UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
CENTRO DE AQUICULTURA DA UNESP – CAUNESP
CAMPUS DE JABOTICABAL
RESFRIAMENTO DE EMBRIÕES DE PACU, Piaractus mesopotamicus (HOLMBERG, 1887) EM
DIFERENTES FASES DO DESENVOLVIMENTO ONTOGENÉTICO
Aluna: Taís da Silva Lopes
Orientadora: Profa. Dra Elizabeth Romagosa
Co-orientador: Prof. Dr. Danilo Pedro Streit Jr
Jaboticabal
São Paulo – Brasil
Fevereiro de 2010
ii
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
CENTRO DE AQUICULTURA DA UNESP – CAUNESP
CAMPUS DE JABOTICABAL
RESFRIAMENTO DE EMBRIÕES DE PACU, Piaractus mesopotamicus (HOLMBERG, 1887) EM
DIFERENTES FASES DO DESENVOLVIMENTO ONTOGENÉTICO
Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação
em
Aqüicultura, do
Centro
de
Aqüicultura da UNESP, Campus da Jaboticabal,
como parte das exigências para obtenção do título
de Mestre em Aqüicultura, área de concentração
em Aqüicultura em Águas Continentais
Aluna: Taís da Silva Lopes
Orientadora: Profa. Dra Elizabeth Romagosa
Co-orientador: Prof. Dr. Danilo Pedro Streit Jr
Jaboticabal
São Paulo – Brasil
Fevereiro de 2010
iii
F864r
Lopes, Taís da Silva
Resfriamento de embriões de pacu, Piaractus mesopotamicus
(HOLMBERG, 1887) em diferentes fases do desenvolvimento ontogenético /
Taís da Silva Lopes. – – Jaboticabal, 2010
ix, 65 f. : il. ; 29 cm
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Centro de
Aqüicultura, 2010
Orientador: Elizabeth Romagosa
Banca examinadora: Luis David Solis Murgas, Sérgio Ricardo Batlouni
Bibliografia
1. Pacu-criopreservação. 2. Peixes-embriões. 3. Embriões-resfriamento. I.
Título. II. Jaboticabal-Centro de Aqüicultura.
CDU 639.31
Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação
– Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal.
I
Ao amor,
sentimento esse tão grandioso que move nossas vidas, e
nos leva em busca de nossos objetivos.
A meus pais,
José Claro e Dorotí, que tanto amo, e que estiveram ao
meu lado em cada momento de felicidade ou
dificuldade.
Dedico
II
"Para viver de verdade, pensando e repensando a existência, para que ela valha à pena, é
preciso ser amado, e amar, e amar-se. Ter esperança, qualquer esperança.
Questionar o que nos é imposto, sem rebeldias insensatas, mas sem demasiada sensatez.
Saborear o bom, mas aqui e ali enfrentar o ruim. Suportar sem se submeter. Aceitar sem se
humilhar. Entregar-se sem renunciar a si mesmo e à possível dignidade.
Sonhar, porque se desistimos disso apaga-se a última claridade e nada mais valerá a apena.
Escapar, na liberdade do pensamento, desse espírito de manada que trabalha
obstinadamente para nos enquadrar, seja lá no que for.
E que o mínimo que a gente faça seja, a cada momento, o melhor que afinal se conseguiu
fazer."
Lya Luft
III
AGRADECIMENTOS
À Deus.
Ao Centro de Aqüicultura da UNESP.
Aos meus orientadores Elizabeth Romagosa e Danilo Pedro Streit Jr.
Aos membros do grupo de pesquisa PEIXEGEN/UEM pela ajuda, companheirismo
e amizade durante a realização do trabalho e, em especial ao coordenador Prof. Dr. Ricardo
Pereira Ribeiro, pelo apoio.
Aos membros do grupo de pesquisa Aquam/UFRGS pelo auxílio na parte prática e
estatística.
Aos professores do Departamento de Ciências Exatas da FCAV/UNESP, Dr.
Euclides Braga Malheiros e Dr. José Carlos Barbosa, pela atenção dispensada nas
discussões sobre estatística dos dados.
À Estação de Aqüicultura e Hidrologia da Duke Energy Brasil, Salto Grande, São
Paulo.
À Estação de piscicultura CODAPAR-UEM, e aos funcionários Victor, Cleiton e
José Geraldo.
Ao Laboratório de Histologia e Embriologia Animal da FCAV/UNESP, em
especial a Profª Dra. Laura Satiko Okada Nakaghi, que gentilmente cedeu equipamentos
para a realização de parte do projeto.
Aos membros da comissão examinadora, de qualificação e defesa, que aceitaram o
convite (Dra. Laura Satiko Okada Nkaghi, Dr. Robie Bombardelli, Dr. Luis David Solis
Murgas e Dr. Sérgio Ricardo Batlouni).
Ao CNPq pela bolsa concedida.
Aos meus pais e familiares pelo incentivo.
Aos amigos que presentes ou não estiveram torcendo pela conclusão de mais essa
etapa de minha vida.
IV
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
TAÍS DA SILVA LOPES - Nascida em 13 de novembro de 1984, em Maringá-PR,
é Zootecnista formada pela Universidade Estadual de Maringá-UEM, em dezembro de
2007. Foi bolsista do Programa de Educação Tutorial-PET, de janeiro de 2004 a maio de
2007, na mesma instituição, além de estagiar no Laboratório de Biologia Molecular
Aplicada a Piscicultura. Ingressou, em março de 2008, no Programa de Pós-graduação,
Mestrado em Aqüicultura, Área de Concentração em Aqüicultura em Águas Continentais,
do Centro de Aqüicultura da Universidade Estadual Paulista, Campus de Jaboticabal.
i
SUMÁRIO
I.
INTRODUÇÃO GERAL ..........................................................................................1
II. OBJETIVO GERAL .................................................................................................3
III. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................4
3.1 ESPÉCIE ESCOLHIDA ..................................................................................................4
3.2 CARACTERÍSTICAS E FASES DE DESENVOLVIMENTO DOS EMBRIÕES .............................6
3.3 CRIOPRESERVAÇÃO E CRIOPROTETORES UTILIZADOS EM EMBRIÕES DE PEIXES .............9
3.4 SENSIBILIDADE DOS EMBRIÕES DE PEIXE AO FRIO...................................................... 10
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 13
IV. RESFRIAMENTO DE EMBRIÕES DE PACU, Piaractus mesopotamicus
(HOLMBERG, 1887) EM DIFERENTES ESTÁDIOS DE DESENVOLVIMENTO
DURANTE SEIS E DEZ HORAS DE ESTOCAGEM ................................................. 20
4.1 INTRODUÇÃO........................................................................................................... 21
4.2 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 23
4.3 RESULTADOS........................................................................................................... 27
4.4 DISCUSSÃO ............................................................................................................. 31
AGRADECIMENTOS........................................................................................................ 34
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 34
V. CURVAS DE RESFRIAMENTO PARA EMBRIÕES DE PACU, Piaractus
mesopotamicus (HOLMBERG, 1887) ESTOCADOS A -8°C ....................................... 38
5.1 INTRODUÇÃO........................................................................................................... 39
5.2 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 40
5.3 RESULTADOS........................................................................................................... 42
5.4 DISCUSSÃO ............................................................................................................. 45
AGRADECIMENTOS........................................................................................................ 47
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 47
VI. ANEXOS......................................................................................................................48
ii
LISTA DE FIGURAS
Pág.
FIGURA 1.
Representação dos principais compartimentos do embrião (vitelo,
camada sincicial do vitelo e blastoderme) e estruturas extraembrionárias (espaço
perivitelinico
e
córion)
de
peixes
teleósteos..........................................................................................
RESFRIAMENTO
DE
EMBRIÕES
DE
PACU,
Piaractus
8
mesopotamicus
(HOLMBERG, 1887) EM DIFERENTES ESTÁDIOS DE DESENVOLVIMENTO
DURANTE SEIS E DEZ HORAS DE ESTOCAGEM
FIGURA 1.
Fluxograma do resfriamento de embriões P. mesopotamicus nos
quatro estádios embrionários em dois tempos de estocagem..........
FIGURA 2.
26
Embriões de P. mesopotamicus. I: Fechamento do blastóporo (8hpf): 1- diâmetro do embrião, 2- diâmetro do córion. II:
Aparecimento da vesícula óptica (13,3-hpf): 1- diâmetro maior do
embrião, 2- diâmetro menor do embrião e, 3- diâmetro do
córion...............................................................................................
FIGURA 3.
27
Porcentual de larvas totais (LT) e subdivisão em larvas (vivas,
LV; mortas, LM; não-eclodidas, LNE; ovos gorados, OG) para
embriões de P. mesopotamicus, nos estádios embrionários de 1,4-,
5,2-, 8- e 13,3-hpf submetidos ao resfriamento por dois períodos..
FIGURA 4.
29
Medidas de diâmetro do córion dos estádios embrionários de P.
mesopotamicus utilizados no resfriamento, no momento da coleta
dos embriões (controle), após seis e 10 horas de refrigeração........
FIGURA 5.
30
Medidas de diâmetro do embrião dos estádios embrionários de P.
mesopotamicus utilizados no resfriamento, no momento da coleta
dos embriões (controle), após seis e 10 horas de refrigeração........
31
iii
CURVAS DE RESFRIAMENTO PARA EMBRIÕES DE PACU, Piaractus
mesopotamicus (HOLMBERG, 1887) ESTOCADOS A -8°C.
FIGURA 1.
A: Ovos gorados que foram descartados e, B: Ovos selecionados
viáveis (embriões no estádio de fechamento do blastóporo)
(estereomicroscópio, 40X)...............................................................
FIGURA 2.
41
Fluxograma de resfriamento de embriões de P. mesopotamicus
sendo os embriões em solução crioprotetora (G1) submetidos a
diferentes curvas de resfriamento e a solução crioprotetora (G2)
passando pelas diferentes curvas, recebendo os embriões após
queda da temperatura.......................................................................
FIGURA 3.
42
Efeito das curvas de resfriamento no grupo G1 em relação ao
total de larvas (LT); larvas natantes (LN); larvas mortas (LM);
larvas não eclodidas (LNE) e; ovos gorados (OG) de P.
mesopotamicus estocados a -8°C por seis horas..............................
FIGURA 4.
44
Efeito das curvas de resfriamento no grupo G2 em relação ao
total de larvas (LT); larvas natantes (LN); larvas mortas (LM);
larvas não eclodidas (LNE) e; ovos gorados (OG) de P.
mesopotamicus estocados a -8°C por seis horas..............................
FIGURA 5.
44
Porcentual de larvas totais entre as curvas de resfriamento para
ambos os grupos (G1-embriões em solução crioprotetora e G2solução
crioprotetora)
observados
em
embriões
de
P.
mesopotamicus estocados por seis horas, a -8°C.............................
45
iv
LISTA DE TABELAS
Pág.
RESFRIAMENTO
DE
EMBRIÕES
DE
PACU,
Piaractus
mesopotamicus
(HOLMBERG, 1887) EM DIFERENTES ESTÁDIOS DE DESENVOLVIMENTO
DURANTE SEIS E DEZ HORAS DE ESTOCAGEM.
TABELA 1. Porcentual de larvas (vivas, LV; mortas, LM; não-eclodidas,
LNE; ovos gorados, OG) para os embriões de pacu, Piaractus
mesopotamicus, nos estádios embrionários de 1,4-, 5,2-, 8- e
13,3-hpf utilizados como controle..................................................
