UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
ESCOLA DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
AVALIAÇÃO DA
ESTABILIDADE DO
EXTRATO ETANÓLICO DE
LYCHNOPHORA
TRICHOCARPHA SPRENG. E
DA EREMANTOLIDA C
BÁRBARA OLIVEIRA HENRIQUES
OURO PRETO – MINAS GERAIS – BRASIL
2011
Bárbara Oliveira Henriques
AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DO EXTRATO DE
LYCHNOPHORA TRICHOCARPA SPRENG. E DA
EREMANTOLIDA C
EVALUATION OF THE STABILITY OF THE EXTRACT
FROM LYCHNOPHORA TRICHOCARPA SPRENG. AND
OF THE EREMANTOLIDE C
Dissertação
Programa
de
de
Mestrado
Pós-graduação
apresentada
em
ao
Ciências
Farmacêuticas da Escola de Farmácia da
Universidade Federal de Ouro Preto, como
complementação dos créditos necessários para a
obtenção do título de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.
Orientadora: Prof. Dra. Dênia Antunes Saúde Guimarães
Co-orientadora: Profa. Dra. Jacqueline de Souza
Ouro Preto, MG.
2011
ii
H519a
Henriques, Bárbara Oliveira.
Avaliação da estabilidade do extrato etanólico de Lychnophora Trichocarpha
Spreng. e da eremantolida C [manuscrito] / Bárbara Oliveira Henriques. – 2011.
xix, 97 f.: il. color.; grafs.; tabs.
Orientadora: Profª Drª Dênia Antunes Saúde Guimarães.
Coorientadora: Profª Drª Jaqueline de Souza.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Escola de
Farmácia. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
Área de concentração: Fármacos e Medicamentos
1. Arnica - Teses. 2. Medicamentos - Estabilidade - Teses. 3. Erematolida C Teses. 4. Licnofolida - Teses. 5. Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.
CDU: 615.451.1:582.998.16
Catalogação: [email protected]
Avaliação da Estabilidade do Extrato Etanólico de
Lychnophora trichocarpha Spreng. e da eremantolida C
Bárbara Oliveira Henriques
Dissertação aprovada pela Banca Examinadora constituída pelos Professores:
______________________________
Nome
Instituição
______________________________
Nome
Instituição
______________________________
Nome
Instituição
______________________________
Nome
Instituição
Ouro Preto, 2011.
iii
Este trabalho foi realizado no Laboratório de
Plantas Medicinais (LAPLAMED) e no Laboratório
de Controle de Qualidade (LCQ-UFOP), do
Programa
de
Pós-graduação
em
Ciências
Farmacêuticas da Universidade Federal de Ouro
Preto, financiado pela Fundação de Amparo à
Pesquisa de Minas Gerais e pela Rede Mineira de
Ensaios
Toxicológicos
e
Farmacológicos
(TOXIFAR-FAPEMIG).
iv
Dedico este trabalho a minha mãe, meu grande
exemplo e ao meu pai, minha grande aspiração,
por acreditarem em mim e me apoiarem, aos meus
irmãos, Angelita, Douglas e Rafaela, por sempre
me apoiaram, e ao Daniel, por tornar o caminho
mais simples e os obstáculos mais fáceis de superar
e por estar sempre ao meu lado.
v
Agradecimentos
Ao CiPharma, pela oportunidade de crescimento pessoal e profissional, e pelo
contínuo investimento na minha formação.
À Professora Dênia Antunes Saúde Guimarães, pelo direcionamento e apoio.
À Professora Jacqueline de Souza, por todo o conhecimento ensinado, pela
atenção, dedicação e paciência.
Ao Professor Gustavo Henrique Bianco de Souza, pela confiança e apoio em vários
momentos do meu percurso.
Ao Professor Tanus Jorge Nagem, por me acolher e me indicar o caminho
acadêmico, pela confiança e apoio.
Às professoras Lucienir Pains Duarte, Suzana Pavlovic e Lisiane da Silveira Ev,
pelas contribuições prestadas ao trabalho na qualidade de membros da banca de
qualificação.
A todos os meus professores, que tanto contribuíram para a minha formação
pessoal e profissional, por me mostrarem caminhos e dividirem comigo suas
experiências.
À amiga Líliam Teixeira Oliveira, pelo grande apoio prestado ao trabalho, pelos
conhecimentos divididos e pela atenção.
A minha mãe, Margarete de Oliveira, pelos conselhos, dedicação e confiança.
vi
Ao meu pai, Jair Fernando Silva Henriques, meu exemplo, pelo apoio e dedicação,
e por acreditar e investir em mim.
Aos meus irmãos, Angelita Maria da Silva, Rafaela Oliveira Henriques e Douglas
Oliveira Henriques, pelo apoio, confiança e companheirismo.
Ao Daniel Mansur Rabelo, que me apoiou de todas as maneiras possíveis e
imagináveis, pelo companheirismo, dedicação absoluta e confiança.
A minha família, por entender a minha ausência e me apoiar em todos os
momentos da minha vida.
Aos grandes amigos Carlos Augusto Vieira Oliveira, Henrique Ferreira de Araújo
Antunes e Paulo Henrique Freitas Martins, por sempre acreditarem em mim e me
apoiarem em todos os momentos dos meus percursos.
Às amigas Tamara Resende Costa, Amanda Silva de Miranda e Camilla Maria
Duarte Pinto, pelos conselhos, confiança e apoio.
Às colegas Marcela de Paula Michel, Patrícia Capelari de Oliveira e Leidiane
Cristina Ferreira, pelos conhecimentos divididos e apoio prestado durante a
realização desse trabalho.
Às alunas de iniciação científica, Fernanda, Nayara e Michele, pela colaboração a
esse trabalho.
Aos colegas de curso, por compartilharem comigo experiências e momentos.
A todos os que, de alguma forma, possibilitaram a realização desse trabalho.
vii
“Toda a natureza é arte que ignoras.
Todo acaso, direção que não podes ver.
Toda discórdia, harmonia que não entendes.
Todo mal parcial, bem universal.”
Alexandre Pope
viii
Resumo
As espécies do gênero Lychnophora são utilizadas pela população como anti-inflamatório,
analgésico e anti-reumático. Estudos anteriores demonstraram a atividade anti-inflamatória tópica
do extrato etanólico de Lychnophora trichocarpha Spreng e de seus constituintes químicos βsitosterol, lupeol, licnofolida e eremantolida C, veiculados em pomada. Estes resultados
mostraram que L. trichocarpha é uma espécie promissora para se tornar um fitoterápico com
utilização no tratamento de processos inflamatórios. Assim, o estudo da estabilidade e o
desenvolvimento de metodologia para o controle de qualidade do extrato etanólico de L.
trichocarpha são justificados para que formulações fitoterápicas preparadas com este extrato
tenham qualidade, eficácia e segurança. O presente trabalho visou avaliar a estabilidade do
extrato etanólico de L. trichocarpha propondo o desenvolvimento de uma metodologia para a
quantificação da eremantolida C e da licnofolida, marcadores químicos, neste extrato. Para este
monitoramento, foi desenvolvido um método por CLAE utilizando coluna cromatográfica
preenchida com octadecilsilano, detecção em DAD com comprimentos de onda de 200 a 400 nm,
cromatogramas extraídos a 265 nm, fase móvel composta de acetonitrila: água em sistema
gradiente. Foi padronizado o uso de solução 100 µg/mL de cumarina como padrão interno. O
método de quantificação possibilitou boa separação e resolução dos picos da eremantolida C, da
licnofolida e do padrão interno, tanto isolados quanto no extrato etanólico de L. trichocarpha. Os
parâmetros de validação avaliados demonstraram que o método é seletivo, linear, preciso e exato,
e que a recuperação dos analitos, estabilidade das soluções dos padrões, limite de detecção e
limite de quantificação são adequados à finalidade desse método. A avaliação da estabilidade do
extrato etanólico de L. trichocarpha Spreng demonstrou que sua vida útil é de 6 meses à
temperatura ambiente, podendo ser maior em temperaturas mais baixas. Já para a eremantolida C,
não ficou evidente a existência de diferenças significativas entre o armazenamento à temperatura
ambiente e em geladeira. Os estudos de fotoestabilidade demonstraram que o extrato etanólico e
a eremantolida C não degradaram quando expostos à luz. Os estudos de degradação forçada
demonstraram que a eremantolida C sofreu degradação sob condições ácidas e alcalinas e
manteve-se estável, por três dias, sob condição neutra, oxidativa e quando exposta a altas
temperaturas.
Palavras-chaves: Lychnophora trichocarpha, eremantolida C, licnofolida, estabilidade,
validação, método CLAE.
ix
Abstract
The species of the genus Lychnophora are used by population as anti-inflammatory, analgesic
and anti-rheumatism. Previous studies have demonstrated topical anti-inflammatory activity
of the ethanolic extract of Lychnophora trichocarpha Spreng and its constituents, β-sitosterol,
lupeol, lychnopholide and eremantholide C, in ointments preparations. These results showed
that L. trichocarpha is a promising species to become an herbal drug that can be used in the
treatment of inflammatory process. Thus, the study of stability and the development of
methodology for quality control of the ethanolic extract of L. trichocarpha are justified to
herbal formulations prepared with this extract have quality, efficacy and safety. This study
aims to evaluate the stability of the ethanolic extract of L. trichocarpha by proposing a
quantitative methodology to assay eremantholide C and lychnopholide, chemical markers, in
this extract. To this monitoring, a method was developed by High Pressure Liquid
Chromatograph using chromatographic column filled with octadecilsilane, photodiode array
detector with wavelengths from 200 nm to 400 nm, chromatograms extracted at 265 nm,
mobile phase consisting of acetonitrile : water gradient system. It was standardized using of
solution 100 μg/mL of coumarin as an internal standard. The quantification method provided
good separation and resolution of the peaks of eremantholide C, lychnopholide and the
internal standard, both isolated and in ethanolic extract of L. trichocarpha. The evaluated
validation parameters have shown that the method is selective, linear, precise and accurate,
and analytes recovery, detection limit, quantification limit and stability of the standard
solutions are fit for purpose. Evaluation of stability of the ethanolic extract of L. trichocarpha
has shown that shelf life of ethanolic extract of L. trichocarpha Spreng is 6 months in room
temperature, and may increase at lower temperatures. To eremantholide C, was not evident
that there are significant differences between storage in room temperature and lower
temperature. Photostability studies have shown that neither ethanolic extract of L.
trichocarpha nor eremantholide C degraded when exposed to light. Forced degradation
studies shown that eremantholide C degraded under acidic and alkaline conditions and
remained stable, for three days, under neutral and oxidative conditions and when exposed to
high temperatures.
keywords: Lychnophora trichocarpha, eremantholide C, lycnopholide, stability, validation,
HPLC method
x
Lista de Abreviaturas e Siglas
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
CG – Cromatografia Gasosa
CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CMD – Concentração Média Determinada
CA – Concentração alta
CB – Concentração baixa
CM – Concentração média
DAD – Detector por arranjo de diodo
DP – Desvio Padrão Relativo
DPA – Desvio padrão do intercepto do eixo Y
DPR – Desvio Padrão Relativo
EM – Espectro de Massas
IBAMA – Instituto Brasileiro do Meio Ambiente
IC – Inclinação da curva média de calibração
ICH – International Conference of Harmonization
INMETRO - Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial
IUPAC – International Union of Pure and Applied Chemistry
IV - Infravermelho
H2O2 – Água oxigenada
LAPLAMED – Laboratório de Plantas Medicinais
LD – Limite de Detecção
LQI – Limite de Quantificação Inferior
N2 – Gás nitrogênio
OMS – Organização Mundial da Saúde
PA – Para Análise
PI – Padrão Interno
R – Coeficiente de correlação
RMN – Ressonância Magnética Nuclear
SUS – Sistema Único de Saúde
US-FDA – United States Food and Drug Administration
xi
Lista de Figuras
Figura 1 - Cromatograma 1 ......................................................................................................41
Figura 2 - Cromatograma 2.......................................................................................................41
Figura 3 – Estrutura química da eremantolida C, licnofolida e cumarina................................43
Figura 4 – Cromatogramas tridimensionais..............................................................................45
Figura 5 - Gráfico 1 e 2..............................................................................................................47
Figura 6 - Gráfico 3 e 4..............................................................................................................48
Figura 7 – Impressão digital do extrato etanólico de L. trichocarpha obtido a partir das
amostras em estudo de estabilidade de longa duração...............................................................51
Figura 8 - Sobreposição das impressões digitais do extrato etanólico de L. trichocarpha
obtidas a partir das amostras em estudo de estabilidade de longa duração com diferentes
tempos de armazenamento em relação ao tempo zero...............................................................52
Figura 9 – Impressão digital do extrato etanólico de L. trichocarpha obtidos a partir das
amostras em estudo de estabilidade em temperatura de geladeira.............................................54
Figura 10 - Sobreposição das impressões digitais do extrato etanólico de L. trichocarpha
obtidas a partir das amostras em estudo de estabilidade em temperatura de geladeira com
diferentes tempos de armazenamento em relação ao tempo zero..............................................55
Figura 11 – Impressão digital do extrato etanólico de L. trichocarpha obtidos a partir das
amostras em estudo de estabilidade acelerada...........................................................................57
Figura 12 - Sobreposição das impressões digitais do extrato etanólico de L. trichocarpha
obtidas a partir das amostras em estudo de estabilidade acelerada com diferentes tempos de
armazenamento em relação ao tempo zero................................................................................58
Figura 13 – Impressões digitais do extrato etanólico do extrato etanólico de L. trichocarpha
obtidas a partir das amostras em estudo de fotoestabilidade.....................................................61
Figura 14 – Cromatograma obtido a partir da amostra controle de degradação da eremantolida
C.................................................................................................................................................66
Figura 15 – Cromatogramas obtidos a partir da degradação ácida da eremantolida
C.................................................................................................................................................67
Figura 16 – Cromatogramas obtidos a partir da extração dos produtos de degradação ácida da
