FLÁVIA CERIZE VALLERINI
EXPRESSÃO DO RECEPTOR ANDROGÊNICO EM
CÉLULAS DO FOLÍCULO PILOSO DE PACIENTES
COM PUBARCA PRECOCE IDIOPÁTICA
Dissertação
apresentada
ao
Curso
de
Pós-
Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da
Santa Casa de São Paulo para obtenção de título de
Mestra em Medicina
São Paulo
2015
FLÁVIA CERIZE VALLERINI
EXPRESSÃO DO RECEPTOR ANDROGÊNICO EM
CÉLULAS DO FOLÍCULO PILOSO DE PACIENTES
COM PUBARCA PRECOCE IDIOPÁTICA
Dissertação
apresentada
ao
Curso
de
Pós-
Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da
Santa Casa de São Paulo para obtenção de título de
Mestra em Medicina
Área de Concentração: Ciências da Saúde
Orientador: Prof. Dr. Carlos Alberto Longui
São Paulo
2015
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
Vallerini, Flávia Cerize
Expressão do receptor androgênico em células do folículo piloso
de pacientes com pubarca precoce idiopática./ Flávia Cerize Vallerini.
São Paulo, 2015.
Dissertação de Mestrado. Faculdade de Ciências Médicas da
Santa Casa de São Paulo – Curso de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde.
Área de Concentração: Ciências da Saúde
Orientador: Carlos Alberto Longui
1. Receptores androgênicos 2. Folículo piloso 3. Adrenarca 4.
Puberdade precoce
BC-FCMSCSP/01-15
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao meu amado marido, Guilherme, e aos meus filhos,
Guilherme e Laura,
que são a minha família, que são o meu mundo.
Aos meus pais, Pedro e Helenita,
que me ensinaram a crescer e a viver, agradecendo por todos os esforços que
fizeram por mim.
Aos meus irmãos e irmãs, tias e tios, sobrinhos e primos,
que fazem parte da minha história.
E à minha avó Iolanda, “in memoriam”,
minha amiga eterna.
Dedicatória
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao Prof. Dr. Carlos Alberto Longui, meu orientador, por todo o apoio
e pelo grande aprendizado e crescimento pessoal a mim proporcionados.
Ao Dr. Flávio Richeti, que me ajudou e me ensinou com a dedicação e
paciência com que só um amigo faria.
À Dra. Tatiane Sousa e Silva, pela grande ajuda operacional no laboratório,
minha sincera gratidão.
Aos alunos da graduação e aos residentes de endocrinologia pediátrica da
FCMSCSP, fundamentais para a realização do meu trabalho.
À minha tia e também professora, Dra. Eliane Arantes Braga, pela ajuda nos
momentos de necessidade.
À Eliane Roseli Barreira e Miguel Ângelo de Góes Junior, pelos conselhos,
suporte e ajuda direta.
À Érika Tiemi Fukunaga e ao Serviço de Estatística da Pós-Graduação, pela
competência e pela precisão na realização do seu trabalho.
Aos Professores da Banca de Exame de Qualificação e Defesa, pelas
sugestões e críticas essenciais ao aperfeiçoamento deste estudo.
À Mirtes Dias Souza, Sônia Regina Alves e toda equipe da Pós Graduação,
pelo auxílio e atenção.
À CAPES, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal De Nível Superior,
pelo incentivo financeiro para a realização da minha pesquisa, possibilitando o
desenvolvimento da mesma.
À Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, à Irmandade
da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo e à Fundação Arnaldo Vieira de
Carvalho, pela oportunidade de realizar este trabalho.
A todos os pacientes que, voluntariamente, cederam suas esperanças em
busca de algo melhor para todos.
Meus sinceros agradecimentos a todos aqueles que, de forma direta ou
indireta, colaboraram para a idealização deste trabalho.
Agradecimentos
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
17OHP: 17-hidroxiprogesterona
ACTH: Hormônio Adrenocorticotrópico
AMPc: Adenosina Monofosfato Cíclico (AMPc)
ANDRO: ∆4-androstenediona
BCR: Gene Normalizador (Breakpoint Cluster Region)
C: Controle
CRH: Hormônio Liberador de Corticotropina
Ct: Ciclo limite (Cycle threshold)
DHT: Dihidrotestosterona
E2: Estradiol
EST: Estatura
HAC: Hiperplasia Adrenal Congênita
ID: Idade
IDPBC: Idade Pubarca
IDTLC: Idade Telarca
M: Medula
MM: Idade da Menarca Materna
SDHEA: Sulfato de Deidroepiandrosterona
OMIM: Herança Mendeliana Humana disponível online (Online Mendelian Inheritance in Man)
P: Peso
PCR: Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction)
PPI: Pubarca Precoce Idiopática
Q: Quencher (fluorocromo inibidor)
qRT-PCR: PCR quantitativa em Tempo Real
R: Reporter (fluorocromo emissor)
RA: Receptor de Andrógenos
RIE: Radioimunoensaio
SOP: Síndrome do Ovário Policístico
StAR: Proteína Reguladora Aguda da Esteroidogênese
TESTOT: Testosterona Total
TESTO: Testosterona
Xq11-12: Braço longo do cromossomo X, região 11-12
ZF: Zona Fasciculada
ZG: Zona Glomerular
ZR: Zona Reticular
Abreviaturas e Símbolos
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ……………………………………………………………………...
1
1.1. Revisão de literatura.................................................................................
3
1.1.1.
Pubarca precoce idiopática.............................................................
3
1.1.2.
Desenvolvimento puberal normal em meninas...............................
4
1.1.3.
Esteroidogênese adrenal................................................................
5
1.1.4.
Hormônios andrógenos...................................................................
9
1.1.5.
A pele como órgão endócrino.........................................................
10
1.1.6.
Receptor de andrógeno (RA) .........................................................
12
1.2. O gene do receptor de andrógeno (OMIM: 313700) ...............................
13
1.3. Justificativa deste estudo.......................................................................... 14
2. OBJETIVOS ………………………………………………………………………... 15
3. CASUÍSTICA E MÉTODO.………………..……………………………………....
17
3.1. Casuística.................................................................................................. 18
3.2. Coleta das amostras de bulbo capilar.......................................................
19
3.3. Análise bioquímica....................................................................................
19
3.4. Análise molecular......................................................................................
20
3.5. Extração do RNA....................................................................................... 20
3.5.1. Folículo piloso (amostras)....................................................................
20
3.5.2. Curva padrão (próstata).......................................................................
21
3.6. Reação enzimática de transcrição reversa...............................................
21
3.7. PCR em tempo real quantitativa (qRT-PCR)............................................
22
3.8. Iniciadores e sondas direcionados ao gene AR....................................... 25
3.8.1. Iniciadores e sondas direcionados ao gene utilizado como
normalizador da reação (BCR- Breakpoint Cluster Region).............
25
3.8.2. A Reação de PCR em tempo real (RT-PCR)....................................
26
3.9. Construção da curva padrão.................................................................... 27
3.10. Cálculo da expressão de RNAm do RA em amostras de pelo pubiano. 28
3.11. Análise estatística..................................................................................
29
4. RESULTADOS.……………………………………………………………………..
30
4.1. Resultados descritivos das variáveis........................................................
33
4.2. Resultados analíticos das variáveis clínicas.............................................
34
4.3. Resultados analíticos das variáveis hormonais........................................
35
Sumário
4.4. Análise da expressão do Gene RA...........................................................
35
4.4.1. Expressão do gene RA em pacientes e controles no grupo PII-III..
36
4.4.2. Expressão do gene RA em pacientes e controles no grupo PIV-V
37
4.4.3. Expressão do gene RA na evolução da puberdade.........................
38
4.5 Correlação entre SDHEA e expressão do gene RA................................... 3939
5. DISCUSSÃO.………………………………………………………………………..
41
6. CONCLUSÃO.…………………………………………………………………….... 45
7. ANEXOS.…………………………………………………………………………..... 47
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.…………………………………………….. 56
RESUMO.…………………………………………………………………………....
63
ABSTRACT.………………………………………………………………………....
65
Sumário
1. INTRODUÇÃO
2
Pubarca precoce idiopática (PPI) no sexo feminino é definida como o
aparecimento de pelos pubianos antes dos oito anos de idade, sem outros sinais de
desenvolvimento puberal ou virilização(1,2). Na maioria das vezes, é uma situação
benigna e autolimitada, seguida por puberdade em idade normal(3,4). O mecanismo
subjacente parece ser o amadurecimento precoce da zona reticular (ZR) do córtex
adrenal,
independente
ou
parcialmente
adrenocorticotrópico ACTH, que origina
dependente
de
hormônio
aumento na produção de andrógenos
adrenais, em particular o aumento de dehidroepiandrosterona (DHEA) e sulfato de
deidroepiandrosterona (SDHEA)(3).
Os andrógenos agem através da ligação a receptores nucleares, o que é
facilitado por serem hormônios lipofílicos derivados do colesterol e capazes de
atravessar a membrana celular. A ligação do esteroide ao seu receptor determina a
migração do complexo hormônio-receptor para o núcleo, onde reconhece o sítio
específico de ligação ao DNA (elemento responsivo) modulando a transcrição dos
genes-alvo(5). Esses hormônios são reconhecidos como os principais moduladores
do desenvolvimento e da manutenção do fenótipo masculino, bem como sua função
reprodutiva, mas também afetam a função de diversos tecidos não reprodutivos,
como, por exemplo, o ósseo e o musculoesquelético. A maioria dessas funções
envolve a expressão do receptor de andrógenos (RA)(6,7).
A hiperexpressão do RA no complexo pilo-sebáceo pubiano pode ser um dos
fatores responsáveis pela hipersensibilidade desse tecido aos andrógenos,
causando o aparecimento precoce dos pelos. A quantificação dos receptores de
andrógenos pode reconhecer a influência da expressão dos receptores na idade de
início da pubarca, bem como oferecer subsídios para o planejamento terapêutico
nos casos que apresentem hiperexpressão do receptor androgênico.
O objetivo deste projeto foi comparar a expressão tecido-específica do gene
de receptor androgênico entre meninas com pubarca precoce idiopática e um grupo
controle, e também correlacionar tal expressão às concentrações séricas dos
hormônios andrógenos.
Introdução
3
1.1. Revisão de literatura
1.1.1. Pubarca precoce idiopática
A adrenarca é denominada por alguns como sendo a “puberdade” da glândula
adrenal(8), caracterizada pela ativação da produção de andrógenos adrenais e por
aumento progressivo da dehidroepiandrosterona (DHEA) e SDHEA, ambos
produtos da ZR da adrenal (Fig. 1)(9). A adrenarca relaciona-se ao desenvolvimento
da ZR do córtex adrenal, mas os mecanismos que regulam a secreção dos
andrógenos adrenais DHEA e androstenediona (ANDRO) não estão completamente
esclarecidos(10).
Por volta dos seis anos de idade, ou menos, ocorre aumento gradual na
secreção de andrógenos adrenais. Esse fato foi reconhecido pela primeira vez há 60
anos atrás, por Talbot et al(11), que identificaram o aumento da excreção de 17cetoesteroides urinários em crianças normais. Observando a presença de pelos
pubianos em pacientes com disgenesia gonadal, Albright et al(12) postularam que,
durante a maturação sexual humana, a adrenal secreta quantidades crescentes de
esteroides com atividade androgênica. Albright et al(12,13) atribuíram a esse processo
de desenvolvimento a denominação de adrenarca.