27
TABELA 2. Larvas totais (LT) e subdivisão em larvas (vivas, LV; mortas,
LM; não-eclodidas, LNE; ovos gorados, OG) de embriões de P.
mesopotamicus submetidos à solução crioprotetora com metanol
e sacarose, estocados a -80C por seis e 10 horas.............................
TEBELA 3.
28
Larvas vivas (LV) de embriões de P. mesopotamicus nos
diferentes
estádios
embrionários
submetidos
à
solução
crioprotetora com metanol e sacarose, estocados a -8°C por seis e
10 horas...........................................................................................
28
CURVAS DE RESFRIAMENTO PARA EMBRIÕES DE PACU, Piaractus
mesopotamicus (HOLMBERG, 1887) ESTOCADOS A -8°C.
TABELA 1. Porcentagem de larvas totais (LT): natantes (LN), mortas (LM) e,
não eclodidas (LNE); e ovos gorados (OG) para os dois grupos:
G1-embriões
em
solução
crioprotetora
e
G2-solução
crioprotetora e posterior recebimento dos embriões de P.
mesopotamicus que foram estocados a -8°C por seis horas............
43
TABELA 2. Porcentagem de LN (larvas natantes) de embriões de P.
mesopotamicus que foram estocados a -8°C por seis horas, em
diferentes formas de submissão a solução crioprotetora (G1embriões em solução crioprotetora e G2-solução crioprotetora e
posterior recebimento dos embriões)..............................................
TABELA 3. Comparação entre as curvas de resfriamento na porcentagem de
larvas: natantes (LN), mortas (LM) e, não eclodidas (LNE); e
43
v
ovos gorados (OG) de P. mesopotamicus estocados a -8°C por
seis horas.........................................................................................
45
1
I. INTRODUÇÃO GERAL
Face ao drástico declínio dos estoques naturais de peixes no mundo e às estimativas
de que a pesca extrativista levará, nas próximas décadas, ao esgotamento irreversível dos
principais estoques de peixes de interesse comercial, tornando-se imprescindível o
desenvolvimento de métodos de conservação dos gametas e sua aplicação na reprodução
(Serralheiro, 2008). Ainda, alia-se ainda à questão do desenvolvimento de tecnologias para
o controle da produção trazendo elementos perfeitamente compatíveis com o que se
preconiza para uma atividade aquícola ecologicamente sustentável e socialmente
responsável, bem como, a sustentabilidade dos recursos e a segurança dos processos de
criação.
A criopreservação de gametas também pode ser utilizada como ferramenta para a
manutenção da variabilidade genética, fundamental em qualquer programa de
melhoramento genético (Falconer, 1987). Ainda, diante de construções de barragens nos
rios, para geração de energia elétrica, faz-se necessário programas de conservação de
gametas para evitar os impactos negativos na ictiofauna (Sirol e Britto, 2006).
A capacidade técnica para conservação de gametas de peixes e de invertebrados
aquáticos tem se expandido rapidamente nos últimos anos, impulsionada principalmente
pela indústria aquícola (Carolsfeld et al., 2003). Nos últimos 25 anos, atenção especial tem
sido direcionada a criopreservação de ovos e embriões de peixes, mas até o momento os
resultados são contraditórios e desencorajadores (Zhang et al., 2007), com isso tem-se
utilizado o resfriamento como alternativa, além de oferecer informações que colaborem
com a criopreservação.
Nessas técnicas são necessários que ovos e embriões sejam resistentes ao choque
térmico, que por sua vez dependem do vitelo disponível que é determinante na fase de
ontogenia em que se encontram, bem como, ao efeito da toxicidade dos crioprotetores,
portanto, os três itens acima citados estão relacionados entre si. Ou seja, essas três
prerrogativas encontram-se diretamente relacionadas para o sucesso de técnicas de
conservação.
É imprescindível para o resfriamento de embriões de peixes que os mesmos sejam
resistentes ao frio suportando redução de temperaturas. Entretanto, esta diminuição de
temperatura pode provocar injúrias nas células ou tecidos, que encontram-se classificadas
em duas categorias: (a) rápido resfriamento ou choque térmico (direto) e, (b) resfriamento
2
lento que é usualmente manifestado após longos períodos de exposição a baixas
temperaturas (indireto) (Morris e Watson, 1984).
Os primeiros protocolos de resfriamento de embriões de peixes migradores foram
descritos por Ahammad et al. (1998) para Labeo rohita, Catla catla e Cirrhinus mrigalha e
por Ahammad et al., (2002) para Cyprinus carpio. Para as espécies de peixes nativas sulamericanas, Streit et al. (2007) utilizaram como espécie modelo o Piaractus
mesopotamicus.
Inúmeros benefícios vêm sendo apontados a partir do domínio da técnica de
resfriamento como, por exemplo, permitir a coleta de embriões em lugares remotos, mantêlos em refrigerador durante o transporte até um local em que possam ser incubados com
maior segurança (Hagedorn e Kleinhans, 2000).
Além da resistência aos choques térmicos, deve-se conhecer qual a fase do
desenvolvimento ontogenético que os ovos ou embriões permanecem íntegros, bem como a
toxidade aos crioprotetores, que é outro aspecto de fundamental importância para o
domínio da técnica (Gwo et al., 1995; Zhang e Rawson, 1995; Hagedorn et al., 1997).
Para Zhang e Rawson (1995), trabalhando com Danio renio, a sensibilidade ao frio
é mais elevada nos estádios iniciais de desenvolvimento embrionário devido à elevada
quantidade de lipídios no embrião, dificultando a ação de proteção dos crioprotetores. Os
autores afirmaram que os lipídios representam quantidades superiores a 52% do peso seco
dos ovos, sendo geralmente, as fases mais desenvolvidas de embriões de peixes suportam
melhor a toxidade dos crioprotetores (Bart, 2000). Porém, o organismo encontrando-se em
uma fase mais complexa, outras dificuldades surgem na utilização da técnica de
preservação.
A aplicação de novas biotecnologias voltadas para o aperfeiçoamento do manejo
reprodutivo, permitirá o incremento da produção aquícola além de diminuir a pressão sobre
os estoques pesqueiros e várzeas, e diminuir os custos com a importação de pescado
(Ostrensky et al., 2008), bem como a utilização do melhoramento genético. Diante do
exposto, pode-se verificar que ainda são necessários mais estudos para que a técnica de
criopreservação possa ser utilizada na conservação de embriões de peixes, entretanto, para
conservação em períodos determinados, o resfriamento tem sido uma alternativa a ser
aprimorada.
3
II. OBJETIVO GERAL
O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos de tempo de estocagem em
diferentes estádios de desenvolvimento embrionário, e curvas de resfriamento, sobre a
viabilidade de embriões de pacu, P. mesopotamicus conservados a -8°C.
4
III. REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Espécie escolhida
O Piaractus mesopotamicus, popularmente denominado como pacu, caranha, pacucaranha ou pacu-guaçu, pertence à ordem dos Characiformes, família Characidae e
subfamília Myleinae (Nakatani et al., 2001). É originário da bacia dos rios Paraná,
Paraguai e Uruguai (Godoy, 1975). É a terceira espécie nativa mais cultivada no Brasil
(IBAMA, 2007) por apresentar excelentes características zootécnicas como rusticidade,
crescimento rápido, fecundidade elevada e grande aceitação no mercado (Castagnolli e
Zuim, 1985; Castagnolli, 1992).
O pacu possui hábito alimentar onívoro, porém, na natureza sua alimentação sofre
flutuações que dependem além da disponibilidade de alimento, das variações ambientais e
da migração reprodutiva (Gonçalves e Urbinati, 2005).
Nesta espécie o desenvolvimento gonadal é do tipo sincrônico em grupo, e a desova
é total ou única ocorrendo na primavera-verão (Romagosa, 1991), principalmente em
novembro podendo variar até fevereiro, época em que são verificadas as temperaturas mais
elevadas e é maior a incidência de chuvas (Romagosa et al., 1988).
O início da maturação gonadal de fêmeas de pacu, Piaractus mesopotamicus ocorre
no terceiro ano de idade, com cerca de 34 cm de comprimento sendo que, com cinco anos,
em média 42 cm de comprimento, as fêmeas adultas encontram-se aptas à reprodução
(Bernardino e Lima, 1999).
Entre os peixes reofílicos, a maturação gonadal do pacu, P. mesopotamicus, é
controlada por fatores externos ambientais (temperatura, horas de luz e pluviosidade) e
sociais (presença do macho) e, internos (hormonais). Os estímulos ambientais ou sociais
captados pelos receptores sensoriais que encaminham essas informações via cerebral,
ativando-se as glândulas endócrinas que agem principalmente, nas gônadas, estimulandoas a produção de hormônios esteróides (Romagosa, 2009). Estes hormônios, responsáveis
pela maturação, estão presentes nos peixes no ambiente natural ou quando cativos, cujas
quantidades variam sazonalmente e durante o ciclo reprodutivo. Os fatores ambientais que
influenciam na desova estão diretamente relacionados a temperatura da água (26-29oC) e
aumento da precipitação pluviométrica (estação chuvosa) concomitantemente, aos maiores
valores do índice gonadossomático durante a maturação das gônadas (Romagosa, 1991).
5
A maturação final e desova dos gametas de P. mesopotamicus, quando mantidos em
cativeiro, é realizada por meio de manipulação hormonal sobre as gônadas (com injeção de
gonadotropinas), com o uso de hormônios hipotalâmicos e seus análogos, uma vez que, o
processo de maturação gonadal e desova não se completam (Bernardino e Lima, 1999).
Para isso, é realizada a seleção de reprodutores, onde são consideradas as características
reprodutivas externas, nas fêmeas (abdome abaulado, macio, papila urogenital saliente e
avermelhada) e, nos machos (fluidez do sêmen sob leve compressão do abdome) (Teodoro
e Ferraz de Lima, 1986).
Atualmente o principal agente indutor da maturação final e desova, aplicados em
reprodução artificial de espécies nativas brasileiras é o extrato bruto de pituitária de carpa e
salmão (Zaniboni-Filho e Weingartner, 2007). Este protocolo consiste na aplicação
(intramuscular ou intraperitonial) de 5,5 mg.Kg-1 é aplicado em duas doses (0,5 e 5,0
mg.Kg-1) para fêmeas, e 1,0 a 3,0 mg.Kg-1 (dose única) para machos, em intervalos de 10 a
12 horas. O momento que deve ser realizada a desova ou extrusão dos ovos baseia-se nas
unidades térmicas acumuladas (UTA) ou horas-grau, que para pacu foi de 275h0C na
região Sudeste do Brasil (Romagosa, 1991; Bernardino e Lima, 1999).
Associado com suas características reprodutivas e o relativo domínio da técnica de
reprodução artificial, em meados dos anos oitenta, surgiu o interesse de desenvolver um
pacote tecnológico para a criação do P. mesopotamicus. Com isso, surgiu à necessidade do
prolongamento da vida útil dos gametas masculinos, que tem sido implementado com
sucesso (Castagnolli e Zuim, 1985; Romagosa et al., 1985; Chabalin e Neves, 1996;
Miliorini, 2002; Carolsfeld, 2003).
