ISSN 1808-9909
Volume 3, Número 1, 2007
PLANT CELL CULTURE
&
MICROPROPAGATION
Cultura de Células
&
Micropropagação de Plantas
Publicação Científica da Associação Brasileira
de Cultura de Tecidos de Plantas
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, MG, v. 3, n. 1, p. 1-54, 2007
A revista “Plant Cell Culture & Micropropagation”, editada semestralmente pela Editora da
Universidade Federal de Lavras (Editora UFLA), publica artigos científicos da área de cultura de tecidos
de plantas por membros da comunidade científica nacional e internacional. Com uma tiragem de 600
exemplares é distribuída aos membros da ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE CULTURA DE
TECIDOS DE PLANTAS (ABCTP) em dia com a anuidade.
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A revista “Plant Cell Culture & Micropropagation” deseja fazer permuta com revistas de áreas afins.
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Efeitos genéticos e de ambiente em um rebanho...
ISSN 1808-99091
Plant Cell Culture & Micropropagation
CONTEÚDO
Beneficial effect of abscisic acid on soybean somatic embryo maturation and conversion into
plants.
Efeito benéfico do ácido abscísico sobre a maturação de embriões somáticos de soja e a conversão em
plantas.
Ricardo Luís Mayer Weber, Ana Paula Körbes, Daniel Antunes Baldasso, Sidia Maria Callegari-Jacques,
Maria Helena Bodanese-Zanettini, Annette Droste.................................................................................................
1
Propagação in vitro de bananeira ‘Prata anã (AAB)’: intensidades luminosas e concentrações de
sacarose nas fases de multiplicação e enraizamento.
In vitro propagation of banana ‘Prata anã’: light intensities and sucrose concentrations during
multiplication and rooting phases.
Hermínio Souza Rocha, Carlos Ramirez de Rezende e Silva, Aparecida Gomes de Araújo, Adriano
Bortolotti da Silva.......................................................................................................................................
10
Resposta à adubação NPK de mudas micropropagadas de abacaxizeiro cv. pérola em fase de
aclimatização.
NPK fertilization of micropropagated pineapple plant cv pérola on aclimatization phase.
Maria Aparecida Moreira, Janice Guedes de Carvalho, Chrystiane Borges Fráguas, Moacir Pasqual.........
17
Efeito de pré-tratamentos em botões florais e do TDZ no cultivo in vitro de anteras de
cafeeiro (Coffea arabica L.).
Effect of pre-treatments in flower buds and TDZ in vitro culture in anthers of coffee (Coffea arabica L.).
Elisângela Rodrigues Figueira, Luciana Nogueira Londe, Raquel Viegas Marques, Soraia Viegas Marques,
Adelaide Siqueira Silva, José Magno Queiroz Luz.................................................................................................
23
Crescimento in vitro de gloxínia em diferentes formulações minerais e concentrações de sacarose.
In vitro growth of gloxinia in different mineral formulations and sucrose concentrations.
Aparecida Gomes de Araujo, Leila Aparecida Salles Pio, Moacir Pasqual, Alba Regina Pereira, Fabíola Villa......
29
Indução de calos in vitro de paricá (Schizolobium amazonicum Huber ex Ducke).
In vitro induction of callus of Schizolobium amazonicum Huber ex Ducke.
Iracema Maria Castro Coimbra Cordeiro, Osmar Alves Lameira, Selma Toyoko Ohashi, Lana Roberta
Sousa Reis...................................................................................................................................................................................
35
Aclimatização ex vitro de abacaxizeiro ornamental em substratos à base de pó-de-coco.
Ex vitro acclimatization of ornamental pineapple (Ananas comosus va. erectifolius) in substrates composed
of coir powder.
Guilherme Vieira do Bomfim, Ana Cristina Portugal Pinto de Carvalho, Fred Carvalho Bezerra,
Benito Moreira de Azevedo, Thales Vinícius de Araújo Viana, Kárcia Manoela Arruda Silva de Oliveira........
41
COMUNICAÇÃO CIENTÍFICA
Avaliação dos níveis de contaminação microbiana, em Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas.
Evaluation of microbial contamination level in a Plant Tissue Culture Laboratory.
Olienaide Ribeiro de Oliveira, Daniel Terao, Ana Cristina Portugal Pinto de Carvalho,Elisangela
Maria dos Santos, Jefté Ferreira da Silva, João Paulo Saraiva Morais................................................
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 1-54, 2007
49
2
SILVA, M. V. G. B. et al.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 1-54, 2007
BENEFICIAL EFFECT
OF
ABSCISIC
ACID
SOYBEAN SOMATIC1
Beneficial
effect
of abscisic acid on
soybeanON
somatic...
EMBRYO MATURATION AND CONVERSION INTO PLANTS
EFEITO BENÉFICO DO ÁCIDO ABSCÍSICO SOBRE A MATURAÇÃO DE
EMBRIÕES SOMÁTICOS DE SOJA E A CONVERSÃO EM PLANTAS
RICARDO LUÍS MAYER WEBER1, ANA PAULA KÖRBES2, DANIEL ANTUNES BALDASSO3,
SIDIA MARIA CALLEGARI-JACQUES4, MARIA HELENA BODANESE-ZANETTINI 5, ANNETTE DROSTE6*
1
Mestrando, Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul/UFRGS –
Av. Bento Gonçalves, 9500 – Agronomia – 91501-970 – Porto Alegre, RS –[email protected]
2
Mestre em Genética e Biologia Molecular – Universidade Federal do Rio Grande do Sul/UFRGS – Departamento de Genética – Av
Bento Gonçalves 9500 – Prédio 43323 – Agronomia – 91501-970 – Porto Alegre, RS – [email protected]
3
Graduado em Ciências Biológicas – Universidade do Vale do Rio dos Sinos – Av. Unisinos, 950 – Laboratório de Cultura de Tecidos
Vegetais, sala 2D 212 – Cristo Rei – Cx. P. 275 – 93022-000 – São Leopoldo, RS – [email protected]
4
Dra. em Ciências, Professora Titular – Universidade Federal do Rio Grande do Sul/UFRGS – Av. Bento Gonçalves 9500 – Prédio 43-323 –
Agronomia – Cx. P. 15053 – 91501970 – Porto Alegre, RS – [email protected]
5
Dra. em Ciências, Professora Titular – Universidade Federal do Rio Grande do Sul/UFRGS – Av. Bento Gonçalves – 9500 – Prédio
43-323 – Agronomia – Cx. P. 15053 – 91501970 – Porto Alegre, RS – [email protected]
6*
Dra. e Ciências (Genética), Professora Adjunta, Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais – Universidade do Vale do Rio dos Sinos –
Cx. P. 275 – 93022-90 – São Leopoldo, RS – [email protected]
ABSTRACT
The effect of abscisic acid (ABA) on soybean [Glycine
max (L.) Merrill] somatic embryogenesis, embryo development,
histodifferentiation, germination and conversion into plants was
investigated. Two experiments were performed. In both
experiments, ABA (50 M) was applied at two different stages
of embryogenic cultures of cultivar IAS-5; namely, at embryo
globular stage on proliferation medium and at the
histodifferentiation stage on maturation medium. In Experiment
I, the number of histodifferentiated embryos was significantly
reduced in the both treatments with ABA on proliferation medium,
independently of the presence/absence of ABA on the maturation
medium. On the other hand, germination and conversion
percentages were significantly enhanced when ABA was added
to both proliferation and maturation medium. The frequency of
dicotyledonous, monocotyledonous and polycotyledonous
embryos was higher when ABA was applied to these two media.
Data obtained in Experiment II confirmed higher conversion
frequency when embryos were treated with ABA at the globular
and histodifferentiation stages. The high conversion frequency
of ABA treated embryos was related to morphological types.
The conversion percentages of dicotyledonous,
monocotyledoneous and polycotyledonous embryos were 3 fold
higher than those of the remaining morphological classes.
Index terms: Glycine max, somatic embryogenesis, embryo
morphologies, growth regulation, histodifferentiation, soybean.
RESUMO
O efeito do ácido abscísico (ABA) sobre a embriogênese
somática de soja [Glycine max (L.) Merrill], o desenvolvimento,
a histodiferenciação e a germinação de embriões e sua conversão
em plantas foi investigado. Dois experimentos foram conduzidos.
Em ambos os experimentos, ABA (50 M) foi aplicado em dois
diferentes estádios de culturas embriogênicas da cultivar IAS-5;
isto é, no estádio globular dos embriões, em meio de proliferação,
e no estádio de histodiferenciação, em meio de maturação. No
Experimento I, o número de embriões histodiferenciados foi
significantemente reduzido nos dois tratamentos com ABA no
meio de proliferação, independentemente da presença/ausência
de ABA no meio de maturação. Por outro lado, as porcentagens
de germinação e conversão foram aumentadas significantemente
quando o ABA foi adicionado a ambos os meios de proliferação e
de maturação. A freqüência de embriões dicotiledonares,
monocotiledonares e policotiledonares foi maior quando ABA
foi aplicado nesses dois meios. Os dados obtidos no Experimento
II confirmaram a freqüência de conversão superior quando os
embriões foram tratados com ABA nos estádios globular e de
histodiferenciação. A alta freqüência de conversão dos embriões
tratados com ABA teve relação com os tipos morfológicos. As
porcentagens de conversão de embriões dicotiledonares,
monocotiledonares e policotiledonares foram três vezes mais altas
do que aquelas das demais classes morfológicas.
Termos para indexação: Glycine max, embriogênese somática,
morfologia dos embriões, regulação do crescimento,
histodiferenciação, soja.
INTRODUCTION
Soybean [Glycine max (L.) Merrill], one of the most
important cultivated species, is an important source of oil
and protein for which in vitro technology has a
considerable potential. However, this species has remained
(Received in september 11, 2006 and approved in february 14, 2007)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 1-9, 2007
2
WEBER, R. L. M. et al.
particularly recalcitrant to highly-efficient transformation
due to low regeneration rates of plants (TRICK et al., 1997).
Embryogenic tissue was first identified as a target
for genetic transformation of soybean by Parrott et al.
(1989) using Agrobacterium tumefaciens–mediated
transformation. Further studies showed embryogenic
tissue to be amenable to transformation via particle
bombardment (DROSTE et al., 2002; FINER &
MCMULLEN, 1991; SATO et al., 1993; SIMMONDS &
DONALDSON, 2000). The development of a system with
high efficiency on conversion of plants from soybean
somatic embryos could increase the potential for
production of large numbers of independent transgenic
lines.
The abscisic acid (ABA) is a sesquiterpenoid
synthesized from xanthophylls. ABA regulates several
important aspects of plant growth and development
(GASPAR et al., 1996). It accumulates at high levels when
a plant is subjected to certain abiotic stresses, such as
hydric stress, and during seed development. ABA provided
by the mother plant and synthesized in the seed itself
contributes to the regulation of embryo development and
maturation. Seed maturation not only includes growth and
development of the embryo, but also involves accumulation
of storage reserves and preparation for desiccation - which
occurs in the last stages of seed maturation. ABA induces
storage protein synthesis and affects the induction and
maintenance of some aspects of dormancy in seeds (ROCK
& QUATRANO, 1995).
In tissue culture, manipulation of culture
conditions to prolong and improve embryo maturation,
and to prevent precocious germination, will probably
increase the similarity observed between zygotic and
somatic embryos. Therefore, somatic embryos will come
to have the vigor and germination associated with their
zygotic counterparts (JIMÉNEZ, 2001; MERKLE et al.,
1995). Studies have reported beneficial effects of ABA
on somatic embryo development. In embryos of hybrid
larch (GUTMANN et al., 1996), sugarcane (NIEVES et al.,
2001) and geranium (MADAKADZE & SENARATNA,
2000) cultured in vitro, exogenous ABA induced and
increased storage proteins.
Exogenously supplied ABA could also increase
the frequency of somatic embryos reaching maturity. In
conifers, maturation in the absence of ABA resulted in
poorly developed somatic embryos which often exhibited
abnormal morphology, asynchronous development and
precocious germination. Exogenously supplied ABA in
maturation medium promoted the development of large
quantities of somatic embryos, which under appropriate
conditions, germinated and developed into plants at a
high frequency (GUTMANN et al., 1996; LELU et al.,
1994). The same effect of exogenous ABA was observed
for grapevine (GOEBEL-TOURAND et al., 1993;
RAJASEKARAN et al., 1982) and carrot (NISHIWAKI et
al., 2000).
In soybean, initial studies on somatic
embryogenesis have reported that ABA may affect normal
embryo induction and maturation (ACKERSON, 1984;
LAZZERI et al., 1987; RANCH et al., 1985). These reports,
however, contained no substantial data and little analysis
about the effects of ABA. Further studies showed that
ABA promoted embryo growth, development, maturation,
and improved embryo germination when applied at the
globular stage (TIAN & BROWN, 2000), while at an
advanced maturation stage ABA supplying did not
increment conversion frequencies (SCHMIDT et al., 2005).
However, the effect of exogenous ABA on the morphology
of somatic embryos and plant conversion capacity has
not been studied.
In order to analyze the effect of ABA on soybean
somatic embryogenesis and to establish the optimal time
of its application, this plant growth regulator was added to
proliferation and maturation medium. Histodifferentiated
embryos were evaluated for their morphology and ability
to convert into plants.
MATERIAL AND METHODS
The IAS-5 soybean cultivar commonly used in
genetic improvement programs and for commercial
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 1-9, 2007
Beneficial effect of abscisic acid on soybean somatic...
3
growing in the Brazilian State of Rio Grande do Sul was
to Petri dishes (10 cm) with 25 ml MSO conversion
used in this study. Young pods with immature seeds
medium, containing MS salts, B5 vitamins, 3% sucrose,
were harvested from field-grown plants and surface
0.3% PhytagelTM, pH 6.4. Germinated embryos were
sterilized during 1 min in 70% ethanol and 10 min in 500
transferred individually to 110ml vessels containing 25
ml of diluted commercial bleach (4% sodium hypoclorite)
ml of the same medium. After 60 days on MSO, embryos
containing 200
l of Tween-20. Following four rinses
were evaluated for conversion. Germination refers to
in sterile distilled water, immature seeds (3-6 mm) were
root and/or shoot development, while conversion was
aseptically excised; the cotyledons were removed and
recorded as the development of the primary root and
used as explants for culture. Cotyledon halves were
formation of at least one trifoliolate leaf.
placed with the abaxial side facing the modified D40
Abscisic acid (ABA) was applied at two different
induction medium (BAILEY et al., 1993), which contains
stages of embryo development: proliferation and
MS salts (MURASHIGE & SKOOG, 1962), B5 vitamins
maturation. ABA (Sigma Chemical Co., 99+% purity) was
(GAMBORG et al., 1968), 181
M 2,4-
dissolved in diluted NaOH solution, filter-sterilized, and
dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 3% sucrose, 0.3%
added to the autoclaved D20 and/or MSM6 media at a
PhytagelTM, pH 7.0. Ten-cm Petri dishes containing 25
concentration of 50
ml of medium and sealed with plastic film were used in
based on a previous study which showed that embryos
this stage. Cultures were incubated at 25±1°C under
treated with ABA (50
fluorescent light at an intensity of 22.5
-2 -1
M. This concentration was used
M) at the globular stage were
Em s and a
larger and exhibited a higher germination capability than
16h light photoperiod. After four weeks on D40 medium,
untreated embryos (TIAN & BROWN, 2000). In
explants were transferred to Petri dishes (10 cm) with 25
proliferation stage, ABA was added to D20 at the last
ml of D20 proliferation medium (modified D40 medium
month before transfer embryo clumps to maturation
containing 90.5
M 2,4-D, 3% sucrose, pH 6.4)
medium; in maturation stage, it was added to MSM6 in
(WRIGHT et al., 1991). Proliferative tissues were
the first month. The experiment was designed as shown
subcultured every 15 days for five months.
in Figure 1.
To induce histodifferentiation, clumps (~3mm) of
A one-way analysis of variance was used to
globular-stage embryos were placed in Petri dishes (10
evaluate the effect of treatments on the number of
cm) with 25 ml of MSM6 maturation medium (FINER &
histodifferentiated embryos obtained, as well as on the
MCMULLEN, 1991) containing MS salts, B5 vitamins,
percentages of embryo germination and plant conversion.
TM
6% maltose, 0.3% Phytagel , pH 6.4. After four weeks,
Comparisons between treatments were made using the
the embryos were separated and subcultured on fresh
Student-Newman-Keuls test. In order to compare the
MSM6
treatments in relation to the frequency of different embryo
medium
for
further
four
weeks.
2
Histodifferentiated embryos were counted and classified
morphologies, a
test of association was used. The
in morphological types, following Buchheim et al. (1989)
adjusted residuals (adjusted differences between observed
and Santos et al. (1997). A sample of histodifferentiated
and expected frequencies) (EVERITT, 1992) for each cell
embryos per treatment was placed on empty sterile
of the table were individually analyzed, to identify punctual
dishes without medium for two days to promote partial
associations between treatments and morphological
desiccation. Subsequently, the embryos were transferred
classes.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 1-9, 2007
4
WEBER, R. L. M. et al.
FIGURE 1 – ABA treatments experimental design.
RESULTS AND DISCUSSION
In order to evaluate the effect of ABA on the
capacity of maturation and germination of soybean somatic
embryos and their conversion into plants, two independent
experiments were carried out. Data of Experiment I are
presented in Table 1. The average number of
histodifferentiated embryos was significantly lower
(F=6.18; df=3;12; p=0.009) in the two treatments with ABA
on proliferation medium (T3 and T4), independently of the
presence/absence of ABA on the maturation medium.
Histodifferentiated embryos were of diverse
morphologies and included the types described by
Buchheim et al. (1989) and Santos et al. (1997). The high
percentage of abnormal somatic embryos found in the
present study is in agreement with previous reports and
appears to be the rule, rather than an exception (BAILEY
et al., 1993; BUCHHEIM et al., 1989; DROSTE et al., 2001;
SANTOS et al., 1997).
The relative frequencies of morphological classes of
histodifferentiated embryos (Table 2) varied among treatments
(
2
=236.9; df=1;8; p<0.001). A subsequent analysis of
adjusted residuals showed that monocotyledonous,
dicotyledonous and polycotyledonous embryos were more
frequent than expected when using ABA in both proliferation
and maturation media (T4). In contrast, these morphological
classes were less frequent than expected in the control
treatment (T1).
One hundred randomly picked histodifferentiated
embryos per treatment were submitted to partial desiccation
and transferred to conversion medium. Germinated embryos
were transferred individually to vessels with the same
medium to further development. The effect of treatments
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 1-9, 2007
Beneficial effect of abscisic acid on soybean somatic...
on embryo germination and plant conversion are presented
in Table 1. The percentage of germinated embryos was
significantly higher (F=6.85; df=3;12; p=0.006) when ABA
was added to proliferation medium (T3 and T4),
independently of the presence/absence of ABA in
maturation medium. The conversion frequency was
significantly higher (F=5.76; df=3;12; p=0.011) using ABA
at both proliferation and maturation media (T4), although
this treatment was not different from T3 (ABA at
proliferation stage).
In all treatments, the frequencies of germination
and conversion were higher than the frequency of
morphologically normal embryos (compare the percentages
of normal dicotyledonous embryos in Table 2 with the
percentages of germination and conversion in Table 1).
Thus, as reported by Bailey et al. (1993), Buchheim et al.
(1989) and Santos et al. (1997), our data indicated that a
5
large number of abnormal embryos were capable to
germinate and convert into plants.
Monocotyledonous, dicotyledonous and
polycotyledonous embryos were more frequent in T4
treatment (Table 2), which presented the highest conversion
percentage (Table 1). This result might indicate that the capacity
of conversion would be related to embryo morphologies. To
test this hypothesis, a second experiment was performed.
In the Experiment II, we compared the two treatments
which presented better results in the first experiment (T3
and T4) with the control treatment (T1). The same design
of Experiment I was followed, except for the sample size of
histodifferentiated embryos evaluated for germination and
conversion (60 embryos/treatment). The reduced sample
allowed for the evaluation of the development of each
embryo, in order to verify a possible relation between
morphology and conversion capacity.
TABLE 1 – Effect of four ABA treatments on the number of histodifferentiated embryos, germination and conversion
percentages in IAS-5 soybean cultivar (Experiment I).
1
2
Number of histodifferentiated embryos per Petri dish.
Means indicated by the same letter do not differ significantly (Student-Newman-Keuls test; 0.05 level).
TABLE 2 – Percentages of morphological classes, after maturation, in IAS5 soybean cultivar submitted to four ABA treatments.
Association 2: 236.9 (p< 0.001).
+/– Indicate significant increased (+) or decreased (–) frequencies in relation to the expected under the no association
hypothesis. Level of significance: at least 0.05.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 1-9, 2007
6
WEBER, R. L. M. et al.
The mean number of histodifferentiated embryos,
when ABA was added to maturation medium. According
and germination and conversion percentages are presented
to Schmidt et al. (2005), these discrepant results indicate
in Table 3. As observed in Experiment I, the presence of
that the positive effect of ABA on embryo development
ABA in proliferation and maturation stages (T4) determined
depends on the time of application. Our results confirmed
a decrease in the number of histodifferentiated embryos,
the beneficial effect of ABA when applied at globular
although differences were statistically not significant.
stage of embryo development and showed that the
Considering the conversion capacity, the same treatment
application of this growth regulator at both proliferation
(T4) gave rise to the highest percentage of converted
and maturation stages improve still more the plant
plants, although this data did not differ significantly from
conversion frequency.
T3 (F=10.48; df=2;6; p=0.011).
As the data of Experiment I indicated an
Despite exogenous ABA decreased the number of
association between embryo morphology and a specific
histodifferentiated embryos, germination and conversion
ABA treatment, in Experiment II, the development of
frequencies were enhanced. This result suggests that
each embryo was followed from histodifferentiation to
embryos treated with ABA presented a higher
conversion. Dicotyledonous, monocotyledonous and
physiological maturity. Although total number of embryos
polycotyledonous embryos corresponded to 19% of
produced is an important parameter, more important is the
the overall number of histodifferentiated embryos.
subset of embryos that reach an advanced stage of
These embryos converted in a percentage of 41%, while
development (GROLL et al., 2002). Maturation of somatic
the remaining morphological types presented a
embryos is a process during which a large amount of
conversion percentage of 14% (data not shown). Table
nutrients accumulate (BUCHHEIM et al., 1989; MERKLE
4 shows the influence of treatments on conversion
et al., 1995). ABA has been reported to stimulate protein
percentage of the different embryo morphologies. ABA,
accumulation of soybean zygotic embryos cultured in vitro
applied at both proliferation and maturation stages (T4),
during the early phase of embryogenesis (ACKERSON,
increased the frequency of dicotyledonous,
1984).
monocotyledoneous and polycotyledonous embryos
Tian & Brown (2000) showed that ABA promoted
(Type 1). Furthermore, ABA enhanced the conversion
soybean somatic embryo growth and development when
capacity of all embryo morphologies, indicating its
applied at the proliferation stage. On the other hand,
beneficial effect on maturation of soybean somatic
Schmidt et al. (2005) did not observe any significant effect
embryos.