Pubarca é o termo que descreve o aparecimento dos pelos pubianos, que
pode ser acompanhado do surgimento de pelos axilares ou não, sendo a
representação clínica da adrenarca. Esse processo é considerado precoce quando
acontece em meninas antes dos oito anos de idade(14,15,16).
Introdução
4
Figura 1: Coloração de hematoxilina e eosina de corte histolológico da adrenal,
mostrando a zona glomerular (ZG), a zona fasciculada (ZF), a zona reticular (ZR) e a
medula (M), nas idades de 3 anos (A) e 12 anos (B) [Modificado de Nakamura et al,
(9)
2009 ].
1.1.2.
Desenvolvimento puberal normal em meninas
As características físicas dos estágios de desenvolvimento e de pelos
pubianos estão resumidos no Quadro 1 e ilustrados pelo Anexo 1.
Introdução
5
Quadro 1: Estágios de desenvolvimento de pelos pubianos.
Caracteres
Sexuais
Estágio I
Secundários (meninas)
Pelos sobre o púbis não estão mais desenvolvidos do
que os da parede abdominal. Pelos pubianos ausentes.
Crescimento esparso de pelos longos, finos, lisos ou
Estágio II
discretamente encaracolados, principalmente ao longo
dos grandes lábios.
Desenvolvimento de
Estágio III
Pelos Pubianos
Pelos tornam-se mais escuros, espessos e
encaracolados, distribuindo-se na região pubiana.
Pelos são do tipo adulto, mas com área de distribuição
Estágio IV menor do que em adultos, não se estendendo para a
superfície interna das coxas.
Estágio V
(2)
Pelos adultos em tipo e quantidade, estendendo-se até
a superfície interna das coxas.
(5)
Marshall, Tanner, 1969 ; Monte et al, 2006 .
Caracterizar separadamente o surgimento dos pelos pubianos (pubarca) e
das mamas (telarca) é importante, pois ambos os desenvolvimentos constituem
eventos distintos(17). O desenvolvimento da mama é controlado primariamente pela
secreção de estrógeno ovariano, enquanto o desenvolvimento de pelos pubianos é
estimulado pela secreção de andrógenos adrenais(5) .
1.1.3. Esteroidogênese adrenal
A descrição anatômica da adrenal foi feita há mais de 450 anos pelo
anatomista italiano Bartholomeo Eustachio, tendo sido ignorada até 1855, quando
Thomas Addison descreveu com detalhes a doença que leva seu nome(18). BrownSéquard demonstrou, em 1856, que as adrenais eram indispensáveis para a vida,
após realizar adrenalectomia em animais(19). Experiências posteriores demonstraram
ser a zona cortical, e não a medular da adrenal, a indispensável para a vida(20). O
conceito de hiperfunção e suas manifestações clínicas, por sua vez, surgiu depois,
com Cushing(21), Albright(22) e Conn(23). Entre 1935 e 1937, o isolamento dos
Introdução
6
hormônios adrenais, com a definição de sua estrutura e síntese(24), e, mais
recentemente, associado aos avanços nas técnicas de quantificação hormonal, bem
como nas técnicas moleculares, ampliaram nossa compreensão a respeito da
fisiologia, da bioquímica e da fisiopatologia do córtex adrenal.
O córtex adrenal produz três hormônios principais: os glicocorticoides
(corticosterona e cortisol), os mineralocorticoides (aldosterona e deoxicorticosterona)
e os andrógenos (DHEA e SDHEA). O precursor de todos os hormônios
provenientes da esteroidogênese adrenal é o colesterol, sendo sua principal fonte a
lipoproteína de baixa densidade (LDL-colesterol) oriunda da circulação, mas sabe-se
que essa não é a única fonte de colesterol para a glândula adrenal, que pode ser
gerado de novo no córtex adrenal, a partir da acetil-coenzima A, e há evidências da
utilização da lipoproteína de alta densidade (HDL-colesterol), através da captação
dessa molécula pelo receptor scavenger tipo I-SR-BI, o receptor de HDL(25).
A esteroidogênese adrenal envolve as vias bioquímicas apresentadas na
Figura 2.
Figura 2: Esteroidogênese na adrenal humana [Modificado de Arlt, Stewart, 2005(25)].
A primeira etapa limitante da esteroidogênese adrenal é a ligação hormonal a
um sistema de transporte intracelular do colesterol, a partir do citoplasma até a
Introdução
7
membrana mitocondrial interna, para a conversão em pregnenolona pelo citocromo
P450 scc, a enzima de clivagem da cadeia lateral. Essa etapa é mediada pela
atividade enzimática da proteína reguladora aguda da esteroidogênese (StAR),
induzida pelo aumento da concentração intracelular de adenosina monofosfato
cíclico (AMPc), proporcionado pela ligação do ACTH ao seu receptor de
membrana(26).
A esteroidogênese envolve a ação combinada de várias enzimas do
citocromo P450. As enzimas CYP11B e a P450scc estão localizadas na mitocôndria
e utilizam um sistema de transporte de elétrons proveniente da adrenodoxinaredutase para oxidar e hidrolisar os esteroides. Já as enzimas 17α-hidroxilase e 21hidroxilase, que estão localizadas no retículo endoplasmático, têm seu transporte
facilitado por flavoproteínas, a POR e o citocromo b5(5).
Na zona reticular, a enzima 17-hidroxilase (CYP17) possui uma atividade
extra, ela cliva a ligação carbono-carbono 17-20 (atividade 17,20-liase), originando
compostos com 19 carbonos. Essa mesma enzima converte 17-hidroxipregnenolona
em DHEA que, por sua vez, é convertida pela 3β-HSD em ANDRO que poderá,
posteriormente, ser convertida em testosterona e estrógenos quando atingir outros
tecidos(25). A 17α- hidroxilase é necessária na ZF da adrenal para a produção de
glicocorticoide, sendo que ambas as atividades 17α-hidroxilase e 17,20-liase são
necessárias para a produção de andrógenos adrenais na ZR da adrenal. Portanto, a
CYP17 é reconhecida como uma das principais reguladoras qualitativas da
esteroidogênese, sendo essencial para a adrenarca(27).
O citocromo b5 (CYB5) é considerado um importante regulador da função da
CYP17 e, particularmente, de sua atividade 17,20-liase. Essa proteína é mais
evidente na ZR da adrenal e resultados sugerem que desempenha um importante
papel no desenvolvimento do córtex adrenal, por meio do seu sistema de
transferência de elétrons, aumentando a atividade da 17,20-liase(28).
A enzima sulfotransferase (SULT2A1) realiza a sulfatação da DHEA, sendo
obrigatória na síntese de SDHEA, sendo este o principal esteroide em massa
produzido pela adrenal adulta, além de ser o mais abundante na circulação do ser
humano adulto. O SULT2A1 é predominantemente expresso no citoplasma das
células adrenocorticais da ZR da adrenal e inclui outros substratos, como
pregnenolona e 17α-hidroxipregnenolona, metabolizando-os aos seus respectivos
produtos sulfatados. Estudos demonstraram que o aumento da produção de SDHEA
Introdução
8
que ocorre na adrenarca está associado com a aceleração da expressão dessa
enzima. Mas ainda há muito a ser esclarecido no que se refere ao papel da
transcrição desse gene na regulação da ZR da adrenal e na adrenarca(9).
A 3β-hidroxiesteroide desidrogenase tipo 2 (HSD3B2) catalisa a conversão de
pregnenolona,
17α-hidroxipregnenolona
e
DHEA
a
progesterona,
17α-
hidroxiprogesterona e androstenodiona, respectivamente (Fig. 2). Essa enzima
normalmente atua de maneira competitiva com a CYP17, diminuindo a produção de
SDHEA. Alterações que diminuam sua atividade podem representar um papel
importante na adrenarca(29).
A 21-hidroxilase do citocromo P450 (CYP21) converte a progesterona e a 17OHP em 11-desoxicorticoesterona, na ZG adrenal, e 11-desoxicortisol, na ZF,
respectivamente. Apesar de não estar diretamente envolvida na produção de DHEA,
assim como a HSD3B2, sua presença desvia a metabolização de produtos
esteroides em mineralocorticoides e glicocorticoides (Fig. 2). Sua deficiência leva ao
aumento da produção de esteróides C19, com consequentes manifestações clínicas
de hiperandrogenismo(30). Evidências sugerem que a adrenarca não depende de
alterações na expressão de CYP21 na zona reticular da adrenal(31).
Apesar de algumas enzimas e cofatores proteicos serem comuns a todas as
zonas adrenais, as classes específicas de esteroides produzidos dentro de cada
uma delas são predominantemente determinadas pela expressão zona-específica
característica de cada enzima esteroidogênica. A Fig. 3 ilustra as principais
diferenças na expressão das enzimas que facilitam a produção de andrógenos
adrenais.
Introdução
9
Figura 3: Vias para a produção de esteroides adrenocorticais. A produção envolve a ação
combinada da StAR, P450scc (CYP11A1), citocromo P450c17; 17α-hidroxilase/17, 20-liase
(CYP17), e sulfotransferase DHEA (SULT2A1). Um facilitador da biossíntese de SDHEA é o
citocromo b5 (CYB5), que pode aumentar a atividade da 17,20-liase de CYP17. Ao
contrário, a 3β-hidroxiesteroide desidrogenase tipo 2 (HSD3B2) e a 21-hidroxilase do
citocromo P450 (CYP21) impactam negativamente na produção do SDHEA [Modificado de
Nakamura et al, 2009(9)].
1.1.4. Hormônios andrógenos
As gônadas e o córtex adrenal têm o mesmo potencial de esteroidogênese,
por sua origem embrionária mesodérmica comum, mas se especializaram na
formação particular de esteroides na dependência do sexo genético e da expressão
de vários fatores de transcrição, tais como o WT1, NR5A1, NR0B1, SRY, SOX9,
AMH, e WNT4(5).
O hormônio adrenocorticotrópico (ACTH) regula a secreção das células da
zona reticular, a camada mais profunda do córtex adrenal que secreta a DHEA e a
ANDRO. Outros fatores parecem estar envolvidos nessa regulação, mas o
mecanismo de controle da produção de andrógenos adrenais não está totalmente
elucidado(25,32) .
Introdução
10
A secreção do ACTH pela hipófise anterior é controlada pelo hormônio
liberador de corticotropina do hipotálamo (CRH). O CRH é secretado no plexo
capilar primário do sistema porta hipofisário, chegando à eminência média do
hipotálamo, sendo então transportada para a hipófise anterior, onde induz a
secreção de ACTH(15).
Os andrógenos adrenais (DHEA, SDHEA e ANDRO) são os esteroides mais
abundantes secretados a partir da glândula adrenal adulta (20 mg/d)(25). O aumento
progressivo da síntese de DHEA e de SDHEA, principais andrógenos adrenais,
ocorre entre 5-25 anos, atingindo seu ápice no início da idade adulta e declinando a
seguir (33).