O P. mesopotamicus tem sido adotado como espécie modelo para realizar estudos
de criopreservação de embriões por meio de técnicas de congelamento (Streit, 2005;
Neves, 2008) e resfriamento (Streit et al., 2007). A aplicação de novas biotecnologias
voltadas para o aperfeiçoamento do manejo reprodutivo dessa espécie permitirá o
incremento da produção aquícola, criando condições para atrair novos investidores,
gerando alternativas de emprego e renda, diminuindo a pressão sobre os estoques
pesqueiros e várzeas, além de diminuir os custos com a importação de pescado (Ostrensky
et al., 2008).
6
3.2 Características e fases de desenvolvimento dos embriões
Em peixes, o sucesso do processo de embriogênese depende da qualidade dos ovos,
ou seja, das características intrínsecas, fisiológicas e metabólicas. A qualidade dos ovos
pode afetar a resistência dos embriões quando expostos a substâncias químicas. Por
exemplo, ovos mais resistentes geram embriões de boa qualidade, entretanto, os mais
sensíveis, em geral resultam em baixa qualidade (Lahnsteiner, 2008). Todavia, para as
espécies de peixes nativos sul-americanos são raras as informações encontradas na
literatura, sendo necessário conhecer bem as características durante o desenvolvimento dos
embriões para então submetê-los a criopreservação.
Em cativeiro, após a hidratação, os ovos de P. mesopotamicus são transferidos para
incubadoras (60 a 200L), com fluxo aberto de água, simulando o movimento dos ovos no
ambiente natural (Romagosa, 1991). Estes ovos recém-fertilizados apresentam diâmetro
que variam de 1,25 a 2,69 mm (Nakatani et al., 2001; Tomiita et al., 2008).
Os embriões, mesmo sendo provenientes do mesmo casal de reprodutores, podem
apresentar diferenças durante o desenvolvimento, relacionando-as principalmente, a
temperatura da água no período de incubação (Landinez et al., 2004), além da quantidade
de vitelo presente no ovo, pois, quanto maior a quantidade, mais lenta será a velocidade no
desenvolvimento embrionário (Kimmel et al., 1995).
Os ovos de P. mesopotamicus são telolécitos, apresentando diferenças entre os dois
pólos, animal e vegetal, visíveis ao final da hidratação, sendo este último processo com a
duração de aproximadamente um minuto (Ribeiro et al., 1995). Estes autores descreveram
que o vitelo permanece concentrado no pólo germinativo, com citoplasma e suas organelas
localizadas no pólo animal, considerada do tipo meroblástico ou parcial.
O desenvolvimento embrionário do P. mesopotamicus foi caracterizado por
Nakatani et al. (2001) nas seguintes fases: (1) clivagem inicial, onde ocorre a formação das
primeiras células; (2) embrião inicial, a partir do momento que começa a diferenciação do
embrião; (3) cauda livre, esta se desprende do vitelo e, (4) embrião final, completamente
formado, pronto para eclosão. Cada fase embrionária possui suas particularidades, que vão
desde o tamanho do vitelo ao complexo sistema de membranas que variam com o decorrer
do desenvolvimento. Zhang et al. (2003) afirmam que durante o processo ontogenético
podem ocorrer “falhas” que inviabilizam o sucesso da criopreservação.
7
Hagedorn et al. (1998) descreveram que embriões de zebrafish, Danio renio como
outras espécies de peixes teleósteos, são compostos por dois compartimentos celulares,
vitelo e blastoderme. O principal componente do vitelo é a vitelogenina, uma
lipofosfoproteína (aproximadamente 400 kda), armazenada nas membranas dos ovos. No
início do desenvolvimento, a blastoderme forma uma placa celular na região do vitelo,
ocorrendo a multiplicação das células. A partir da fase de 128 células iniciam o movimento
de epibolia, em que a blastoderme envolve o vitelo, até revesti-lo completamente (100% de
epibolia). Subjacente a blastoderme, está à camada sincicial do vitelo (multinucleada), que
substitui a fina camada citoplasmática que o envolvia. A partir daí reveste o vitelo
atingindo o embrião em 50 a 70% do movimento de epibolia.
Para o pacu as etapas seguintes ao fechamento do blastóporo, caracterizadas pelo
processo de organogênese, têm início com a formação do plano do corpo do embrião.
Pode-se observar a segmentação, que é identificada pelo número de sômitos visíveis na
região caudal. A partir daí, a cauda se destaca do vitelo, há o aparecimento da vesícula
óptica e, em seguida, além da cauda bem alongada, a porção final do tubo digestório está
evidente, completando o desenvolvimento do embrião para o momento da eclosão, cerca
de 17 horas pós-fertilização, com médias de temperatura da água de 27 ± 1oC (Tomiita et
al., 2008).
O vitelo, a blastoderme e camada sincicial do vitelo são estruturas embrionárias e
além delas, o embrião de teleósteos é composto por outras estruturas extra-embrionárias
como, espaço perivitelinico e córion (Neves, 2008), como representado na Figura 1. O
córion é uma camada não celular que envolve o embrião, composto na maior parte por
glicoproteínas, sendo considerado uma barreira que impede o movimento de água e soluto
para dentro e fora das membranas que envolvem o embrião (Hagedorn et al., 1997).
8
Figura 1. Representação dos principais compartimentos do embrião (vitelo, camada
sincicial do vitelo e blastoderme) e estruturas extra-embrionárias (espaço perivitelinico e
córion) de peixes teleósteos. Fonte: (Hagedorn et al., 1997, adaptado por Neves, 2008).
A caracterização dos ovos pode ser determinada também, pelo diâmetro do córion e
do vitelo, estruturas do vitelo, tamanho do espaço perivitelínico, forma e a cor (Nakatani et
al., 2001). Ainda, o espaço perivitelínico pode ser categorizado conforme sua participação
no volume total do ovo, que pode ser restrito (≤ 9,9%) a muito amplo (≥ 30%), sendo que,
em P. mesopotamicus é considerado amplo (25,41%) segundo os mesmos autores.
Os embriões de peixes quando submetidos à criopreservação apresentam problemas
principalmente relacionados à: (1) permeabilidade das paredes dos ovos e (2) mecanismo
de bombeamento osmótico (Hagedorn et al., 1997).
Pesquisas apontam taxas de permeabilidade inferiores nos embriões de peixes
quando comparados aos embriões de drosophilas (Liu et al., 1989) e ratos (Leibo, 1973).
Entretanto, os problemas causados pela osmorregulação são, na maioria, devido à
quantidade de água retida nos embriões de peixes. Hagedorn et al. (1997) por meio da
técnica de microscopia eletrônica, mensuraram a cinética do volume da água líquida de
58%, sendo que 61% do volume total encontra-se no vitelo, e o restante (39%) na
blastoderme.
9
3.3 Criopreservação e crioprotetores utilizados em embriões de peixes
Criopreservação é uma técnica pela qual, células viáveis, tecidos e organismos
podem ser mantidos, com metabolismo celular em estado quiescente, por períodos
indeterminados. Porém, as conseqüências da exposição de células vivas a baixas
temperaturas são inúmeras, sendo que, as causas das injúrias podem ter origem no
momento da refrigeração, quando expostos a temperaturas próximas a zero, até o
congelamento, que chega geralmente a -196 0C (Zhang et al., 2007).
Os primeiros trabalhos com criopreservação de células vivas foram realizados por
Polge et al. (1949) com espermatozóides de frango, a partir do qual foram surgindo novos
relatos, entre eles, com embriões de camundongos na década de 70 (Whittingham et al.,
1972). Atualmente a criopreservação de embriões de mamíferos é bem estabelecida, o que
tem despertado o interesse da aplicação desta técnica em embriões de peixes. Entretanto,
como há inúmeras particularidades nos embriões de espécies aquáticas, esta técnica não
tem sido elucidada.
O sucesso na criopreservação de embriões de peixes poderia trazer muitos
benefícios, como por exemplo, contornar os impactos ambientais negativos. Dessa forma,
gametas coletados em programas de reprodução de populações de peixes silvestres ou
mantidos em cativeiros, podem ser utilizados para a conservação de recursos genéticos e na
condução de estudos de melhoramento animal, quando conservados por curto ou longo
período (Gorman, 2000). Adicionalmente, esta tecnologia poderia fornecer embriões de
diferentes espécies de peixes em determinadas estações do ano quando não desovam
naturalmente (Janik et al., 2000) e, consequentemente, permitir o aumento da produção
piscícola em cativeiro.
Para que as células sejam mantidas em baixas temperaturas é essencial a utilização
de agentes crioprotetores, pois, na sua ausência ocorre a formação de cristais de gelo,
considerados letais para as células (Polge et al., 1949; Leibo, 2000). Por outro lado, apesar
de necessário, a sua toxidez pode provocar a mortalidade das células durante a entrada ou
saída no seu interior (Chao e Liao, 2001).
Os crioprotetores podem ser divididos em duas categorias de acordo com sua ação,
(1) intracelular e, (2) extracelular. Os intracelulares são compostos orgânicos responsáveis
por proteger as organelas das células durante o resfriamento. São moléculas com baixo
peso molecular, que apresentam facilidade para atravessar as membranas celulares,
10
destacando-se para os embriões de peixes, o metanol e o dimetilsulfóxido (DMSO). Por
outro lado, o crioprotetor extracelular é formado por macromoléculas e açúcares cuja
função é reduzir a formação de gelo, facilitar a desidratação das células e proteger a
membrana celular. São moléculas com alto peso molecular não podendo permear as
células, sendo que, geralmente, o mais utilizado em embriões de peixes é a sacarose
(Niemann, 1991).
Desde meados de 2005, no Brasil, tem sido desenvolvidos experimentos
relacionados ao resfriamento e criopreservação de embriões (Streit Jr, 2005; NinhausSilveira et al., 2006; Streit et al., 2007; Neves, 2008). Pesquisas relacionadas ao
conhecimento do potencial tóxico dos crioprotetores nas espécies de peixes nativos foram
desenvolvidas por Ninhaus-Silveira et al. (2006) com embriões de curimbatá, Prochilodus
lineatus. Os autores obtiveram 0% na estimativa das taxas de eclosão de embriões, após têlos submetidos a vários crioprotetores, durante um, cinco e 15 minutos e, em seguida,
congelados por 24 horas. Os testes com crioprotetores citados anteriormente por Streit Jr.
(2005) com P. mesopotamicus, observaram toxidez maior quando utilizaram o DMSO em
relação ao metanol.
O protocolo de resfriamento para as espécies de peixes nativos sul-americanos foi
sugerido por Streit Jr. et al. (2007) para embriões de pacu, P. mesopotamicus.
Combinações de crioprotetores intra (17,1% de sacarose) e extracelulares (9% de metanol),
para o resfriamento a -8°C estocados, por seis horas, recomendando a utilização de tal
solução para a realização deste protocolo.
3.4 Sensibilidade dos embriões de peixe ao frio
De modo geral, o resfriamento de ovos e embriões de peixes tem sido utilizado
como uma estratégia de conservação por tempo limitado (Zaniboni-Filho e Nuñer, 2004).
Um dos principais fatores que dificultam o congelamento de embriões de peixes é a alta
sensibilidade ao frio (Stoss, 1983). Em função disso, inúmeros estudos foram
desenvolvidos para observar, em diferentes espécies de peixes, os danos causados aos
embriões, quando submetidos a baixas temperaturas (Zhang e Rawson, 1995; Dinnyes et
al., 1998; Calvi e Maisse, 1998; Liu et al., 2001).
