VIANA CLT; DE BORTOLI SA; VEIGA, ACP, GOULART RM; VACARI AM; LEMOS MVF. Diferentes gerações da
Diferentes gerações da traça-das-crucíferas sob pressão de seleção a Bacillus thuringiensis.
traça-das-crucíferas sob pressão de seleção a Bacillus thuringiensis. 2010. Horticultura Brasileira 28: S552-S557.
Diferentes gerações da traça-das-crucíferas sob pressão de seleção a Bacillus
thuringiensis.
Cácia Leila T P Viana1; Sergio Antonio De Bortoli1; Ana Carolina P Veiga1; Roberto M
Goulart1; Alessandra M Vacari1; Alessandra Karina Otuka1; Manoel V F Lemos2.
1
FCAV/Unesp - Departamento de Fitossanidade, Laboratório de Biologia e Criação de Insetos, Faculdade de
2
Ciências Agrárias e Veterinárias; Departamento de Biologia A,plicada a Agropecuária (Via de Acesso Paulo
Donato Castellane s/n, CEP: 14.8884-900 Jaboticabal-SP), e-mail: [email protected], [email protected],
[email protected], [email protected], [email protected], [email protected],
[email protected].
RESUMO
A metodologia padrão para criação de
Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera:
Plutellidae) utilizada no Laboratório de
Biologia de Criação de Insetos (LBCI) da
FCAV-Unesp, Campus de Jaboticabal, SP, foi
alterada quanto à qualidade da couve, uma
vez que as folhas são previamente
pulverizadas com suspensão de esporo/
cristal da linhagem padrão HD-1 de Bacillus
thuringiensis var. kurstaki para posteriormente
serem fornecidas à alimentação das lagartas.
6
A concentração inicial usada foi 6,0x10
esporos/mL. Os bioensaios foram realizados
com a oitava, décima quinta e vigésima
geração, sendo que até a sétima geração a
mortalidade da criação apresentava-se alta
(média de 90%), caracterizando à
suscetibilidade. Em cada bioensaio nas
gerações avaliadas foi testada a linhagem
padrão HD-1 sob diferentes concentrações.
A porcentagem de mortalidade foi reduzida
a
na 15 geração ao ser comparada com a
a
primeira geração avaliada (8 ). O ciclo
biológico foi muito variável quanto às
gerações, ou seja, apresenta-se maior ou
menor em relação à duração total do ciclo
em dias. Outro parâmetro que apresenta este
comportamento é a porcentagem de
mortalidade. Tal fato pode ser explicado pela
própria variação genética do inseto, em que
sob freqüente pressão de seleção expõe a
biologia do indivíduo à constantes mudanças.
Palavras-chave: Brassica oleracea var.
acephala , resistência, pressão de seleção.
ABSTRACT
Differents generartions of the
Diamomdbach moth under selection
pressure to Bacillus thuringiensis.
The standard methodology for rearing
of Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera:
Plutellidae) used in the Laboratório de
Biologia de Criação de Insetos (LBCI) da
FCAV-Unesp, Campus de Jaboticabal, SP,
has changed about the quality of kale, since
the leaves are first sprayed with a suspension
of spore / crystal standard strain HD-1 Bacillus
thuringiensis var. kurstaki before to be
provided to feed the caterpillars. The initial
6
concentration used was 6.0 x 10 spores / mL.
Bioassays were conducted with different
generations, and until the seven generation
mortality of rearing had to be high (mean
90%), characterizing the susceptibility. In each
test was evaluated in generations tested
standard strain HD-1 at different
concentrations. The mortality rate was
th
reduced in the 15 generation to be compared
th
with the first generation evaluated (8 ). The
life cycle was very variable as to the
Hortic. bras., v. 28, n. 2 (Suplemento - CD Rom), julho 2010
S 552
Diferentes gerações da traça-das-crucíferas sob pressão de seleção a Bacillus thuringiensis.
generations, has a higher or lower than total
cycle in days. Other parameter that shows
this behavior was the percentage of mortality.
