinaptogénese ou
neurotransmissão anormal (O ' CALLAGHAN, 1991; RAJKOWSKA et al., 2002).
28
Exposição de co-culturas de neurônios/células gliais a alcaloides da P. juliflora
induziu perturbação da monocamada de astrócitos e da rede de neuritos, e ainda
intensa vacuolização em ambos os tipos de células. Estes fenômenos também foram
associados com alterações na expressão de βIII-tubulina, o principal componente do
citoesqueleto neuronal. Interrupções na marcação da βIII-tubulina foram tipicamente
observadas em culturas expostas a 3 µg/mL de F32, sugerindo uma falha na
polimerização desta proteína dos neurônios, um fenômeno que pode estar
associado com a vacuolização. Estudos publicados referem que os astrócitos são
capazes de produzir moléculas que afetam o crescimento axonal, tal como o
componente de matriz extracelular laminina. Além disso, intervenções na integridade
de astrócitos e astrogliose afetam neuritos (COSTA et al, 2002; NONES et al, 2010;
TARDY, 2002). A resposta dos astrócitos a alcaloides de P. juliflora, caracterizada
por alterações na morfologia e na expressão de GFAP, pode estar associada a
alterações na expressão de βIII-tubulina e na integridade da rede de neurites.
A microglia representa o conjunto de células imunes residentes no cérebro,
que funcionam de forma semelhante aos macrófagos de tecidos de outros órgãos,
servindo como fagócitos (quando requisitados) e que constituem a primeira linha de
defesa contra os agentes patogênicos invasores e outros insultos (STREIT et al.,
1999). Estas células são muito sensíveis a até pequenas perturbações na
homeostasia do SNC, e tornam-se facilmente ativadas durante a maior parte das
condições neuropatológicas, incluindo lesão do nervo periférico, trauma e enfarto,
doenças inflamatórias, e neurotóxicas induzidas por lesão neuronal (STREIT et al.,
2000). No entanto, a sua ativação pode interferir com a saúde e integridade de
células neuronais (COYLE & SCHWARCZ, 2000; MOISES et al., 2002). A ativação
da microglia gera alterações morfológicas que transformam estas em células
pequenas e redondas, sem processos e que expressam OX-42 (HUMPEL & SALIMI,
2002; SILVA et al., 2008). Um número maior de células OX-42-positivas foram
observadas em co-culturas de neurônios/células gliais expostas a ambos, ETA e
F32. Este efeito apresentou-se aumentado na presença da concentração mais
elevadas de ETA e F32 (3 µg/mL). Esta observação indica que os alcaloides da P.
juliflora também podem induzir a microgliose. Entre vários fatores liberados pelas
células gliais ativadas, o NO parece desempenhar um papel crítico por lesão
29
cerebral induzido por estresse (DIMAYUGA et al., 2007;. GEBICKE-HAERTER,
2001; MANNING et al., 2001; NICHOLSON et al., 2004).
Em repouso as células gliais não produzem NO. A produção de NO pode ser
induzida pela conversão de L-arginina em L-citrulina, que é catalisada pela óxido
nítrico sintase induzível (iNOS). Nesse estudo, não houve mudanças significativas
nos níveis de nitrito observadas no meio de cultura de células tratadas com 1,5 - 3
µg/mL de ETA ou no meio de culturas tratadas com 1,5 µg/mL de F32. No entanto, o
tratamento de 24 h das culturas com 3 µg/mL de F32 induziu um aumento
significativo na produção de nitrito, possivelmente devido à ativação glial. Estudos
realizados em culturas primárias de células gliais verificaram que alguns agentes
químicos induzem ativação glial e indução da produção de NO (RÖHL & SIEVERS,
2005; SAMANTARAY et al., 2007; RYU et al., 2007). Num estudo, utilizando culturas
primárias de células gliais, observou-se que 24 h de tratamento das culturas mistas
de astrócitos/microglia com flavonóide rutina (100 µmol/L) induziu um aumento
significativo na produção de nitrito. Este tratamento não teve o mesmo efeito em
culturas primárias de astrócitos, possivelmente indicando a ativação da microglia
(SILVA et al., 2008). Um aumento dos níveis de nitrito no meio de culturas primárias
de células da glia foi também observada após a exposição a 3 µg/mL da fração F32
(SILVA et al., 2007). Em ambos os casos, a ativação e proliferação de microglia
foram também observadas após a exposição aos compostos e relacionadas com o
óxido nítrico (NO), que indica a microglia, como fonte principal de NO em resposta a
desafios químicos.
Considerando-se que a F32 foi mais citotóxica do que ETA e que a F32
induziu in vitro as alterações morfológicas e ultraestruturais características da
“Doença da cara torta”, podemos sugerir que os alcaloides piperidinicos juliprosopina
e juliprosina são os responsáveis primários pelos danos neurotóxicos observados
em animais após o consumo da planta. Mais estudos devem ser realizados para
caracterizar o mecanismo de formação de vacúolos e se eles têm uma ação
protetora contra a morte celular programada induzida pelo dano mitocondrial
observado neste estudo.
30
3.5 Agradecimentos
Este trabalho foi fomentado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da
Bahia (FAPESB). Nós agradecemos o apoio de pesquisas prestado pela Fundação
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), e pelo
Programa de Pós-graduação em Ciência Animal nos Trópicos - Universidade
Federal da Bahia. A microscopia eletrônica foi apoiada pela Plataforma de
Microscopia Eletrônica - Centro de Pesquisa Gonçalo Muniz, da Fundação Oswaldo
Cruz, Salvador, Brasil.
31
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39
Juliprosina
Juliprosopina
Figura 1 – Estrutura química dos alcaloides piperidínicos juliprosina e juliprosopina,
presentes na fração F32.
40
Células Viáveis (%)
Células Viáveis (%)
0
1,5
3
7,5
10
30
45
0
1,5
3
10
30
45
[F32] (µg/mL)
Células Viáveis (%)
Células Viáveis (%)
[ETA] (µg/mL)
7,5
0,0
0,5
1,0
1,5
LOG [ETA] (µg/mL)
2,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
LOG [F32] (µg/mL)
Figura 2 – Análise do efeito dos alcaloides de P. julifora sobre viabilidade dos
neurônios e células gliais através do teste do MTT. As células foram incubadas em
condições controle (0,1% de DMSO) ou na presença de ETA (A) ou F32 (B) e
viabilidade determinada após 24 horas do tratamento. Resultados expressos em
percentagem da absorbância em relação ao controle considerado como 100%. *p<0,05.