eremantolida C...........................................................................................................................68
xii
Figura 17 - Cromatogramas obtidos a partir da degradação alcalina da eremantolida
C.................................................................................................................................................69
Figura 18 – Cromatogramas obtidos no teste de degradação neutra da eremantolida
C.................................................................................................................................................70
Figura 19 – Cromatogramas obtidos no teste de degradação oxidativa da eremantolida
C.................................................................................................................................................71
Figura 20 – Cromatogramas obtidos no teste de degradação por altas temperaturas da
eremantolida C...........................................................................................................................72
xiii
Lista de Quadros e Tabelas
Quadro 1 – Espécies de Lychnophora e seus marcadores químicos................................................9
Quadro 2 – Estruturas químicas de lactonas sesquiterpênicas e as espécies das quais já foram
isoladas...........................................................................................................................................13
Tabela 1 – Condições cromatográficas utilizadas no método de quantificação da eremantolida C e
licnofolida no extrato etanólico de L. trichocarpha.......................................................................40
Tabela 2 - Proporção dos solventes da fase móvel em função do tempo de análise......................40
Tabela 3 – Resultados da validação do método de quantificação da eremantolida C e
licnofolida.......................................................................................................................................46
Tabela 4 – Resultados da validação do método de quantificação da eremantolida C e
licnofolida.......................................................................................................................................49
Tabela 5 – Teores de eremantolida C e licnofolida no extrato em estudo de estabilidade de longa
duração em diferentes tempos de armazenamento.........................................................................53
Tabela 6 – Teores de eremantolida C e licnofolida no extrato em estudo de estabilidade em
temperatura
de
geladeira
em
diferentes
tempos
de
armazenamento...............................................................................................................................56
Tabela 7 – Teores de eremantolida C e licnofolida no extrato em estudo de estabilidade acelerada
em diferentes tempos de armazenamento.......................................................................................59
Tabela 8 – Absorbância das soluções de quinino, expostas e protegidas da luz, em diferentes dias
de armazenamento..........................................................................................................................60
Tabela 9 – Teores de eremantolida C na eremantolida C previamente isolada em estudo de
estabilidade
de
longa
duração
em
diferentes
tempos
de
armazenamento...............................................................................................................................64
Tabela 10 – Teores de eremantolida C na eremantolida C previamente isolada em estudo de
estabilidade em temperatura de geladeira em diferentes tempos de armazenamento....................65
Tabela 11 – Teores de eremantolida C na eremantolida C previamente isolada em estudo de
estabilidade acelerada em diferentes tempos de armazenamento..................................................65
xiv
Lista de Equações
Equação
1
–
Equação
utilizada
para
o
cálculo
da
precisão
de
métodos
analíticos...................................................................................................................................17
Equação 2 – Equação utilizada para o cálculo do LD de métodos analíticos...........................18
Equação 3 – Equação utilizada para o cálculo do LQI de métodos analíticos..........................19
xv
SUMÁRIO
I – INTRODUÇÃO.....................................................................................................................1
II – OBJETIVOS.........................................................................................................................4
II.1 – Objetivo geral....................................................................................................................5
II.2 - Objetivos específicos.........................................................................................................5
III – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...........................................................................................6
III.1 - Família Asteraceae............................................................................................................7
III.2 - Gênero Lychnophora........................................................................................................7
III.3 - A espécie Lychnophora trichocarpha..............................................................................9
III.3.a - Perfil químico de Lychnophora trichocarpha..............................................................10
III.3.b - Atividades biológicas de Lychnophora.......................................................................10
III.3.c - Toxicidade de Lychnophora trichocarpha..................................................................11
III.4 – Lactonas sesquiterpênicas..............................................................................................12
III.5 - Qualidade de extratos vegetais.......................................................................................14
III.6 - Validação de metodologias analíticas............................................................................14
III.6.a - Legislações e recomendações sobre validação............................................................15
III.6.b - Parâmetros de validação..............................................................................................16
III.6.b.1 – Especificidade e seletividade...................................................................................16
III.6.b.2 - Faixa linear e intervalo de trabalho...........................................................................16
III.6.b.3 – Linearidade...............................................................................................................17
III.6.b.4 – Precisão....................................................................................................................17
III.6.b.4.a – Repetibilidade ou precisão intra-corridas..............................................................17
III.6.b.4.b – Precisão intermediária ou precisão inter-corridas.................................................18
III.6.b.4.c – Reprodutibilidade ou precisão inter-laboratorial...................................................18
III.6.b.5 – Limite de detecção...................................................................................................18
III.6.b.6 – Limite de quantificação inferior...............................................................................18
III.6.b.7 – Exatidão...................................................................................................................19
III.6.b.8 – Recuperação dos analitos.........................................................................................19
III.6.b.9 – Estabilidade das soluções dos padrões.....................................................................19
III.7 – Estabilidade de produtos naturais..................................................................................20
III.7.a – Estudos de estabilidade...............................................................................................20
III.7.b – Legislação...................................................................................................................21
III.7.b.1 – Resolução RE 1, de 29 de julho de 2005, da ANVISA...........................................21
xvi
III.7.b.2 – Guia para realização de estudos de fotoestabilidade................................................22
III.7.b.3 – Guia de estabilidade de produtos cosméticos..........................................................22
III.7.c – Estabilidade de produtos naturais................................................................................23
IV – MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................................26
IV.1 – Material, equipamentos, soluções e reagentes...............................................................27
IV.1.a – Material.......................................................................................................................27
IV.1.b – Equipamentos..............................................................................................................27
IV.1.c – Solventes e reagentes..................................................................................................28
IV.2 – Coleta e identificação do material vegetal.....................................................................28
IV.3 - Preparo do extrato etanólico...........................................................................................28
IV.4 - Obtenção dos marcadores químicos...............................................................................29
IV.5 – Desenvolvimento do método analítico..........................................................................29
IV.6 – Validação do método analítico......................................................................................29
IV.6.a – Preparo das amostras...................................................................................................29
IV.6.a.1 – Solução estoque de cumarina...................................................................................29
IV.6.a.2 – Solução estoque dos marcadores químicos 1...........................................................30
IV.6.a.3 – Solução estoque dos marcadores químicos 2...........................................................30
IV.6.a.4 – Solução estoque de eremantolida C.........................................................................30
IV.6.a.5 - Solução estoque do extrato etanólico.......................................................................30
IV.6.a.6 – Soluções diluídas dos marcadores químicos............................................................30
IV.6.b – Parâmetros de validação.............................................................................................31
IV.6.b.1 – Seletividade..............................................................................................................31
IV.6.b.2 – Intervalo linear.........................................................................................................31
IV.6.b.3 – Linearidade..............................................................................................................32
IV.6.b.4 – Precisão....................................................................................................................32
IV.6.b.5 – Limite de detecção...................................................................................................32
IV.6.b.6 – Limite de quantificação inferior..............................................................................32
IV.6.b.7 – Exatidão...................................................................................................................32
IV.6.b.8 – Recuperação dos analitos.........................................................................................33
IV.6.b.9 – Estabilidade das soluções dos padrões.....................................................................33
IV.7 – Estudo de estabilidade...................................................................................................33
IV.7.a – Estudo de estabilidade de longa duração....................................................................33
IV.7.b – Estudo de estabilidade a 8º C......................................................................................34
xvii
IV.7.c – Estudo de estabilidade acelerada................................................................................34
IV.7.c.1 – Degradação forçada da eremantolida C...................................................................34
IV.7.c.2 – Degradação forçada da eremantolida C...................................................................34
IV.7.c.2.a – Preparo das amostras e condições de degradação.................................................34
IV.7.c.2.a.1 – Controle..............................................................................................................35
IV.7.c.2.a.2 – Degradação ácida...............................................................................................35
IV.7.c.2.a.3 – Degradação alcalina...........................................................................................35
IV.7.c.2.a.4 – Degradação neutra..............................................................................................35
IV.7.c.2.a.5 – Degradação oxidativa.........................................................................................36
IV.7.c.2.a.6 – Degradação por altas temperaturas....................................................................36
IV.7.c.2.a.6.a – Controle...........................................................................................................36
IV.7.c.2.a.6.b – Degradação a 90º C.........................................................................................36
IV.7.c.2.b – Controle da influência dos reagentes....................................................................36
IV.7.c.2.b.1 – Água oxigenada..................................................................................................36
IV.7.c.2.b.2 – Ácido clorídrico 1M + hidróxido de sódio 1M..................................................37
IV.7.d – Estudo de fotoestabilidade..........................................................................................37