O conhecimento do estádio de desenvolvimento dos embriões de peixes a serem
utilizados é um importante critério para o sucesso na criopreservação, pois, muitos estudos
11
reportaram que a sensibilidade ao frio é dependente do estádio embrionário (Maddock,
1974; Haga, 1982; Jaoul e Roubaud, 1982; Roubaud et al., 1985; Begovac e Wallace,
1986; Liu et al., 1993; Zhang e Rawson, 1995; Hagedorn et al., 1997). Outro fator que deve
ser levado em consideração são as curvas de resfriamento, como no experimento desenvolvido
por Zhang et al. (2003) com Danio rerio, utilizando 1, 30 e 300°C por minuto, onde ficou
evidente sua influência nas taxas de sobrevivência.
Zaniboni-Filho e Nuñer (2004) afirmam que o sucesso do procedimento de
resfriamento é variável e dependente da utilização de diluidores e ou crioprotetores
específicos, e dos estudos que devem ser desenvolvidos especificamente para cada espécie.
Deste modo, verifica-se que o resfriamento, tanto para sêmen quanto para ovos e embriões
de peixes, é uma alternativa viável para a conservação em curto prazo.
3.4.1 Estádio embrionário dependente
A sensibilidade ao frio depende do estádio de desenvolvimento embrionário foi
verificado para diferentes espécies como Oncorhynchus mykiss (Maddock, 1974; Haga,
1982), Pimephales promelas (Begovac,1986), Cyprinus carpio L. (Jaoul e Roubaud, 1982;
Roubaud et al., 1985), Danio rerio (Zhang e Rawson, 1995; Hagedorn et al., 1997) e
Carassius auratus (Liu et al., 1993), entre outras. A maioria desses estudos revelou que os
embriões em estádios iniciais do desenvolvimento embrionário são mais sensíveis as
injúrias causadas pelo frio.
A alta sensibilidade a criopreservação nas primeiras fases embrionárias foi
justificada por Lahnsteiner (2008) pelas seguintes razões: (a) rápido processo de
diferenciação celular afetada pelos crioprotetores; (b) pós-fertilização - a formação do ovo
não é completa, isto é, o endurecimento do córion, entrada de água, osmorregulação e,
portanto, estádios ontogenéticos iniciais podem ser altamente permeáveis aos
crioprotetores comparado aos estádios mais avançados e, (c) baixo potencial de
desintoxicação das vias metabólicas reguladoras nos estádios ontogenéticos iniciais, que
por se encontrarem pouco desenvolvidos, são incapazes de compensar o efeito tóxico dos
crioprotetores.
Cada estádio embrionário das diferentes espécies de peixes possui suas
particularidades, entre elas, a permeabilidade das membranas. Hagedorn et al. (1997)
examinaram a multicompartimentalização de embriões de zebrafish mostrando a
permeabilidade individual de cada compartimento do embrião. Estes experimentos
12
identificaram que a camada sincicial vitelina é uma barreira para o movimento do
crioprotetor para dentro do embrião. No decorrer do desenvolvimento embrionário esta
camada se forma e substitui a camada citoplasmática do vitelo (Betchaku e Trinkhaus,
1978),
evidenciando
as
especificidades
dos
estádios
iniciais
em
relação
à
compartimentalização.
Além disso, segundo Calvi e Maisse (1998) durante o processo de desenvolvimento
embrionário ocorre a redução do tamanho das células devido ao aumento da clivagem
proporcionando melhor relação entre a superfície/volume. Sendo assim, os autores
afirmam que a permeabilidade dos crioprotetores nos estádios embrionários mais
avançados foi melhor em relação a fase inicial.
A influência dos estádios embrionários foi evidenciada por Ahammad et al. (2003)
trabalhando com embriões de Labeo rohita em três estádios distintos (9, 12 e 15 horas pósfertilização), utilizando dois crioprotetores (metanol e propilenoglicol), em diferentes
tempos de estocagem (1-48 horas) e temperaturas (-4 oC e temperatura ambiente, 28 oC). Os
autores observaram, por meio da estimativa das taxas de eclosão, que as melhores
condições para estocagem dos embriões, em temperatura abaixo de zero, foi observada no
estádio embrionário intermediário.
3.4.2 Curvas de resfriamento
A desidratação das células durante o resfriamento depende diretamente da
velocidade de redução da temperatura. Curvas de resfriamento ótimas variam
consideravelmente, por causa das diferenças entre os tipos de células, ou seja, a quantidade
de água intracelular, tamanho da célula, permeabilidade da membrana para a entrada e
saída de água e, o coeficiente de temperatura (Hagedorn et al., 1997).
Quando o resfriamento é suficientemente lento, as células são capazes de perder
água rapidamente por osmose, suportando a desidratação e mantendo o equilíbrio do
potencial químico da água e da solução intracelular com a água extracelular (Meryman,
1977). Porém, este mesmo autor mostra que mesmo assim, a exposição das células a
solução crioprotetora causa um estresse osmótico, que dependendo da concentração,
duração e temperatura de exposição à solução, pode levar a célula a entrar em colapso. Por
outro lado, se o resfriamento for rápido, o potencial químico da água e da solução
extracelular diminui mais rápido do que o da água intracelular, resultando em água
13
intracelular remanescente que, eventualmente, forma gelo intracelular, que muitas vezes é
letal para as células (Zhang et al., 2007).
Nos últimos anos, vários métodos de congelamento de embriões bovinos se
baseiam em uma curva de diminuição da temperatura padrão desenvolvido por Willadsen
et al. (1976). Esses trabalhos correlacionam à queda de temperatura em função do tempo
obtido com velocidade de 3ºC a 1ºC/minuto e, a indução à cristalização da solução
crioprotetora “seeding” na temperatura de -7ºC com gradativa queda até -33 a -35ºC e,
posteriormente, armazenado em nitrogênio líquido (N2).
Estudos realizados com embriões de peixes, Danio rerio mostraram o efeito das
curvas de resfriamento lento (10C/minuto), intermediário (30oC/minuto) e rápido
(~300 oC/minuto), utilizando-se como crioprotetor o metanol, em diferentes estádios
embrionários (Zhang et al., 2003). Os autores verificaram que o efeito do crioprotetor
metanol foi mais pronunciado quando os embriões foram submetidos ao resfriamento
lento, não apresentando diferenças significativas em relação ao controle não resfriado.
Enquanto, nas demais curvas de resfriamento, a taxa de eclosão após o resfriamento foi
significativamente menor.
O conhecimento dos diferentes estádios embrionários de espécies de peixes
tropicais, bem como, a submissão desses as diferentes curvas de resfriamento é necessário
para estabelecer um protocolo de resfriamento, além de servir como base para o
congelamento, conhecendo-se injúrias causadas pela queda da temperatura.
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20
IV. RESFRIAMENTO DE EMBRIÕES DE PACU, Piaractus mesopotamicus
(HOLMBERG, 1887) EM DIFERENTES ESTÁDIOS DE DESENVOLVIMENTO E
TEMPOS DE ESTOCAGEM
COOLING OF EMBRYOS OF PACU, Piaractus mesopotamicus (HOLMBERG,
1887), IN DIFFERENTS STAGES OF DEVELOPMENT AND STORAGE TIME
Resumo
O objetivo do trabalho foi acompanhar os efeitos durante o resfriamento, em quatro
estádios de desenvolvimento embrionário de pacu, Piaractus mesopotamicus, em dois
tempos de estocagem, seis e 10 horas. Embriões em quatro estádios de desenvolvimento
(blastoderme, 64 células - 1,4-horas pós-fertilização, hpf; 25% do movimento de epibolia 5,2-hpf; fechamento do blastóporo – 8-hpf e; aparecimento da vesícula óptica - 13,3-hpf)
foram expostos a uma solução crioprotetora contendo metanol (10%) e sacarose (0,5M). A
seguir, os embriões passaram por curva de resfriamento de 1°C por minuto até -8°C, onde
foram mantidos nos dois períodos de estocagem. Utilizou-se delineamento inteiramente
casualizado, as taxas de eclosão dos embriões foram avaliados para cada tratamento, com
seis repetições, comparando-se com o controle que não foi resfriado. O número total de
larvas estimadas para as duas primeiras fases do desenvolvimento ontogenético (1,4- e 5,2hpf) foi estatisticamente menor que nas demais fases. Entretanto, os estádios de 8 e 13,3hpf não diferiram entre si (49,90%±6,71 e 55,24%±6,71), respectivamente, encontrando-se
mais próximas ao controle (90,67%±6,56). Além disso, a permeabilidade das membranas,
estimada através do diâmetro dos embriões, variou estatisticamente do controle para seis e
10 horas de estocagem, quando utilizado os estádios de 1,4 e 5,2-hpf, enquanto para os
demais não houve diferença. Da mesma forma, pode-se verificar que houve correlação
negativa entre o número total de larvas e o diâmetro do embrião. Sendo assim, a utilização
dos estádios embrionários de 8 e 13,3-hpf são os mais recomendados para o resfriamento
de embriões de pacu estocados até 10 horas, a -8°C.
Palavras-chave: Criopreservação, desenvolvimento ontogenético, peixes sul-americanos,
sobrevivência larval.
21
Abstract
The objective of this research was to verify the effects of cooling of embryos of pacu,
Piaractus mesopotamicus, in four stages of development, for two stocking periods. The
stages of embryo development were: at blastoderm, ~64 cells - 1.4 hours after fertilization
(haf); at 25% of the epiboly movement - 5.2 haf; at blastoporous closing - 8.0 haf; and at
optical vesicle appearing - 13.3 haf. Embryos were exposed to a cryoprotectant solution
containing methanol (10%) and sucrose (0.5M). After that, embryos were submitted to a
cooling curve (-1oC/min) until -8 oC and then kept at -8oC for six or ten hours. Also, for
each stage of embryo development a control group with not cooled embryos was used to
compare the eclosion rates. The total number of larvae estimated for the first two stages of
ontogenetic development (1.4 and 5.2-haf) was lower compared to the other stages. There
was no difference for the total number of larvae between the stages 8.0 e 13.3-haf
(49.90%±6.71 and 55.24%±6.71, respectively). Therefore, the utilization of the
embryonary stages of 8.0 and 13.3-haf are recommended for cooling pacu embryos stored
up to 10 hours at -8 ° C.
Key-words: Cryopreservation, ontogenetic development, South American fish, larvae
survival rates.
4.1 Introdução
O interesse pela conservação de gametas de peixes e sua aplicação na reprodução
tem aumentado recentemente, diante do declínio dos estoques naturais, provocado pela
pesca comercial [1]. Enquanto, pesquisadores vêm se dedicando a criopreservação de
sêmen dos principais peixes de água doce sul-americanos como, por exemplo, o Piaractus
mesopotamicus [2], Prochilodus lineatus [3], Brycon amazonicus [4], Brycon orbignyanus
[5, 6], raros são os registros sobre a criopreservação de embriões de peixes em geral, bem
como, de pacu, sendo que estudos tem se dedicado ao resfriamento como alternativa para
conservação de embriões. Todavia, a otimização de protocolos de resfriamento e processos
de avaliações padronizadas são ainda necessárias.
