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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Programa de Pós-Graduação em Ciência e
Tecnologia de Alimentos
TESE
Óleos essenciais e oleoresina da pimenta rosa (Schinus
terebinthifolius Raddi): propriedades químicas e
biológicas.
MASSAKO TAKAHASHI DOURADO
PELOTAS/RS
2012
2
MASSAKO TAKAHASHI DOURADO
Óleos essenciais e oleoresina da pimenta rosa (Schinus terebinthifolius
Raddi): propriedades químicas e biológicas.
Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciência e Tecnologia de
Alimentos da Faculdade de Agronomia
“Eliseu
Maciel”
da
Universidade
Federal de Pelotas, como requisito
parcial à obtenção do título de doutor
em Ciência e Tecnologia de Alimentos.
Orientação: Prof. Dr. Wladimir Padilha da Silva
Co-orientação: Profa. Dra Ângela Maria Fiorentini
Pelotas /RS
2012
3
Dados de catalogação na fonte:
Ubirajara Buddin Cruz – CRB-10/901
Biblioteca de Ciência & Tecnologia - UFPel
D739o
Dourado, Massako Takahashi
Óleos essenciais e oleoresina da pimenta rosa
(Schinus terebinthifolius Raddi) : propriedades químicas
e biológicas / Massako Takahashi Dourado. – 120f. : il.
color. – Tese (Doutorado). Programa de Pós-Graduação
em Ciência e Tecnologia Agroindustrial. Universidade
Federal de Pelotas. Faculdade de Agronomia Eliseu
Maciel. Pelotas, 2012. – Orientador Wladimir Padilha da
Silva ; co-orientador Ângela Maria Fiorentini.
1.Schinus terebinthifolius Raddi. 2.Pimenta rosa.
3.Aroeira. 4.Antioxidante. 5.Atividade antimicrobiana.
6.Óleos essenciais. 7.Cromatografia gasosa.
8.Propriedades químicas e biológicas.
CDD:
663.84
4
Massako Takahashi Dourado
Óleos essenciais e oleoresina da pimenta rosa (Schinus terebinthifolius
Raddi): propriedades químicas e biológicas.
Comissão de orientação:
Prof. Dr. Wladimir P. da Silva (orientador)- DTCA - UFPel/RS
Profa. Dra. Ângela Maria Fiorentini (co-orientador) - DTCA-UFPel/RS
Banca examinadora:
________________________________________________________________
Andrea da Silva Ramos Rocha CF-UCPel
________________________________________________________________
Eliezer Avila Gandra CCQFA-UFPel
________________________________________________________________
Luciano do Amarante CCQFA-UFPel
Pelotas, dezembro de 2012
Pelotas /RS
5
Ao meu esposo Augusto.
Aos meus filhos Daniel, André e Adriana.
Aos meus pais Katsuko e Fusao,
dedico.
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AGRADECIMENTOS
A Deus por me dar vida e me proporcionar saúde para iniciar e terminar
mais esta etapa da vida.
A minha família - Augusto, Daniel, André e Adriana, que sempre me
apóiam em tudo e tem sido um forte pilar na minha vida.
Ao prof. Dr. Wladimir Padilha da Silva pela orientação, profissionalismo,
suporte técnico, ensinamentos e amizade.
A profa Dra Ângela Maria Fiorentini pela co-orientação, por instruir e
repartir os conhecimentos técnicos e amizade.
Ao Programa de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos
(PPGCTA) da Universidade Federal de Pelotas.
A Universidade Federal de Pelotas, e ao CCQFA (Centro de Ciências
Químicas Farmacêuticas e de Alimentos)
Aos colegas da Universidade de Caxias do Sul professores Dr. Sidnei
Moura e Silva e Msc. Fabiane Agostini.
A todos os colegas do Laboratório de Microbiologia de Alimentos do CTA,
em especial às amigas: Tatiane, Milena e Liziane.
À amiga Lidine Pires Gouvêa, pela amizade, ajuda nesta jornada árdua,
pela cumplicidade, carinho e afeto.
Aos prof. Dr. Cesar V. Rombaldi (UFPel) e profa Dra Andrea da Silva
Ramos Rocha (UCPel), pelas criticas construtivas e importantes sugestões
auferidas à finalização do trabalho.
Ao prof. Dr. Pedro Luiz Antunes com saudades e carinho.
A todos meus parentes mesmo longe sempre presentes na minha vida.
Ao Prof. Dr. Claudio Martin Pereira de Pereira, pelo auxilio nas análises
cromatográficas e na doação de alguns reagentes químicos.
Ao Prof. Dr. Neftali Lenin Villarreal Carreño pela doação do Clevenger
para extração de óleos essenciais.
À amiga e orientada, Janaína Garcia Timm pelo auxílio nas análises
laboratoriais, amizade e companheirismo.
A todos que de alguma maneira, contribuíram direta ou indire tamente na
realização deste trabalho.
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“Deus nos fez perfeitos e não escolhe os capacitados, capacita os
escolhidos. Fazer ou não fazer algo, só depende de nossa vontade e
perseverança”
(Albert Einstein)
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RESUMO
DOURADO, M.T Óleos essenciais e oleoresina da pimenta rosa (Schinus
terebinthifolius Raddi): propriedades químicas e biológicas. 2012. 120f.
Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Agronomia “Eliseu Maciel”,
Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
A pimenta rosa (Schinus terebinthifolius Raddi), popularmente conhecida como
pimenta rosa, aroeira, aroeira mansa ou aroeira-vermelha, pertencente à família
Anacardiaceae, é muito utilizada na medicina popular, no tratamento de
diversas enfermidades. No Brasil, tem sido pouco explorada, mas em outros
países, como a França, é um condimento muito popular. Os óleos essenciais
são produtos do metabolismo secundário de plantas, cada vez mais utilizados
para diferentes finalidades, como na produção de medicamentos, na
cosmetologia, na perfumaria e na área de alimentos. Em alimentos são muito
utilizados no controle microbiológico, pois aumentam a sua vida útil, além de
poder conferir sabor, odor e apresentar potencial antioxidante, devido a sua
fração fenólica. Os óleos essenciais podem ser extraídos do caule, frutos,
folhas, sementes e casca e, dependendo da porção de onde são retirados, sua
composição difere entre si, não só em quantidade como em qualidade. Neste
estudo, objetivou-se padronizar as condições de extração e caracterizar fisicoquimicamente os frutos de pimenta rosa em diferentes estágios de maturação,
analisar o óleo essencial e a oleoresina, que é uma mistura de compostos
(óleos voláteis, resinas, ácidos graxos não voláteis, pigmentos e outras
substâncias) através da cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de
massa (CG/MS). O óleo essencial foi extraído por hidrodestilação utilizando
Clevenger e foi avaliado por cromatografia gasosa, onde foram identificados 25
compostos no óleo essencial de frutos maduros de pimenta rosa sendo o
componente majoritário o mirceno e no óleo essencial de frutos verdes foram
identificados 19 compostos sendo o componente majoritário o α-pineno. A
oleoresina foi extraida por dois métodos (Soxhlet e a frio) utilizando sete
diferentes solventes, o que interferiu no rendimento final. A oleoresina foi
extraída em condições similares e foi avaliada por cromatografia gasosa, onde
o solvente metanol foi o mais eficaz. O óleo essencial foi utilizado no estudo do
potencial antimicrobiano avaliado pela determinação da Concentração Inibitória
Mínima (CIM) e da Concentração Bactericida Mínima (CBM), além da
capacidade antioxidante do extrato. Os resultados indicaram que o óleo
essencial de pimenta rosa apresenta atividade antimicrobiana tanto em
bactérias Gram-positivas como nas Gram-negativas, sendo todas as bactérias
estudadas patogênicas em alimentos, e não apresentaram diferença para CIM
nem para MBC tanto para E. coli como para L. monocytogenes. A atividade
antioxidante foi avaliada através do método da capacidade de captura in vitro
do radical livre DPPH, verificou-se que o menor valor de EC50 (0,0170g) foi para
o extrato aquoso de frutos maduros de pimenta rosa. O valor de EC50 significa
quantidade de antioxidante necessário para reduzir a 50% a concentração
inicial de DPPH.
Palavras-chave: Schinus terebinthifolius Raddi; aroeira; pimenta rosa; óleos
essenciais, oleoresina, atividade antimicrobiana, antioxidante e DPPH.
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ABSTRACT
DOURADO, M.T Óleos essenciais e oleoresina da pimenta rosa (Schinus
terebinthifolius Raddi): propriedades químicas e biológicas. 2012. 120f.
Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Agronomia “Eliseu Maciel”,
Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
The pink pepper (Schinus terebinthifolius Raddi), known popularly as pink
pepper, aroeira, soft aroeira or red aroeira, belongs the Anacardiaceae family, is
widely used in folk medicine to treat some diseases. In Brazil, has been
underexplored, but in other countries, like France, is a popular condiment.
Essential oils are products of secondary metabolism of plants, increasingly used
for different purposes, such as in the production of medicinal products in
cosmetology, in the perfumery industry and in the food field. In foods are very
used in microbiological control by increasing its useful life, also addition to flavor,
odor and to produce antioxidant potential, duo to its phenolic fraction. Essential
oils can be extracted from stems, fruits, leaves, seeds, bark and depending on
the portion where is removed, its composition differs together, in quantity and
quality. This study aimed to standardize the extraction conditions and physicochemical characterization of pink pepper fruits at different stages of maturity,
analyze the essential oil and oleoresin, that is a mix of compounds (volatile oils,
resins, not volatile fatty acids, pigments and other substances) through gaseous
chromatography associated to mass spectrometry (GC / MS). The essential oil
was removed by hydrodistillation using Clevenger and was evaluated by
gaseous chromatography, which were identified 25 compounds in the essential
oil of mature fruits of pepper rose, being the myrcene the majority component
and in the essential oil of unripe fruits were identified 19 compound, being the αpinene the majority component. The oleoresin was extracted by two methods
(Soxhlet and cold) using seven different solvents, which affect the final
production. The oleoresin was extracted under similar conditions and were
evaluated by gaseous chromatography, which the methanol solvent was more
effective. The essential oil was used in the study of antimicrobial potential
assessed by determining the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and
Minimum Bactericidal Concentration (MBC), also in the antioxidant capacity of
the extract. The results indicated that the essential oil in the pink pepper
presented antimicrobial activity in both Gram-positive and Gram-negative
bacterias, and all bacterias studied are pathogenic in food, and showed no
difference in MIC or MBC for both E. coli and L. monocytogenes. Antioxidant
activity was evaluated by the method of harvesting capacity in vitro free radical
DPPH, it was found that the lowest EC50 value (0.0170 g) was for the aqueous
extract of ripe fruits of pink pepper. The mean EC 50 amount of antioxidant
required to reduce 50% the initial concentration of DPPH.
Key words: Schinus terebinthifolius Raddi, aroeira, pink pepper, essential oil,
oleoresin, antimicrobial, antioxidant and DPPH.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Destilador por arraste de vapor d'água; método industrial. ............... 31
Figura 2 - Aparelho de Clevenger para extração de óleos essenciais ............. 32
Figura 3 - Extrator Soxhlet ........................................................................... 33
Figura 4 - Flores brancas de pimenta rosa .................................................... 36
Figura 5 - Morfologia das flores de Shinus terebinthifolius Raddi masculina e
feminina. a) secção longitudinal parcial da flor masculina (estames completos e
gineceu reduzido); b) secção longitudinal parcial da flor feminina (gineceu
completo e estames reduzidos) .................................................................... 37
Figura 6 - Inflorescências de Schinus terebinthifolius Raddi a) Inflorescência
com flores masculinas, b) Inflorescência com flores femininas. Barras de escala
a= 0,5cm, b=1 cm ....................................................................................... 37
Figura 7 - Schinus terebinthifolius Raddi (frutos maduros de pimenta rosa).....38
Figura 8 - Schinus terebinthifolius Raddi (frutos verdes de pimenta rosa)........38
Figura 9 - Frutos maduros de pimenta rosa selecionados .............................. 40
Figura 10 - Atividade antioxidante DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazila), na forma
oxidada e reduzida ...................................................................................... 48
Figura 11 - Escherichia coli; a) Coloração de Gram e b) Imagem de microscopia
eletrônica.................................................................................................... 53
Figura 12 - Staphylococcus aureus; a) Coloração Gram e b) Imagem de
microscopia eletrônica ................................................................................. 54
Figura 13 - Listeria monocytogenes; a) Coloração Gram, b) Imagem de
microscopia eletrônica ................................................................................. 57
Figura 14 - Salmonella Typhimurium a) Coloração Gram e b) Imagem de
microscopia eletrônica ................................................................................. 58
Figura 15 - Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas do
óleo essencial de frutos verdes de pimenta rosa extraído por Clevenger. ....... 81
Figura 16 - Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas do
óleo essencial de frutos maduros de pimenta rosa extraído por Clevenger...... 85
Figura 17 - Estrutura química dos componentes majoritários presentes no óleo
essencial de frutos verdes e maduros de pimenta rosa .................................. 88
11
Figura 18 - Cromatograma de ésteres de ácidos graxos de frutos maduros de
pimenta rosa, equipado com coluna de polietileno, 30m de comprimento, 0,32
de diâmetro e espessura 0,25μm, e como gás de arraste o He, levando em
consideração a concentração de ácido graxo (100%) .................................... 95
Figura 19 - Cromatograma de ésteres de ácidos graxos de frutos maduros de
pimenta rosa, 30 m de comprimento, diâmetro de 0,32mm e espessura de
0,25μm, gás de arraste o He, levando em consideração a concentração de
ácido graxo em relação à amostra (22,909%) ............................................... 95
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Características fisico-químicas de frutos verdes e maduros de
pimenta rosa ............................................................................................... 73
Tabela 2: Efeito do tipo de maceração no rendimento (g%) de óleo essencial de
frutos de pimenta rosa, obtido por hidrodestilação. ........................................ 75
Tabela 3: Rendimento de óleos essenciais de frutos maduros de pimenta rosa
(Schinus terebinthifolius Raddi) em função do tempo de extração empregado na
hidrodestilação............................................................................................ 77
Tabela 4: Índice de refração (23°C) e densidade (25°C) de óleos essenciais
obtidos de pimenta rosa madura e verde ...................................................... 78
Tabela 5: Composição química do óleo essencial de frutos verdes de pimenta
rosa obtido por Clevenger modificado, determinada por cromatografia gasosa
acoplada ao espectrômetro de massa. ......................................................... 80
Tabela 6: Composição química do óleo essencial de frutos maduros de pimenta
rosa obtidos por hidrodestilação, determinada por cromatografia gasosa
acoplada ao espectrômetro de massa. ......................................................... 84
Tabela 7: Teor de oleoresina (g%) extraída pelo método de Bligh-Dyer, sem e
com a utilização de ultrassom ...................................................................... 90
Tabela 8: Resultados da extração de oleoresina de frutos maduros de pimenta
rosa, a frio e com o uso de calor (Soxhlet) .................................................... 91
Tabela 9: Composição em ácidos graxos (%) da oleoresina do fruto maduro de
pimenta rosa, obtida por extrato hexanóico em Soxhlet ................................. 94
Tabela 10: Valores de EC50 para o extrato aquoso, etanólico e cetônico de
frutos maduros de pimenta rosa. .................................................................. 97
Tabela 11: Valores de EC50 para o óleo essencial de pimenta rosa verde e
madura. ...................................................................................................... 97
Tabela 12: Atividade antimicrobiana do óleo essencial de frutos maduros de
pimenta rosa obtido por hidrodestilação, avaliada pelo método da difusão em
ágar ......................................................................................................... 100
Tabela 13: Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida
Mínima (CBM) do óleo essencial de pimenta rosa extraído de frutos maduros,
com Clevenger por hidrodestilação............................................................. 102
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LISTA DE SIGLAS, SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
% - Porcentagem
a.C - Antes de Cristo
ABTS - 2,2‟-azinobis 3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico
ANOVA - análise de variância
AOAC - Association of Analytical Communities
BHA - Butylated hydroxyanisole
BHT - Butylated hydroxytoluene
CG/MS - Cromatografia gasosa acoplada ao espectro de massa, do inglês Gas
Chromatography Mass Spectrometry
CO2 - Dióxido de carbono
DCTA - Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial
DNA - Ácido desoxirribonucléico
FDA - Food and Drug Administration
g - Gramas
H2 O2 - Peróxido de Hidrogênio
Hz - Hertz
IAL - Instituto Adolfo Lutz
IUPAC - International Union of Pure and Applied Chemistry
mg/L - Miligrama por litro
mM - Milimolar
NADH – dinucleotídio de adenina nicotinamida reduzido
nm - Nanômetro (1 x 10-9 metros)
o
C - Graus Celsius
OMS - Organização Mundial da Saúde
p/p - Peso sobre peso
pH - Potencial de Hidrogênio
SUS - Sistema Único da Saúde
UFPel - Universidade Federal de Pelotas
μL - Microlitros
μm - Micrometro (1,0 x 10-6 metros)
FID - Flame Ionization Detector
CIM – Concentração Inibitória Mínima
CBM – Concentração Bactericida Mínima
DPPH – 2,2-difenil-1-picrilhidrazila
ATTC - American Type Culture Collection
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO......................................................................................... 17
2 OBJETIVOS ............................................................................................ 21
2.1 Objetivos gerais ...................................................................................21
2.2 Objetivos específicos ...........................................................................21
3 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................... 23
3.1 Extratos vegetais .................................................................................23
3.2 Óleos essenciais .................................................................................24
3.3 Oleoresinas .........................................................................................27
3.3.1 Ácidos graxos presentes na oleoresina........................................... 28
3.4 Métodos de extração de óleos essenciais..............................................29
3.4.1 Destilação por arraste de vapor ...................................................... 30
3.4.2 Extração com Clevenger (Hidrodestilação) ..................................... 31
3.4.3 Extração por Soxhlet ..................................................................... 32
3.4.4 Enfleurage .................................................................................... 33
3.4.5 Maceração.................................................................................... 33
3.4.6 Prensagens a frio .......................................................................... 34
3.4.7 Extração com solventes orgânicos ................................................. 34
3.4.8 Extração com dióxido de carbono supercrítico ................................ 34
3.5 Características da pimenta rosa (Schinus terebinthifolius Raddi).............35
3.6 Medicamentos fitoterápicos a base de pimenta rosa no Sistema Único de
Saúde (SUS) ...............................................................................................42
3.7 Antioxidantes.......................................................................................42
3.7.1 Atividade antioxidante - capacidade de sequestrar radicais livres ..... 43
3.8 Atividade antimicrobiana ......................................................................48
3.8.1 Óleos essenciais no controle de micro-organismos ......................... 50
3.9 Avaliação da atividade antimicrobiana de óleos essenciais.....................51
3.9.1 Método de difusão em ágar............................................................ 51
3.9.2 Micro-organismos.......................................................................... 51
3.9.2.1 Escherichia coli .......................................................................... 52
3.9.2.2 Staphylococcus aureus ............................................................... 53
3.9.2.3 Listeria monocytogenes .............................................................. 55
15
3.9.2.4 Salmonella Thyphimurium........................................................... 57
4 MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................ 60
4.1 Material botânico .................................................................................60
4.2 Excicata ..............................................................................................60
4.3 Caracterização dos frutos de pimenta rosa ............................................61
4.3.1 Determinação da umidade de frutos maduros e verdes de pimenta
rosa............................................................................................................ 61
4.3.2 Determinação de Cinzas de frutos maduros e verdes de pimenta rosa
.................................................................................................................. 61
4.3.3 Determinação eletrométrica do pH de frutos maduros e verdes de
pimenta rosa ............................................................................................... 62
4.4 Avaliação da trituração da amostra .......................................................62
4.5 Extração do óleo essencial por hidrodestilação ......................................63
4.6 Índice de refração do óleo essencial .....................................................63
4.7 Densidade do óleo essencial ................................................................64
4.8 Avaliações da composição do óleo essencial por cromatografia gasosa
acoplada a espectrometria de massa (CG/MS) ..............................................64
4.9 Extração de oleoresina.........................................................................64
4.9.1 Método de Bligh-Dyer sem ultrassom ............................................. 64
4.9.2 Método de Bligh-Dyer com ultrassom ............................................. 65
4.9.3 Método de Soxhlet ........................................................................ 65
4.9.4 Extração de oleoresina de pimenta rosa a frio ................................. 66
4.9.5 Derivatização da oleoresina ........................................................... 66
4.9.6 Cromatografia da oleoresina derivatizada de frutos maduros de
pimenta rosa ............................................................................................... 67
4.10 Determinação da curva do DPPH....................................................... 67
4.11 Atividades antioxidante...................................................................... 68
4.12 Avaliações microbiológicas ................................................................ 69
4.12.1 Micro-organismos utilizados ......................................................... 69
4.12.2 Preparação do inóculo ................................................................. 70
4.12.3 Avaliação qualitativa da atividade antimicrobiana pela técnica de
Difusão em Ágar ......................................................................................... 70
4.13 Determinação da Concentração Inibitória Minima (CIM)
e da
Concentração Bactericida Minima (CBM) ...................................................... 71
16
5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ...........................................................................72
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................73
7 CONCLUSÕES ...................................................................................... 104
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS ........................................................ 106
17
1 INTRODUÇÃO
A busca por produtos seguros é uma preocupação constante dos
consumidores em geral e, nesse sentido, as indústrias têm direcionado
esforços buscando técnicas/métodos/processos alternativos para produzir
alimentos seguros, bem como para aumentar a vida útil dos produtos. A
atividade microbiana é uma das principais causas de deterioração de
alimentos sendo frequentemente a responsável pela diminuição de sua
qualidade, segurança e vida útil (SANCHES, 2004).