TABLE 3 – Effect of three ABA treatments on the number of histodifferentiated embryos, germination and conversion
percentages in IAS5 soybean cultivar (Experiment II).
1
2
Number of histodifferentiated embryos per Petri dish.
Means indicated by the same letter do not differ significantly (Student-Newman-Keuls test; 0.05 level).
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 1-9, 2007
Beneficial effect of abscisic acid on soybean somatic...
7
TABLE 4 – Effect of three ABA treatments on number of histodifferentiated and converted embryos of different
morphological types of IAS5 soybean cultivar.
1
Type 1 refers to dicotyledonous, monocotyledonous and polycotyledonous embryos.
Type 2 refers to fused cotyledon embryos, vestigial cotyledon embryos, trumpet embryos,
fused embryos and fasciated embryos.
2
As far as we know, no information is available about
the influence of ABA on soybean somatic embryo
morphologies. It has been shown that the somatic embryos
of some spruce species matured at low levels of exogenous
ABA showed abnormal morphology and poor germinability.
When the ABA concentration was increased, precocious
germination was prevented and characteristic structures
of mature embryos were formed and entered a stage of
dormancy, which was broken when the embryos were
transferred to medium without growth regulators.
Molecular analyses revealed that only mature spruce
somatic embryos accumulate storage proteins at a
detectable level (ROBERTS et al., 1990). According the
authors, the accumulation of storage proteins appeared to
be a consequence of ABA inhibiting precocious
germination and extending the period of maturation.
It has not been proven that a plant hormone might
operate a specific function by itself. On the contrary, there
are several potential mutual interacting points between
hormones, depending upon the plant species and tissue
type (COENEN & LOMAX, 1997; FEDEROFF, 2002; ROCK
& SUN, 2005). The question is still more complex if we
realize that somatic embryogenesis, as other development
processes, comprises several successive physiological
phases, with different requirements (MERKLE et al., 1995).
It seems probable that the observed responses of the cell
culture systems, after a growth regulated supplement, are
related to such interactions (JIMÉNEZ, 2001).
CONCLUSIONS
The results of the present work showed a beneficial
effect of exogenous abscisic acid on the conversion of
soybean somatic embryos into plants. The benefit of ABA
depends on the embryo development stage in which this
growth regulator is applied. The best result was obtained
when ABA was applied at both proliferation and maturation
stages.
ACKNOWLEDGMENTS
Research support was provided by Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq) and Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado
do Rio Grande do Sul (FAPERGS).
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Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 1-9, 2007
PROPAGAÇÃO IN VITRO DE
BANANEIRA
‘PRATA ANÃ (AAB)’:
ROCHA,
H. S. et al.
INTENSIDADES LUMINOSAS E CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE
NAS FASES DE MULTIPLICAÇÃO E ENRAIZAMENTO
10
IN VITRO PROPAGATION OF BANANA ‘PRATA ANÃ’: LIGHT INTENSITIES AND
SUCROSE CONCENTRATIONS DURING MULTIPLICATION AND ROOTING PHASES
HERMÍNIO SOUZA ROCHA1, CARLOS RAMIREZ DE REZENDE E SILVA2,
APARECIDA GOMES DE ARAÚJO3, ADRIANO BORTOLOTTI DA SILVA3
1
Dr. em Agronomia/Fitopatologia, Embrapa – Campo Biotecnologia Vegetal Ltda, Biofábrica – Rua Embrapa, S/N° – Cx. P. 007 –
Centro – 44380-000 – Cruz Das Almas, BA – hermí[email protected]
2
Professor Titular do Departamento de Agricultura/DAG – Universidade Federal de Lavras/UFLA – Cx. P. 3037 – 37200000 –
Lavras, MG – [email protected]
3
Doutorando em Agronomia/Fitotecnia – Universidade Federal de Lavras/UFLA – Cx. P. 3037 – 37200-000 – Lavras, MG.
RESUMO
A utilização da micropropagação em plantas da família
das musáceas tem aumentado sobremaneira o número de plantas
disponíveis em curto espaço de tempo, pois resulta em mudas
clonadas isentas de pragas e doenças, além de proporcionar
significativos ganhos qualitativos e quantitativos para os
produtores. Objetivou-se, neste trabalho, avaliar os efeitos de
diferentes condições de luminosidade e concentrações de
sacarose na caracterização fitotécnica da bananeira ‘Prata anã’
cultivada in vitro, nas fases de multiplicação e enraizamento.
Para a fase de multiplicação utilizou-se o meio MS suplementado
com 22,2 M de BAP, solidificado com 4,5 g L-1 de phytagel
e pH de 5,8. Na fase de enraizamento foi utilizado o meio MS
com 5,37
M de ANA, solidificado com 6 g L-1 de ágar e pH
de 5,8. Após o preparo, 50 mL do meio foram distribuídos em
frascos, que foram vedados com tampas metálicas e autoclavados
à 121oC, 1,2 atm de pressão, por 20 minutos. Os tratamentos
consistiram de concentrações de sacarose (15 e 30 g L-1) e
condições de luz (artificial e natural). A luz artificial refere-se à
sala de crescimento (fotoperíodo de 16 horas, intensidade
luminosa de 35 mol m-2 s-1 e temperatura de 25±2oC) e a luz
natural, à estufa PAD & FAN (23 a 38oC). O delineamento foi
inteiramente casualizado, com cinco repetições, cada uma
composta por quatro plantas/frasco. Decorridos 65 dias,
observou-se maior eficiência na micropropagação da bananeira
‘Prata Anã (AAB)’ utilizando-se luz natural, com a
suplementação de 15 e 30 g L-1 de sacarose para as fases de
multiplicação e enraizamento, respectivamente. Estes resultados
são particularmente vantajosos em termos econômicos, pois a
utilização da luz natural nas salas de crescimento, em um
laboratório de micropropagação vegetal, representa uma
economia de até 45% com energia elétrica.
Termos para indexação: Micropropagação, Musa sp.,
Carboidrato, Luz Natural
ABSTRACT
Micropropagation of musaceae has intensively increased
the availability of plantlets in a short period of time, resulting in
the production of cloned disease free plantlets and an increase of
banana qualitative and quantitative traits for growers. The
objective of this work was to evaluate the effects of different
light conditions and sucrose concentrations, on in vitro cultured
‘Prata Anã’ banana explants during the phases of multiplication
and plant rooting. For the multiplication phase, MS medium was
used, supplemented with BAP (22.2 M) solidified with 4.5 g
L-1 Phytagel , pH 5.8. For the rooting phase, MS medium was
also used with the supplementation of NAA (5.37
M),
solidified with 6 g L-1 agar and pH 5.8. The different media were
dispensed in a 50 mL volume inside glass containers, closed with
metal tops and autoclaved under 121ºC temperature and 1.2 atm
of pressure, during 20 minutes. The treatments consisted of
explants in multiplication and rooting media, supplemented with
15 or 30 g L-1 sucrose, under artificial and natural light conditions.
Artificial light refers to a growth room, with 16 hours
photoperiod, 35
mol m-2 s-1 light intensity and 25±2oC
temperature. The natural light condition was obtained using a
PAD&FAN greenhouse type (23 to 38oC). The experimental
design used was a complete randomized, with five replicates
composed by four plantlets per glass container. After 65 days,
higher efficiency in the micropropagation was observed using
natural light conditions and medium supplemented with 15 and
30 g L-1 sucrose, for the multiplication and rooting phases,
respectively. These results are particularly advantageous in
economic terms, since the use of natural light for growth rooms
in a commercial micropropagation laboratory represents a 45%
economy in electric energy.
Index terms: Micropropagation, Musa sp., Carbohydrate,
Natural Light.
INTRODUÇÃO
A micropropagação é a principal forma de validação
das novas variedades produzidas por programas de
melhoramento genético da bananeira, possibilitando aos
produtores o imediato acesso aos novos materiais
(Recebido em 21 de março de 2005 e aprovado em 22 de março de 2007)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p.10-16, 2007
Propagação in vitro de bananeira ‘Prata anã’: intensidades...
lançados. No Brasil, a grande limitação para um maior
acesso dos produtores às mudas micropropagadas, visando
a implantação de novos bananais, é o elevado custo deste
tipo de material propagativo, que é muito superior ao das
mudas convencionais.
A utilização de lâmpadas fluorescentes brancas é
citada em 90% dos trabalhos de pesquisas em cultura de
tecidos de plantas, como a fonte de luz mais disponibilizada
(DOOLEY, 1991). Os custos com iluminação, principalmente
das salas de crescimento em um laboratório de cultura de
tecidos, contabilizam 65% do total gasto em eletricidade
(STANDAERT-DE-METSANAERE, 1991) e se constituem
num dos mais elevados componentes do custo total de
produção de mudas, com exceção dos gastos com mãode-obra (DOOLEY, 1991).
Kodym & Zapata-Arias (1999) estudaram as
vantagens potenciais da utilização de luz solar sobre a
luz artificial para o cultivo in vitro de bananeiras ‘Grande
Naine’ e os efeitos das flutuações de temperatura,
fotoperíodo e intensidade luminosa nas taxas de
multiplicação e qualidade das plantas. Ao testar três
diferentes ambientes de cultivo in vitro, ou seja, câmara
de crescimento com luz artificial e temperatura
controladas, sala de crescimento com luz natural sem
controle de temperatura e casa de vegetação com luz
natural, também sem controle de temperatura, verificaram
que as maiores taxas de multiplicação foram obtidas sob
condições de luz natural, em casa de vegetação. Sistemas
radiculares mais vigorosos foram também verificados nas
plantas cultivadas sob luz natural.
Normalmente, para o cultivo in vitro de células,
tecidos ou órgãos, faz-se necessário a incorporação de
uma fonte de carbono no meio de cultura. A sacarose é
quase que universalmente usada na micropropagação e
em outras técnicas de cultivo in vitro. Contudo, convém
salientar que a concentração ótima de sacarose para a
indução de morfogênese ou crescimento difere entre os
genótipos e, às vezes, entre genótipos muito próximos
(GEORGE, 1993).
11
A concentração de sacarose no meio de cultura
tem efeito sobre a multiplicação e o crescimento.
Concentrações de 2% a 4% (peso por volume) são as mais
comuns. Abaixo dessa faixa, pode ocorrer clorose nas
culturas e acima desta pode-se incorrer em problemas de
excessivo potencial osmótico do meio, resultando na
deterioração das culturas (GRATTAPAGLIA &
MACHADO, 1998). Por sua vez, George (1993) observou
que a presença de sacarose no meio de cultura inibiu a
formação de clorofila e, conseqüentemente, a fotossíntese,
prejudicando o crescimento autotrófico. Já Debergh (1988)
afirma que a redução ou até mesmo a eliminação da sacarose
do meio de enraizamento deve ser utilizada com a finalidade
de facilitar a passagem das plantas do estádio heterotrófico
para autotrófico, por ocasião do transplantio para a fase
de aclimatização.
Uma gradual intensificação da luminosidade, ainda
na condição in vitro, simultaneamente à diminuição na
concentração de sacarose nos meios de cultura, podem ser
de grande utilidade na aclimatização, proporcionando às
plantas um metabolismo mais próximo da condição
autotrófica, contribuindo, então para a redução de perdas
nessa fase. Desta forma, objetivou-se avaliar o efeito da
luminosidade sobre as características fitotécnicas da
bananeira ‘Prata Anã (AAB)’ cultivada in vitro, em
associação com alterações nas concentrações de sacarose
dos meios de cultura, nas fases de multiplicação e
enraizamento.
MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi conduzido na biofábrica da Campo
Biotecnologia Vegetal, instalada na Embrapa Mandioca e
Fruticultura, Cruz das Almas, BA. O material vegetal
utilizado foi retirado de plantas de bananeira ‘Prata Anã’
(AAB), selecionadas no banco ativo de germoplasma
daquela unidade da Embrapa.
Gemas laterais e apicais, extraídas a partir de rizomas
das plantas matrizes selecionadas, apresentavam dimensões
iniciais de aproximadamente 10x10x12cm. Realizou-se uma
lavagem das gemas com detergente, enxágüe em água de
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 10-16, 2007
12
ROCHA, H. S. et al.
torneira e desinfestação em hipoclorito de sódio 3%,
durante 30 minutos. Após essa primeira desinfestação,
reduziu-se o tamanho das gemas para aproximadamente
de 5x5x2,5cm e, em seguida, uma nova desinfestação, com
hipoclorito de cálcio 10%, durante 20 minutos. Após essa
etapa transferiu-se todo o material para as câmaras de fluxo
laminar, e, em condições assépticas, novamente
procederam-se cortes superficiais até que as gemas
atingissem as dimensões de 1x1x0,5cm, quando foram
novamente desinfestadas com hipoclorito de cálcio a 5%
durante 5 minutos. Após essa última desinfestação, as
gemas foram reduzidas para 0,5x0,5x0,5 cm, procedendose à inoculação em meio de cultura MS (MURASHIGE &
SKOOG, 1962), suplementado com 22,2
M de 6-1
benzilaminopurina (BAP), 30 g L de sacarose, solidificado
com 4,5 g L-1 de Phytagel e pH ajustado para 5,8. Os
explantes permaneceram em sala de crescimento durante
45 dias, após os quais se realizou a eliminação dos
contaminados e deu-se prosseguimento à fase seguinte,
que consistiu em subdividi-los ao meio, com o objetivo de
atingir o domo meristemático, quebrando a dominância
apical e forçando a ocorrência de múltiplas brotações
laterais.
Foram efetuados dois subcultivos após essa fase,
em intervalos de 35 dias, quando se realizou a limpeza e
subdivisão das brotações, retirando-se as partes oxidadas.
No segundo subcultivo, as plântulas foram
inoculadas nos tratamentos constituídos por meio de
multiplicação e enraizamento, contendo 15 e 30 g L-1 de
sacarose sob condições de luz artificial e luz natural. A luz
artificial refere-se à salas de crescimento com lâmpadas
fluorescentes (2000 a 3000 lux), fotoperíodo de 16 horas e
temperatura controlada em 25±2oC. A luz natural diz respeito
à da estufa PAD & FAN , com cobertura dupla de plástico
inflado, com sombrite de 50% para retenção da radiação
solar, e temperatura oscilando entre 23 a 38oC. Lateralmente,
a estufa é fechada por plástico rígido PVC transparente.
Os frascos foram acomodados em estantes, na sala de
crescimento e na estufa PAD & FAN , a uma altura de 1,50
metro do nível do solo.
Na fase de multiplicação utilizou-se o meio de cultura
MS, suplementado com 22,2 M de BAP, solidificado com
4,5 g L-1 de Phytagel e pH ajustado para 5,8. Para a fase de
enraizamento, foi utilizado o meio MS, suplementado com
5,37 M de Ácido naftalenoacético (ANA), solidificado
com 6 g L-1 de ágar e pH ajustado para 5,8.
Após o preparo do meio, procedeu-se à distribuição
no volume de 50 mL por frasco com capacidade de 268 mL,
quer foram vedados com tampas metálicas e posteriormente
autoclavados à temperatura 121oC e 1,2 atm de pressão,
por 20 minutos.
Decorridos 65 dias, avaliaram-se as características
fitotécnicas das plântulas: número de brotações; número
de brotações maiores que 1cm; comprimento da parte aérea
(cm); comprimento de raiz (cm); massa fresca da parte aérea
(g); massa fresca do sistema radicular (g) e massa seca
total de plantas (g).
O delineamento experimental utilizado foi
inteiramente casualizado, com cinco repetições,
composta por quatro plantas cada. O esquema
experimental foi o fatorial 2x2, [concentrações de
sacarose (15 g L-1 e 30 g L-1) e condições de luminosidade
(luz natural e luz artificial)], em dois experimentos, um
na fase de multiplicação e outro na fase de enraizamento
(Tabela 1). Os fatores foram avaliados pelo teste de
médias Scott-Knott, no programa estatístico SISVAR
(FERREIRA, 2000), a 5% de probabilidade.
TABELA 1 – Descrição dos tratamentos a que foram
submetidos os explantes de bananeira ‘Prata Anã (AAB)’,
durante a fase de micropropagação.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p.10-16, 2007
Propagação in vitro de bananeira ‘Prata anã’: intensidades...
RESULTADOS E DISCUSSÃO
13
Os resultados verificados para esta variável
Na fase de multiplicação, as variáveis número de
demonstram que a luz natural é capaz de promover maior
brotações (NB), número de brotações maiores que 1cm
crescimento da parte aérea do que a luz artificial. Isto é
(NB>1 cm), massa fresca da parte aérea (MFPA) e massa
particularmente importante para os explantes, pois
fresca do sistema radicular (MFSR), não apresentaram
proporciona um desenvolvimento ex vitro mais rápido,
significância para a interação entre os fatores tipos de luz
permitindo a emissão de novas folhas, mais adaptadas às
e sacarose, e nem tampouco para os mesmos fatores
condições ambientais adversas, que são verificadas na
isoladamente (Tabela 2).
casa de vegetação e em campo. Neste aspecto, ocorre
Houve interação significativa entre os fatores tipos
redução de perdas na fase de aclimatização, reduzindo,
de luz e concentrações de sacarose para comprimento da
conseqüentemente, os custos de produção da muda
parte aérea (CPA), comprimento do sistema radicular (CSR)
micropropagada.
e massa seca total de plantas (MSTP), conforme Tabela 2.
Maiores comprimentos do sistema radicular foram
Pode-se verificar que os maiores comprimentos da
verificados com a utilização de 15 g L-1 de sacarose,
parte aérea foram obtidos com o material cultivado sob
obtendo-se médias de 4,91 e 4,50 cm em plantas mantidas
condições de luz natural, alcançando médias de 9,29 e 8,35
sob condições de luz natural e luz artificial, respectivamente
-1
cm, em meios contendo 15 e 30 g L de sacarose,
(Tabela 2). Kodym & Zapata-Arias (1999) verificaram que,
respectivamente. Esses valores, apesar de não diferirem entre
em explantes de bananeira ‘Grande Naine’ foram formadas
si, foram estatisticamente superiores aos comprimentos
raízes mais fortes e vigorosas sob luz natural. Estes
obtidos nas plantas cultivadas sob luz artificial (Tabela 2).
resultados, verificados para o maior comprimento do
Esses resultados corroboram aqueles obtidos por
sistema radicular tanto em ambiente de luz natural quanto
Seko & Nishimura (1996), em trabalho com regeneração de
de luz artificial, interagindo com a maior concentração de
plantas de arroz a partir de cultura de calos, no qual foram
sacarose no meio, podem ser explicados pelo fato da
obtidos os maiores comprimentos das brotações, sob a
sacarose ser um importante promotor de crescimento, por
mais alta intensidade luminosa, 125
-2
-1
mol m s e
se constituir em uma fonte de carboidratos prontamente
fotoperíodo de 24 horas. Apesar dos resultados obtidos
disponível. Estudos comprovaram que 75 a 85 % do
por estes autores terem sido gerados em condições de luz
aumento da biomassa se deve à incorporação de carbono
artificial, a intensidade luminosa foi semelhante aos valores
pela adição de sacarose (RIEK et al., 1997). Pierik (1987) e
observados para a condição de casa de vegetação do
Shibli et al. (1992) observaram a necessidade de
presente trabalho.
fornecimento de alta concentração de sacarose para a
TABELA 2 – Dados fitotécnicos em plantas de bananeira ‘Prata Anã (AAB)’ cultivadas em meio de multiplicação, sob
condição de luz artificial e luz natural, com diferentes concentrações de sacarose.
Médias seguidas pela mesma letra na vertical fazem parte do mesmo agrupamento pelo teste de Scott-Knott, ao nível
de 5% de probabilidade.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 10-16, 2007
14
ROCHA, H. S. et al.
emissão de raízes em várias espécies. Calvete et al. (2002)
no cultivo in vitro de morangueiro cv Campinas, observou
que 45 g L-1 de sacarose proporcionou melhores respostas
para a formação de raízes e que na ausência do carboidrato
não houve formação de raízes.
Os meios de multiplicação, suplementados com 30
-1
g L de sacarose nas condições de luz natural (0,17 g) e
artificial (0,18 g), foram responsáveis pela obtenção dos
maiores valores para a variável massa seca total de plantas
(MST), como pode ser visto na Tabela 2. Estes resultados
corroboram com Serret et al. (1997), que observaram, na
multiplicação in vitro de Gardenia jasminoides, os de efeito
direto de altas concentrações de sacarose no meio de
cultura sobre o peso final das plântulas.
Se considerarmos que as variáveis mais importantes
a serem avaliadas para medir a eficiência dos tratamentos
na fase de multiplicação são NB e NB>1cm, e que não
foram observadas diferenças significativas para os
mesmos, é possível concluir que, em termos de benefícios
econômicos, pode-se recomendar a utilização da luz natural
com a suplementação de apenas 15 g L-1 de sacarose, para
os explantes de bananeira ‘Prata anã (AAB)’.
Na fase de enraizamento, as variáveis comprimento
da parte aérea (CPA), comprimento do sistema radicular
(CSR) e massa fresca da parte aérea (MFPA) não
apresentaram diferenças significativas, para os fatores
estudados (Tabela 3). Houve interação significativa para
massa fresca do sistema radicular (MFSR) e massa seca
total de plantas (MSTP).
As maiores massas frescas do sistema radicular
foram obtidas nos explantes cultivados nos tratamentos
que consistiram de meios suplementados com 30 g L-1 de
sacarose, tanto nas condições de luz natural (5,78 g),
quanto sob luz artificial (4,82 g). Os mesmos não diferiram
entre si (Tabela 3).
A sacarose é necessária para o desenvolvimento
de células do xilema e floema, em tecidos cultivados in
vitro. Aloni (1980) afirma que a quantidade de vasos
xilemáticos é dependente da concentração de sacarose no
meio de cultura. Uma maior concentração de sacarose é
necessária para promover uma perfeita conexão das raízes
com os vasos xilemáticos das plântulas, aumentando as
taxas de absorção de água e nutrientes pelas raízes, ainda
no ambiente in vitro, na fase de enraizamento. Desta forma,
para bananeira ‘Prata Anã’, é provável que a concentração
de 30 g L-1 seja a ideal para que ocorra essa conexão
resultando em maiores taxas de absorção de água pelas
raízes, elevando seus calibres e, conseqüentemente, a
massa fresca dos mesmos.
A massa seca total, cujo valor é a representação do
crescimento efetivo da parte aérea e do sistema radicular,
teve influência da interação dos fatores. Os dois
tratamentos que consistiram de meio de enraizamento,
suplementados com 30 g L-1 de sacarose, nas condições
de luz natural (0,46 g), e a mesma concentração de sacarose
sob luz artificial (0,31 g), foram responsáveis pela promoção
dos maiores valores para esta variável, não diferindo entre
si (Tabela 3).