Em embriões de peixes um dos principais problemas associados a baixas
temperaturas é atribuída a permeabilidade das membranas à água, aos crioprotetores e
sensibilidade ao frio [7, 8, 9]. Sabe-se ainda que, tanto a permeabilidade das membranas,
quanto a sensibilidade ao frio são dependentes do estádio embrionário utilizado no
22
momento do resfriamento [10]. Na maioria das espécies estudadas, como Oncorhynchus
mykiss [11, 12], Pimephales promelas [13], Cyprinus carpio [14, 15], Danio rerio [8, 9] e
Carassius auratus [16], os estádios de pós-gastrulação são menos sensíveis às injúrias
causadas pelo resfriamento. Ainda, Hagedorn et. al [8] mostraram que a remoção do córion
em embriões de Danio rerio, pela enzima pronase, não alterou a suscetibilidade ao frio.
Um dos fatores limitantes para criopreservação dos embriões de peixes é a alta
sensibilidade observada nos estádios iniciais do desenvolvimento e que progressivamente
diminui durante o desenvolvimento do embrião. Segundo Lahnsteiner [17] a causa dessa
limitação pode ser justificada pelas seguintes razões: (a) rápido processo de diferenciação
afetado principalmente pelos crioprotetores; (b) durante a pós-fertilização a formação do
ovo não é completa, isto é, o endurecimento do córion influência a entrada de água e a
osmorregulação, portanto, os estádios ontogenéticos iniciais podem ser altamente
permeáveis aos crioprotetores, quando comparado aos estádios mais avançados; (c) baixo
potencial de desintoxicação das vias metabólicas reguladoras principalmente, nos estádios
ontogenéticos iniciais, que se encontram pouco desenvolvidos e, são incapazes de
compensar o efeito tóxico dos crioprotetores. Além disso, segundo Calvi e Maisse [18]
trabalhando com Oncoryinchus mykiss citaram que durante o desenvolvimento
embrionário ocorre a redução do tamanho das células devido ao aumento da clivagem
proporcionando melhor relação entre a superfície e o volume. Sendo assim, os autores
afirmam que a permeabilidade dos crioprotetores nos estádios embrionários mais
avançados foi melhor em relação a fase inicial.
Esforços no desenvolvimento de métodos de criopreservação para espécies
aquáticas focam quase que exclusivamente sobre o uso dos crioprotetores e sua
permeabilidade [19]. Segundo os autores, estudos recentes têm mostrado que na ausência
de crioprotetores tradicionais vem sendo utilizados crioprotetores intracelulares em baixa
concentração.
Uma vez que cada espécie possui particularidades em relação ao desenvolvimento
ontogenético, o presente estudo teve como objetivo verificar o efeito do resfriamento nos
quatro estádios de desenvolvimento embrionário do P. mesopotamicus, em dois tempos de
estocagem.
23
4.2 Material e métodos
4.2.1 Origem dos embriões
Embriões de P. mesopotamicus foram coletados, em fevereiro de 2009, na Estação
de Hidrologia e Aquicultura da DUKE ENERGY Brasil, Salto Grande, São Paulo, Brasil.
Os reprodutores utilizados possuíam, em média, quatro anos de idade e, foram mantidos
em tanques escavados a uma densidade de 0,4 kg de peixe por m2. Foi utilizado um pool de
ovos proveniente das desovas de seis casais, resultantes da indução hormonal. Para isso,
foram injetados (intramuscular) 5,5 mg.Kg-1 de extrato bruto de pituitária de carpa em duas
doses (0,5 e 5,0 mg.Kg-1), com intervalo de 12 horas para fêmeas, e 1,0 mg.Kg-1 (dose
única) para machos. Após 275 horas/grau ocorreu a extrusão dos gametas, e os ovos
recém-fertilizados foram transferidas para incubadoras cônicas (7L) com fluxo contínuo de
água.
A sequência de eventos ocorridos da fase de desenvolvimento do embrião até a
eclosão de larvas foi acompanhada permitindo assim, avaliar como foi o desenvolvimento.
A temperatura da água foi mantida em 27°C±1.
4.2.2 Delineamento experimental
Os ovos viáveis selecionados foram divididos em grupo controle e grupo
tratamento (resfriamento em dois tempos de estocagem). Para isto os experimentos foram
realizados em delineamento inteiramente casualizado, sendo que para o grupo controle
houve três repetições. Para o grupo tratamento foi utilizado esquema fatorial, onde cada
um dos quatro estádios embrionários passou por dois tempos de estocagem, com seis
repetições. Da mesma forma, foi utilizado delineamento inteiramente casualizado, em
esquema fatorial, para a análise morfométrica dos embriões, onde foram mensurados os
quatro estádios embrionários (córion e embrião), sem passar por tratamento e após dois
períodos de estocagem, com cinco repetições. Ainda, foi verificado se há correlação entre
as variáveis: número total de larvas (LT) e diâmetro do embrião.
Cada unidade experimental foi composta por cem (100) embriões viáveis. ANOVA
foi utilizada para verificar a comparação de médias, através do teste de Tukey ao nível de
significância de 5%, bem como para analisar o coeficiente de correlação entre duas
variáveis [20].
24
4.2.3 Grupo controle
O grupo controle foi utilizado para verificar a influencia da seleção de ovos viáveis,
em momentos distintos do desenvolvimento ontogenético, na taxa de eclosão, mesmo sem
passar por tratamento de resfriamento. Este grupo foi composto por quatro tratamentos,
sendo que cada um representava os seguintes estádios embrionários [21]:
 Tratamento controle 1: blastoderme - 1,4-horas pós-fertilização (hpf), (~ 64 células);
 Tratamento controle 2: epibolia - 5,2-hpf (25% movimento de epibolia);
 Tratamento controle 3: fechamento do blastóporo - 8-hpf (90% movimento de epibolia);
 Tratamento controle 4: aparecimento da vesícula óptica no embrião - 13,3-hpf.
Para isso, foram utilizadas 12 incubadoras de 3L, com fluxo contínuo, sem passar
por solução crioprotetora até o momento de eclosão das larvas (aproximadamente 18-hpf)
(Fig. 1).
4.2.4 Estádios embrionários submetidos ao resfriamento
Para compor o grupo tratamento, embriões viáveis nos diferentes estádios
embrionários (1,4; 5,2; 8 e 13,3-hpf) foram coletados das incubadoras, sendo que cada
unidade experimental foi acondicionada em tubos vacutainer e recebeu uma solução
crioprotetora contendo metanol (10%) e sacarose (0,5M). Em seguida, estes tubos foram
levados a caixas de isopor e gelo, cuja temperatura foi constantemente controlada. Desta
forma, os embriões passaram por uma curva de resfriamento, onde a temperatura caiu
cerca de 1°C por minuto, até atingirem -8°C, sendo mantidos em dois tempos de
estocagem, seis e 10 horas. Os tubos foram retirados do refrigerador, aclimatados por cinco
minutos em água a temperatura ambiente, e em seguida transferidos para incubadoras de
3L. Cada tubo ocupou uma incubadora (3L) com fluxo de água contínuo, totalizando 48
incubadoras, onde permaneceram até completar o desenvolvimento embrionário (Fig. 1).
4.2.5 Avaliação da sobrevivência larval
Ao completar o desenvolvimento embrionário (cerca de 18-hpf), tanto o grupo
controle, quanto o grupo tratamento, foram retirados das incubadoras para estimar o
número total de larvas (LT) e ovos gorados (OG). O total de larvas foi subdividido em
larvas: vivas (LV), mortas (LM) e não-eclodidas (LNE) (desenvolvimento embrionário
incompleto).
25
4.2.6 Análise morfométrica dos embriões
Cem (100) embriões de cada grupo (controle e tratados em dois tempos de
estocagem) nos quatro estádios embrionários (1200 embriões) foram coletados e
conservados em formol tamponado [22]. Em um estereomicroscópio acoplado a câmera
digital os embriões foram medidos, suas imagens digitalizadas e analisadas utilizando-se o
software LEICA IM50 no Laboratório de Histologia e Embriologia Animal da
FCAV/UNESP, Jaboticabal, São Paulo, Brasil. Realizaram-se medidas do diâmetro do
córion e do embrião, sendo que, no estádio de aparecimento da vesícula óptica, foi
mensurado o maior e o menor diâmetro do embrião, por não apresentar forma esferóide
[23] (Fig. 2).
26
Fig. 1. Fluxograma do resfriamento de embriões de P. mesopotamicus nos quatro estádios embrionários em
dois tempos de estocagem.
27
Fig. 2. Embriões de P. mesopotamicus. I: Fechamento do blastóporo (8-hpf): 1- diâmetro do embrião, 2 –
diâmetro do córion. II: Aparecimento da vesícula óptica (13,3-hpf): 1-diâmetro maior do embrião, 2-diâmetro
menor do embrião e, 3-diâmetro do córion. (Estereomocroscópio, 40X).
4.3 Resultados
4.3.1 Estudo controle
O porcentual de LT, a partir dos ovos selecionados viáveis para os tratamentos do
grupo controle, está apresentado na Tab. 1. Notou-se um significativo aumento (p<0,05) de
LT nos dois estádios de desenvolvimento mais avançados, na ordem: 5,2 < 1,4 < 8 < 13,3hpf (Tab. 1). Observou-se que não houveram diferenças significativas (p>0,05) entre os
estádios embrionários para LV, LM e LNE. A média de LT para os quatro estádios
embrionários foi de 90,67%, esta foi utilizada para comparação com o grupo tratamento,
assim como as LV, LM, LNE e OG apresentados na Tab. 1.
Tabela 1. Porcentual de larvas (vivas, LV; mortas, LM; não-eclodidas, LNE; ovos gorados,
OG) para os embriões de P. mesopotamicus, nos estádios embrionários de 1,4; 5,2; 8 e
13,3-hpf utilizados como controle.
Estádios
LT
LV
LM
1,4-hpf
91,9%±3,77bc
72,31±16,52
19,08±8,37
0,54±3,52 11,84bc ±1,48
5,2-hpf
81,4%±1,38c
61,38±16,52
10,00±8,37
10,00±3,52
18,62 c ±1,48
8-hpf
92,6%±3,72ab
85,30±16,52
3,96±8,37
3,36±3,52
7,65 ab ±1,48
13,3-hpf
96,8%±0,85a
74,32±16,52
20,84±8,37
1,62±3,52
3,23a ±1,48
Média
90,67%±6,38
73,33±16,52
13,47±8,37
3,88±3,52
10,34±1,48
embrionários
LNE
OG
* Cada média ± desvio padrão representa os dados de três repetições com 100 embriões cada. Médias
seguidas de mesma letra nas colunas não diferem entre si (Tukey, α=5%). Dados transformados por arco
seno (raiz (x/100)).
28
4.3.2 Estádios embrionários submetidos ao resfriamento
O porcentual de LT não diferiu estatisticamente (p>0,05) para os dois tempos de
resfriamento utilizados (seis e 10 horas) (Tab. 2), porém apresentou número maior de LV
no tempo de seis horas, no estádio de 8-hpf (Tab. 3).
Tabela 2. Larvas totais (LT) e subdivisão em larvas (vivas, LV; mortas, LM; nãoeclodidas, LNE; ovos gorados, OG) de embriões de P. mesopotamicus submetidos à
solução crioprotetora com metanol e sacarose, em dois tempos de estocagem a -8°C.