41
H
Vacuolização em
Astrócitos (%)
Vacuolização em
Astrócitos (%)
G
0
0,3
1,5
ETA (µg/mL)
3
0
0,3
1,5
F32 (µg/mL)
Figura 3 - Análise do efeito dos alcaloides de P. juliflora na morfologia
celular e indução de vacuolização de astrócitos em co-culturas de
neurônios/células gliais através da coloração com o agente pancrônico de
Rosenfeld. (A) Culturas em condições de controle ou após 24 h de
tratamento com 1,5 µg/ mL de ETA (B), 3 µg/mL ETA (C), 1,5 µg/mL F32 (D e
E), ou 3 µg/mL F32 (F). A seta indica o corpo celular de um neurônio; a ponta
de seta Indica um neurônios com interrupções nos neuritos; o asterisco
indica astrócito com vacuolização citoplasmática em neurites e vacúolos;
objetiva 20x0,70, barra de escala = 10 µm. (G e H) Quantificação dos
astrócitos em vacuolização nas co-culturas em condições de controle (0,1%
de DMSO) e 24 h após tratamento com ETA (0,3-3 µg/mL) ou F32 (0,3-1,5
µg/ml), os resultados estão expressos como uma percentagem da média
razão de astrócitos possuindo vacúolo/astrócitos totais desvio padrão (SD);
* p <0,05.
42
Figura 4 – Análise do efeito dos alcaloides de P. juliflora na morfologia de astrócitos e
expressão GFAP em co-culturas de neurônios/células gliais. Fotomicrografias de
marcação imunocitoquímica de astrócitos expressando GFAP em condições de controle
(A) e após 24 h de tratamento com 1,5 µg/mL F32 (B), 3 µg/ mL F32 (C), 1,5 µg / ml de
ETA (D) ou 3 µg/ml de ETA (E). A cromatina nuclear de neurônios e células gliais foi
corada com Hoechst 33258. Objetiva 20x0,70; barra de escala = 10 µm. (F) bandas
imunorreativas da proteína GFAP foram identificadas através de westernimunoblot em
extratos protéicos das co-culturas 24 h após o tratamento com alcaloides; os resultados
são representativos de três experiências independentes.
43
Figura 5 – Análise do efeito dos alcaloides de P. juliflora na morfologia de neurônios e
expressão β-III-tubulina em co-culturas de neurônios/células gliais. Foto micrografias de
marcação imunocitoquímica de neurônios expressando β-III-tubulina em condições de controle
(A) e após 24 h de tratamento com 3 µg/ml de ETA (B) ou 3 µg/mL F32 (C). A cromatina nuclear
de neurônios e células gliais foi corada com Hoechst 33258. Objetiva 20x0,70; barra de escala =
10 µm.
44
0
1,5
ETA (µg/mL)
3
0
1,5
3
F32 (µg/mL)
Figura 6 – Análise do efeito dos alcaloides de P. juliflora na ativação da microglia em coculturas de neurônios/células gliais após marcação imunocitoquímica da proteína OX-42 e
coloração com Rosenfeld. Fotomicrografias de marcação imunocitoquímica de astrócitos
expressando GFAP em condições de controle (A) e após 24 h de tratamento com 1,5 µg/ml de
ETA (B) ou 1,5 µg/ mL F32 (C). Objetiva 20x0,70; barra de escala = 10 µm. Quantificação de
células da microglia OX42 positvas em condições controle ou tratadas com 1,5 - 3 µg/ml de ETA
(D) ou 1,5 - 3 µg/ mL F32 (E); *p<0,05.
45
0
1,5
ETA (µg/mL)
3
0
1,5
3
F32 (µg/mL)
Figura 7 – Medida da produção de nitrito (NaNO2) no meio de cultura em condições de
controle e após 24 h de tratamento com 1,5 - 3 µg/ml de ETA (A) ou F32 (B).
Resultados expresso como media desvio-padrão; *p<0.05.
46
Figura 8 – Análise por microscopia eletrônica de transmissão de modificações
ultraestruturais induzidas por alcaloides de P. juliflora em co-culturas de
neurônios/células gliais. Fotomicrografias das culturas em condições de controle
(A) e após 24 h de tratamento com ou 3 µg/ml de ETA (B), 3 µg/ mL F32 (C e D).
O asterisco branco (em B) indica mudanças na morfologia mitocondrial. A seta
(em C e D) indica desintegração ou encurtamento das cristas mitocondriais. O
asterisco negro (em D), indica vacúolos citoplasmáticos.
47
4. ARTIGO CIENTÍFICO II
Autofagia protege contra a morte celular induzida por alcaloides da Prosopis juliflora
em co-cultura de neurônios/células da gliais.
RESUMO
Prosopis juliflora (Swartz) DC é um arbusto nativo da América Central, norte da
América do Sul e das ilhas do Caribe, que se tornaram frequentes invasoras em
regiões de todo o mundo. Esta planta tem sido usada para alimentar animais e seres
humanos, no entanto, uma ação sinérgica dos alcaloides piperidínicos tem sido
sugerida como responsável por danos neurotóxicos observados em bovinos e
caprinos após intensa ingestão deste alimento. Neste estudo investigou-se o
envolvimento de dano mitocondrial e autofagia no mecanismo de morte celular
induzida por alcaloides piperidínicos de folhas da P. juliflora utilizando 30 µg/mL de
um extrato alcaloidal (ETA) e 7,5 µg/mL de uma fração de alcaloides (F32) em
modelos de co-cultura de neurônio/células gliais. Foi demonstrado que ETA e F32
induziram redução nos níveis de ATP, perturbação do potencial de membrana
mitocondrial e aumento significativo no número de células LC3-positivas após 12h
de exposição, aumento na ativação da caspase-3, após 16h de exposição, mudança
drástica na morfologia de neurônios e células gliais e morte celular significativa após
24 horas de exposição. Curiosamente, pré-incubação com bafilomicina aumentou a
morte celular e alterações morfológicas induzidas por ETA, e privação de soro fetal
bovino reduziu a morte celular e alterações morfológicas induzidas por F32. Em
conclusão, estes resultados sugerem que o mecanismo de morte neuronal e glial
induzida por alcaloides de P. juliflora envolve apoptose em resposta ao dano
mitocondrial e inibição do fluxo da autofagia. Além disso, a autofagia parece ser um
mecanismo importante de proteção contra a morte celular induzida por alcaloides da
P. juliflora em co-cultura de neurônio/células da gliais.
Palavras-chave: Prosopis juliflora; alcaloides piperidínicos; autofagia; apoptose;
neurônios; células gliais.
