EFEITO DA ADIÇÃO INTERMITENTE DE NITRATO NA BIOGÊNESE DE H2S
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Ricardo Vieira Gonçalves, Sandra Mara Santana Rocha, Vicelma Luiz Cardoso
Bolsista de iniciação Científica PIBIC/CNPQ/UFU, discente do curso de Engenharia Química da UFU/MG
Aluna de Doutorado da Faculdade de Engenharia Química da UFU/MG
Professora da Faculdade de Engenharia Química da UFU/MG
1,2,3
Faculdade de Engenharia Química da Universidade Federal de Uberlândia. Av João Naves de Ávila, 2121,
Bloco 1K, Campus Santa Mônica, Uberlândia - MG, CEP 38400-902.
e-mail: [email protected]
RESUMO - A principio todos os efluentes podem ser tratados por via anaeróbia, porém
efluentes contendo altas concentrações de sulfato apresenta problemas relacionados
principalmente à produção de sulfeto (H2S), que é a forma de enxofre energeticamente mais
estável e que sob condições anaeróbias, é altamente reativo. Uma alternativa para a redução
da produção de H2S tem sido a adição de nitrato ao efluente. A aplicação de nitrato favorece a
atividade das bactérias redutoras de nitrato (BRN), e consequentemente inibe o metabolismo
das bactérias redutoras de sulfato (BRS) que são as responsáveis pela produção de H2S em
sistemas de digestão anaeróbia. Este trabalho avaliou a redução da produção de sulfeto por
BRS mediante adição intermitente de nitrato, empregando um efluente sintético rico em sulfato
e uma cultura mista isolada da água de produção de petróleo da cidade de Carmópolis – SE,
enriquecida com BRS. Os resultados mostraram que houve inibição das BRS quando em
concentrações de nitrato e nitrito foram superiores a 40 e 100 mg/L, respectivamente. O
consumo de nitrato nas etapas em que o mesmo foi adicionado mostrou que as BRN
mantiveram-se ativas durante toda a operação.
Palavras-chave: tratamento de efluentes, bactérias redutoras de sulfato (BRS), bactérias
redutoras de nitrato (BRN)
INTRODUÇÃO
O tratamento anaeróbio de efluentes
contendo altas concentrações de sulfato apresenta
problemas relacionados principalmente à geração
de sulfeto. O sulfeto é a forma de enxofre
energeticamente mais estável e, sob condições
anaeróbias, é altamente reativo, corrosivo e tóxico.
Por conseguinte, durante o tratamento anaeróbio
pode ocasionar diversos problemas físicoquímicos (corrosão, odores, aumento na
concentração da demanda química de oxigênio
(DQO) no efluente) e/ou biológicos (toxicidade,
inibição do metabolismo microbiano), devido à
produção de sulfeto de hidrogênio.
Efluentes deste tipo são gerados em vários
processos industriais, como por exemplo, na
exploração e produção de petróleo, e naqueles
que fazem uso de ácido sulfúrico ou de matériasprimas ricas em sulfato (indústrias de fermentação
e pesqueira), ou ainda naqueles que empregam
compostos reduzidos de enxofre, tais como sulfeto
(curtume, polpeamento Kraft), sulfito (indústria de
papel sulfite) e tiossulfato (branqueamento de
papel) (Lens et al.,1995). Segundo Lima et al.
(2001), quanto maior a disponibilidade de matéria
orgânica para metabolização microbiana, maior a
produção de sulfeto para um mesmo tempo de
retenção hidráulica. Nestes casos o sulfato atua
como aceptor final de elétrons para um grupo de
bactérias que pode associar a oxidação de
compostos orgânicos e a redução de sulfato à
produção de sulfeto de hidrogênio (H2S), o qual é
excretado como produto final do metabolismo das
bactérias redutoras de sulfato (BRS). Segundo
Lima et al. (2001), quanto maior a disponibilidade
de matéria orgânica a ser metabolizada em uma
solução, maior a produção de sulfeto para um
mesmo tempo de retenção hidráulica. Uma
alternativa para o controle da atividade de BRS e
consequentemente na remoção de H2S tem sido a
adição de nitrato ao efluente, chamada de
tecnologia da exclusão biocompetitiva, pois a
utilização
do
nitrato
permite
estimular
seletivamente a microbiota presente no sistema
(Hitzman et al., 1998).