Entre as inúmeras espécies de plantas utilizadas pela população
no controle microbiano, poucas têm ação comprovada cientificamente,
contudo, o uso popular tradicionalmente consolidado tem sido utilizado
como guia para pesquisas farmacológicas (ELISABETSKY, 1987; BABU
et al.,1997). Estuda-se cada vez mais a utilização de metabólitos de
vegetais, tanto na conservação de alimentos, evitando assim, sua
deterioração, quanto na garantia de sua seguridade.
Os consumidores buscam alimentos com menor quantidade de
aditivos sintéticos (BRULL e COOTE, 1999). Há um crescente interesse
no uso de produtos naturais em substituição aos aditivos sintéticos ou
semi-sintéticos e hoje, no mundo globalizado, a cultura de consumo de
produtos orgânicos, sem a adição de substâncias químicas, tem
aumentado a cada dia (MENDONÇA, 2004). O uso abusivo, por longos
períodos, de compostos antimicrobianos químicos é um dos principais
fatores de pressão seletiva para o surgimento da resistência a esses
compostos,
exigindo
cada
vez
mais
pesquisas
na
busca
da
potencialidade antimicrobiana de compostos de origem vegetal.
Para reduzir os prejuízos econômicos e à saúde pública que
podem advir das contaminações alimentares, tem sido recomendo o
18
emprego de bactericidas naturais por estes não deixarem resíduos
tóxicos nas matérias-primas que serão posteriormente utilizadas (BRULL
e COOTE, 1999). Produtos naturais, de origem vegetal, podem tornar o
alimento mais atrativo ao consumidor e, espera-se, que com isto tragam
menos toxicidade, mesmo quando utilizados em concentrações mais
elevadas (PEREIRA et al., 2006). Há um crescente interesse em
encontrar agentes antimicrobianos naturais para uso alimentício e
farmacêutico, com o objetivo de promover ação sinérgica ou em
substituição aos conservantes químicos, os quais têm sido restringidos
devido ao seu potencial carcinogênico (RAUHA et al., 2000). Dessa
forma, são necessários maiores investimentos e estudos para substituir
os aditivos sintéticos por conservantes naturais presentes nos vegetais e
que, ao mesmo tempo em que possam realçar o aroma e sabor, atuem no
controle microbiano.
A própria legislação de alimentos tem restringido o uso de certos
antimicrobianos sintéticos, com base na sua possível toxicidade. Neste
contexto, a fitoquímica apresenta-se como uma alternativa útil, em
substituição
aos
conservantes
químicos
sintéticos.
Substâncias
produzidas naturalmente por bactérias, como a nisina, também têm sido
empregadas em alimentos, principalmente naqueles produtos com
grandes possibilidades de multiplicação de micro-organismos, como é o
caso de alimentos com elevada atividade de água.
Com a tendência atual do mercado em utilizar produtos naturais, os
agentes antimicrobianos extraídos de plantas, como os óleos essenciais,
têm a cada dia mais ganho destaque (PEREIRA et al., 2006).
A Organização Mundial da Saúde (OMS, 2000) destaca que 80%
da população mundial utilizam as plantas medicinais para a atenção
primária de saúde. Em pesquisa realizada em 1995, em Feira de
Santana, Bahia, a pimenta rosa, conhecida naquela região como aroeira,
foi a décima erva medicinal mais usada na medicina popular, num total de
138 ervas citadas (NGOKWEY, 1995). Este mesmo autor cita que a
pimenta rosa é utilizada na medicina popular para o tratamento de
doenças venéreas, reumatismo, diarréias, gengivite, febre e dores em
geral.
19
A atividade antimicrobiana da pimenta rosa, provavelmente, se
deve a presença de substâncias fenólicas. Essa atividade já foi
comprovada contra bactérias Gram-positivas (Staphylococcus aureus e
Bacillus subtilis) e bactérias Gram-negativas (Escherichia coli e
Pseudomonas aeruginosa), bem como na levedura Candida albicans
(MARTINEZ et al., 1996 a; MARTINEZ,GONZALEZ e BADELL, 1996 b,
GUERRA et al., 2000; MOURE et al., 2001).
No Brasil, o uso de frutos da pimenta rosa ainda é pouco explorado.
Entretanto, têm sido utilizados como condimentos, principalmente em
culinária, para temperar carnes de peixes, salames e massas, como
também em bebidas doces como coquetéis e chocolates (BERTOLDI,
2006). A pimenta rosa é explorada comercialmente para exportação,
apresentando valor comercial maior que a pimenta do reino. Segundo o
jornal ESTADO DE MINAS – caderno Agropecuário de 16/02/2009, o
quilo de pimenta rosa foi comprado por R $3,00 dos fornecedores e
chegou ao mercado internacional por US$ 8,00 a US$10,00, enquanto o
quilo de pimenta do reino já seca custou R$ 3,50. Os frutos secos de
pimenta rosa são exportados, principalmente na forma desidratada, sendo
comercializados a granel. O óleo essencial de pimenta rosa, no Brasil,
também é destinado à exportação. A produção brasileira de óleos
essenciais em geral é equivalente a 13,1% da produção mundial, sendo
responsável por 45 milhões de dólares (Ferri, 1995 apud SILVA et al.,
2005). Um dos grandes entraves para o crescimento da cadeia produtiva
de óleos essenciais é a utilização de produtos similares sintéticos,
entretanto, como descritos anteriormente, em especial a indústria
alimentícia, está substituindo os produtos sintéticos pelos naturais, em
função das exigências atuais dos mercados (Ferri, 1995 apud SILVA et al.
2005).
Como a pimenta rosa possui importância comercial por se tratar de
uma planta com propriedades medicinais, fitoquímicas e alimentícias é
preciso investir, conhecer, caracterizar além de aplicar maiores recursos a
fim de esclarecer muitos detalhes ainda desconhecidos a respeito desta
planta, e assim com o presente estudo preencher uma grande lacuna
existente sobre esta planta nativa do Brasil, mas pouco explorada tanto
20
científicamente
como
comercialmente.
A
investigação
realizada é uma parte do que ainda está para ser feito, uma vez que é
grande o número de plantas ainda não estudas, tanto no seu uso direto
como da obtenção de novos componentes bioativos com aplicação na
área de alimentos ou de novas moléculas que poderão num futuro
próximo servir para semi síntese de compostos farmacologicamente
ativos.
A pimenta rosa apresenta alto valor agregado no mercado
internacional, além de apresentar características que têm potencial para
serem exploradas pela indústria de alimentos. Existe carência de
informações científicas sobre essa planta nativa, quanto ao rendimento
tanto de óleo essencial como de oleoresina, melhor tipo de solvente e do
método de extração, bem como sobre a caracterização fisico-química e
biológica desses óleos. E como o Brasil possui uma das maiores
diversidades vegetais do mundo e inúmeras experiências vinculadas ao
conhecimento popular das plantas medicinais, é preciso correlacionar o
conhecimento popular com a comprovação científica.
21
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivos gerais
Caracterizar físico-quimicamente os frutos de pimenta rosa (Shinus
terebinthifolius Raddi), padronizar as condições de extração do óleo
essencial e da oleoresina, bem como determinar a composição química, a
atividade antimicrobiana e antioxidante do óleo essencial e da oleoresina.
2.2 Objetivos específicos
a) Determinar o tempo de extração e calcular o rendimento de óleo
essencial de frutos de pimenta rosa obtido por hidrodestilação;
b) Determinar a ação do ultrassom no rendimento de lipídios
(oleoresina), extraídos pelo método de Bligh-Dyer;
c) Determinar o rendimento de oleoresina, através da extração com
diferentes solventes;
d) Avaliar o rendimento de oleoresina através da extração a quente
e a frio;
e) Caracterizar as substâncias voláteis presentes no óleo essencial
através da cromatografia gasosa (CG/MS);
f) Determinar os ácidos graxos presentes na oleoresina através da
cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa.
g) Determinar a atividade antioxidante do óleo essencial extraído
por hidrodestilação com Clevenger.
h) Avaliar a atividade antimicrobiana in vitro do óleo essencial pelo
método de difusão em ágar;
22
i)
Determinar
a
Concentração
Inibitória
Mínima
(CIM)
e
Concentração Bactericida Mínima (CBM), do óleo essencial para microorganismos
Gram-positivos
(Staphylococcus
aureus
e
Listeria
monocytogenes) e Gram-negativos (Escherichia coli e Salmonella
Thyphimurium).
23
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Extratos vegetais
O homem tem procurado conhecer
os
vegetais e
suas
propriedades medicinais desde a antiguidade, tendo observado que todas
as partes da planta podem apresentar substâncias ativas importantes,
destacando-se os óleos essenciais. Dessa forma, tem-se observado um
aumento na utilização de vegetais, com as mais variadas finalidades:
fitoterápicos,
no controle de micro-organismos patogênicos e/ou
deteriorantes em alimentos, ou como prebióticos. Os conservantes
sintéticos atuam no controle microbiano, mas ao mesmo tempo podem
causar efeitos adversos à saúde, como o câncer, e/ou ter efeito
teratogênico, por isto tem sido repudiado pelos consumidores. A busca
por novos produtos que atuem no controle microbiano e que ajam
também na conservação de alimentos, se faz necessária e, nesta busca,
estão sendo estudados e testados produtos naturais, dentre os quais,
destacam-se os óleos essenciais.
Segundo VON POSER e MENTZ (2003) as plantas sintetizam
compostos químicos essenciais ao seu desenvolvimento a partir dos
nutrientes, minerais, CO2, água e luz. Os produtos químicos produzidos
pelos vegetais podem ser divididos em dois grupos: os metabólitos
primários (lipídios, protídios e glicídios), essenciais a todos os seres vivos,
e os chamados metabólitos secundários, compostos de estruturas
complexas, de baixo peso molecular, encontrados em pequenas
concentrações e em grupos distintos de plantas.
A atividade antimicrobiana de plantas medicinais tem sido
pesquisada em diversas espécies, tanto no Brasil quanto em outros
24
países (LOGUERCIO et al., 2005). Muitas espécies vegetais têm sido
usadas pelas suas características antimicrobianas, conferidas por
compostos sintetizados pelo
seu
metabolismo secundário.
Estes
compostos são reconhecidos por suas substâncias ativas, como é o caso
dos compostos fenólicos, que fazem parte dos óleos essenciais, e dos
taninos (SANTOS et al., 2007).
A atividade microbiana é a principal causa de deterioração de
muitos alimentos e é responsável pela diminuição de sua qualidade e de
sua vida útil. Além disso, a contaminação microbiana nos alimentos
representa um importante problema de saúde pública, pois a presença de
micro-organismos patogênicos e suas toxinas causam danos à saúde dos
consumidores. Dessa forma, há um grande interesse em utilizar produtos
naturais em substituição aos aditivos químicos sintéticos, pois muitos
deles apresentam elevada toxicidade.
Segundo Pereira et al. (2006), a utilização de substâncias naturais
de origem vegetal, como conservantes em alimentos, os torna mais
atrativos aos consumidores por não apresentarem efeitos tóxicos, mesmo
quando utilizadas em concentrações relativamente elevadas. Os mesmos
autores citam o uso de diferentes condimentos no controle de microorganismos deteriorantes e patogênicos veiculados por alimentos. De
acordo com Chao e Young (2000), estudos têm comprovado o efeito de
compostos extraídos de óleos essenciais de plantas que atuam como
fungicidas naturais inibindo a atividade fúngica e, um número significativo
destes constituintes tem se mostrado bastante eficaz.
3.2 Óleos essenciais
Óleos essenciais são produtos do metabolismo secundário do s
vegetais, que estão sendo, a cada dia, mais utilizados com diferentes
finalidades. Na área de alimentos, têm sido utilizados no controle
microbiológico, para o aumento da vida útil e para o controle de
patógenos, bem como conferindo sabor, odor, etc.
São compostos voláteis, oleosos, com odor intenso e, geralmente,
agradável, formados por diversas substâncias, podendo apresentar
25
propriedades antissépticas, bactericidas, diuréticas, antiespamódicas,
anti-inflamatórias, expectorantes, antivirais, cicatrizantes, vermífugas,
analgésicas, sedativas, etc (BAKKALI et al., 2008; NASCIMENTO et al.,
2007). Os óleos essenciais são uma mistura de diversos compostos,
todos voláteis, com tensão de vapor pouco elevada, odoríficos, insolúveis
em água (CARSON e FRILEY, 1995; NELSON, 2000). Tisserand e
Balacs (1999) descrevem que são substâncias orgânicas voláteis
responsáveis pela fragrância de muitas plantas e que podem ser
extraídas de diversas partes como folhas, flores, frutos, sementes, raízes,
rizomas e caules das plantas.
Craveiro et al. (1981) relatam que, por muito tempo, os óleos
essenciais foram considerados substâncias de desintoxicação dos
vegetais. Hoje se sabe que estas substâncias voláteis têm importância
nos mecanismos de defesa das plantas contra seus predadores, como
fungos, bactérias, vírus, parasitas, insetos, moluscos e animais superiores
(CALIXTO, 2001).
Os óleos essenciais apresentam natureza volátil e composição
lipofílica. Além de sua utilização industrial na produção de perfumes e
cosméticos, os óleos essenciais também têm sido aplicados com outras
finalidades, como o uso farmacológico e no combate a fungos e bactérias
(CARDOSO et al., 2000).
Deve-se destacar que a composição dos óleos essenciais é
determinada por fatores genéticos, porém, os fatores ambientais podem
causar variações significativas em seus constituintes. A época de
colheita, posição geográfica, horário, o modo de secagem do material
vegetal, bem como teor de umidade, água, solo e herbivoria também
podem influir sobre a composição e o teor do óleo produzido (SILVA et
al., 2003 a; SANTOS et al., 2004; FERRONATTO et al., 2007; GOBBONETO e LOPES, 2007).
Bedin, Gutkoski e Wiest (1999) conceituam especiarias como
vegetais que possuem substâncias aromáticas ou picantes de origem
tropical, utilizadas para realçar sabores e odores nos alimentos, incluindo
caule, flores, germinações, bulbos, rizomas, e outras partes das plantas.
Sagdiç (2003) cita que as substâncias que conferem sabores existentes
26
nas especiarias são geralmente compostos como álcoois, ésteres,
aldeídos, terpenos, fenóis, ácidos orgânicos e muitos outros elementos,
que não foram ainda totalmente identificados, nem quanto a sua função,
nem quanto a sua composição. Nos frutos da pimenta rosa, utilizados
como condimentos, estão presentes os flavonóides, taninos e óleos
essenciais, que são metabólitos secundários com grande aplicação na
indústria de medicamentos, cosméticos, perfumaria e indústria de
alimentos (como flavorizantes, antioxidantes e corantes de alimentos e
bebidas)
(LAWRENCE,
1984;
QUEIRES
e
RODRIGUES,
1998,
ALLARDICE, BONE e HUTCHISON, 1999; TOSS et al., 2006).
Especiarias têm sido por muito tempo, utilizadas como provedores de
caracteres sensoriais aos alimentos. Porém, nos últimos anos, tem
surgido interesse voltado para o seu uso como promissores compostos
antimicrobianos em conservação de alimentos (EL-SHAMI et al., 1985;
AKGUL e KIVANÇ , 1988; COSETINO et al., 1999; DOMANS e DEANS,
2000, RISTORI, PEREIRA e GELLI, 2002).
Tanto as indústrias de alimentos, quanto os órgãos reguladores,
têm voltado suas atenções para a busca de alternativas aos conservantes
sintéticos, porém, sem descuidar da produção de alimentos seguros
(BRULL e COOTE, 1999). Segundo Chao e Young (2000), muitas
pesquisas vêm sendo realizadas na busca de compostos alternativos
para um uso racional e seguro de conservantes naturais para serem
utilizados em alimentos. Dentre estes compostos temos os óleos
essenciais que são líquidos oleosos menos densos que a água, com
aroma e sabor muito acentuados solúveis em solventes orgânicos e
facilmente oxidáveis sob a ação da luz (BORNHAUSEN, 1991).
Há relatos na literatura científica abordando o estudo do potencial
antimicrobiano de especiarias, como o orégano (Origanum vulgare (L.),
no controle de bactérias e fungos em alimentos (ALIGIANS et al., 2001).
Estudos têm mostrado que espécies de Origanum possuem propriedades
antimicrobianas e antioxidantes, e que as suas propriedades biológicas
apresentam variações de acordo com a técnica de cultivo, origem, estágio
vegetativo e a estação do ano na qual foi coletado o material (LEUNG e
FOSTER, 1996; MILOS, MASTELIC E JERCOVIK, 2000). Sahin et al.,
27
(2003) avaliaram a atividade antimicrobiana do extrato metanólico do óleo
essencial de orégano frente a uma série de bactérias de interesse em
alimentos e observaram que este é efetivo na inibição de Acinetobacter
baumanii,
Bacillus
macerans,
Bacillus subtillis,
B.
megantertium,
Clavibacter michiganense, Enterococcus faecalis, Escherichia coli,
Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes .
Outros autores concluíram que o óleo essencial de orégano possui
compostos com atividade antimicrobiana (ZARGARI, 1990; LEUNG e
FOSTER, 1996).
3.3 Oleoresinas
As oleoresinas são uma mistura de óleos voláteis, materiais
resinosos e ácidos graxos não voláteis, pigmentos e outras substâncias
extraídas por solventes adequados. São extraídas com solventes
orgânicos, entretanto, na indústria, o etanol é o solvente mais utilizado
(CHASSAGNEZ, CORRÊA e MEIRELES, 1997). Segundo Azevedo et al.,
(2010), estudando oleoresina de copaíba, a produção dessa substância
varia muito entre amostras (árvores), entretanto, destacam que não se
conhecem os fatores
ambientais,
que
época do
determinam essa variação. As condições
ano
e as caracteristicas genéticas
são,
provavelmente, as principais.
Diferentemente dos óleos essenciais, que podem ser extraídos por
hidrodestilação, a oleoresina necessita de solventes orgânicos de
diferentes polaridades para remover substâncias lipídicas contidas nos
frutos de pimenta rosa.
Simões et al., (1999) destacam que as extrações de óleos voláteis
podem ser realizadas com o uso de solventes orgânicos apolares como o
éter etílico, éter de petóleo ou diclorometano, mas que apresentam o
inconveniente de extrair outras substâncias lipofílicas, além dos óleos
voláteis, o que torna o produto com pouco valor comercial, devido aos
seus contaminantes.
28
3.3.1 Ácidos graxos presentes na oleoresina
Lipídio é uma terminologia utilizada para gorduras e substâncias
gordurosas. São substâncias insolúveis em água e solúveis em solventes
orgânicos, como éter etílico, éter de petróleo, acetona, clorofórmio,
benzeno e álcoois. Os solventes apolares extraem a fração lipídica
neutra, que inclui ácidos graxos livres, mono, di e triacilgliceróis, e alguns
mais polares como fosfolipídios, glicolipídios e esfingolipídios. Outros
lipídios são extraídos apenas parcialmente, como é o caso das ceras,
pigmentos e as vitaminas lipossolúveis. As oleoresinas são substâncias
hidrofóbicas, portanto, o método de extração e o tipo de solvente são
geralmente tão críticos quanto o tempo e a temperatura de extração,
devido à dificuldade de solubilização e degradação de compostos por
oxidação (BERTOLDI, 2006).