This fact can be explained by the genetic
variation of the insect, which often under
pressure of selection exposes the biology of
the individual to constant changeng.
Keywords: Brassica oleracea var. acephala,
resitance, selection pressure.
A ocorrência mundial da traça-das-crucíferas, Plutella xylostella (L., 1758) (Lepidoptera:
Plutellidae), tem se caracterizado como fator determinante na redução da produção de repolho
(DICKSON et al., 1990). No Brasil, esta praga é constatada praticamente durante todo o
ano (BARROS et al., 1993; LOGES, 1996). MUSSURY et al. (2002) relataram que P. xylostella
tem sido também considerada uma das principais pragas em plantios de canola, causando
danos desde a fase vegetativa até o final do florescimento, destruindo, muitas vezes, a
haste floral. No Brasil foi constatada também sua ocorrência em canola a partir do início de
agosto até o final de setembro (DOMICIANO & SANTOS, 1996).
O método de controle mais utilizado nos campos produtores de crucíferas ainda é o
químico, por ser considerado prático, rápido e eficiente na redução populacional dessa praga
(DIAS et al., 2004).
Apesar da eficiência do método de controle químico, a utilização inadequada dessa
tática vem ocasionando o aparecimento de populações da traça-das-crucíferas resistentes
aos inseticidas (THULER, 2006). Para minimizar esse problema, uma das alternativas
empregadas é o controle biológico por meio da aplicação de inseticidas à base da bactéria
entomopatogênica Bacillus thuringiensis (Bt).
Os resultados de controle obtidos inicialmente com Bt tornaram freqüente sua utilização;
no entanto, a maioria dos produtos formulados com essa bactéria, encontrados no mercado,
são formulados com B. thuringiensis var. kurstaki que expressa as toxinas Cry1Aa, Cry1Ab
ou Cry1Ac. Isto significa que as ligações das toxinas com o epitélio, no intestino do inseto,
ocorrem através dos mesmos receptores de membrana, facilitando o aparecimento de
populações resistentes, o que já vem sendo relatado (TANG et al., 1996). P. xylostella foi o
primeiro inseto para o qual observaram-se populações de campo com altos níveis de
resistência em respostas a tratamentos comerciais com B. thuringiensis (HERRERO et al.,
2001). A resistência à bactéria pode estar relacionada a diversos fatores, como por exemplo,
ao modo de ação das toxinas, sendo que algumas hipóteses podem ser consideradas, como
a mudança na conformação dos receptores, pH intestinal menos alcalino impedindo a
solubilização do cristal, proteases intestinais incapazes de digerir ou ativar as ä-endotoxinas
ou então muito eficazes, que poderiam digerir totalmente a protoxina, e também a
hipersensibilidade dos indivíduos-alvo (MONNERAT & BRAVO, 2000).
Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar as características biológicas da
traça-das-crucíferas em diferentes gerações sob pressão de seleção a B. thuringiensis.
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido no Laboratório de Biologia e Criação de Insetos (LBCI),
da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da FCAV-Unesp, em sala climatizada a
25±1ºC, umidade relativa de 70±10% e fotofase de 12 horas.
Hortic. bras., v. 28, n. 2 (Suplemento - CD Rom), julho 2010
S 553
Diferentes gerações da traça-das-crucíferas sob pressão de seleção a Bacillus thuringiensis.
A metodologia padrão para criação de Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae)
utilizada no LBCI foi alterada quanto à qualidade da couve, uma vez que as folhas previamente
6
pulverizadas com concentração de 6,0x10 esporos/mL da linhagem padrão HD-1 de Bacillus
thuringiensi var. kurstaki para posteriormente serem fornecidas à alimentação das lagartas.
Os bioensaios foram realizados com oitava, décima e vigésima geração, sendo que até a
sétima geração a mortalidade da criação apresentava-se alta (média de 90%), caracterizando
à suscetibilidade. Em cada bioensaio nas gerações avaliadas foi testada a linhagem padrão
HD-1 sob diferentes concentrações. As concentrações utilizadas nos bioensaios destas
gerações foram baseados em observações pessoais realizadas diariamente na condução
da metodologia de criação sob presssão de seleção, principalmente quanto ao comportamento
e período de duração larval.