A ação desses hormônios é exercida principalmente pela conversão, em
outros tecidos, em andrógenos ou estrógenos mais ativos(34). Enquanto nas
mulheres cerca de 50% dos andrógenos são de origem adrenal(35), em homens
adultos esse valor é de cerca de 2%, devido à grande produção de andrógenos
testiculares(36).
1.1.5. A pele como órgão endócrino
A pele e seus apêndices, incluindo folículos pilosos, glândulas sebáceas e
glândulas écrinas e apócrinas, à semelhança dos órgãos esteroidogênicos clássicos,
como gônadas e adrenais, estão munidos de todas as enzimas necessárias para a
síntese e metabolização de andrógenos. Além disso, pele e fâneros também se
constituem em tecido-alvo para a ação dos próprios andrógenos(37,38).
O efeito dos andrógenos é mediado pela ligação a receptores nucleares
específicos. Mutações no gene do RA, como, por exemplo, na Síndrome da
Insensibilidade Completa aos Andrógenos, impede a ação dos andrógenos em todos
os tecidos, incluindo a pele(39).
Os hormônios androgênicos circulantes com ação em todos os tecidos,
incluindo a pele, são o SDHEA e a ANDRO (produzidos nas adrenais), a
testosterona (TESTO) e a dihidrotestosterona (DHT), principalmente sintetizadas nas
gônadas, mas também sintetizadas ou metabolizadas pela pele.
O SDHEA adrenal, que chega à pele pela circulação, apesar de ser um
andrógeno fraco, pode ser convertido a DHEA pela atividade sulfatase de monócitos
Introdução
11
e, posteriormente, sebócitos e queratinócitos podem converter DHEA em ANDRO,
um andrógeno mais potente, bem como sebócitos podem metabolizar andrógenos
até TESTO. A ativação da TESTO, por sua conversão em DHT, é catalisada por 5αredutase tipo 1, expressa em quase todas as células da pele, mas especialmente em
sebócitos, ao passo que a 5α-redutase tipo 2 é expressa por fibroblastos e papilas
dérmicas(40).
Assim, a pele pode ser considerada um órgão endócrino, com capacidade de
sintetizar significativa quantidade de andrógenos com ação parácrina e intrácrina
(Fig. 4).
Figura 4: Esquema do metabolismo dos precursores de andrógenos até seus metabólitos
mais ativos com ações androgênicas, tanto endócrinas como parácrinas. ∆4A:
androstenediona; DHT: di-hidrotestosterona; DHEAS: Sulfato de Deidroepiandrosterona;
DHEA: Deidroepiandrosterona; AR: Receptor de Andrógenos; T: Testosterona; S: sulfatase;
3βOHD: 3βOHD hidroxiesteroide desidrogenase; 5αR:5α-redutase. (Modificado de Pombo,
2000) (3).
Introdução
12
1.1.6. Receptor de andrógeno (RA)
Os andrógenos são hormônios lipofílicos, que de maneira passiva ou
facilitada,
atravessam
a
membrana
celular
e
atingem
seus
receptores
citoplasmáticos, promovendo sua translocação nuclear.
O RA tem a capacidade de se ligar tanto à TESTO como à DHT, porém com
afinidade maior para DHT e, consequentemente, maior atividade.
A estrutura tridimensional do domínio de ligação ao hormônio é semelhante
ao de outros receptores esteroides. A ligação ao hormônio altera a conformação do
receptor, permitindo sua dimerização, translocação ao núcleo, ligação ao elemento
responsivo do gene-alvo e, finalmente, a ligação de moléculas coativadoras, que
estabilizam e amplificam a transdução do sinal hormonal e a transcrição do genealvo(5).
Numerosos tecidos expressam o RA e essa expressão depende da resposta
aos andrógenos, da concentração de receptores, bem como da concentração de
DHT ou TESTO e, segundo se pesquisa, também de coativadores existentes em
cada tecido. Por excelência, os tecidos com resposta androgênica são: o testículo, a
próstata, os genitais, a cartilagem cricoide, o músculo estriado, a pele e,
principalmente, o folículo piloso. Também podemos encontrá-la, entre outros
exemplos, na cartilagem de crescimento e no osso. Em grande parte de tais tecidos
é essencial a ação da enzima 5α-redutase na transformação de TESTO em DHT,
que se expressa nas mesmas células que expressam os receptores. Em outros
tecidos, porém, o andrógeno TESTO não pode atuar diretamente, senão através de
sua transformação em estradiol (E2) mediante a enzima aromatase (por exemplo, na
hipófise). Existem, consequentemente, duas vias para se intensificar ou variar a
ação dos andrógenos: a transformação de TESTO em DHT, intermediada pela 5αredutase, e a transformação de TESTO em E2, que a modifica. Ainda que somente
uma pequena quantidade de TESTO se transforme em E2 (0,2%), como o E2 atua
em concentrações inferiores, essa via adquire importância biológica(3).
Introdução
13
1.2. O gene do receptor de andrógeno (OMIM: 313700)
A localização cromossômica do RA é o braço longo do cromossomo X (Xq1112), cópia única(41,42,43), que se estende por 75 a 90 kilobases (kb) de DNA
genômico. A região codificadora compreende 2757 pares de bases, dividida em oito
exons(44).
Os genes da superfamília dos receptores nucleares apresentam domínios
comuns, denominados domínio de ligação ao ligante hormonal, domínio de ligação
ao DNA e domínio de ativação de função (transativação). Existe também uma
pequena porção do exon 4 que conecta esses dois domínios, conhecida como
dobradiça hinge(45).
O domínio N-terminal é codificado pelo éxon1, correspondente à zona
promotora reguladora da transcrição, sendo constituído por 1613 pares de bases e
possui função moduladora, sendo responsável pela velocidade de transcrição do
gene(46), conforme a Figura 5.
Figura 5: Receptor androgênico com os três principais domínios: Domínio N-terminal
codificado pelo éxon 1, domínio de ligação ao DNA codificado pelos éxons 2 e 3 e domínio
de ligação ao andrógeno, codificado pelos exons 4 a 8 [Richeti, 2011(47)].
O domínio de ligação ao DNA é codificado pelos exons 2 e 3 e constituído por
65 aminoácidos. São seus dois dedos de zinco que o tornam capaz de se ligar aos
elementos responsivos do gene-alvo da ação androgênica.
Os éxon de 4 a 8 codificam o domínio de ligação ao andrógeno, a região da
proteína que se une especificamente aos andrógenos.
Antes do advento da PCR quantitativa em Tempo Real (qRT-PCR), a
expressão do gene do RA só podia ser avaliada em ensaios qualitativos ou
Introdução
14
semiquantitativos, mas,
com a sua introdução, tornou-se possível a avaliação
quantitativa da expressão gênica.
O grupo que desenvolve pesquisas relacionadas a esse tema, do qual esta
autora faz parte, descreveu inicialmente a padronização de um ensaio utilizando
qRT-PCR na quantificação da expressão do gene do receptor glicocorticoide(48,49),
seguida da padronização da expressão do RA em pele prepucial e em folículos
pilosos(50).
1.3. Justificativa deste estudo
Considerando que a pele produz, metaboliza e, simultaneamente, está sob o
efeito de andrógenos(51), levantou-se a hipótese de que o aumento da expressão dos
receptores androgênicos ao nível do folículo piloso possa conferir maior
sensibilidade da pele aos andrógenos e, finalmente, determinar o aparecimento
precoce dos pelos pubianos.
Embora a PPI seja uma situação benigna, cerca de 25% dos casos pode
evoluir em longo prazo para hirsutismo, acne, irregularidade menstrual e síndrome
dos ovários policísticos, situações nas quais o excesso de produção dos andrógenos
ou maior sensibilidade a estes estão presentes
(6,52,53,54)
. Entre as pacientes com
PPI, a detecção precoce daquelas que potencialmente possuem hipersensibilidade
aos andrógenos pode contribuir para o reconhecimento de pacientes com risco
evolutivo de virilização, permitindo melhor planejamento terapêutico.
Introdução
15
2. OBJETIVOS
16
1– Quantificar e comparar a expressão tecido-específica do RNA mensageiro
do receptor de andrógenos em folículos pilosos pubianos provenientes de meninas
com pubarca precoce idiopática e meninas controles.
2– Correlacionar a quantidade do RNA mensageiro do receptor de
andrógenos com a idade de início da pubarca e com a concentração do SDHEA.
Objetivos
17
3. CASUÍSTICA E MÉTODO
18
3.1. Casuística
O protocolo do estudo (Processo nº 163/10) foi aprovado no Comitê de Ética e
Pesquisa em Seres Humanos da Irmandade Santa Casa de São Paulo. Todos os
pacientes ou seus responsáveis assinaram o Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido antes de serem incluídos no estudo (Anexos 2 e 3).
Foram obtidas amostras de pelo da região dos grandes lábios para
quantificação do RNAm do RA de 110 meninas, sendo que 52 delas apresentavam
pubarca precoce idiopática (PPI) e 58 controles pareadas pelo estágio de
desenvolvimento de pelos pubianos de acordo com os critérios de Marshall,
Tanner(2). No momento da coleta dos pelos era realizado o exame físico detalhado
das pacientes e eram colhidas informações sobre as variáveis a serem analisadas
no estudo, tais como peso, IMC, presença de acne, acantose, hirsutismo, idade de
menarca, idade de telarca, e as características físicas dos pelos pubianos (Anexo 4).
As pacientes foram divididas em dois grupos, PII-III e PIV-V, de acordo com o
fato de a pilificação pubiana estar em estágios iniciais (PII-III) ou finais (PIV-V) .
Foram excluídas pacientes com hiperplasia adrenal congênita (HAC),
segundo os critérios diagnósticos utilizados no ambulatório de endocrinologia
pediátrica da ISCMSP, que se baseiam na obtenção da concentração da 17OHP por
radioimunoensaio (RIE). O diagnóstico de HAC é descartado para concentrações de
17OHP menores do que 2 ng/mL, sujeitas a teste de estímulo com ACTH para
valores entre 2 e 10 ng/mL (ou se possível, estudo molecular para detecção de
mutações) e provável diagnóstico, se os valores resultarem acima de 10 ng/mL, visto
a impossibilidade de realização do teste de estímulo com ACTH para todas as
pacientes com essa suspeita. Foram também excluídas pacientes com puberdade
precoce. Nos critérios de exclusão iniciais constava tumor gonadal ou adrenal, ou
uso exógeno de andrógenos, ou terapia antiandrogênica há menos de seis meses,
mas nenhuma paciente submetida ao diagnóstico diferencial de pubarca apresentou
estes critérios.
Casuística e Método
19
3.2. Coleta das amostras de bulbo capilar
Foram obtidas amostras de 4 a 6 pelos da região dos grandes lábios (2 a 3
pelos de cada grande lábio), extraídos suavemente por tração manual simples com
luva. Os pelos com os folículos presentes foram armazenados em tubo específico
com solução de armazenamento apropriado e, em seguida, agitados vigorosamente,
a fim de expor esse substrato à solução de armazenamento para minimizar a
degradação do RNA. Em seguida, as amostras foram armazenadas em Freezer a
-80ºC, idealmente mantidas por um período máximo de 15 dias, devido à constante,
porém lenta, degradação do RNA das amostras.