TABELA 3 – Dados fitotécnicos em explantes de bananeira ‘Prata Anã (AAB)’, em meio de enraizamento, sob condição
de luz artificial e luz natural, com diferentes concentrações de sacarose.
Médias seguidas pela mesma letra na vertical fazem parte do mesmo agrupamento pelo teste de Scott-Knott, ao nível
de 5% de probabilidade.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p.10-16, 2007
Propagação in vitro de bananeira ‘Prata anã’: intensidades...
Diversos autores são contrários à idéia de redução
de sacarose durante a micropropagação. Eles afirmam que
os mecanismos pelos quais a concentração de carboidrato
influencia na aclimatização não são muito claros, portanto,
15
FERREIRA, D. F. Análises estatísticas por meio do Sisvar
para Windows: versão 4.0. In: REUNIÃO ANUAL DA
REGIÃO BRASILEIRA DA SOCIEDADE
INTERNACIONAL DE BIOMETRIA, 45., 2000, São Carlos.
Anais... São Carlos: UFSCar, 2000. p. 255-258.
manter os níveis de sacarose em torno de 3% na fase que
antecede à aclimatização é recomendável, pois, desse modo,
a planta acumularia reservas de energia para sobreviver
GEORGE, E. F. Plant propagation by tissue culture: the
components of culture media. 2. ed. Great Britain: Exegetics,
1993. 574 p.
melhor ao ambiente (CAPELLADES et al., 1990;
WAINWRIGHT & SCRACE, 1989).
CONCLUSÕES
Pode-se obter maior eficiência na micropropagação
GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M. A.
Micropropagação. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.;
BUSO, J. A. Cultura de tecidos e transformação genética
de plantas. Brasília, DF: Embrapa/SPI/CNPH, 1998. v. 1, p.
183-260.
da bananeira ‘Prata Anã’ utilizando-se a luz natural, com a
suplementação de 15 e 30 g L-1 de sacarose nos meios de
multiplicação e enraizamento, respectivamente. Estas
alterações no protocolo proporcionarão na redução dos
KODYM, A.; ZAPATA-ARIAS, F. J. Natural light as an
alternative light source for the in vitro culture of banana
(Musa acuminata cv. Grande Naine). Plant Cell, Tissue
and Organ Culture, Amsterdam, v. 55, n. 2, p. 141-145, 1999.
custos com energia elétrica, além de apontar para uma
diminuição de perdas na aclimatização.
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Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 10-16, 2007
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Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p.10-16, 2007
RESPOSTA À ADUBAÇÃO
NPK
MUDAS
MICROPROPAGADAS17
Respostas à adubação
NPK DE
de mudas
micropropagadas...
DE ABACAXIZEIRO CV. PÉROLA EM FASE DE ACLIMATIZAÇÃO
NPK FERTILIZATION OF MICROPROPAGATED PINEAPPLE PLANT CV PÉROLA ON
ACLIMATIZATION PHASE
MARIA APARECIDA MOREIRA1, JANICE GUEDES DE CARVALHO2,
CHRYSTIANE BORGES FRÁGUAS3, MOACIR PASQUAL4
1
Engenheira Agrônoma, Professora do Departamento de Agronomia/Fesurv – Universidade Federal de Sergipe/UFS – Centro de
Ciências Biológicas e da Saúde – Av. Marechal Rondon, s/n – Jardim Rosa Else – 49100-000 – São Cristóvão, SE – [email protected]
2
Engenheira Agrônoma, Professora do Departamento de Ciência do Solo/DCS – Universidade Federal de Lavras/UFLA – Cx. P. 3037 –
37200-000 – Lavras, MG – [email protected]
3
Engenheira Agrônoma, Doutoranda – Universidade Estadual Paulista/UNESP – Júlio de Mesquita Filho – Campus Universitário –
Jardim Paraíso – Cx. P. 237 – 18610-307 – Botucatu, SP – [email protected]
4
Engenheiro Agrônomo, Professor Titular – Departamento de Agricultura/DAG – Universidade Federal de Lavras/UFLA – Cx. P. 3037 –
37200-000 – Lavras, MG – [email protected]
RESUMO
Objetivou-se estudar o efeito da adubação NPK, em
mudas micropropagadas de abacaxizeiro cv. Pérola [Ananas
comosus (L.) Merr.] em fase de aclimatização. Como substrato
foi utilizado solo de subsuperfície, peneirado e misturado com
areia, na proporção de 2:1, e colocado em vasos com
capacidade para 1kg. Foram utilizadas mudas micropropagadas
de aproximadamente 2 g de peso de matéria fresca, para os
testes de época de adubação (plantio e 45 dias pós-plantio) e
níveis de adubação (0, 25, 50 e 100%), utilizando como
adubação básica: 300 mg de N, 200 mg de P e 200 mg de K por
kg de solo. As avaliações foram feitas 90 dias após o plantio.
Com os resultados obtidos concluiu-se que as plantas
micropropagadas de abacaxizeiro cv. Pérola respondem à
adubação efetuada logo no início da aclimatização pois, o
máximo de rendimento para altura de planta (23,18 cm), peso
de matéria fresca (24,57 g) e seca da parte aérea (2102,4 mg)
foi conseguido com 100% da adubação recomendada, utilizada
no plantio. Para as variáveis analisadas de raiz, as plantas
adubadas aos 45 dias apresentaram maior comprimento (15,02
cm), maior peso de matéria fresca (0,63 g) sem significância
para peso de matéria seca.
Termos para indexação: Ananas comosus, micropropagação,
cultura de tecidos.
ABSTRACT
The objective of this work was to study the effect of
NPK fertilizer on micropropagated plantlets of pineapple cv.
Pérola [Ananas comosus (L.) Merr.] during the acclimatization
phase. Soil drizzled and mixed with sand (2:1 proportion) was
used as substrate in 1kg capacity vases. Micropropagated plantlets
with approximately 2 g of fresh weight matter were used for
testing the period of fertilization (at planting and 45 days after
planting) and fertilizer levels (0, 25, 50 and 100%), using as basic
fertilizer: 300 mg N, 200 mg P and 200 mg K/kg soil. After 90
days of planting it was observed that these plantlets responded
to the fertilization at the beginning of the acclimatization process.
Highest height (23.18 cm), fresh weight matter (24.57 g) and
shoot dry matter (2102.4 mg) was obtained using 100% fertilizers.
After 45 days of culture, the plantlets roots presented larger
length (15.02 cm), higher fresh matter weight (0.63 g) and no
significant dry matter weight.
Index terms: Ananas comosus, micropropagation, tissue culture.
INTRODUÇÃO
A fase de aclimatização de plantas micropropagadas
consiste em retirá-las da condição ‘in vitro’ e transferi-las
para casa-de-vegetação, podendo tornar-se um fator
limitante na cultura de tecidos. Nessa fase as plantas, que
se desenvolveram heterotroficamente sob condições de
alta umidade, passam a condições autotróficas e moderada
ou baixa umidade (ZIMMERMAN, 1988). Pela grande
diferença entre as duas condições ambientais (READ &
FELLMAN, 1985) é necessário que as plantas
micropropagadas passem por um período de aclimatização
antes de serem transferidas para condições de campo.
A perda de vigor e a subseqüente morte devido ao
dessecamento são dois sérios problemas que ocorrem com
plantas, que são transferidas das condições ‘in vitro’, para
casa-de-vegetação (SUTTER & HUTZELL, 1984) não
sendo, no entanto, os principais fatores da baixa
sobrevivência de determinadas espécies. Segundo Marin
& Gella (1988), a mudança do metabolismo heterotrófico
para o autotrófico é outro fator envolvido que deve ser
considerado.
Segundo Howard (1987), as mudas provenientes
do cultivo ‘in vitro’ são de pequeno tamanho (menos de
(Recebido em 27 de abril de 2004 e aprovado em 22 de abril de 2007)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 17-22, 2007
18
MOREIRA, M. A. et al.
5cm) quando transplantadas, de modo que necessitam
aumentar entre 10 a 20 vezes o seu tamanho para serem
transferidas ao campo. Além disso, as raízes formadas ‘in
vitro’ não são funcionais quando transplantadas e, sendo
assim, novas raízes têm que se desenvolver e se tornar em
aptas para absorver água do substrato (CAILLOUX, 1984).
É comum adicionar fertilizante granulado ao
substrato para suprir as necessidades iniciais da cultura
(GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1990). O nitrogênio e o
fósforo são os nutrientes que, mais freqüentemente,
proporcionam efeitos positivos sobre o crescimento das
plantas, não significando que esses nutrientes tenham
maior importância que os demais, mas sim que são exigidos
em elevadas quantidades. Também na produção de mudas
objetiva-se alcançar um estado nutricional equilibrado, com
reflexos positivos no crescimento da muda e na sua
qualidade final (HOFFMANN et al., 1996).
A deficiência de nutrientes pode ocorrer, podendo
ser observados sintomas na raiz e na parte aérea, e também
aumento na relação de matéria seca de raiz/parte aérea
(MARSCHNER, 1995), afetando o crescimento, morfologia
e distribuição do sistema radicular no substrato. Esse efeito
é típico quando ocorre deficiência, principalmente de
nitrogênio, menor para fósforo e normalmente ausente com
outros nutrientes, exceto o magnésio.
Um aumento no fornecimento de nitrogênio
aumenta o desenvolvimento de raízes e parte aérea, sendo
maior o da parte aérea, causando com isso uma típica queda
na relação matéria seca de raiz/parte aérea (MARSCHNER
et al., 1986 citados por MARSCHNER, 1995).
A cultura é exigente em nutrientes. Segundo Hiroce
et al. (1977), são extraídos, aproximadamente, 350 Kg ha-1
de N, 30 Kg ha-1 de P e 500 Kg ha-1 de K em cultivos com
50.000 plantas ha-1.
As recomendações para mudas micropropagadas de
abacaxizeiro são escassas, visto que a propagação é feita por
mudas retiradas da planta-mãe e plantadas diretamente no
campo, sendo encontradas recomendações para mudas
oriundas de seccionamento de talo: 100g de superfosfato
simples/m2 de canteiro, seguida de 4 adubações com uréia
após o início da formação de raízes (CHALFOUN, 1983);
aplicação de uréia e sulfato de potássio (ambos na dosagem
de 10g/m2 de canteiro) quando as plantas atingirem 5cm de
altura, cerca de 6 a 8 semanas após plantio (ITAL, 1987); e
utilização de 20g/m2 de superfosfato triplo aos 7-14 dias antes
do plantio, seguida de aplicações foliares de nitrogênio (uréia
a 0,1%) e potássio (sulfato de potássio a 0,5%) (REINHARDT,
1982). A aplicação de adubos em cobertura com nitrogênio e
potássio pode proporcionar maior eficiência, se for realizada
após o enraizamento inicial das plantas.
Para ensaios em casa-de-vegetação pode-se
fornecer os nutrientes nas seguintes doses (mg/dm3): N300, P-200, K-150, Ca-75, Mg-15, S-50, B-0,5, Cu-1,5, Fe-5,
Mo-0,1 e Zn-5, sendo dispensada a calagem quando o pH
estiver entre 6 e 6,5 (MALAVOLTA, 1980).
Objetivou-se estudar o efeito da adubação NPK
em mudas micropropagadas de abacaxizeiro cv. Pérola
[Ananas comosus (L.) Merr.], em fase de aclimatização.
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado em casa-de-vegetação
com sistema de nebulização intermitente, com temperatura
entre 26 a 31°C.
Foram selecionadas mudas micropropagadas em meio
MS, com peso da matéria fresca em torno de 2 g. As raízes das
mudas foram lavadas para retirar o excesso de meio de cultura,
levadas para casa-de-vegetação e plantadas em vasos com
capacidade para 1kg. Como substrato foi utilizado solo de
subsuperfície, peneirado e misturado com areia, na proporção
de 2:1, e colocado em vasos, depois da adição do fósforo nas
quantidades de acordo com os tratamentos. A adubação
básica utilizada foi: 300mg de N, 200mg de P e 200mg de K por
kg de solo (baseada na adubação para ensaios em casa-devegetação, segundo Malavolta (1980), utilizando-se como
fontes o sulfato de amônio, superfosfato simples e cloreto de
potássio, respectivamente. O nitrogênio e o potássio foram
aplicados em pequenos sulcos ao redor da muda.
A irrigação foi feita manualmente e as mangueiras
de nebulização sobre os vasos foram desligadas para evitar
excesso de água e, com isso, perda de nutrientes.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 17-22, 2007
Respostas à adubação NPK de mudas micropropagadas...
Os fatores testados foram: época de adubação (no
plantio e 45 dias após o plantio) e níveis de adubação (0, 25,
50, e 100% da adubação básica) constituindo, portanto, um
fatorial 2x4, com 8 tratamentos. O delineamento utilizado foi o
inteiramente casualizado, com 4 repetições e 3 plantas/ parcela,
totalizando 96 plantas. As avaliações foram feitas após 90
dias e as variáveis analisadas foram: peso de matéria fresca e
seca de raiz e parte aérea, altura da planta, comprimento de
raiz, número de folhas e relação matéria seca raiz/parte aérea.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Houve interação significativa entre os fatores
estudados para todas as variáveis de parte aérea
analisadas, com exceção do número de folhas, para o qual
apenas a adubação foi significativa.
Para a variável altura de planta, a época de aplicação
da adubação foi estatisticamente igual para os níveis de 0,
25 e 50% da adubação básica. O nível de 100% da adubação
básica foi superior para a adubação de plantio,
apresentando média de 23,18cm de altura (Tabela 1),
confirmando a característica de alta exigência nutricional.
Resultado semelhante foi observado para as
variáveis peso de matéria fresca e seca da parte aérea,
sendo que com o nível de 100% utilizado no plantio obtevese média de 24,57g para matéria fresca e 2102,44 mg para
peso de matéria seca (Tabela 1).
No que diz respeito ao número de folhas registrou
efeito significativo apenas a adubação, observando-se o
máximo de folhas quando foi utilizada 86,76% da adubação,
com média de 14,5 folhas (Figura 1).
19
Normalmente, as plantas em fase de aclimatização
não respondem à adubação, pois, obrigatoriamente,
necessitam passar por um período de adaptação devido
ao estresse que elas sofrem com essa mudança de ambiente,
além da transformação de seu metabolismo para autotrófico
(MARIN & GELLA, 1988). Deve ser considerado a perda
de água pelas plantas micropropagadas que, nessa fase, é
crítica, necessitando de alta umidade relativa.
As mudas de abacaxizeiro se adaptaram rapidamente
às mudanças ambientais, observando-se apenas 9,3% de
morte das plântulas após 90 dias em casa-de-vegetação,
considerando que das foram mantidas aí desligando-se o
sistema de nebulização sobre as plantas, mantendo-se
apenas irrigação manual diária sobre os vasos e
nebulização no restante da casa-de-vegetação. Pelos
resultados obtidos verificou-se que o abacaxizeiro
apresenta fácil aclimatização, podendo realizar adubações
no plantio, ou seja, logo no início da aclimatização.
Para altura da planta (Figura 2), matéria fresca
(Figura 3) e matéria seca da parte aérea (Figura 4), as
adubações de plantio foram significativamente superiores
quando se utilizou 100% da adubação recomendada para
plantio em vasos, o que leva a supor que essa dosagem de
adubação pode ser aumentada. Segundo Paula et al. (1998),
o abacaxizeiro é uma planta com alta exigência nutricional
quando comparado à outras culturas. Não observou-se
características de deficiência nutricional ou toxicidade nas
plantas, durante o experimento. Segundo Taiz & Zeiger
(2004), os sintomas de deficiência são resultado do
suprimento inadequado de algum elemento essencial à planta.
TABELA 1 – Altura de planta (AP), peso de matéria fresca (MF) e seca (MS) da parte aérea de abacaxizeiro
micropropagado cv. Pérola, em função da adubação NPK, em fase de aclimatização.
Médias seguidas por letras distintas, na horizontal, diferem entre si, ao nível de 5% de probabilidade.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 17-22, 2007
20
MOREIRA, M. A. et al.
FIGURA 1 – Número de folhas de abacaxizeiro
micropropagado cv. Pérola, em função da adubação NPK,
em fase de aclimatização.
FIGURA 4 – Peso de matéria seca de parte aérea de mudas
de abacaxizeiro micropropagado cv. Pérola, em função da
adubação NPK, em fase de aclimatização.
Caso ocorra deficiência de N, ele é transportado das
folhas velhas, que se tornam amareladas, para as folhas em
desenvolvimento. Há um crescimento reduzido da planta.
Quando à deficiência é do P e um dos primeiros sintomas é
a cor verde-azulada das folhas mais velhas, seguido pela
murcha e secamento da extremidade das mesmas. Já a
escassez do K causa, inicialmente, o aparecimento de
pontuações pardas e ressecamento do ápice para a base
das folhas mais velhas (PAULA et al., 1998).
FIGURA 2 – Altura de mudas de abacaxizeiro
micropropagado cv. Pérola, em função da adubação NPK,
em fase de aclimatização.
Segundo Howard (1987), as mudas provenientes
do cultivo ‘in vitro’ necessitam aumentar entre 10 a 20 vezes
o seu tamanho durante a aclimatização, antes de serem
transplantadas para o local definitivo. Outro relato indica
que o período de aclimatização de mudas micropropagadas
de abacaxizeiro leva de seis a oito meses (TEIXEIRA et al.,
2001), e, dependendo do substrato e da nutrição das
plantas (FOLLIOT & MARCHAL, 1990), pode levar até
dez meses. Neste trabalho, as mudas de abacaxizeiro
aumentaram em torno de 12 vezes o peso de matéria fresca
no período de 90 dias, resultando em transferência
antecipada para o campo. Provavelmente, o substrato
utilizado e 100% da adubação proposta resultaram em um
FIGURA 3 – Peso de matéria fresca da parte aérea de
mudas de abacaxizeiro micropropagado cv. Pérola, em
função da adubação NPK, em fase de aclimatização.
balanço adequado dos nutrientes favorecendo o
crescimento e desenvolvimento das mudas e, assim,
podendo antecipar o transplantio para o campo.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 17-22, 2007
Respostas à adubação NPK de mudas micropropagadas...
21
As variáveis analisadas para características de raiz
comparação com as plantas adubadas no plantio (Tabela
mostraram comportamento diferente da parte aérea no
2). A adubação de cobertura, feita 45 dias após plantio, e
que diz respeito à significância dos fatores estudados.
pelos resultados obtidos em relação à raiz, verificou-se
Para comprimento de raiz (C) e relação de matéria seca
que as raízes tiveram maior desenvolvimento quando, na
raiz/parte aérea (R/A) apenas o fator época de adubação
fase inicial,utilizaram apenas os nutrientes encontrados
mostrou significância (Tabela 2). Para peso de matéria
no solo. Possivelmente devido à necessidade de maior
seca não houve significância para os fatores estudados.
exploração do substrato, afetando o crescimento,
Para peso de matéria fresca da raiz (Figura 5) os dois
morfologia e distribuição do sistema radicular, no substrato.
fatores estudados mostraram significância sem interação
No entanto, para peso de matéria seca não houve efeito
entre eles.
significativo para os fatores estudados.
A relação matéria seca raiz/parte aérea das
TABELA 2 – Comprimento (C), peso de matéria fresca
(MF) e seca (MS) de raiz e relação peso de matéria seca de
raiz/parte aérea (R/A) de mudas micropropagadas de
abacaxizeiro cv Pérola, em função da adubação NPK.
plantas adubadas 45 dias após o plantio foi maior, ao
contrário das plantas adubadas no plantio (Tabela 2).
A relação peso de matéria seca raiz/parte aérea pode
ser indicativa de deficiência nutricional verificandose, nessas condições, um valor maior. Em condições
ótimas de nutrientes, há um maior desenvolvimento da
parte aérea, causando com isso uma típica queda na
Médias seguidas por letras distintas, na vertical, diferem
entre si ao nível de 5% de probabilidade.
relação matéria seca de raiz/parte aérea (MARSCHNER,
1995).
O peso de matéria fresca da raiz também foi
significativamente maior nas mudas que receberam
adubação 45 dias após o plantio (Tabela 2). O valor
máximo foi obtido com 100% da adubação recomendada
(Figura 6).
FIGURA 5 – Peso de matéria fresca de raiz de abacaxizeiro
micropropagado cv. Pérola, em função da adubação NPK,
em fase de aclimatização.
Com a adubação de cobertura as plantas
apresentaram raízes com comprimento significativamente
maior e, também, maior peso de matéria fresca em
FIGURA 6 – Peso de matéria seca de raiz de abacaxizeiro
micropropagado cv. Pérola, em função da adubação NPK,
em fase de aclimatização.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 17-22, 2007
22
MOREIRA, M. A. et al.
CONCLUSÕES
A utilização de 100% da adubação recomendada
para vaso, aplicada no plantio das mudas micropropagadas,
proporcionou os melhores resultados no desenvolvimento
do abacaxizeiro cv. Pérola, e podendo antecipar o
transplantio das mudas para o campo.
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Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 17-22, 2007
EFEITO DE PRÉ-TRATAMENTOS
EM
FLORAIS E DO 23
Efeito de pré-tratamentos em
botõesBOTÕES
florais...
TDZ NO CULTIVO IN VITRO DE ANTERAS DE CAFEEIRO
(Coffea arabica L.)
EFFECT OF PRE-TREATMENTS IN FLOWER BUDS AND TDZ IN VITRO CULTURE IN
ANTHERS OF COFFEE (Coffea arabica L.)
ELISÂNGELA RODRIGUES FIGUEIRA1, LUCIANA NOGUEIRA LONDE2, RAQUEL VIEGAS MARQUES3,
SORAIA VIEGAS MARQUES4, ADELAIDE SIQUEIRA SILVA5, JOSÉ MAGNO QUEIROZ LUZ6
1
Bióloga, Mestre em Agronomia – Universidade Federal de Uberlândia/UFU – Av. Engenheiro Diniz, 1178 – Cx. P. 593 – 38.400-902 –
Uberlândia, MG – [email protected]. br
2
Bióloga, Mestre em Genética e Bioquímica – Universidade Federal de Uberlândia/UFU – Campus Umuarama Bloco E sala 33 –
Umuarama – 38400902 – Uberlândia, MG – [email protected]
3
Engenheira Agrônoma – Universidade Federal de Uberlândia/UFU – Av. Engenheiro Diniz, 1178 – Cx. P. 593 – 38.400-902 –
Uberlândia, MG – [email protected]
4
Engenheira Agrônoma – Universidade Federal de Uberlândia /UFU – Av. Engenheiro Diniz, 1178 – Cx. P. 593 – 38.400-902 –
Uberlândia, MG – [email protected]
5
Bióloga, Mestranda em Agronomia, Universidade Federal de Uberlândia /UFU – Av. Engenheiro Diniz, 1178 – Cx. P. 593 – 38.400-902 –
Uberlândia, MG – [email protected]
6
Engenheiro Agrônomo, Dr., Professor do Curso de Agronomia – Universidade Federal de Uberlândia/UFU – Curso de Agronomia –
Av. Pará, Bloco 2E, Sala 14 – Campus Umuarama – Cx. P. 593 – 38400-902 – Uberlândia, MG – [email protected]
RESUMO
A espécie Coffea arabica apresenta poucos progressos
quanto à aplicação da cultura de anteras. Pouco se conhece
sobre as cultivares mais responsivas ao cultivo in vitro, sobre a
ação e concentração dos reguladores de crescimento e sobre
pré-tratamentos que melhor induzem a androgênese no cafeeiro.