48
Autophagy protects against cell death induced by alkaloids from Prosopis juliflora in
neuron/glia cells co-culture
SUMMARY
Prosopis juliflora (Swartz) DC is a shrub native to Central America, northern South
America and the Caribbean islands, that have become frequent in other regions
throughout the world. This plant has been used to feed animals and humans,
however a synergic action of piperidine alkaloids have been suggested to be
responsible for the neurotoxic damage observed in cattle and goats after intensive
ingestion of this feed. In this study we investigated the involvement of mitochondrial
damage and autophagy on mechanism of cell death induced by piperidine alkaloids
from P. juliflora using 30 µg/mL of a total alkaloid extract (TAE) and 7.5 µg/mL of an
alkaloid fraction (F32) in models of neuron/glial cell primary co-culture. We found that
TAE and F32 induce reduction in ATP levels, disruption of mitochondrial membrane
potential and significant increase in number of LC3 positives cells after 12h of
exposure, increase in caspase-3 activation after 16h, dramatic morphological
changes on neuron and glial cells and a significant cell death after 24h of exposure.
Interestingly, preincubation with bafilomycin increased the cell death and
morphologic changes by TAE, and serum deprivation reduced the cell death induced
and morphologic changes induced by F32. In conclusion, these results suggest that
mechanism of neuron and glial cells death induced by alkaloids from P. juliflora
involve apoptosis in response to mitochondrial damage and autophagic flux
inhibition. Moreover, autophagy seems to be an important protective mechanism
against the cell death induced by alkaloids from Prosopis juliflora in neuron/glia cells
co-culture
Key Words: Prosopis juliflora; Piperidine alkaloids; autophagy; apoptosis; neurons;
glial cells.
49
4.1. Introdução
Prosopis juliflora (Swartz) DC é um arbusto nativo da América Central, norte
da América do Sul e das Ilhas do Caribe (BURKART, 1976), que se tornaram
invasoras em outras regiões em todo o mundo como a Índia, sul da África, Oriente
Médio, Paquistão e Havaí (EUA) (PASIECZNIK et al., 2001). No Brasil, esta planta
foi introduzida na década de 1940 e suas vagens têm sido usadas para a
alimentação de gado leiteiro e de corte, ovinos, caprinos, suínos, galinhas e eqüinos
(MORENO et al., 2005; SILVA et al. 2002a,b; STEIN et al. 2005; ROSSI et al., 2009;
MORENO et al., 2005; SILVA et al. 2002a,b; STEIN et al. 2005; ROSSI et al., 2009).
Também têm sido usadas para o consumo humano, na elaboração de pães,
biscoitos, geléias, doces, e bebida substituta do café (VIEIRA et al, 1995; CHOGE et
al, 2007).
Esta
planta
contém
esteroides,
alcaloides,
cumarinas,
flavonoides,
sesquiterpenos e ácido esteárico (ALMARAZ-ABARCA et al., 2007). Extratos das
vagens e folhas de algaroba têm demonstrados vários efeitos farmacológicos, tais
como anti-bacteriano (AQEEL AHMAD et al., 1989; AQEEL AHMAD et al., 1986;
AQEEL AHMAD et al., 1995 ; KANTHASAMY et al., 1989; CA-CERES et al., 1995;
AL-SHAKH-HAMED & AL-JAMMAS, 1999; SATISH et al., 1999), antifúngica (AQEEL
AHMAD et al., 1989a; KANTHASAMY et al., 1989; KAUSHIK et al., 2002),
estimulantes do sistema imunitário (AQEEL AHMAD et al., 1992), inibidores da
acetilcolinesterase, inibidores da butirilcolinesterase com atividade de bloqueio de
canais de Ca2+ (CHOUDHARY et al., 2005) e efeito anti-helmintico (BATATINHA et
al., 2011). Estas propriedades têm sido atribuídas aos alcaloides piperidínicos que
têm a sua estrutura compostas por dois anéis piperidínicos, que são ligados a uma
porção indolizidínica através de duas cadeias alifáticas (AHMAD & MOHAMMAD et
al, 1979; AHMAD et al, 1985, AHMAD et al, 1986; AHMAD et al, 1989). Os principais
alcaloides biologicamente ativos juliprosina e juliprosopina apresentam os grupos
químicos funcionais (carbonila e os radicais hidroxila) em carbonos 3 e 3' dos anéis
piperidínicos ou no carbono 3''' do anel indolizidínico, respectivamente (NAKANO et
al, 2004; CHOUDHARY et al. , 2005). A ação sinérgica dos alcaloides piperidínicos
têm sido sugerida como responsável pelo dano neurotóxico observado em bovinos e
caprinos, após a ingestão intensiva de Prosopis juliflora (TABOSA et al, 2000a;
50
TABOSA et al, 2000b; SILVA et al 2007; CÂMARA et al., 2009; SILVA et al., 2012).
Tabosa et al., (2000b) observaram que a atividade tóxica em animais de laboratório
está quimicamente relacionado com os alcaloides piperidínicos, dentre eles a
juliprosopina e a juliprosina, presentes nas vagens desta leguminosa. No primeiro
capítulo desta tese, demonstramos que uma fração (F32) composta pelos alcaloides
piperidínicos juliprosopina, como constituinte majoritário, e em menor quantidade
juliprosina, amplificou efeitos neurotóxicos induzidos por um extrato alcaloidal (ETA)
em neurônios e células gliais in vitro. Estes efeitos são caracterizados por
astrogliose, microgliose, interrupção na expressão de proteínas do citoesqueleto,
danos mitocondriais e indução de autofagia (SILVA et al, 2012). No entanto, o
envolvimento destas alterações celulares e no mecanismo de morte induzida por
estes alcaloides ainda não foi caracterizado. Neste sentido, este estudo vem
investigar o envolvimento do dano mitocondrial e autofagia no mecanismo de morte
celular induzida por alcaloides piperidínicos da P. juliflora usando um extrato
alcaloide total (ETA) e a fração F32 em modelos de co-cultura de neurônios/células
gliais.