Para o preparo da suspensão esporo/cristal da linhagem padrão foram cultivados em
placas de Petri com meio de cultura Agar Nutriente “NA” (extrato de carne 3g/L, peptona
bacteriológica 5g/L e Ágar 15g/L) e incubados a 30°C, durante 5 dias. Após este período,
todo conteúdo bacteriano foi transferido, com auxílio de alça de platina, para tubo Falcon
®
contendo 10 ml de água Milli-Q autoclavada e 0,05% de Tweem 20 (espalhante adesivo). A
suspensão obtida foi homogeneizada em aparelho do tipo Vórtex e a partir desta foram
-1
-2
feitas duas suspensões seriadas, sendo a primeira 10 e a segunda 10 . A suspensão seriada
-2
10 foi utilizada para contagem de esporos em câmara de NeuBauer para posterior
padronização das concentrações dos bioensaios. Para cada tratamento utilizou-se 5 discos
de couve com diâmetro de 8 cm, que foram pulverizados com volume de 0,5 ml da suspensão
por face do disco, e uma pulverização contendo água com Tween como testemunha. A
pulverização foi realizada com auxílio de uma pistola para pintura, tipo aerógrafo, acoplada
2
a um compressor da marca Schulz Modelo MS 2.3 com pressão operacional de 25lbf/pol ,
sob capela de exaustão. Após a secagem sobre bancada, por 30 minutos a 25ºC, os discos
foram colocados individualmente em placas de Petri sobre papel filtro levemente umedecido
com água. Sobre cada disco foliar colocou-se 12 lagartas de P. xylostella de terceiro ínstar
para alimentação. A primeira avaliação de mortalidade larval foi com 24 horas, devido ao
modo de ação da bactéria, e as demais diariamente. Os bioensaios com as diferentes
concentrações iniciaram-se a partir da oitava geração, a qual apresentava maior porcentagem
de sobrevivência.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A porcentagem de mortalidade na oitava geração para as maiores concentrações foi
de 100%, com diferença significativa das demais, inclusive da testemunha. É importante
ressaltar que a testemunha foi composta por lagartas da criação que estava sob pressão de
seleção, e não lagartas sadias da criação estoque do LBCI. Nas demais gerações avaliadas
é possível observar que a mortalidade foi reduzida em relação à oitava geração, principalmente
8
para a concentração de 3x10 esporos/ml, fato este que pode ser explicado pela condição
biológica do inseto que está sob uma determinada seleção genética por vários ciclos de vida
(Tabela1 e Figura 1).
O ciclo biológico foi muito variável na oitava geração (Tabela 2), para todas as
características biológicas avaliadas. À exemplo da duração larval, onde o período de
desenvolvimento da lagarta na testemunha e na maior concentração testada foi semelhante
Hortic. bras., v. 28, n. 2 (Suplemento - CD Rom), julho 2010
S 554
Diferentes gerações da traça-das-crucíferas sob pressão de seleção a Bacillus thuringiensis.
6
estatisticamente. Contudo, esta observação foi contrária nas demais concentrações (6x10 e
7
2,7x10 esporos/ml) (Tabela 2). Já a viabilidade pupal da testemunha foi igual ao da
7
concentração 2,7x10 esporos/ml, proporcionando maior número de pupas viáveis. Entretanto,
o mesmo não ocorreu na maior concentração, em que condicionou à uma menor duração
larval. Provavelmente neste tratamento as lagartas não se alimentaram o necessário para
acumular reservas nutritivas para a fase de pupa. Este comportamento na fase larval influenciou
negativamente nas características biológicas, como peso de pupas e razão sexual (Tabela 2).