Visando suprir essa carência, com este trabalho objetivou-se
testar o efeito de vários pré-tratamentos e de doses de TDZ
sobre a cultura de anteras em duas cultivares de Coffea arabica
L., para a indução de calos e regeneração de plântulas duplohaplóides. Os experimentos foram conduzidos no laboratório
de Cultura de Tecidos Vegetais da Universidade Federal de
Uberlândia (UFU). Botões florais com 4,5 a 6,0 mm de
comprimento das cultivares Mundo Novo IAC 379-19 e Catuaí
Vermelho IAC 99 foram coletados e submetidos a três prétratamentos com duração de 24 horas: choque frio (geladeira a
4ºC), choque de calor (estufa a 35ºC) e temperatura ambiente.
Após os pré-tratamentos, os botões florais foram desinfestados
em solução de álcool a 70% por um segundo, e por 15 minutos,
em uma solução de hipoclorito de sódio a 1%, sob agitação. A
seguir, as anteras foram inoculadas em meio MS suplementado
com TDZ (0,001; 0,01; 0,1; e 1,0 mg.L-1). Verificou-se que o
pré-tratamento dos botões florais por choque frio foi mais
eficiente que por choque de calor e temperatura ambiente para
a indução de calosidades em anteras, e que a cultivar Catuaí
Vermelho é mais responsiva à androgênese que a cultivar Mundo
Novo.
ABSTRACT
The Coffea arabica species shows little progress in anther
culture. Very little is know about the cultivars responsiveness to in
vitro culture, the action and the concentration of growth regulators
and about pre-treatments wich induce the androgenesis in coffee. To
provide this need, this paper was to test the effect of various pretreatments and levels of TDZ on anther culture in two cultivars of
Coffea arabica L. to induce callus and duplohaploids plantlet
regeneration. The experiments were carried out at Plant Tissue Culture
laboratory at Universidade Federal de Uberlândia (UFU). Flower
buds with 4,5 to 6,0 mm of length of Mundo Novo IAC 379-19 and
Catuaí Vermelho IAC 99 cultivars were collected and submited a
three pre-treatments with 24 hours duration: (1) cold shock (fridge
at 4°C), (2) hot shock (greenhouse at 35°C) and (3) environmental
temperature. After the pre-treatments, the flower buds were surfaced
sterilized in alcohol 70% solution for one second and for 15 minutes
in sodium hypochlorite 1% under agitation. The anthers were
inoculated in medium MS, supplemented with TDZ (0,001; 0,01;
0,1 and 1,0 mg.L). It was observed that the pre-treatment in flower
buds by cold shock was more efficient than hot shock and
environmental temperature for the calluses induction in anthers, and
the cultivar Catuai Vermelho is the most responsive cultivar at
androgenesis that Mundo Novo cultivar.
Termos para indexação: Calogênese, androgênese, duplohaplóides, cafeeiro, Coffea.
Nos programas de melhoramento as técnicas
convencionais têm apresentado resultados promissores
Index terms: Calogenesis, androgenesis, duplohaploids, coffee,
Coffea.
INTRODUÇÃO
(Recebido em 21 de fevereiro de 2006 e aprovado em 22 de maio de 2007)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 23-28, 2007
24
FIGUEIRA, E. R. et al.
na cultura do café, no que se refere ao aumento de
produtividade e obtenção de novas cultivares. Entretanto,
por se tratar de cultura perene propagada via semente, os
programas de melhoramento de café demandam,
aproximadamente, 25 anos desde a hibridação até a
obtenção de uma nova cultivar (ANDRADE, 1998).
Uma forma de reduzir o tempo para a obtenção de
novas cultivares é a utilização da cultura de anteras, pois
permite a obtenção de haplóides a partir de plantas
segregantes, o que leva à rápida produção de plantas
homozigotas através da duplicação do número de
cromossomos numa única etapa, substituindo as gerações
de autofecundação e acelerando significativamente o
processo de obtenção de novas cultivares (ANDRADE, 1998).
A técnica de cultura de anteras/micrósporos consiste
em cultivar anteras imaturas em meio de cultura apropriado e
sob condições ambientais adequadas, a fim de modificar a
rota normal de desenvolvimento dos micrósporos, levandoos a formar células vegetativas ao invés de grãos de pólen
(GEORGE & SHRRINGTON, 1984). Portanto, a célula
gametofítica masculina pode ter o seu desenvolvimento normal
alterado, dando origem a embriões somáticos com potencial
para regenerar plantas homozigotas (VASIL et al., 1979).
Contudo, os mecanismos básicos pelos quais os
micrósporos se desviam de sua rota ontogenética normal
ainda são pouco compreendidos, o que dificulta a indução
da androgênese em algumas espécies e limita sua aplicação
nos modernos programas de melhoramento. Todavia,
estudos têm mostrado que o redirecionamento da rota
ontogenética dos micrósporos necessita de um estímulosinal, como por exemplo o choque térmico (calor ou frio)
(KALTCHUK-SANTOS & BODANESE-ZANETTINI, 2002).
As condições ótimas de incubação, principalmente
temperatura e iluminação, dependem da espécie e mesmo
do genótipo, mas geralmente as temperaturas ideais variam
entre 20 e 28oC, sendo que a pré-incubação em baixas
temperaturas é relatada como benéfica para muitas espécies
(MARTINEZ et al., 1989).
Moraes Fernandes (1990), cita que a composição
do meio de cultura, particularmente os reguladores de
crescimento, estão entre os fatores mais importantes que
determinam a regeneração de embriões haplóides, e que
dentre os principais grupos desses reguladores estão as
citocininas. O thidiazuron (TDZ) é um regulador de
crescimento derivado de uréia mas com estrutura que não
contém anel purínico, ao contrário do que acontece nas
citocininas. Inicialmente, esse composto foi registrado
como desfolhante de algodão, e mais recentemente foi
reportado como tendo ação citocinínica, e por isto, tem
sido bastante usado no cultivo in vitro (ANDRADE, 1998).
Araújo (2004), estudando a calogênese em anteras
oriundas de uma população segregante F2 de Coffea
arabica L., inoculou tais explantes em meio de indução de
calos (IC) suplementado de 2,4-D e cinetina; meio IC
suplementado de cinetina, ácido indol butírico (AIB) e 2,4D e meio IC suplementado com cinetina, ácido giberélico
(GA3) e ANA. Concluiu que a combinação entre 2,4-D e
cinetina favorece a indução de calos primários e que o GA3
possui um efeito no aumento da rapidez de crescimento
dos calos provenientes de anteras de cafeeiro.
Mustafa (2003) inoculou anteras da cultivar Catuaí
Vermelho IAC 99, em ausência e presença de luz, e anteras
da cultivar Mundo Novo em presença de luz, em meio MS
suplementado com 2,4-D e BAP. Os resultados mostraram
que é necessária a combinação entre auxina e citocinina
para que ocorra intumescimento das anteras e indução e
aumento no tamanho dos calos. Além disso, foi observado
que anteras submetidas à ausência de luz obtiveram
menores índices de oxidação.
Mais recentemente, Araújo et al. (2003), em um
trabalho sobre indução in vitro de calogênese em anteras
de cafeeiro, submeteram explantes florais de Coffea arabica
L. cultivar ‘Rubi’ e de uma população segregante F2, a
diferentes concentrações de ácido 2,4- diclorofenoxiacético
(2,4-D) combinadas com cinetina, e obtiveram
aproximadamente, 40% de calos para a cultivar ‘Rubi’ e
32,18% para a população F2.
Porém, em alguns experimentos, a técnica não se
mostra adequada, visto que vários fatores podem
influenciar na resposta das anteras cultivadas. Entre eles,
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 23-28, 2007
Efeito de pré-tratamentos em botões florais...
os mais importantes são o genótipo do material a ser
cultivado, o estádio de desenvolvimento do explante, as
condições de cultivo e idade das plantas doadoras, meio
de cultura e condições físicas da cultura pré e pós
inoculação (MORAES FERNANDES, 1990).
Apesar de experimentos envolvendo cultura de
anteras de café serem realizados desde 1973 (SHARP et al.,
1973), resultados de regeneração de plantas foram
conseguidos somente em 1987 (ASCANIO & ARCIA, 1987;
CARNEIRO, 1987) e pouco se conhece sobre as cultivares
mais responsivas ao cultivo in vitro, sobre a ação e
concentração de alguns reguladores de crescimento e sobre
pré-tratamentos que melhor induzem à androgênese, no
cafeeiro. Para suprir essa carência, objetivou-se com este
trabalho, testar o efeito de vários pré-tratamentos e de
doses de TDZ, sobre a cultura de anteras em duas
cultivares de Coffea arabica L., visando a indução de calos
e regeneração de plântulas duplo-haplóides.
MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram conduzidos no laboratório
de Cultura de Tecidos Vegetais da Universidade Federal
de Uberlândia (UFU), Uberlândia-MG. Foram utilizadas as
cultivares Mundo Novo IAC 379-19 e Catuaí Vermelho IAC
99, da espécie Coffea arabica L.
Botões florais com 4,5 a 6,0 mm de comprimento,
aferidos com o auxílio de um paquímetro, foram coletados
e submetidos a três pré-tratamentos com duração de 24
horas: choque frio (geladeira a 4oC), choque de calor (estufa
a 35oC) e temperatura ambiente.
Após os pré-tratamentos, os botões florais foram
desinfestados em uma solução de álcool a 70% por um
segundo, e por 15 minutos, em uma solução de hipoclorito
de sódio a 1%, sob agitação. A seguir, em câmara de fluxo
laminar, os botões foram lavados por três vezes com água
destilada autoclavada. As anteras foram retiradas dos
botões florais através de uma incisão em um de seus lados
com o auxílio de bisturi. Na tentativa de minimizar os
processos de oxidação e contaminação, antes de
inoculadas as anteras foram imersas por um segundo em
25
uma solução de ácido ascórbico (600 mg.L-1), a seguir em
hipoclorito de sódio a 0,2% por um segundo e, finalmente,
enxaguadas em água destilada autoclavada.
As anteras foram inoculadas em tubos de ensaio
contendo 10 ml do meio MS (Murashige & Skoog, 1962),
suplementado com TDZ nas concentrações de 0,001; 0,01;
0,1 e 1,0 mg.L -1 . Após a inoculação, as anteras
permaneceram em sala de crescimento a uma temperatura
de 25 ± 2°C e fotoperíodo de 16 horas, com intensidade
luminosa de 2500 lux.
O delineamento experimental foi o de blocos
casualizados, uma vez que as anteras foram inoculadas em
dias diferentes, em esquema fatorial 2x3x4 (duas cultivares,
três pré-tratamentos e quatro concentrações de TDZ), com
quatro repetições por tratamento. Cada parcela experimental
foi composta por quatro tubos, contendo cinco anteras
por tubo. Foram realizadas avaliações aos 10, 20 e 30 dias
após o plaqueamento, dos seguintes índices: anteras
oxidadas, anteras contaminadas, anteras intumescidas e
anteras com calosidades, para todos os pré- tratamentos.
Os dados obtidos foram testados quanto à
normalidade e à homogeneidade, com a utilização do
programa PROPHET, necessitando de transformação para
x 1/2 . Para a análise de variância, os dados foram
analisados pelo programa SANEST, com aplicação do teste
de F a 1 e 5% de probabilidade. As cultivares e os prétratamentos foram analisados pelo teste de Tukey, a 1 e
5% de probabilidade.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os dados obtidos para os níveis de TDZ não foram
significativos, em nenhum dos períodos de cultivo in vitro
analisados. Houve interação significativa, a 5% de
probabilidade, somente para cultivar e para pré-tratamento
aos 10 dias de cultivo in vitro. Aos 30 dias de cultivo in vitro,
os dados para a variável oxidação não foram significativos.
Aos 10 dias de cultivo in vitro, a cultivar Mundo
Novo apresentou maiores índices de oxidação para os prétratamentos choque frio e temperatura ambiente que a
cultivar Catuaí (Tabela 1).
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 23-28, 2007
26
FIGUEIRA, E. R. et al.
TABELA 1 – Número médio de anteras oxidadas nas cultivares Mundo Novo e Catuaí, para os pré-tratamentos por
choque frio, choque de calor e temperatura ambiente, aos 10 dias de cultivo in vitro.
Médias seguidas por letras distintas na coluna diferem entre si, pelo teste de Tukey, a 1% de probabilidade.
Aos 20 dias de cultivo in vitro, Mundo Novo
também apresentou maior oxidação quando comparada à
Catuaí. Em relação aos pré-tratamentos, os de choque de
calor e a temperatura ambiente obtiveram o maior número
médio de anteras oxidadas (Tabela 2).
O cafeeiro, como outras espécies lenhosas, libera
substâncias fenólicas e, por essa razão, deve-se adicionar
ao meio de cultura substâncias antioxidantes. No presente
trabalho, apesar do uso de ácido ascórbico nas anteras,
ainda houve oxidação.
A presença do regulador de crescimento TDZ no
meio de cultura pode ter aumentado o processo de oxidação
significativa, a 5 % de probabilidade, entre choque frio e
temperatura ambiente (Tabela 4). Aos 30 dias de cultivo in
vitro, os dados para a variável pré-tratamento não foram
significativos.
Houve maior formação de calosidades nas anteras
da cultivar Catuaí, que nas do Mundo Novo. O choque
frio foi o melhor pré-tratamento para a indução de
calosidades, seguido pela temperatura ambiente, aos 10,
20 e 30 dias de cultivo in vitro (Tabela 5).
Apesar do TDZ ser mais ativo que outras
citocininas, pois ele não é tão facilmente degradado
(ANDRADE, 1998) e de ser bastante utilizado para
das anteras, conforme relatado por Nogueira et al. (2003).
Estes autores observaram que a adição de TDZ causou
necrose em segmentos nodais de murici-pequeno e inibiu
a formação de brotações.
Os maiores índices de contaminação aos 10 dias de
cultivo in vitro foram observados para o pré-tratamento
por choque de calor. Aos 20 dias, não houve diferença
significativa entre os pré-tratamentos choque de calor e
choque frio e, aos 30 dias de cultivo in vitro, não houve
diferença significativa entre os pré-tratamentos (Tabela 3).
No início do cultivo in vitro as anteras apresentaram um
maior índice de contaminação no pré-tratamento por choque
de calor, provavelmente devido ao fato da maior
temperatura ter favorecido a proliferação de
microrganismos.
Quanto ao intumescimento, a cultivar Catuaí foi a
que obteve os maiores índices, aos 10, 20 e aos 30 dias de
cultivo in vitro. Em relação aos pré-tratamentos, choque
frio obteve os maiores índices de intumescimento aos 10
dias de cultivo in vitro, já aos 20 dias, não houve diferença
promover a regeneração in vitro em muitas espécies,
particularmente em lenhosas (SHAN et al., 2000), não
houve resposta para a aplicação do TDZ nos níveis
estudados.
No presente estudo, o pré-tratamento por choque
frio aumentou o intumescimento e a indução de calos nas
anteras, principalmente na cultivar Catuaí, entretanto, estas
não formaram embrióides.
A dificuldade para a formação de embrióides e
regeneração de plantas provavelmente está relacionada
à grande variedade de fatores que interferem no
processo androgenético, tais como o genótipo, uma vez
que é comum a diferença na resposta à androgênese,
entre cultivares (ARAÚJO, 2004; LUZ et al., 2001), o
estado fisiológico do cafeeiro durante o seu cultivo e
no momento da retirada de suas anteras e as variações
ambientais (LUZ, 1995). Além disso, a oxidação por
substâncias fenólicas, observadas em todos os
tratamentos, pode ter reduzido a resposta das anteras à
androgênese.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 23-28, 2007
Efeito de pré-tratamentos em botões florais...
27
TABELA 2 – Número médio de anteras oxidadas das cultivares Mundo Novo e Catuaí submetidas à pré-tratamentos
por choque frio, choque de calor e temperatura ambiente, aos 20 dias de cultivo in vitro.
TABELA 3 – Número médio de anteras contaminadas para
os pré-tratamentos choque frio, choque de calor e
temperatura ambiente, aos 10, 20 e 30 dias de cultivo in
vitro.
Médias seguidas por letras distintas na coluna diferem
entre si, pelo teste de Tukey, a 1% de probabilidade.
Todavia, os resultados obtidos com o
intumescimento das anteras e o início da formação de
calosidades evidenciam que pré-tratamentos e a escolha
do genótipo são muito importantes para o estabelecimento
de um protocolo para a produção de duplo-haplóides in
vitro. Para a otimização destes protocolos sugere-se que
mais estudos sejam realizados visando a seleção de
genótipos mais responsivos e de fatores ambientais que
tenham influência sobre a resposta das anteras de Coffea
arábica L. cultivadas in vitro.
CONCLUSÕES
TABELA 4 – Número médio de anteras intumescidas
para os pré-tratamentos choque frio, choque de calor e
temperatura ambiente, aos 10 e 20 dias de cultivo in
vitro.
Com base nos resultados obtidos nesse trabalho,
conclui-se que:
O pré-tratamento de botões florais por choque frio
é eficiente para induzir calosidades em anteras de Coffea
arabica cultivadas in vitro.
A cultivar Catuaí Vermelho IAC 99 é mais responsiva
à androgênese que a cultivar Mundo Novo IAC 379-19.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Médias seguidas por letras distintas na coluna diferem
entre si, pelo teste de Tukey, a 5 % de probabilidade.
TABELA 5 – Número médio de anteras com calosidades
para os pré-tratamentos por choque frio, choque de calor e
temperatura ambiente, aos 10, 20 e 30 dias de cultivo in vitro.
Médias seguidas por letras distintas na coluna diferem
entre si, pelo teste de Tukey, a 5 % de probabilidade.
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Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 23-28, 2007
CRESCIMENTO
IN VITRO
DE GLOXÍNIA
EM DIFERENTES 29
Crescimento
in vitro de gloxínia
em diferentes formulações...
FORMULAÇÕES MINERAIS E CONCENTRAÇÕES DE SACAROSE
IN VITRO GROWTH OF GLOXINIA IN DIFFERENT MINERAL FORMULATIONS AND
SUCROSE CONCENTRATIONS
APARECIDA GOMES DE ARAUJO1, LEILA APARECIDA SALLES PIO1,
MOACIR PASQUAL2, ALBA REGINA PEREIRA1, FABÍOLA VILLA1
1
Engenheira Agrônoma, Pós Graduação Fitotecnia – Departamento de Agricultura/DAG – Universidade Federal de Lavras/UFLA –
Cx. P. 3037 – 37200-000 – Lavras, MG.
2
Engenheiro Agrônomo, Dr., Professor Titular do Departamento de Agricultura/DAG – Universidade Federal de Lavras/UFLA – Cx. P. 3037 –
37200-000 – Lavras, MG – [email protected]
RESUMO
A produção de espécies ornamentais a partir de técnicas
de cultura de tecidos é uma alternativa viável para a obtenção de
um grande número de plantas com alta qualidade genética e
fitossanitária e em curto espaço de tempo. Objetivou-se avaliar o
desenvolvimento in vitro de explantes de gloxínia (Sinningia
speciosa Hiern.) em diferentes formulações minerais e
concentrações de sacarose. Segmentos nodais com,
aproximadamente 1,0 ± 0,5 cm de comprimento e contendo 2
gemas, oriundos de plântulas preestabelecidas in vitro, foram
inoculados nos meios contendo os sais de Knudson C, WPM, B5
e MS combinados com diferentes concentrações de sacarose (0,
15, 30, 45 e 60 g L-1), acrescidos de 1 mg L-1 de BAP (6benzilaminopurina). O pH do meio foi ajustado para 5,8 ± 0,1 e
solidificado com 6 g L-1 de ágar. Após o preparo, os meios foram
distribuídos em tubos de ensaio (150 x 25 mm) na quantidade de
15 mL/tubo, vedados com tampas de polipropileno e autoclavados
a 121oC, 1 atm por 20 minutos. Após a inoculação, os tubos
foram transferidos para sala de crescimento, com luminosidade
em torno de 35 ìmol m-2 s-1, temperatura de 25±2oC e fotoperíodo
de 16 horas. O delineamento experimental utilizado foi o
inteiramente casualizado, com 4 repetições e 3 tubos por parcela.
Decorridos 60 dias, avaliou-se o comprimento da parte aérea,
número de brotos, número de folhas e massa fresca de brotações.
Melhores resultados para o crescimento in vitro de gloxínia são
obtidos com a formulação de sais de MS, combinado com 60 g L-1
de sacarose, para todas as variáveis analisadas.
Termos para indexação: Sinningia speciosa Lood. Hiern., sais
minerais, carboidrato, gloxinia.
ABSTRACT
The production of ornamental species using tissue
culture techniques is a viable alternative to obtain a larger amount
of uniform plants with high genetic and health quality in a short
period of time. The objective of this work was to evaluate the
in vitro development of gloxinia (Sinningia speciosa Hiern.)
explants in different culture mineral formulations and sucrose
concentrations. Nodal segments measuring approximately 1.0
cm length, containing two buds, extracted from in vitro
prestablished plants, were inoculated in the Knudson C, WPM,
B5 and MS culture media combined with different sucrose
concentrations (0, 15, 30, 45 and 60 g L-1), supplemented with
1mg L-1 BAP (6-benzylaminopurine). The pH was adjusted to
5.8 ± 0.1 and the medium was supplemented with 6g L-1 agar.
After preparation, the media were distributed in test tubes
(150 x 25 mm), in a volume of 15 mL /tube after which they
were sealded with polypropylene tops and autoclaved at 121ºC,
at 1 atm pressure for 20 minutes. After inoculation, the explants
were transfered to growth rooms, with irradiance of 35 mmol
m-2 s-1, temperature of 25 ± 2ºC and a 16h photoperiod. The
experimental design used was entirely random, with 4 replicates
and 3 test tubes per plot. The best results obtained for gloxinia
in vitro growth were obtained with the use of MS medium,
supplemented with 60 g L -1 sucrose for all the analyzed
variables.
Index terms: Sinningia speciosa , culture medium, carbohydrate,
gloxinia.
INTRODUÇÃO
A propagação convencional da gloxínia é feita por
meio de sementes, gerando variações nas plantas
produzidas. O emprego das técnicas de cultura de tecidos
tem se tornado uma alternativa bastante viável para
obtenção de um grande número de plantas com qualidade
fitossanitária, e vem sendo utilizada para espécies de grande
valor comercial, especialmente plantas ornamentais. A
propagação in vitro pode ser feita a partir de brotos apicais
ou segmentos foliares, em formulações salinas de MS,
suplementado com reguladores de crescimento.