IV.7.d.1 – Fonte luminosa.........................................................................................................37
IV.7.d.2 – Determinação do tempo de exposição.....................................................................37
IV.7.d.3 – Câmara para estudos de fotoestabilidade.................................................................37
V – RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................................39
V.1 – Desenvolvimento do método...........................................................................................40
V.2 – Validação do método.......................................................................................................44
V.3 – Estudos de estabilidade do extrato etanólico..................................................................50
V.3.a – Estabilidade de longa duração......................................................................................50
V.3.a.1 – Impressão digital do extrato......................................................................................50
V.3.a.2 – Teor dos marcadores químicos..................................................................................53
V.3.b – Estabilidade a 8º C.......................................................................................................53
V.3.b.1 – Impressão digital do extrato......................................................................................53
V.3.b.2 – Teor dos marcadores químicos..................................................................................55
V.3.c – Estabilidade acelerada..................................................................................................56
V.3.c.1 – Impressão digital do extrato......................................................................................56
V.3.c.2 – Teor dos marcadores químicos..................................................................................59
V.3.d – Fotoestabilidade...........................................................................................................59
xviii
V.3.d.1 – Determinação do tempo de exposição das amostras.................................................59
V.3.d.2 – Impressão digital.......................................................................................................60
V.3.d.3 – Teor dos marcadores químicos..................................................................................61
V.3.e – Discussão......................................................................................................................61
V.4 – Estudos de estabilidade da eremantolida C....................................................................64
V.4.a – Estabilidade de longa duração......................................................................................64
V.4.b – Estabilidade a 8º C.......................................................................................................64
V.4.c – Estabilidade acelerada..................................................................................................65
V.4.c.1 – Armazenamento a 40º C............................................................................................65
V.4.c.2 – Degradação forçada da eremantolida C.....................................................................66
V.4.c.2.a – Controle..................................................................................................................66
V.4.c.2.b - Degradação ácida....................................................................................................66
V.4.c.2.c - Degradação alcalina................................................................................................68
V.4.c.2.d - Degradação neutra...................................................................................................69
V.4.c.2.e - Degradação oxidativa..............................................................................................70
V.4.c.2.f - Degradação por altas temperaturas..........................................................................71
V.4.d - Fotoestabilidade............................................................................................................72
V.4.e – Discussão......................................................................................................................72
VI – CONCLUSÃO..................................................................................................................75
VII – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................77
VIII – ANEXOS........................................................................................................................85
ANEXO
A.............................................................................................................................86
ANEXO B.................................................................................................................................94
xix
I – INTRODUÇÃO
20
Dono de grande parcela da biodiversidade mundial, o Brasil possui cerca de 20% do número
total de espécies do planeta. Esse imenso patrimônio genético tem valor econômico-estratégico
inestimável em várias atividades, merecendo destaque o campo do desenvolvimento de novos
medicamentos (CALIXTO, 2003).
De acordo com a legislação sanitária brasileira, fitoterápico é o medicamento em que são
empregadas exclusivamente matérias-primas ativas vegetais, caracterizado pelo conhecimento de
sua eficácia e segurança, reprodutibilidade e constância de sua qualidade (BRASIL, 2004).
Os fitoterápicos sempre detiveram uma parcela significativa no mercado de medicamentos.
O setor movimenta globalmente US$ 21,7 bilhões por ano. No Brasil, não existem dados oficiais
atualizados, porém, estima-se que esse mercado gira em torno de US$ 160 milhões por ano. Merece
destaque o ritmo de crescimento das vendas, mais de 15% anuais, diferentemente dos
medicamentos sintéticos que está em torno de 4%. A movimentação anual do setor fitoterápico, em
toda a cadeia produtiva, está estimada em cerca de R$ 1 bilhão, segundo a Febrafarma em 2007
(CARVALHO et al., 2008).
Estima-se que, em 2003, 40% dos medicamentos disponíveis na terapêutica eram
desenvolvidos de fontes naturais: 25% de plantas, 13% de microrganismos e 3% de animais
(CALIXTO, 2003).
O mercado de fitoterápicos está em plena ascensão. Muitas plantas brasileiras são utilizadas
pela população há várias gerações, sendo que diversas já foram estudadas ou estão em estudo, no
campo da etnobotânica, ciência que avalia e estuda o emprego e a prescrição de plantas com
finalidade terapêutica. O estudo de uma planta como medicinal necessita de um período de 5 a 10
anos de pesquisas e ensaios clínicos realizados pelo trabalho conjunto de
uma equipe
multidisciplinar. A biodiversidade do Brasil, associada à rica diversidade étnica e cultural favorece
o desenvolvimento de pesquisas com plantas medicinais. Cientistas e universidades brasileiras estão
qualificados para o estudo das plantas brasileiras e o desenvolvimento de produtos fitoterápicos,
possibilitando, assim, que sejam disponibilizados à população plantas medicinais e fitoterápicos
com qualidade, segurança e eficácia. No Brasil, os trabalhos científicos com plantas tem tido grande
aumento nos últimos dez anos, estimando-se que em torno de cinco mil estudos estejam em
andamento atualmente (CRF-SP, 2009).
Em 2006, o Ministério da Saúde publicou o texto A fitoterapia no SUS e o Programa de
Pesquisas de Plantas Medicinais da Central de Medicamentos. Esse leva em conta a recomendação
da Organização Mundial de Saúde (OMS), que sugere a adoção das práticas tradicionais com
comprovada eficácia, como ferramenta para manutenção das condições de saúde. Com isso, aponta
a urgente necessidade de implantação de uma política nacional que contemple diretrizes e ações
voltadas à inserção das Plantas Medicinais e da Fitoterapia no Sistema Único de Saúde (SUS) e de
21
regulamentação sanitária específica para o setor de produção pública de preparações fitoterápicas, o
que proporcionará a uniformização dos padrões de produção e fornecimento de plantas medicinais e
fitoterápicos e assegurará, assim, a qualidade nos serviços e insumos disponíveis aos usuários do
SUS (Ministério da Saúde, 2006).
Ainda assim, grande parte desse patrimônio natural permanece desconhecido, tornando
evidente a ampla necessidade de explorar a diversidade de produtos naturais brasileiros, através do
estudo fitoquímico e biológico de suas espécies. Isso ressalta a importância da promoção do uso
racional das plantas medicinais e dos fitoterápicos, uma vez que são tradicionalmente e comumente
utilizados pela população, garantindo seu uso correto, com segurança e eficácia.
“A regulação do uso de plantas medicinais tradicionais personifica três aspectos
fundamentais: qualidade, segurança e eficácia” (SPRINGFIELD et al., 2005). Esse trabalho aborda
o estudo da qualidade, através da avaliação da estabilidade do extrato etanólico de L. trichocarpha
Spreng.
22
II – OBJETIVOS
23
II.1 – OBJETIVO GERAL
Avaliar a estabilidade do extrato etanólico seco das partes aéreas de Lychnophora
trichocarpha Spreng sob diferentes condições de temperatura para o desenvolvimento de um
potencial fitoterápico.
II.2 – OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Obter o extrato etanólico de L. trichocarpha Spreng;
 Desenvolver e validar metodologia para quantificação de eremantolida C de licnofolida em
extrato vegetal de L. trichocarpha Spreng;
 Aplicar a metodologia desenvolvida para gerar boa impressão digital do extrato vegetal de
L. trichocarpha Spreng;
 Realizar o estudo de estabilidade do extrato etanólico seco de L. trichocarpha Spreng sob
diferentes condições de temperatura;
 Realizar o estudo de estabilidade da eremantolida C sob diferentes condições de temperatura
e sob condições de degradação forçada;
 Realizar o estudo de fotoestabilidade do extrato etanólico seco de L. trichocarpha Spreng e
da eremantolida C;
 Avaliar a adequação da estabilidade do extrato etanólico seco de L. trichocarpha Spreng
para o desenvolvimento de um potencial fitoterápico.
24
III – REVISÃO
BIBLIOGRÁFICA
25
III.1 – Família Asteraceae
Dentre as plantas que vêm sendo estudadas visando à obtenção de atividade farmacêutica,
cabe ressaltar as espécies pertencentes à família Asteraceae, que possui distribuição cosmopolita,
com aproximadamente 1600 gêneros e 23000 espécies. No Brasil, ocorrem aproximadamente 300
gêneros e 2000 espécies. Diversas plantas medicinais pertencem a essa família, destacando-se a
carqueja (Baccharis trimera Less. e outras espécies desse gênero), a camomila (Matricaria recutita
L.), o guaco (Mikania spp. Willd), a estévia (Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni) e a mil-folhas
(Achillea millefolium L.). Outras espécies dessa família têm importância, como ornamentais,
comestíveis ou plantas invasoras (SOUZA et al., 2005).
As espécies da família Asteraceae são particularmente comuns nas formações abertas do
Brasil, principalmente no cerrado, onde se destacam os gêneros Calea e Aspilia. Nos campos, são
freqüentes Vernonia, Baccharis e Senecio. Nos campos rupestres um dos elementos de maior
destaque é o gênero Lychnophora, com porte geralmente arbustivo e folhas rígidas. No interior das
florestas densas, as espécies da família Asteraceae são pouco comuns e apenas alguns gêneros,
como Adenostemma, podem ser encontrados. Em florestas secundárias, as Asteraceas podem ser
relativamente comuns, especialmente espécies arbustivas e arbóreas de Vernonia (SOUZA et al.,
2005).
III.2 – O Gênero Lychnophora
O gênero Lychnophora Martius é um dos sete gêneros da subtribo Lychnophorinae (tribo
Vernoniaeae, Asteraceae) (BOHLMANN; JAKUPOVIC, 1990). É amplamente distribuído no
Brasil, sendo endêmico do Planalto Brasileiro, e algumas de suas espécies são popularmente
conhecidas como “arnica“, “falsa arnica” ou “arnica da serra” (CERQUEIRA et al., 1987). As
espécies são características de campos rupestres, ocorrendo principalmente nos estados de Minas
Gerais, Bahia e Goiás (BOHLMANN; JAKUPOVIC, 1990). São utilizadas na medicina popular
como preparações alcoólicas e hidroalcóolicas, embebidas em álcool ou cachaça, para os
tratamentos de dor, inflamação, reumatismos, contusões e picadas de insetos (SAÚDEGUIMARÃES et al., 1998).
O perfil químico desse gênero é basicamente caracterizado pela ocorrência de
sesquiterpenos, diterpenos, triterpenos, lactonas sesquiterpênicas, flavonoides, esteroides e
poliacetilenos (BORELLA et al., 1998). Também foram detectados açúcares, taninos e ácidos
graxos de cadeia longa e seus ésteres, e a ausência de arilpropanóides e derivados da phidroxiacetofenona é característica da tribo Vernoniaeae (BOHLMANN e JAKUPOVIC, 1990).
26
Estudos realizados com espécies desse gênero levaram ao isolamento de lactonas sesquiterpênicas
com atividades biológicas (COILE et al., 1981; VICHNEWSKI et al., 1989; BORELLA et al.,
1992; da COSTA et al., 1993).
É constante entre as espécies do gênero Lychnophora a ocorrência de lactonas
sesquiterpênicas, principalmente as dos tipos goiazensolida, eremantolida e guaianolida. Por isso, as
substâncias dessa classe são consideradas marcadores químicos deste (BORELLA et al., 1998;
SAKAMOTO et al., 2003). Segundo a Resolução RDC No. 48, de 16 de março de 2004, da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), marcadores químicos são componentes ou classe de
compostos químicos (ex: alcaloides, flavonoides, ácidos graxos, etc.) presentes na matéria-prima
vegetal, idealmente o próprio princípio ativo, e preferencialmente que tenha correlação com o efeito
terapêutico, que é utilizado como referência no controle de qualidade da matéria-prima vegetal e
dos medicamentos fitoterápicos (BRASIL, 2004).
Dentre algumas espécies desse gênero cujo perfil fitoquímico já foi avaliado, diversas
substâncias pertencentes a diferentes classes de metabólitos secundários foram identificadas. Para o
gênero Lychnophora, merece destaque o grupo das lactonas sesquiterpênicas, consideradas seus
marcadores químicos e isoladas a partir de suas espécies (Quadro 1):
27
Quadro 1 – Espécies do gênero Lychnophora e algumas substâncias isoladas a partir delas,
mostrando que as lactonas sesquiterpênicas são os marcadores químicos do gênero.
Planta
Substâncias já isoladas (marcadores químicos)
L. reticulada Gardn