VIII Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica
27 a 30 de julho de 2009
Uberlândia, Minas Gerais, Brasil
Neste contexto, o objetivo deste estudo foi
avaliar o comportamento da cultura mista rica em
BRS frente a adição intermitente de nitrato,
conduzidos em sistemas anaeróbios constituídos
de cultura mista enriquecida com Bactérias
Redutoras de Sulfato.
MATERIAIS E MÉTODOS
Microorganismos
Foi utilizada uma cultura mista de bactérias
anaeróbias enriquecida com BRS, proveniente da
água de produção de petróleo proveniente da
cidade de Carmópolis, SE.
Efluente Sintético
O efluente foi desenvolvido a partir da
modificação da composição do meio Postgate E
(Postgate, 1984) pela substituição da fonte de
carbono (lactato de sódio) por ácidos orgânicos
(valérico, butírico, propiônico e acético) e
supressão do agar-agar. Neste meio foi adicionado
sulfato e nitrato de sódio conforme em
concentrações otimizadas em estudo anterior
(Rocha et.al., 2006).
Aclimatação da Cultura
A aclimatação foi realizada através de
subcultivos da cultura microbiana em meio
Postgate
E
(Postgate,
1984),
contendo
concentrações crescentes de carbono orgânico
(0,1-5,0 g/L), através da adição da mistura dos
ácidos valérico, butírico, propiônico e acético.
Os testes de aclimatação foram conduzidos
em frascos do tipo penicilina com 50 mL de
capacidade, contendo 40 mL de meio reacional. A
condição de anaerobiose foi assegurada com fluxo
de N2 durante seu preparo e distribuição nos
frascos, e pela vedação dos frascos através de
tampas de borracha e selos de alumínio. Como
inóculo foram utilizados 4 mL da cultura estoque.
Tão logo, era evidenciado o crescimento das BRS,
4 mL do cultivo eram novamente transferidos para
outro frasco contendo o meio com a subseqüente
concentração de carbono (mistura de ácidos).
Primeira etapa - Duração de 10 dias. Do dia
de partida até o 10º foram adicionados 500 mg/L
de NO3- (nitrato de sódio) em todos os frascos em
dias alternados. Nesta fase, foram sacrificados 10
frascos, 2 a cada 2 dias, antes da adição de
nitrato, para a realização das análises químicas e
microbiológicas.
Segunda etapa - Duração de 40 dias. Teve
início no 10º dia de operação (fim da primeira
etapa) com a adição da mistura de ácidos
orgânicos, na concentração de 1000 mg/L de
carbono, nos frascos remanescentes da etapa
anterior, de tal modo a restabelecer a condição
inicial em termos de conteúdo de carbono. Nesta
fase, dois frascos eram sacrificados em dias prédeterminados, finalizando este teste 40 dias após o
início do processo.
Terceira etapa – Duração de 30 dias. Teve
início no décimo dia da segunda etapa, 20 dias a
partir do início do processo. Esta etapa consistiu
em adicionar nutrientes em alguns frascos
provenientes da segunda etapa (parte dos frascos
continuou o estudo até o final dos 50 dias de
processo), através da retirada de parte do seu
conteúdo (50% v/v) e injeção de igual volume do
meio Postgate, a fim de favorecer a atividade da
cultura microbiana. No primeiro dia foi sacrificado
um frasco, logo após a adição dos nutrientes, para
avaliar
a
nova
condição
reacional,
as
concentrações iniciais de nitrato, nitrito, sulfato,
sulfeto e de microrganismos, considerando a
diluição do meio e a entrada de impurezas
advindas da adição do meio Postgate. Os demais
frascos eram sacrificados quando necessário
realizar as análises.