Os lipidios presentes nos vegetais são uma forma de armazenar
energia, é uma rota metabólica anabólica, portanto, consome energia.
Nas células fotossintéticas dos vegetais, a síntese de ácidos graxos
ocorre no estroma dos cloroplastos e requer NADPH, provindo da
fotossíntese. A acetil-CoA sintetase nos cloroplastos possui alta afinidade
pelo acetato e consome ATP, originando o acetil-CoA que sofre
carboxilação formando o malonil-CoA, uma reação irreversível, onde
inicia
a
síntese
de
ácidos
graxos,
envolvendo
um
complexo
multienzimático acetil-CoA carboxilas e que necessita da biotina como
grupo prostético (BELTRÃO e OLIVEIRA, 2007).
Os lipídios mais neutros estão ligados covalentemente e podem ser
extraídos dos tecidos utilizando solventes apolares, enquanto lipídios
mais polares, que estão ligados por forças eletrostáticas e pontes de
hidrogênio, necessitam de solventes polares capazes de romper estas
ligações e liberá-los. Maior eficiência na extração lipídica se deve as
características dos solventes e aos efeitos da cavitação e agitação
promovidas pelas ondas sonoras no solvente (ZHANG et al., 2008), que
rompem as estruturas que dão resistência as paredes dos tecidos
vegetais. Desde que foi evidenciada a presença de óleos nos espaços
intracelulares nas células vegetais, os pesquisadores têm estudado os
29
métodos para provocar maiores danos às estruturas celulares, de forma a
extrair maior quantidade de óleo possível. A utilização de enzimas
envolve um custo muito elevado, enquanto que com o ultrassom o
processo é mais simples, e tem mostrado bons resultados, o que é
comprovado pela microscopia eletrônica sobre a matriz após a extração
(FREITAS et al., 2007; ZHANG et al., 2008).
O método clássico de extração, proposto por Soxhlet (BRUM,
ARRUDA E REGITANO-D´ARCE, 2009), foi o primeiro a ser usado na
extração de lipídios em matrizes graxas, estando baseado no refluxo de
solventes apolares. É bastante usado em nível laboratorial por ser um
método fácil, rápido e eficiente na extração de lipídios além de possibilitar
a extração de maiores volumes de óleo em uma única extração (BRUM
et al., 2009)
Já o método de Bligh-Dyer (SGANZERLA, 2010) utiliza uma
mistura de três solventes (clorofórmio-metanol-água), tendo a capacidade
de extrair tanto lipídios neutros quanto os lipídios mais polares. É muito
utilizado, apesar de apresentar algumas desvantagens, como a toxidez
dos solventes usados e a extração dos contaminantes não-lipidicos da
fase orgânica. Entretanto, entre suas vantagens, destaca-se a formação
de um sistema bifásico a partir das proporções de solventes adicionados
durante a extração, baseado na teoria do equilíbrio líquido-líquido de três
componentes (clorofórmio-metanol-água).
3.4 Métodos de extração de óleos essenciais
Os óleos essenciais são misturas de compostos químicos,
podendo ser extraídos por diferentes processos, os quais dependem da
natureza do óleo a ser extraído (GRAMOLELI JÚNIOR et al., 2006).
Os principais métodos de extração utilizados industrialmente são:
destilação por arraste de vapor, enfleurage, maceração, prensagem,
extração por solventes e extração com dióxido de carbono supercrítico. A
seguir, serão descritos, brevemente, os principais métodos de extração,
detalhando um pouco mais o método de hidrodestilação com Clevenger e
30
destilação com Soxhlet, utilizado neste estudo para a extração de óleo
essencial e da oleoresina, respectivamente.
3.4.1 Destilação por arraste de vapor
É um método utilizado para extração de quase todos os tipos de
óleos essenciais, fornecendo um bom rendimento com boa qualidade. A
extração pode ser feita com “vapor úmido” e “vapor seco” encontrando-se
o material a tratar, imerso ou não em água (GRAMOLELI JÚNIOR et al.,
2006). Segundo Ullmann‟s (2002) a destilação por arraste de vapor não é
recomendada para alguns tipos de flores, pois alguns produtos dela
resultante decompõem-se pelo calor. Alguns compostos presentes nos
óleos essenciais são substâncias de alto ponto de ebulição e podem ser
isolados através da destilação por arraste de vapor (GUIMARÃES,
OLIVEIRA e ABREU, 2000). Segundo Lima e Oliveira (2003) o uso da
destilação por arraste de vapor é recomendado quando se deseja separar
uma substância cujo ponto de ebulição é alto e/ou apresenta risco de se
decompor,
ou ainda é utilizado
na purificação de substâncias
contaminadas com impurezas resinosas apolares.
É uma destilação de misturas imiscíveis de compostos orgânicos e
água (vapor), pois misturas imiscíveis não se comportam como soluções.
A Figura 1 mostra o destilador por arraste de vapor d‟água, método
industrial, onde a matéria-prima é acondicionada e o vapor passa
carreando o óleo essencial contido na amostra. Os óleos essenciais
assim obtidos seguem diferentes destinos no ramo industrial.
31
Figura 1- Destilador por arraste de vapor d'água; método industrial
Fonte: http://www.laszlo.ind.br/default.asp?pagina=extracao
3.4.2 Extração com Clevenger (Hidrodestilação)
O extrator Clevenger foi projetado para funcionar em circuito
fechado, tendo como base um design da farmacopéia européia, que
opera por hidrodestilação, através do método de coobação (recirculação
de águas condensadas). Por funcionar em circuito fechado, apresenta
perda mínima de substâncias voláteis (SANTOS et al. 2004, a).
É um método de extração de óleos essenciais em pequena escala,
(em escala laboratorial), através da técnica de arraste de vapor (Fig. 2).
A hidrodestilação utiliza a água como solvente, a qual é capaz de extrair
os óleos essenciais e não deixar resíduos tóxicos após a extração.
Posteriormente, necessita somente da remoção de água excedente, sem
purificação, apresentando um bom rendimento e uma alta eficiência. O
extrator é projetado para destilação de óleos essenciais mais leves que a
água, o que limita o seu uso para extrair óleos mais densos que a água.
32
Figura 2 - Aparelho de Clevenger para extração de óleos essenciais
Fonte: http://www.ebah.com.br/content/ABAAABQxIAD/caracterizacaoquimica-oleo-essencial-casca-citrus-sinensis-obtido-porhidrodestilacao-aparelho-clevenger
No aparelho Clevenger, quando a mistura água/biomassa entra em
ebulição, os vapores de água e as substâncias voláteis carreadas são
conduzidos até o condensador, onde há uma troca de calor, condensando
os vapores com a água de refrigeração. Nessa etapa, podem ser
visualizados através do Clevenger, o óleo essencial e a água, sendo esta
água retornada ao balão através do tubo de retorno e o ciclo se repete
continuamente até que atinja o tempo de 240 minutos, onde o aparelho é
desligado e o óleo removido (SANTOS et al., 2004).
3.4.3 Extração por Soxhlet
Neste tipo de extração, a amostra é pesada em balança analítica e
transferida para um cartucho, que é tampado com algodão estéril. A
extração por Soxhlet é utilizada para as oleoresinas, pois utiliza solventes
como hexano, álcool etílico, clorofórmio, etc (BRUM, ARRUDA e
REGITANO-D´ARCE, 2009).
33
O conjunto extrator Soxhlet (Figura 3) permite que uma quantidade
de solvente puro passe repetidas vezes sobre a substância a ser extraída
(realização de ciclos). O balão que contém o solvente é acoplado a uma
manta de aquecimento e ligado.
Figura 3 - Extrator Soxhlet
Fonte : http://en.wikipedia.org/wiki/File:Soxhlet_Extractor.jpg
3.4.4 Enfleurage
Esta técnica é utilizada para extração de óleos essenciais de
pétalas de flores como jasmim, que perdem seus perfumes após a
colheita. Baseia-se na aplicação de gorduras, por possuírem a
capacidade de absorção em contato com as flores, absorvendo o perfume
exalado (MARQUES, 1973).
3.4.5 Maceração
O processo de maceração é muito semelhante à enfleurage, com o
diferencial que na maceração utiliza-se gordura quente. Atualmente, o
processo está em desuso, porém, já foi considerado como o melhor
processo de extração de óleos essenciais (MARQUES, 1973).
34
3.4.6 Prensagens a frio
É um processo físico, onde a planta é prensada, obtendo-se,
assim, o óleo essencial. É muito utilizado para retirada de óleos de
plantas cítricas como limão, laranja e bergamota (GRAMOLELI JÚNIOR
et al., 2006). Os pericarpos desses frutos são prensados, e a camada que
contém o óleo essencial é separada. Posteriormente, o óleo é separado
por decantação, centrifugação, ou destilação fracionada (LIMA, OLIVEIRA
e LIMA, 2006).
3.4.7 Extração com solventes orgânicos
Neste processo, o material a ser extraído é colocado dentro dos
extratores em temperatura adequada, com um solvente apropriado
(usualmente éter de petróleo). O solvente penetra nas flores ou outro
material e dissolve o perfume natural e também os corantes. Esta técnica
é muito vantajosa em relação à extração por destilação, pois reproduz
melhor o perfume natural presente nas flores, entretanto, dependendo do
óleo essencial a ser extraído, o processo pode ser inviável devido ao alto
custo da aparelhagem (GRAMOLELI JÚNIOR et al., 2006). Além disso, o
rendimento em óleos essenciais não é muito elevado. Segundo Lima,
Oliveira e Lima (2006), este método normalmente é usado para extração
de oleoresina e resinas presentes em plantas aromáticas.
3.4.8 Extração com dióxido de carbono supercrítico
Neste processo as partes das plantas a serem utilizadas são
colocadas em tanques, injetando dióxido de carbono supercrítico (em
estado entre o líquido e o gasoso). Quando a pressão diminui, o dióxido
de carbono retorna ao seu estado natural não deixando resíduo no
produto, e a oleoresina é removida do material vegetal.
35
3.5
Características
da
pimenta
rosa
(Schinus
terebinthifolius Raddi).
Nome científico: Schinus terebinthifolius Raddi
Sinonímia:
Schinus
mucronulata,
Schinus
weinmanniifolius,
Schinus riedeliana, Schinus selloana, Schinus damaziana, Schinus
raddiana.
Família: Anacardiaceae
Divisão: Angiosperma
Origem: Brasil, Paraguai e Argentina.
Nomes populares:
aroeira-de-capoeira,
aroeira,
aroeira-da-praia,
aroeira-do-campo,
aroeira-do-mato,
aroeira-de-goiás,
aroeira-do-
amazonas, aroeira-do-rio-grande, aroeira-rasteira, aroeira-mansa, aroeirabrava, aroeira-preta, aroeira-branca, aroeira-vermelha, pimenta brasileira
ou pimenta-rosa (CLEMENTE, 2006).
Nome em outros idiomas:
Espanhol: Lentisco; Frances: Lentisque, poivre d‟Amerique, poivre
Du Perou; Ingles: Califórnia peper tree, Alemão: pimenteira bastarda;
Pfefferstrauch.
O termo aroeira vem da abreviatura de araroeira, que significa
arara mais o sufixo – eira, árvore da arara, por ser a planta onde os
indígenas observaram que as araras pousavam e viviam (SÁ, 1999;
SOUSA, 2004).
A pimenta rosa é uma árvore de pequeno a médio porte, que
possui propriedades adstringentes, antissépticas e anti-inflamatórias
(BIAVATTI et al., 2007; AGRA, FRANÇA e BARBOSA-FILHO, 2007
AGRA et al., 2008). Segundo Lorenzi (2000), esta planta é comumente
encontrada em beiras de rios, córregos e em várias várzeas úmidas de
formação secundária, entretanto, desenvolve-se também em terrenos
pobres e secos. É muito utilizada na arborização de cidades, como árvore
ornamental, apresentando caule um pouco tortuoso e casca escura e
fissurada. As folhas são imparipinadas, com 8 a 12 cm de comprimento e
7 a 13 folíolos verdes, elípticos a abovados, com nervuras claras. A
36
pimenta rosa é dióica, havendo árvores fêmeas e árvores machos
possuindo flores pequenas e brancas dispostas em inflorescências
axilares e terminais do tipo racemo (Fig. 4). Os frutos são pequenos em
drupas,
esféricos,
vermelhos a
rosados,
muito
utilizados como
condimentos (BERTOLDI, 2006). O florescimento ocorre na primavera e
no outono, sendo que o pólen pode provocar reações alérgicas e
irritações em pessoas sensíveis.
Figura 4 - Flores brancas de pimenta rosa
Segundo Lenzi e Orth (2004), a pimenta rosa apresenta flores
masculinas e femininas (Fig.5), sendo ambas actinomorfas, pentâmeras,
diclinas, apresentando cinco sépalas verdes e cinco pétalas brancas.
Foram detectadas diferenças no comprimento e na largura das
inflorescências masculinas e femininas, mas o número de inflorescências
por ramo não diferiu entre as plantas.
37
Figura 5 - Morfologia das flores de Shinus terebinthifolius Raddi
masculina e feminina. a) secção longitudinal parcial da flor masculina
(estames completos e gineceu reduzido); b) secção longitudinal parcial da
flor feminina (gineceu completo e estames reduzidos)
Fonte: Lenzi e Orth (2004).
Lenzi e Orth (2004) verificaram que plantas masculinas produziam
um maior número de flores do que plantas femininas, sendo a proporção
de flores entre plantas femininas e masculinas de 1:4. O número médio
de flores por inflorescência foi de 1392±507,71 (n=8) nas plantas
masculinas e 346,25±53,91 (n=8), nas femininas (Figura 6).
Figura 6 - Inflorescências de Schinus terebinthifolius
Raddi a)
Inflorescência com flores masculinas, b) Inflorescência com flores
femininas. Barras de escala a= 0,5cm, b=1 cm
Fonte: Lenzi e Orth (2004)
38
É uma planta de domínio público, popularmente utilizada no
tratamento caseiro de inflamações (LISBOA NETO et al., 1998). Seus
princípios ativos ainda não são totalmente conhecidos, portanto, há
necessidade de maiores investimentos em conhecer seus constituintes
químicos,
estruturais
e
propriedades
farmacológicas
(JORGE
e
MARKMANN, 1996).
Segundo Ewe e Sternberg (2003) a pimenta rosa nativa foi
introduzida nos Estados Unidos com fins ornamentais e econômicos. Por
ser uma espécie que apresenta alta capacidade de produção de
compostos alelopáticos, bem como rápido desenvolvimento e reprodução,
verificou-se que esta se mostrou uma espécie invasora e perigosa para a
biodiversidade, já que interfere na flora e na fauna local.
O fruto da pimenta rosa (Figuras 7,8 e 9), é pouco explorado no
Brasil, mas na França é bastante popular, sendo utilizado tanto na
ornamentação como tempero de diferentes pratos culinários. Apresenta
sabor levemente picante e adocicado, podendo ser empregados na forma
de grãos inteiros ou moídos. É especialmente usado na confecção de
molhos que acompanham as carnes brancas, de aves e peixes. No Peru,
é usado em xaropes, vinagres e em bebidas alcoólicas, devido ao seu
sabor picante; no Chile são acrescentados nos vinhos (COUTO, 2010).
Sua madeira é utilizada para moirões, cercas, lenha e carvão, sendo a
casca utilizada na indústria para extrair taninos para uso no curtimento do
couro (ALLARDICE, BONE e HUTCHISON, 1999). Além disso, possui
importância
comercial
devido
às
suas
propriedades
fitoquímicas e alimentícias (GUERRA et al., 2000).
medicinais,
39
Figura 7 - Schinus terebinthifolius Raddi (frutos maduros de pimenta
rosa)
Figura 8 - Schinus terebinthifolius Raddi (frutos verdes de pimenta rosa)
40
Figura 4 - Frutos maduros de pimenta rosa selecionados
A pimenta rosa foi analisada quanto à composição química de seus
frutos e folhas,
detectando-se
compostos como
hidrocarbonetos
terpênicos, cetonas e ácidos (KAISTHA e KIER, 1962 a, b). As folhas
possuem propriedades balsâmicas e antirreumáticas, sendo usadas na
cura de feridas e úlceras. Já os ramos novos, além de serem usados com
a mesma finalidade, possuem a propriedade de branquear e limpar os
dentes (BERTOLDI, 2006).
Os frutos apresentam propriedades diuréticas (CORRÊA, 1984;
BALBACH, 1986). Entretanto, a maior aplicação é na culinária, sob a
forma desidratada, sendo usados como condimentos para temperar
carnes brancas, salame, chocolates e massas (BERTOLDI, 2006). Como
medicamento, são utilizados no tratamento de inflamações uterinas, como
cicatrizantes em feridas, e apresentam ação como adstringentes e
antimicrobianos (GUERRA et al., 2000). Atualmente, os frutos maduros
vêm se destacando cada vez mais pelo seu consumo como condimento
alimentar, tanto no mercado interno como no internacional (BERTOLDI,
2006).
As folhas, cascas, frutos, sementes e resina (ou bálsamo), têm sido
utilizados como medicamento pelos povos indígenas em todas as regiões
tropicais (PANETTA e MCKEE, 1997). Entretanto, segundo Lorenzi e
41
Matos (2002), são as cascas, as folhas e os frutos que apresentam
propriedades medicinais, sendo a escolha do material a ser utilizado, e as
formas corretas de seu preparo e administração, de fundamental
importância para sua utilização, seja para uso interno (oral) ou para uso
externo (pomadas para pele, ou para as mucosas das cavidades
naturais). Os preparados de pimenta rosa devem ser utilizados com muita
cautela, pois podem causar reações alérgicas na pele e nas mucosas em
indivíduos alérgicos (LORENZI e MATOS, 2002). Foi identificada, em
todas as partes da planta, a presença de pequenas quantidades de alquilfenóis,
que
em
(REICHERT e
pessoas
FRERICHS,
sensíveis,
1945;
causam
dermatite
GRUENWALD,
alérgica
BRENDLER e
JAENICKKE, 2000). Compostos presentes nas espécies da família das
Anacardinaceae são comumentes causadores de dermatites de contato.
Alguns indivíduos, quando entram em contato com a planta, podem
desenvolver irritações na pele, prurido, urticárias, febre e transtornos
visuais (BERTOLDI, 2006). Apesar disto, o extrato hidro alcoólico da
pimenta rosa não apresentou efeito tóxico ou genotóxico (RUIZ et al.,
1996).
De acordo com Carvalho et al. (2003), o extrato de pimenta rosa
mostrou-se potencialmente mutagênico em bactérias e apresentou
propriedades antioxidantes, devido à presença de flavonóides. A análise
fitoquímica revelou a presença de taninos, alcalóides, flavonóides,
saponinas, esteróides, esteróis, terpenos e de óleos essenciais, os quais
estão presentes nas folhas, cascas e frutos. Nos frutos, se concentra a
maior quantidade de óleos essenciais, em torno de 5% e, nas folhas,
aproximadamente 1%.
A Farmacopéia Brasileira (1988) indica o uso da casca da pimenta
rosa, entretanto, estudos revelam que outras partes da planta também
podem ser utilizadas como fonte de substâncias biologicamente ativas.
Estudos fitoquímicos nessa planta detectaram a presença de compostos
fenólicos simples, flavonóides, taninos, óleos essenciais, esteróides,
triterpenos, antraquinonas e saponinas (LAWRENCE, 1984; JORGE e
MAKMANN, 1996; QUEIRES e RODRIGUES, 1998; LIMA, OLIVEIRA e
LIMA, 2006).
42
Os flavonóides, taninos e óleos essenciais têm sido utilizados nas
indústrias de medicamentos, cosméticos e perfumaria, bem como na
indústria de alimentos (como flavorizantes, antioxidantes e corantes de
bebidas e alimentos) podendo ser utilizados, também, na indústria de
curtimento de couro (LAWRENCE, 1984; QUEIRES e RODRIGUES,
1998; ALLARDICE et al. , 1999; TOSS et al., 2006).