Vários autores têm relatado a possibilidade de
reduzir a concentração de sais de MS para diversas
espécies, visando, principalmente, melhor
(Recebido em 03 de novembro de 2003 e aprovado em 28 de maio de 2007)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 29-34, 2007
30
ARAUJO, A. G. de et al.
desenvolvimento das plantas e redução nos custos
(OLIVEIRA, 1994). Lu et al. (1990) utilizaram 50% da
formulação de sais de MS, obtendo bom enraizamento em
crisântemo. Resultados similares foram obtidos por
Muangkaewngam & Chato (1992) e Paiva et al. (1997) com
a utilização de 50% dos sais de MS, para o desenvolvimento
in vitro de gloxínia.
A concentração de sacarose no meio de cultura é
um fator determinante na promoção de crescimento e é
dependente do tipo de explante (CALDAS et al., 1998).
Concentrações de 2 a 4% (p/v) são as mais comuns. Abaixo
dessa faixa, pode ocorrer clorose nas culturas e, acima
dela, pode-se incorrer em problemas de excessivo potencial
osmótico do meio, possibilitando deterioração das culturas
(GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). George (1993)
observa que a presença de sacarose no meio de cultura
inibe a formação de clorofila e, conseqüentemente, a
fotossíntese, prejudicando o crescimento autotrófico.
Estudos comprovaram que 75 a 85 % do aumento
da biomassa se deve à incorporação de carbono pela adição
de sacarose (RIEK et al., 1997). A concentração mais utilizada
no preparo do meio de cultura Knudson é de 20 g L-1,
entretanto modificações nesse valor podem beneficiar o
cultivo in vitro.
Por outro lado, o excesso de sacarose pode ser
prejudicial, pois inibe a síntese de clorofila e, portanto,
reduz a capacidade fotossintética das culturas, mesmo
sendo essencial ao crescimento (YAMADA & SATO,
1978). Foi observado aumento na taxa de fotossíntese, em
subculturas sucessivas, quando a concentração de
sacarose foi reduzida de 20 ou 40 g L-1 para 10 g L-1
(PASQUAL, 2001). Embora o açúcar não seja o componente
de maior custo no preparo do meio de cultura, a redução
da sua concentração pode ser economicamente favorável,
especialmente para produção comercial de mudas
(HOFFMANN, 1999).
Conduziu-se o presente trabalho para avaliar o
efeito da sacarose e diferentes formulações salinas no
crescimento in vitro de gloxínia (Sinningia speciosa
Hiern.).
MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de
Cultura de Tecidos Vegetais, do Departamento de
Agricultura, da Universidade Federal de Lavras (UFLA),
Lavras- MG.
O material vegetal utilizado consistiu de segmentos
nodais medindo aproximadamente 1,0 ± 0,5 cm de
comprimento e contendo 2 gemas, oriundos de plântulas
preestabelecidas in vitro, em meio de cultura MS.
Os tratamentos constituíram-se de diferentes
formulações minerais de Knudson C (KNUDSON, 1946);
WPM (LLOYD & MCCOWN, 1980); B5 (GAMBORG,
1968) e MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) acrescidos
de 1 mg L-1 de BAP, combinados com sacarose nas
concentrações de (0, 15, 30, 45 e 60 g L-1). O pH do meio
foi ajustado para 5,8 ± 0,1 e solidificado com 6 g L-1 de
ágar. Após o preparo, 15 mL de meio de cultura foram
distribuídos em tubos de ensaio, com dimensões de 150
x 25 mm, os quais foram vedados com tampas de
polipropileno, identificados e autoclavados a 121oC e 1
atm por 20 minutos. O delineamento experimental
utilizado foi o inteiramente casualizado, perfazendo um
fatorial de 4 x 5, com 4 repetições, e três tubos por
repetição.
Após 45 dias, em sala de crescimento com
irradiância de 35 mmol m-2 s-1, temperatura de 25±2oC e
fotoperíodo de 16 horas, foram avaliados os seguintes
parâmetros: número de folhas, número de brotos,
comprimento da parte aérea, ou seja, comprimento médio
de brotos e massa frescas de brotações. Os dados não
sofreram nenhum tipo de transformação e na análise
estatística do experimento foi utilizado o programa Sisvar
(FERREIRA, 2000).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A análise de variância para número de folhas,
número de brotos, comprimento da parte aérea e massa de
plântulas fresca demonstrou que houve diferença
significativa para as diferentes formulações salinas dos
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 29-34, 2007
Crescimento in vitro de gloxínia em diferentes formulações...
31
meios de cultura utilizados e concentrações de sacarose,
ou seja houve interação entre os fatores estudados.
Para a variável número de folhas houve uma
tendência de crescimento linear à medida em que a
concentração de sacarose aumentou até 60 g L-1 para os
sais de MS. As demais formulações salinas de Knudson C,
WPM e B5 tiveram resultados inferiores, observando-se
um aumento no número de folhas, até a concentração de
30 g L-1 de sacarose. A partir desse ponto, verifica-se uma
redução na formação de folhas novas (Figura 1).
O maior número de folhas (50,9 em média) foi
verificado na formulação de sais de MS, combinado com
60 g L-1 de sacarose (Figura 1). Isso se explica, pois a
formulação de MS possui maior quantidade de sais
minerais em comparação às outras formulações salinas e,
juntamente com a sacarose, favorecem a emissão de folhas
(CALDAS et al., 1998).
Estes resultados contradizem aqueles obtidos por
Araujo et al. (2004), que observaram maior número de folhas
em plântulas de gloxínia (12 folhas/broto), em meio MS, com
50% de sais minerais, suplementado com 30 g L-1 de
sacarose, na ausência de BAP.
O maior número de brotos foi alcançado com a
utilização da formulação salina de MS, combinado com 60
g L-1 de sacarose, obtendo-se uma média de 8,0 brotos/
plântula, seguida da formulação salina do meio B5,
suplementada com 30 g L-1 de sacarose, que apresentou
7,2 brotos/explante (Figura 2).
Resultados contraditórios foram obtidos por Araujo
et al. (2004) que verificaram maior número de brotos (3,5)
em plântulas de gloxínia quando se utilizou o meio ½ MS,
30 g L-1 de sacarose e 2,0 mg L-1 de BAP.
Maior número de brotos foi observado em sais de MS
em comparação com os sais WPM e KC, em plântulas de
orquídea Brassocattleya ‘Pastoral’ x Laeliocattleya ‘Amber
glow’ cultivadas in vitro (ARAUJO, 2004). Estudando a mesma
espécie de orquídea, Silva (2003) verificou melhores respostas
em sais de MS, suplementado com 0,1 mg L-1 de ANA (ácido
naftaleno acético), em cultivo in vitro.
De acordo com a Figura 3, o maior comprimento da
parte aérea (2,42 cm) foi obtido quando utilizou-se a
formulação de sais de MS, combinado com a maior
concentração de sacarose (60 g L-1). Araújo et al. (2004)
estudando a mesma espécie obtiveram maior comprimento
FIGURA 1 – Número de folhas em brotos de gloxínia
cultivados em diferentes formulações salinas e
concentrações de sacarose. UFLA, Lavras, MG, 2003.
FIGURA 2 – Número de brotos em culturas de gloxínia
cultivadas em diferentes formulações salinas e
concentrações de sacarose. UFLA, Lavras, MG, 2003.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 29-34, 2007
32
ARAUJO, A. G. de et al.
médio dos brotos (1,68 cm), com a formulação de MS, com
50% de sais minerais.
Perkins et al. (1995) observaram maior incremento
na taxa de crescimento e desenvolvimento de Microtis
parviflora R. Br. com a suplementação de sacarose, no
meio de cultura. Bhattarcharjee et al. (1999), constataram
que a utilização de 20 g L-1 de sacarose, em comparação
com 0, 10 e 40 g L-1 de sacarose, proporcionou melhor
desenvolvimento foliar de híbridos de Phalaenopsis.
A utilização da formulação salina de MS
proporcionou maior massa fresca de brotações (0,85 g),
combinada com a concentração de 60 g L-1 de sacarose. As
demais formulações salinas tiveram resultados inferiores
(Figura 4).
Embora a alta concentração de sacarose tenha
elevado o potencial osmótico, a absorção de nutrientes
pelos explantes, possivelmente, não foi prejudicada devido
FIGURA 4 – Massa fresca de brotações de gloxínia
cultivadas em diferentes formulações de sais minerais
e concentrações de sacarose. UFLA, Lavras, MG,
2003.
à alta concentração de sais, no meio de cultura MS
(PASQUAL, 2001).
FIGURA3 – Comprimento da parte aérea em culturas de
gloxínia cultivadas em diferentes formulações de sais e
concentrações de sacarose. UFLA, Lavras, MG, 2003.
Araujo (2004), estudando diferentes meios de
cultura e concentrações de BAP, em plântulas de
Brassocattleya ‘Pastoral’ x Laeliocattleya ‘Amber glow’,
verificou o maior peso da matéria fresca de plântulas, nas
formulações de MS e WPM.
Melhores resultados para as variáveis número
de folhas, número de brotos, comprimento da parte aérea
e massa fresca de brotações de gloxínia foram
observados na formulação salina de MS, suplementado
com 60 g L-1 de sacarose. As formulações salinas WPM,
B5 e Knudson C apresentaram resultados inferiores. Essa
resposta, provavelmente, deve-se ao fato desses
possuírem baixa concentração de sais minerais em
relação ao MS e, sendo assim não propiciam condições
satisfatórias para o desenvolvimento de explantes de
gloxínia.
Verifica-se que a concentração de saturação de
sacarose está em torno de 30 g L-1, para as formulações
minerais WPM, B5 e Knudson C. Já os sais minerais de
MS, combinado com 60 g L-1 de sacarose, resultou em
melhores respostas para todas as variáveis.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 29-34, 2007
Crescimento in vitro de gloxínia em diferentes formulações...
CONCLUSÕES
O ponto de saturação de sacarose para a formulação
salina de MS não foi atingido, devendo-se realizar outros
experimentos, com concentrações mais elevadas.
Para o desenvolvimento in vitro de gloxínia,
melhores resultados são obtidos com a utilização dos sais
minerais de MS, combinado com 60 g L-1 de sacarose para
todas as variáveis estudadas.
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INDUÇÃO DE
CALOS
Indução
de calos inIN
vitroVITRO
de paricá...DE PARICÁ
(Schizolobium amazonicum HUBER EX DUCKE)
35
IN VITRO INDUCTION OF CALLUS OF Schizolobium amazonicum
HUBER EX DUCKE
IRACEMA MARIA CASTRO COIMBRA CORDEIRO1, OSMAR ALVES LAMEIRA2,
SELMA TOYOKO OHASHI3, LANA ROBERTA SOUSA REIS4
1
Engenheira Florestal, Doutoranda – Universidade Federal Rural da Amazônia/UFRA – Av. Presidente Tancredo Neves, Nº 2501 –
Montese – Cx. P. 917 – 66.077-530 – Belém, PA – [email protected]
2
Engenheiro Agrônomo, Doutor – Embrapa Amazônia Oriental – Laboratório de Biotecnologia – Tv. Eneas Pinheiro, sn – Marco – Cx. P. 48 –
66095-100 – Belém, PA – [email protected]
3
Engenheira Florestal, Doutoranda – Universidade Federal Rural da Amazônia/UFRA – Av. Tancredo Neves, 2501 – Terra Firme – Cx. P. 917 –
66077530 – Belem, PA – [email protected]
4
Bolsista de Iniciação Científica PIBIC/CNPq/UFRA/Embrapa Amazônia Oriental – Tv. Eneas Pinheiro, sn – Cx. P. 48 – 66095-100 –
Belém, PA – [email protected]
RESUMO
Conduziram-se ensaios com o objetivo de testar diferentes
concentrações de reguladores de crescimento na indução de calos
e regeneração de plantas de paricá com intuito de iniciar o processo
de embriogênese somática. Segmento nodal de plântulas
germinadas in vitro foram inoculados em diferentes concentrações
de BAP associado a AIB em meio MS, solidificado com 6 g L-1 de
agar, 30 g L-1 de sacarose e 1 g.L-1 de PVP. Para o subcultivo dos
calos os tratamentos foram dispostos num esquema fatorial 2 x
2, sendo constituídos pelas combinações das condições presença
e ausência de luz, com as concentrações de 67,86µM 2,4 D +
49,21µM 2iP e 4,41µM TDZ. O meio de cultura utilizado foi ½
MS com a concentração de nitrato de amônio reduzida a ¼,
adicionado de 30 g L-1 de sacarose e 1 g L-1 de acido ascórbico. Os
efeitos dos tratamentos foram avaliados através das variáveis de
respostas qualitativas e quantitativas. Aos vinte dias de cultivo,
o tratamento mais eficiente para indução de calos foi á combinação
de 6,66µM de BAP e 4,92µM de AIB, com 90% de calos. A
oxidação foi mais acentuada nos tratamentos com maiores
concentrações de BAP. Os calos apresentaram textura friável,
coloração variando de bege a amarelo. No subcultivo foi obtido
61,53% de formação de parte aérea no meio ½ MS contendo
¼NH4NO3 + 4,41µM TDZ na presença de luz.
Termos para indexação: Cultura de tecidos, regulador de
crescimento, Schizolobium amazonicu, paricá.
ABSTRACT
The objective of this work was to test different growth
regulators concentrations for callus induction and regeneration of
Schizolobium amazonicum plants in order to initiate the process
of somatic embryogenesis. Nodal segments of in vitro germinated
plantlets were inoculated in different concentrations of BAP
combined with IBA in MS medium, solidified with 6 g L-1 agar,
30 g L-1 sucrose and 1 g L-1 PVP. A 2 x 2 factorial with the
presence and absence of light and the concentrations 67.86 µM
2,4-D + 49.21 µM 2iP and 4.41 µM TDZ was used. The used
medium culture was MS 50% with the ammonium nitrate
concentration reduced to 25% supplemented with 30 g L-1 sucrose
and 1 g L-1 ascorbic acid. The effects of the treatments were
evaluated through qualitative and quantitative responsive
variables. With twenty days of culture, the most efficient
treatment for callus induction (90%) was the combination of
6.66 µM BAP and 4.92 µM IBA. Oxidation was observed in
treatments with higher concentrations of BAP. The callus
presented friable texture and coloration varying from beige to
yellow. Subculture provided the formation of 61.53% shoots in
MS 50% containing 25% NH4NO3 + 4.41µ M TDZ in the
presence of light.
Index terms: Tissue culture, growth regulators, Schizolobium
amazonicum, paricá.
INTRODUÇÃO
O intenso processo de exploração tem levado à
busca de novas fontes de produção de madeira, como o
reflorestamento. A espécie florestal Schizolobim
amazonicum Huber ex Ducke (paricá) vem sendo utilizada
nos programas de reflorestamento, no estado do Pará, pelo
rápido crescimento, com idade de rotação prevista para 14
anos de idade. Seleção de material genético de qualidade
pode reduzir este tempo de rotação para oito anos ou
menos. Para tanto a cultura de tecidos, através da
regeneração das plantas in vitro, diretamente, a partir do
explante ou através do cultivo de calos, pode ser uma
alternativa para propagação deste material de qualidade.
Pesquisas vêm sendo desenvolvidas para definir
metodologia de micropropagação da espécie, com vistas
ao melhoramento dos plantios.
Os tipos de cultivo in vitro para propagação de
espécies lenhosas não diferem muito daqueles utilizados
para outra espécie de planta. Entretanto, para estas
(Recebido em 02 de agosto de 2003 e aprovado em 25 de maio de 2007)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 35-40, 2007
36
CORDEIRO, I. M. C. C. et al.
espécies, como o paricá, a utilização de protocolos
convencionais de micropropagação tem sido dificultada
por vários fatores, destacando-se a formação de calos e a
constante presença de oxidação.
O calo é um tecido formado pela intensa divisão
das células do explante quando este é cultivado em meio
com alta concentração de auxina, na presença ou não de
citocinina. Em alguns casos, podem-se obter respostas in
vitro, sem o uso de reguladores de crescimento, no entanto,
muitas vezes, o crescimento e a morfogênese são regulados
pela interação e balanço entre reguladores de crescimento,
adicionados ao meio, e pelos níveis endógenos, produzidos
nas células cultivadas in vitro.
A concentração ideal dos reguladores de
crescimento depende dos padrões de absorção,
translocação e metabolismo na planta. O tipo de calo
formado, seu grau de diferenciação celular e o potencial
morfogenético dependem do explante e dos constituintes
do meio de cultura (GEORGE & SHERRINGTON, 1984). Os
calos também diferem em textura, friabilidade e coloração.
Alguns são compactos e crescem vagarosamente, outros
são friáveis e desintegram-se facilmente, quando
manipulados (AITCHISON et al., 1977); também a
friabilidade é importante para o cultivo de células em
suspensão (CID, 1992).
A manipulação de reguladores de crescimento é
uma das técnicas mais utilizadas no intuito de maximizar a
organogênese in vitro, entretanto, não foram encontrados
na literatura relatos de trabalhos sobre a indução de calos
de paricá. Conduziu-se, este trabalho para testar diferentes
tipos e concentrações de reguladores de crescimento na
indução de calos e regeneração de plantas de paricá,
visando iniciar a metodologia para o processo de
embriogênese somática.
MATERIAL E MÉTODOS
Indução de calogênese
Foram utilizados como explantes segmentos nodais
provenientes de plântulas de paricá, obtidas de germinação
in vitro. O meio de cultura utilizado foi MS (MURASHIGE
& SKOOG, 1962) solidificado com agar na concentração
de 6 g L-1, contendo 30 g L-1 de sacarose e 1 g L-1 de PVP
(polivinilpirrolidone), suplementado com 0,0; 4,44; 6,66;
8,88; 11,1 e 13,32 µM de BAP (6-benzilaminupurina),
associado com 4,92 µM de AIB (ácido indol butírico). O
pH do meio foi ajustado para 5,8, antes da autoclavagem a
120 °C por 15 minutos. Após este procedimento os
explantes foram mantidos, por um período de 20 dias, em
sala de incubação, com temperatura de 25º C ± 1º C, na
ausência de luz.
O delineamento utilizado foi inteiramente
casualizado, constando de 7 tratamentos com 5
repetições, sendo cada repetição composta por 5 tubos,
com um explante cada. Aos vinte dias de cultivo, foi
realizada a coleta de dados com a contagem de presença
e ausência de calos, oxidação, observação da coloração
e textura dos calos. As variáveis, calo e oxidação foram
avaliados através do teste qui-quadrado (X2) e expressos
em percentagem. Para coloração e textura utilizou-se
avaliação visual e para o tamanho dos calos considerouse como pequenos (P < 0,5 cm,); médios (M = 0,5 cm) e
grandes (G > 1,0 cm).
Subcultivo de calos
Os calos formados foram submetidos aos seguintes
tratamentos: na ausência e presença de luz, com as
concentrações de 67,86µM 2,4 D + 14,76µM 2iP e 4,41µM
TDZ. O meio líquido básico utilizado foi o ½ MS modificado
com a concentração do nitrato de amônio reduzida a ¼,
adicionado com 30 g L-1 de sacarose e 1 g L-1 de ácido
ascórbico. O pH do meio foi ajustado para 5,8, antes da
autoclavagem. Após a inoculação o material foi mantido
em sala de incubação em agitação de 76 rpm (rotação por
minuto), com temperatura de 25 ± 2ºC.
O delineamento experimental adotado foi
inteiramente casualizado, em esquema fatorial 2 x 2. A
avaliação foi realizada ao final de 20 dias, onde foram
observadas oxidação (OX), presença de pontos
esverdeados (PE), Raiz (R) e Parte aérea (Pa). Os resultados
foram expressos em percentagem.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 35-40, 2007
Indução de calos in vitro de paricá...
RESULTADOS E DISCUSSÃO
37
calos em explantes de espécies lenhosas. Andrade et al.
Indução de Calogênese
(2000), utilizando segmentos internodal e cotiledonar de
Na Tabela 1 estão registrados os resultados do teste
qui-quadrado, onde aparecem diferenças significativas
entre as concentrações de BAP, combinadas com AIB, ao
nível de 5% de probabilidade, permitindo a identificação
do tratamento com o maior percentual de formação de calos
e oxidação.
A presença de calos foi observada a partir do sexto
dia após a inoculação. Aos vinte dias de cultivo, explantes
mantidos na presença de BAP e, na combinação deste
com AIB, formaram calos. Por outro lado, quando os
explantes foram cultivados apenas com a presença de AIB,
não houve formação de calos (Tabela 1). Os resultados
indicaram a necessidade da citocinina no meio de cultura.
Tisseart (1985) observou aumento na formação de calos
quando adicionou citocinina ao meio. Isso, provavelmente,
deve-se ao fato de que o BAP possibilita a diferenciação e
desenvolvimento dos explantes em curto espaço de tempo,
dado o alto grau de atividade biológica das células.
Nos tratamentos contendo 6,66 e 11,1µM de BAP
ocorreu o maior percentual de calos formados nos
explantes, respectivamente, 90 e 85,4%. Essas observações
estão de acordo com as afirmações de Laszloffy et al. (1992),
que relatam a presença de altas concentrações de citocinina
no meio de cultura, o que induz à excessiva formação de
aroeira (Myracrodruon urundeuva Allem.), verificaram
surgimento de calos em praticamente todas as combinações
com altas concentrações de ANA, com BAP e Cinetina.
Para Litz & Jarret (1991), freqüentemente se induz à formação
de calos em explantes cultivados em meio contendo auxina,
ou com uma alta relação citocinina/auxina.
Lameira et al. (1997) obtiveram até 100% de formação
de calos em segmentos caulinares de erva-baleeira (Cordia
verbenaceae DC.), quando utilizou em meio de cultura MS,
2,04 e 6,13µM de TDZ. E Cerqueira et al. (2002), obtiveram
75% de formação de calos em segmentos foliares de ervade-touro (Tridax procumbens L.) quando adicionaram, ao
meio de cultura, as mesmas concentrações de ANA e BAP.
Do mesmo modo Silva (2000) em seu estudo com Carapa
guianensis Aubl, obteve 100% de formação de calos
quando utilizou a interação de 5,37µM de ANA e 4,64µM
de cinetina.
Geralmente concentrações semelhantes de auxina
e citocinina, no meio de cultura, promovem a formação
de calos, entretanto, as respostas de combinação ou a
interação desses reguladores de crescimento na
indução de calos, segundo George & Sherrington (1984)
podem variar de acordo com as condições da cultura,
tipo de explante e principalmente do genótipo. Santos
TABELA 1 – Percentagem de calos e oxidação em explantes nodais de paricá mantidos, na ausência de luz, em meio MS
suplementado com BAP e AIB. Embrapa Amazônia Oriental, Belém/ Pará, 2003.