Quarta etapa - Duração de 10 dias. Teve
início no 24º dia do início do processo,
aproximadamente metade do total de dias do
processo. Foram utilizados 10 frascos nas
condições da etapa anterior, onde foi feita nova
adição de 500 mg/L NO3 a cada dois dias, de
modo a estabelecer procedimento idêntico ao
efetuado na primeira etapa. Analogamente, os
frascos foram sacrificados dois a dois, para o
estudo do comportamento da cultura microbiana,
que foi feito através da análise das mesmas
determinações quantitativas realizadas nas etapas
anteriores.
Metodologia Analítica
Adição Intermitente de Nitrato
Para este teste foram utilizados frascos de
50 mL de capacidade, contendo 40 mL do efluente
sintético. Os experimentos foram divididos em três
etapas, num tempo total de 50 dias.
Periodicamente, amostras dos cultivos eram
analisadas química e microbiologicamente, para
quantificação de nitrato, nitrito, sulfato, sulfeto,
BRS, BHA e BRN. A descrição detalhada de cada
etapa é apresentada a seguir:
A concentração de sulfetos totais foi
determinada através da adaptação do método
colorimétrico para dosagem de gás sulfídrico
(Jacobs et al., 1957; APHA, 1992).
A determinação do sulfato, feita utilizando-se
o kit de dosagem Sulfaver da marca HACH,
conforme sugerido por Vieira (2003).
A concentração de nitrato e nitrito,
determinada através da adaptação do método
VIII Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica
27 a 30 de julho de 2009
Uberlândia, Minas Gerais, Brasil
colorimétrico descrito nas normas do Instituto
Adolfo Lutz (1985).
A quantificação das bactérias redutoras de
sulfato, feita pela técnica do número mais provável
(NMP) (Harrison Jr., 1982) utilizando meio
Postgate.
A quantificação das bactérias heterotróficas
anaeróbias (BHA), pela técnica do número mais
provável (NMP) (Harrison Jr., 1982) utilizando meio
fluido ao tioglicolato (MERK), após diluições
decimais sucessivas em solução redutora.
A quantificação das bactérias redutoras de
nitrato, pela técnica do número mais provável
(NMP) (Harrison Jr., 1982) utilizando meio mineral
(Davidova et. al., 2001).
RESULTADOS E DISCUSSÕES
A Tabela 1 mostra os resultados obtidos
para concentração residual de nitrato durante a
primeira etapa do teste, com duração de 10 dias.
O consumo de nitrato foi total nos primeiros
dois dias, seguido de um gradual decréscimo que
refletiu em acúmulo de nitrato nos reatores, ao
longo do tempo de operação. Este comportamento
pode estar relacionado à formação de algum
intermediário metabólico capaz de inibir a atividade
das BRN.
Não
houve
equivalência
entre
as
concentrações de nitrato consumido e de nitrito
formado. A menor quantidade de nitrito residual
pode ser atribuída à sua posterior redução com
formação de amônia, ou ainda à conversão do
nitrato em gás nitrogênio ou em óxido nitroso, por
atividade das bactérias desnitrificantes (Energy
Institute, 2003).
Não foi detectada a presença de BRS ao
final da primeira etapa, apesar da concentração
6
inicial de 1,8 x 10 NMP/mL. Estes resultados,
aliados à ausência de consumo de sulfato e
produção de H2S, demonstram a inibição das BRS
pela aplicação de 500 mg/L de nitrato, em pulsos.
Por outro lado, a concentração de bactérias
heterotróficas anaeróbias, inicialmente de 9,5 x 105
NMP/mL,
atingiu
2,7
x
1011 NMP/mL.
Provavelmente, o aumento do número de BHA foi
decorrente do desenvolvimento das BRN. O
crescimento das BHA em detrimento das BRS
denota a competição das duas populações
microbianas pelo substrato, conforme referido por
alguns autores (Garbossa, 2003). Neste caso, as
bactérias continuam ativas apesar de haver a
prevenção da produção de H2S.
A taxa de consumo de nitrato sofreu
gradativamente pequenos decréscimos durante os
dez dias de operação, conforme mostra a
Tabela 1. A taxa média de consumo de nitrato nos
dez dias de operação foi de 216 mg/L.dia.