15-desoxigoiazensolida;

8-(2-metilpropanoiloxi)-4-hidroxi-1-oxoeudesma-2,7(11)-dien-6,12olida;

8-(2-metilpropenoiloxi)-4-hidroxi-1-oxoeudesma-2,7(11)-dien-6,12olida.
(ALVES et al., 2008)
L. rupestris Semir & 

Leitão Filho
Licnofolida;
15-acetoxieremantolida C.
(CUNHA et al., 1995)
L. ericoides Mart

Centraterina

Eremantolida A

2’-3’-epoxi-15-goiazensolida

(4R, 5S, 6S, 7S, 8S, 10R, 11S, 16R)-diidroeremantolida A
(BORELLA et al., 1998).
L. pseudovillosissima 
Semir & Leitão Filho

15-desoxigoiazensolida;
Licnofolida.
(BORELLA et al., 1998).
L.
markgravii 

Barroso
15-desoxigoiazensolida;
8α-tiglinoiloxigoianzensolida.
(SARTORI et al., 2002).
L.
passerina 
(Mart. ex. DC) Gardn
Costunolida;

Diidrocostuslactona;

11β,13diidroeremantina;

Goiazensolida.
(BOHLMANN et al., 1981; OLIVEIRA et al., 1996).
L.
Spreng
trichocarpha 