4.2 Material e métodos
Co-culturas primárias de neurônios/células gliais
Culturas primárias das células da glia foram preparadas de acordo com
método descrito por Cookson & Pentreath (1994). Resumidamente, os hemisférios
cerebrais de ratos Sprague-Dawley de um dia de idade pós-natal foram isolados
assepticamente e as meninges foram removidas com auxilio de lupa para posterior
dissecção do tecido cortical. Em seguidas, as células foram suspensas em meio
DMEM/HAM-F12 (Cultilab, SP, Brasil), suplementado com 100 UI/mL de penicilina
G, estreptomicina 100 µg/mL, 2 mM de L-glutamina, 0,011 g/L de piruvato, 10% de
SFB, 3,6 mg/L Hepes e 33 mM de glicose (Cultilab, SP, Brasil) e cultivadas em
placas de 100 milímetros Ø em uma atmosfera úmida com 5% de CO2 a 37° C. O
meio de cultura foi mudado a cada dois dias, e as células foram cultivadas durante
15 dias, para serem então tripsinizadas (tripsina-EDTA) e plaqueadas a uma
densidade de 670 células/mm2 e mantidos por 48 h em uma atmosfera úmida com
5% de CO2 a 37° C para estabilização da cultura. Neste momento, neurônios de
hemisférios cerebrais de embriões de ratos Sprague-Dawley com 15-18 dias de
idade gestacional, foram obtidos através do mesmo método descrito acima para a
51
cultura da glia. As células neuronais em suspensão no meio DMEM/HAM-F12
suplementado foram semeadas sobre a monocamada astroglial numa proporção de
1:2 células gliais (335 células/mm2). As células gliais e neuronais juntas foram
incubadas em atmosfera úmida com 5% de CO2 a 37° C durante 8 dias, quando os
tratamentos foram realizados.
Alcaloides e tratamentos
O extrato de alcaloide foi obtido através do método ácido/base de extração
modificado, tal como descrito por Ott-Longoni et al. (1980), com algumas
modificações (SILVA et al, 2007). A fração F32 composta por dois alcaloides
piperidínicos juliprosopina e juliprosina foi obtida por cromatografia em coluna de
sílica gel utilizando clorofórmio/metanol (99:1 a 1:1) como fase móvel (SILVA et al,
2007). Para os tratamentos, o ETA e a F32 foram dissolvidos em dimetilsulfóxido
(DMSO, Sigma, St. Louis, MO), para gerar soluções de estoque em concentrações
de 30 mg/mL, que foram armazenadas a -20° C. As células foram tratadas com
concentrações próximas aos valores de EC50 determinados no primeiro capítulo
testa tese, 30μg/mL de ETA ou F32 de 7,5μg/mL, por um período de 12 - 24 h. O
grupo do controlo negativo foi tratado com DMSO diluídos em meio de cultura, o
maior volume equivalente usado nos grupos tratados (0,1%) e não mostrou nenhum
efeito significativo nos parâmetros analisados em comparação com células que não
receberam diluentes.
Medição de ATP
Após 12h de exposição aos alcaloides, os níveis de ATP em co-cultura foram
mensurados usando o Kit Cell-Titer-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega,
Madison, WI, USA). Para tanto, as células após tratamentos foram tripsinizadas e
transferidas para placas de 96 poços, adotando-se oito replicatas por condição
experimental. Um volume de 100 μl do reagente Kit Cell-Titer-Glo foi adicionado em
cada poço, e após 10 min, o sinal de luminescência foi mensurado usando um leitor
de ELISA a 562 nm. Possíveis diferenças entre o número de células presentes em
cada poço foi normalizada por dosagem de proteínas pelo Kit BSA. Os resultados
foram expressos na razão de µg de ATP por µg de proteína.
52
Determinação do potencial de membrana mitocondrial
O JC-1 (iodeto de 5, 5´, 6, 6´-tetracloro-1, 1´, 3, 3´-tetraetilbenzimidazolilcarbocianina) é um corante catiônico, que ao corar células com potencial de
membrana mitocondrial normal, se apresenta na forma monomérica no citoplasma e
na forma de agregados nas mitocondriais. Entretanto na visualização de células que
tiveram alteração no potencial de membrana mitocondrial é percebida apenas a sua
marcação na forma monomérica. Após tratamentos de 12 h, as células foram
incubadas com solução de 1,5 µg/mL do corante JC-1 em PBS em ambiente escuro,
por 40 min e posteriormente lavadas com PBS e observadas em microscopia
confocal, pela qual foram avaliadas as intensidades de fluorescência monomérica
verde a 488 nm (excitação) e 510–525 nm (emissão) e da fluorescência de
agregados vermelho a 543 nm (excitação) e 570 nm (emissão).
Tranfecção com plasmídio GFP-LC3
Para detecção de autofagossomos, as co-culturas de neurônios/células gliais
foram transfectadas com o plasmídeo GFP-LC3 (gentilmente cedido por Zsolt
Tallocky PhD, Columbia University Medical Center). Para formar o complexo de
transfecção, foram utilizados 2 µL de reagente de transfecção HD Fugene (Roche
Diagnóstico) e 0,5 µg de DNA plasmídial GFP-LC3 em 25 µL de volume total do
meio de cada placa, mantidas no escuro durante 15 min. Em seguida, o complexo
de transfecção em 150 µL de meio de cultura foi adicionado a cada placa e incubouse durante 24 h. Em seguida, o meio de cultura foi mudado e as células foram
cultivadas durante mais 24 horas antes do tratamento com ETA e F32.
Microscopia confocal
Lamínulas foram montadas em lâminas com líquido de montagem (Dako,
Carpinteria, CA) e mantidas no escuro a 4° C. O modelo de microscópio Confocal
LSM-410 (Axiovert-100; Zeiss, Gottingen, Alemanha) foi utilizado para analisar as
células. A iluminação da amostra foi realizada por meio de um laser de He-Ne com
excitação a 543 nm e um filtro de emissão a 560 nm.