Estádios embrionários
LT
LV
LNE
LM
OG
6 horas
34,08±4,74 21,66±4,96 a 8,89±3,10 3,53±1,69 65,91±4,74
10 horas
22,14±4,74
8,75±4,96b 9,34±3,10 4,31±1,69 77,58±4,74
* Cada média ± desvio padrão representa os dados de seis repetições com 100 embriões cada. Médias nas
colunas não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (P<0,10). Dados originais e análise estatística
transformada por Arc Seno(raiz(x/100)).
Tabela 3. Larvas vivas (LV) de embriões de P. mesopotamicus nos diferentes estádios
embrionários submetidos à solução crioprotetora com metanol e sacarose, estocados a -8°C
por seis e 10 horas.
Tempo de resfriamento
Estádios
embrionários
1,4-hpf
5,2-hpf
8-hpf
13,3-hpf
6 horas
10 horas
Ca
0,00
0,00Ba
12,42±8,9Ba
0,00Bb
Aa
43,14±2,7 17,82±5,2Ab
31,11±9,3Ba 17,18±3,9Aa
* Cada média ± desvio padrão representa os dados de seis repetições com 100 embriões cada. Mesma letra
maiúscula para coluna e minúscula para linha, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (P<0,10).
Dados originais e análise estatística transformada por Arc Seno(raiz(x/100)).
Os estádios de 13,3 e 8-hpf apresentaram médias de LT significativamente
superiores (p<0,05) quando comparados aos estádios iniciais, como 1,4-hpf, onde foi
verificada apenas a presença de OG. Porém, entre as médias que compõem LT, o maior
porcentual de LV foi no estádio de 8-hpf seguido pelo estádio de 13,3-hpf, sendo que neste
ultimo estádio a porcentagem de LM e LNE foi maior, de todo o modo não houve
diferença do estádio de 8-hpf (Fig. 3).
29
Fig. 3. Porcentuais de larvas totais (LT) e subdivisão em larvas (vivas, LV; mortas, LM; não-eclodidas, NE;
ovos gorados, OG) para embriões de P. mesopotamicus, nos estádios embrionários de 1,4; 5,2; 8 e 13,3-hpf
submetidos ao resfriamento por dois períodos. Cada média ± desvio padrão representa os dados de seis
repetições com 100 embriões cada. Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si dentro da mesma
variável, nos diferentes tratamentos (Tukey, α=5%). Dados transformados por arco seno (raiz (x/100)).
4.3.3 Análise morfométrica dos embriões
O diâmetro do córion não diferiu estatisticamente (p>0,05), nos quatro estádios
ontogenéticos utilizados, em seis e 10 horas de resfriamento, comparado ao controle. Podese verificar que nos estádios de 1,4; 8 e 13,3-hpf as medidas dos diâmetros do córion
manifestaram-se de forma semelhante. Ou seja, o grupo controle apresentou inicialmente
tendência de medidas maiores, sendo que, após seis horas, ocorreu redução desses
diâmetros, que passaram a aumentar gradativamente até atingirem 10 horas de estocagem.
Comportamento esse, que se apresentou de forma inversa para o estádio de 5,2-hpf, como
pode ser visualizado na Fig. 4.
30
Fig. 4. Medidas de diâmetro do córion dos estádios embrionários P. mesopotamicus utilizados no
resfriamento, no momento da coleta dos embriões de (controle), após seis e 10 horas de refrigeração. Não
houve diferença estatística (Tukey, α=5%).
O diâmetro dos embriões tanto para o controle, quanto após seis e 10 horas de
refrigeração foi similar (Fig. 5). No estádio de 1,4-hpf o diâmetro dos embriões com seis
horas de refrigeração aumentou significativamente (p<0,05) em relação ao controle,
reduzindo com 10 horas de estocagem a -8°C (Fig. 5). Enquanto, o estádio de 5,2-hpf não
apresentou diferença significativa (p>0,05) quando comparado o controle com o
tratamento de seis horas de estocagem, sendo que, passadas 10 horas de refrigeração, esse
valor diminuiu significativamente.
Não houveram diferenças significativas dos demais estádios embrionários (8 e
13,3-hpf) medidos quando comparados os tempos de estocagem e o controle. Para as
medidas dos estádios embrionários dentro de cada tempo de resfriamento (controle, seis e
10 horas), os diâmetros dos embriões controle, nos estádios de 1,4; 5,2; 8 e 13,3-hpf, não
diferiam entre si (p>0,05). Enquanto, nos embriões refrigerados por seis horas, o estádio de
8-hpf apresentou menor diâmetro e, refrigerados por 10 horas, o estádio de 1,4-hpf foi o
maior diâmetro, em relação aos demais estádios embrionários, que permaneceram por ação
do mesmo tempo de estocagem.
31
Fig. 5. Medidas de diâmetro do embrião dos estádios embrionários de P. mesopotamicus utilizados no
resfriamento, no momento da coleta dos embriões (controle), após seis e 10 horas de refrigeração. Médias
seguidas de mesma letra maiúscula para tempo de resfriamento dentro de cada estádio embrionário e,
minúscula para estádios embrionários em cada tempo de resfriamento, não diferem entre si (Tukey, α=5%).
Houve correlação negativa entre LT e o diâmetro do embrião (r = -0,37166) (p
<0,05). Ou seja, quanto maior o diâmetro do embrião, menor o número total de larvas de P.
mesopotamicus.
4.4 Discussão
Os embriões de cada estádio embrionário de P. mesopotamicus apresentaram
diferenças no total de larvas mesmo sem passar por tratamento. Isto indica que ao
selecionar ovos viáveis nos estádios mais iniciais (mórula- 1,4-hpf e 25% do movimento de
epibolia- 5,2-hpf) a possibilidade de 100% desses se desenvolverem é menor que ao
selecioná-los em estádios mais avançados. Sendo assim, para utilização como controle,
deve-se considerar o efeito da taxa de eclosão para cada estádio embrionário, bem como, a
qualidade dos ovos [17], que pode ser minimizado com a utilização de vários casais de
reprodutores.
32
Para os parâmetros avaliados, a resposta dos embriões tratados de P.
mesopotamicus, em dois tempos de estocagem não houve diferença significativa em
relação ao número total de larvas, porém para a porcentagem de larvas vivas o estádio mais
intermediário, 8-hpf apresentou melhor resultado, com seis horas de estocagem a -8°C,
sendo que para o estádio de 13,3-hpf não apresentou diferença entre os tempos de
estocagem, sugerindo que a resistência ao tempo de resfriamento pode aumentar quando
utilizados estádios mais avançados.
Zhang et al. [24] afirmaram que durante o processo ontogenético podem ocorrer
“falhas” que inviabilizam o sucesso da criopreservação, como ocorreu no estádio de 1,4hpf, em que foi verificada apenas a presença de ovos gorados. Do mesmo modo Zhang e
Rawson [8], trabalhando com embriões de Danio renio em estádios iniciais também
verificaram este fato. No presente estudo, pode-se atribuir isto ao fato de o P.
mesopotamicus ser uma espécie tropical, fazendo com que haja sensibilidade mais elevada
nestes estádios de desenvolvimento embrionário, devido à elevada quantidade de lipídios
no embrião, dificultando a ação de proteção dos crioprotetores. Além disso, as fases
iniciais de desenvolvimento embrionário são susceptíveis ao efeito tóxico sobre as células
[25], ou seja, as vias metabólicas reguladoras nestes estádios ainda encontram-se pouco
desenvolvidas sendo incapazes de compensar a toxicidade dos crioprotetores [17].
Embriões encontrando-se em uma fase mais complexa, outras dificuldades surgiram
na utilização da técnica de resfriamento. Pois, no estádio mais avançado de 13,3-hpf,
ocorreu maior incidência de larvas mortas e não eclodidas, em relação aos estádios iniciais,
podendo essa ser uma tônica recorrente à medida que os embriões estejam mais
desenvolvidos. O fato destes embriões terem morrido antes ou logo após a eclosão, reforça
a idéia da sensibilidade das células embrionárias desta espécie a baixas temperaturas. Em
geral, a sensibilidade ao frio está relacionada com o tipo, número e mecanismo de
reparação das células e tecidos [26], ou seja, quanto maior a complexidade das células,
menor a possibilidade dessas células reagirem da mesma forma quando expostas ao frio.
Os estádios embrionários mais resistentes para o P. mesopotamicus, tanto para as
injúrias causadas pelo frio, quanto à toxidade dos crioprotetores foram os intermediários,
com 8 e 13,3-hpf. Resultados estes que corroboraram com os encontrados por Ahammad et
al. [10], utilizando embriões de Labeo rohita, onde a maior sobrevivência dos embriões
ocorreram também no estádio intermediário quando pode-se visualizar os batimentos
cardíacos.
33
A sensibilidade ao resfriamento dependente do estádio, também está relacionada
com a permeabilidade das paredes dos ovos e, ao mecanismo de bombeamento osmótico
[22]. A permeabilidade em embriões de peixes é inferior quando comparada a embriões de
drosophilas [27] e ratos [28]. Entretanto, os problemas causados pela osmorregulação são,
na maioria, devido à quantidade de água retida nos embriões de peixes. Hagedorn et al.
[22] por meio da técnica de microscopia eletrônica, mensuraram em embriões de Danio
rerio, que do total do volume da água líquida, 61% encontra-se no vitelo, e o restante
(39%) na blastoderme. Porém, esses valores podem variar de acordo com o estádio
embrionário, espécie e o tempo em que esses embriões foram submetidos ao resfriamento.
Sendo necessário, dessa forma, verificar alterações morfológicas, afim de constatar
mudanças durante o resfriamento.
O diâmetro do embrião está diretamente relacionado com o volume do mesmo, uma
vez que é alterado, indica que também houve alteração no volume. Lahnsteiner [17]
utilizou o diâmetro como medidas morfométricas para avaliar a permeabilidade de
embriões de Danio rerio em diferentes crioprotetores internos e externos. Ainda, Hagedorn
et al. [23], utilizando o volume para mensurar a permeabilidade de crioprotetores na
mesma espécie, constataram que durante o movimento de epibolia os embriões são
relativamente esféricos, mudando após o movimento completo e, se houver mudança no
volume (desidratação/hidratação), isto é causado pela permeabilidade da água e ou
criprotetores. O mesmo foi verificado no presente trabalho,
até os embriões de P.
mesopotamicus completarem o movimento de epibolia. Dessa forma, utilizou-se o
diâmetro para mensurar a permeabilidade da solução crioprotetora nos diferentes estádios
embrionários.
Foi verificado que para medidas de diâmetro do córion não houveram mudanças em
relação ao controle em nenhum estádio embrionário, estocado por seis e 10 horas. Porém,
as medidas dos diâmetros dos embriões variaram. Em 8-hpf (6 horas de resfriamento)
foram encontradas as menores medidas de diâmetro dos embriões, sendo distintas em
relação ao controle e 10 horas de resfriamento. Além disso, o maior diâmetro foi
encontrado em 1,4-hpf em 10 horas de resfriamento. Ou seja, os estádios em que
ocorreram a maior e menor taxa de sobrevivência (8 e 1,4-hpf, respectivamente)
apresentaram diferentes permeabilidades, possivelmente, relacionado à saída de água e
entrada de solução crioprotetora.