Eremantolida C;
Licnofolida.
(SAÚDE-GUIMARÃES et al., 1998).
III.3 – A Espécie Lychnophora trichocarpha Spreng
28
III.3.a – Perfil Químico de L. trichocarpha Spreng
Estudos fitoquímicos das partes aéreas de Lychnophora trichocarpha revelaram a
identificação dos seguintes constituintes: friedelina, lupeol, β-sitosterol, estigmasterol, α-amirina e
β-amirina, além das lactonas sesquiterpênicas eremantolida C e licnofolida. Também foram
detectados
açúcares
redutores,
hidrocarbonetos,
ésteres
graxos,
flavonoides,
lactonas
sesquiterpênicas e saponinas (SAÚDE-GUIMARÃES et al., 1998).
Estudo realizado por Ferrari (2008) com a fração acetato de etila, obtida a partir do extrato
etanólico de L. trichocarpha, levou ao isolamento de eremantolida C, licnofolida, sitosterol e
lupeol, constituintes químicos responsáveis pela atividade anti-inflamatória da fração estudada.
O conhecimento dos componentes químicos de cada espécie é de grande importância, uma
vez que diferentes substâncias podem exercer sinergismo nas atividades biológicas exercidas pela
planta, causar efeitos tóxicos ou mesmo afetar a estabilidade do extrato ou de alguma forma
farmacêutica que possa ser proposta para incorporar essa matéria-prima vegetal. Além disso, o
conhecimento da constituição química de uma espécie vegetal possibilita a determinação de seus
marcadores químicos, o que é de fundamental importância para o desenvolvimento de metodologias
analíticas para o controle de qualidade de extratos vegetais utilizados como matérias-primas para
medicamentos fitoterápicos.
III.3.b - Atividades Biológicas de Lychnophora
Algumas plantas do gênero Lychnophora são utilizadas na medicina popular como agentes
analgésicos e anti-inflamatórios (CERQUEIRA et al., 1987). As espécies que já foram estudadas
química e biologicamente não apenas justificaram o uso popular (RÜNGELER et al., 1999;
GOBBO-NETO et al., 2005; SANTOS et al., 2005), mas também demonstraram outras importantes
atividades como tripanossomicida (OLIVEIRA et al., 1996; GRAEL et al., 2005), citotóxica
(SANTOS et al., 2004a,b) e antimicrobicida (JORDÃO et al., 1997; SAÚDE-GUIMARÃES et al.,
2002).
A triagem de 45 espécies de plantas da família Asteraceae para atividade anti T. cruzi foi
realizada, dentre as quais encontravam-se algumas espécies do gênero Lychnophora. As espécies L.
villosissima, L. trichocarpha, L. pinaster e L. passerina, mostraram atividade significativa (CHIARI
et al., 1996). Em outro estudo realizado por Oliveira e colaboradores (1996), foram investigados os
componentes químicos responsáveis pela atividade tripanossomicida nas espécies L. passerina, L.
trichocarpha e L. pinaster. Essa atividade foi atribuída às lactonas sesquiterpênicas goyazensolida
29
para L. passerina, eremantolida C e licnofolida para L. trichocarpha e ao ácido licnofórico para L.
pinaster.
Para as espécies L. trichocarpha, L. pinaster, L. ericoides, L. passerina e L. staavioides
foram realizadas a avaliação da atividade de inibição da xantina oxidase, enzima que catalisa o
metabolismo da hipoxantina e xantina a ácido úrico. Todas as espécies testadas exibiram atividade
significativa (FERRAZ FILHA et al., 2006).
A atividade anti-inflamatória e antinociceptiva do extrato etanólico de cinco espécies do
gênero Lychnophora foi avaliada através do teste do edema de pata induzido por carragenina em
camundongos. As pomadas contendo os extratos etanólicos de L. trichocarpha, L. pinaster, L.
ericoides e L. passerina promoveram redução significativa do edema de pata, comprovando a
atividade anti-inflamatória destas espécies. As atividades farmacológicas foram estatisticamente
similares à atividade do padrão utilizado, diclofenaco emulgel (GUZZO et al., 2008).
Em outro estudo, a atividade anti-inflamatória do extrato etanólico de L. trichocarpha, de
frações e substâncias isoladas foi avaliada através do teste do edema de pata induzido por
carragenina em camundongos. As pomadas contendo o extrato etanólico, a fração e acetato de etila
e as substâncias eremantolida C, licnofolida, β-sitosterol e lupeol demonstraram significativa
atividade. Esses resultados sugeriram que a atividade anti-inflamatória do extrato se deve à ação
sinérgica desses componentes (FERRARI, 2008).
Libertino e colaboradores (2009) avaliaram possíveis efeitos cardiovasculares do extrato de
L. trichocarpha por administração intragástrica em ratos. Não foram observadas diferenças
significativas entre o grupo tratado com o extrato e o grupo controle, assim, concluiu-se que a
administração do extrato não afeta parâmetros ou reflexos cardiovasculares basais.
Em outro estudo, Libertino e colaboradores (2010) investigaram se a administração
intragástrica do extrato etanólico de L. trichocarpha poderia alterar a pressão arterial média e a
frequência cardíaca de ratos normotensos e hipertensos. Os resultados obtidos nesse estudo
sugeriram um efeito anti-hipertensivo do extrato nos animais com hipertensão renovascular, mas
não nos normotensos, e a frequência cardíaca dos animais dos dois grupos não sofreu alteração pela
administração desse extrato.
III.3.c – Toxicidade de Lychnophora trichocarpha Spreng
A toxicidade do extrato etanólico de L. trichocarpha foi investigada em camundongos por
Ferrari (2008), avaliando a letalidade, atividade motora e força muscular, consumo médio de
alimento e variação do peso corporal, parâmetros bioquímicos, peso úmido dos órgãos e
histopatologia. Foi demonstrado que o extrato é tóxico por via intraperitonial. Na avaliação da
30
toxicidade aguda foram observadas alterações da atividade locomotora e da capacidade exploratória
dos animais, redução do consumo de alimento e do peso corporal. Nas análises histopatológicas dos
rins e fígado foram observadas congestão e inflamação, e também foram detectadas alterações
pulmonares e cerebrais. Esse estudo demonstrou que a utilização sistêmica do extrato não é segura,
sendo apenas a via tópica adequada para o tratamento de processos inflamatórios.
Paula e colaboradores (2009) avaliaram as alterações induzidas pelo extrato etanólico de L.
trichocarpha Spreng na pressão arterial sistólica e diastólica, e nos parâmetros do
eletrocardiograma: frequência cardíaca, complexo QRS e intervalos PR, QT e QTc em ratos. Os
resultados demonstraram que a administração do extrato induziu aumento significativo da pressão
arterial quando comparado com o grupo controle, e nos demais parâmetros cardiovasculares
analisados não foram observadas diferenças significativas entre os dois grupos. Os resultados
sugerem que o extrato bruto de L. trichocarpha induz atividade hipertensiva, indicando que o uso
oral dessa espécie não é seguro.
III.4 – Lactonas Sesquiterpênicas
Conforme descrito anteriormente, lactonas sesquiterpênicas são consideradas marcadores
químicos do gênero Lychnophora.
O quadro a seguir mostra as estruturas químicas de algumas lactonas sesquiterpênicas e as
espécies do gênero Lychnophora das quais já foram isoladas (Quadro 2):
31
Quadro 2 – Exemplos de lactonas sesquiterpênicas isoladas de Lychnophoras.
Lactona sesquiterpênica
Espécies de Lychnophora das quais já foram isoladas
L. pseudovillosissima Semir & Leitão Filho (BORELLA et al.,
O
O
1998);
O
O
O
L. markgravii Barroso (SARTORI et al., 2002);
O
15-desoxigoiazensolida
L. reticulata Gardn. (ALVES et al., 2008).
L. rupestris Semir & Leitão Filho (CUNHA et al., 1995).
O
OH
O
O
O
O
OAc
15-acetoxieremantolida C
L. diamantiana Coile & Jones (DA COSTA et al., 1992);
O
O
L. ericoides Mart. (BORELLA et al., 1998).
O
O
O
O
OH
Centraterina (licnoforolida A)
L. ericoides Mart (BORELLA et al., 1998).
O
OH
O
O
O
O
Eremantolida A
L. ericoides Mart. (BORELLA et al., 1998);
O
O
L. rupestris Semir & Leitão Filho (CUNHA et al., 1995);
O
O
O
O
L. trichocarpha Spreng (SAÚDE., 1994).
Licnofolida
L. markgravii Barroso (SARTORI et al., 2002).
O
O
O
O
O
O
OH
8α-tiglinoiloxigoianzensolida
L. rupestris Semir & Leitão Filho (CUNHA et al., 1995);
O
OH
O
L. trichocarpha Spreng (SAÚDE, 1994).
O
O
O
Eremantolida C
32
III.5 - Qualidade de Extratos Vegetais
Para garantir a atividade, o material vegetal deve ser submetido a controle de qualidade
adequado. Alguns testes frequentemente utilizados para esse fim são solubilidade, teor de cinzas
sulfatadas, solventes orgânicos residuais totais, contaminação microbiológica, aflatoxinas, presença
de pesticidas, reações para detecção da presença de grupos funcionais específicos, determinação de
pH, teor de metais pesados e tamanho de partícula. A maioria desses testes já está descrita em
Farmacopéias, não sendo específicos para cada espécie vegetal (BEEK et al., 2009).
Para garantir a qualidade, segurança e eficácia de plantas medicinais, seus derivados e
produtos fitoterápicos, estes devem ser caracterizados através de sua constituição química, ou de
suas atividades farmacológicas. Para tanto, a opção mais segura é identificar e determinar a
concentração das substâncias ativas ou classes destas, mas isso nem sempre é possível devido à
grande variedade química de componentes do extrato. Assim, uma boa alternativa é usar
substâncias marcadoras (SIMÕES, 2003).
A questão da qualidade de fitoterápicos já vem sendo levantada há algum tempo. Em 1985,
Farias e colaboradores discutiram o problema da qualidade de fitoterápicos e apontaram a
importância da pesquisa acadêmica para a sua melhoria; esse trabalho também avalia um conjunto
de fatores que influenciam na qualidade do produto, tais como características da matéria-prima,
controle do processamento e da forma farmacêutica, a embalagem, e até mesmo a bula e a
propaganda (FARIAS et al., 1985). Hoje, a questão ganha destaque, uma vez que é necessário
atender às demandas do mercado e às crescentes exigências dos consumidores e dos órgãos de
fiscalização, cada vez mais severos, tanto pela aprovação de novas legislações como pelo aumento
da fiscalização e exigência do cumprimento dessas legislações.
Apesar do uso popular de L. trichocarpha Spreng como agente anti-inflamatório e dos
estudos que comprovam essa atividade, não foram encontrados relatos na literatura sobre estudos da
estabilidade desse extrato, tampouco foram determinados os procedimentos de controle de
qualidade da droga vegetal, do extrato etanólico nem das possíveis formas farmacêuticas de uso
tópico que poderiam veicular esse extrato. O foco principal desse estudo é a análise da estabilidade
do extrato etanólico seco das partes aéreas de L. trichocarpha, através de indicadores como o teor
dos marcadores químicos, a impressão digital do extrato e o possível surgimento de produtos de
degradação, como parâmetro para avaliar a sua qualidade. Assim, torna-se evidente a necessidade
de desenvolver e validar uma metodologia que permita avaliar a qualidade e a estabilidade do
extrato.
III.6 - Validação de Metodologias Analíticas
33
Métodos analíticos destinados a avaliar a qualidade de substâncias ou produtos devem
cumprir a etapa de validação, ou seja, o monitoramento analítico do produto farmacêutico ou de
alguma substância nele presente. Validar um processo é estabelecer evidências que provam que,
com alto grau de confiança, esse processo produzirá produtos de acordo com as especificações prédeterminadas e a qualidade adequada (SWARTZ; KRULL, 1998; BRENDOLAN, 2000).
A validação é a etapa pela qual é demonstrado, através de uma série de estudos, que as
características de execução do método atendem às exigências das aplicações analíticas propostas, o
que garante resultados reprodutíveis, confiáveis e adequados aos fins para os quais são destinados
(SWARTZ; KRULL, 1998; BRENDOLAN, 2000).
Ribani e colaboradores (2004) fizeram uma revisão sobre validação em métodos
cromatográficos e eletroforéticos, utilizando legislações de organizações nacionais, como ANVISA
e INMETRO (Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial), e
internacionais como ICH (“International Conference on Harmonization”), IUPAC (“International
Union of Pure and Applied Chemistry”) e US-FDA (“United States Food and Drug
Administration”). Segundo esse trabalho, os estudos de validação devem ser representativos e
conduzidos de modo a adequar a variação da faixa de concentração e os tipos de amostras, além da
freqüência de utilização do método. Os parâmetros analíticos devem ser avaliados de acordo com a
intenção do uso, ou seja, os experimentos devem ser direcionados ao que realmente é necessário. De
acordo com os autores, os parâmetros normalmente avaliados na validação de métodos analíticos
são: seletividade, linearidade e faixa de aplicação, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de
quantificação e robustez (RIBANI et al., 2004).