3.3. Análise bioquímica
Com intervalo inferior a três meses da obtenção dos pelos genitais, foram
obtidas amostras de sangue periférico para quantificação por quimioluminescência
de SDHEA (Siemens Healthcare, Llanberis, United Kingdom) e TESTOT (Siemens
Healthcare, Llanberis, United Kingdom). Por RIE foram determinadas a ANDRO
(IMMUNOTECH a.s., Prague, Czech Republic) e 17OHP (DIAsource Immunoassays
S.A., Louvain-la-Neuve, Belgium).
Há um grande problema metodológico, que se apresenta para qualquer grupo
que queira utilizar em seu estudo medidas hormonais na faixa pediátrica, devido à
escassez de valores de referência para a referida faixa etária da população. Abaixo,
seguem os valores de referências indicados pelos kits utilizados:
SDHEA (ng/mL)
•
Meninas Tanner I: 132 - 650
Meninas Tanner II e III: 220 - 1750
Meninas Tanner IV: 570 - 2300
Meninas Tanner V: 760 - 3780
•
TESTOT (ng/mL)
Meninas Tanner I: 2 - 10
Meninas Tanner II, III, IV e V: 5 – 40
Casuística e Método
20
•
ANDRO (ng/mL)
Crianças de 1 a 6 meses: 0,10 a 0,33
Crianças de 7 a 12 meses: 0,10 a 0,28
Crianças de 1 a 6 anos: 0,10 a 0,23
Crianças de 7 a 9 anos: 0,10 a 0,34
Mulheres: 0,10 a 3,00
•
17OHP (ng/mL)
Crianças de 1 mês a 1 ano: 1 a 40
Crianças de 1 a 13 anos: 0,1 a 1,5
Mulheres fase folicular: 0,11 a 1,08
Mulheres fase lútea: 0,95 a 5
Inicialmente pretendíamos coletar o sangue no mesmo momento da amostra
de
pelo,
mas
encontramos
grande
resistência
por
parte
das
pacientes,
principalmente as do grupo controle. Assim, optamos por coletar os exames
juntamente aos exames de rotina das pacientes, desde que não ultrapassasse o
período máximo de três meses, para que não houvesse interferência maior nas
concentrações séricas hormonais, visto que a paciente poderia mudar de estádio
puberal.
3.4. Análise molecular
As amostras de bulbo piloso foram submetidas à extração de RNA e à
transcrição reversa para a obtenção de DNA complementar (cDNA), posteriormente
quantificado por PCR em tempo real para a determinação da quantidade de RNA
mensageiro específico do receptor androgênico.
3.5. Extração do RNA
3.5.1. Folículo piloso (amostras)
As amostras foram descongeladas e, após pipetagem vigorosa, o conteúdo foi
transferido para um tubo de 2 mL e os folículos pilosos descartados. Foram
adicionados 200 µL de clorofórmio para cada 1 mL de Trizol (Trizol Reagent
Casuística e Método
21
Invitrogen). As amostras foram agitadas novamente, incubadas em temperatura
ambiente por 2 minutos e, em seguida, centrifugadas a 12500 rpm, por 15 minutos, a
4°C.
Após a centrifugação, a fase aquosa de cada amostra foi transferida para um
tubo de 1,7 mL e foram acrescentados 500 mcL de isopropanolol para cada 1 mL de
Trizol, agitada em vórtex e, após repouso de 10 minutos, em temperatura ambiente,
a solução foi novamente centrifugada a 12500 rpm, por 10 minutos, a 4°C.
O sobrenadante foi descartado com pipeta, e o precipitado lavado com 1000
µL de etanol 85% gelado, agitado no vórtex e, em seguida, centrifugado a 9500 rpm,
por 8 minutos, a 4°C. Foi realizada a remoção cuidadosa do etanol e, no gelo, o
precipitado foi ressuspenso em 40 µL de água livre de DNase e RNase, e sua
concentração medida por meio de espectrofotometria. A essa solução acrescentouse 1 µL de enzima inibidora de RNase (Applied N8080234) com armazenamento a
-80°C, por um período de no máximo duas semanas, até a realização da transcrição
reversa.
3.5.2. Curva padrão (próstata)
A próstata é um órgão que expressa grandes quantidades do RA. Um tecido
que expresse grande quantidade do gene em questão é necessário, pois a solução
utilizada como curva padrão deve ser diluída seriadamente e suas concentrações
conhecidas(55). Em estudo anterior de nosso grupo, a padronização da curva padrão
foi realizada utilizando-se a próstata de doador-cadáver para quantificação dos
ensaios de expressão do RA. Neste estudo, a mesma curva padrão foi empregada.
Em resumo, a partir do cDNA extraído do fragmento prostático, com o rompimento
das células por homogeneização (Tissue Disruptor Qiagen), foi realizada a extração
do RNA, utilizando-se o kit (rNeasy Mini Kit - Cat. No. 74104, Qiagen), seguida de
transcrição reversa a cDNA. Esse cDNA serviu como subsídio para o
desenvolvimento da curva padrão.
3.6. Reação enzimática de transcrição reversa
Tanto o RNA procedente do bulbo capilar quanto o de próstata foram diluídos
em 50µl de água ultra pura (GIBCO) e submetidos a uma reação enzimática
Casuística e Método
22
modulada pela ação da transcriptase reversa, possibilitando a síntese do cDNA. A
reação contém o RNA da amostra a ser transcrita, tampão, dNTPs, iniciadores
aleatórios
(Random
primers),
transcriptase
reversa
(Multiscribe
reverse
transcriptase) e a enzima inibidora de RNase (RNase Inhibitor) (Tab. 1).
Tabela 1: Componente para realização da Reação de Transcriptase Reversa (Kit
Taq Man ReverseTranscriptase Reagents N8080234).
Componentes
Volume/Tubo µl
Buffer TaqMan RT
5,0
25nM MgCl2
11,0
DeoxyNTP
10,0
Randon Primers
2,5
Inibidor de RNase
1,0
Tanscriptase Reversa MultiScribe
1,25
Total Mix
30,75
RNA
19,25
Total
50,0
3.7. PCR em tempo real quantitativa (qRT-PCR)
A reação de cadeia da polimerase (Polymerase Chain reaction) é uma técnica
de amplificação in vitro do DNA. O PCR em tempo real, uma variante da reação de
PCR convencional, representa grande avanço nos métodos moleculares de
quantificação da expressão gênica em determinado tecido ou amostra biológica.
Esse método utiliza um sistema fluorescente baseado na atividade 5´ 3´exonuclease
da Taq DNA polimerase, capaz de clivar uma sonda de hibridização não-extensível
Casuística e Método
23
(Sonda TaqMan) durante a fase de extensão da PCR. Tal sonda de hibridização é
marcada com dois fluorocromos. Neste estudo, o fluorocromo utilizado foi o FAM (6carboxi-fluoresceína), este servindo como emissor de fluorescência (R: reporter).
Seu espectro de onda é absorvido pelo fluorocromo inibidor (Q: quencher), que
neste estudo foi o TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina) (Fig. 6).
Figura 6: Ilustração da Sonda TaqMan (Universal PCR Master Mix, Part Number: 4304437
Applied Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA)(56).
Enquanto a sonda está intacta, ocorre transferência da energia fluorescente
do emissor, que é absorvida pelo fluorocromo inibidor pela proximidade física entre
eles. Durante a fase de extensão da PCR, a sonda de hibridização é clivada pela
ação nucleolítica 5´ 3´ da Taq polimerase. Como consequência, essa sonda será
degradada e a emissão fluorescente de FAM já não é mais transferida eficazmente
para o fluorocromo inibidor, resultando em incremento da emissão fluorescente, que
passa a ser detectada a cada ciclo da PCR.
A intensidade da fluorescência produzida durante as amplificações de PCR,
em cada um dos 96 poços do bloco do aparelho, é possível devido a uma câmara
CCD (charged coupled device) presente no equipamento, que capta o sinal durante
25 milissegundos, a cada 8,5 segundos, durante a PCR. Um algoritmo do
computador compara a quantidade de fluorescência emitida pelo fluorocromo
emissor (reporter) com a absorção pelo fluorocromo inibidor (quencher), gerando um
valor de ∆RN (R/Q). O valor ∆RN reflete a quantidade da sonda de hibridação que
foi degradada. O algoritmo calcula a média dos valores ∆RN coletados nos três
últimos ciclos de extensão, produzindo uma representação gráfica (amplification
Casuística e Método
24
plot), na qual, na abscissa, estão representados os números de ciclos e, na
ordenada, está representado o sinal de fluorescência(57,58,59) (Fig. 7).
Figura 7: Representação gráfica (amplification plot) demonstrando a quantificação de RNA
da amostra (∆RN), representada no eixo-Y, e do tempo, representada pelo número de
ciclos, plotada no eixo X. Esse gráfico é a representação dos resultados da amplificação da
curva-padrão do GRα. O ponto 1:100.000.000 não amplificou. A figura mostra ainda um
paciente exemplo (A), que amplificou com um Ct 29,16. [Modificada por Silva, 2014(60)]
Durante os primeiros 10 a 15 ciclos da amplificação por PCR, os valores de
∆RN se mantêm em linha basal (baseline). Dessa maneira, o sinal vai sendo
acumulado, mas permanecendo abaixo dos limites de detecção do aparelho. Haverá
um aumento de sinal fluorescente, correspondente às sondas que serão clivadas a
cada ciclo da reação de PCR, durante o qual a Taq DNA polimerase sintetiza novas
cadeias. Os sinais medidos durante os ciclos da PCR são utilizados para demarcar
uma linha de corte (threshold). A linha de corte é calculada pelo programa como
uma função da quantidade de fluorescência da linha basal e é traçada num ponto
em que o sinal gerado a partir de uma amostra é significativamente maior do que a
fluorescência basal. Geralmente essa linha de corte corresponde a dez desviospadrão acima da média da emissão dos ciclos iniciais. Adicionada à linha de corte,
forma-se uma intersecção com a curva de amplificação detectada acima da linha de
corte, que corresponde à fase exponencial da reação de PCR. Esse ponto é utilizado
Casuística e Método
25
para definir o ciclo limite (Cycle threshold ou Ct) de uma amostra. Portanto, o
número de ciclos da PCR, requeridos para gerar um sinal fluorescente
significativamente maior do que a fluorescência de base, é definido como o ciclo
limite, ou Ct(57,58,59).
A quantificação real depende ainda do cálculo de expressão ajustado em
relação a um gene normalizador, neste estudo representado pelo BCR, que possua
expressão constitutiva estável, ao longo do tempo, e que sirva para corrigir a
expressão do gene em estudo, para a quantidade total de RNA extraído. A
construção de uma curva com quantidades conhecidas de RNA permite criar um
padrão que possa ser repetidamente utilizado para corrigir diferenças entre
sucessivos ensaios de expressão.
3.8. Iniciadores e sondas direcionados ao gene AR
Neste estudo, utilizamos iniciadores sense e antisense desenhados na
transição dos exons 4-5 do gene AR e sonda marcada com o fluorocromo 6-FAM.