34
Cabe ressaltar que para cada estádio embrionário, o diâmetro dos embriões variou
com o tempo de estocagem em relação ao controle nos dois estádios iniciais (1,4 e 5,2hpf). Entretanto, nos estádios com maiores taxas de sobrevivência de embriões (8 e 13,3hpf), estas variações não foram significativas. Sendo assim, a ação dos agentes
criprotetores está diretamente relacionada ao estádio embrionário e ao tempo de
estocagem. Pois se a permeabilidade da água e crioprotetores não for adequada pode
ocorrer formação de cristais de gelo, intra e extracelulares, considerados letais às células
[29, 30]. Porém, os crioprotetores podem ser tóxicos a determinados estádios, provocando
elevadas taxas de mortalidade [31]. Isto foi confirmado pelo coeficiente de correlação
negativo, com embriões de P. mesopotamicus, entre as variáveis LT e diâmetro dos
embriões, pois, o número total de larvas diminuiu conforme as medidas de diâmetro do
embrião aumentaram.
Os estádios embrionários intermediários podem ser considerados os mais
recomendados para a utilização em protocolo de resfriamento de embriões de P.
mesopotamicus, mantidos até 10 horas a -8°C, sendo que o melhor resultado foi na
utilização do estádio de 8-hpf estocado por seis horas. Entretanto, fatores relacionados a
injúrias no resfriamento e, controle total da permeabilidade e osmorregulação do embrião
devem ser considerados.
Agradecimentos
Este trabalho foi desenvolvido com apoio do CNPq, grupo de pesquisa
PEIXEGEN/Universidade Estadual de Maringá e Aquam/Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, DUKE Energy Brasil, Faculdade de Agronomia Luiz Meneguel, e
Laboratório de Histologia e Embriologia Animal da Faculdade de Ciências Agrárias e
Veterinária /Universidade Estadual Paulista.
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38
V. CURVAS DE RESFRIAMENTO PARA EMBRIÕES DE PACU, Piaractus
mesopotamicus (HOLMBERG, 1887) ESTOCADOS A -8°C
Resumo
A técnica de resfriamento vem sendo utilizada como alternativa para observar os danos
causados aos embriões quando expostos ao frio, como para espécies sul-americanas apenas
o efeito tóxico dos crioprotetores vem sendo observado, o objetivo do presente estudo foi
avaliar o efeito das diferentes curvas de resfriamento lento na estocagem de embriões de
pacu, Piaractus mesopotamicus submetidos ao resfriamento de -8°C. Embriões, no estádio
de fechamento do blastóporo, foram divididos em dois grupos: G1- embriões submetidos à
solução crioprotetora contendo metanol (10%) e sacarose (0,5M) que constituíram os
seguintes tratamentos: (T1) direto da temperatura ambiente, levados ao refrigerador sem
passar por curva; (T2) curva de resfriamento de 0,5°C/minuto e, (T3) curva de
resfriamento de 1°C/minuto e; G2- somente a solução crioprotetora passou pelas mesmas
curvas recebendo os embriões após diminuição da temperatura, compondo os tratamentos
T4, T5 e T6, respectivamente. Os tratamentos foram mantidos a -8°C por um período de
seis horas. O desenvolvimento dos embriões foi avaliado para cada tratamento, com seis
repetições, em delineamento inteiramente casualizado. A sobrevivência dos embriões não
submetidos à refrigeração foi de 94,3%±8,05. A porcentagem de larvas totais (LT) e ovos
gorados (OG) não diferiram estatisticamente entre os grupos, com exceção para a
porcentagem de LN, que apresentou melhor resultado no grupo G1, na curva de
1°C/minuto, ou seja, o momento em que os embriões foram submetidos à solução
crioprotetora foi melhor antes da queda da temperatura. Além disso, quando comparada as
três curvas de resfriamento, a diminuição de 1°C/minuto apresentou o maior porcentual de
LT (90,85%), seguida pela curva de 0,5°C/minuto (78,52%). Desta forma, recomenda-se a
utilização de curvas de resfriamento de 1°C/minuto, para embriões de pacu estocados por
seis horas, a -8°C, pois curvas com velocidade acima disso sofrem com injúrias causadas
pela rápida queda da temperatura.
Palavras-chave: Biotecnologia, criopreservação, queda de temperatura, sobrevivência de
larvas.
39
5.1 Introdução
A congelação de embriões de peixes ainda não é realizada com eficiência devido a
uma série de fatores como: tamanho dos embriões; sistema complexo de compartimentos;
permeabilidade entre as membranas e alta sensibilidade ao frio (Hagedorn et al., 1997;
Hagedorn et al., 1998). Na busca por respostas, estudos têm utilizado a técnica de
resfriamento (temperaturas próximas ao ponto de congelação da água) como alternativa
para observar os danos causados aos embriões quando expostos ao frio (Ahammad et al.,
1998; Liu et al., 2001; Zhang, et al., 2003; Ahammad, et. al, 2003). De forma geral, para
que as células sejam mantidas em baixas temperaturas é essencial a utilização de agentes
crioprotetores, pois, na sua ausência ocorre a formação de cristais de gelo, considerados
letais para as células (Polge et al., 1949; Leibo, 2000). Por outro lado, apesar de necessário,
a toxidez dos crioprotetores pode provocar a mortalidade das células durante a entrada ou
saída no seu interior (Chao e Liao, 2001).
A desidratação das células durante o resfriamento depende diretamente da
velocidade de redução da temperatura. Todavia, as curvas de resfriamento variam de
acordo com os diferentes tipos de células, sendo necessário levar em consideração
características como: quantidade de água intracelular; tamanho da célula; permeabilidade
da membrana para a entrada e saída de água e; o coeficiente de temperatura (Hagedorn et
al., 1997).
Há dois métodos de criopreservação utilizando-se curvas de resfriamento lento ou
rápido. No primeiro as células são resfriadas com a diminuição gradativa da temperatura na
presença de crioprotetores resultando em um aumento da osmolaridade do meio
extracelular, o qual leva a rápida desidratação das células (Mazur, 1984). O segundo
método é um processo de resfriamento rápido, conhecido como vitrificação, mas este
requer uma rápida exposição das células a uma solução crioprotetora altamente
concentrada, todavia torna-se mais tóxica (Fahy, 1984).
De acordo com Mazur (1977), ao submeter células contendo crioprotetores à
temperatura ao redor de -5ºC, tanto as células como o meio circundante provocam o
abaixamento do ponto de solidificação da solução, efeito que é atribuído a presença da
solução crioprotetora. Afirma também que quando a temperatura permanece entre -5 e 15ºC, geralmente, ocorre a formação de gelo no meio extracelular, mas as células
40
continuam descongeladas e super resfriadas, provavelmente, porque a membrana
plasmática impede o crescimento de cristais de gelo em direção ao meio extracelular.
Pesquisas relacionadas a técnicas de congelação e resfriamento de embriões
desenvolvidas no Brasil são recentes (Ninhaus-Silveira et al., 2006; Streit Jr. et al., 2007), e
estão relacionadas ao conhecimento do potencial tóxico dos crioprotetores nas espécies
nativas. O P. mesopotamicus tem sido adotado como espécie sul-americana modelo (Streit,
2005; Streit et al., 2007; Neves, 2008; Fornari, 2009), onde foram observadas combinações
de crioprotetores intra e extracelulares, para o resfriamento, a -8°C, e congelação. Desta
forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes curvas de resfriamento na
estocagem de embriões de P. mesopotamicus, a -8°C.
5.2 Material e métodos
5.2.1 Coleta de embriões
Para obtenção dos embriões foram utilizados seis casais de pacu, P. mesopotamicus
da Estação de Hidrologia e Aquicultura da DUKE Energy Brasil, Salto Grande, São Paulo.
Os reprodutores possuiam quatro anos de idade, e foram mantidos em tanques escavados, a
uma densidade de 0,7 kg peixe/m2. Os animais foram selecionados de acordo com o grau
de maturação gonadal determinado pelas características externas (Teodoro & Ferraz de
Lima, 1986; Gonçalves & Urbinati, 2005), para a indução à desova, onde a terapia
hormonal utilizada foi de 5,5 mg.Kg-1 de extrato bruto de pituitária de carpa em duas doses
(0,5 e 5,0 mg.Kg-1), com intervalo de 12 horas para fêmeas, e 1,0 mg.Kg-1 (dose única)
para machos (via intramuscular). Após 275h°C foi realizada a liberação dos gametas
(extrusão) com posterior fertilização, para em seguida um pool de ovos serem levados para
incubadoras de 7L, com fluxo de água contínuo e temperatura de 27±10C.
5.2.2 Curvas de resfriamento
Foram selecionados ovos viáveis, ou seja, que apresentavam desenvolvimento
embrionário normal, no estádio de fechamento do blastóporo (8 horas pós-fertilização),
excluídos os ovos gorados (Fig. 1A e 1B). 1800 ovos formaram o primeiro grupo (G1),
onde foram submetidos à solução crioprotetora, contendo metanol (10%) e sacarose (0,5M)
para constituir os seguintes tratamentos: T1- Da temperatura ambiente levados direto ao
41
refrigerador, T2- Curva de 0,5°C/minuto e T3- Curva de 1°C/minuto. Após a queda da
temperatura, estes foram levados a -8±2°C, por seis horas.
Fig. 1. A: Ovos gorados que foram descartados e, B: Ovos selecionados viáveis (embriões no estádio de
fechamento do blastóporo) (estereomicroscópio, 40X).
O restante dos ovos (1800) formou o grupo dois (G2), aguardando o resfriamento
da solução crioprotetora, que passou pelos tratamentos: T4- Direto da temperatura
ambiente ao refrigerador, T5- Curva de 0,5°C/minuto e T6- Curva de 1°C/minuto, onde a
temperatura diminuiu gradativamente, até chegar a -5°C, para, em seguida receber os ovos
que então foram encaminhados ao refrigerador (-8°C), durante seis horas (Fig. 2). Ovos
selecionados viáveis sem passar pelo resfriamento foram utilizados para estimar as taxas de
eclosão.
Para controlar a queda da temperatura durante as curvas de resfriamento foram
utilizadas seis caixas de isopor e gelo. Cada caixa foi mantida a uma temperatura constante
(20, 15, 10, 5, 0 e -5°C, respectivamente), monitorada com o auxílio de termômetros, para
que os embriões fossem transferidos conforme tempo proposto em cada curva (Fig. 2).
Completado o período de estocagem, cada repetição, composta por 100 embriões,
foi retirada do refrigerador e transferida a uma incubadora de 3L (fluxo de água contínuo),
onde permaneceram até a eclosão, cerca de 18 horas pós-fertilização.
5.2.3 Viabilidade dos embriões
O desenvolvimento dos embriões, após o processo de resfriamento, foi avaliado
após a eclosão, através da estimativa das larvas totais (LT), que se subdividiu em larvas:
natantes (LN), mortas (LM), não eclodidas (LNE) e ainda, a presença de ovos gorados
(OG), em cada unidade experimental.
42
5.2.4 Análise estatística
Os dados foram avaliados usando delineamento inteiramente casualizado, onde
cada tratamento foi repetido seis vezes. Para a comparação das médias foi empregada a
ANOVA e o teste de Tukey ao nível de significância de 5%.
Fig. 2. Fluxograma de resfriamento de embriões de P. mesopotamicus sendo os embriões em solução
crioprotetora (G1) submetidos a diferentes curvas de resfriamento e a solução crioprotetora (G2) passando
pelas diferentes curvas, recebendo os embriões após queda da temperatura.