III.6.a – Legislações e Recomendações sobre Validação
A Resolução RE no 899, de 29 de maio de 2003, da ANVISA, consiste no Guia para
Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos. Segundo esta resolução, a validação deve
assegurar, através de estudos experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações
analíticas, garantindo a confiabilidade dos resultados, e seu principal objetivo é demonstrar que o
método é apropriado para a finalidade pretendida. Para métodos bioanalíticos, essa resolução sugere
que sejam avaliados precisão, exatidão, linearidade, limite de detecção, limite de quantificação,
especificidade, reprodutibilidade, estabilidade e recuperação (BRASIL, 2003).
O INMETRO também publicou, em março de 2003, o DOQ-CGCRE-008, Orientações
sobre Validação de Métodos de Ensaios Químicos. Segundo esse documento, a validação
comprova, por meio de evidências objetivas, que os requisitos para aplicação ou usos específicos de
um método analítico foram atendidos (INMETRO, 2003).
34
III.6.b – Parâmetros de Validação
Para cada substância a ser analisada, tipo de método e finalidade do teste, as legislações
recomendam que sejam avaliados diferentes parâmetros de validação do método.
Os parâmetros de validação serão descritos a seguir, de acordo com as legislações brasileiras
(BRASIL, 2003; INMETRO, 2003) e de acordo com a revisão de Ribani e colaboradores (2004).
III.6.b.1 – Especificidade e Seletividade
Capacidade de determinar a medida exata de um composto mesmo quando outros
componentes estão presentes, como impurezas, produtos de degradação e componentes da matriz.
Para determiná-la, deve-se avaliar a substância de interesse junto com as impurezas, produtos de
degradação ou componentes da matriz, provando não haver interferências dos mesmos nos
resultados. Para métodos cromatográficos, deve-se garantir a pureza dos picos, por exemplo,
utilizando detectores de arranjo de diodo (DAD) ou espectrometria de massas (BRASIL, 2003).
Segundo Ribani, o termo especificidade não é adequado, porque significaria produzir
resposta para uma única substância de interesse, enquanto seletividade significa produzir resposta
para vários compostos químicos com uma característica em comum, mas capaz de distinguir a
resposta de um analito dos outros (RIBANI et al., 2004), por isso é o termo mais adequado e é o que
será adotado nesse trabalho.
Quando se trabalha com plantas medicinais, seus derivados e medicamentos fitoterápicos, a
avaliação da seletividade é dificultada porque, na maioria dos casos, não é possível obter a matriz
isenta das substâncias a serem analisadas, e, além disso, a matriz é extremamente complexa, com
grande diversidade de substâncias químicas.
Assim, podem ser necessárias avaliações de diferentes maneiras, como o método de adição
padrão, a avaliação por DAD e a submissão das amostras a degradação forçada por armazenamento
sob condições de estresse, a fim de detectar o surgimento de possíveis produtos de degradação
(BRASIL, 2003; INMETRO, 2003; RIBANI et al., 2004).
III.6.b.2 – Faixa Linear ou Intervalo de Trabalho
É a faixa de concentrações compreendida entre os limites de quantificação superior e
inferior do método. Em geral, origina-se do estudo de linearidade e sua determinação varia com a
aplicação do método (BRASIL, 2003).
35
A concentração teórica mais provável do analito deve, preferencialmente, estar no centro da
faixa de trabalho. Em âmbitos gerais, são necessários vários pontos de calibração para a sua
construção, de preferência mais que seis (INMETRO, 2003).
III.6.b.3 – Linearidade
Capacidade de uma metodologia analítica de obter resultados diretamente proporcionais à
concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo pré-determinado. Deve ser determinada
pela análise de, no mínimo, cinco concentrações, calculadas a partir da finalidade e da concentração
teórica do teste, e, através de tratamento estatístico por regressão linear. O método é considerado
linear se o coeficiente de correlação obtido (R) for maior ou igual a 0,99 (BRASIL, 2003) ou a 0,90
(INMETRO, 2003).
III.6.b.4 – Precisão
É a aproximação de resultados obtidos em uma série de medidas de uma amostragem
múltipla de uma mesma amostra, ou seja, a obtenção de resultados concordantes entre si (BRASIL,
2003; INMETRO, 2003). Pode ser expressa como desvio padrão ou desvio padrão relativo (DPR)
(coeficiente de variação) de uma série de medidas, conforme a equação abaixo (Equação 1):
Equação 1 – Equação utilizada para o cálculo da precisão de métodos analíticos (FONTE:
BRASIL, 2003).
DPR = DP x 100
CMD
DPR: desvio padrão relativo; DP: desvio padrão; CMD: concentração média determinada.
Não são aceitos valores de DPR superiores a 5% (BRASIL, 2003).
A precisão é avaliada em três níveis:
III.6.b.4.a – Repetibilidade ou Precisão Intra-corrida
Concordância entre os resultados dentro de um curto período de tempo, sendo o mesmo
analista e a mesma instrumentação. Deve ser avaliada a partir de três concentrações, baixa, média e
alta, com três réplicas cada, ou por seis determinações a 100% da concentração do teste (BRASIL,
2003).
36
III.6.b.4.b – Precisão Intermediária ou Precisão Inter-corridas
Concordância entre resultados encontrados no mesmo laboratório, mas em dias diferentes,
com analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes. Deve ser obtida a partir de três
concentrações, baixa, média e alta, com três réplicas cada ao longo de no mínimo dois dias distintos
(BRASIL, 2003).
III.6.b.4.c – Reprodutibilidade ou Precisão Inter-laboratorial
Concordância entre os resultados provenientes de laboratórios diferentes como em estudos
colaborativos, geralmente objetivando padronização de metodologia analítica, ou a inclusão de
metodologias em farmacopéias (BRASIL, 2003).
III.6.b.5 – Limite de Detecção
O limite de detecção (LD) é a menor quantidade do analito presente em uma amostra
possível de ser detectado, mas não necessariamente quantificado, sob condições experimentais prédeterminadas, sendo obtido através da análise de concentrações conhecidas e decrescentes do
analito, até o menor nível detectável. Para métodos experimentais, pode-se estimá-lo utilizando a
relação de três vezes o ruído da linha de base (BRASIL, 2003). Pode ser determinado pela equação
abaixo (Equação 2):
Equação 2 – Equação utilizada para o cálculo do LD de métodos analíticos (FONTE:
BRASIL, 2003).
LD = DPa x 3
IC
DPa: desvio padrão do intercepto do eixo Y de, no mínimo, três curvas de calibração
construídas contendo concentrações do fármaco ao suposto limite de quantificação; IC é a
inclinação da curva de calibração.
III.6.b.6 – Limite de Quantificação Inferior
O limite de quantificação inferior (LQI) é a menor quantidade do analito em uma amostra
que pode-se obter com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas.
Pode-se determiná-la por meio do ruído observado na linha de base, considerando como esse limite
37
a concentração que produz relação sinal-ruído superior a 10:1. Também pode ser estabelecido por
meio de análise de soluções contendo concentrações decrescentes do analito até o menor nível
determinável com precisão de 20% e exatidão de 80% a 120% (BRASIL, 2003). Pode também ser
determinado pela equação abaixo descrita (Equação 3):
Equação 3 – Equação utilizada para o cálculo do LQI de métodos analíticos (FONTE:
BRASIL, 2003).
LQI = DPa x 10
IC
DPa: desvio padrão do intercepto do eixo Y de, no mínimo, três curvas de calibração
construídas contendo concentrações do fármaco ao suposto limite de quantificação; IC é a
inclinação da curva de calibração.
III.6.b.7 – Exatidão
A exatidão do método é a proximidade dos resultados obtidos pelo método em relação ao
valor real. Para determiná-la, deve-se aplicar a metodologia analítica proposta na análise de uma
substância de pureza conhecida, um padrão de referência, ou comparar os resultados obtidos com os
resultados obtidos utilizando uma segunda metodologia bem caracterizada com a exatidão já
estabelecida. Deve ser avaliada partindo-se de, no mínimo, nove determinações, presentes no
intervalo linear, ou seja, três concentrações, baixa, média e alta com três réplicas cada, sendo
expressa pela relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a concentração
teórica correspondente. O desvio não deve exceder 15%, excetuando-se o limite de quantificação,
que pode atingir 20% (BRASIL, 2003).
III.6.b.8 – Recuperação dos Analitos
A recuperação determina a eficiência do procedimento de extração de um método analítico
dentro de um limite de variação. Recuperações de 100% do analito são ideais, entretanto valores
menores são aceitos, desde que haja recuperação precisa e exata. Deve ser obtida a partir de três
concentrações, baixa média e alta, comparando-se os resultados com soluções padrão não extraídas,
que representam 100% de recuperação, e o cálculo deve ser feito em função da relação do resultado
obtido para o padrão extraído e o não-extraído (BRASIL, 2003).
III.6.b.9 – Estabilidade das Soluções dos Padrões
38
Deve ser avaliada a estabilidade das soluções dos padrões mantidas à temperatura ambiente
por no mínimo seis horas após a preparação, ou caso haja congelamento ou resfriamento, avaliar a
estabilidade considerando a temperatura e o período de armazenamento. Os resultados encontrados
devem ser comparados àqueles obtidos por amostras recém-preparadas (BRASIL, 2003).
III.7 – Estabilidade de Produtos Farmacêuticos
Todos os fármacos estão sujeitos à decomposição, química, física ou microbiológica. As
principais reações envolvidas na degradação química são: hidrólise, oxidação, reações
fotoquímicas, isomerização e polimerização. O fator extrínseco de estabilidade está relacionado às
condições ambientais que podem favorecer ou acelerar a ocorrência dessas reações, por exemplo,
temperatura, umidade e luz. Também há o fator intrínseco de estabilidade, ou seja, a vulnerabilidade
da substância sofrer reações químicas, que pode ser monitorado pela avaliação das suas
propriedades físico-químicas. No caso de medicamentos, a grande importância dos processos de
degradação é o risco do comprometimento da eficácia e segurança (EV, 2000; GIL, 2007). A
eficácia pode ser comprometida pela diminuição do teor dos fármacos ou pelo comprometimento da
forma farmacêutica que provoque variação na sua porcentagem de cedência, culminando numa
menor absorção do fármaco pelo organismo. Já a segurança pode ser afetada se os produtos de
degradação que se formarem tiverem maior toxicidade que o fármaco em si, causando assim
maiores danos ao organismo.
“A estabilidade de um fármaco ou medicamento consiste na sua manutenção dentro de
especificações estabelecidas, tendo asseguradas sua identidade, potência, qualidade e pureza”
(BRASIL, 2005).
III.7.a – Estudos de Estabilidade
Os estudos de estabilidade são um conjunto de métodos qualitativos e quantitativos que têm
por finalidade avaliar o comportamento dos fármacos ou medicamentos que se alteram com o
tempo, por influência de fatores extrínsecos, e possibilitam também avaliar possíveis instabilidades
entre os componentes das formulações (GIL, 2007).
Esses estudos iniciam-se por testes acelerados, em que as amostras contidas em embalagens
impermeáveis ou semipermeáveis são submetidas à temperatura de 40°C e umidade relativa de
75%. Para a determinação do prazo de validade de um fármaco ou medicamento, devem ser
39
realizados estudos em longo prazo, em que as amostras são expostas à temperatura de 30°C e
umidade relativa de 75% (United States Pharmacopoea 27, 2003).
Os estudos de estabilidade fornecem indicações sobre o comportamento do produto, em
determinado intervalo de tempo, frente a condições a que possa ser submetido, ou seja, fornece
informações que indicam o grau de estabilidade relativa do produto nas variadas condições a que
possa estar sujeito, desde sua fabricação até o término de sua validade. A estabilidade é relativa,
uma vez que varia com o tempo e em função de fatores que aceleram ou retardam alterações ou
degradações no produto (ANVISA, 2004).
III.7.b – Legislação
III.7.b.1 – Resolução RE no 1, de 29 de julho de 2005, da ANVISA
No Brasil, os estudos de estabilidade de insumos farmacêuticos e medicamentos na indústria
farmacêutica devem ser procedidos de acordo com as recomendações da Resolução RE no 1, de 29
de julho de 2005, da ANVISA, que publica o Guia para a Realização de Estudos de Estabilidade,
visando orientar a realização dos testes de estabilidade de produtos farmacêuticos, com finalidade
de prever, determinar ou acompanhar seu prazo de validade (BRASIL, 2005).
Em relação aos estudos de estabilidade de produtos farmacêuticos, essa resolução fornece as
seguintes definições:

TESTE DE ESTABILIDADE: conjunto de testes projetados para obter informações sobre a
estabilidade de produtos farmacêuticos visando definir seu prazo de validade e período de
utilização em embalagem e condições de armazenamento especificadas.

ESTUDO DE ESTABILIDADE ACELERADA: estudo projetado para acelerar a
degradação química e/ou mudanças físicas de um produto farmacêutico em condições
forçadas de armazenamento. Os dados assim obtidos, juntamente com aqueles derivados dos
estudos de longa duração, podem ser usados para avaliar efeitos químicos e físicos
prolongados em condições não aceleradas e para avaliar o impacto de curtas exposições a
condições fora daquelas estabelecidas no rótulo do produto, que podem ocorrer durante o
transporte.

ESTUDO DE ESTABILIDADE DE ACOMPANHAMENTO: estudo realizado para
verificar se o produto farmacêutico mantém suas características físicas, químicas,
biológicas, e microbiológicas conforme os resultados obtidos nos estudos de estabilidade de
longa duração.
40

ESTUDO DE ESTABILIDADE DE LONGA DURAÇÃO: estudo projetado para verificar
as características físicas, químicas, biológicas e microbiológicas de um produto
farmacêutico durante e, opcionalmente, depois do prazo de validade esperado. Os resultados
são usados para estabelecer ou confirmar o prazo de validade e recomendar as condições de
armazenamento.

PRAZO DE VALIDADE: data limite para a utilização de um produto farmacêutico definida
pelo fabricante, com base nos seus respectivos testes de estabilidade, mantidas as condições
de armazenamento e transporte estabelecidos.
Segundo a Resolução RE no 1, de 29 de julho de 2005, o prazo de validade deve ser
determinado pelo estudo de estabilidade de longa duração, procedido conforme legislação em anexo
(Anexo a). Também é recomendado que os estudos de estabilidade sejam procedidos com o produto
em sua embalagem primária.
III.7.b.2 – Guia para Realização de Fotoestabilidade
Segundo a Resolução RE 1, de 29 de julho de 2005, da ANVISA, os estudos de
fotoestabilidade devem ser realizados de acordo com o Guia para Realização de Fotoestabilidade,
disponível no portal da ANVISA (ANVISA, 2011). Se não for apresentado o estudo de
fotoestabilidade de medicamento para o registro, deve haver justificativa técnica com evidência
científica de que os fármacos ou o produto não sofrem degradação pela luz ou de que a embalagem
primária não permite a passagem de luz (BRASIL, 2005).
Segundo esse guia, o teste de fotoestabilidade tem como objetivo demonstrar que a
exposição do produto à luz não provoca alterações significativas. As especificações para as opções
de fontes de luz, câmara para estudo de fotoestabilidade e recomendações de determinação do
tempo mínimo de exposição das amostras de acordo com o sistema actinométrico que devem ser
utilizadas na realização de estudos de fotoestabilidade estão disponíveis na recomendação em anexo
(Anexo b).
III.7.b.3 – Guia de Estabilidade de Produtos Cosméticos
Em 2004, a ANVISA disponibilizou o Guia de Estabilidade de Produtos Cosméticos
(ANVISA, 2004).
Segundo essa resolução, os seguintes aspectos devem ser considerados na estabilidade:
 Físicos: no final do estudo, as propriedades físicas originais do produto devem ser
conservadas;
41
 Químicos: a integridade da estrutura química, o teor dos componentes e outros parâmetros
devem ser mantidos dentro dos limites especificados;
 Microbiológicos: as características microbiológicas devem ser conservadas, conforme os
requisitos especificados;
 Funcionalidade: os atributos do produto devem ser mantidos sem afetar o fim a que se
destina.
 Segurança: alterações que influenciem a segurança de uso do produto não podem acontecer.
Quanto ao acondicionamento das amostras em estudo de estabilidade, esse guia recomenda
que sejam acondicionadas em frasco de vidro neutro, transparente, com tampa que garanta boa
vedação, e que haja espaço que permita a troca de gases.
III.7.c – Estabilidade de Produtos Naturais
Poucos relatos foram encontrados na literatura de trabalhos que avaliam a estabilidade de
produtos naturais.
Maciel e colaboradores (2006) avaliaram a estabilidade preliminar de tinturas de diferentes
espécies de arnicas, L. pinaster, L. rupestris e Arnica montana, em estufa climatizada a 30º C e 70%
de umidade relativa por 6 meses e em prateleira por 10 meses, visando avaliar a semelhança entre as
preparações e verificar as alterações sofridas com o tempo. A avaliação dos produtos ao final do
período de armazenamento demonstrou que os odores característicos apresentaram-se menos
intensos, houve diminuição do pH, houve redução das porcentagens de resíduo seco e as análises de
CLAE demonstraram a degradação dos marcadores químicos. Os resultados obtidos no estudo
indicaram haver instabilidade nas tinturas avaliadas ao longo do tempo.
Estudo realizado por Lima e colaboradores (2005) avaliou o efeito da luz e da temperatura
de congelamento sobre a estabilidade das antocianinas da pitanga roxa, Eugenia uniflora L., sendo
avaliada a polpa congelada nos tempos 0, 2, 4, 6 e 12 meses de estocagem, e comparando-se
amostras expostas e protegidas da luz, através da absorbância dos extratos. Nas amostras
congeladas, aconteceu degradação significativa das antocianinas nos 60 dias iniciais, não havendo
decréscimo no teor dessas substâncias nos meses subseqüentes. Quanto à exposição à luz, foi
demonstrada maior instabilidade do extrato antociânico, em relação ao extrato armazenado
protegido da luz.
Bailoni e colaboradores (1998) avaliaram a estabilidade do extrato antociânico das folhas de
Acalipha híspida, exposto e protegido da luz, sob atmosfera de N2, e foram feitas leituras periódicas
das absorbâncias. Os resultados obtidos demonstraram que proteger o produto da luz diminui a
42
perda da cor original ao longo do tempo, e sugeriram que o armazenamento do produto a
temperaturas mais baixas também diminui essa perda.
Em outro estudo, Amaral e colaboradores (2009) avaliaram o teor de cumarina no xarope de
guaco sob diferentes temperaturas de armazenagem, como indicativo da sua estabilidade. A
cumarina é uma das substâncias que já foi isolada a partir dessa planta e está relacionada à sua
atividade anti-inflamatória e expectorante. O xarope foi preparado e armazenado sob diferentes
condições de temperatura, 10º C, temperatura ambiente, 37º C e 45º C, durante 5 meses. Os
resultados obtidos demonstraram variação de teor – aumentos e decréscimos - em todas as
temperaturas testadas, atribuídas a equilíbrio isomérico, ciclização do precursor e volatilização. Os
teores de cumarina variaram de 1,19 mg/mL a 1,37 mg/mL, em função do tempo e da temperatura.
A fotoestabilidade do extrato de folhas de Photomorphe umbellata L. Miq (pariparoba) foi
avaliada por Almeida e colaboradores (2008), por meio da avaliação do teor de 4-nerolidilcatecol,
sendo as amostras expostas à luz por 30, 60, 90 e 120 minutos. Houve pequena variação nos teores,
atribuída à evaporação do solvente, portanto, ficou demonstrado que o extrato se mantém estável
quando exposto à luz, nas condições estudadas.
A potencial atividade anti-inflamatória, exibida pelo extrato etanólico por via tópica, indica
que L. trichocarpha é uma espécie promissora para tornar-se um fitoterápico que possa ser utilizado
nos processos de inflamação, bem como ser fonte de substâncias que possam originar fármacos com
a mesma indicação. No entanto, apesar da fitoquímica bem estudada e das atividades terapêuticas já
conhecidas, não foram encontrados na literatura relatos sobre métodos analíticos de quantificação
dos marcadores químicos direto no extrato etanólico sem prévio fracionamento, tampouco sobre
estudos de estabilidade para esta espécie vegetal, nem como droga vegetal, extrato ou derivados e
nem como fitoterápico.
A realização dos estudos de estabilidade serve como instrumento preditivo de possíveis
desvios na eficácia e na segurança definidas para o produto, durante seu desenvolvimento. O prazo
de validade, caracterizado como o período de vida útil, durante o qual o produto mantém suas
características originais, além de ser um requisito legal, é um requisito técnico de qualidade, pois
um produto instável do ponto de vista físico-químico, microbiológico ou toxicológico, além da
perda de eficácia, poderá ter a segurança de uso diminuída e a confiabilidade comprometida frente
ao consumidor (ANVISA, 2004).
O trabalho de desenvolvimento de um método analítico parte da busca bibliográfica dos
métodos analíticos existentes para quantificação da substância de interesse ou, na sua ausência, de
estruturas químicas semelhantes. Após compilação das informações analíticas são propostas
alterações visando otimizar o método, diminuindo o tempo de análise, minimizando o emprego de
solventes orgânicos, obtendo melhor separação dos sinais cromatográficos e recuperação dos
43
analitos de interesse. A partir da quantificação de marcadores químicos e avaliação do decréscimo
de sua concentração em uma amostra em função do tempo é possível avaliar a estabilidade de
extratos e produtos de origem natural. O estudo de estabilidade tem grande importância para
qualquer produto farmacêutico, uma vez que possibilita determinar as condições de armazenamento
e período de uso nos quais o produto mantém suas características iniciais, garantindo a segurança e
eficácia durante determinado período. Para L. trichocarpha, o estudo de estabilidade significa uma
etapa a mais no desenvolvimento de um fitoterápico seguro e eficaz, que possa ser padronizado e
regulamentado, e, uma vez registrado, disponibilizado à população.
Considerando as atividades farmacológicas da L. trichocarpha já comprovadas, a fitoquímica já
bem estudada, a ocorrência da “arnica” em Minas Gerais e seu imenso uso popular no Estado e no país
e a importância dos estudos de estabilidade para garantir a qualidade do produto, bem como sua
segurança e eficácia, torna-se relevante o estudo mais aprofundado desta espécie vegetal no sentido de
se obter dados sobre a estabilidade de seu extrato etanólico e de se estabelecer uma metodologia para a
avaliação da qualidade deste extrato visando à obtenção de formulações eficazes e seguras que possam
ser utilizadas como medicamentos fitoterápicos.
44
VII – REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
45