Tanto o desenho dos iniciadores da reação como o da sonda para AR foram
baseados
em
sequência
depositada
no
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/21322251,
NCBI,
acessada
disponível
pelo
na
página
OMIM
(Online
Mendelian Inheritance in Man): Assay ID (Hs00171172_m1); localização (3293);
sonda (FAM5NFQ); sequência (AGGCCTTGCCTGGCTTCCGCAACTT); que faz
pareamento nos exons (4-5). A PCR gera um Amplicon com 72pb.
3.8.1. Iniciadores e sondas direcionados ao gene utilizado como normalizador
da reação (BCR- Breakpoint Cluster Region)
Uma das etapas essenciais para a análise da expressão gênica por meio de
PCR em tempo real inclui a escolha de um gene controle ou normalizador, cuja
expressão não encontre variação desprezível entre as amostras analisadas. Muitos
genes podem ser utilizados para isso, como o GAPDH, o G6PD e o ABL. Neste
estudo, o gene BCR (22q11.21) foi escolhido como normalizador, devido à sua
expressão estável e constante ao longo do tempo, bem como à eficiência de
Casuística e Método
26
amplificação similar ao gene de estudo (RA). A sonda e os iniciadores para o gene
normalizador BCR foram:
•
Iniciador BCR Sense: C C T T CGACGT CAATAACAAGGAT;
•
Iniciador BCR Anti-sense: C C TGCGATGGCGT T CAC;
•
Sonda BCR: 6- FAM TCCATCTCGCTCATCATCACCGACA- TAMRA;
•
Tamanho do Produto: 67 pb.
3.8.2. A Reação de PCR em tempo real (RT-PCR)
As reações de PCR foram realizadas em tubos de alta claridade óptica (PCR
optical tubes, Applied Biosystems), específicos para PCR em tempo real. Foi
utilizada uma solução-mãe ou mix para cada gene no preparo das reações (Tab. 2).
Tabela 2: Componentes da reação de PCR em tempo real somados a 5 µl de cDNA.
Componente
Master Mix
BCR Sense (30µM)
BCR AS (30µM)
BCR PROBE VIC (25µM)
H2O
Volume final
Componente
Master Mix 2x
Assay AR 20x (FAM)
H2O
Volume final
Vol/RX
12,5
0,2
0,2
0,27
6,83
20
Mix 1
Vol/RX
12,5
1,25
6,25
20
Mix 2
Os tubos foram colocados no termociclador de tempo real (7500, Applied
Biosystems).
A programação de temperatura compreendeu uma ativação inicial da Taq
Polimerase, que ocorre a 95ºC, por dez minutos, seguida da amplificação da
sequência em 40 ciclos de dois estágios: 15 segundos, a 95ºC, para desnaturação
das fitas de cDNA, seguidos de 90 segundos, a 60ºC, para anelamento e extensão
dos iniciadores. Na fase de extensão, a Taq Polimerase, por meio de sua atividade
5' exonuclease, desloca e fragmenta a sonda, que emite fluorescência quando o
fluorocromo inibidor (TAMRA) se afasta do emissor (6-FAM).
Casuística e Método
27
3.9. Construção da curva padrão
Para obtermos um número absoluto de moléculas das amostras amplificadas
é necessária a construção de uma curva padrão de amplificação. Uma amostra
padrão de cDNA da próstata é diluída de forma seriada 1:10, para a obtenção de
diferentes concentrações. Para cada ensaio, são utilizadas amostras de cDNA da
próstata e dos indivíduos do estudo, nos quais são amplificados os genes BCR e o
RA. A Figura 8A exemplifica a curva de amplificação de 4 pontos da curva padrão
do RA, utilizando cDNA proveniente de próstata.
Figura 8A: Exemplo de curva padrão: curvas de amplificação com amostras em duplicata
em quatro concentrações, obtidas por diluição sucessiva 1:10 de cDNA proveniente de
próstata humana de doador-cadáver.
O coeficiente de regressão linear (r2) deve ser maior do que 0,99 para
verificar a eficiência da reação, ou seja, para sua validação, a curva necessita de um
valor próximo a 1, significando estreita relação entre os pontos da curva, e o valor
ideal da inclinação da curva (slope) é de 3,33, mostrando que ocorreu duplicação
total em cada ciclo e eficiência de 100% da reação (Fig. 8B).
Casuística e Método
28
Figura 8B: Gráfico de regressão linear em função dos dados oriundos da Figura 8A 7A,
utilizando-se a quantidade de moléculas por tubo (abscissa) e o CT de cada ponto da curva
(ordenada).
3.10. Cálculo da expressão de RNAm do RA em amostras de pelo pubiano
A média dos Cts (Cycle threshold) das duplicatas das amostras dos pelos
pubianos é corrigida pela média dos Cts da curva padrão (Fig. 8A). Foi realizada a
divisão das concentrações obtidas de ambos os genes, para que possam ser
estabelecidos os valores que representam o número de unidades de expressão de
RA/BCR de cada amostra (Fig. 9).
Casuística e Método
29
Figura 9: Representação de amplificação das duplicatas do gene BCR (A), apresentando
um Ct aproximado de 27 e do gene RA(B), apresentando um CT aproximado de 32.
Considerando-se o Ct RA=32 e o Ct BCR=27 (Fig. 9), cada um desses Cts
gerou um número quantitativo de unidades de expressão determinados pela curva
padrão (Mean Qty). Foi realizada a razão simples, entre as médias das duplicatas
dos valores obtidos do RA sobre a média das duplicatas dos valores obtidos do BCR
atribuídos pela curva padrão, obtendo-se um valor quantitativo absoluta da
expressão do RA .
3.11. Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas empregando-se o software SPSS
(Statistical Package for Social Sciences) 13.0 for windows, Chicago, Il; USA.
A comparação da mesma variável entre pacientes e controles foi feita através
do Test-t Student ou do teste Mann-Whitney, de acordo com a distribuição
paramétrica ou não paramétrica dos resultados. Os valores foram descritos como
médias e desvios-padrão. Valores de p<0.05 foram considerados significantes.
A correlação entre duas variáveis quantitativas de um mesmo indivíduo foi
realizada por teste de correlação de Pearson, e a visualização da correlação pelo
diagrama de dispersão dos resultados.
Casuística e Método
30
4. RESULTADOS
31
Em 19/52 (35%) das pacientes com PPI e 18/58 (31%) dos controles não foi
possível obter quantidades adequadas de RNA para análise por qRT-PCR. Em
alguns
casos,
principalmente
nas
meninas
em
fases
muito
iniciais
do
desenvolvimento sexual, os pelos eram finos e com folículos pequenos, dificultando
a extração de RNA dessas amostras.
Desse modo, a quantificação do RNAm foi possível em 33 pacientes com PPI
e em 40 controles. Do grupo controle foi excluída uma menina e do grupo das
pacientes com PPI foram excluídas sete que, na evolução, se enquadraram nos
critérios de exclusão. Também consideramos necessária a exclusão de duas
pacientes, uma entre os casos e uma entre os controles, que apresentaram uma
hiperexpressão do RA, e, pela impossibilidade de realizarmos uma recoleta para
confirmação desses resultados, optou-se por excluí-las do estudo, resultando em um
total de 25 pacientes com PPI e 38 controles, conforme demonstrado na Tabela 3.
Tabela 3: Divisão das pacientes conforme estágios de pilificação.
Estágios de pilificação
PPI (n)
C (n)
52
58
Sem RNAm viável
19
18
Excluídas pelos critérios
7
1
Excluídas por hiperexpressão
1
1
25
38
PII-III
16
11
PIV-PV
9
27
Total de coletas
Total
PPI: pubarca precoce idiopática; C: controle.
No projeto inicial foi programada a avaliação de 100 pacientes. Como não
havia estudos anteriores que nos fornecessem o tamanho da amostra necessário, foi
realizada uma análise a partir dos resultados iniciais obtidos. Se as diferenças entre
os grupos fossem mantidas em uma casuística maior, o número de casos
necessários para se atingir um poder do teste estatístico de 0,8 seria superior a mil
participantes em cada grupo. Assim, mantivemos o número de casos inicialmente
programado.
Ao completar a inclusão de casos deste estudo, o cálculo de tamanho
amostral foi refeito, empregando-se o Teste t de Student. A comparação entre casos
Resultados
32
e controles no grupo PII-III com nível de significância de 0,05, poder de 0,8,
utilizando-se a diferença entre as médias de 0,007 e desvio padrão de 0,020. Desta
forma, encontrando-se um tamanho amostral necessário de 130 indivíduos por
grupo, para adequada análise da expressão do RA.Quando se utilizou a diferença
de 0,05 na média e desvio-padrão de 0,018, proveniente da média dos desviospadrão dos casos e controles do grupo PIV-V, encontramos um tamanho amostral
de 205 por grupo, para análise da expressão do RA.
Os valores finais sugerem que futuros estudos envolvendo expressão do RA
em folículo piloso pubiano são viáveis como grupos de estudo locais, não exigindo
escala populacional.
Resultados
33
4.1. Resultados descritivos das variáveis
Os resultados descritivos das variáveis clínicas e hormonais das pacientes
com PPI e de controles nos grupos PII-III e PIV-V são descritos na Tabela 4 e 5.
Tabela 4: Resultados descritivos de média e desvio padrão das variáveis clínicas e
laboratoriais de pacientes PPI e controles nos estágios de pilificação PII-III.
Variável
Grupo
Caso
Idade
Controle
Caso
Peso
Controle
Caso
Estatura Controle
Caso
IMC
Controle
Caso
Controle
ID TLC
Caso
ID Pub
Controle
Caso
170HP
Controle
Caso
SDHEA Controle
Caso
TESTO
Controle
Caso
ANDRO Controle
Caso
AR/BCR Controle
Caso
mnc_mat Controle
N
16
11
16
10
16
10
16
10
11
8
15
8
11
8
10
7
11
7
10
8
16
11
15
11
Média
8,1
11,4
36,29
36,44
1,35
1,41
20,1
18,2
6,9
10,8
6,1
10,2
0,9
0,8
866
624
11,5
15,9
0,76
1,11
0,0176
0,0276
11,8
13,1
Mediana
8,1
11,8
33,95
34,35
1,36
1,39
18,5
17,6
7,0
10,5
6,3
10,0
0,5
0,8
788
636
10,0
10,0
0,60
0,90
0,0153
0,0232
12,0
12,0
Desvio
1,4
1,6
8,78
11,56
0,11
0,08
4,7
4,1
1,8
1,7
1,0
1,7
1,3
0,6
594
456
5,1
10,1
0,60
0,71
0,0187
0,0217
1,6
2,0
Minimo
5,6
9,1
24,80
24,10
1,16
1,26
14,6
13,3
4,0
9,0
4,0
8,5
0,2
0,2
75
39
10,0
10,0
0,10
0,10
0,0004
0,0024
9,0
11,0
Máximo
10,3
14,6
55,00
65,40
1,49
1,52
32,0
28,5
9,0
14,0
7,5
13,0
4,6
2,1
2210
1210
27,0
34,0
2,00
2,00
0,0750
0,0640
15,0
17,0
p
< 0,001 *
0,895 **
0,142 *
0,225**
< 0,001 *
< 0,001 *
0,507**
0,558**
0,106**
0,285**
0,114**
0,101**
IDTLC= Idade da Telarca; IDPub= Idade da Pubarca; 17OHP= 17-hidroxiprogesterona; SDHEA=
Sulfato de Deidroepiandrosterona; TESTOT= Testosterona Total; ANDRO= ∆4-androstenediona; Mnc
mat=idade da menarca materna.