A etapa seguinte (segunda etapa) teve
como finalidade avaliar se o consumo de nitrato,
ou seja, o crescimento das BRN foi limitado pela
eventual depleção da fonte de carbono. Assim,
após o décimo dia de operação, teve início a
segunda etapa com a adição 1000 mg/L de
carbono aos sistemas, voltando desta maneira o
meio reacional à condição inicial em termos de
concentração de carbono. A Tabela 2 mostra os
resultados obtidos após a correção da
concentração de carbono.
Observa-se que decorridos 5 dias da adição
de carbono, o consumo de nitrato se manteve
inalterado. Porém, ocorreu uma brusca redução no
número de bactérias heterotróficas anaeróbias de
11
8
2,7 x 10
para 2,1 x 10 NMP/mL. Este
comportamento pode estar relacionado à
readaptação dos microrganismos às novas
condições de cultivo visto que, logo a seguir,
houve um aumento gradual do consumo de nitrato.
A redução da concentração de nitrito entre o
décimo e o décimo sétimo dia, sem consumo de
nitrato, provavelmente está relacionada à redução
parcial do nitrito a NH3 ou sua desnitrificação, com
geração de N2, que continua ocorrendo devido a
instabilidade do mesmo.
Nesta etapa também não houve consumo
de sulfato e produção de sulfeto até o
quadragésimo dia de processo. Estes resultados
em associação à ausência de crescimento de BRS
até 40 dias de processo confirmam a intoxicação
o
destas bactérias pelo nitrito. No 50 dia de
processo verificou-se a volta do consumo de
sulfato e a produção de sulfeto. Este fato confirma
a possibilidade das BRS em sobreviver mesmo em
ambientes com aplicação do nitrato, já que
algumas apresentam a capacidade de realizar a
respiração do nitrato (Dunsmore et al., 2004). Os
resultados mostraram que a concentração de BRS
ao final de cinqüenta dias de processo foi de
1,8 ± 1,2 x 104 NMP/mL.
Considerando que o baixo consumo de
nitrato e aumento da concentração de nitrito até o
vigésimo dia poderia estar relacionado à limitação
de nutrientes e não da fonte de carbono. No
vigésimo dia de operação, ainda na segunda
etapa, foi feita a substituição em alguns dos
reatores de 50% do volume do meio reacional por
igual volume do meio Postgate, a fim de promover
o enriquecimento do cultivo, iniciando assim a
terceira etapa para esses reatores. A Tabela 3
mostra os resultados após adição de nutrientes.
VIII Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica
27 a 30 de julho de 2009
Uberlândia, Minas Gerais, Brasil
Tabela 1 - Resultados obtidos na primeira etapa após cinco adições de 500 mg/L de nitrato.
=
Tempo NO3 residual NO3 consumido
NO2
SO4 residual
H2S
Taxa de consumo de
*
(dias)
(mg/L)
(mg/L)
(mg/L)
NO3- (mg/L.dia)
(mg/L)
(mg/L)
--0
0
0
---0
1600 ± 20
500
0
250
2
0±0
90 ± 10
1590 ± 23
450
0
238
4
50 ± 2
86 ± 8
1585 ± 25
410
0
227
6
140 ± 3
100 ± 10
1603 ± 10
370
0
216
8
270 ± 5
88 ± 15
1593 ± 15
290
0
202
10
480 ± 15
95 ± 7
1607 ± 5
* A determinação da concentração de nitrato residual foi feita antes da adição de nova carga.
Tabela 2 - Resultados obtidos na segunda etapa após adição de nitrato.