3.6 Medicamentos fitoterápicos a base de pimenta rosa no
Sistema Único de Saúde (SUS)
A partir de 2009, o SUS do Brasil, financia o fornecimento de
fitoterápicos produzidos à base de cascas de pimenta rosa. A Portaria no
2.982, de 26 de novembro de 2009 GM/MS, do Ministério da Saúde,
publicada no Diário Oficial da União, amplia a oferta de fitoterápicos no
Componente Básico de Assistência Farmacêutica, oferecendo diversos
fitoterápicos, utilizando como matéria-prima a pimenta rosa, espinheirasanta, guaco, alcachofra, cascara sagrada, garra do diabo, isoflavona de
soja e unha de gato, disponibilizando aos usuários do SUS mais opç ões
terapêuticas. Isso é importante, porque a Organização Mundial da Saúde
(OMS-2000) recomenda que os países usem os recursos naturais
disponíveis no próprio território para promover a saúde primária.
De acordo com Almeida e Leite
(2010),
antes
de sua
recomendação e de seu uso houve um grande número de estudos
científicos e evidências que comprovavam a sua segurança e eficácia em
humanos.
3.7 Antioxidantes
Alimentos que contém óleos ou gorduras estão sujeitos durante o
processamento ou estocagem, às reações químicas que podem resultar
em alterações indesejáveis modificando as características finais do
produto. Reações de hidrólise e oxidações podem ser responsáveis por
esse processo, principalmente as últimas. Para impedir que esses tipos
43
de reações ocorram são utilizados os chamados antioxidantes, sobretudo
em alimentos que contenham quantidades significativas de óleos a fim de
prevenir e retardar sua oxidação (BECKER, NISSEN e SKIBSTED, 2004).
São também utilizados antioxidantes sintéticos como o butil-hidroxianisol
(BHA) e butil-hidroxitolueno (BHT), muito usados, mas tóxicos em altas
dosagens (WENG e WANG, 2000. Os antioxidantes quando presentes
em pequenas concentrações retardam a oxidação de óleos e gorduras
nos alimentos, que pode causar odor e off-flavours. Portanto, os
antioxidantes preservam a cor, sabor, evitam a perda de nutrientes,
mantem a qualidade nutricional, sensorial e conferem segurança
alimentar (BERTOLDI. 2006).
3.7.1 Atividade antioxidante - capacidade de sequestrar radicais
livres
Os radicais livres são substâncias que possuem elétrons não
pareados, que podem provocar danos a qualquer molécula do organismo.
São responsáveis pelo envelhecimento, e por doenças degenerativas
como câncer, doenças cardíacas, doenças oculares como catarata,
disfunções cerebrais e comprometimento do sistema imune (MELO et al,
2011). Os antioxidantes são substâncias que controlam a produção de
radicais livres nos seres vivos, os quais podem ser de origem endógena
ou exógena (provenientes da alimentação, ou de outra fonte). Como
exemplos, podemos citar os tocoferóis, vitamina C, polifenóis, selênio e
carotenóides (ATOUI et al., 2005 ; SOUZA et al., 2007).
Espécies Reativas de Oxigênio (ROS, sigla do inglês reactive
oxygen species) referem-se aos radicais livres contendo oxigênio, como o
ânion superóxido (O2•-ˑ), o radical hidroxila (HO•), o radical peroxila (ROO•)
e espécies não radicalares como o peróxido de hidrogênio (H 2 O2) e o
oxigênio singlete ( 1 O2). Estes radicais são produzidos como subprodutos
de reações biológicas ou por fatores exógenos e, quando produzidos em
grandes escala, podem causar desordens celulares ao reagir com lipídios,
proteínas, carboidratos e ácidos nucléicos (CEZAROTTO, 2009). A
redução de ROS é realizada basicamente por dois mecanismos, sendo
44
um enzimático, onde as enzimas do sistema antioxidante são capazes de
reciclar as moléculas oxidadas e prevenir danos às membranas e ao
DNA, como a superóxido dismutase, catalase, ascorbato e glutationa
redutase, dentre outras. O outro processo é químico, onde se utilizam
moléculas com capacidade redutora, como os compostos fenólicos,
ascorbato, carotenoides, dentre outros (SOUSA et al., 2007).
Os antioxidantes são substâncias que previnem ou retardam os
danos provocados pelos processos oxidativos, agindo através da inibição
dos radicais livres (antioxidantes primários), ou por outro processo que
não envolva a inibição direta dos radicais livres (antioxidantes
secundários) (MARIUTTI e BRAGAGNOLO, 2007).
Melo et al. (2011) citam que do ponto de vista químico, os
antioxidantes possuem pelo menos um grupo hidroxila, podendo ser
sintéticos como o BHA (butilhidroxianisol) e o BHT (butilhidroxitolueno)
ambos utilizados nas indústrias alimentícias. Porém, acredita-se que o
uso
destes
antioxidantes
pode
estar
associado
a
processos
carcinogênicos quando consumidos em grandes quantidades. A dúvida
quanto à toxicidade destes compostos faz com que haja um grande
incentivo no consumo de antioxidantes de origem natural, bem como na
pesquisa de novos antioxidantes naturais, que apresentem as mesmas
funções e eficácia dos sintéticos (MADSEN e BERTELSEN, 1995;
PASSOTTO, PENTEADO e MANCINI-FILHO, 1998).
O BHA e BHT são os antioxidantes sintéticos mais utilizados nas
indústrias alimentícias, pois apresentam boa resistência a processos de
forneamento, embora sejam pouco resistentes à fritura. Segundo
Bannwart e Toledo (1999) o TBHQ (terc-butila hidroquinona) é um
produto que foi introduzido na década de 70, e mostrou ser efetivo em
produtos submetidos à fritura. O galato de propila, utilizado como
antioxidante sintético, é um sólido cristalino, solúvel em solventes
orgânicos, produzido a partir do ácido gálico, que tem mostrado atividade
antioxidante em alimentos e óleos vegetais, especialmente quando
combinado com palmitato de ascorbila. Ramalho e Jorge (2006) citam
que estudos toxicológicos com animais têm demonstrado a possibilidade
destes antioxidantes sintéticos serem carcinogênicos. Em outros estudos
45
efetuados por Cruces-Blanco et al. (1999) cita que o BHA induz
hiperplasia gastrintestinal em roedores, porém, em humanos, ainda não
se sabe.
A capacidade antioxidante, está associada à diminuição dos
processos oxidativos, impedindo danos ao DNA e as macromoléculas,
que pode culminar em doenças cardíacas, câncer, e cataratas
(KUSKOSKI et al., 2005). Os polifenóis apresentam atividade antioxidante
principalmente
devido
às
suas
propriedades
redutoras,
doando
hidrogênio, neutralizando os radicais de oxigênio (ATOUI et al., 2005).
Melo et al. (2011) citam, ainda, a existência de antioxidantes naturais
bioativos, como os organosulfurados, fenólicos e terpenos, constituintes
de diversos alimentos.
Algumas frutas podem potencialmente conter maior teor de
fitoquímicos antioxidantes na semente e pele muito mais do que na polpa,
isto pode ser comprovado pelo extrato metanólico de acerola que
evidenciam a presença compostos fenólicos de alta capacidade
antioxidante. Esta ação antioxidante tem sido atribuída à presença de
compostos fitoquímicos bioativos, assim como nos frutos de aroeira que
contêm níveis significativos destes elementos químicos, que auxiliam nas
funções fisiológicas e bioquímicas, beneficiando a saúde humana assim
como a acerola, supracitada (GUO et al. 2003).
Gordon (1996) relata que os organismos vivos possuem sistemas
antioxidantes endógenos para manter os níveis de radicais livres dentro
dos limites toleráveis. Entretanto, estes sistemas não são totalmente
eficientes e, quando os danos a biomoléculas são excessivos, podem
levar à morte celular. Por isto, o uso de antioxidantes naturais, como
substâncias fenólicas presentes naturalmente na maioria das plantas, tem
sido associado ao menor estresse oxidativo (GORDON, 1996).
Uma alimentação rica em antioxidantes, como vitamina C e E, tem
sido recomendada para evitar o estresse oxidativo. A busca por estas
substâncias antioxidantes tem sido motivo de vários estudos em centros
de pesquisas, indústrias farmacêuticas e indústrias alimentícias, com
elevados investimentos.
46
Diferentes fitoquímicos estão presentes nas frutas e hortaliças em
geral, que apresentam capacidade antioxidante, a qual exerce diferentes
funções no organismo, como retardar o envelhecimento e prevenir contra
doenças, por apresentarem capacidade de reagirem com os radicais
livres, protegendo o organismo de estresse oxidativo. ( WANG e PRIOR,
1997; TAPIERO, TOWNSEND e TEW, 2002).
Diversos ensaios foram desenvolvidos para screening de atividade
antioxidante, sendo os mais utilizados o ABTS (ácido 2,2-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfônico)), FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power),
DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazila) e ORAC (capacidade de absorção de
radical oxigênio) (LEONG e SHUI, 2002; THAIPONG et al., 2006).
Durante
o estresse oxidativo há formação de compostos
potencialmente tóxicos, que causam danos prejudicando a saúde,
aumentando o risco de doenças cardíacas e degenerativas, podendo
levar ao envelhecimento. Desta forma, a natureza química e a atividade
antioxidante naturais estão sendo a cada dia mais pesquisadas, isoladas
de diversas plantas. Dentre eles, destacam-se os polifenóis, os quais
demonstraram
diversas
atividades
biológicas:
antibacteriana,
anti-
inflamatória, antioxidante e antiviral (LARSON, 1988). Atoui et al. (2005)
destacam que a atividade antioxidante dos polifenóis é devida,
principalmente, as suas propriedades redutoras, onde doam hidrogênio,
neutralizando os radicais de oxigênio. O uso de antioxidantes é
necessário para prevenir ou retardar a oxidação de substratos
potencialmente oxidáveis, como lipídios (BECKER, NISSEN e SKIBSTED,
2004), reduzindo, assim, os riscos de muitas enfermidades por sua
capacidade de captar, reativar e recuperar danos causados pelos radicais
livres relacionados com estas doenças (ALONSO et al., 2004, MOURE et
al., 2001).
A atividade antioxidante dos óleos essenciais e da oleoresina está
relacionada com os componentes químicos presentes e com sua
estabilidade. O tipo de solvente utilizado na extração de óleo essencial
ou da oleoresina determina o seu potencial antioxidante, visto que o
comportamento estrutural e a bioatividade de seus componentes no
extrato dependem da biodiversidade e da polaridade encontrada. Estudos
47
comparativos são requeridos para otimizar ao máximo o enriquecimento
de compostos bioativos no extrato vegetal de pimenta rosa (BERTOLDI,
2006).
Não existe um método único que avalie satisfatoriamente a
atividade antioxidante de uma amostra, pois depende da técnica de
extração, tipo de amostra, dos componentes químicos presentes, além de
parâmetros
metodológicos,
como
tempo,
temperatura,
fatores
interferentes entre muito outros (BERTOLDI, 2006). Silva (2003) cita que
são encontrados na literatura resultados conflitantes de atividade
antioxidante de certos compostos puros e de extratos. Diversas causas
são responsáveis por essas diferenças, como o método de extração
empregado, estrutura física do sistema testado, natureza do substrato
para oxidação, presença de componentes interferentes, maneira como a
oxidação foi iniciada e o mecanismo de ação do antioxidante ( BECKER,
NISSEN E SKIBSTED, 2004).
A utilização de DPPH é uma técnica rápida e simples, que
apresenta o máximo de absorção a 515-520nm, na qual ao abstrair um
radical hidrogênio do antioxidante em estudo observa-se uma diminuição
da absorção e consequentemente da coloração.
Segundo Melo et al. (2006), para avaliar a atividade antioxidante de
diferentes
amostras,
muitas
técnicas foram estudadas.
Algumas
determinam a capacidade dos antioxidantes em sequestrar os radicais
livres produzidos no meio reacional e, outras, avaliam a eficiência dos
antioxidantes em inibir a peroxidação lipidica. Dentre as diferentes
técnicas existentes, destaca-se a do DPPH• (2,2-difenil-1-picrilhidrazil),
que vem sendo muito utilizada por ser, rápida e sensível, quando
comparada a outras técnicas, permitindo, segundo Ascoli, et al. (2006) e
Roesler et al. (2007) realizar um screening de amostras com diferentes
polaridades. Esta técnica permite a redução do radical DPPH•, ou seja, na
capacidade do radical livre reagir com substâncias doadoras de H (Figura
10). A coloração inicial da solução de DPPH é roxa intensa e a ação
antioxidante de um extrato vai fazendo com que ocorra descoloramento
da solução, a qual, ao final torna-se amarelada (ASCOLI, et al., 2006;
DUARTE-ALMEIDA, et al., 2006). O ensaio DPPH é o mais utilizado para
48
determinação da capacidade antioxidante em diferentes vegetais.
A
capacidade redutora é medida através da redução da absorbância do
radical por 30 minutos ou até cessar a variação na absorbância.
Geralmente o resultado é apresentado como EC 50, que expressa a
concentração da amostra ou do padrão, necessária para reduzir em 50%
a concentração inicial de DPPH•.
Figura 5 - Atividade antioxidante DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazila), na
forma oxidada e reduzida
Fonte: Cezarotto (2009)
3.8 Atividade antimicrobiana
A deterioração de alimentos por micro-organismos é um grande
problema nas indústrias alimentícias, dessa forma, a fim de minimizar
esse problema, os fabricantes utilizam os chamados aditivos químicos,
para conservar e aumentar o prazo de validade desses produtos. A
deterioração do alimento é inevitável, e o uso de conservantes poderá
aumentar a vida útil do alimento, entretanto, esses conservantes químicos
poderão apresentar toxicidade. A história do uso de substâncias
antimicrobianas na prática médica é muito mais antiga que a descoberta
de espécies microbianas, pois há citações que Hipócrates (470-399 a.C.)
já recomendava a lavagem dos ferimentos com vinho, a fim de impedir a
propagação do processo infeccioso. Há relatos datados de 2.500 a 3.000
anos atrás, que alguns povos, como os chineses e os indianos, já
utilizavam mofos e papa de soja para tratamentos de lesões infectadas e
dos processos inflamatórios (SANCHES, 2004).
49
Lima (2001) descreve que os vegetais têm sido empregados tanto
como alimentos, quanto como medicamentos em diversas enfermidades
na forma de chás, sucos, tintura, banhos, cataplasma e unguentos. O
mesmo autor cita que os povos antigos da China, Egito, Ásia e Roma já
utilizavam numerosas espécies vegetais, para uso medicinal, com base
em seus conhecimentos empíricos. Embora não seja um fato recente o
conhecimento sobre a presença de substâncias antimicrobianas nos
vegetais superiores, a busca destas substâncias teve um grande impulso
após a descoberta da penicilina.
Ainda hoje existem muitas comunidades e grupos étnicos,
principalmente os de rendas mais baixas, que utilizam as plantas
medicinais como o principal, senão o único medicamento para o
tratamento de suas enfermidades (CAETANO et al., 2002).
Apesar do grande desenvolvimento da síntese orgânica e de novos
processos biotecnológicos, 25% dos medicamentos prescritos nos países
industrializados ainda são procedentes de plantas (Oliveira apud O‟HARA
et al., 1998).
Segundo Simões et al. (1999), a etnofarmacologia atua como uma
importante ferramenta no estudo e na pesquisa de novos fármacos de
origem vegetal, e a diversidade molecular no reino vegetal é ainda
considerada quase que ilimitada. Weniger (1991)
relata que o
conhecimento popular, embora empírico, fornece indícios de plantas
portadoras de propriedades curativas, representando deste modo a etapa
inicial para projetos de pesquisa. Esse mesmo autor destaca que a
atuação dos primeiros médicos, em sua maioria de origem portuguesa
que vieram ao Brasil no período pré-descobrimento, foram influenciados
pela convivência com a cultura indígena aqui presente, e posteriormente,
sofreram influência africana (CALAÇA, 2002).
Melo Junior et al. (2000) estudaram o extrato da casca de pimenta
rosa, e observaram que dentre as dezessete plantas medicinais
pesquisadas, esta foi uma das que apresentou maiores halos de inibição
no teste de difusão em ágar, contra micro-organismos Gram-positivos,
como Enterococcus, Streptococcus viridans, Streptococcus não do grupo
A, B, D e bacilo Gram-positivo corineforme, porém, não observaram
50
atividade em micro-organismos Gram-negativos como Proteus vulgaris,
Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter freundii e Escherichia coli.
Martinez Guerra et al. (2000) estudaram a atividade do extrato
etanólico de folhas de pimenta rosa (etanol a 80%) utilizando cepas dos
micro-organismos Staphylococcus aureus (Gram-positivo), E. coli e
Pseudomonas aeruginosa (Gram-negativo) além da levedura Candida
albicans, pelo método de difusão em ágar. Observaram que os extratos
nas concentrações 80, 60, 40, 30, 15,5 e 1% apresentaram atividade
antimicrobiana frente a todos os micro-organismos testados. Martinez et
al. (1996 a,b) utilizaram folhas de pimenta rosa (etanol a 30%) em
diferentes concentrações, utilizando o extrato nas bactérias S. aureus, B.
subtillis (Gram-positivas) E. coli e P. aeruginosa (Gram-negativas) e na
levedura Candida albicans, pelo técnica de difusão em ágar. Os autores
verificaram que na menor concentração (10%) não houve inibição de
nenhum dos micro-organismos, porém, nas concentrações de 50 e 100%,
todas as bactérias foram inibidas, mas as leveduras não sofreram
inibição.
3.8.1 Óleos essenciais no controle de micro-organismos
A cada dia está aumentando o interesse da comunidade cientifica
pela fitoterapia, o que tem levado ao desenvolvimento de pesquisas
científicas baseadas nas práticas e ditos populares. De acordo com
SANTOS et al. (2006 a), a fitoterapia pretende realizar a cura com o uso
de plantas de modo simples, empírico, pouco científica e experimental. A
seleção etnofarmacológica de plantas pode ser baseada em ditos
populares, que sem dúvida é uma ferramenta valiosa para descoberta de
novos fármacos. Dentre estas descobertas estão os óleos essenciais,
atualmente bastante pesquisados para sua utilização em novos
medicamentos.
O óleo essencial de pimenta rosa foi testado como antimicrobiano
contra Escherichia coli,
Shigella dysenteriae,
Bacillus
subtilis
e
Staphylococcus albus (SIDDIQUI et al., 1995). Siddiqui et al. (1996)
estudaram a atividade antifúngica desse óleo essencial nos fungos
51
Aspergillus níger, A. parasiticus, A. flavus, A. oryzae, A. fumigatum,
Trichoderma
spp
e
Helminthosporium
oryzae,
verificando
que
apresentavam atividade anti-fúngica.
Os óleos essenciais não são substâncias puras, sendo uma
mistura de vários compostos orgânicos voláteis, complexas, presentes em
diferentes concentrações, que variam de espécie para espécie vegetal.
Segundo Cezarotto (2009), as propriedades antimicrobianas dos óleos
essenciais parecem estar associadas a altos teores de hidrocarbonetos
monoterpênicos, em especial ao α-pineno. A atividade antimicrobiana
destes compostos provavelmente se deve a capacidade de destruir a
integridade celular, inibir a respiração e processo de transporte iônico,
além da capacidade de aumentar a permeabilidade da membrana celular
(COX et al, 2000; SIQUEIRA et al; 1985).
3.9
Avaliação
da
atividade
antimicrobiana
de
óleos
essenciais
3.9.1 Método de difusão em ágar
O resultado obtido por este método é qualitativo, sendo útil para
inferir a sensibilidade do micro-organismo a determinados compostos.
O extrato da planta ou o óleo essencial a testar é colocado em um
reservatório (disco de papel no meio de cultura ou em poços) em contato
com o meio sólido, como o ágar, inoculado com determinado microorganismo. Decorrido o tempo de incubação, mede-se o diâmetro ou o
raio da zona clara (onde não houve o crescimento) em volta do
reservatório (LINTON, 1983).
3.9.2 Micro-organismos
Diversos micro-organismos têm sido testados como alvo frente a
diferentes óleos essenciais, visando verificar a atividade antimicrobiana
desses óleos. Devido a sua importância em alimentos e pelo fato de
52
representarem os dois grandes grupos de micro-organismos, Grampositivos e Gram-negativos, neste estudo, selecionaram-se como alvo as
bactérias E. coli, L. monocytogenes, Salmonella Thyphimurium e S.
aureus, as quais serão descritas brevemente, lembrando que as bactérias
Gram-positivas diferem das Gram-negativas em diferentes características,
especialmente no que diz respeito a composição química, estrutura,
permeabilidade
da
parede
celular,
fisiologia,
metabolismo
e
patogenicidade (Tortora,Funke e Case, 2000).