* Teste t-Student / ** Mann-Whitney
Resultados
34
Tabela 5: Resultados descritivos de média e desvio padrão das variáveis clínicas e
laboratoriais de pacientes PPI e controles nos estágios de pilificação PIV-V.
Variável
Idade
Peso
Estatura
IMC
ID TLC
ID Pub
170HP
SDHEA
TESTO
ANDRO
AR/BCR
mnc_mat
mnc_idade
Grupo
Caso
Controle
Caso
Controle
Caso
Controle
Caso
Controle
Caso
Controle
Caso
Controle
Caso
Controle
Caso
Controle
Caso
Controle
Caso
Controle
Caso
Controle
Caso
Controle
Caso
Controle
N
9
26
9
26
9
26
9
26
6
23
8
23
5
17
4
17
5
17
5
15
9
27
7
25
8
22
Média
13,7
14,3
51,21
53,64
1,55
1,56
20,6
21,9
8,4
10,6
6,8
10,1
1,3
1,2
1220
1029
30,6
18,3
3,14
1,98
0,0150
0,0185
14,3
12,7
10,7
12,0
Mediana Desvio
13,9
3,1
13,8
2,0
50,10
16,34
50,35
13,18
1,61
0,12
1,56
0,07
20,4
4,2
21,3
4,5
8,1
1,7
11,0
1,4
7,0
0,7
10,0
1,1
1,2
0,7
1,0
1,0
868
889
1100
582
38,0
19,2
10,0
12,7
3,20
2,40
1,50
1,89
0,0100
0,0136
0,0080
0,0223
14,0
2,1
13,0
1,7
11,5
1,6
12,0
1,1
Minimo
8,0
11,0
24,10
32,33
1,30
1,43
14,3
14,6
7,0
8,0
5,6
8,4
0,3
0,3
615
118
10,0
6,6
0,80
0,70
0,0025
0,0006
12,0
9,0
8,0
10,0
Máximo
p
18,9
18,9
0,678**
76,50
91,20
0,610**
1,69
1,72
0,664**
27,8
34,3
0,497**
11,4
14,0
0,017**
8,0
12,0
<0,001**
2,1
4,4
0,610**
2530
2270
0,788**
49,0
48,0
0,180**
6,80
0,294**
8,50
0,0450
0,0850 0,784**
18,0
0,060**
17,0
12,0
14,0
0,042**
IDTLC= Idade da Telarca; IDPub= Idade da Pubarca; 17OHP= 17-hidroxiprogesterona; SDHEA=
Sulfato de Deidroepiandrosterona; TESTOT= Testosterona Total; ANDRO= ∆4-androstenediona;
Mnc mat= Idade da Menarca Materna; Mnc idade=idade da menarca
** Mann-Whitney
4.2. Resultados analíticos das variáveis clínicas
A idade cronológica é significativamente menor nas pacientes com PPI em
estágios iniciais de pelos pubianos (PII-III), quando comparadas aos seus controles.
No momento da avaliação, as pacientes em estágios finais de pelos pubianos (PIVV) apresentaram idade cronológica similar.
Conforme o esperado (1,2), tanto no grupo PII-III quanto no grupo PIV-V, a
idade da pubarca foi diferente, sendo significativamente menor nas pacientes com
PPI em relação aos controles.
Resultados
35
A idade da telarca também foi diferente, sendo tal diferença significativamente
menor nas pacientes com PPI, quando comparada aos controles em ambos os
grupos.
A comparação de pacientes com PPI e controles em ambos os grupos
mostrou uma proporção de casos com e sem menarca semelhante. Apenas 1/16
pacientes apresentou a menarca, entre as pacientes com PPI no grupo PII-III (aos
11 anos), não havendo nenhum caso entre as 11 meninas do grupo controle. No
grupo PIV-V, a menarca já estava presente em 8/9 pacientes com PPI e em 22/27
controles. No grupo PIV-V, a mediana da menarca foi menor no grupo PPI, em
relação aos controles (11,5 x 12 anos), e essa diferença é significativa pelo Teste de
Mann-Whitney (p:0,042).
Não houve diferença significativa entre pacientes PPI e controles quando
analisamos o peso, bem como estatura e IMC.
A idade da menarca materna foi igual quando comparamos PPI e controles
tanto no grupo PII-III, quanto no grupo PIV-V.
4.3. Resultados analíticos das variáveis hormonais
Não foi encontrada diferença significativa nas medidas de 17OHP basal, tanto
em PPI quanto nos seus controles.
Não houve diferença significativa quando foram comparados os valores
SDHEA entre PPI e controles de um mesmo grupo.
Não houve diferença significativa entre pacientes PPI e controles quando
analisamos a dosagem da TESTOT
.Mesmo na comparação das medidas de ANDRO, não encontramos diferença
significativa entre PPI e controles.
4.4. Análise da expressão do Gene RA
A expressão do RA nos dois grupos apresenta dispersão ampla e não
paramétrica, tanto em pacientes com PPI como em controles. Não houve diferença
de expressão do RA quando pacientes com PPI e controles foram comparadas,
tanto no grupo PII-III, quanto no grupo PIV-V.
Resultados
36
4.4.1. Expressão do gene RA em pacientes e controles no grupo PII-III
Não houve diferença significativa quanto à expressão do gene RA entre
pacientes com PPI e controles do grupo PII- III (Tab. 6, Fig. 10).
Tabela 6: Expressão do RA em pacientes e controles no grupo PII-III.
Variável Grupo
Caso
AR/BCR Controle
N
Média
Mediana
16
0,0176
0,0153
11
0,0276
0,0232
Desvio
Mínimo
Máximo
0,0187
0,0004
0,0750
0,0217
0,0024
0,0640
p
0,114 **
* * Mann-Whitney
Figura 10: Gráfico da comparação da expressão do gene RA entre pacientes com PPI e
controles do grupo PII-III. PPI=pubarca precoce idiopática e C=controles.
Resultados
37
4.4.2. Expressão do gene RA em pacientes e controles no grupo PIV-V
Não houve diferença significativa quanto à expressão do gene RA entre
pacientes com PPI e controles no grupo PIV-V (Tab. 7, Fig. 11).
Tabela 7: Expressão do RA em pacientes e controles no grupo PIV-V.
Variável
AR/BCR
Grupo
N
Média
Mediana Desvio
Mínimo Máximo
Caso
9
0,0150
0,0100
0,0136
0,0025
0,0450
Controle
27
0,0185
0,0080
0,0223
0,0006
0,0850
p
0,784 **
** Mann-Whitney
Figura 11: Gráfico da comparação da expressão do gene RA entre pacientes com PPI e
controles em estágios finais de pelos pubianos (PIV-V), PPI=pubarca precoce idiopática e
C=controles.
Resultados
38
4.4.3. Expressão do gene RA na evolução da puberdade
Quando agrupamos as meninas PII-III, independente de serem casos ou
controles e comparamos a expressão do RA destas com as meninas PIV-V, também
agrupadas pelo Tanner, não encontramos diferença significativa. (Tab.8)
Tabela 8: Expressão do RA em pacientes e controles no grupo PIV-V.
Variável
AR/BCR
Grupo
N
Média
Mediana Desvio
Mínimo Máximo
PII-III
27
0,0216
0,0170
0,0202
0,0004
0,0750
PIV-V
36
0,0176
0,0086
0,0203
0,0006
0,0850
p
0,311 **
** Mann-Whitney
Resultados
39
4.5. Correlação entre SDHEA e expressão do gene RA
Não se observou correlação significante entre a expressão do RA e os valores
de SDHEA entre pacientes com PPI e controles, tanto do grupo PII-III, quanto do
grupo PIV-V.
Figura 12: Diagrama de dispersão de resultados da expressão do RA e os valores de
SDHEA em pacientes com PPI e controles do grupo PII-III. PPI=pubarca precoce idiopática.
Resultados
40
Figura 13: Diagrama de dispersão de resultados da expressão do RA e os valores de
SDHEA em pacientes com PPI e controles do grupo PIV-V. PPI=pubarca precoce idiopática.
Resultados
41
5. DISCUSSÃO
42
Um estudo transversal realizado nos Estados Unidos com 17.077 meninas
apontou sinais de desenvolvimento puberal em idades cada vez mais jovens(61),
sugerindo mudanças nos critérios atuais para diagnóstico de pubarca precoce. Tais
resultados devem ser interpretados com cautela, pois existem falhas metodológicas
no estudo(6,62). Alguns aspectos relevantes apresentados naquele estudo, que
também merecem reflexão, incluem causas possíveis da PPI, como predomínio da
precocidade sexual no sexo feminino, revisão de critérios diagnósticos(63) e riscos a
que as pacientes estariam sujeitas durante sua evolução, na maturidade.
Em pacientes com PPI existe a associação em longo prazo com o
aparecimento de sinais de hiperandrogenismo, tais como hirsutismo, acne,
irregularidade menstrual e alterações metabólicas compatíveis com a síndrome dos
ovários policísticos (SOP) ou a síndrome metabólica(6,52,53,54,64,65,66). Reconhecer
precocemente, durante a infância, os casos com maior risco evolutivo para tais
distúrbios na vida adulta seria importante para a prática clínica.
A hipótese de trabalho desta pesquisa sugeriu que um potencial mecanismo
envolvido no aparecimento da PPI seria a hipersensibilidade do folículo piloso à
ação androgênica, mediada pelo receptor androgênico. Portanto, procuramos
identificar se o excesso de expressão tecido-específico do RA seria determinante do
aparecimento da PPI. Quando comparamos pacientes com PPI e controles com
pubarca em idade cronológica normal, não identificamos anormalidades de
expressão do RA, tanto no grupo com estágios iniciais de pilificação pubiana (PII-III),
quanto nos estágios finais de pilificação (PIV-V). Analisando a expressão do RA em
sua evolução durante a puberdade através da comparação de meninas em estágios
iniciais de pilificação(PII-III) com meninas em estágios finais de pilificação (PIV-V),
observamos que esta se mantém similar durante todo este processo.
Relatos anteriores identificaram associação entre a obesidade e maior
frequência de adrenarca precoce(67,68). Mudanças no estado nutricional, causando
elevação do IMC, foram consideradas importantes reguladores fisiológicos de
adrenarca, independentemente da concentração de andrógenos adrenais, idade ou
estágio de desenvolvimento puberal(69). Na amostra presente neste trabalho, o
excesso de peso não figurou como um interferente significante, visto que peso,
estatura e IMC foram similares entre PPI e controles, o que também coincide com
estudos que mostram PPI gerando aceleração apenas transitória de crescimento,
Discussão
43
com efeitos insignificantes sobre o aparecimento e a progressão da puberdade ou
altura final(70,71).