=
Tempo NO3 residual NO3 consumido
NO2
SO4 residual
H2S
*
(dias)
(mg/L)
(mg/L)
(mg/L)
(mg/L)
(mg/L)
10
---0
480*± 15
95*±7
1607*±5
15
0
500 ± 10
0 ± 10
50±10
1600 ± 20
17
0
450 ± 8
30 ± 8
53 ± 10
1590 ± 23
0
20
1585 ± 25
390 ± 8
60 ± 8
97 ± 12
0
25
1603 ± 10
302 ± 5
88 ± 5
96 ± 10
30
0
112 ± 3
101 ± 5
150 ± 5
1593 ±14
0
40
1507 ± 15
57 ± 3
55 ± 5
110 ± 5
50
17±1
40 ± 5
40 ± 3
1077 ±14
135± 10
Taxa de consumo de
NO3 (mg/L.dia)
---0
3,5
8,5
13
19
5,5
3,0
*Valores referentes ao último dia da primeira etapa, e iniciais da segunda etapa.
Tabela 3 - Resultados obtidos na terceira etapa após adição de nutriente.
SO4=
Tempo NO3- residual NO3- consumido
NO2(mg/L)
(mg/L)
(mg/L)
(mg/L)
(dias)
*
*
---20
79 ± 8
1230*± 12
294 ± 15
22
54 ± 5
240 ± 20
101 ± 10
1200 ± 10
24
40 ± 3
14 ± 5
105 ± 12
1235 ± 12
0
26
1230 ± 12
42 ± 4
102 ± 10
0
28
43 ± 4
100 ± 12
1233 ± 10
0
30
1229 ± 12
40 ± 2
100 ± 10
40
18 ± 2
22 ± 6
50 ± 10
1029 ± 12
50
7±2
11 ± 4
30 ± 10
637 ± 12
H2S
(mg/L)
0
0
0
0
0
0
65 ± 5
125 ± 5
*Valores obtidos após adição do meio Postgate, estabelecendo o início da terceira etapa.
Pode-se observar que, após adição de
nutrientes, o consumo de nitrato aumentou
sensivelmente em dois dias de operação.
Concomitantemente, foi verificado o crescimento
das bactérias heterotróficas anaeróbias, sua
6
concentração variou de 1,1 x 10 NMP/mL,
9
referente ao vigésimo dia, a 2,4 x 10 NMP/mL no
vigésimo quarto dia. Por sua vez, as BRS não
apresentaram crescimento e não houve consumo
de sulfato e nem produção de sulfeto até o
trigésimo dia, apesar da adição de nutrientes e da
conseqüente diluição dos constituintes do meio
reacional.
A partir do vigésimo quarto dia não ocorreu
consumo de nitrato e sua concentração final
estabilizou em torno de 40 mg/L até o trigésimo
dia. A concentração de nitrito se manteve também
estável em torno de 100 mg/L até o trigésimo dia,
e o número de BHA diminuiu para 4,7 x 108
NMP/mL. Este comportamento deve estar
relacionado à formação de intermediários
metabólicos de efeito tóxico para o metabolismo
das bactérias redutoras de nitrato (Garbossa,
2003). A continuação dessa etapa finalizou com o
retorno da BRS, do consumo de sulfato e da
produção de sulfeto a partir do quadragésimo dia.
Nota-se que houve a redução de nitrato e de nitrito
no meio. Este comportamento mostra que houve
inibição das BRS quando em concentrações de
nitrato e nitrito foram superiores a 40 e 100 mg/L,
respectivamente. No final do processo a
concentração de BRS foi de 8,7 ± 2,4 x104
NMP/mL
A quarta e última etapa deste teste foi
realizada para avaliar o comportamento da cultura
microbiana frente a uma nova injeção de nitrato,
visto a baixa concentração deste ânion no meio
reacional. Assim, a partir do vigésimo quarto dia de
VIII Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica
27 a 30 de julho de 2009
Uberlândia, Minas Gerais, Brasil
operação (aproximadamente metade do tempo
continuaram a terceira etapa até o final (50 dias de
total de operação) foi reiniciada a adição
processo). A Tabela 4 apresenta os resultados
intermitente de nitrato, a cada dois dias, por um
desta última etapa do estudo.