Ativação de Caspase 3
Após 16h de tratamento, as células foram soltas com tripsina e centrifugadas
a 3000 rpm durante 5 min. O sedimento foi ressuspenso em tampão RIPA (Tris-HCl
53
50 mM, pH: 7,4; NaCl 150 mM, 1% NP40, com coquetel de inibidores de protease
1μL/mL), e nova centrifugação após 30 min de incubação a 14000 rpm, durante 30
min. Em seguida o sobrenadante contendo a proteína total foi recuperado. A
proteína total foi quantificada por reagente BSA. Para a análise, 100 µg de proteína
foi depositada em gel de empilhamento (4% de poliacrilamida) e corridas em gel a
10% de poliacrilamida. A eletroforese foi realizada a 110 V durante 90 min. As
proteínas foram transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno
(PVDF, Immobilon-P, Millipore), a 100 V durante 1 h. O depósito igualitário da
quantidade de proteína foi confirmado por coloração das membranas com vermelho
Ponceau (Sigma). Em seguida, as membranas foram bloqueadas durante 1 h à
temperatura ambiente, em 20 mmol/L Tris-solução salina tamponada (pH 7,5),
contendo 0,05% de Tween 20 (TBS-T) e 5% de leite desnatado em pó.
Subsequentemente, as membranas foram incubadas com anticorpo de coelho anticaspase 3 (1:1000, Santacruz, sc-7148), diluído em TBS-T contendo 1% de leite
desnatado em pó, durante toda a noite. Anticorpo de cabra conjugado com fosfatase
alcalina anti-IgG de coelho (1:5000 em TBS-T, Bio-Rad) foi usado como um
anticorpo secundário. Bandas imunorreativas foram visualizadas utilizando o kit de
substrato de AP-conjugada (Bio-Rad), de acordo com as instruções do fabricante. A
quantificação foi obtida por densitometria de varredura (ScanJet 4C, Hewlett
Packard) e analisados com o software ImageJ 1.33u (Wayne Rasband, National
Institutes of Health, EUA).
Viabilidade celular
A viabilidade celular foi avaliada através da integridade da membrana
plasmática utilizando o método da exclusão ao Azul de Tripan. Tanto as células
aderentes quanto as flutuantes, em placas de 35 mm de Ø (TPP Suíça), foram
colhidas após tripsinização (0,025% de tripsina, EDTA 0,50%) e centrifugadas
durante 5 minutos a 3000 rpm. As células foram suspensas em 200 µL de PBS e
coradas com Azul de Tripan, a uma concentração final de 0,1% (v / v). Oito placas
replicatas
foram
usadas
para
cada
análise.
As
células
viáveis
e
não-viáveis (azuis) foram determinadas após 24 h de exposição a 30 μg/mL de ETA
ou 7,5 μg/mL de F32 através da contagem do número de células em 10 µL de
suspensão para cada experimento. Os resultados obtidos foram expressos como a
média ± desvio padrão (DP). Os efeitos de inibição ou indução de autofagia na
54
viabilidade celular em co-culturas expostas a 30 µg/mL de TAE ou 7,5 µg/mL de F32,
durante 24 horas foram analisados por meio de pré-incubação com 1 µM
bafilomicina (inibidor de autofagia) durante 2 h, ou pré-incubação com meio de
cultura sem soro fetal bovino durante 1 h (indução de autofagia).
Determinação de alterações morfológicas
As alterações morfológicas foram analisadas e fotografadas em um
microscópio óptico de contraste de fase e usando uma câmera digital. O
experimento foi realizado em placas de 3,5 Ø (TPP Suíça). Os efeitos de inibição ou
indução
de
autofagia
na
morfologia
das
células
expostas
a
30 µg/mL de ETA ou 7,5 µg/mL de F32 durante 24 horas, foram analisados por uso
de pré-incubação com um bafilomicina 1 µM durante 2 horas, para inibir a autofagia
ou a pré-incubação com meio sem soro fetal bovino durante 1 h para induzir
autofagia.
Análises estatísticas
Os resultados foram expressos em média ± desvio-padrão. One-way ANOVA
seguido pelo teste de Student-Newmann-Keuls foram utilizados para determinar as
diferenças estatísticas entre os grupos que diferem em apenas um parâmetro. Teste
t de Student foi utilizado para as comparações entre dois grupos. Valores de p <0,05
foram considerados significativos.
4.3. Resultados
A medição do ATP revelou que 12 h de exposição ao ETA (30 µg/mL) e F32
(7,5 µg/mL) inibiu o metabolismo mitocondrial (Fig. 1). Alterações no potencial de
membrana mitocondrial medida por coloração de JC-1 demonstraram que as coculturas de neurônios/células gliais em condições controle (DMSO a 0,1%)
apresentaram o JC-1 como um monômero no citossol como marcação verde (Fig.
2B) e também acúmulo na forma de agregados em que as mitocôndrias são
marcadas na coloração vermelha (Fig. 2A), que indica que as células apresentaram
potencial de membrana mitocondrial normal. Por outro lado, as células expostas
durante 12 h a 30 µg/mL de ETA (Fig. 2C, 2D) ou 7,5 µg/mL de F32 (Fig. 2E, 2F),
não mostraram acúmulo de JC-1 na forma de agregados, o que é indicativo de perda
de potencial de membrana mitocondrial.
55
Verificou-se que a exposição à 30 µg/mL de ETA ou 7,5μg/mL de F32, por 16
h, induzidiu apoptose por aumento da expressão da caspase-3 ativa em co-culturas
de neurônios/células gliais em comparação com a expressão de caspase-3 ativa de
células em condições controle (DMSO a 0,1%) (Fig. 3).
A
formação
autofagossomos
foi
analisada
em
co-culturas
de
neurônios/células gliais transfectadas com plasmídeos codificado para LC3-GFP,
que produz fluorescência verde. A incubação de células transfectadas com 30 µg/mL
de ETA (7,948 ± 3,981%) ou 7,5 µg/mL de F32 (29,51 ± 10,55%), durante 12h,
induziu a formação de vacúolos autofágicos (Fig. 4). Nenhum número significativo de
células positivas com vacúolos autofágicos foi visualizado em células expostas ao
veículo DMSO a 0,1%.