A comparação entre pacientes com PPI e controles em ambos os grupos
mostrou uma proporção de casos com e sem menarca semelhante, sugerindo que,
embora possa haver antecipação do início puberal, não se espera a antecipação da
menarca em pacientes com PPI. Embora a idade da menarca seja menor do que a
mediana da população geral em pacientes com PPI, quando se compara com os
controles no grupo PIV-V, esse achado deve ser interpretado com limitações, devido
ao pequeno tamanho da amostra, visto que as pacientes apresentaram menarca
ainda dentro de um intervalo de normalidade.
Estudos prévios sugerem que a PPI seja secundária à maturação precoce e
independente da adrenal(72,73,74,75). Os resultados deste trabalho identificam valores
similares de SDHEA em pacientes com PPI e controles, quando os mesmos são
pareados para o mesmo estágio de Tanner, sugerindo que a antecipação da
adrenarca, e não o excesso de produção androgênica adrenal, seja o principal fator
determinante dessa condição. Nas pacientes com PPI, valores similares de SDHEA,
em relação às controles, foram atingidos em média 3,5 anos antes. Tais achados
estão em concordância com estudos anteriores, que demonstram que androgênios
adrenais são considerados aumentados para a idade cronológica, mas similares
para os estágios puberais(74,75,76).
Alguns trabalhos levantam a hipótese de que o aumento do DHEA possa
oferecer maior quantidade de substrato para conversão em estradiol nas mamas,
representando uma fonte significativa de estrogênio na criança pré-púbere(77).
Apesar de relatos demonstrarem que apenas uma pequena porcentagem da
conversão de DHEA ao estradiol ocorre na periferia(78), essa quantidade poderia ser
significativa para o tecido-alvo, quando a concentração de DHEA estiver aumentada.
Tal fenômeno poderia explicar o fato de algumas das pacientes com PPI, que
participaram deste estudo, apresentarem telarca mais cedo, em comparação às
controles.
Neste trabalho foi feita uma opção por dosar o SDHEA, em vez do DHEA,
pois o primeiro apresenta uma origem quase exclusivamente adrenal e suas
concentrações séricas não apresentam flutuações circadianas como a DHEA, que
ainda apresenta, também, variações em função da fase do ciclo menstrual.
Igualmente não foi dosado o DHT, por tratar-se do metabólito mais ativo da TESTOT
Discussão
44
que foi dosada juntamente a outros precursores, como a ANDRO, a 17OHP e o
SDHEA.
Quando se buscou correlacionar as concentrações de SDHEA e a expressão
de RA, acreditava-se encontrar qualquer uma das seguintes três possibilidades:
1. A hiperprodução de SDHEA causando um “down regulation” com menor
expressão do RA;
2. A principal hipótese deste estudo: concentrações baixas de SDHEA para o
estádio de pilificação pubiana, com hiperexpressão do RA justificando a PPI;
3. E, o que realmente foi encontrado: concentrações de SDHEA normais para o
estádio de pilificação pubiana, com expressão normal do RA.
Em conjunto, os achados desta pesquisa apontam para uma expressão
normal do RA em células do folículo piloso dos grandes lábios de pacientes com
PPI. As concentrações de SDHEA são adequadas para o estágio de pilificação
pubiana, porém se elevam de forma antecipada no tempo em relação aos controles,
evidenciando a ativação precoce da zona reticular do córtex adrenal.
Um limitante deste estudo é o reduzido número de casos com PPI,
especialmente no grupo PII-III. Se as diferenças entre os grupos fossem mantidas
em uma casuística maior, como calculado, permitiria a identificação de uma pequena
diferença na comparação dos resultados. O questionamento a ser feito é se uma
diferença dessa magnitude possa ter qualquer significância clínica.
A grande relevância deste estudo foi testar uma hipótese inédita e, oferecer a
informação de que não existem diferenças grosseiras na expressão do RA entre
pacientes PPI e controles. Ademais, o estudo viabilizou um cálculo amostral para se
prosseguir futuramente com essa investigação.
Discussão
45
6. CONCLUSÃO
46
1. A quantidade de RNAm do RA foi similar entre pacientes com PPI e controles,
tanto nos estágios iniciais quanto nos finais de desenvolvimento dos pelos
pubianos, sugerindo expressão normal do RA em pacientes com PPI.
2. A quantidade de RNAm do RA foi semelhante entre meninas com estágios
iniciais de pilificação quando comparadas a meninas com estágios finais de
pilificação, sugerindo expressão constante do RA durante toda a evolução
puberal.
3. Não se observou correlação significante entre a expressão do RA e os
valores de SDHEA.
4. As concentrações de SDHEA nas pacientes com PPI são adequadas para o
estágio da pilificação pubiana, porém antecipadas em relação aos controles,
indicando ativação precoce da zona reticular do córtex adrenal.
5. Em conjunto, pode-se concluir que pacientes com PPI apresentam
concentração normal de SDHEA circulante, bem como expressão normal dos
receptores androgênicos ao nível do folículo piloso pubiano, porém em idade
cronológica antecipada em relação aos controles. Portanto, os dados que
constam neste trabalho sugerem que a pubarca precoce devido à adrenarca
prematura seja um fenômeno de antecipação de maturação, sem elevação
das concentrações hormonais ou aumento dos receptores androgênicos que
pudessem determinar a hipersensibilidade local aos andrógenos.
Conclusão
47
7. ANEXOS
48
ANEXO 1
Desenvolvimento dos pelos pubianos
Carel, Leger, 2008(79).
Anexos
49
ANEXO 2
Aprovação do Comitê de Ética
Anexos
50
ANEXO 3
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Você está sendo convidado a participar de um estudo de pesquisa cujo título é:
"Determinação da quantidade de RNA-mensageiro do receptor de andrógenos em
indivíduos com pubarca precoce idiopática.”
Eu,
_____________________________________________,
responsável
pela
menor
________________________________________________, fui informado(a) que minha
filha participará de um estudo sobre meninas com pelos pubianos para comparar a idade
que o pelo começou e os exames laboratoriais de sangue e do próprio pelo. Na consulta
médica, serão colhidos de 4-6 pelos da região dos grandes lábios, puxados com a mão
suavemente pelo médico. Também será colhida amostra de sangue (3ml). Este estudo será
feito para entendermos melhor os motivos que determinam o aparecimento dos pelos
pubianos. Compreendo que a participação de minha filha não é obrigatória e pode não
trazer qualquer benefício direto a ela, mas proporcionará um melhor conhecimento à
respeito deste problema, que poderá beneficiar outras crianças. Em alguns casos, o
resultado dos exames pode ainda orientar o melhor tratamento a ser realizado. Fui
informado(a) quanto ao desconforto no momento da coleta do pelo, que será puxado com os
dedos. Fui ainda informado (a) que a coleta de sangue pode também trazer o desconforto
da picada e o aparecimento de inchaço ou uma mancha roxa no local da picada. Estou
ciente que poderei recusar participar deste estudo, assim como retirar minha filha durante a
avaliação, sem que isto traga prejuízos ao seu acompanhamento neste serviço. Fica
garantido o sigilo quanto aos dados oferecidos e resultados de exames, mantendo a
privacidade dos pacientes quanto aos dados confidenciais da pesquisa. Você não deve
assinar este formulário de consentimento a menos que você tenha tido a oportunidade de
fazer todas as perguntas e ter esclarecido todas as suas dúvidas. Quaisquer dúvidas que
eventualmente possam ocorrer você poderá entrar em contato com a pesquisadora Dra.
Flávia Cerize Vallerini no telefone (0xx11) 2176-7000 (ramal: 5862/5863).
Assim sendo, autorizo a participação da minha filha neste estudo.
Nome e Assinatura do Responsável pelo menor
Nome e Assinatura do Responsável pela pesquisa
São Paulo
___/___/________
Anexos
51
ANEXO 4
EXAME FÍSICO
NOME:____________________________________________________________________
P:______________
DATA NASCIMENTO:___/___/______
E:______________
IMC:___________
ACNE: NÃO SIM LOCAIS:_____________________
CA:____________
ACANTOSE: NÃO SIM LOCAIS:_________________
ESTÁGIO PUBERAL DE TANNER:
PII PIII PIV PV
MI MII MIII MIV
MV
MENARCA:__________________
IRREGULARIDADE:___________
CARACTERÍSTICAS:
PELO FINO □
NÃO PIGMENTADO
PELO GROSSO □
□
LISO □
PIGMENTADO/ESCURO □
ENCARACOLADO □
MENARCA MÃE:__________________
PUBARCA MÃE:__________________
TELARCA MÃE:__________________
COLETADA AMOSTRA
COLETADO SANGUE
Anexos
IMC ID TLC ID PUB
15,34 8,63 6,25
17,71 8,75
6,5
17,84
N
5
28,44
<7
19,71
4
5
14,56
N
7
16,15
9
7,5
18,19
5
7
20,67
7,9
6
23,86
N 5,08
17,11
N
7
22,31
8,5
7
20,98
5
4
17,99
7 7,08
18,80
6
6
32,05
6
5,5
P
III
III
II
II
II
III
III
II
III
III
II
III
III
III
III
II
M
III
III
III
II
II
I
III
III
I
I
I
III
III
III
III
II
MM
IC/IO
17OHP SDHEA TESTOT ANDRO
13
9a2m/11a
10
4,6 1120
<20
1,5
12 7a/5e9-6a10m
0,2 <150
<20
0,1
9 07/08/2011
0,8
587
<20
0,5
12 5a8m/6a10m
0,2
<20
0,2
14 7a6m/8a10m
0,3 1030
<20
0,7
13,5
7a/10a
0,7
256
<20
0,4
11,83
8a/11a
1,6
734
<20
0,4
7a9m/10a
0,4
605
<20
1
10
5a6m/6a
15
11
0,6 2210
27
2
12
11
12
0,5
842
<20
0,8
11
0,5 1200
<20
RA/BCR
0,01107
0,02046
0,01430
0,02002
0,01631
0,00075
0,00043
0,00201
0,00117
0,01859
0,01368