3.9.2.1 Escherichia coli
Segundo Tortora, Funke e Case (2000) o gênero Escherichia
compreende bacilos Gram-negativos, sendo a espécie de maior
importância, Escherichia coli. É uma bactéria anaeróbia facultativa, que
faz parte da microbiota intestinal de animais de sangue quente, portanto,
quando está presente na água e nos alimentos é um indicativo da
contaminação de origem fecal recente. É um bacilo, não esporulado,
catalase-negativo,
oxidase-negativo,
pertencente
à
família
Enterobacteriaceae, que é capaz de fermentar a glicose, produzindo gás
e ácido (HOLT et al., 1994; FRANCO e LANDGRAF, 1998; ADAMS,
2000). Trabulsi e Alterthum (2005) descrevem que na espécie E. coli
existem várias cepas patogênicas. E. coli podem causar infecções
intestinais, urinárias, septicemias, meningite e outros tipos de patologias
(Fig11).
53
(a)
(b)
Figura 6 - Escherichia coli; a) Coloração de Gram e b) Imagem de
microscopia eletrônica
Fonte: a) faculty. ccbcmd.edu; b) diariodonordeste.globo.com
Os sintomas causados por esta bactéria são diarreia acompanhada
de dores abdominais, vômitos e febre com duração de 6 horas até três
dias, apresentando um período de incubação variando de 17 a 72 horas
(FRANCO E LANDGRAF, 1998).
Bertoldi (2006), em seu trabalho cita vários autores, que
observaram atividade antimicrobiana, atribuida à presença de substâncias
fenólicas presentes na pimenta rosa, contra uma série de microorganismos, inclusive a E.coli.
3.9.2.2 Staphylococcus aureus
São bactérias Gram-positivas com, aproximadamente, 1µm de
diâmetro, que ocorrem aos pares, em pequenas cadeias ou em cachos
similares aos de uva. Pertence à família Micrococcaceae, são bactérias
anaeróbicas facultativas, catalase-positiva e oxidase-positiva (ADAMS,
2000). Promovem intoxicação alimentar em humanos através da
produção de enterotoxinas, além de causarem abcessos, furúnculos e
feridas. São halotolerantes, resistindo a concentrações de 10 a 20% de
54
nitratos e cloreto de sódio, o que torna os alimentos curados, veículos
potenciais para a sua multiplicação.
Desenvolvem-se bem sob condições de alta pressão osmótica e
pouca umidade, o que parcialmente explica porque podem crescer e
sobreviver nas condições nasais, ambiente externo e sobre a pele.
(a)
(b)
Figura 7 - Staphylococcus aureus; a) Coloração Gram e b) Imagem de
microscopia eletrônica
Fonte:
a)
Infetious
Diseases
Biomarker
Database
(http://biomarker.korea.ac.kr/pathogen/pathogen_view_en.jsp?pdass=1&id
=81), b) NIAID.NIH.GOV
S. aureus é uma bactéria patogênica que possui diversos fatores
de
virulência:
estafiloquinase,
hialuronidase,
fosfatase,
coagulase,
hemolisina, enterotoxinas. As enterotoxinas são as responsáveis pelas
intoxicações alimentares (FORSYTHE, 2005).
Esta espécie é a mais resistente de todas as bactérias patogênicas
não formadoras de esporos. Multiplicam-se entre 7 e 48°C, sendo a
temperatura ótima de desenvolvimento de 37°C. Suas enterotoxinas são
produzidas quando cultivadas a temperatura de 10 a 48°C, entretanto, a
faixa de 35 a 40°C é considerada ótima para sua proliferação. A faixa de
pH ótimo é entre 6-7, sendo seu limite 4-10. Para a produção de suas
enterotoxinas, o pH é na faixa de 6 (ADAMS, 2000).
55
S. aureus pode estar presente no ar, na poeira, em esgoto, na
água, em alimentos, equipamentos processadores de alimentos, nas
superfícies expostas aos ambientes, nos seres humanos e nos animais
(Fig.12). Os homens e os animais são os reservatórios principais,
podendo portar essa bactéria no nariz, garganta, cabelo e pele. As
intoxicações alimentares estafilocócicas são provocadas pelo consumo de
alimentos contaminados com as enterotoxinas estafilocócicas (carne,
frangos, ovos, saladas, produtos de panificação, leites ou seus
derivados), e o risco aumenta quando estes produtos não foram
devidamente acondicionados e/ou refrigerados (FORSYTHE, 2005).
Freire (2008) e Santos (2004 b), destacam que os sintomas são
caracterizados por períodos curtos de incubação (2 a 4 horas), náuseas,
vômitos, dores abdominais e prostração, podendo também levar a
diarreias. A recuperação, geralmente, ocorre entre 1 a 2 dias. Os
sintomas e a duração da doença podem variar, dependendo da
suscetibilidade do hospedeiro, do tipo de toxina, da quantidade de
alimento contaminado ingerido, da quantidade de toxina presente nos
alimentos.
Bertoldi (2006) cita vários autores reportando que a atividade
antimicrobiana da pimenta rosa se deva provavelmente à presença de
substâncias fenólicas contra a bactéria Staphylococcus aureus e inclusive
contra algumas bactérias Gram-negativas e também contra a levedura
Candida albicans.
3.9.2.3 Listeria monocytogenes
L. monocytogenes é uma bactéria desprovida de cápsula, que não
forma esporo. Multiplica-se tanto em aerobiose como em anaerobiose,
tendo predileção por ambientes microaerófilicos e tem capacidade de se
multiplicar em temperaturas de refrigeração (ROCOURT, 1999).
É encontrada na natureza e no trato intestinal dos animais. A
contaminação de diversos alimentos, principalmente carcaça, carnes e
seus cortes durante o abate pode ocorrer pelo seu manuseio incorreto.
Este micro-organismo é o agente da listeriose, que é uma zoonose de
56
grande importância em saúde pública, podendo causar casos graves
como aborto, septicemia e meningites (MANTILLA et al., 2007). Esta
patologia é muito mais grave em determinados grupos de risco, como
mulheres grávidas, crianças, idosos e pacientes imunocomprometidos.
Este micro-organismo se multiplica em temperaturas de refrigeração,
sendo seguidamente isolado em alimentos manipulados de modo
inadequado e em indústrias de processamento de alimentos (MANTILLA
et al., 2007).
L. monocytogenes é um bastonete Gram-positivo, anaeróbico
facultativo e não esporulado. Está amplamente disseminado na natureza,
envolvendo um grande número de fontes de infecção. (HOFER, REIS e
HOFER, 2006).
Segundo Hofer, Reis e Hofer (2006) e Araújo et al. (2002), a partir
dos anos oitenta, houve aumento no número de casos e de surtos de
listeriose humana e a relação de sua veiculação com os alimentos
contaminados. Glass e Doyle (1989) descrevem que a contaminação pós
processamento
de
produtos
prontos
para
o
consumo
com L.
monocytogenes pode representar perigo ao consumidor (Fig13). Esta
bactéria pode se multiplicar em produtos cárneos durante a estocagem
sob refrigeração. Doyle (1988) cita que a presença de nitrito de sódio nos
níveis permitidos pela legislação não é capaz de inibir L. monocytogenes
a menos que haja uma interação com outros agentes antimicrobianos.
Esta bactéria é muito tolerante a cloreto de sódio, podendo sobreviver
vários dias, dependendo da concentração utilizada e da temperatura de
conservação (DOYLE, 1988).
57
(a)
(b)
Figura 8 - Listeria monocytogenes; a) Coloração Gram, b) Imagem de
microscopia eletrônica
Fonte: a) Kenneth Todar University of Wisconsin-Madison Department of
Bacteriology
(2004).
b)
University
of
Wisconsin-Madison
Dep.
Bacteriology. Kenneth Todar (2205).
3.9.2.4 Salmonella Thyphimurium.
S. Thyphimurium são bactérias Gram-negativas, pertencentes à
família das Enterobacteriaceae. Não são esporuladas, anaeróbicas
facultativas, produtoras de gás a partir da glicose, exceto Salmonella
Typhi, que não produz gás (LE MINOR e POPOFF, 1987).
O trato intestinal de animais homeotérmicos e heterotérmicos é o
habitat das salmonelas. O consumo de alimentos contaminados por esse
micro-organismo pode causar diversas infecções, como febre tifóide,
causadas por
Salmonella Typhi,
febres entéricas causadas por
Salmonella Paratyphi A, B e C e gastroenterites ou salmoneloses
causadas por outros sorovales. (FRANCO e LANDGRAF, 1996).
58
(a)
(b)
Figura 9 - Salmonella Typhimurium a) Coloração Gram e b) Imagem de
microscopia eletrônica
Fonte:
Rocky
Mountain
Laboratories/NIAID/NIH
(http://www.sciencemuseum.org.uk/antenna/spacebacteria/)
Dores abdominais, diarreia, náuseas, vômitos, febre moderada e
dores de cabeça são alguns dos sintomas das gastroenterites, cujo
período de incubação veria de 6 a 72 horas, com média de 12 a 36 horas
(Fig 14). Na febre tifóide ocorre febre contínua, diarreia, esplenomegalia,
erupção de manchas rosa no abdome e septicemia. (FRANCO e
LANDGRAF, 1996). A febre entérica se manifesta com febre, dores
corporais e abdominais, calafrios, náuseas, vômitos e diarreia. Este tipo
de febre pode durar de uma a oito semanas, enquanto, as febres
entéricas duram no máximo três semanas (FRANCO e LANDGRAF,
1996).
Segundo Salyers e Whitt (1994),
os principais alimentos
causadores de intoxicação por Salmonella spp são carne de aves,
saladas elaboradas com carne de aves, ovos e derivados, carnes e
produtos cárneos e outros alimentos proteicos. A infecção pode ser muito
grave em crianças com idade inferior a três meses, em idosos e em
indivíduos imunocomprometidos. Esta infecção pode levar a morte
dependendo da virulência da cepa, do inóculo ingerido, e do estado do
sistema imune do hospedeiro. A transmissão pode ocorrer diretamente
59
por via oral, através de fezes contaminadas. A ingestão de ovos
contaminados com Salmonella enteritidis pode causar salmonelose, e a
contaminação por este sorotipo aumentou a partir da década de 1980
(SALYERS e WHITT, 1994).
60
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Material botânico
As amostras de frutos verdes e maduros de pimenta rosa utilizados
para a extração do óleo essencial, determinação do rendimento e da
constituição química, foram obtidas a partir de exemplares adultos
provenientes do campus Capão do Leão, da Universidade Federal de
Pelotas, RS. Foram colhidas manualmente, nos períodos antes e durante
a maturação dos frutos (maio a julho de 2011). Os frutos foram coletados
em pontos aleatórios da planta, na copa e nas laterais das árvores, em
diferentes horários. Os frutos verdes foram coletados até o mês de maio,
enquanto os maduros, foram coletados em períodos mais longos, no final
de maio até julho. Dados geográficos da região de produção dos frutos
são: “latitude: 310 48‟0459”, “longitude: 52024‟5532” e altitude de 21
metros.
4.2 Excicata
A identificação do material botânico foi realizada através de
comparação com amostras existentes no herbário do Departamento de
Botânica da Universidade Federal de Pelotas, RS, Brasil. O voucher do
material testemunha está depositado neste mesmo herbário, sob o
registro número 25.131, para a Schinus terebinthifolius Raddi, pimenta
rosa madura, coletada no Campus Universitário da UFPel – RS.
61
4.3 Caracterização dos frutos de pimenta rosa
As características físico-químicas determinadas foram umidade,
cinzas e pH. Posteriormente, foram determinados a influência do tipo de
trituração,extração do óleo essencial e da oleoresina, rendimento,
densidade e índice de refração do óleo essencial.
4.3.1 Determinação da umidade de frutos maduros e verdes de
pimenta rosa
A determinação do teor de umidade dos frutos foi realizada pelo
método gravimétrico (perda por dessecação). Para tanto, transferiu-se 2g
dos frutos de pimenta rosa, colocando em cadinhos de porcelana,
previamente tarados, os quais foram secos em estufa elétrica durante 24
horas, regulada a 105ºC. Após esse período, os cadinhos foram retirados
e mantidos em dessecador até atingirem a temperatura ambiente. A
percentagem (%) de matéria seca (MS) a 105ºC foi obtida através da
Equação 1, onde: Pa refere-se ao peso da amostra, Pu é o peso do
cadinho contendo a amostra antes da dessecação, Ps é o peso do
cadinho contendo a amostra após a dessecação. A percentagem de
matéria seca das amostras foi obtida a partir da média de triplicatas
conforme Equação 1:
Equação 1: MS(%) = (Pu –Ps) x 100/Pa
4.3.2 Determinação de Cinzas de frutos maduros e verdes de
pimenta rosa
A análise de cinzas foi realizada de acordo com o Método 923.03
da AOAC (1995), com frutos in natura, utilizando-se 2g de amostra do
fruto, devidamente triturada com auxilio de mixer, até obter uma pasta
homogênea. Após, colocou-se em cadinhos de porcelana previamente
tarados, sendo secos em estufa a 100ºC, calcinados e incinerados à
62
600ºC em mufla, por 4h. Depois, foi deixado esfriar em dessecador até
atingir a temperatura ambiente, sendo pesados posteriormente.
O teor de cinzas foi obtido por diferença de peso entre a massa do
cadinho vazio, previamente tarado, e a massa do cadinho com o resíduo
calcinado, considerando a massa da amostra fresca, de acordo com a
Equação 2:
Equação 2: Cinzas (%) = (massa do cadinho com cinzas (g) - massa do
cadinho (g) x 100 / massa de amostra pesada.
Todas as determinações foram executadas em triplicatas.
4.3.3 Determinação eletrométrica do pH de frutos maduros e verdes
de pimenta rosa
O pH foi mensurado com auxílio de um potenciômetro (pH TEK,
modelo 3B), sendo as amostras trituradas e diluidas em água ultra pura e
as médias calculadas a partir de triplicatas, segundo a Farmacopéia
brasileira (1988) pelo método de potenciometria.
4.4 Avaliação da trituração da amostra
A fim de verificar se a trituração ou sua intensidade têm influência
no rendimento de óleo essencial e de oleoresina, utilizaram-se as
amostras (frutos maduros e verdes) que foram submetidas a três tipos de
trituração para extrair o óleo essencial e a oleoresina, de forma a verificar
qual a mais eficaz. Utilizou-se um tratamento sem trituração e dois com
trituração, sendo utilizada em um deles a trituração com mixer (modelo
Walita, 700 w), até obter uma massa homogênea e, no outro, trituração
parcial com auxílio de gral e pistilo.
Após a definição da melhor forma de trituração, esta foi utilizada
durante todo o restante dos experimentos, para extração de óleo
essencial e da oleoresina da pimenta rosa.
63
4.5 Extração do óleo essencial por hidrodestilação
Esta parte do experimento foi conduzida no Laboratório da Química
Orgânica, UFPel, Pelotas, RS (Laboratório de Oleoquímica). Utilizou-se o
aparelho Clevenger modificado, acoplado a um balão de fundo redondo,
com capacidade de 2 litros. Foram utilizados separadamente, frutos
maduros e verdes de pimenta rosa, ambos triturados, sendo o material
pesado e submetido à extração durante 5 horas, em ebulição, conforme
determinado pela Farmacopéia Brasileira (1988). A análise foi realizada
em triplicata.
Cem gramas da amostra foi colocada em balão de fundo redondo
de 2L, e acrescentou-se 1.350mL de água ultra pura (Milli-Q). Adaptou-se
o aparelho Clevenger ao balão, e a parte do tubo graduado e do tubo
retorno foi preenchido com água. Em seguida, com o auxilio de uma
manta, foi realizado o aquecimento, em constante ebulição. Após 5 horas,
o óleo foi removido e desidratado com sulfato de sódio anidro, filtrado em
lã de vidro e pesado em balança analítica. Posteriormente, foi colocado
em frasco de vidro, coberto com papel alumínio para proteger da ação da
luz, e estocado em freezer comercial (-18oC) até o momento de sua
utilização (aproximadamente três a cinco meses).
O mesmo procedimento foi utilizado para determinar o rendimento
dos óleos essenciais, em função do tempo de extração, entretanto, para
essa finalidade, as amostras de óleo, foram coletadas de hora em hora do
aparelho de Clevenger, num total de 5 horas, sendo o óleo removido e o
rendimento calculado. Todas as determinações foram realizadas em
triplicata. Para essa avaliação utilizou-se frutos de pimenta rosa maduros.
4.6 Índice de refração do óleo essencial
Na determinação do índice de refração, as leituras foram feitas por
refratometria, utilizando o refratômetro de bancada ABBÉ (QUIMIS/
modelo Q767B), determinado a 230C, em triplicata.
64
4.7 Densidade do óleo essencial
Foi determinada de acordo com metodologia preconizada pelas
Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz (1985), utilizando-se balança
analítica. A densidade do óleo essencial foi determinada pela relação
entre determinada massa (g) pelo volume (mL) do óleo essencial. O
resultado corresponde à média de três determinações.
4.8 Avaliações da composição do óleo essencial por
cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa
(CG/MS)
A análise cromatográfica foi realizada na Universidade de Caxias
do Sul (UCS), no Laboratório de Óleos Essenciais e Produtos Naturais
(LOES). A análise em GC/MS foi realizada em cromatógrafo gasoso
acoplado a detector seletivo de massas Hewlett Packard 6890/MSD5973,
equipado com software HP Chemstation e espectroteca Wiley 275. Foi
utilizada a coluna capilar de sílica fundida HP-Innowax (30 m x 250 m)
0,50 m espessura de filme (Hewlett Packard, Palo Alto, USA).
Temperatura da coluna, 40°C (8 min) para 180°C a 3°C/min, 180-230°C a
20°C/min, 230°C (20 min); interface 280°C; split ratio 1:100; gás de
arraste He (56 Kpa); razão de fluxo: 1,0 mL/min.; energia de ionização 70
eV; volume injetado 0,4 L diluído em hexano (1:10).
4.9 Extração de oleoresina
Todos os experimentos foram realizados com frutos maduros de
pimenta rosa.
4.9.1 Método de Bligh-Dyer sem ultrassom
As amostras frutos maduros de pimenta rosa foram pesados e
acrescidos de 10mL de clorofórmio, 20mL de metanol e 8mL de água
65
destilada. Após a homogeneização, as amostras foram transferidas para
um funil de separação com agitação, onde se acrescentou mais 10mL de
clorofórmio e 10mL de sulfato de sódio a 1,5%. Após nova agitação,
deixou-se em repouso para separar as camadas bifásicas e filtrou-se,
utilizando papel de filtro com sulfato de sódio anidro, para remover a
água. Posteriormente, pipetou-se 5mL para uma cápsula de porcelana
previamente seca e pesada, a qual foi colocada em estufa até que os
solventes (metanol, clorofórmio e água) fossem eliminados e, depois,
colocou-se em dessecador até o resfriamento da amostra, pesando-se
em seguida em balança analítica.
A quantidade de lipídio presente na amostra foi determinada,
utilizando-se a Equação 3:
Equação 3: Lipídios % = PL x 4 x 100 / peso amostra PL (peso do
lipídio contido na cápsula menos o peso da cápsula), e dos 20 mL de
clorofórmio só 5 mL foi para a cápsula, por isto deve-se multiplicar por 4.
Após a extração da oleoresina, o material foi submetido à
derivatização sendo diluído em hexano e levado para determinação dos
lipídios presentes na oleoresina através da cromatografia gasosa. Todas
as análises foram realizadas em triplicata.
4.9.2 Método de Bligh-Dyer com ultrassom
As amostras de frutos maduros de pimenta rosa, trituradas e
pesadas, foram sonicadas em aparelho de ultrassom (modelo Maxi Clean
1450A, UNIQUE – Brasil), por 30min. Após este tempo, as amostras
foram submetidas à extração de lipídios.