*Diferenças significativas pelo teste qui-quadrado, ao nível de 5% de probabilidade.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 35-40, 2007
38
CORDEIRO, I. M. C. C. et al.
(1998) explica que os reguladores de crescimento agem
sobre a expressão gênica, fazendo com que, a partir de
células de tecidos organizados, se forme uma massa de
células cujo crescimento é, geralmente, rápido e muito
irregular.
No que concerne à oxidação, foi observado que,
á medida que aumentava a concentração de BAP com a
associação de AIB, maior era o percentual de oxidação
(Tabela 1). Altas concentrações de citocinina ao meio
de cultura podem provocar toxidez nos tecidos, fazendo
com que não haja absorção dos nutrientes contidos no
meio, o que ficou evidente no tratamento com a
concentração de 13,32 µM de BAP, onde o percentual
de oxidação foi de 70%. Os menores percentuais de
oxidação ocorreram nos tratamentos contendo somente
BAP ou AIB, respectivamente, 20 e 23% (Tabela 1). O
processo oxidativo também pode estar relacionado à
intensidade de luz, fotoperíodo, temperatura e à
concentração de sais minerais no meio de cultura
(MONACELLI et al., 1999).
Na Tabela 2, estão as respostas de variáveis
qualitativas obtidas em calos de segmento nodal de
paricá. De modo geral os explantes foram envolvidos por
uma massa globular, de coloração predominantemente
bege na presença das menores concentrações de BAP,
de bege amarelado na presença de 8,88 e 11,1µM de BAP
e chegando até amarelo, na presença da maior
concentração de BAP. O tamanho dos calos variou entre
grande, médio e pequeno durante todo período de cultivo,
os maiores tamanhos coincidem com as concentrações
mais altas de BAP associado á auxina e os menores na
concentração mais baixa, associada ou não à auxina.
Resultados semelhantes foram obtidos por Landa et al.
(2000), em experimento com Caryocar brasiliensis Camb.
(pequizeiro), com segmentos foliares de plantas jovens,
e foi observado que o uso apenas de BAP proporcionou
pequena formação de calos, porém, a interação entre os
reguladores de crescimento BAP e ANA os calos
apresentaram-se bem maiores. A textura foi
constantemente friável, porém, o aspecto visual foi
melhor, em concentrações mais baixas dos reguladores
de crescimento.
Diversos fatores podem influenciar na coloração e
consistência dos calos, entre eles concentração e tipo do
regulador de crescimento, usado no meio de cultura.
Geralmente, calos friáveis são correlacionados com um
menor estádio de diferenciação do que os calos compactos.
Conceição (2000) relata que, calos friáveis são induzidos a
partir de calos compactos, obtidos inicialmente em meio
sólido. Por outro lado Cid (1992) afirma que calos com essa
característica geralmente são aclorofilados, com coloração
amarela ou bege.
TABELA 2 – Respostas de variáveis qualitativas, em calos de segmentos nodais de plântulas germinadas in vitro de
Schizolobium amazonicum Huber ex Ducke, mantidos na ausência de luz, em meio MS, suplementado com BAP e AIB.
Embrapa Amazônia Oriental, Belém-Pará, 2003.
LEGENDA: Cor do calo (CC): (A= amarelo, B-bege e BA= bege amarelado); Textura do calo (TC): (F = friável e C=
compacto); e Tamanho do calo (T): (P < 0,5 cm, M = 0,5 cm e G > 1,0 cm): (-) sem formação de calo.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 35-40, 2007
Indução de calos in vitro de paricá...
Subcultivo de calos
39
transferidos para o subcultivo os calos, gradualmente,
De modo geral, todos os calos, quando transferidos
tornaram-se marrom. Após esse período, os calos ficaram
para o meio líquido, apresentaram formação de pontos
mais escuros e perderam a capacidade de regeneração.
esverdeados, ocorrendo o maior percentual (69,23%) no
Esses resultados diferem dos encontrados por Monacelli
tratamento contendo o meio ½ MS, com ¼ NH4NO3 +
et al. (1999) em segmentos caulinares de Vismia
4,41µM de TDZ, na presença de luz. A formação de parte
guianensis Seem. em meio MS, suplementado com 2,4 D
aérea somente ocorreu nos tratamentos que continham o
e KIN, onde os calos inicialmente eram escuros, duros
TDZ (Tabela 3).Respostas similares foram observadas por
com crescimento lento, mas após cinco a seis subcultivos,
Camargo (1997), com Bertholletia excelsa Humb. & Bonpl.
tornaram-se mais claros, friáveis e com crescimento
(castanha-do-Brasil), e por Landa et al. (2000) em explantes
rápido.
foliares de Caryocar brasiliensis Camb. (pequizeiro). Não
Vários trabalhos (GEOGE & SHERRINGTON, 1984;
foi observada a formação de raízes e os calos ficaram com
JOSEPH et al., 1996; MONACELLI et al., 1999; SANTOS,
aspecto oxidado e/ou necrosado, não havendo
1998) têm demonstrado que, certos grupos de plantas
regeneração.
respondem mais facilmente em culturas in vitro, que
Segundo relatos de George & Sherrington (1984) e
outros. Estas diferenças mostram que as condições ideais
Lameira et al. (1997), os calos quando são cultivados por
à calogênese dependem de vários fatores, tais como:
várias semanas apresentam a desaceleração do crescimento,
tamanho do explante; composição do meio de cultura;
necrose, escurecimento e finalmente secamento. Estes fatos,
reguladores de crescimento; órgão fornecedor do
provavelmente são resultados da carência ou exaustão de
explante; idade e época do ano em que o explante é
nutrientes no meio; inibição da absorção dos nutrientes;
colhido; e genótipo da planta doadora. Assim sendo, a
evaporação, acompanhada pelo aumento na concentração
manutenção dos calos pode apresentar alta freqüência
de algum nutriente; toxidez pela acumulação de metabólitos;
de variação, dependendo da espécie vegetal e do
e desequilíbrio no balanço dos reguladores de crescimento.
refinamento metodológico utilizado. Provavelmente, isso
Entretanto, essas respostas variam em função do balanço
tenha ocorrido por efeito fitotóxico da elevada
hormonal de cada espécie.
concentração dos reguladores de crescimento utilizados
Durante o primeiro cultivo, os calos eram bege,
bege amarelado e amarelo e todos friáveis; quando
no meio, o que comprova a necessidade de realização de
novos trabalhos.
TABELA 3 – Respostas morfogenéticas (%), observadas aos 20 dias de cultivo, em calos de Schizolobium amazonicum
Huber ex Ducke, submetidos a tratamentos para as condições presença e ausência de luz. Embrapa Amazônia Oriental,
Belém-Pará, 2003.
Pe = Pontos Esverdeados; Pa = Parte aérea; R = Raiz e Ox = Oxidação.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 35-40, 2007
40
CORDEIRO, I. M. C. C. et al.
CONCLUSÕES
Os resultados obtidos permitem concluir que, em
segmento caulinar de paricá do tipo nodal, houve a formação
de calos na maioria dos tratamentos testados, sendo que o
maior percentual ocorreu no meio MS, contendo 6,66 µM
de BAP + 4,92 µM de AIB. E ocorreu maior percentual de
oxidação nos tratamentos que continham as maiores
concentrações da citocinina.
Os calos apresentaram tamanhos variados, friáveis
e coloração, variando do bege ao amarelo, no primeiro
cultivo e marrom no subcultivo. O maior percentual na
formação da parte aérea ocorreu no subcultivo no meio ½
MS, contendo ¼ NH4NO3 + 4,41 µM de TDZ, na presença
de luz.
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Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 35-40, 2007
ACLIMATIZAÇÃO EX
VITROex DE
ABACAXIZEIRO
Aclimatização
vitro de
abacaxizeiro ornamental... ORNAMENTAL EM
41
SUBSTRATOS À BASE DE PÓ-DE-COCO
EX VITRO ACCLIMATIZATION OF ORNAMENTAL PINEAPPLE (Ananas comosus (L.)
Merr. var. erectifolius (L.B.Smith)) IN SUBSTRATES COMPOSED OF COIR POWDER
GUILHERME VIEIRA DO BOMFIM1, ANA CRISTINA PORTUGAL PINTO DE CARVALHO2,
FRED CARVALHO BEZERRA3, BENITO MOREIRA DE AZEVEDO4, THALES VINÍCIUS DE ARAÚJO VIANA5,
KÁRCIA MANOELA ARRUDA SILVA DE OLIVEIRA6
1
Engenheiro Agrônomo, Mestrando em Irrigação e Drenagem – Universidade Federal do Ceará/UFC/DENA – Av. da Universidade,
2853 – Benfica – 60020-181 – Fortaleza, CE – [email protected]
2
Bióloga, Dra. em Ciências Biológicas - Genética, Pesquisadora da Embrapa Agroindústria Tropical – Rua Dra. Sara Mesquita, 2.270 –
Pici – Cx. P. 3761 – 60511110 – Fortaleza, CE – [email protected]
3
Engenheiro Agrônomo, Dr. em Irrigação e Drenagem, Pesquisador da Embrapa Agroindústria Tropical – Rua Dra. Sara Mesquita,
2270 – Planalto – Pici – Cx. P. 3761 – 60511-110 – Fortaleza, CE – [email protected]
4
Engenheiro Agrônomo, Dr. em Irrigação e Drenagem, Professor Adjunto – Universidade Federal do Ceará/UFC – Av Mister Hull,
2977 – Bloco 804 – Campus do Pici – Antônio Bezerra – Cx. P. 12168 – 60356-000 – Fortaleza, CE – [email protected]
5
Engenheiro Agrônomo, Dr. em Irrigação e Drenagem, Professor Adjunto – Universidade Federal do Ceará/UFC/DENA – Departamento
de Engenharia Agrícola – Av. Mister Hull S/N – Campus do Pici – 60455-970 – Fortaleza, CE –[email protected]
6
Física, Licenciada em Física – Universidade Estadual do Ceará/UECE – Av. Parajana, 1700 – Campus do Itapery – 60.740 – Fortaleza, CE.
RESUMO
A aclimatização é uma etapa crítica da micropropagação
para muitas espécies vegetais, inclusive para o abacaxizeiro
ornamental (Ananas comosus (L.) Merr. var. erectifolius (L. B.
Smith) Coppens & F. Leal; que é uma planta de grande
importância para o Ceará, pois se destaca como a segunda
espécie ornamental mais exportada pelo Estado. A cultura é
produzida em larga escala pela micropropagação mas atualmente,
não se dispõe de informações técnicas e científicas sobre o seu
manejo em substratos para mudas, durante a fase de
aclimatização. Considerando a importância econômica da cultura
e carência de informações relacionadas com o cultivo das plantas
nesta fase, conduziu-se o presente estudo para avaliar o efeito
de diferentes substratos na aclimatização de mudas
micropropagadas dessa variedade ornamental. O experimento
foi conduzido em um telado da Embrapa Agroindústria Tropical,
situada no município de Fortaleza-CE (3º44’ S e 38º33’ W). As
mudas, contidas em tubetes de 180 cm3 e cultivadas nos
diferentes substratos, foram irrigadas por microaspersão, com
uma lâmina d’água de 3 mm, aplicada duas vezes ao dia. Os
tratamentos consistiram em quatro combinações de substratos
na proporção volumétrica de 3:1 (pó-de-coco seco com
Vitasolo®, pó-de-coco seco com húmus de minhoca, pó-de-coco
verde com Vitasolo ® e pó-de-coco verde com húmus de
minhoca). As variáveis agronômicas testadas foram o número
de folhas, a maior largura da 3ª folha e o maior diâmetro da
roseta, aos 83 dias após o transplantio, e as massas fresca e
seca das partes aérea e radicular. O delineamento experimental
utilizado foi o de blocos ao acaso, com 4 tratamentos e 5
repetições para as variáveis relacionadas com o desenvolvimento
foliar, e 4 tratamentos e 4 repetições para as variáveis
relacionadas com a produção de massa na planta. Todas as
parcelas continham 8 plantas cada. De acordo com os resultados,
o melhor desenvolvimento das mudas micropropagadas de
abacaxizeiro ornamental foi proporcionado pelos substratos à
base de pó-de-coco seco, especialmente, pelo substrato pó-decoco seco mais húmus de minhoca.
Termos para indexação: Micropropagação, Ananas comosus var.
erectifolius, Pó-de-coco seco, Pó-de-coco verde e Adubação orgânica.
ABSTRACT
The acclimatization is a critical stage of the micropropagation
for many vegetable species even to ornamental pineapple (Ananas
comosus (L.) Merr. var. erectifolius (L. B. Smith) Coppens & F.Leal.
This plant has a great importance to the state of Ceará since it has
been considered as the second state’s most exported ornamental
species. Although its large scale production may be achieved through
micropropagation, nowadays, technical or scientific information
about the management of substrate during the acclimatization phase
is not available. Considering the economic importance of the culture
and the lack of information about the cultivation of plants in this
phase, the objective of the present study was to evaluate the effect
of different substrates during acclimatization of micropropagated
plants. The research was performed in a greenhouse of the Embrapa
Tropical Agroindustry located in Fortaleza, Ceará State (3º44' S and
38º33' W). The plants, cultivated on different substrates in 180 cm3
pots, were irrigated twice a day with a water level of 3 mm. Four
different combinations of substrate were tested (3:1): dry coir powder
with Vitasolo®; dry coir powder with wormcompost; green coir
powder with Vitasolo® and green coir powder with wormcompost.
The tested agronomic variables were the number of leaves, the largest
width of the 3rd leaf and the largest diameter of the rosette, at 83
days after the transplant, and root and shoot fresh/dry masses. The
used experimental design was a randomized block with 4 treatments
and 5 replicates for the variables related to foliar development, and
with 4 treatments and 4 replicates for the variables related to
production of plant mass. Each one of plot comprised 8 plants. In
accordance with results, the best development of ornamental
pineapple micropropagated plants was observed using the substrate
composed by dry coir powder with wormcompost.
Index terms: Micropropagation, Ananas comosus var. erectifolius,
Dry coir dust, Green coir dust and Organic fertilization.
(Recebido em 22 de setembro de 2006 e aprovado em maio de 2007)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 41-48, 2007
42
BOMFIM, G. V. do et al.
INTRODUÇÃO
As bromélias são plantas ornamentais de rara beleza
que impressionam tanto por suas formas exóticas como
pela gama de cores e variedades de suas inflorescências.
Uma destas é o (Ananas comosus (L.) Merr. var. erectifolius
(L. B. Smith) Coppens & F.Leal, uma variedade de
abacaxizeiro ornamental que caracteriza-se por folhas
rígidas, eretas, sem espinhos e de coloração púrpura, e
frutos pequenos, cilíndricos e de coloração vermelha
(COPPENS-d’EECKENBRUGGE & LEAL, 2003).
Esta é a variedade de abacaxizeiro mais conhecida
e explorada como planta ornamental no Brasil e, atualmente,
assume o segundo lugar no ranking de exportações
cearenses de flores e plantas ornamentais. Pela à grande
demanda do mercado, a cultura, hoje, é produzida em escala
comercial por meio da micropropagação, uma técnica da
cultura de tecidos que, conforme Torres et al. (1998),
apresenta cinco etapas importantes. Uma delas, a
aclimatização, é uma fase muito crítica, pois é considerada
em alguns casos o principal gargalo da micropropagação
de várias plantas (HAZARIKA, 2003).
Entre os fatores que podem influenciar a
aclimatização de plantas micropropagadas, o substrato
apresenta grande relevância, pois influencia a resposta
das plantas através de suas características físicas, químicas
e biológicas (CORDÃO TERCEIRO NETO, 2004). A escolha
de substratos é um dos principais problemas técnicos que
muitos produtores têm enfrentado durante a aclimatização
do abacaxizeiro ornamental (Ananas comosus var.
erectifolius), pois, atualmente, não existem informações
técnicas e científicas sobre o seu manejo em substratos
para mudas. Nesse sentido, o presente trabalho foi realizado
para avaliar os efeitos de quatro substratos (pó-de-coco
seco com Vitasolo®, pó-de-coco seco com húmus de
minhoca, pó-de-coco verde com Vitasolo® e pó-de-coco
verde com húmus de minhoca) na aclimatização de mudas
micropropagadas desta variedade ornamental.
Agroindústria Tropical, localizada no município de
Fortaleza-CE (3º44’ S e 38º33’ W), com mudas
micropropagadas in vitro de abacaxizeiro ornamental
(Ananas comosus var. erectifolius).
Os materiais orgânicos usados na elaboração dos
substratos foram: húmus de minhoca; Vitasolo®; pó-decoco seco e pó-de-coco verde. O húmus de minhoca
(Fertilvida®) e o Vitasolo®, um material regional com matéria
orgânica superior a 48 %, alta retenção de umidade e pH
próximo da neutralidade (SANTOS et al., 2004), foram
obtidos já devidamente prontos no comércio local. Os pósde-coco verde e seco, por sua vez, tiveram que ser
processados em equipamentos apropriados, instalados nas
mediações da Empresa. Seu beneficiamento foi realizado
mediante a moagem do mesocarpo, adquirido na região
litorânea de Fortaleza, seguida de peneiramento.
Os materiais orgânicos resultaram em quatro tipos
de substrato, com proporções equivalentes a três partes
de pó-de-coco e uma parte de adubo orgânico (volume/
volume): pó-de-coco seco com Vitasolo® (PCS+V); pó-decoco seco com húmus de minhoca (PCS+H); pó-de-coco
verde com Vitasolo® (PCV+V) e pó-de-coco verde com
húmus de minhoca (PCV+ H).
A análise química dos substratos, efetuadas a partir
de amostras retiradas de cada combinação, foi elaborada com
base na metodologia de Sonneveld et al. (1974) (Tabela 1).
Os substratos, já devidamente prontos, foram
inseridos em 160 tubetes de 180 mL. Destes, 40 foram
preenchidos com PCS+V, 40 com PCS+H, 40 com PCV+V e
40 com PCV+H. Portanto, o volume de material utilizado na
formulação de cada substrato correspondeu a 135 mL de
pó-de-coco e 45 mL de adubo orgânico, por tubete.
As plantas (± 5 cm de altura com 4 a 5 folhas),
provenientes do material in vitro, foram retiradas dos
frascos, e as suas raízes foram lavadas em água corrente
para a retirada do excesso do meio de cultura. Após a
lavagem, as raízes foram podadas com o auxílio de uma
MATERIAL E MÉTODOS
tesoura para uniformizar o tamanho, facilitar o plantio e
O trabalho foi realizado em um telado do tipo
sombrite (50 % de sombreamento) pertencente à Embrapa
estimular o desenvolvimento de um sistema radicular mais
funcional.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 41-48, 2007
Aclimatização ex vitro de abacaxizeiro ornamental...
43
TABELA 1 – Características químicas dos substratos pó-de-coco seco mais Vitasolo® (PCS+V), pó-de-coco seco mais
húmus de minhoca (PCS+H), pó-de-coco verde mais Vitasolo® (PCV+V) e pó-de-coco verde mais húmus de minhoca
(PCV+ H), Fortaleza-CE, 2005.
Fonte: Laboratório de Solo e Água da Embrapa Agroindústria Tropical-CE;
(pH) potencial hidrogeniônico, (Corg) carbono orgânico, (CE) condutividade elétrica.
Extrator usado na determinação do pH e da CE foi a água na proporção volumétrica (amostra:extrator) de 1:1,5.
A partir do primeiro dia após transplantio (1º DAT),
e 4 repetições para as variáveis relacionadas com a
as plântulas foram irrigadas por microaspersão, com uma
produção de massa na planta. Cada parcela continha 8
lâmina d’água de 3 mm, parcelada duas vezes ao dia, uma
plantas. Assim, foram avaliadas 40 plantas por tratamento,
no período diurno, iniciando-se às 09h30min, e a outra no
o que representou um total de 160 plantas no experimento.
período vespertino, a partir das
14h30min. Quanto aos
Os tratamentos testados foram: pó-de-coco seco com
tratos culturais, todas as mudas receberam duas adubações
Vitasolo® (PCS+V); pó-de-coco seco com húmus de
mensais via foliar com um litro de uma solução nutritiva
minhoca (PCS+H); pó-de-coco verde com Vitasolo®
(1,56 mL·planta–1), contendo o meio de cultura MS
(PCV+V) e pó-de-coco verde com húmus de minhoca
(MURASHIGE & SKOOG, 1962), diluído a 25 % da
(PCV+H).
concentração original.
Os dados deste experimento foram submetidos a
Aos 83 dias após o transplantio (83 DAT), foram
uma análise de variância pelo método dos polinômios
analisadas as variáveis agronômicas: número de folhas,
ortogonais. Quando significativos, estes dados foram
maior largura da 3ª folha e maior diâmetro da roseta e, logo
comparados pelo teste de Tukey, a 5 % de probabilidade,
após este período, as massas fresca e seca das partes aérea
para verificar a existência de diferenças significativas entre
e radicular. O delineamento experimental foi o de blocos ao
os tratamentos. Nos tratamentos que apresentaram
acaso com 4 tratamentos e 5 repetições para as variáveis
diferença estatística, foi realizada uma comparação, em
relacionadas com o desenvolvimento foliar e 4 tratamentos
percentagem, dos resultados mais promissores (maiores
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 41-48, 2007
44
BOMFIM, G. V. do et al.
valores numéricos), com aqueles menos promissores
(menores valores numéricos).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os valores médios das variáveis relacionadas com o
desenvolvimento foliar constam na Tabela 2. De acordo com
os resultados, todas foram influenciadas pelos substratos.
Para o número de folhas, o resultado mais promissor
foi proporcionado pelo PCS+H. Este resultado foi 8,15,
9,67 e 16,57 % superior aos propiciados pelo PCS+V, PCV+H
e PCV+V, nesta ordem. O PCS+V, por sua vez, foi mais
eficiente que o PCV+V em 9,7 %.
Quanto à maior largura da 3ª folha e ao maior
diâmetro da roseta, nota-se (Tabela 2) que os resultados
foram similares. Na primeira variável, o PCS+H foi 12,19 e
17,56 % superior ao PCV+H e PCV+V, respectivamente. Já
na segunda, esta superioridade foi de 14,62 e 24,44 %. Nas
duas variáveis o PCS+V superou o PCV+V em 11,98 (maior
largura da 3ª folha) e 20,63 % (maior diâmetro da roseta).
Alguns autores obtiveram, em experimentos,
resultados semelhantes aos encontrados nesta pesquisa.
Por exemplo, Souza Júnior et al. (2001), quando analisaram
o efeito de três tipos de substrato na aclimatização de
mudas de abacaxizeiro (Ananas comosus cv. Perola),
verificaram que as melhores respostas de crescimento, em
condições ex vitro, foram alcançadas mediante a utilização
do substrato formulado com húmus de minhoca.