0,00826
0,01700
0,07500
0,01900
0,04400
PPI= Pubarca Precoce Idiopática; IDTLC= Idade da Telarca; IDPUB= Idade da Pubarca; P=Estágio de Tanner para pelos pubianos
M=Estágio de Tanner para mamas; MM= Idade da Menarca Materna; IC/IO= Idade Cronológica/ Idade Óssea;
17OHP= 17-hidroxiprogesterona; SDHEA=Sulfato de Deidroepiandrosterona; TESTOT= Testosterona Total; ANDRO=Δ4-androstenediona;
RA= Receptor Androgênico; BCR= Gene Normalizador (Breakpoint Cluster Region )
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
IDADE PESO ESTATURA
9,62
29
1,38
10,24
33
1,37
7,13 24,8
1,18
7,82 52,6
1,36
5,76 28,1
1,19
8,88 29,7
1,43
10,30 35,7
1,49
8,43 38,5
1,46
8,27 36,9
1,34
5,58 32,1
1,16
8,14 34,6
1,42
9,50
49
1,48
6,90 33,3
1,26
7,92 30,4
1,30
8,00 37,9
1,42
7,64
55
1,31
Dados individuais das pacientes com PPI do grupo PII-III
52
ANEXO 5
Anexos
IDADE PESO ESTATURA IMC ID TLC ID PUB P
M MM
IC/IO
17OHP SDHEA TESTOT ANDRO RA/BCR
1 12,30 42,4
1,51 18,67
9
7 IV IV 14 12a3m/14a
1,2 615 <20
3,2 0,01003
2 13,20 51
1,56 20,96 7,16 6,5
V
V
9a4m/13-14a
0,00644
3 16,45 50,1
1,62 19,21
5,58
V
V 13 14a6m/13a6m
2,1 2530
49
3,7 0,02078
4 7,98 24,1
1,30 14,26
<8 IV
I 16 7a6m/8a10m
1,2 1010 <20
0,8 0,00327
5 14,40 43,8
1,61 17,00 11,4
8
V IV 18 14a4m/15a
0,3 725
46
1,2 0,00253
6 11,41 42
1,44 20,40
7
7 IV IV 12 11a4m/13a
0,01346
7 14,71 76,5
1,66 27,76
7
7
V
V 13
1,7
38
6,8 0,02512
8 18,95 73,7
1,69 25,74
6
V IV
0,00837
9 13,90 57,3
1,62 21,83
9
7
V
V 14
0,04500
PPI= Pubarca Precoce Idiopática; IDTLC= Idade da Telarca; IDPUB= Idade da Pubarca; P=Estágio de Tanner para pelos pubianos
M=Estágio de Tanner para mamas; MM= Idade da Menarca Materna; IC/IO= Idade Cronológica/ Idade Óssea;
17OHP= 17-hidroxiprogesterona; SDHEA=Sulfato de Deidroepiandrosterona; TESTOT= Testosterona Total; ANDRO=Δ4-androstenediona;
RA= Receptor Androgênico; BCR= Gene Normalizador (Breakpoint Cluster Region)
Dados individuais das pacientes com PPI do grupo PIV-V
53
ANEXO 6
Anexos
IDADE PESO ESTATURA IMC ID TLC ID PUB P
M MM
IC/IO
17OHP SDHEA TESTOT ANDRO RA/BCR
1 12,38 34,6
1,37 18,57
11-12a
III
III
11
2,1 1210 <20
1,8 0,02315
2 9,09
9,75 8,58
II
I
11
0,5 636 <20
0,6 0,05833
3 11,79 65,4
1,51 28,53
9-10a
III
II
16
0,00237
4 10,17 31,7
1,36 17,19
8-9a
III
III
17
0,17
39 10,64
0,7 0,00833
5 12,12 32
1,36 17,35 11,4 11,58
III
III
14 11a11m/10a
0,9 226 <20
1,1 0,01349
6 10,75 35,2
1,50 15,64 10
9
III
II
12
0,00293
7 10,56 24,1
1,26 15,18
9
9
III
II
14
1 336 <20
0,1 0,05100
8 9,41 38
1,40 19,39
9 8,5
III
II
12
0,3
0,7 0,03100
9 11,77 43,3
1,52 18,74 11 11
II
II
12
1 740
27
1,9 0,06400
10 14,63 34,1
1,38 17,91 14 13
II
III
13
0,7 1180
34
2 0,02100
11 12,35 26
1,40 13,27 12 11
II
II
12
0,02800
PPI= Pubarca Precoce Idiopática; IDTLC= Idade da Telarca; IDPUB= Idade da Pubarca; P=Estágio de Tanner para pelos pubianos
M=Estágio de Tanner para mamas; MM= Idade da Menarca Materna; IC/IO= Idade Cronológica/ Idade Óssea;
17OHP= 17-hidroxiprogesterona; SDHEA=Sulfato de Deidroepiandrosterona; TESTOT= Testosterona Total; ANDRO=Δ4-androstenediona;
RA= Receptor Androgênico; BCR= Gene Normalizador (Breakpoint Cluster Region )
Dados individuais dos controles do grupo PII-III
54
ANEXO 7
Anexos
IDADE PESO ESTATURA IMC ID TLC ID PUB
P
M
MM
IC/IO
17OHP SDHEA TESTOT ANDRO RA/BCR
1
70,7
1,66 25,66
9-10a
V
V
13
13a7m/15a
0,02368
2 14,07 32,33
1,49 14,56 11,08 10,75
IV
IV
13
14a/13a6m
0,00767
3 13,75
43,4
1,51 19,06
9
10
V
V
11
13a8m/15a
0,01306
4 14,78
11
12
V
V
1,9
344
<20
1 0,00160
5 11,47
49,9
1,47 23,09
8,4
8,4
IV
III
11
11a4m/13a
0,45
117,9
6,62
0,01809
6 12,22
47,9
1,57 19,43
11
8,5
V
III
15
0,4
1320
<20
1,9 0,00954
7 16,50
51,8
1,56 21,18 11,16
10,5
V
V
0,3
1130
<20
1,8 0,07208
8 14,09
59
1,66 21,46
11-12a
V
V
13
1,6
668
46
2,7 0,00395
9 15,40
50,7
1,56 20,97
9-10a
V
V
13
0,6
1520
22
1,1 0,00617
10 13,59
54,7
1,56 22,56
9,66
9,66
V
V
13
0,3
483
<20
0,7 0,00144
11 18,56
46,3
1,63 17,43
10
10
V
V
12
0,00063
12 14,49
91,2
1,69 32,12
11
10
V
V
9
0,5
1660
25
0,00665
13 18,07
43,5
1,55 18,15
10,5
9
V
V
15
0,00267
14 13,11
45
1,43 21,94
9,5
11
IV
IV
13
12a/12a
1
822
25
2,1 0,00828
15 12,72
63,9
1,72 21,60
9,5
9,5
V
V
12
12a/14a
0,00591
16 15,20
50,7
1,47 23,62
14
12
V
V
10
0,01834
17 15,27
68,2
1,57 27,67
11
10
V
V
13
4,4
1550
<20
22 0,02085
18 13,20
42,1
1,54 17,77
10,5
10,5
V
V
12
1,2
564
48
1,9 0,00726
19 13,48
53,3
1,61 20,56
12
10
V
IV
14
0,4
697
<20
1,1 0,00600
20 15,29
45,8
1,61 17,67
11
11
V
IV
17
0,7
1350
22
1,5 0,03200
21 13,85
44,3
1,51 19,43
12
9
V
IV
12
1,6
1100
<20
0,8 0,03000
22 18,92
62
1,58 24,84
11
11
V
V
12
0,00500
23 11,00
82,3
1,55 34,26
9
10
V
V
13
2,4
369
26
1 0,00400
24 13,38
44,4
1,56 18,24
11
11,4
IV
IV
13
0,08500
25 13,42
50
1,45 23,78
13
12
IV
IV
15
1,3
1520
<20
1,4 0,06500
26 13,78
59,1
1,56 24,29
8
8,5
V
V
11
1,4
2270
<20
8,5 0,03100
27 12,58
42
1,57 17,04
N
9
IV
I
13
0,02100
PPI= Pubarca Precoce Idiopática; IDTLC= Idade da Telarca; IDPUB= Idade da Pubarca; P=Estágio de Tanner para pelos pubianos
M=Estágio de Tanner para mamas; MM= Idade da Menarca Materna; IC/IO= Idade Cronológica/ Idade Óssea;
17OHP= 17-hidroxiprogesterona; SDHEA=Sulfato de Deidroepiandrosterona; TESTOT= Testosterona Total; ANDRO=Δ4-androstenediona;
RA= Receptor Androgênico; BCR= Gene Normalizador (Breakpoint Cluster Region )
Dados individuais dos controles do grupo PIV-V
55
ANEXO 8
‘
Anexos
56
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Referências Bibliográficas
63
RESUMO
64
Vallerini FC. Expressão do receptor androgênico em células do folículo piloso de
pacientes com pubarca precoce idiopática. Dissertação (Mestrado); 2015.
A patogênese da pubarca precoce idiopática (PPI) ainda é incerta. Um potencial
mecanismo seria a hipersensibilidade do folículo piloso à ação androgênica. A
detecção precoce de hipersensibilidade aos andrógenos poderá permitir melhores
estratégias
de
tratamento
caso
ocorra
evolução
para
uma
síndrome
hiperandrogênica. A hipótese deste estudo é que um excesso de expressão tecidoespecífico do receptor androgênico (RA) esteja relacionado ao aparecimento da PPI.
O RNAm RA foi medido por PCR em tempo real nos folículos pilosos de grandes
lábios de meninas (PPI:25; controles:38). As pacientes foram divididas em dois
grupos, PII-III e PIV-V, de acordo com sua classificação nos estágios de Tanner.
Androstenediona,
testosterona
total,
17-hidroxiprogesterona
e
sulfato
de
deidroepiandrosterona (SDHEA) também foram dosados. Como esperado, a idade
cronológica e da pubarca foram reduzidas em PPI comparadas às controles. A idade
da telarca foi reduzida em ambos os grupos PPI iniciais e finais. A proporção de
pacientes com menarca foi semelhante em PPI e controles, mas a idade da menarca
foi reduzida em PPI. As concentrações hormonais foram semelhantes nos dois
grupos, quando são pareados para o mesmo estágio de pelos pubianos de Tanner.
A mesma concentração de DHEAS foi atingida em média 3,5 anos antes em PPI
quando comparadas às controles. Não houve diferença na expressão de RNAm do
RA entre as pacientes com PPI e controles em fases iniciais, quando comparadas
com fases finais de Tanner. Nenhuma correlação significativa foi detectada entre
SDHEA e expressão de RA. Concluiu-se que as pacientes com PPI têm secreção de
SDHEA normal, mas mais precoce, além de expressão normal de RNAm do RA.
Palavras- chave: pubarca precoce, receptor androgênico, adrenarca.
Resumo
65
ABSTRACT
66
Vallerini FC. Expression of androgen receptor in hair follicle cells of patients with
idiopathic premature pubarche. Master Dissertation, 2015.
The pathogenesis of idiopathic Precocious Pubarche (iPP) is still unclear. A potential
mechanism is the androgen hypersensitivity of pubic hair follicles. Progression to
virilization and polycistic ovary syndrome can occur. Early detection of androgen
hypersensitivity may allow better treatment strategies. We hypothesized that
excessive androgen receptor (AR) expression of pubic hair is related to iPP
development. AR mRNA was measured by real time PCR in hair follicles from major
labia of 68 girls (iPP:25; controls:38). ). The patients were divided in two groups, PIIIII and PIV-V, based on their Tanner stage classification. Androstenedione, total
testosterone, 17OH progesterone and dehydroepyandrosterone sulfate were also
measured. As expected, chronologic and pubarche ages were reduced in iPP
compared with controls. Telarche age was reduced in both initial and late iPP groups.
Proportion of patients with menarche were similar in iPP and controls, but menarche
age was reduced in iPP patients. Hormone concentrations were similar in both
groups when adjusted for Tanner pubic hair stage. The same level of DHEAS was
reached 3.5 years earlier in iPP compared with controls with the same Tanner stage.
There was no difference in androgen receptor mRNA expression between iPP
patients and controls or when initial were compared with later Tanner stages. No
significant correlation was detected between DHEAS and AR expression. We
conclude that iPP patients have normal but earlier DHEAS secretion in the presence
of normal androgen receptor mRNA expression.
Key words: androgen receptor, adrenarche, pubarche.
Abstract