4.9.3 Método de Soxhlet
Empregou-se método IUPAC 1.122 (1979) com uso de sete
diferentes solventes. Foi fixada a velocidade/quantidade de 6 a 8
sifonagens por hora à temperatura constante. As amostras de frutos
66
maduros de pimenta rosa foram trituradas e pesadas em balança
analítica, colocadas em um cartucho onde as extremidades foram
dobradas para impedir a saída de material. O cartucho foi colocado no
extrator Soxhlet, encaixado em um balão volumétrico com capacidade de
1000mL, onde o solvente utilizado foi acrescentado. O condensador foi
conectado e a manta de aquecimento ligada, permanecendo em ebulição
por 6 horas, sendo o tempo calculado a partir da ebulição. Somente os
frutos maduros de pimenta rosa foram analisados por esta metodologia. A
análise foi realizada em triplicata.
A extração utilizando Soxhlet foi realizada com os seguintes
solventes em triplicatas: acetona, álcool etílico, éter etílico, éter de
petróleo, clorofórmio, metanol e hexano.
4.9.4 Extração de oleoresina de pimenta rosa a frio
As amostras de frutos maduros de pimenta rosa foram trituradas e
pesadas em balança analítica e, depois, colocadas por 72 horas em
diferentes solventes (acetona, álcool etílico, éter etílico, éter de petróleo,
clorofórmio, metanol e hexano), a fim de determinar o rendimento de
oleoresina extraída. Após esse tempo, filtrou-se em papel de filtro
Whatmam e, o material coletado foi colocado em rota evaporador para
remoção do solvente. O material que apresentava, ainda, um pouco de
solvente, foi colocado em nitrogênio líquido, para eliminação do solvente.
O balão foi pesado e o rendimento de oleoresina calculado.
4.9.5 Derivatização da oleoresina
A oleoresina extraída por Soxhlet foi submetida à derivatização,
onde 250 mg do óleo foi pesado em um balão volumétrico, acrescido de 6
mL de solução metanólica de NaOH a 2% recém preparada e deixada em
refluxo por 10 minutos. Após o tempo previsto foi, adicionado 7 mL de
solução metanólica de BF3 (trifluoreto de boro) e continuou em ebulição
por mais 2 minutos. Adicionou-se 5 mL de heptano e deixou ebulir por
mais 1
minuto,
desligando o equipamento e
deixando resfriar
67
naturalmente. Após adicionou-se solução supersaturada de NaCl, onde
houve separação em duas fases. O sobrenadante foi filtrado, e o material
foi passado em sulfato de sódio anidro a fim de remover a água residual.
Posteriormente, o material passou por nitrogênio para secar e remover
toda a água que por ventura estivesse presente. Após este procedimento
obteve-se o éster metílico, e só depois é que o material foi submetido à
cromatografia gasosa.
4.9.6 Cromatografia da oleoresina derivatizada de frutos maduros de
pimenta rosa
Foi realizada no Centro de Ciências Químicas, Farmacêuticas e de
Alimentos (CCQFA), no Laboratório de Heterociclicos Bioativos e
Bioprospecção
-
LAHBBIO.
Utilizou-se
cromatografia
gasosa
(Cromatógrafo Shimadzu 2010, equipado com coluna de polietileno glicol
RTX-Wax), tendo como gás de arraste o gás He (Helio) e o volume
injetado foi de 1μL diluído em hexano (1:10). Realizou-se o processo de
derivatização, a fim volatilizar os ácidos graxos, para que pudessem ser
detectados no cromatógrafo pelo detector FID (Flame Ionization
Detector), bem como para reduzir a adsorção de soluto no suporte e
superfície da coluna e melhorar a separação dos compostos (DROZD,
1975; GUTNIKOV, 1995).
4.10 Determinação da curva do DPPH
A determinação da atividade antioxidante foi realizada no Centro
de Ciências Química Farmacêutica e de Alimentos da UFPel, utilizando
todos os reagentes p.a. Todas as soluções foram preparadas no dia e
devidamente armazenadas.
Em ambiente escuro, transferiu-se uma alíquota de 4mL de
solução de DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil) (0,06mM) em diferentes
concentrações (10µM, 20 µM, 30µM, 40µ, 50 µM e 60µM), para cubetas
de vidro e realizaram-se as leituras em espectrofotômetro (Biospectro
68
modelo SP-22) a 515nm. A técnica utilizada foi aquela descrita no
Comunicado Técnico on line no 127 do Ministério da Agricultura Pecuária
e Abastecimento, de julho de 2007, calculando-se a equação da reta,
plotando as concentrações de DPPH (μM) no eixo X e as absorbâncias no
eixo Y.
4.11 Atividades antioxidante
Para avaliar a atividade antioxidante do extrato bruto e do óleo
essencial de pimenta rosa utilizou-se o método de capacidade de captura
in vitro do radical livre DPPH (2,2, difenil-2-picrilhidrazil), de acordo com
Brand-Williams et al. (1995) e modificado por Sánchez-Moreno, Larrauri e
Saura-Calixto (1998). O comprimento de onda utilizado foi de 515nm.
Os frutos foram submetidas a dois processos de extração, um
utilizando água ultra pura (Milli-Q) e outro o álcool etílico, sendo 10g de
frutos para 100mL de solução. Depois da trituração da amostra com
auxilio de um mixer até se obter uma pasta homogênea, as amostras
foram submetidas a agitação por 1 hora, centrifugadas a 25.500g (15.000
rpm) durante 15 minutos, em centrifuga Sorvall Instruments (modelo
RC5C). O sobrenadante foi transferido para um balão volumétrico,
completando-se o volume para 100 mL de água ultra pura ou álcool
etílico, conforme o solvente desejado.
A partir do extrato obtido, foram preparados tubos de ensaio
contendo quatro diluições diferentes, em triplicatas. Utilizou-se álcool
etílico como branco, para calibrar o espectrofotômetro. As leituras foram
monitoradas a cada 5 minutos, onde observou a redução da absorbância
até a sua estabilização, ou seja, até que o radical livre DPPH
remanescente nas reações de redução não ocorra mais ou alcance seu
estado estacionário. Após a estabilização da absorbância final este valor
foi utilizado para o cálculo do EC50 (tempo EC50) e, finalmente, foi
calculado grama de fruta/g DPPH = EC50(mg/L)/1.000.1/g DPPH, isto para
obter o resultado final que é expresso em g fruta /g de DPPH (RUFINO et
al., 2007).
69
Avaliou-se a capacidade de diferentes extratos (aquoso, etanólico
e cetônicos) de pimenta rosa em sequestrar os radicais DPPH em
concentrações e intervalos de tempo distintos, para verificar a atividade
antioxidante de cada extrato.
Os frutos de pimenta rosa madura foram triturados até obter uma
pasta homogênea utilizando um mixer. Nesta etapa, o solvente etanol foi
substituído por acetona, agitada por 1 hora, e a amostra foi filtrada em um
balão
volumétrico,
sendo
o
volume
completado
para
100mL.
Posteriormente, foram feitas as diluições e levadas ao espectrofotômetro
e determinada o valor do EC50 e a quantidade de fruta em grama/g de
DPPH. Utilizando o solvente acetona, a amostra foi apenas agitada por
uma hora e filtrada, após seguiu-se os mesmos procedimentos realizados
com etanol.
No óleo essencial de pimenta rosa tanto a verde quanto a madura,
foi determinada a atividade antioxidante, sendo a pimenta rosa verde
diluída em etanol p.a, e a pimenta rosa madura diluída em acetona p.a,
pois a diluição em etanol do óleo de pimenta rosa madura deixou a
solução totalmente turva o que impediu de fazer as leituras no
espectrofotômetro. Desta maneira, o solvente foi trocado por acetona p.a,
isto se deve provavelmente a presença de compostos lipídicos removidos
pelo etanol, pois os componentes presentes nos frutos verdes são
diferentes dos frutos maduros.
4.12 Avaliações microbiológicas
Os testes microbiológicos foram desenvolvidos no Laboratório de
Microbiologia de Alimentos do Departamento de Ciência e Tecnologia
Agroindustrial, da FAEM/UFPel.
4.12.1 Micro-organismos utilizados
Foram utilizados dois micro-organismos Gram-positivos e dois
Gram-negativos:
Staphylococcus
aureus
(ATCC
6538),
Listeria
70
monocytogenes (ATCC 7644), Salmonella Thyphimurium (ATCC 14028)
e, Escherichia coli (ATCC 11775).
4.12.2 Preparação do inóculo
As bactérias foram incubadas em caldo Triptona de Soja com 0,6%
Extrato de levedura (TSB-YE, Merck) (para L. monocytogenes, e em
Caldo Infusão cérebro coração (BHI, Difco) para as outras bactérias,
incubou-se `a 370C, durante 24 horas. Após esse período preparou-se
uma suspensão dos micro-organismos em solução salina (0,8%),
ajustando-se a turvação de acordo com a escala 0,5 de McFarland
(1,5x108 UFC mL-1).
4.12.3 Avaliação qualitativa da atividade antimicrobiana pela técnica
de Difusão em Ágar
Essa avaliação foi feita pelo método de difusão em ágar. O inóculo
bacteriano padronizado, correspondendo a 0,5 da escala McFarland (1,5
x 108 UFC. mL-1), foi distribuído por toda a placa de petri com auxílio de
swab esterilizado. No ágar, pequenos poços foram perfurados e um
volume de 10μL de óleo essencial foi
usado para preencher
individualmente cada um dos poços (com 5 mm de diâmetro), sendo as
placas incubadas por 24h a 36oC. No final deste período obser va-se a
formação dos halos de inibição: se a amostra de óleo essencial avaliada
apresentava atividade inibitória sobre as bactérias testadas, formava-se
um halo ao redor do poço onde foi adicionado o óleo essencial, indicando
ausência de crescimento bacteriano.
Após o tempo previamente determinado, mediram-se os halos de
inibição de crescimento, em milímetros, com o auxílio de uma régua
milimetrada. Todos os experimentos foram realizados em três repetições
e as análises foram efetuadas em triplicatas.
71
4.13 Determinação da Concentração Inibitória Minima (CIM) e da
Concentração Bactericida Minima (CBM)
Para essa avaliação utilizaram-se microplacas de 96 cavidades,
avaliando-se os resultados de acordo com o preconizado pelo National
Committee of Clinical Laboratory Standards, com modificações.
A
microplaca foi dividida em linhas de A a H e em colunas de 1 a 12. A CIM
é definida como sendo a menor concentração da amostra testada que
inibiu em 100% o crescimento dos micro-organismos nos poços e a CBM
é a menor concentração da amostra testada capaz de causar a morte do
inóculo. Nas microplacas foram utilizados três controles, sendo um
controle negativo (só o meio de cultura TSB-YE ou só BHI), um controle
de crescimento (meio de cultura e dimetilsulfóxido - DMSO) e um controle
positivo (meio de cultura e inóculo). Diluições seriadas de razão dois do
óleo essencial foram utilizadas em meio de cultivo, (onde em cada poço
continha a metade da concentração do poço anterior).
Inicialmente, com o auxílio de uma alça de inoculação esterilizada,
transferiu-se uma aliquota de micro-organismos de culturas com 24horas
de desenvolvimento para os tubos contendo os meios específicos para
cada micro-organismo alvo: (TSB-YE para L. monocytogenes e BHI para
as outras bactérias), até atingir a turbidez de 0,5 da escala Mc Farland
(1,5 x 108 UFC.mL-1), comparando com o frasco da escala contendo um
padrão de turbidez (MURRAY et al., 1999).
A CBM foi determinada de acordo com o resultado da CIM,
retirando-se 5µL de amostra daqueles poços onde não ocorreu
crescimento microbiano visí vel e semeando-se em placas de petri
contendo ágar Mϋller Hinton, as quais foram incubadas em estufa a 360C
por 24 horas. As análises foram realizadas em triplicata. A menor
concentração de óleos essenciais na qual não houve crescimento dos
micro-organismos nas placas de Petri foi determinada como a sendo a
CBM para o óleo essencial.
72
5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística foi realizada por meio de análise de variância
(ANOVA).
As
diferenças
significativas
entre
as
médias
foram
determinadas pelo teste t ou teste de Duncan, em nível de 5% de
probabilidade.
73
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Neste estudo realizou-se, primeiramente, a caracterização físicoquímica da matéria-prima, de frutos de pimenta rosa e, após, determinouse a melhor forma de trituração da amostra, o tempo de extração do óleo
essencial, o melhor solvente para extrair a oleoresina, bem como a
melhor técnica de extração (Soxhlet ou a frio). Além disso, identificaramse os componentes presentes nos óleos essenciais e na oleoresina,
através de cromatografia gasosa, acoplada a espectrometria de massa e
finalmente
determinou-se
a
atividade
antioxidante
e
atividade
antimicrobiana.
Os valores de pH, umidade e cinzas dos frutos maduros e verdes
de pimenta rosa estão expressos na Tabela 1.
Tabela 1: Características fisico-químicas de frutos verdes e maduros de
pimenta rosa
Amostras
pH (%)
Umidade (%)
Cinzas (%)
Pimenta rosa madura
5, 46±0,13 a
34,05±0,15 a
3,18±0,18 a
Pimenta rosa verde
5,55±0,09 a
70,40±1,67 b
1,22±0,27 b
Dados expressos como médias de três repetições. As médias seguidas pelas mesmas
letras não diferem entre si a 5% de probabilidade.
Segundo Totti e Medeiros (2006), o teor de umidade de frutos
verdes de pimenta rosa foi de 65,4% e da pimenta rosa madura de
55,6%, sendo que neste estudo, observou-se valores de 70,40% e de
34,05% para frutos verdes e maduros respectivamente, conforme
mostrado na Tabela 1. Os valores de umidade verificados neste estudo
74
para frutos verdes foram semelhantes ao citado por Totti e Medeiros
(2006), entretanto, para a pimenta rosa madura foi inferior.
Degáspari, Waszcznaky e Santos (2004), citam valores de
umidade para frutos maduros de pimenta rosa antes da secagem, de
39%, valor semelhante ao encontado neste estudo. É importante destacar
que esta perda de umidade de frutos verdes em relação aos maduros, se
deve ao fato de que, com a evolução de maturação, os frutos e as
sementes perdem a água, e quando as sementes atingem a umidade de
14%, elas praticamente perdem a capacidade de germinação (TOTTI e
MEDEIROS 2006).
O teor de cinzas para frutos maduros foi de 3,18% e, para frutos
verdes, foi de 1,22%. Observa-se que os frutos verdes apresentam uma
quantidade menor de cinzas. Ressalta-se que nem sempre este resíduo
representa toda a substância inorgânica presente na amostra, pois
segundo as Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz (1985), alguns sais
podem sofrer redução ou volatilização no aquecimento a esta temperatura
(600oC) , alterando o valor de cinzas. Neste estudo, a determinação das
cinzas foi realizada por simples incineração, precedida de calcinação.
O teor de cinzas de frutos maduros de pimenta rosa apresentou
diferença significativa em relação a quantidade de cinzas de frutos
verdes. Isto se deve, provavelmente, ao maior conteúdo de sólidos
solúveis presentes e, também, devido ao conteúdo de água ser maior nos
frutos verdes, diluindo o teor de silicatos, fosfatos e sílica presente na
amostra inicial. (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1988; SHARAPIN et al.,
2000; COSTA, 2001).
Com relação ao pH, observa-se que não houve diferença
significativa entre os valores obtidos para os frutos maduros e verdes.
Entretanto, o pH dos frutos maduros é levemente inferior ao dos frutos
verdes. Nas plantas encontram-se diversos ácidos minerais, mas
particularmente ácidos orgânicos pertencentes a diferentes séries,
aromáticas, terpênicas, heterociclicas, em geral combinados sob a forma
de sais, ésteres, lactonas, amidas, lipidios, resinas, glicidios, proteínas e
em outros compostos naturais. Como os frutos maduros tiveram um pH
menor em relação aos frutos verdes, isto sugere a presença de mais
75
substâncias ácidas no fruto maduro ou, ainda, que em frutos verdes a
quantidade de água presente, dilui os ácidos e, conforme os frutos vão
amadurecendo a quantidade de água diminui e, assim, os ácidos ficam
mais concentrados.
Após a caracterização da matéria-prima, se objetivou extrair e
caracterizar os óleos essenciais e a oleoresina presentes nos frutos de
pimenta rosa. Entretanto, várias etapas da extração de óleos essenciais
são críticas na obtenção desses compostos. Assim, tendo em vista que
os dados relativos à extração desses compostos em pimenta rosa são
escassos na literatura, testaram-se diferentes protocolos nas principais
etapas críticas, a fim de se estabeler aquele que apresente o melhor
desempenho para ser utilizado com esta matéria-prima.
Com relação à primeira etapa de extração testaram-se três
tratamentos diferentes, de forma a verificar o rendimento de cada uma
delas na obtenção de óleos essenciais de pimenta rosa: maceração com
gral e pistilo, maceração com mixer, e sem maceração. Observou-se que
quando os frutos foram submetidos à maceração com mixer, houve maior
rendimento do que nos outros dois tratamentos (Tabela 2), reforçando a
importância de uma vigorosa maceração da matéria-prima para que se
obtenha uma maior quantidade de óleo. Provavelmente, a maceração
rompa as paredes celulares facilitando a extração do óleo.
Tabela 2: Efeito do tipo de maceração no rendimento (g%) de óleo
essencial de frutos de pimenta rosa, obtido por hidrodestilação
Tipo de maceração
Rendimento de óleo essencial
g%
Sem maceração
0,015±0,01
Maceração parcial (gral e pistilo)
1,83±0,88
Maceração com mixer
5,89±0,82
Dados expressos como média ±desvio padrão de três repetições .
O resultado obtido neste estudo utilizando a maceração com mixer
é semelhante ao obtido por Silva et al. (2005), que encontraram 5,09% de
76
rendimento de óleo essencial, quando a amostra de pimenta rosa foi
macerada, antes da extração.
De acordo com Bertoldi (2006) o teor médio de óleos essenciais
extraídos de frutos secos da pimenta rosa foi de 7% (v/p). Santos et al.
(2006) extraíram o óleo essencial de diferentes partes do vegetal (frutos,
folhas, e flores frescas de pimenta rosa) através da hidrodestilação
utilizando o Clevenger, por 1 hora. O teor médio encontrado ficou entre
0,15% e 0,17%. Assim, pode-se inferir que o teor de óleos essenciais
sofre grandes variações, dependendo da parte utilizada da planta, ou
ainda, que o período de extração utilizado por aqueles autores não foi
suficiente para extrair uma boa quantidade de óleos essenciais. Neste
trabalho, o rendimento final foi de 5,89 g/%, ficando abaixo da média de
7% obtido por Bertoldi (2006) e 8,5% obtido por Roveda et al. (2010), mas
acima do valor obtido por Silva (2005), de 5,09 g/%.
Vários fatores podem interferir na qualidade e quantidade de
substâncias presentes no óleo essencial, como características da região,
temperatura, índice pluviométrico, solo, umidade relativa, altitude, entre
outros fatores, pois estes afetam sua fisiologia e, consequentemente, a
síntese dos compostos (BERTOLDI, 2006). Roveda et al. (2010) relatam
que a quantidade de compostos voláteis é máxima antes da floração, na
sequência, há uma queda neste conteúdo, e quando a planta está em
semente, esta é mínima. Estes últimos autores citam, ainda, que se deve
levar em consideração a espécie estudada, local de coleta (ecotipos) e
variabilidade genética das plantas, que estão intimamente relacionadas
com a qualidade dos óleos essenciais, sendo expressa através de
quimiotipos.
O tempo de extração é outro fator que pode influenciar no
rendimento do óleo obtido. Conforme especificações da Farmacopéia
Brasileira (1988), o tempo máximo para extração de óleos essenciais dos
frutos de pimenta rosa deve ser de 5 horas, dessa forma, avaliou-se o
rendimento de hora em hora, até a quinta hora, de frutos maduros de
pimenta rosa, conforme pode ser visualizado na Tabela 3.
77
Tabela 3: Rendimento de óleos essenciais de frutos maduros de pimenta
rosa (Schinus terebinthifolius Raddi) em função do tempo de extração
empregado na hidrodestilação
Tempo de
Rendimento
extração
g h-1
1 hora
4,5098 a
4,5098
Frutos maduros
2 horas
0,6972 b
5,2070
de pimenta
3 horas
0,1835 c
5,3905
rosa
4 horas
0,1239 d
5,5144
5 horas
0,0095 e
5,5239
Amostra
g%
Dados expressos como média de três repetições. Médias seguidas pela mesma letra
não diferem estatisticamente entre si, ao nível de 5% de probabilidade.