período de 10 dias, em alguns reatores os demais
Tabela 4 - Resultados obtidos na quarta etapa após adição intermitente de nitrato
=
H2S
Taxa de consumo de
NO2
SO4 residual
Tempo NO3 residual NO3 consumido
*
(mg/L)
(mg/L)
NO3 (mg/L.dia)
(dias)
(mg/L)
(mg/L)
(mg/L)
0
---24
0
*1235 ± 12
*40 ± 5
*105 ± 5
26
0
164
212 ± 15
328 ±17
127 ±10
1220 ± 10
28
0
193
266 ± 20
446 ±25
134 ± 8
1210 ± 15
30
0
197
374 ± 25
392 ±19
140 ± 12
1200 ± 12
32
0
206
395 ± 21
479 ±27
142 ± 10
1220 ± 10
0
208
34
1200 ± 10
495 ± 38
400 ±21
153 ± 7
* Valores referentes ao vigésimo quarto dia da terceira etapa, e correspondentes ao início da quarta etapa.
A adição de nitrato promoveu o aumento do
seu consumo, e a conseqüente elevação da
concentração de nitrito, não obstante a taxa de
consumo de nitrato tenha sido praticamente
constante no decorrer do processo. Além disso, a
concentração inicial de bactérias heterotróficas
9
anaeróbias de 2,4 x10 NMP/mL, no vigésimo
quarto dia, aumentou para 2,7 x 1011 NMP/mL no
trigésimo quarto dia. Logo, o aumento do número
de BHA pode ser atribuído ao crescimento das
BRN devido ao consumo de nitrato e a geração de
nitrito, produto resultante do metabolismo de
algumas espécies deste grupo microbiano. Este
fato pode ser confirmado pela redução da
concentração de bactérias anaeróbias observada
na terceira etapa, quando os experimentos foram
conduzidos em condições semelhantes exceto
pela não adição de nitrato.
Um comportamento distinto foi observado
na primeira etapa, quando o sistema também foi
conduzido com injeção intermitente de nitrato
(Tabela 1). Naquela condição, o consumo de
nitrato foi decrescendo ao longo do tempo. As
taxas de consumo de nitrato destas etapas
também foram diferenciadas, isto é, na primeira
etapa a taxa diminui com o tempo e na quarta
etapa se manteve praticamente constante. Este
fato pode estar relacionado à adaptação das
bactérias a altas concentrações de nitrato e às
condições do meio reacional. Por outro lado, o
valor médio das taxas de consumo de nitrato foi
igualmente de 200 mg/L.dia, para as duas etapas
realizadas com adição intermitente de nitrato. Vale
ressaltar que o número de bactérias heterotróficas
anaeróbias ao final da primeira etapa (10º dia) e da
quarta etapa (34º dia) apresentaram a mesma
11
ordem de grandeza (10 NMP/mL), indicando que
o crescimento celular possa ter atingido seu ponto
de máximo.
CONCLUSÕES
A evolução da concentração de nitrato no
meio reacional para as 4 etapas desenvolvidas
mostra que a adição de nutrientes (terceira etapa)
foi mais importante para o aumento do consumo
de nitrato do que a adição de carbono (segunda
etapa). O consumo de nitrato nas etapas em que o
mesmo foi adicionado (primeira e quarta etapa),
mostra que as BRN mantiveram-se ativas durante
toda a operação. As BRS retornaram ao processo
após algum tempo sem adicionar nitrato, quando
as concentrações de nitrato e nitrito no meio
diminuíram, mostrando que a adição de nitrato
promoveu apenas a inibição de atuação dessas
bactérias e não sua eliminação do processo.
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R.V., CAMMAROTA, M.C., SÉRVULO, E.F.C.,
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Sistemas
Anaeróbios,
Anais
do
XVI
Congresso Brasileiro de Engenharia Química,
Santos, p. 1-8.
VIEIRA, D.S., 2003. Avaliação da biodegradação
anaeróbia no tratamento de água de
produção, EQ/UFRJ, Rio de Janeiro – RJ
(Dissertação de Mestrado).
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a FAPEMIG, ao
CNPq e a CAPES pela ajuda financeira para a
realização deste projeto.
VIII Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica
27 a 30 de julho de 2009
Uberlândia, Minas Gerais, Brasil