5.3 Resultados
O número total de larvas eclodidas dos embriões que não passaram pelo
resfriamento foi estimada em 94,3% ± 8,05. Quando comparadas as médias dos embriões
que passaram por resfriamento, G1 e G2, não mostraram diferenças estatísticas entre os
embriões que passaram por queda de temperatura em meio à solução crioprotetora,
daqueles embriões que foram adicionados a solução após a queda de temperatura (p>0,05)
(Tab. 1).
43
Tab. 1. Porcentagem de larvas totais (LT): natantes (LN), mortas (LM) e, não eclodidas
(LNE); e ovos gorados (OG) para os dois grupos: G1-embriões em solução crioprotetora e
G2-solução crioprotetora e posterior recebimento dos embriões de P. mesopotamicus que
foram estocados a -8°C por seis horas.
Curvas de resfriamento
LT
LN
LM
LNE
OG
G1
82,81
51,13
11,29
20,36
17,19
G2
74,55
48,72
11,51
14,31
25,45
D.P.
10,67
14,01
8,39
11,30
10,71
* Médias seguidas de mesmas letras nas colunas não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (P<0,05).
Dados originais e análise estatística transformada por Arc Seno(raiz(x/100)).
Em relação à porcentagem de LN, não houve diferença comparando as médias dos
grupos (Tab. 1), porém comparando os tratamentos T3 e T6 os resultados diferem, ou seja,
ambos os tratamentos que passaram por curva de resfriamento de 1°C/minuto,
apresentaram diferença significativa, sendo que o T3 foi superior estatisticamente ao T6.
Os demais tratamentos não apresentaram diferenças significativas entre os grupos (Tab. 2).
Tab. 2. Porcentagem de LN (larvas natantes) de embriões de P. mesopotamicus que foram
estocados a -8°C por seis horas, em diferentes formas de submissão a solução crioprotetora
(G1-embriões em solução crioprotetora e G2-solução crioprotetora e posterior recebimento
dos embriões).
Formas de submissão
Curvas de resfriamento
G1
G2
Ba
Direto (T1 e T4)
40,89
52,56 Aa
0,5°C/minuto (T2 e T5)
41,05 Ba
54,95 Aa
1°C/minuto (T3 e T6)
71,45 Aa
41,05 Bb
D.P.
8,2
20,2
* Médias seguidas de mesmas letras maiúsculas nas colunas e minúsculas nas linhas não diferem
estatisticamente pelo teste de Tukey (P<0,05). Dados originais e análise estatística transformada por Arc
Seno(raiz(x/100)).
O efeito das curvas dentro de cada grupo, G1 (Fig. 3) e G2 (Fig. 4), para o número
total de larvas foi significativamente diferente de acordo com a velocidade de queda da
temperatura (p<0,05). Nos embriões submetidos ao grupo G1, o porcentual de LT nas
curvas de 0,5 e 1°C/minuto foi estatisticamente superior (p<0,05) comparada aos que
passaram da temperatura ambiente direto para a temperatura de estocagem (-8°C). Porém,
a 1°C/minuto houve maior porcentagem de LN, sendo que para LM e LNE não diferiram
estatisticamente das demais curvas (p>0,05) (Fig. 3).
44
Fig. 3. Efeito das curvas de resfriamento no grupo G1 em relação ao total de larvas (LT); larvas natantes
(LN); larvas mortas (LM); larvas não eclodidas (LNE) e; ovos gorados (OG) de P. mesopotamicus estocados
a -8°C por seis horas. Médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey
(P<0,05). Dados originais e análise estatística transformada por Arc Seno(raiz(x/100)).
Para o resfriamento da solução crioprotetora, cujos embriões foram adicionados
após redução da temperatura (G2), apesar da curva de 1°C/minuto apresentar porcentagem
de LT superior as demais curvas (p<0,05), a quantidade de LN foi menor (p<0,05) e, em
contrapartida, o porcentual de LNE foi significativamente maior (Fig. 4).
Fig. 4. Efeito das curvas de resfriamento no grupo G2 em relação ao total de larvas (LT); larvas natantes
(LN); larvas mortas (LM); larvas não eclodidas (LNE) e; ovos gorados (OG) de P. mesopotamicus estocados
a -8°C por seis horas. Médias seguidas de mesmas letras nas colunas não diferem estatisticamente pelo teste
de Tukey (P<0,05). Dados originais e análise estatística transformada por Arc Seno(raiz(x/100)).
Quando comparada as médias das curvas de resfriamento pode-se observar que a
curva de 1°C/minuto apresentou porcentual de LT maior do que os embriões que estavam à
temperatura ambiente e foram diretamente alocados na temperatura de -8°C (p<0,05), no
entanto estas duas não diferiram da curva de 0,5°C/minuto (p>0,05) (Fig. 5). Esta mesma
45
condição pode ser observada para LNE e OG (p<0,05), porém, a porcentagem de LN e LM
não diferiram entre si (p>0,05) (Tab. 3).
Fig. 5. Porcentual de larvas totais entre as curvas de resfriamento para ambos os grupos (G1-embriões em
solução crioprotetora e G2-solução crioprotetora) observados em embriões de P. mesopotamicus estocados
por seis horas, a -8°C. Médias seguidas de mesmas letras nas colunas não diferem estatisticamente pelo teste
de Tukey (P>0,05). Dados originais e análise estatística transformada por Arc Seno(raiz(x/100)).
Tab. 3. Comparação entre as curvas de resfriamento na porcentagem de larvas: natantes
(LN), mortas (LM) e, não eclodidas (LNE); e ovos gorados (OG) de P. mesopotamicus
estocados a -8°C por seis horas.
Curvas de resfriamento
LN
LM
LNE
OG
Direto
46,73
15,4
4,52 b
33,32 b
0,5°C/minuto
46,81
11,72
19,99ª
21,48ªb
1°C/minuto
56,25
7,06
27,5 a
9,6a
D.P.
20,71
12,4
16,71
12,83
* Médias seguidas de mesmas letras nas colunas não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (P>0,05).
Dados originais e análise estatística transformada por Arc Seno(raiz(x/100)).
5.4 Discussão
A utilização de protocolos de resfriamento tem como objetivo a remoção total da
água intracelular por meio de um processo de queda gradativa da temperatura, para que
assim não ocorra formação de cristais de gelo, que são letais as células (Hagedorn et al.,
2004). Os autores mostram que a temperatura de formação de gelo extracelular depende da
solução crioprotetora utilizada, mas que em geral, é entre -5 a -15°C, sendo que a presença
ou não dos embriões na solução não alteraram a temperatura do meio no momento de
46
formação de gelo. O presente estudo indica que não foram detectadas diferenças
estatísticas no momento em que os embriões foram submetidos à solução crioprotetora. Ou
seja, a desidratação das células ocorreu de forma semelhante, quando os embriões
passaram por diminuição gradativa de temperatura na presença da solução, ou quando
foram submetidos diretamente em solução na temperatura de -8°C.
As observações de Morris e Watson (1984) para formação de injúrias corroboram
com os resultados encontrados para embriões de P. mesopotamicus. Estes autores citam
que as injúrias causadas pela submissão de células ao resfriamento são classificadas em
duas categorias: (a) direta, onde ocorre o choque térmico em conseqüência ao rápido
resfriamento e; (b) indireta, que é independente da curva de resfriamento, e se manifesta
depois de longo período de estocagem em baixas temperaturas. Sendo assim, a quantidade
de LT, para os dois grupos utilizados, foi menor quando houve resfriamento sem passar por
curva, ou seja, essa forma de resfriamento causou uma injúria direta, o que pode ser
atribuído ao choque térmico sofrido pelas células.
De forma geral, a maior porcentagem de LT foi encontrada quando os embriões
foram submetidos à curva de resfriamento a 1°C/minuto, o que indica que no resfriamento
lento, acima dessa velocidade, diminui a viabilidade dos embriões. Em estádios distintos,
embriões de Danio rerio, estudados por Lahnsteiner (2009), não mostraram diferenças
entre a curva de resfriamento lento (0,35°C/minuto) e o resfriamento direto, no término do
desenvolvimento embrionário. Os resultados entre as pesquisas mostraram que essas
diferenças talvez estejam relacionadas aos crioprotetores utilizados (PPS-physiologic
saline solution (125mmol/L NaCl, 2mmol/L KCl, 1mmol/L CaCl2, 1mmol/L MgSO4,
100mmol/L tris)). Pois, Zang et. al (2003), usando metanol em três curvas de resfriamento
(1, 30 e 300°C/minuto) em diferentes estádios embrionários de Danio rerio, mostrou altas
taxas de sobrevivência dos embriões nas três curvas em qualquer estádio estudado.
Quanto à forma de submissão dos embriões a solução crioprotetora, observou-se
que em embriões submetidos inicialmente a solução crioprotetora, as curvas de 0,5 e
1°C/minuto apresentaram melhor incidência de LT, porém, as LN ocorreram em maior
número na curva de 1°C/minuto, o que está diretamente relacionado com a velocidade de
formação de gelo. Enquanto, para embriões expostos a solução crioprotetora no fim da
curva de resfriamento (-8°C), pode-se verificar um menor número de LN na curva de
1°C/minuto, apesar de essa ter apresentado maior porcentagem de LT. Para Mazur (1980) a
resistência de tecidos vivos a baixas temperaturas depende da velocidade do resfriamento,
47
bem como do efeito tóxico do crioprotetor a ser submetido, sendo assim, essas diferenças
de LT e LN podem estar relacionadas aos efeitos da solução crioprotetora sob os embriões
em diferentes situações de resfriamento.
A origem das injúrias provocadas pelo resfriamento, direto ou indireto, está
relacionada com: a fase de transição da membrana lipídica, a despolimerização dos
microtúbulos, a dificuldade da divisão celular e, a desnaturação das proteínas (Liu et al.,
2001; Zhang et al., 2003). Apesar de não deixarem claro o mecanismo de proteção do
metanol aos embriões de Danio rerio, Zhang et al. (2003) atribuíram seu efeito as
características comuns a cadeias curtas de álcool, que são capazes de diminuir a
temperatura da fase de transição da membrana lipídica.
Em conclusão, os embriões que foram submetidos da temperatura ambiente a
solução crioprotetora com metanol e sacarose, com velocidade de resfriamento de 1
°C/minuto, para serem estocados a -8°C, produziu um percentual maior de embriões
viáveis. Sendo que, a submissão dos embriões na solução crioprotetora antes de passar por
curva de resfriamento apresentou uma quantidade maior de larvas natantes.
Agradecimentos
Este trabalho foi desenvolvido com apoio do CNPq, grupo de pesquisa
PEIXEGEN/Universidade Estadual de Maringá e Aquam/Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, DUKE Energy Brasil, e Faculdade de Agronomia Luiz Meneguel.
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50
VI. ANEXOS
Reprodutor de pacu (P. mesopotamicus).
Fertilização dos ovócitos.
51
Embriões sendo submetidos à solução crioprotetora.
Embriões em solução crioprotetora passando pela
temperatura de 5°C para completar a curva de resfriamento
de 1°C/minuto.
52
Caixas de isopor utilizadas para realizar a diminuição
gradativa da temperatura (curva de resfriamento).
Incubadoras de 3L onde os embriões, estocados a -8°C,
foram aclimatados para completarem o desenvolvimento
embrionário.
53
Estrutura para incubadoras de 3L, onde foram distribuídos os
tratamentos.
Larva normal (natante) de pacu, recém eclodida.