Observou-se que o maior rendimento em óleo essencial ocorreu na
primeira hora de extração, portanto, se o objetivo for a obtenção de maior
quantidade de óleo essencial não é preciso, necessariamente, extrair por
4 ou 5 horas, economizando, assim, energia e tempo, diminuindo o custo
final do óleo. Já Bertoldi (2006) cita que o teor máximo de óleos
essenciais extraídos de frutos da pimenta rosa foi obtido em um período
de três horas, entretanto, não menciona o rendimento de hora em hora.
Silva et al. (2005) encontraram rendimento de óleo essencial de
sementes de pimenta rosa, na primeira hora de 1,95%, na segunda hora
3,72% e, com 4 horas, passou para 4,61%. Embora o rendimento
encontrado por esses autores seja menor do que o obtido neste estudo,
estes corroboraram a observação de que é na primeira hora que se extrai
maior quantidade de óleo: o rendimento passou de 1,95% na primeira
hora, para 1,77% na segunda hora e, na sequência houve uma queda
acentuada no rendimento.
Após determinação dos melhores parâmetros para extração de
óleo essencial de pimenta rosa, e de sua utilização para a obtenção do
óleo, esse foi submetido à caracterização.
O índice de refração de uma substância pura é uma constante, em
condições normais de pressão e temperatura, que pode ser usado como
78
um meio de identificação para sua pureza, como é o caso dos óleos
essenciais.
Os resultados da determinação do índice de refração e densidade
do óleo essencial extraído de frutos maduros e verdes de pimenta rosa
por hidrodestilação estão apresentados na Tabela 4.
Tabela 4: Índice de refração (23°C) e densidade (25°C) de óleos
essenciais obtidos de pimenta rosa madura e verde
Óleo essencial
Índice de refração (230C)
Densidade (25ºC)
g/cm3
Pimenta rosa madura
1,484 a
0,873 b
Pimenta rosa verde
1,484 a
0,864 b
Os valores apresentados na Tabela 4, para o índice de refração de
óleos essenciais de frutos de pimenta rosa maduros e verdes foram iguais
entre si (1,484), bem como iguais ao índice de refração citado pela
Farmacopéia Brasileira (1998), que é de 1,481, entretanto, esta
publicação não cita o tipo de frutos utilizados, se maduros ou verdes.
A qualidade do óleo essencial obtido é considerada um fator básico
importante e está vinculada a sua obtenção, fazendo com que a
realização de análises físicas sejam frequentes e constantes. Desse
modo, podem-se avaliar as suas características, prevenindo problemas
na sua comercialização, como a adulteração com compostos sintéticos de
baixo preço, mistura com óleos essenciais de baixa qualidade ou a adição
de solventes para aumentar o rendimento (VITTI e BRITO, 2003). Para
evitar estes tipos de problemas as análises químicas de índice de
refração e densidade são frequentementes utilizadas a fim de constatar
adulterações dos óleos com uma simples análise física.
Os valores encontrados para a densidade relativa de óleo
essencial de frutos de pimenta rosa, verdes e maduros, extraídos por
hidrodestilação, foram de 0,864 g/cm3 e 0,873 g/cm3, respectivamente
(Tabela 4). Estes valores são semelhantes aos obtidos por Bertoldi (2006)
que encontrou 0,854 g/cm3 usando solvente acetona, 0,856 g/cm3 com o
solvente etanol e 0,877 g/cm3 com éter de petróleo. Vale ressaltar que
79
embora os dados se aproximem bastante, os valores citados por Bertoldi
(2006), foram obtidos para oleoresina.
A composição dos óleos essenciais obtidos de vegetais pode ser
bastante variável e essa variação pode dever-se à própria planta da qual
foi obtido, como, também, a fatores ambientais ou ao ciclo fisiológico do
vegetal.
Tendo em vista que a variação na composição dos óleos
essenciais influencia diretamente nas características e nas propriedades
dos óleos obtidos, realizou-se a caracterização química dos óleos
essenciais obtidos de frutos de pimenta rosa maduros e verdes, através
de análise cromatográfica por CG/MS.
Na análise cromatográfica do óleo essencial dos frutos verdes de
pimenta rosa foram identificados 19 compostos, sendo o componente
majoritário o α-pineno (41,17%) seguido de δ-cadineno (10,21%) e Dgermacreno (8,56%), conforme demonstrado na Tabela 5 e Figura 15.
80
Tabela 5: Composição química do óleo essencial de frutos verdes de
pimenta rosa obtido por Clevenger modificado, determinada por
cromatografia gasosa acoplada ao espectrômetro de massa
Substâncias identificadas
Peso molecular (g.mL-1)
%
α-pineno
136,23
41,17%
β-pineno
136,23
0,91%
m irceno
136,23
0,58%
α-copaeno
204,35
1,19%
α-gurjuneno
204,35
1,28%
β-cubebeno
204,35
0,25%
trans-β-cariofileno
204,36
2,86%
neo-allo-ocimeno
136,23
0,41%
α-humuleno
204,35
0,67%
trans-β-farneseno
122,37
0,28%
α-amorfeno
204,37
0,37%
D-germacreno
135,55
8,56%
epi-biciclosesquifelandreno
204,35
0,43%
α-muuroleno
222,37
1,50%
biciclogermacreno
204,37
0,54%
δ-cadineno
204,35
10,21%
cis-calameneno
202,34
0,37%
palustrol
222,37
0,31%
viridiflorol
222.37
0,91%
81
Figura 10 - Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas
do óleo essencial de frutos verdes de pimenta rosa extraído por
Clevenger.
82
Figura 15 - Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas
do óleo essencial de frutos verdes de pimenta rosa extraído por
Clevenger (continuação).
83
No óleo ossencial de frutos maduros de pimenta rosa, foram
identificados 25 compostos. O componente majoritário foi o mirceno
(48,15%), seguido de D-germacreno (7,86%), δ-cadineno (6,43%) e αpineno (5,14%), conforme pode ser visualizado na Tabela 6 e Figura 16.
Roveda et al. (2010), analisando óleos essenciais de frutos maduros de
pimenta rosa, também por CG/MS, identificaram 19 compostos, com
predominância de monoterpenos, tendo como componente majoritário o
α-pineno (22,56%), seguido por sabineno (15,78%), z-salveno (10,69%),
β-pineno (10,52%), α-funebreno (8,82%) e limoneno (5,52%). Já Gehrke,
Stolz e Morel, (2008) observaram que os principais compostos
encontrados em frutos de pimenta rosa da região noroeste do Estado do
Rio Grande do Sul, foram os monoterpenos, α-3-careno e o α-pineno,
representando em torno de 40% dos constituintes.
Ressalta-se que nas condições estudada,
na cromatografia
gasosa de frutos maduros de pimenta rosa foram identificados maior
número de elementos químicos que no cromatograma da pimenta rosa
verde, o que pode ser devido à falta de alguns padrões para identificação,
uma vez que o número de padrões utilizados para os frutos maduros de
pimenta rosa foram os mesmos para frutos verdes.
84
Tabela 6: Composição química do óleo essencial de frutos maduros de
pimenta rosa obtidos por hidrodestilação, determinada por cromatografia
gasosa acoplada ao espectrômetro de massa
Substâncias identificadas Peso Molecular (g.mL-1)
(%)
α-pineno
136,23
5,14%
β-pineno
136,23
1,52%
sabineno
136,23
0,28%
mirceno
136,23
48,15%
limoneno
136,23
1,91%
Β-felandreno
136,23
0,77%
Α-copaeno
204,35
1,08%
Α-gurjuneno
204,35
0,77%
Β-cubebeno
204,35
0,35%
trans-β cariofileno
204,36
4,79%
alloaromadendreno
204,35
0,37%
γ-gurjuneno
204,35
0,28%
α-humuleno
204,35
0,66%
trans-β-farneseno
222,37
0,91%
135,55
7,86%
epibiciclosesquifela
204,35
0,56%
α-muuroleno
204,37
1,36%
biciclogerm acreno
204,37
0,41%
β-bisaboleno
222,37
0,23%
cis-α-bisaboleno
204,35
0,42%
δ-cadineno
204,35
6,43%
Β-sesquifelandreno
204,35
0,16%
cis-calameneno
202,34
0,47%
óxido de cariofileno
220,35
0,25%
222,36
0,67%
D-germacreno
viridiflorol
85
Figura 116 - Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de
Massas do óleo essencial de frutos maduros de pimenta rosa extraído por
Clevenger.
86
Silva et al. (2005) também analisaram o óleo essencial de pimenta
rosa por CG/EM e identificaram hidrocarbonetos monoterpênicos (αpineno,
β-pineno,
α-felandreno,
β-felandreno,
sabineno),
alcoóis
monoterpênicos (α-terpineol, cis e trans hidrato de sabineno) e
sesquiterpenos (carvacrol, δ-cadineno e α-gurjuneno). Os autores citam
que cromatograma foi realizado com óleo essencial extraído com hexano,
embora não citem as concentrações dos compostos encontrados, nem se
a amostra foi de frutos verdes ou maduros. Já Roveda et al. (2010),
avaliando óleo essencial de frutos de pimenta rosa maduros, através da
cromatografia gasosa, identificaram alguns elementos como α e β pineno,
limoneno, germacreno, δ gurjuneno, sabineno, que também foram
observados no óleo avaliado neste estudo, enquanto outros, como, Zsalveno, trieyeleno, α-fencheno, neo-iso-verbanol, 2-E-decenal, hidroxicitronelal, Z-patchenol, longieyeleno α funebreno, epizonareno e E-9epicaryophylleno, α-epi-Muurolol, não foram identificados neste trabalho.
A análise cromatográfica dos óleos essenciais de frutos verdes e
maduros de pimenta rosa permitiu verificar que essa matéria-prima
apresenta um teor importante em alcoóis, fenóis e aldeídos, além de
terpenos (α e β pinenos e limonenos), o que infere o potencial
antimicrobiano e antioxidante desse óleo, haja visto que essas
substâncias apresentam essas propriedades. Estes mesmos elementos
foram encontrados em trabalhos realizados por Novacosk e Torres
(2006), Souza et al. (2005), Cezarotto (2009) e Bertoldi (2006), os quais
citam que devido à riqueza química em fenóis, aldeídos e álcoois, os
óleos essenciais apresentam propriedades antissépticas.
Observa-se que a composição química de um óleo essencial
extraído de uma mesma espécie vegetal pode variar significativamente.
De modo geral, a frequente variação química de óleos essenciais obtidos
a partir de uma mesma espécie, é devido à alta complexidade química
dos óleos, que sofrem influência de vários fatores, tanto geográficos e
ecológicos (habitat), quanto pela variabilidade genética das plantas, que
está diretamente ligada com a qualidade dos óleos essenciais (ROVEDA
et al., 2010).
87
Em relação às análises dos óleos essenciais derivados dos frutos
verdes e maduros de pimenta rosa, foi verificada que na maioria dos
espectros de massas, foi confirmada a presença do íon molecular das
substâncias químicas presentes em quantidades majoritárias em cada
fração estudada. Os espectros de massas estão representados pelas
Figuras 15 e 16 (Ver os componentes majoritários e peso molecular nas
Tabelas 5 e 6).
Na Figura 17 se observam algumas estruturas químicas dos
componentes majoritários presentes nos óleos essenciais obtidos neste
estudo. Através delas se pode verificar se a substância apresenta
polaridade, qual o grupo químico importante, além de suas propriedades
físico-químicas, como por exemplo, se formam substâncias coloidais, se
apresentam reação ácida e de sabor adstringente, etc.
88
Figura 12 - Estrutura química dos componentes majoritários presentes no
óleo essencial de frutos verdes e maduros de pimenta rosa
Cezarotto (2009) analisou o D-germacreno do óleo essencial de
uma planta muito utilizada na medicina popular, que é a macela
(Achyrocline satureioides (Lam) DC), através de cromatografia gasosa. O
autor relata que hidrocarbonetos monoterpênicos, especialmente o αpineno, presentes nesse óleo, são responsáveis por suas propriedades
antimicrobianas. Dessa forma, como os óleos essenciais de frutos verdes
e maduros de pimenta rosa possuem α-pineno, em especial os frutos
verdes, onde este foi o componente majoritário (41,17%), apresentam
potencial para serem utilizados como antimicrobianos.
A atividade biológica de um óleo essencial depende de seus
constituintes químicos, em especial citral, pineno, cineol, cariofileno,
elemeno, furanodieno, limoneno, eugenol e carvacrol. Porém, é
importante ressaltar que devido à complexidade da composição química
de um óleo essencial, torna-se difícil relacionar a atividade biológica com
89
as substâncias presentes (SOUZA et al., 2005), pois os compostos
podem atuar em sinergismo, e, quando isolados, podem perder a sua
atividade biológica.
O método de Bligh-Dyer é bastante utilizado, tanto na sua forma
original, quanto com modificações, para a extração de lipídios, entretanto,
apresenta como desvantagem, a utilização de solventes tóxicos
(clorofórmio e metanol) para fazer a extração dos contaminantes nãolipidicos da fase orgânica. A vantagem apresentada por este método em
relação à extração a quente, é que esta técnica pode ser usada tanto em
material seco como para produtos com alto teor de umidade, extraindo
todas as classes de lipidios, inclusive os polares. Pode ser utilizado para
avaliação de deterioração dos lipídios através do índice de peróxido e
ácidos graxos livres, além de determinar a taxa de carotenóides, vitamina
E, composição de ácidos graxos e esteróis. Alguns desses compostos
podem ser degradados com o uso do calor, principalmente as vitaminas
(CECCHI, 1999).
Birch et al. (2001) encontraram rendimento para teor de lipídios de
pimenta rosa de 15% base seca e 12% base úmida, embora não citem o
método utilizado na extração. Santos et al. (2006), extraindo lipídios
dessa mesma matéria-prima, obtiveram rendimento de 22,93%, com o
uso de álcool e água destilada como solventes. Neste estudo, obteve-se
rendimento de 10,77% utilizando apenas o método de Bligh-Dyer, inferior
ao obtido por Birch et al. (2001).
Sganzerla (2010) utilizou ultrassom na extração de oleoresina de
amêndoas de butiás e observou aumento significativo no teor de óleo
extraído, quando comparado com o método sem o ultrassom. A utilização
de ultrassom em reações orgânicas vem aumentando nos últimos anos,
devido às vantagens apresentadas por esta técnica, como a redução do
tempo de reação, menor consumo de energia, menor quantidade de
solventes utilizados, e aumento no rendimento das reações (CINTAS e
LUCHE, 1999; CRAVOTTO e CINTAS, 2006). Dessa forma, testou-se o
ultrassom combinado com o método de Bligh-Dyer, e observou-se que o
rendimento médio subiu para 18,07% (Tabela 7). Observa-se que quando
90
se utilizou o ultrassom, o rendimento foi superior ao relatado por Birch,
Fenner, Watkins e Boyd (2001).
Tabela 7: Teor de oleoresina (g%) extraída pelo método de Bligh-Dyer,
sem e com a utilização de ultrassom
Sem ultrassom
Com ultrassom
10,77% ±1,1334 b
18,07% ±0,8004 a
Frutos maduros de
pimenta rosa
Valores médios obtidos de três extrações ± desvio padrão. As médias seguidas pela mes ma letra não diferem
estatisticamente entre si, ao nível de 5% de probabilidade.
O aumento da eficácia da extração de lipídios quando se usa
ultrassom, se deve aos efeitos de cavitação e agitação produzidas por
ondas sonoras no solvente, bem como a atuação dos solventes utilizados
(ZHANG et al., 2008), os quais rompem as paredes das células vegetais,
facilitando a remoção de lipídios contidos no seu interior. Quanto maior o
dano à estrutura das células, melhor a extração de óleo, e maior é o
rendimento (Tabela 7). Quando os frutos permanecem na sua forma
íntegra, quase não se observa extração de óleo, mas quando há o
rompimento
celular,
isto
favorece
a
saída
de
lipídios
e,
consequentemente, aumenta o rendimento final. Este método de extração
é rápido, fácil e o rendimento de oleoresina encontrado aumentou
consideravelmente quando se utilizou o ultrassom.
A Tabela 8 mostra o rendimento da extração de oleoresina de
frutos maduros de pimenta rosa, utilizando dois métodos distintos (a frio e
com Soxhlet) com sete diferentes solventes.
91
Tabela 8: Resultados da extração de oleoresina de frutos maduros de
pimenta rosa, a frio e com o uso de calor (Soxhlet)
Rendimento em
Rendimento em
oleoresina extraído a
oleoresina extraído
frio (g/%)
com Soxhlet (g/%)
Acetona
15,97±0,63 c
19,98±0,65 c
Éter etílico
10,00±1,08 e
16,33±,1,14 d
Éter de petróleo
7,75±0, 48 e
15,45±1,83 d
Clorofórmio
12,66±1,52 d
16,73±0,67 d
Álcool etílico
22,96±0,93 b
26,29±2,45 b
Metanol
33,84±1,05 a
37,29±1,18 a
Hexano
3,58±0,76 f
7,88±1,27 e
Solvente
Dados expressos como médias ± desvio padrão de três repetições. As médias seguidas
pela mesma letra não diferem entre si, pelo teste t (p≤0,05).
Houve diferença de rendimento na extração de oleoresina de frutos
de pimenta rosa, tanto em função da técnica empregada (a quente ou a
frio), como pelo tipo de solvente utilizado (éter etílico, hexano ou éter de
petróleo). O uso de Soxhlet proporcionou um rendimento maior de
oleoresina, do que quando os solventes foram utilizados a frio (Tabela 8).
O efeito da temperatura na extração é um diferencial, que pode ser
observado quando se compara a técnica com uso de calor em relação à
técnica a frio, assim como se deve levar em consideração a interação
entre os lipidios e o solvente. A diferença no rendimento de extração pode
ser devida às distintas temperaturas de ebulição dos solventes
empregados, pois o etanol possui elevada temperatura de ebulição
(78oC), comparado ao hexano (69oC) e ao éter de petróleo (60oC).
Quando se compara as duas técnicas com o mesmo solvente, observa-se
que o metanol foi mais eficiente com o uso do Soxhlet do que a frio, o que
pode ter ocorrido por causa da degradação de compostos termolábeis. A
temperatura interfere na capacidade de dissolução de certos compostos
em relação a determinados solventes. À medida que aumenta a
temperatura ocorre a solubilização de alguns compostos no solvente,
92
aumentando a eficiência da extração. Além disso, a agitação do solvente
pelo calor também pode favorecer a extração (BERTOLDI, 2006).
O metanol foi o solvente mais eficaz, por ambos os métodos,
extraindo-se 33,84g% de oleoresina quando a extração foi realizada a
frio, e 37,29g%, com Soxhlet. O segundo melhor solvente para a extração
de oleoresina de frutos de pimenta rosa, foi o etanol, com o qual se
obteve 22,96g% e 26,29g% de rendimento, após extração a frio e com
Soxhlet, respectivamente. Bertoldi (2006) cita que obteve o melhor
rendimento quando realizou extração com etanol, seguido de acetona,
porém, este autor não utilizou metanol. Com relação ao método de
extração, Bertoldi (2006) observou que as oleoresinas são melhor
extraídas com o uso de Soxhlet, do que quando extraídas a frio, o mesmo
observado neste estudo.
Os rendimentos de oleoresina extraída com Soxhlet utilizando os
solventes acetona, éter etílico, clorofórmio e metanol foram de 25,11%,
63,3%, 32,14% e 10,19% maiores que a frio, respectivamente (Tabela 8),
demonstrando que há influência da temperatura no rendimento de
extração de oleoresina e que esta é diferente para cada tipo de solvente.
No caso do solvente hexano, o rendimento a quente foi 120,1% maior do
que a frio. É importante ressaltar que praticamente todos os constituintes
de interesse para a análise de fitoquímicos apresentam alguma
solubilidade nos solventes testados neste estudo, entretanto, para serem
empregados rotineiramente, deverão, antes, serem testados para verificar
a ausência de toxicidade e segurança, para sua utilização na rotina
extrativa.
O metanol foi o solvente mais eficaz nos dois métodos de extração
testados (Soxhlet e a frio), seguido de álcool etílico e acetona. Com
relação ao éter etílico e ao éter de petróleo, não houve diferença
significativa nos rendimentos obtidos quando utilizados a quente ou a frio,
evidenciando que neste último caso o uso de calor não aumentou a
solubilização dos compostos presentes nos frutos de pimenta rosa. Já
Salvi Jr (2009), extraindo a oleoresina de folhas de pimenta rosa, obteve
melhor rendimento utilizando etanol, seguido de acetato de etila,
93
entretanto não utilizou o metanol como o solvente e não extraiu
oleoresina de frutos e sim das folhas.