A superioridade do substrato PCS+H em relação aos
substratos à base de pó-de-coco verde pode ser explicada,
provavelmente, pela baixa salinidade (1,8 dSm-1), alta
concentração de nitrogênio e valor adequado de pH
(Tabela 1). A baixa concentração salina do PCS+H em
relação ao PCV+H (3,1 dSm-1) e, principalmente, ao PCV+V
(4,9 dSm-1) pode ter contribuído positivamente para o
melhor desenvolvimento das plantas. O mesmo ocorreu
com o PCS+V (0,6 dS·m-1) em comparação ao PCV+V. Isso
porque é de conhecimento que a salinidade, acima do nível
tolerado pelas plantas, pode reduzir o crescimento vegetal
pelo déficit hídrico, pela toxidade de íons específicos
(AYERS & WESTCOT, 1999), pelo desbalanceamento
iônico (WALKER, 1986), ou ainda, pela combinação de
algum destes fatores (SOARES et al., 2005).
A alta salinidade contribui para a retenção da água
no substrato, pelo aumento da pressão osmótica e pode
provocar déficit hídrico na planta (AYERS & WESTCOT,
1999). McCree & Fernández (1989) salientam que o déficit
hídrico diminui a expansão foliar, acelera a senescência,
reduz o índice de área foliar e aumenta a abscisão das
folhas, logo, prejudica o desenvolvimento das plantas. Para
Berkowitz (1988), a reduzida disponibilidade de água no
meio ainda pode prejudicar a absorção de nutrientes pelas
raízes das culturas, uma vez que, no geral, a disponibilidade
de água e nutrientes é positivamente correlacionada, ou
seja, os nutrientes só encontram-se disponíveis às raízes
TABELA 2 – Valores médios das variáveis número de folhas (NF), maior largura da 3ª folha (MLF) e maior diâmetro da
roseta (MDR) de abacaxizeiro ornamental (Ananas comosus var. erectifolius), aos 83 dias após o transplantio das
mudas, de acordo com os substratos pó-de-coco seco mais Vitasolo® (PCS+V), pó-de-coco seco mais húmus de
minhoca (PCS+H), pó-de-coco verde mais Vitasolo® (PCV+V) e pó-de-coco verde mais húmus de minhoca (PCV+H),
Fortaleza-CE, 2005.
Médias seguidas de mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5 %.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 41-48, 2007
Aclimatização ex vitro de abacaxizeiro ornamental...
quando estão diluídos na solução do solo (na presença da
água). Os sintomas que normalmente ocorrem em plantas
afetadas pela salinidade caracterizam-se pelo
desenvolvimento lento e redução do tamanho das folhas
que, inclusive, tornam-se mais grossas (SANTOS &
CARLESSO, 1998). Esses sintomas também foram notados
durante a realização deste experimento nas mudas de
abacaxizeiro ornamental, cultivadas nos substratos com
elevado valor de CE (Tabela 1), neste caso, no PCV+H e,
especialmente, no PCV+V.
Segundo Silva & Marouelli (1998), os principais
íons causadores de fitotoxidade são o boro, o cloreto e o
sódio. Até em concentrações baixas, estes íons podem
causar efeitos tóxicos às plantas que, normalmente, podem
ser visualizados pela queimadura das pontas ou bordas
foliares (AYERS & WESTCOT, 1999). No caso do
abacaxizeiro ornamental, mesmo com distintas
concentrações de sódio em cada substrato (Tabela 1),
nenhum sintoma de fitotoxicidade, como estes reportados
pelos autores, foi visualizado.
Aquino (2004) retrata que o desbalanceamento
iônico pode provocar um fenômeno conhecido como
inibição competitiva, em que cátions ou ânions de mesma
carga competem entre si pelos sítios de absorção
localizados nas raízes. Nesta concorrência, os íons em
maior concentração acabam sendo preferencialmente
absorvidos em detrimento de outros, provocando
possíveis sintomas de deficiência e, por conseguinte,
redução acentuada do desenvolvimento vegetal. No atual
experimento, as plantas cultivadas no PCV+V
apresentaram sintomas de deficiência nutricional,
visualizados pelo retardamento do crescimento e clorose
foliar. É provável que a elevada concentração iônica
presente no substrato (Tabela 1), possivelmente
aumentada pelas aplicações da solução nutritiva
(adubação foliar), tenha favorecido o aparecimento de
fenômenos relacionados com a competição entre íons.
Uma análise química foliar indicaria quais foram os
elementos químicos que mais influenciaram o
desenvolvimento das mudas.
45
A presença do nitrogênio em maior concentração
(Tabela 1) foi, possivelmente, um dos fatores que também
colaborou para a obtenção dos melhores resultados do
PCS+H na maioria das variáveis. A maior concentração de
nitrogênio (19,17 gkg-1) neste substrato pode ter propiciado
um desenvolvimento vegetativo mais acentuado nas
plantas, pois, de acordo com Carvalho (2002), o nitrogênio
é um elemento de crescimento, já que o mesmo faz parte de
todas as proteínas, ácidos nucléicos, clorofila, etc. Aquino
et al. (1993) acrescentam, afirmando que o seu efeito mais
visível é a vegetação exuberante, pois estimula a formação
e o desenvolvimento de gemas frutíferas e floríferas,
promove maior perfilhamento e aumenta o teor de proteínas.
O PCS+H, de acordo com a Tabela 1, apresentou
valor de pH (5,5) dentro da faixa considerada ideal (4,5 a
5,5) para o abacaxizeiro (NASCENTE et al., 2005; SEAGRI,
2006). O mesmo aconteceu com o PCS+V (5,1). Segundo
Aquino (2004), o pH é um fator muito relevante, e pode
influenciar direta e indiretamente os vegetais. Seus efeitos
diretos incluem a ação tóxica do íon H+ e os indiretos
envolvem disponibilidade de nutrientes, elementos tóxicos
e produção das plantas. No caso dos substratos à base de
pó-de-coco verde, observa-se que os valores de pH, 6,4
no PCV+V e 6,7 no PCV+H, encontravam-se acima da faixa
recomendada. Aquino (2004) cita que o pH elevado pode
provocar a precipitação de micronutrientes importantes
(zinco, ferro, manganês e boro) no metabolismo vegetal e
na ativação enzimática. Raven et al. (2001) elucidam que
plantas com deficiência de micronutrientes costumam
apresentar clorose foliar. As plantas de abacaxizeiro
cultivadas nos substratos compostos de pó-de-coco verde,
especialmente no PCV+V, apresentaram amarelecimento
generalizado das folhas. A razão dos sintomas mais
expressivos no PCV+V, mesmo tendo apresentado o pH
um pouco inferior ao PCV+H, pode ter sido decorrente da
alta concentração de cálcio (55,4 gkg-1), possivelmente
aumentada pelas adubações foliares. Nesse contexto,
Martinez (2004) comenta que o aumento de cálcio na
solução nutritiva eleva o pH e promove precipitações de
micronutrientes catiônicos.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 41-48, 2007
46
BOMFIM, G. V. do et al.
Os valores médios da produção de massa das
plantas estão registrados na Tabela 3. De acordo com esta
tabela, todas as variáveis foram influenciadas pelos
substratos.
formado pela mistura pó-de-coco verde mais
vermicomposto.
Com relação às massas fresca e seca da parte
radicular, observa-se que as mesmas apresentaram
Os maiores valores de massa fresca da parte aérea
resultados semelhantes. O maior e o menor valor das
ocorreram nos substratos PCS+H, PCS+V e PCV+H, pois
variáveis foram obtidos com os substratos PCS+H e
os seus acúmulos de massa foram, respectivamente, 58,83,
PCV+V, nesta ordem. O PCS+H proporcionou um maior
55,49 e 42,65 % maiores que o PCV+V. Utilizando diferentes
acúmulo de massa fresca (48,85 %) e seca (58 %) em
substratos no desenvolvimento de mudas da bromélia
comparação com o PCV+V.
Encholirium spectabile Mart. ex Schult. f., Guimarães et
Durante todo o experimento, constatou-se que os
al. (2004) também verificaram que o substrato contendo
substratos PCS+V e PCS+H, principalmente o PCS+H,
húmus de minhoca foi o que mais se destacou quanto ao
foram aqueles que asseguraram o melhor desenvolvimento
desenvolvimento geral da planta, pois propiciou os
da cultura no que se refere às partes foliar e radicular. Com
melhores resultados de matéria fresca e seca da planta e de
relação ao PCV+H, os resultados do experimento mostraram
síntese de biomassa.
que o mesmo apresentou menor desempenho em relação
Quanto à massa seca da parte aérea, o acúmulo de
aos substratos à base de pó-de-coco seco. Apesar disso,
massa no PCS+H foi 32,8 e 58,66 % superior ao acúmulo no
a cultura apresentou um bom desenvolvimento geral, pois
PCV+H e PCV+V, respectivamente. O PCS+V também
os valores acumulados de matéria fresca e matéria seca da
superou em 53,52 % o PCV+V. Resultados análogos foram
parte radicular e matéria fresca da parte aérea não diferiram,
alcançados por Correia et al. (2001), em um experimento
estatisticamente, dos valores proporcionados pelo PCS+H
que testou substratos alternativos para a aclimatização de
e PCS+V. Nesse sentido, uma melhoria no manejo desse
mudas micropropagadas de abacaxizeiro (Ananas comosus
substrato poderia torná-lo tão bom quanto os outros
var. comosus). Os autores constataram que o pó-de-coco
substratos. Uma técnica bastante utilizada, para melhorar
seco mais vermicomposto foi um dos substratos que
as características químicas de substratos compostos por
proporcionou o maior acúmulo de matéria seca da parte
pó-de-coco verde, é a lavagem do pó-de-coco com água
aérea da cultura, e estatisticamente superior ao substrato
de baixa salinidade. A lavagem acaba reduzindo a salinidade
TABELA 3 – Valores médios das variáveis relacionadas com a produção de massas fresca e seca das mudas de
abacaxizeiro ornamental (Ananas comosus var. erectifolius), de acordo com os substratos pó-de-coco seco mais
Vitasolo® (PCS+V), pó-de-coco seco mais húmus de minhoca (PCS+H), pó-de-coco verde mais Vitasolo® (PCV+V) e póde-coco verde mais húmus de minhoca (PCV+H), Fortaleza-CE, 2005.
Médias seguidas de mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5 %.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 41-48, 2007
Aclimatização ex vitro de abacaxizeiro ornamental...
do material a níveis muito baixos, ou seja, níveis
recomendados para o cultivo de vegetais. Nesse sentido,
Cordão Terceiro Neto (2004) realizou a lavagem do pó-decoco verde e conseguiu, com isso, atingir um valor de CE
igual 0,25 dSm-1. Nesse reduzido nível de salinidade, o autor
pôde aclimatizar, satisfatoriamente, mudas de violeta
africana (Saintpaulia ionantha H. WENDL.).
A utilização de resíduos da agroindústria em práticas
agrícolas, como o cultivo de plantas em substratos à base
de pó-de-coco, por exemplo, representa, segundo Kämpf
(2000), a solução de problemas sócio-econômicos e
ambientais. Lemle (2005) acredita que a utilização do póde-coco, em mistura com outros materiais, reduz o custo
de aquisição de substratos comerciais e ajuda a minimizar
os problemas ambientais gerados pelo acúmulo excessivo
de resíduos (cascas) provenientes da indústria de
processamento do coco. Em complemento, Assis et al.
(2005) relatam que o uso do pó-de-coco pode ajudar a
preservar determinados materiais que se encontram em
risco de extinção, como é o caso do xaxim.
CONCLUSÕES
A aclimatização de mudas micropropagadas de
abacaxizeiro ornamental (Ananas comosus var.
erectifolius), na região litorânea do Estado do Ceará pode
ser realizada em telado, com o substrato pó-de-coco seco
mais Vitasolo® e, sobretudo, com o substrato pó-de-coco
seco mais húmus de minhoca.
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COMUNICAÇÃO
Avaliação
dos níveis de contaminaçãoCIENTÍFICA
microbiana, em laboratório...
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AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS DE CONTAMINAÇÃO MICROBIANA,
EM LABORATÓRIO DE CULTURA DE TECIDOS DE PLANTAS
EVALUATION OF MICROBIAL CONTAMINATION LEVEL IN A PLANT TISSUE
CULTURE LABORATORY
OLIENAIDE RIBEIRO DE OLIVEIRA1, DANIEL TERAO2, ANA CRISTINA PORTUGAL PINTO DE CARVALHO3,
ELISANGELA MARIA DOS SANTOS4, JEFTÉ FERREIRA DA SILVA5, JOÃO PAULO SARAIVA MORAIS6
1
Estudante do Curso de Agronomia – Universidade Federal do Ceará/UFC – Av. da Universidade, 2853 – Benfica – 60020-181 –
Fortaleza, CE – [email protected]
2
Dr. em Fitopatologia, Laboratório de Fitopatologia – Embrapa Agroindustrial Tropical – Rua Dra. Sara Mesquita, 2270 – Pici –
60511-110 – Fortaleza, Ce – [email protected]
3
Dra. em Ciências Biológicas, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Centro Nacional de Pesquisa de Agroindústria Tropical –
Rua Dra. Sara Mesquita, 2.270 – Pici – Cx. P. 3761 – 60511110 – Fortaleza, CE –[email protected]
4
Estudante do Curso de Agronomia – Universidade Federal do Ceará/UFC – Av. da Universidade, 2853 – Benfica – 60020-181 – Fortaleza, CE.
5
Programa de pós-graduação de Agronomia/Fitotecnia – Universidade Federal do Ceará/UFC – Av. da Universidade, 2853 – Benfica –
60020-181 – Fortaleza, CE – [email protected]
6
Graduação em Farmácia, Embrapa Agroindustrial Tropical, Centro Nacional de Pesquisa de Agroindústria Tropical – Rua Dra. Sara
Mesquita, 2270 – Pici – Cx. P. 3761 – 60511-110 – Fortaleza, CE – [email protected]
RESUMO
Objetivou-se avaliar e caracterizar os níveis de
contaminação microbiana, em diferentes ambientes de um
laboratório de cultura de tecidos de plantas. No Laboratório de
Cultura de Tecidos e Genética Vegetal na Embrapa Agroindústria
Tropical foi efetuado um levantamento dos níveis populacionais
de contaminação fúngica e bacteriana. Foram avaliados os
seguintes ambientes: sala de lavagem e esterilização, sala de
recebimento de material vegetal, sala de preparo de meio de cultura,
sala de manipulação asséptica, câmara de crescimento, capela de
fluxo lâminar ligada e desligada. Placas de Petri com meio de
cultura BDA (Batata-Dextrose-Agar) foram distribuídas,
aleatoriamente, em diferentes locais dentro do laboratório, e
abertas durante 60 minutos. Foi efetuada a contagem de colônias
fúngicas e bacterianas durante quatro dias de incubação, e após
esse período, os contaminantes fúngicos foram isolados e
identificados. Destacaram-se os seguintes fungos, encontrados
com maior freqüência no ambiente do laboratório: Aspergillius
niger Tiegh. (1867), Fusarium sp., e Penicilium sp.
De todos os ambientes avaliados do laboratório, observouse que, na capela de fluxo laminar ligada, não foi detectada incidência
de colônias desses microrganismos. Tal fato justifica-se por ser o
local asséptico pois é onde se faz a repicagem dos explantes in
vitro. Conclui-se que a identificação e monitoramento de
contaminantes, em ambiente do laboratório de culturas de tecido
de plantas é importante para se estudar formas de controles
desses microrganismos.
Termos para indexação: Contaminação, micropropagação,
assepsia, fungo, bactéria.
ABSTRACT
The objective of this work was to evaluate and
characterize the rate of microbial contamination in several
environments of a plant tissue culture laboratory. A research of
population levels of fungi and microbial contamination was
performed at the Laboratório de Cultura de Tecidos e Genética
Vegetal, of Embrapa Agroindústria Tropical. The following
environments were evaluated: washing sterilization room, plant
material reception room, media preparation room, inoculation
room, growth room and laminar hood (turned-on and off). Petri
dishes with PDA (potato-dextrose-agar) culture medium were
randomly displayed inside the laboratory and opened for 60
minutes. The fungi and bacterial colonies were counted for four
days since the inoculation day. After this period, isolated fungi
contaminants were identified. The following fungi were frequently
found in the laboratory: Aspergillius niger Tiegh. (1867),
Fusarium sp. and Peniciliums sp. Only on turned-on laminar
hood, no incidence of microorganism colonies was detected.
Therefore, the identification of contaminants in plant tissue
culture laboratory environments is important in order to study
ways of control for these microorganisms.
Index terms: Contamination, micropropagation, asepsis, fungi,
bacterium.
INTRODUÇÃO
A contaminação microbiana é uma das causas
principais de perdas de material vegetal, em laboratórios de
cultura de tecido de plantas. Em muitos casos, as fontes
contaminantes não são determinadas facilmente. Entretanto,
as mais comuns são associadas com os microorganismos
do ambiente e do individuo manipulador (LEIFERT et al.,
1994), e microrganismos oriundos do material.
As contaminações em laboratório desse tipo podem
ser provenientes de várias fontes, como: correntes de ar,
(Recebido em 05 de junho de 2006 e aprovado em 17 de abril de 2007)
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 49-54, 2007
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OLIVEIRA, O. R. de et al.
partículas do solo carregando esporos e células de
microrganismos que penetram nos locais de trabalho pelos
condicionadores de ar, podendo ser também transportadas
e introduzidas pelo homem, permanecendo no ambiente
em condições de assepsia inadequada. Outros
equipamentos que podem introduzir a contaminação são
aqueles destinados aos tratamentos de água
(deionizadores, destiladores, etc.), seja pela falta de
manutenção ou por manuseio inadequado (CAPÓ, 1998).
Além disso, esterilização inadequada do meio de cultura,
pinças, bisturis, vidrarias e outros materiais necessários e
desinfecção inadequada das plantas trazidas do campo
podem contaminar as culturas (LOPES, 1996).
A câmara de fluxo laminar é o principal local onde a
maioria dos contaminantes pode ser introduzida por
manipulação (CAPÓ, 1998). Outras contaminações são
introduzidas na cultura de tecidos como resultados de
práticas de laboratório deficientes, como é o caso de
Bacillus sp. que pode contaminar os meios de cultura
devido à esterilização insuficiente ou inadequado
funcionamento da autoclave (MONTARROYOS, 2000).
Assim, em laboratórios de cultura de tecido de
plantas, elevado grau de assepsia é condição fundamental
em qualquer situação, já que fungos e bactérias encontram,
no meio nutritivo utilizado, ambiente apropriado para se
desenvolverem rapidamente, ocasionando a morte das
culturas. A limpeza e a esterilização de vidrarias e de outros
instrumentos seriam outras práticas que, se realizadas
isoladas das demais, trariam mais segurança quanto ao
risco de contaminação, uma vez que ali são mantidos, por
algum tempo, os frascos de culturas contaminadas e a
vidraria usada, até o momento de serem lavadas (TEXEIRA
& TORRES, 1998).
A contaminação, no laboratório de cultura de tecido
de plantas, pode ser evitada a partir do treinamento dos
operadores em técnicas assépticas, como emprego de batas,
máscaras e toucas, além do cuidado com a manipulação do
tecido vegetal e das ferramentas de trabalho utilizadas
como: pinças, bisturis, tesouras, entre outros (DANTAS
et al., 2002).
Objetivou-se com este trabalho avaliar e caracterizar
os níveis de contaminação microbiana, em diferentes
ambientes de um laboratório de cultura de tecidos de
plantas.
MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi conduzido nos Laboratórios de
Fitopatologia e no de Cultura de Tecidos e Genética Vegetal
da Embrapa Agroindústria Tropical, Campos do Pici,
Fortaleza, Ceará, entre os meses de janeiro a outubro de
2005.
O monitoramento dos níveis populacionais de
contaminação fúngica e bacteriana foi realizado no
Laboratório de Cultura de Tecidos e Genética Vegetal, nos
seguintes ambientes: sala de lavagem e esterilização, sala
de preparo de meio de cultura, sala de manipulação
asséptica, câmara de crescimento, sala de recebimento de
material vegetal, interior da capela de fluxo laminar ligada e
desligada. Para tanto, placas de Petri contendo meio de
cultura BDA (Batata-Dextrose-Agar) foram distribuídas,
aleatoriamente, nos sete ambientes, e abertas para exposição
do meio de cultura, durante 60 minutos. Após este período,
foram fechadas e mantidas em temperatura ambiente (25o
C), na sala de incubação com regime de luz intermitente
(12/12h), no Laboratório de Fitopatologia.
A seguir, diariamente, foi efetuada a contagem das
colônias fúngicas e bacterianas durante quatro dias
sucessivos de incubação, e posterior isolamento. Em
seguida, as culturas foram mantidas em temperatura
ambiente durante sete dias na sala de incubação, no
Laboratório de Fitopatologia.
A identificação dos fungos isolados foi realizada
através de observações macro e micromofológicas das
culturas, sendo aqueles mais freqüentes, selecionados.
O delineamento experimental utilizado foi em
esquema fatorial (ambiente x tempo) inteiramente
casualizado, com 7 tratamentos e 5 repetições, perfazendo
35 unidades experimentais. Cada repetição foi constituída
por uma placa de Petri contendo estruturas dos patógenos
coletados dos vários ambientes do laboratório (tratamento).
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 49-54, 2007
Avaliação dos níveis de contaminação microbiana, em laboratório...
Os dados foram submetidos à análise de variância e as
médias comparadas pelo teste de Tukey, a nível de 5% de
probabilidade. Os dados de contagem das colônias fúngicas e
bacterianas foram transformados pela
X
3 (TERAO, 2001).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pelo monitoramento dos níveis de colônias
fúngicas, em diferentes ambientes do Laboratório de
Cultura de Tecidos e Genética Vegetal da Embrapa
Agroindústria Tropical, observou-se a presença de
colônias no meio de cultura a partir do segundo dia de
avaliação. Verificou-se também que houve diferença
significativa quanto ao número de colônias fúngicas, entre
os ambientes e os dias avaliados (Figura 1).
Ainda foi observado que a sala de recebimento de
material vegetal foi o local com maior índice populacional de
colônias fúngicas a partir do segundo dia de avaliação,
diferindo, estatisticamente, dos demais ambientes até o quarto
dia. Tal fato justifica-se por ser um local onde se recebe e se
armazena material contaminado, proveniente do campo.
Já nas salas de limpeza e esterilização, sala de
preparo de meio de cultura, sala de manipulação asséptica,
câmara de crescimento e no interior da capela de fluxo
51
laminar desligada, houve significativo aumento no número
de colônias fúngicas no terceiro e no quarto dia.
Por outro lado, no interior da capela de fluxo laminar
ligada não foram constatadas colônias fúngicas, mostrando
que, neste ambiente, o nível de assepsia é eficiente. A capela
de fluxo laminar ligada força a passagem do ar por meio de
um filtro bacteriológico, de maneira que seja criado um
ambiente estéril, com pressão positiva, evitando a entrada
do ar externo contaminado (PEREIRA & MELO, 2006).