Para estudar a relação entre vacúolos autofágicos na morte celular induzida
pelos alcaloides, co-culturas de neurônios/células gliais foram pré-incubadas com 1
µM de bafilomicina (um inibidor da V-ATPase), durante 2 h, ou pré-incubadas
durante 1 h na ausência de soro fetal bovino, para induzir autofagia. As células vivas
e mortas foram contadas em microscópio de contraste de fase após coloração com
azul tripan (Fig. 5). Uma redução significativa na viabilidade das células foi
observada em células incubadas durante 24 h com 30 µg/mL de ETA ou 7,5 µg/mL
de F32. Este teste de viabilidade celular, também revelou que a pré-incubação com
1 µM de bafilomicina aumentou a morte celular induzida por ETA, devido à inibição
autofagia (A-). Enquanto que a privação de soro reduziu a morte celular por F32,
devido à indução da autofagia (A+). Para esclarecer um possível efeito protetor da
autofagia induzida, também investigamos a morfologia de neurônios e células gliais
em co-culturas pré-incubadas com 1 µM de bafilomicina, durante 2 h, ou préincubados na ausência de soro fetal bovino, durante 1 h. A morfologia foi analisada e
fotografadas em um microscópio óptico de contraste de fase e imagens registradas
em câmara digital (Fig. 6). Observou-se em co-culturas nas condições controle
(0,1% de DMSO, 0,1% de DMSO + 1 uM bafilomycin ou 0,1% de DMSO + privação
de soro), neurônios possuindo dois ou mais neuritos sobre uma monocamada de
astrócitos (Fig. 6 A, B, C ). No entanto co-culturas de neurônios/células gliais
expostas a alcaloides (30μg/mL de ETA ou 7,5 μg/mL de F32) durante 24 h mostrou
56
alterações estruturais nos astrócitos e perturbações na rede de neuritos (Fig. 6 D; G:
seta indica uma célula neuronal corpo; asterisco indica astrócitos com alterações
morfológicas). As mudanças morfológicas de astrócitos foram mais intensas em coculturas previamente incubadas com bafilomicina e apresentou uma grande
quantidade de astrócitos com características morfológicas de células mortas (Fig. 6
E, H: ponta de seta indica um astrócito morto; asterisco indica astrócitos com
alterações morfológicas). Por outro lado, as alterações morfológicas em astrócitos e
perturbações na rede de neuritos em co-culturas pré-incubadas na ausência de soro
fetal bovino foi menos intensa. Tal forma que nesta condição, ainda havia alguns
neurônios apresentando um único neurito (Fig. 6 F; I).
4.4. Discussão
Lesões neurohistológicas e ultraestruturais de bovinos experimentalmente
intoxicados com Prosopis juliflora foram caracterizadas por vacuolização e inchado
em mitocôndrias, com cristas mitocondriais desorientadas, desintegradas e
deslocadas perifericamente em neurônios do núcleo motor de nervos cranianos
(TABOSA et al., 2006). Em nossos estudos anteriores, foi demonstrado que doses
subtóxicas de extrato de alcaloides (ETA) induziram alteração na forma e tamanho
mitocondrial e F32 induziu desintegração de cristas mitocôndrias em co-culturas de
neurônios/células gliais
(Primeiro capítulo desta Tese). Neste estudo, foi
demonstrado que o tratamento de co-culturas de neurônios/células gliais com 30
µg/mL de ETA ou 7,5 µg/mL de F32, por 12 h, inibe o metabolismo mitocondrial e
induz uma perda no potencial de membrana mitocondrial. Ainda, mostramos que
ETA e F32 induziu ativação de caspase-3 após 16 h de incubação e morte celular
em 24 h de incubação, sugerindo que os alcaloides de P. juliflora induzem uma
morte celular com características iniciais de apoptose. Esta deve estar relacionada
com o dano mitocondrial mostrado nas células após 12 h de exposição, uma vez que
estudos têm demonstrado que as caspases 3 e 7 são mediadores críticos de de
apoptose por acometimentos mitocondriais (LAKHANI et al., 2006). Além disso, as
mitocôndrias desempenham um papel fundamental em desencadear a morte celular
por apoptose, uma vez que a sobrecarga de cálcio mitocondrial (Ca2+) é uma das
formas pró-apoptóticas para induzir o inchaço das mitocôndrias, com perturbação ou
ruptura da membrana exterior, e por sua vez a liberação de fatores mitocondriais
apoptóticos para o citossol (GIORGI et al., 2012).
57
É sabido que intoxicação de animais por P. juliflora induz vacuolização
citoplasmática em neurônios (TABOSA et al, 2000a; TABOSA et al, 2006; CÂMARA
et al., 2009). Nossos estudos anteriores caracterizaram in vitro os vacúolos
citoplasmáticos induzidos por alcaloides piperidínicos da P. juliflora, como vacúolos
autofágicos (Primeiro capítulo desta Tese). No presente estudo, mostramos que ETA
e F32 induziram em co-culturas transfectadas com GFP-LC3 um aumento
significativo no número de células com vacúolos autofágicos. A proteína LC3 tem
sido usada como um marcador específico para a quantificação de autofagossomos e
a sobre-expressão de GFP-LC3 é um método de avaliação bem aceito, simples e
específico que não perturba o número de autofagossomos pela metodologia
(TANIDA & WAGURI, 2010). Sabe-se que a autofagia desempenha um papel
importante na eliminação das organelas danificadas, tais como a mitocôndria e
constituem proteção contra a morte celular programada induzida por disfunção
mitocondrial em células neuronais (PARIS et al., 2011). Esta ocorre em vários
passos como se segue: a formação de fagóforos, formação de autofagossomos
maduros, alvo e tráfico de autofagossomos para lisossomos, formação de
autolisossomos por fusão entre autofagossomos e lisossomos, e, finalmente, a
degradação dos corpos autofágicos dentro dos lisossomos (YAMAMOTO et al. ,
2010). Além disso, sabe-se que os vários passos da autofagia podem ser
monitorados por movimento do GFP-LC3 por microscopia de fluorescência, uma vez
que o sinal fluorescente de GFP é mais sensível a pH ácido, que, implica que GFPLC3 é consumido dentro de autolisossomos recém-formados (Para revisão ver
KLIONSKY et al., 2012). Deste modo, o aumento do número de células expostas
aos alcaloides de ETA e F32 acumulando GFP-LC3 é sugestivo de defeito na fusão
de autofagossomos com lisossomos que podem por sua vez inibir a eliminação de
organelas danificadas, tais como mitocôndrias, e subsequente proteção contra a
morte celular programada. Nós ainda demonstramos que a pré-incubação com
bafilomicina aumentou a morte celular por ETA, e a privação de soro reduziu a morte
celular induzida por F32. No entanto, para ambos os tratamentos (ETA e F32)
neurônios e células gliais apresentaram alterações morfológicas mais intensas
quando as células foram pré-incubadas com bafilomicina, ou menos intensa quando
pré-incubadas com a privação de soro. Bafilomicina A1 é um inibidor de H +-ATPase
vacuolar, que suprime macroautofagia, impedindo a acidificação dos lisossomos e
58
perturbação
na
sequência
da
fusão
entre
autofagossomos e
lisossomos
(DEGTYAREV et al, 2008; WU et al, 2009). Por outro lado, o estresse nutricional
induzido por privação de soro, ativa autofagia (TRONCOSO et al, 2012; YANG el al,
2008). Além disso, foi demonstrado que autofagia pode ser ativada em células
neuronais em resposta a lesões e sugerida ter um papel na proteção de células
contra as doenças neurodegenerativas (SARKAR et al, 2007; PARIS et al., 2011).