Tendo em vista que diversos fatores podem fazer variar a
composição da oleoresina, é importante, antes da cromatografia, realizar
a derivatização desse lipídio para tornar as substâncias mais voláteis para
serem identificadas pelo sistema FID (Flame Ionization Detector). Dessa
forma, se obtiveram os ésteres metílicos que foram submetidos à análise
cromatográfica, a fim de determinar quais os ácidos graxos presentes na
amostra de oleoresina de frutos de pimenta rosa madura. Na Tabela 9,
observa-se a presença de nove ácidos graxos, dos 14 presentes no
padrão
(percentagem
em
relação
à
amostra
derivatizada).
A
concentração de ácidos graxos foi determinada em relação à amostra,
sendo um total de 22,90% identificados. Pode-se observar, pela Figura 18
e 19, que muitos picos não foram identificados no cromatograma. O perfil
de ácidos graxos demonstra que os ácidos oléico (13,699%) e palmítico
(6,534%) são os majoritários, sendo o ácido oléico, o componente lipídico
presente em maior quantidade. A identificação do perfil lipídico é
importante, tendo em vista que as propriedades físico-quimicas dos
triacilgliceróis
e
suas
aplicações
tecnológicas
estão
diretamente
relacionadas com a sua composição, com o tamanho da cadeia estrutural,
grau e posição das insaturações (SUNDRAN, 1997; ONG e GOH, 2002).
Destaca-se que a análise foi em relação à amostra. Quando a
análise é em relação ao ácido graxo, considerando 100% de ácidos
graxos, a maior quantidade foi de ácido oléico (60,505%), seguido de
palmítico (27,942%), esteárico (6,164%), ácido linolênico (1,494%),
palmitoleico (1,127%), e o restante foram elementos traços com menos
de 1% cada um. Estes dados nos permitem ampliar o conhecimento
sobre os componentes lipídicos presentes na oleoresina, particulamente
de frutos de pimenta rosa, uma vez que os ésteres de ácidos graxos e
seus derivados são utilizados nas indústrias alimentícias, farmacêuticas e
cosméticas, por apresentam baixa toxicidade e serem biodegradáveis.
Ésteres de cadeia curta são importantes flavorizantes e aromatizantes
usados nos alimentos, enquanto os ésteres de cadeia longa estão sendo
pesquisados com o objetivo de serem utilizados na produção de biodiesel
94
e de ceras para indústria oleoquímica (GULATI et al., 1998 e LARIOS et
al., 1998).
Tabela 9: Composição em ácidos graxos (%) da oleoresina do fruto
maduro de pimenta rosa, obtida por extrato hexanóico em Soxhlet
Concentração em
Ácido graxo
relação a amostra
(%)
Concentração de ácido
graxo (%)
Laurico (C 12:0)
0,141
0,516
Palmítico (C 16:0)
6,534
27,942
Palmitoleico (C 16:1)
0,283
1,127
Esteárico (C 18:0)
1,398
6,164
Oléico (C18:1)
13,699
60,505
Linoléico (C18:2)
0,162
0,686
Linolênico (C 18:3)
0,338
1, 494
Araquídico (C 20:0)
0,190
0,838
Behenico (C 22:0)
0,164
0,727
Total
22,909
100,0
C – representa carbonos, seguido de sua quantidade e número de insaturações.
95
Figura 13 - Cromatograma de ésteres de ácidos graxos de frutos maduros de pimenta
rosa, equipado com coluna de polietileno, 30m de comprimento, 0,32 de diâmetro e
espessura 0,25μm, e como gás de arraste o He, levando em consideração a
concentração de ácido graxo (100%)
Figura 14 - Cromatograma de ésteres de ácidos graxos de frutos maduros de pimenta
rosa, 30 m de comprimento, diâmetro de 0,32mm e espessura de 0,25μm, gás de arraste
o He, levando em consideração a concentração de ácido graxo em relação à amostra
(22,909%)
96
A relação encontrada foi de cinco (5) ácidos graxos saturados para
quatro (4) de ácidos graxos insaturados, entretanto, quando se considera
a percentagem (%) de ácidos, verifica-se que 63,22% são ácidos graxos
insaturados e 36,78% são ácidos graxos saturados. O ácido oléico, que
foi
aquele
presente em maior
quantidade,
é um ácido graxo
monoinsaturado, do grupo ômega 9 (ω-9), presente nos óleos vegetais
como o azeite de oliva, que exerce ação benéfica no controle de
problemas cardiovasculares.
Na determinação da atividade antioxidante, utilizando a técnica do
radical DPPH, este reage com o antioxidante, transformando-o em sua
forma reduzida. O DPPH na sua forma oxidada é violeta, porém, na sua
forma reduzida, torna-se amarelada,
sendo o grau de descoramento
verificado através de espectrofotometria. O descoramento indica que a
substância tem a capacidade de sequestrar o radical livre. A capacidade
do antioxidante de sequestrar metade dos radicais livres DPPH presente
na solução, é expressa em EC50, e quanto menor o valor de EC50 da
substância em estudo, menor quantidade do extrato será necessária para
reduzir 50% do radical livre DPPH, e consequentemente, maior será a
sua atividade antioxidante (LIMA, 2008).
Os valores de EC50 para cada extrato estão apresentados na
Tabela 10. O valor EC50 representa uma forma de expressar a atividade
antioxidante pelo ensaio do radical DPPH, sendo um valor numérico que
demonstra a quantidade de amostra necessária para reduzir em 50% a
quantidade de radicais livres DPPH presente no meio, no início da
reação, isto é, EC50 é a concentração do extrato com 50% de atividade
antioxidante. O EC50 (concentração de antioxidante capaz de reduzir a
50% da concentração inicial do radical livre DPPH•) é inversamente
relacionada com a habilidade de doar hidrogênio) (ZERAIK et al., 2008).
97
Tabela 10: Valores de EC50 para o extrato aquoso, etanólico e cetônico
de frutos maduros de pimenta rosa
Extrato de pimenta
rosa madura
EC50 mg.L-1
EC50 g pimenta/g
DPPH
Extrato aquoso
0,1174
0,0170
Extrato etanólico
0,1253
0,0206
Extrato cetônico
0,1666
0,0241
Tabela 11: Valores de EC50 para o óleo essencial de pimenta rosa verde
e madura
Óleo essencial de
pimenta rosa, verde e
EC50 mg.L-1
madura
Extrato etanólico de
Pimenta rosa verde
Extrato
cetônico
de
Pimenta rosa madura
EC50 g de pimenta/g
DPPH
0,7
0,1131
1,0982
0,2357
É possível observar (Tabela 10) que o extrato aquoso foi o que
apresentou menor valor de EC50, seguido do extrato etanólico e,
finalmente, do extrato cetônico, indicando que o extrato aquoso é aquele
que resulta numa atividade antioxidante maior, quando comparado com
os outros dois extratos. Em relação ao óleo essencial da pimenta rosa,
observou-se que o extrato etanólico de pimenta rosa verde apresentou
menor valor de EC50, demonstrando maior atividade antioxidante, quando
comparado ao extrato cetônico da pimenta rosa madura, conforme pode
ser visuailzado na Tabela 11.
98
Oliveira e Sawaya (2008), utilizando DPPH, encontraram valores
de EC50 para folhas de pitanga de 0,040 mg de DPPH em água e
0,114mg de DPPH em etanol. Para sementes de pitanga em água o valor
foi de 0,041mg e, em etanol, de 0,032mg, indicando menores valores de
EC50 e, consequentemente, maior atividade antioxidante.
Os valores
encontrados para óleo essencial de pitanga demonstram que a sua
atividade antioxidante é muito elevada, o que também pode ser
observado com o extrato aquoso e etanólico de pimenta rosa neste
trabalho, conforme visualizado nas Tabelas 10 e 11.
O óleo essencial de frutos de pimenta rosa verde, apresentou
atividade sequestrante de radicais DPPH e seu valor de EC50 foi de
0,1131, expresso em g de pimenta rosa verde / g de DPPH. O óleo
essencial de pimenta rosa madura, também apresentou atividade
sequestrante, mas o seu valor foi maior (0,2357).
A amostra extraída com água ultra pura (Milli-Q), quando
comparada com outras extrações, foi a que apresentou menor valor de
EC50, indicando maior atividade antioxidante. Comparando o extrato de
pimenta rosa in natura
com o do óleo essencial, ambos etanólicos,
verificou-se um valor de EC50 menor para o extrato de pimenta rosa. O
mesmo ocorreu com o extrato cetônico da pimenta rosa in natura que
apresentou um valor menor de EC 50, quando comparado com o extrato
cetônico do óleo essencial.
Aparentemente,
as
substâncias
com atividade
antioxidante
presentes nas diferentes amostras de pimenta rosa são solúveis, tanto
em água, como em etanol e acetona, sendo extraídas de forma
diferenciada por estes três solventes.
Os responsáveis pela atividade
antioxidante das plantas são os polifenóis (BERTOLDI, 2006), que
apresentam, também, atividade biológica, antibacteriana, anti-inflamatória
e antiviral. Dessa forma, podemos deduzir que no extrato aquoso de
pimenta rosa in natura o teor de polifenóis esteja presente em maior
concentração, doando os hidrogênios, e neutralizando os radicais de
oxigênio. Entretanto, em todos os extratos temos atividade antioxidante
agindo, em quantidades diferentes, mas sempre presentes, evitando
assim o estresse oxidativo.
99
Comparando os resultados de EC50 obtidos com pimenta rosa com
os de referências consultadas, verifica-se que para polpa de fruto de
maracujá foi de 57,94; para chá mate de 1,42, para resveratrol (padrão),
de 0,30 e para rutina (padrão), de 0,09 (ZERAIK et al., 2008). Os valores
de EC50 foram calculados pela equação do gráfico de % DPPH
sequestrados em função da concentração das amostras. Pode-se verificar
que os frutos de pimenta rosa apresentam uma boa atividade antioxidante
quando comparados com os de referência, entretanto, faltam outros
estudos para que se possa comparar os valores de EC50 desse estudo
com óleo essencial ou extrato bruto de pimenta rosa avaliado em outros
estudos.
A atividade antimicrobiana dos óleos essenciais pode ter
aplicações como conservantes nas indústrias farmacêuticas, alimentícias,
ou como uma alternativa medicinal em terapias naturais. Nesse sentido, o
óleo essencial de pimenta rosa obtido por hidrodestilação foi testado
frente a diferentes micro-organismos tanto, Gram-positivos como Gramnegativos.
A avaliação qualitativa, realizada através da técnica de difusão em
ágar, demonstrou que o óleo essencial de frutos maduros de pimenta
rosa, apresenta atividade antimicrobiana, conforme verificado na Tabela
12.
Atualmente, pouco se sabe sobre o modo de ação dos óleos
essenciais em extratos alcoólicos nas células microbianas, o que
sabemos é que afeta o sistema de troca da membrana, isto pode ser
devido à ação do óleo diluído que atinge mais facilmente a célula, pois
torna mais fácil a sua difusão no meio de cultura contendo ágar (COX et
al., 2000).
Observou-se que houve inibição dos micro-organismos alvo, o que
é demonstrado pela formação de halos em volta dos poços onde foram
depositadas as soluções testadas. Esses resultados corroboram o
trabalho de Lima et al. (2004), que avaliaram o extrato aquoso de pimenta
rosa frente as bactérias S.aureus, S. epidermidis, B. cereus e P.
aeruginosa, e verificaram que todas mostraram sensibilidade a esse óleo
essencial. Da mesma forma, Santos (2007) cita que os extratos
100
hidroalcoólicos de pimenta rosa apresentaram atividade contra S. aureus,
P. aeruginosa, E. coli e B. subtilis. É interessante destacar que o óleo
essencial de frutos de pimenta rosa madura, apresentou atividade
antimicrobiana tanto em bactérias Gram-negativas (E. coli e S.
Typhimurium),
quanto
em
Gram-positivas
(S.
aureus
e
L.
monocytogenes).
Santos (2007) estudou a CIM do extrato obtido de cascas de
pimenta rosa, tratadas por autoclave a 121oC por 15 minutos, e verificou
os resultados através dos halos de inibição, em termos do diâmetro da
zona de inibição, e classificou: ˂9mm, inativo; 9-12 mm parcialmente
ativo; 13-18mm ativo, ˃18 mm muito ativo.
Tabela 12: Atividade antimicrobiana do óleo essencial de frutos maduros
de pimenta rosa obtido por hidrodestilação, avaliada pelo método da
difusão em ágar
Micro-organismos
Halo de inibição em mm (10µL)
E. coli ATCC 11775
17±0,0632
S. aureus ATCC 23235
21±0, 0547
S. Thyphimurium ATCC 94
15±0,1341
L. monocytogenes ATCC 7644
15±0,0132
dados expressos como médias, ± desvio padrão de três repetições
Qualitativamente os resultados obtidos no presente trabalho
mostram que a pimenta rosa promoveu inibição no crescimento das
bactérias estudadas, com zonas de inibição entre 15 e 21 mm de
diâmetro, com média de 17 mm, S. aureus foi a bactéria que apresentou
maior sensibilidade com o halo de inibição de 21 mm de diâmetro, sendo
esta, portanto, considerada muito ativo, segundo a classificação de
Santos (2007). Alcântara et al. (2006), estudando o extrato da casca de
pimenta rosa, também demonstraram o seu efeito inibitório sobre S.
aureus. Da mesma forma Guerra et al. (2000), estudando o extrato
etanólico a 80% de casca da aroeira, observaram que esta apresentou
101
atividade antimicrobiana contra E. coli, P. aeruginosa, S. aureus e
Candida albicans, apresentando ação até a concentração de 1%.
Salienta-se que esses autores utilizaram o óleo essencial do caule da
pimenta rosa, diferentemente deste estudo, que utilizou óleo essencial de
frutos maduros dessa planta.
A técnica de difusão em ágar utilizada é um ensaio preliminar e
tem a
vantagem de gerar
informações prévias sobre a ação
antimicrobiana de determinadas substâncias, como óleos essenciais,
antibióticos, extratos vegetais, fornecendo dados qualitativos. No entanto,
devido à natureza química (hidrofílica ou lipofílica) dos compostos
naturais, nem sempre ocorre a difusão uniforme destas substâncias
através do meio contendo ágar (LAMBERT, SKANDAMIS e COOTE,
2001).
Óleos essenciais de outros vegetais também têm demonstrado
ação antibacteriana. O óleo essencial de orégano, por exemplo, contém o
timol, cujo composto fenólico apresenta ação sobre a célula bacteriana.
Mendonça (2004), por exemplo, descreve que o óleo essencial de
orégano apresentou ação antibacteriana na concentração de 5%, contra
S.aureus.
A CIM de uma substância é aquela concentração na qual não há
crescimento do micro-organismo alvo, após 24 horas de incubação.
A CIM do óleo essencial de pimenta rosa obtido por hidrodestilação
contra os micro-organismos alvo testados neste estudo, pode ser
visualizada na Tabela 13.
A determinação da CBM foi realizada retirando-se uma alíquota de
5μL dos poços onde não ocorreu crescimento microbiano visível na
técnica de CIM, semeando-se em ágar Mϋller-Hinton, e incubando-se à
temperatura de 37oC por 24horas. A CBM foi considerada como a menor
concentração de óleo essencial de pimenta rosa na qual n ão houve
crescimento dos micro-organismos no ágar Mϋller-Hinton. Alcântara et al.
(2006) estudando o extrato da casca do caule da aroeira obteve o valor
de 6,25% para a concentração inibitória mínima (CIM) testando em
Staphylococcus aureus, um dado que não podemos comparar pois o
102
extrato foi removido de outra parte da planta, não citando o método de
extração.
Tabela 13: Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração
Bactericida Mínima (CBM) do óleo essencial de pimenta rosa extraído de
frutos maduros, com Clevenger por hidrodestilação
Concentração
Concentração
Inibitória Mínima
Bactericida Mínima
(Bacteriostático)
(Bactericida)
(CIM) μg.mL-1
(MBC) μg.mL-1
5,46
10,92
E.coli ATCC 11775
2,73
5,46
S.aureus ATCC 23235
10,92
21,84
2,73
5,46
S. Thyphimurium
ATCC
94028
Listeria
monocytogenes
ATCC 7644
CIM - Concentração Inibitória Mínima
MBC - Concentração Bactericida Mínima
De acordo com os resultados apresentados na Tabela 13, observase que o óleo essencial de pimenta rosa madura, apresentou os valores
de CIM e CBM de 2,73 μg.mL-1 e 5,46 μg.mL-1 respectivamente, para as
bactérias E. coli, e L. monocytogenes. Já para a bactéria S.
Thyphimurium, o valor de CIM e de CBM foram de 5,46 μg.mL-1 e 10,92
μg.mL-1 e, para S. aureus o valor encontrado foi de 10,92 μg.mL-1 e
21,84 μg.mL-1, respectivamente. Estes valores indicam que é necessário
uma maior concentração de óleo essencial de frutos maduros de pimenta
rosa para agir como bacteriostático ou bactericida para S. aureus, do que
103
para as outras bactérias avaliadas neste estudo. Destaca-se que para L.
monocytogenes e E. coli, duas bactérias de grande importância em
alimentos, uma baixa concentração já provoca a inibição e morte
bacterianas, demonstrando o potencial de uso desse óleo como antibacteriano em alimentos.
Salvi Jr. (2009) avaliou a atividade antibacteriana e a CIM do
extrato etanólico de aroeira, frente a diversas bactérias. Com relação, a E.
coli e a, S.aureus, encontrou valores para o CIM de 62,5μg.mL-1 e
125μg.mL-1,
respectivamente,
que
são
valores
superiores
encontrados no óleo essencial de pimenta rosa avaliado neste estudo.
aos
104
7 CONCLUSÕES

O estágio de maturação interfere em características físico-químicas de
frutos de pimenta rosa (Schinus terebinthifolius Raddi), com o fruto
verde apresentando quase o dobro de umidade, em relação ao
maduro. Já o teor de cinzas foi maior para frutos maduros. O pH não
variou entre as amostras.

O óleo essencial de frutos de pimenta rosa pode ser extraído por
hidrodestilação utilizando Clevenger modificado, com um rendimento
médio de 5,52%, sendo a maior quantidade de óleo essencial extraída
na primeira hora.

O índice de refração e a densidade do óleo essencial de frutos
maduros e verdes não apresentaram diferenças significativas entre si.

A análise cromatográfica acoplada à espectrometria de massas
(CG/MS) do óleo essencial de frutos verdes de pimenta rosa
demonstrou ter constituintes diferenciados da pimenta rosa madura.
Em frutos maduros identificou-se 25 diferentes compostos, sendo o
mirceno encontrado em maior quantidade. Em frutos verdes foram
identificados 19 compostos, sendo o α-pineno o componente
majoritário. Com relação ao espectro de massas foi confirmada a
presença
do
majoritárias;
íon
molecular
correspondente
às
substâncias
105

A técnica de Bligh-Dyer permite a extração de oleoresinas e a
quantidade extraída aumentou quando foi acoplada ao ultrassom.

O uso de diferentes métodos de extração (Soxhlet e a frio) e de
diferentes solventes teve influência no rendimento final de oleoresina,
sendo que no método de Soxhlet o rendimento foi maior que a frio, e o
melhor solvente foi o metanol.

A oleoresina pode ser extraída de frutos de pimenta rosa, utilizando
tanto solventes polares como apolares, e temperaturas de ebulição
podem auxiliar na remoção destes óleos. O binômio tempotemperatura deve ser otimizado para cada solvente utilizado.

Dos compostos identificados na oleoresina de pimenta rosa madura, a
maioria é de ácidos graxos saturados, entretanto, o ácido oleico (ω-9)
foi o componente majoritário.

O óleo essencial de pimenta rosa apresentou atividade antioxidante
tendo maior atividade no extrato aquoso, seguido de extrato etanólico
e, posteriormente, com extrato cetônico.

O óleo essencial de pimenta rosa apresenta atividade antimicrobiana
para bactérias de importância em alimentos, tanto para Grampositivas, quanto para Gram-negativas. Tanto a E.coli como a
L.monocytogenes
não diferiram quanto aos
-1
-1
valores de CIM
(2,73μg.mL ) e MBC (5,46 μg.mL ), mas diferiram das demais
bactérias estudadas.
106
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