As variações observadas nesta geração são explicadas pela pressão de seleção em
que os insetos estão sendo submetidos, demonstrando uma provável alteração fisiológica
no organismo (LEE et al., 1995). Esta mudança também pode ser observada nas demais
gerações avaliadas neste trabalho, como pode ser visto pelos baixos valores de mortalidade
a
a
nas maiores concentrações. Na 15 e 20 geração foi determinado apenas a mortalidade,
em virtude do excesso de indivíduos sobreviventes, com os mesmos apresentando
comportamento semelhante à testemunha, principalmente nas menores concentrações
(Figura 1). Na Tabela 2 verifica-se também que em algumas concentrações não foi realizado
bioensaio, justamente devido ao comportamento dos insetos, porque em concentração muito
baixa não se observava efeito negativo, sendo que os mesmos apresentavam aspecto visual
e comportamental semelhante ao da criação sob pressão de seleção. A vigésima geração
após sucessivas aplicações de B. thuringiensis apresentou indícios de resistência, devido à
redução na mortalidade. Dessa forma, é possível concluir à ocorrência de uma variação
genética no inseto, em que sob freqüente pressão de seleção expõe a biologia do indivíduo
a constantes mudanças, o que pode caracterizar uma resistência à bactéria.
REFERÊNCIAS
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químico da traça-das-crucíferas, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) em repolho.
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DIAS, DGS.; SOARES, CMS; MONNERAT, R. 2004. Avaliação de larvicidas de origem
microbiana no controle da traça-das-crucíferas em couve-flor. Horticultura Brasileira v. 22,
(3): 553-556.
DICKSON, MH; SHELTON, AM; EIGENBRODE, SD; VAMOSY, ML; MORA, M. 1990. Selection
for resistance to diamondback moth (Plutella xylostella) in cabbage. Hortscience 25: (12):
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DOMICIANO, NL; SANTOS, B. 1996. Pragas da canola: bases preliminares para manejo no
Paraná. Boletim Técnico IAPAR, (35): 1-16.
HERRERO, S; FERRÉ, J; ESCRICHE, B.2001. Mannose phosphate isomerase izoenzymes
in Plutella xylostella support common genetic bases of resistance to Bacillus thuringiensis
toxins in Lepidoptera species. Applied and Environmental Microbiology 67, (2): 979-981.
LEE, MK.; RAJAMOHAN, F; GOULD, F; DEAN, DH. 1995. Resistance to Bacillus thuringiensis
Cry1A ä-endotoxin in a laboratory-selected Heliothis virescens strain is related to receptor
alteration. Applied Environmental. Microbiology 61: 3836-3842.
Hortic. bras., v. 28, n. 2 (Suplemento - CD Rom), julho 2010
S 555
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LOGES, V. 1996. Danos causados pela traça das crucíferas Plutella xylostella (Linnaeus,
1758) em cultivares de repolho Brassica oleracea var. capitata (L.) e efeito sobre populações
da praga e do parasitóide Oomyzus sokolowskii (Kurdjumov, 1912), em condições de campo.
1996. 98p. Dissertação (Mestrado em Fitossanidade) - Universidade Federal Rural de
Pernambuco, Recife.
MONNERAT RS; BRAVO A. 2000. Proteínas bioinseticidas produzidas pela bactéria Bacillus
thuringiensis: modo de ação e resistência. In: MELO IS; AZEVEDO JL. (Eds.). Controle
Biológico. Jaguariúna: Embrapa Meio Ambiente, 163 p.
MUSSURY, RM; FERNANDES, WD; SCALON, SPQ. 2002. População de Diabrotica speciosa
(Germar, 1824) e Plutella xylostella Linnaeus, 1758, associada a Brassica napus L. em função
de dois métodos de captura. Ciência e Agrotecnologia 26, (5): 993-998.
TANG, JD; SHELTON, AM; VAN RIE, J; DE ROECK, S; MOAR, WJ; ROUSH, RT; PEFEROEN,
M.1996. Toxicity of Bacillus thuringiensis spore and crystal protein to resistant diamondback
moth (Plutella xylostella). Applied and Enviromental Microbiology 62: 564-569.