Autofagia e apoptose não são vias exclusivas, elas poderiam ocorrer em sinergia,
onde ambas as vias são interligadas. É possível que tanto a parte de apoptose e
quanto autofagia se forme de um mesmo mecanismo, onde a autofagia atua como
um antagonista para bloquear a apoptose e promover a sobrevivência da célula
(EISENBERG-LERNER et al., 2009).
Em conclusão, nossos resultados sugerem que o mecanismo de morte
induzida em neurônios e células gliais por alcaloides da P. juliflora envolve apoptose
em resposta ao dano mitocondrial e inibição do fluxo da autofagia. Além disso, a
autofagia induzida protege estas células contra a morte celular programada.
4.5 Agradecimentos
Este
trabalho
foi
financiado
pelo
CNPq
(Conselho
Nacional
de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico) e FONDECYT 1100165.
59
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65
Figura 1 – Níveis de ATP por luminescência em condições
controle (0.1% DMSO) ou na presença de 30 µg/mL ETA
ou 7,5 µg/mL F32, for 12 h. *p<0.001.
66
Figura 2 –
Análise de alterações no potencial de
membrana mitocondrial por coloração com JC-1 em cocultura de neurônio/células gliais visualizada por
microscopia confocal. As figuras mostram células
incubadas na ausência (A - B, 0.1% DMSO) ou presença
de 30µg/mL de ETA (C - D) ou 7.5µg/mL de F32 (E - F),
por 12 h. Em células saudáveis o JC-1 apresenta-se como
um monômero no citossol (verde, B) e também como
acúmulo de agregados na mitocôndria, que cora em
vermelho (A). Na perda de potencial de membrana
mitocondrial JC-1 não pode acumular-se dentro das
mitocôndrias (C - E).
67
Cont.
ETA
F32
Pró-caspase 3
29 KDa
17 KDa
Caspase-3 clivada
Figura 3 - Ativação de caspase-3 em co-culturas de neurônios/células
gliais em condições controle (0.1% DMSO) ou tratadas durante 16 h com
30 µg/mL de ETA ou 7,5µg/mL de F32 foi determinada por análises de
western blotting (A). A quantificação foi obtida por escaneamento e
análise de densitometria usando o programa ImageJ 1.33u. O gráfico de
barras representa a expressão relativa de caspase-3 clivada (B).
68
% de células LC3 (+) / DAPI (+)
D
C o n t .
E T A
F 3 2
Figura 4 - Determinação de vesículas de autofagossomos
em co-culturas de neurônios/células gliais transfectadas
com GFP-LC3. Células transfectadas foram tratadas com
0.1% DMSO (A), 30µg/mL de ETA (B), 7,5µg/mL de F32
(C), por 12h. A, B e C são amostras com luz incidindo com
filtro de 543-nm de excitação e filtro de 560 nm de emissão
para visualizar fluorescência verde. Em D, a quantificação
do número de células DAPI (+) com vacúolos autofágicos
(LC3+) (*p < 0.05; ***p < 0.001).
69
% de cálulas viáveis
A
100
**
50
% de células viáveis
B
A
ut
.(
+)
+
ET
A
ET
A
+
(A
ut
.-)
ET
A
(+
)
A
ut
.
ut
.-)
(A
C
on
t
0
100
***
50
F3
2
+
A
ut
F3
.(
-)
2
+
A
ut
.(
+)
F3
2
)
A
ut
.
(+
(-)
ut
.
A
C
on
t
0
Figura 5 – O efeito da inibição ou indução de autofagia em células
expostas a 30 µg/mL de ETA (A) ou 7,5 µg/mL de F32 (B) por 24 h
foi analisado por pré-incubação por 2h com bafilomicina, que é
um inibidor de V-ATPase “Aut.(-)” ou pré- incubação por 1h na
ausência de soro fertal bovino no meio de cultura, como indutor de
autofagia “Aut.(+)”. A viabilidade celular foi mensurada por
contagem de células viáveis e mortas após coloração com Azul de
Tripan. Em (A), um aumento significativo na quantidade de células
mortas foi observado quando as células foram pré-incubadas com
bafilomicina. Em (B) uma redução significante na morte celular
observada em células pré-incubadas com meio sem soro, em
comparação com células apenas incubadas com ETA e F32. A
significância estatística foi avaliada usando
ANOVA para
múltiplas comparações e Newman-Keuls. Valores das amostras
controle foram fixados em 100 %; **p<0.01; ***p<0.001.
70
A
B
C
D
E
F
*
*
*
G
H
I
*
*
*
*
Figura 6 – Efeitos da inibição ou indução de autofagia na
morfologia de neurônios e células gliais co-cultivados
expostos a 30 µg/mL de ETA (D; E; F); 7,5 µg/mL de F32
(G; H; I) ou condições controle (A; B; C) durante 24h, foi
analisado e fotografado em um microscópio de contraste de
fase e câmara digital. Para a inibição de autofagia, as
células foram pré-incubadas com 1µM de bafilomicina,
durante 2h (B; E’ H). Para induzir autofagia , células foram
pré-incubadas com meio de cultura sem soro fetal bovino por
1 h (C; F; I). Setas indicam corpos de neurônios; pontas de
seta indicam astrócitos mortos; asteriscos indicam astrócitos
com alterações morfológicas. Objetiva 40x0,70; barra de
escala = 1 µm.