Os principais fungos contaminantes detectados
foram: Aspergillius niger, Fusarium sp, e Penicilium sp.
Esses resultados corroboram pesquisas realizadas por
Leifert et al. (1994), que encontraram fungos dos gêneros
Penicillium, Aspergilius, Rhizopus, Candida, Curvularia,
Neurospora, Philophora e Fusarium, isolados nas culturas
de tecido de planta, e também por serem conhecidos como
patógenos de plantas in vivo.
Em relação ao monitoramento dos níveis
populacionais de colônias bacterianas, observou-se
diferença significativa quanto ao número de colônias
bacterianas para os locais e dias de avaliação (Figura 2),
observando-se que, na sala de preparo de meio de cultura
foi encontrada maior incidência de colônias bacterianas.
Médias seguidas de mesma letra, maiúscula entre época de avaliação e minúscula dentro do mesmo ambiente, não diferem entre si, ao
nível de 5% de probabilidade, pelo teste de Tukey.
FIGURA 1 – Níveis de contaminação fúngica, em diferentes ambientes do Laboratório de Cultura de Tecidos e Genética Vegetal.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 49-54, 2007
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OLIVEIRA, O. R. de et al.
Médias seguidas de mesma letra, maiúscula entre época de avaliação e minúscula dentro do mesmo ambiente, não diferem entre si, ao
nível de 5% de probabilidade, pelo teste de Tukey.
FIGURA 2 – Níveis de contaminação bacteriana, em diferentes ambientes do Laboratório de Cultura de Tecidos e
Genética Vegetal.
Na sala de limpeza e esterilização, sala de recebimento,
sala de manipulação asséptica e câmara de crescimento, foram
encontradas uma menor quantidade de colônias bacterianas
a partir do segundo dia até o quarto dia de avaliação, e no
primeiro dia o nível de contaminação não diferiu da sala de
limpeza e esterilização e da sala de recebimento.
Na sala de limpeza e esterilização houve um aumento
gradativo do número de colônias bacterianas do primeiro
ao quarto dia de avaliação. Já na sala de preparo de meio
de cultura houve incremento no número de colônias do
primeiro ao quarto dia de avaliação, não havendo diferença
a partir de então. Na sala de manipulação e crescimento
observou-se um aumento gradativo do número de colônias
do primeiro ao quarto dia. Na sala de recebimento, o número
de colônias permaneceu constante do primeiro ao quarto
dia de avaliação.
Na área de trabalho da capela de fluxo laminar desligada
o nível de contaminação foi bastante inferior, quando
comparado com os demais ambientes. De forma contrária,
nenhuma contaminação por colônias bacterianas dentro da
capela de fluxo laminar ligada foi verificada, demonstrando que,
neste ambiente, o controle é eficiente, sendo imprescindível
para os trabalhos de manipulação asséptica.
Como foi observado nos vários ambientes deste
Laboratório, a incidência de contaminação varia de acordo
com os ambientes, e que o local que necessita de assepsia
total, a capela de fluxo laminar ligada, não foi verificada
contaminação por fungos e bactérias, demonstrando-se que
os contaminantes que ocorrem nos cultivos in vitro deste
laboratório provêm dos demais ambientes externos ou do
individuo manipulador. Isso sugere a necessidade de
aplicação de métodos de prevenção para garantir assepsia.
Sugere-se a compartimentalização das atividades
dentro do laboratório, separando as atividades que lidam
com material contaminado, daquelas que trabalham com
material esterilizado e que exigem ambiente mais asséptico,
e deve-se também, limitar a circulação de pessoas nas áreas
que exigem maior assepsia (TEXEIRA & TORRES, 1998).
Outra forma de controle é a realização de treinamento de
técnicas assépticas, para as pessoas que trabalham no
laboratório, como a utilização de bata e máscaras, tendo
ainda o cuidado com a manipulação de ferramentas de
trabalho utilizadas como pinças, bisturis, e tesouras. No
que se refere às câmaras de fluxo laminar, deve-se proceder,
periodicamente, à avaliação da eficiência e troca dos filtros
dentro do seu prazo de validade (DANTAS et al., 2002).
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 49-54, 2007
Avaliação dos níveis de contaminação microbiana, em laboratório...
Outras medidas de prevenção, sugeridas por
Montarroyos (2000), são: limpezas das autoclaves, trocandose a água contida em seu interior ao final de cada dois dias
de trabalho; observar, periodicamente, a base das culturas
in vitro contra a luz, visando à detecção de bactérias, no
seu estágio inicial de desenvolvimento, e fazer um
acompanhamento fitossanitário das instalações
regularmente, para manter o nível de contaminação no
laboratório de cultura de tecido de plantas dentro de 3 à 5%.
53
Revisão Anual de Patologia de Plantas, [S.l.], v. 10, p. 391407, 2002.
LEIFERT, C.; MORAIS, C. E.; WAITES, W. M. Ecology of
microbial saprophytes and pathogens in tissue culture and
field grown plants: reason for contamination problems in
vitro. Critical Reviews in Plant Sciences, [S.l.], v. 13, p.
139-183, 1994.
LOPES, C. A. Contaminações bacterianas em culturas de
tecidos: o que são e como controlar. Brasília, DF: Embrapa/
CNPH, 1996. 6 p.
CONCLUSÕES
Conclui-se que os diferentes ambientes do
Laboratório de Cultura de Tecidos e Genética Vegetal
apresentaram níveis diferenciados de contaminação, sendo
a capela de fluxo laminar ligada, um local completamente
asséptico. Portanto, para evitar a contaminação microbiana
deve-se manter elevado grau de limpeza em todo o
laboratório, controlar a entrada de pessoas nos ambientes
que exigem maior assepsia e, além disso, utilizar métodos
preventivos de controle.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CAPÓ, Y. A. Contaminación microbiana em el cultivo in
vitro de plantas. In: PONCE, J. N. P. (Ed.). Propagación y
mejora genética de plantas por biotecnología. Cuba: GEO,
1998. p. 81-104.
DANTAS, S. A. F.; OLIVEIRA, S. M. A.; CÂMARA, T. R.
Contaminação microbiana no cultivo in vitro de plantas.
MONTARROYOS, A. V. V. Contaminação in vitro
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Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária,
2000.
PEREIRA, C. D.; MELO, B. Cultura de tecidos vegetais.
Disponível em:
<http://www.fruticultura.iciag.ufu.br/cult_tecidos.htm>.
Acesso em: 15 maio 2006.
TERAO, D. Identificação e caracterização fisiológica e
controle do agente da malformação floral e vegetativa da
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TEXEIRA, S. L.; TORRES, A. C. Organização do laboratório
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J. A. Cultura de tecido e transformação de plantas. Brasília,
DF: Embrapa-SPI/CNPH, 1998. v. 1, p. 71-72.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 49-54, 2007
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OLIVEIRA, O. R. de et al.
Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.3, n.1, p. 49-54, 2007
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a) TÍTULO, suficientemente claro, conciso e completo,
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trabalho, com os demais termos em ordem decrescente de
importância. b) TÍTULO EM INGLÊS; c) NOME(s) DO(s)
AUTOR(es) no máximo 6 (seis), em letras maiúsculas, um
após o outro, centralizados, e no rodapé da primeira página
, deverão vir a formação acadêmica e a Instituição onde
trabalham; d) RESUMO (de acordo com NBR6028 da
ABNT). O resumo não deve ultrapassar a 250 (duzentos e
cinqüenta) palavras e não possuir parágrafos. Após o
Resumo devem-se incluir TERMOS PARA INDEXAÇÃO
(palavraschave), diferentes daqueles constantes do título
e separados por vírgula. Os termos para indexação devem
estar descritos na forma maiúscula e minúscula, serem
expressões que identifiquem o conteúdo do artigo, ser
indicadas entre 3 e 5, e se possível, extraídas do vocabulário
Thesagro – Thesaurus Agrícola Nacional, desenvolvido
pela CENAGRI (indicação da revista “Plant Cell Culture
& Micropropagation”para evitar o uso de vários sinônimos
como termos de indexação). Se não forem encontrados
descritores disponíveis para cobrirem a temática do artigo,
poderão ser indicados termos ou expressões de uso
conhecido; e) ABSTRACT, incluindo, em seguida, INDEX
TERMS; f) INTRODUÇÃO (incluindo a revisão de
literatura); g) MATERIAL E MÉTODOS; h) RESULTADOS
E DISCUSSÃO (podendo conter tabelas e figuras); i)
CONCLUSÕES; e j) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
5. A comunicação deverá conter os seguintes tópicos: a)
TÍTULO, suficientemente claro, conciso e completo,
evitando palavras supérfluas. Recomenda-se começar pelo
termo que represente o aspecto mais importante do
trabalho, com os demais termos em ordem decrescente de
importância. Deve ser apresentada a versão do título para
o idioma inglês; b) TÍTULO EM INGLÊS; c) NOME(s)
DO(s) AUTOR(es) no máximo 6 (seis), em letras
maiúsculas, um após o outro, centralizados, e no rodapé
da primeira página, deverão vir a formação acadêmica e a
Instituição onde trabalham; d) RESUMO (de acordo com
NBR6028 da ABNT). O resumo não deve ultrapassar a 250
(duzentos cinqüenta) palavras e não possuir parágrafos.
Após o Resumo devem-se incluir TERMOS PARA
INDEXAÇÃO (palavras-chave), diferentes daqueles
constantes do título e separados por vírgula. Os termos
para indexação devem estar descritos na forma maiúscula
e minúscula, serem expressões que identifiquem o
conteúdo do artigo, ser indicadas entre 3 e 5; e);
ABSTRACT, incluindo, em seguida, INDEX TERMS; f)
TEXTO [sem subdivisão, porém com introdução, material
e métodos, resultados e discussão e conclusão
subtendidos (podendo conter tabelas ou figuras)] e g)
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
6. AGRADECIMENTOS: ao fim do texto e, antes das
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cada tipo de documento;
- As referências devem ser ordenadas alfabeticamente.
EXEMPLIFICAÇÃO (TIPOS MAIS COMUNS):
ARTIGO DE PERIÓDICO:
VIEIRA, R. F.; RESENDE, M. A. V. de. Épocas de plantio de
ervilha em Patos de Minas, Uberaba e Janaúba, Minas
Gerais. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 24, n. 1, p. 7480, jan./mar. 2000.
dominica (F.) durante o armazenamento em atmosfera
controlada com Co2 e N2. 1997. 52 f. Dissertação (Mestrado
em Ciência dos Alimentos) – Universidade Federal de
Lavras, Lavras, 1997.
MATIOLI, G. P. Influência do leite proveniente de vacas
mastíticas no rendimento de queijo frescal. 2000. 55 p.
Dissertação (Mestrado em Ciências dos Alimentos) Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2000.
Nota: “A folha é composta de duas páginas: anverso e
verso. Alguns trabalhos, como teses e dissertações são
impressos apenas no anverso e, neste caso, indica-se f.”
(ABNT, NBR6023/2002, p. 18).
TRABALHOS DE CONGRESSO E OUTROS EVENTOS:
SILVA, J. N. M. Possibilidades de produção sustentada de
madeira em floresta densa de terra firme da Amazônia
brasileira. In: CONGRESSO FLORESTAL BRASILEIRO, 6.,
1990, Campos do Jordão. Anais... Campos do Jordão: SBS/
SBEF, 1990. p. 39-45.
DOCUMENTOS ELETRÔNICOS:
As obras consultadas online são referenciadas
conforme normas específicas para cada tipo de documento
(monografia no todo e em parte, trabalho apresentado em
evento, artigo de periódico, artigo de jornal, etc.), acrescidas
de informações sobre o endereço eletrônico apresentado
entre braquetes (< >), precedido da expressão “Disponível
em:” e da data de acesso ao documento, precedida da
expressão “Acesso em:”.
LIVRO:
Nota: “Não se recomenda referenciar material eletrônico de
curta duração nas redes” (ABNT, NBR6023/2000, p. 4). Segundo
padrões internacionais, a divisão de endereço eletrônico, no
fim da linha, deve ocorrer sempre após barra (/).
a) Livro no todo:
Monografia (acesso online):
STEEL, R. G. D.; TORRIE, J. H. Principles and procedures
of statistics. New York: McGraw-Hill Book, l960. 481 p.
a) Livro no todo
b) Parte de livro com autoria específica:
FLEURY, J. A. Análise ao nível de empresa dos impactos
da automação sobre a organização da produção de trabalho.
In: SOARES, R. M. S. M. Gestão da empresa. Brasília: IPEA/
IPLAN, 1980. p. 149-159.
c) Parte de livro sem autoria específica:
MARTIM, L. C. T. Nutrição de bovino de corte em
confinamento. In: ______. Confinamento de bovino de
corte. 2. ed. São Paulo: Nobel, 1986. cap. 3, p. 29-89.
DISSERTAÇÃO E TESE:
GONÇALVES, R. A. Preservação da qualidade tecnológica
de trigo (Triticum aestivum L.) e controle de Rhyzopertha
TAKAHASHI, T. (Coord.). Tecnologia em foco. Brasília:
Socinfo/MCT, 2000. 90 p. Disponível em: <http//
www.socinfo.org.br>. Acesso em: 22 ago. 2000.
b) parte de livro
TAKAHASHI, T. Mercado, trabalho e oportunidades. In:
______. Sociedade da informação no Brasil: livro verde.
Brasília: Socinfo/MCT, 2000. cap. 2, p. 13-24. Disponível
em: <http://www.socinfo.gov.br>. Acesso em: 22 ago. 2000.
c) Parte de congresso, seminário, etc.
GIESBRECHT, H. O. Avaliação de desempenho de institutos
de pesquisa tecnológica: a experiência de projeto excelência
na pesquisa tecnológica. In: CONGRESSO ABIPTI, 2000,
Fortaleza. Gestão de institutos de pesquisa tecnológica.
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www.abipti.org.br>. Acesso em: 01 dez. 2000.
d) Tese
SILVA, E. M. Arbitrariedade do signo: a língua brasileira
de sinais (LIBRAS). 1997. 144 p. Dissertação (Mestrado
em Lingüística Aplicada e Estudo de Língua) - Pontifícia
Universidade Católica de São Paulo, São Paulo, 1997.
Disponível em: <http://www.terra.com.br/virtualbooks/
freebook/port/did/ teses.htm>. Acesso em: 28 nov. 2000.
Artigo de periódico (acesso online):
RESENDE, A. M. G. Hipertexto: tramas e trilhas de um
conceito contemporâneo. Informação e Sociedade, Recife,
v. 10, n. 1, 2000. Seção Educação. Disponível em: <http://
www.informaçãoesociedade.ufpb.br/>. Acesso em: 30 nov.
2000.
CITAÇÃO: PELO SISTEMA ALFABÉTICO (AUTORDATA) (conforme ABNT, NBR10520/2002)
Dois autores - Steel & Torrie (1960) ou (STEEL & TORRIE,
1960).
Três ou mais autores - Valle et al. (l945) ou (VALLE et al.,
1945).
Obs.: Quando forem citados dois autores de uma mesma
obra deve-se separá-los pelo sinal & (comercial).
9. CASO O ARTIGO CONTENHA FOTOGRAFIAS,
GRÁFICOS, FIGURAS, SÍMBOLOS E FÓRMULAS,
ESSAS DEVERÃO OBEDECER ÀS SEGUINTES
NORMAS:
9.1. Fotografias deverão ser apresentadas em preto e
branco, nítidas e com contraste, inseridas no texto após a
citação das mesmas e também em um arquivo à parte, salvas
em extensão “TIFF” ou “JPEG” com resolução de 300
dpi.
9.2. Figuras deverão ser apresentadas em preto e branco,
nítidas e com contraste, inseridas no texto após a citação
das mesmas e também em um arquivo à parte, salvas em
extensão “TIFF” ou “JPEG” com resolução de 300 dpi.
As figuras deverão ser elaboradas com letra Times New
Roman, tamanho 10, sem negrito; sem caixa de textos e
agrupadas.
9.3. Gráficos deverão ser inseridos após citação dos
mesmos, dentro do próprio texto, elaborado
preferencialmente em Excel, com letra Times New Roman,
tamanho 10, sem negrito.
9.4. Símbolos e Fórmulas Químicas deverão ser feitas em
processador que possibilite a formatação para o programa
Page Maker (ex: MathType, Equation), sem perda de suas
formas originais.
10. O Editor Chefe notificará o autor do recebimento do
original e, posteriormente, o informará sobre sua
publicação. Os artigos que necessitarem de modificações
serão devolvidos ao autor para a devida revisão.
11. Os artigos não aprovados serão devolvidos.
12. Os artigos serão publicados em ordem de aprovação.
13. O não-cumprimento dessas normas implicará na
devolução do artigo ao autor.
14. Os casos omissos serão resolvidos pela Comissão
Editorial
15. O artigo deverá ser enviado para:
ABCTP
Plant Cell Culture & Micropropagation
Universidade Federal de Lavras
Departamento de Biologia - Setor de Fisiologia Vegetal
Caixa Postal: 3037
Lavras – MG
CEP 37200-000
E-mail: [email protected]
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS
1. Concepts and affirmations included in articles and
communications are of the entire responsibility of the
authors.
2. “Plant Cell Culture & Micropropagation”, a semestral
journal edited by Editora UFLA of the Universidade Federal
de Lavras, publishes scientific articles and communications
in the area of plant tissue culture, elaborated by researchers
of the national and international scientific community. There
are no page charges for publication. Submission of a
manuscript implies that it is neither under consideration
for publication elsewhere nor has appeared previously in
part or in whole. On acceptance for publication, authors
assign to the Editors full copyright of the manuscript in all
languages and countries. Publications will depend on
editorial rules and on the review of experts and ad hoc
commission. Reviewer and editorial opinions will be
anonymously communicated to authors.
3. The articles and communication submitted for
publication must be presented in CD, using the program
Microsoft Word for Windows (version 98, 2000, XP or
2003), written in Portuguese, English or Spanish, using
only conventional nomenclature. At the time of
submission, authors are required to submit together with
the CD, 4 (four) hard copies, one original and three
copies without the name(s) of the author(s) as well as
the footnote on the first page (to be used by the
reviewers), printed on A4 white paper (21 cm x 29.7cm)
or on continuous form, typewritten only on one side,
double spaced using font Times New Roman, size 12,
with a 3 cm margin on the left hand side and 2.0 cm
margin on the right hand side, 2.5 cm upper and lower
margin, 2.5 cm for the heading and 2.,5 cm for the
footnote. The manuscript must present a maximum of 14
pages. At the time of submission, a cover letter must be
sent with the manuscript copies to the Editor requesting
publication of the article. This cover letter must be signed
by all authors and also contain the full address,
telephone number and e-mail of the authors. Any
inclusion, exclusion or alteration in the authors order
must be notified and signed by all authors including the
one excluded.
4. Each manuscript must be organized in: a) TITLE
sufficiently clear; conspicuous and complete, without
superfluous words. It is recommended to initiate with the
term that represent the most important aspect, with other
terms in decreasing of importance; b) TITLE in Portuguese;
c) FULL NAME(s) OF THE AUTHOR(s), maximum of 6
(six), in capital letters, one after the other in the center of
the page, with the footnote of the first page containing
their professional qualification or academic training and
their work institution. d) ABSTRACT written continuously
without paragraph. It must not exceed 250 words. Index
terms must be enclosed after the abstract using terms
different from those used in the title and separated by
comma. The index terms (3 to 5) must be described in capital
and small letters, and express the content of the article; e)
ABSTRACT and INDEX TERMS in Portuguese; f)
INTRODUCTION (including literature review); g)
MATERIAL AND METHODS; h) RESULTS AND
DISCUSSION (it may include tables and figures); i)
CONCLUSIONS and j) REFERENCES.
5. Communication must have the following topics: a)
TITLE, sufficiently clear, conspicuous and complete,
without superfluous words. It is recommended to initiate
with the term that represent the most important aspect,
with other terms in decreasing of importance; The
PORTUGUESE version of the title has to be presented;
b) TITLE in Portuguese; c) FULL NAME(s) OF THE
AUTHOR(s), maximum of 6 (six), in capital letters, one
after the other in the center of the page with the footnote
of the first page containing their professional
qualification or academic training and their work
institution; d) ABSTRACT written continuously
without paragraph. It must not exceed 250 words. Index
terms must be enclosed after the abstract using terms
different from those used in the title and separated by
comma. The index terms (3 to 5) must be described in
capital and small letters, and express the content of the
article; e) ABSTRACT and INDEX TERMS in
Portuguese, f) TEXT (with no division but must include
introduction, material and methods, results and
discussion and conclusion (it may include tables and
figures) and g)REFERENCES.
6. ACKNOWLEDGEMENTS: Acknowledgements to
people or institutions might be included at the end of the
text prior References. The written style must be serious
and clear, indicating the reasons of the acknowledgements
made.
7. TABLES AND FIGURES: must be included right after
their citation in the text.
8. REFERENCES: references must be cited according to
NBR6023/2002 of ABNT. All references and their correct
citation in the text are of the entire responsibility of the
author(s).
- Some important orientations: all authors of the scientific
document must be presented (source); the journal must be
cited using its full name; all references must present the
name of the city where the journal was published; all
references must be cited alphabetically.
9. PHOTOGRAPHS, GRAPHS, FIGURES, SYMBOLS
OR FORMULA CONTAINED IN THE ARTICLE SHOULD
OBEY THE FOLLOWING RULES:
9.1. Photographs must be presented in black and white,
clear and with contrast, inserted in the text after their
citation and also in a separate file (on the same diskette
as the article) saved in extension “TIFF” or “JPEG”
with resolution of 300 dpi.
9.2. Figures must be presented in black and white, clear
and with contrast, inserted in the text after their citation
and also in a separate file (on the same diskette as the
article) saved in extension “TIFF” or “JPEG” with
resolution of 300 dpi. They must be elaborated using Times
New Roman font, size 10, without bold, without text box
and arranged.
9.3. Graphs must be inserted in the text after their citation,
elaborated preferentially in Excel, using Times New Roman
font, size 10, without bold.
9.4. Symbols and Chemical Formula must be presented
using a word processor that permits a format for Page
Maker (ex: MathType, Equation) without loss of its original
form.
10. The Brazilian Association of Plant Tissue Culture
(ABCTP) will inform the author the receipt of the original
manuscript and eventually it will also send information
regarding its publication. Manuscripts that require
modifications will be returned to the author for the
respective revision andcorrections.
11. Manuscripts not approved will be returned to the
author.
12. Articles will be published according to the order of
receipt and approval.
13. If any of these rules are not attended the manuscript
will be returned to the author.
14. Manuscripts should be sent to the following address:
ABCTP
Plant Cell Culture & Micropropagation
Universidade Federal de Lavras
Departamento de Biologia - Setor de Fisiologia Vegetal
Caixa Postal: 3037
Lavras – MG
CEP 37200-000
Brazil
E-mail: [email protected]