THULER, RT. Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae): táticas para o manejo integrado
em brássicas. 2006. 83f. Tese (Doutorado em Agronomia – Entomologia Agrícola) - Faculdade
de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista , Jaboticabal.
Tabela 1. Médias de mortalidade (%) de lagartas de Plutella xylostella (Lepidoptera:
a
a
a
Plutellidae) na 8 , 15 e 20 geração sob pressão de seleção do Bacillus thuringiensis
Berliner, sendo que nestas gerações as lagartas foram expostas ao alimento tratado e não
tratado com diferentes concentrações desta bactéria. (Mean mortality (%) of larvae of Plutella
xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) in the 8, 15 e 20 generations under selection pressure
Bacillus thuringiensis Berliner, and in these generations the larvae were exposed to food
treated and untreated with different concentrations of bacteria). FCAV-Unesp, Jaboticabal,
2010.
Tratamento
HD-1
1
CV (%)
Concentração esporo/mL
6
6x10
7
2,7x10
8
3x10
8
6,7x10
7
6x10
2
0,00
36,31
a
a
a
8 geração
15 geração
20 geração
48,00±2,06b
48,00 ±2,86b
100,00±3,50a
100,00±0,00a
16,67 ± 2,74c
32,00
14,20±2,59b
64,20±3,05a
0,00±0,00b
30,00
60,00±1,59a
37,60±1,89b
0,00±0,00b
Hortic. bras., v. 28, n. 2 (Suplemento - CD Rom), julho 2010
S 556
Diferentes gerações da traça-das-crucíferas sob pressão de seleção a Bacillus thuringiensis.
Tabela 2. Características biológicas da oitava geração de Plutella xylostella (Lepidoptera:
Plutellidae) sob pressão de seleção de Bacillus thuringiensis Berliner submetida a diferentes
concentrações desta bactéria. (Biological characteristics of Plutella xylostella (Lepidoptera:
Plutellidae) different generation under selection pressure to Bacillus thuringiensis Berliner
subjected to different concentrations of this bacteria). FCAV-Unesp, Jaboticabal, 2010.
HD-1
Concentração
esporo/mL
Duração
larval (dias)
Viabilidad
e pupal (%)
Duração
pupal (dias)
Peso de
pupas (mg)
Razão
sexual
3X10
6
6X10
7
2,7X10
2
0,00
7,80±0,57b
9,24±0,03a
8,85±0,01a
7,58±0,04b
37,50±6,18c
76,76±2,77b
85,00±2,20a
81,78±1,77a
4,00±0,00b
3,56±0,05a
4,54±0,06b
3,60±0,07a
4,38±0,08a
5,09±0,06b
4,10±0,04a
4,75±0,04b
0,25±b
0,40±ab
0,29±b
0,49±a
-
38,45
34,00
39,96
33,56
38,00
8
CV (%)
Legenda: 1= Linhagem padrão de B. thuringiensis var. kurstaki, 2= Testemunha.
Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si, pelo teste de Tukey, a 0,5 % de probabilidade (Means followed by the same letter in the column do not differ significantly, according to Tukey’s test
p<0.05).
Figura 1. Mortalidade (%) de lagartas de Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) sob pressão de seleção
da linhagem padrão HD-1 de Bacillus thuringiensis var. kurstaki Berliner por diferentes gerações. Nestas
gerações as lagartas foram alimentadas com folhas de couve var. Manteiga tratadas com esta bactéria por
6
7
8
7
diferentes concentrações: CL1= 6x10 ; CL2=2,7x10 ; CL3=3x10 ; CL4=6x10 esporos/ml. [Larvae mortality
(%) of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) under selection pressure of standard strain HD-1 Bacillus
thuringiensis var. kurstaki Berliner by different generations. In these generations the larvae were fed on
kale leaves var. Manteiga treated with different bacteria concentrations]. FCAV-Unesp, Jaboticabal, 2010.
Hortic. bras., v. 28, n. 2 (Suplemento - CD Rom), julho 2010
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