71
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os estudos apresentados nesta tese vêm contribuir para elucidar os impactos
neurológicos observados em animais intoxicados pelo consumo da Prosopis juliflora,
uma planta de grande importância para a alimentação de animais e humanos na
região Nordeste do Brasil, no sentido em que caracterizamos os alcaloides
juliprosopina e juliprosina como os componentes ativos da fração de maior
toxicidade para células do sistema nervoso central e correlacionamos efeitos in vitro,
tais como ativação de células gliais, morte de neurônios, danos mitocondriais e
vacuolização citoplasmática induzidos por estes alcaloides, com as lesões
histológicas e ultraestruturais visualizadas em bovinos e caprinos intoxicados pela P.
juliflora, conforme descrito na literatura. Ainda sugerimos a mitocôndria como a
organela alvo destes alcaloides na célula, o que desencadeia um processo
autofágico, de caráter protetor, que, no entanto apresenta-se interrompido pela
própria ação destes alcaloides, conduzindo à célula à morte celular por apoptose.
A elucidação dos impactos neurológicos gerados pelos alcaloides da
P. juliflora e ainda, o esclarecimento dos mecanismos de ação destes princípios
ativos, assim como os mecanismos de inibição dos efeitos deletérios gerados pelos
mesmos, servirão como norteadores para pesquisas aplicadas que visem contribuir
para a prevenção e tratamento de intoxicações animais por consumo de vagens da
P. juliflora. Com isso o fornecimento deste vegetal de alta qualidade nutricional como
alimento para bovinos e caprinos, poderá ser amplificado, o que solucionará
problemas econômicos do setor agropecuário, decorrentes de períodos de escassez
de água que ocorre em algumas regiões do Brasil.
72
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91
7. PRODUÇÃO BIBLIOGRAFICA
7.1. Resumos publicados e apresentados em Eventos Científicos diretamente
relacionados à Tese.
SILVA, V. D. A.; PITANGA, B. P. S.; SILVA, ANA RITA ; SILVA, AMM; MENEZES
FILHO, N.J. ; COSTA, M. F. D.; VELOZO, E. S.; ELBACHÁ, R. S.; COSTA, S.
L. Effects of alkaloids extracted from leaves of Prosopis juliflora Swartz. D.C. on glial
activation and on neurons viability. In: X Reunião Regional Nordeste Sociedade
Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular e I Simpósio Latino Americano de
NeuroquímicI Simpósio Latino Americano de Neuroquímica, 2010, Salvador. Anais
do X Reunião Regional Nordeste Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia
Molecular e I Simpósio Latino Americano de NeuroquímicI Simpósio Latino
Americano de Neuroquímica, 2010.
SILVA, V. D. A.; MENDES, A.M.; PITANGA, B. P. S.; Souza, CS; MENEZES FILHO,
N.J.; COSTA, M. F. D.; ELBACHÁ, R. S.; VELOZO, E. S.; COSTA, S. L. Cytotoxics
alkaloids extrecteds from Prosopis juliflora leaves induce astroglial vacuolation and
microglial activation on neuron/glia co-culture. In: XV Congresso da Sociedade
Brasileira de Biologia Celular, XV Meeting Brazilian Society for Cell Biology, 2010,
São Paulo. Anais do XV Congresso da Sociedade Brasileira de Biologia Celular, XV
Meeting Brazilian Society for Cell Biology, 2010.
SILVA, V. D. A.; PITANGA, B. P. S.; Souza, CS; Silva, Ana Rita; Silva,
AMM; COSTA, M. F. D.; ELBACHÁ, R. S.; VELOZO, E. S.; Figueira, C.P.; COSTA,
S. L.. Alkaloids extracted from leaves of Prosopis Juliflora Swart. D.C. induce glial
activation and autophagic cell death on neuron/glial cell primary co-cultures. In: XL
Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquimica e Biologia Molecular, 2011,
Foz do Iguaçu. Anais da XL Reunião Anual da SBBq, 2011.
SILVA, V. D. A. ; CUEVAS, C. ; MUNOZ, P. A. ; VELOZO, E. S. ; Segura-Aguilar, J.
; COSTA, S. L. . Autophagy protects against cell death induced by alkaloids from
Prosopis juliflora in neuron/glia cells co-culture.. In: XLI Annual Meeting of The
92
Brazilian Biochemistry and Molecular Biology Society, 2012, Foz do Iguaçú, PR.
Anais da XLI Annual Meeting of The Brazilian Biochemistry and Molecular Biology
Society, 2012.
7.2. Artigos publicados diretamente relacionados à tese
SILVA, V.D.A; PITANGA, B.P.S; NASCIMENTO, R.P ; SOUZA, C.S:; PAULO
LUCAS C. COELHO, P.L.C; MENEZES-FILHO, N; SILVA, A.M.M; COSTA, M.F.D;
EL-BACHA, R.S.; EUDES S.; VELOZO, E.S.;COSTA, S.L. Submetido para a revista
Toxicologic Pathology.
7.3. Demais produção bibliográfica no período da Tese
PITANGA, B. P. S.; NASCIMENTO, R.P.; SILVA, V. D. A. ; COSTA, S. L. . The Role
of Astrocytes in Metabolism and Neurotoxicity of the Pyrrolizidine Alkaloid
Monocrotaline, the Main Toxin of Crotalaria retusa. Front Pharmacol., v. 3, p. 1-7,
2012.
PITANGA, B. P. S. ; SILVA, V. D. A. ; Souza, CS ; JUNQUEIRA, H. ; FRAGOMENI,
B.O.; NASCIMENTO, R.P.; Silva, Ana Rita; COSTA, M. F. D. ; ELBACHÁ, R.
S.; COSTA, S. L. . Assessment of neurotoxicity of monocrotaline, an alkaloid
extracted from Crotalaria retusa in astrocyte/neuron co-culture system.
Neurotoxicology (Park Forest South), v. 32, p. 776-784, 2011.
SILVA NETO, J. P.; BARRETO, R. A.; PITANGA, B. P. S. ; Souza, CS ; SILVA, V. D.
A. ; Silva, Ana Rita ; VELOZO, E. S.; BATATINHA, M. J. M.; TARDY, M. ; RIBEIRO,
C. S.; DIAS, M.F.; ELBACHÁ, R. S.; COSTA, S. L. . Genotoxicity and morphological
changes induced by the alkaloid monocrotaline, extracted from Crotalaria retusa, in a
model of glial cells. Toxicon (Oxford), v. 55, p. 105-117, 2010.
93
8. ANEXOS
A
B
C
D
Anexo 1: Em (A): algarobeiras em região semi-árida da
África; em (B): vagens de algaroba; em (C): farelo de
algaroba para alimentação animal (fotos de Pasiecznik);
em (D): bovino intoxicado por consumo da algaroba
(Câmara et al., 2009).
94