ALMEIDA, R. L.; MIRANDA, D. V.; SAWADA, T. C. H.; BARROS, S. B. M.; ROPKE,
C. D. Padronização e determinação da fotoestabilidade do extrato de folhas de
Phothomorphe umbellata L. Miq (pariparoba) e avaliação da inibição in vitro de
metaloproteinases 2 e 9 na pele. Rev. Bras. Ciênc. Farm. v. 44, n. 1, p. 43-50 2008.

ALVES, K. C. M.; GOBBO-NETO, L.; LOPES, N. P. Sesquiterpene lactones and
flavonoids from Lychnophora reticulata Gardn. (Asteraceae). Biochem. System. Ecol. v. 36,
p. 434-436, 2008.

AMARAL, M. P. H.; VIEIRA, F. P.; LEITE, M. N.; AMARAL, L. H.; PINHEIRO, L. C.;
FONSECA, B. G.; PEREIRA, M. C. S.; VAREJAO, E. V. Determinação do teor de
cumarina no xarope de guaco armazenado em diferentes temperaturas. Rev. Bras.
Farmacogn. v. 19, n 2b, p. 607-611, 2009.

ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Guia de Estabilidade de Produtos
Cosméticos. Série Qualidade em Cosméticos, v. 1. Brasília, 2004. 52 p. Disponível em:
http://www.anvisa.gov.br/cosmeticos/guia_series.htm, acesso em 03/05/2011.

ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Recomendação de Fotoestabilidade.
Disponível em: http://www.anvisa.gov.br/medicamentos/recomenda/fotoestabilidade.pdf , acesso
em 03/05/2011.

BAILONI, M. A.; BOBBIO, P. A.; BIBBIO, F. A. Preparação e estabilidade do extrato
antociânico das folhas da Acalipha híspida. Ciênc. Tecn. Alim. v. 18, n 1, 1998.

BEEK, T. A.; MONTORO, P. Chemical analysis and quality control of Ginkgo biloba
leaves, extracts and phytopharmaceuticals. J. Chrom. A. v. 1216, p. 2002, 2009.

BILIA, A. R.; BERGONZI, M. C.; MORGENNI, F.; MAZZI, G.; VINCIERI, F. F.
Evaluation of chemical stability of St. John’s wort commercial extract and some
preparations. Int. J. Pharm. v. 213, p. 199-208, 2001.
 BOHLMANN, F. E.; JAKUPOVIC, J. Progress in the chemistry of the Vernoniae
(Compositae). Pl. Syst. Ecol. Suppl. v. 4, p. 3-43, 1990.

BOHLMANN, F.; MÜLLER, L.; KING, R.M.; ROBINSON, H. A guaianolide and other
constituents from Lychnophora species. Phytochem. v. 20, n. 5, p. 1149-1151, 1981.

BOHLMANN, F.; ZDERO, C.; KING, R. M.; ROBINSON, H. Sesquiterpene lactones from
Eremanthus species. Phytochem. v. 19, p. 2663-2668, 1980.

BORELLA, J. C.; LOPES, J. L. C.; LEITÃO FILHO, H. D.; SEMIR, J.; DIAZ, J. G.;
HERZ,
W.
Eudesmanolides
and
15-deoxygoyazensolide
from
Lychnophora
pseudovilosissima. Phytochem. v. 31, n.2, p. 692-695, 1992.
46

BORELLA, J. C.; LOPES, J. L. C.; VICHNEWSKI, W.; CUNHA, W. R.; HERZ, W.
Sesquiterpene lactones, triterpenes and flavones from Lychnophora ericoides and
Lychnoplora pseudovillosissima. Biochem. Syst. Ecol, v. 26, n. 1, p. 671-676, 1998.
 BRASIL. Resolução RDC Nº. 48, de 16 de março de 2004: Dispõe sobre o registro de
medicamentos
fitoterápicos.
Disponível
em:
http://e-
legis.anvisa.gov.br/leisref/public/showAct.php?id=10230&word=registro%20de%20medica
mentos%20fitoter%C3%A1picos. Acesso em: 22 maio 2009.
 BRASIL. Resolução RDC Nº. 899, de 29 de maio de 2003: “Guia para validação de
métodos
analíticos
e
bioanalíticos”.
Disponível
em:
http://e-
legis.bvs.br/leisref/public/showAct.php?id=1237&word. Acesso em: 10 jun 2009.
 BRASIL. Resolução RE Nº. 1, de 29 de julho de 2005: Guia para a realização de estudos de
estabilidade.
Disponível
em:
http://e-
legis.anvisa.gov.br/leisref/public/showAct.php?id=18109&word=guia%20de%20estabilidad
e. Acesso em: 22 maio 2009.
 BRENDOLAN, G. Validação de Métodos Cromatográficos. Pedreira: SGB Consultoria
Química Ltda, 2000, 72p, Apostila.
 CALIXTO, J. B. Biodiversidade como fonte de medicamento. Cienc. Cult. São Paulo, v.55,
n. 3, p. 37-39, 2003.
 CARVALHO, A. C. B.; BALBINO, E. E.; MACIEL, A.; PERFEITO, J. P. S. Situação do
registro de medicamentos fitoterápicos no Brasil. Rev. Bras. Farmacogn. v. 18, n. 2. p. 314319, 2008.

CERQUEIRA, M.B.S.; SOUZA, J.T.; AMADO JÚNIOR, R.; PEIXOTO, A.B.F. Ação
analgésica do extrato bruto aquoso do caule e das folhas da Lychnophora ericoides Mart.
(arnica). Cienc. Cult. v. 39, n. 5/6, p. 551-583, 1987.

CHIARI, E.; PERRY, K. S. P.; SAÚDE, D. A.; CRISTINA-DUARTE, D. S.; RASLAN, D.
S.; BOAVENTURA, M. A. D.; GRANDI, T. S. M.; STEHMANN, J. R.; ANJOS, A. M. G.;
OLIVEIRA, A. B. Seleção in vitro de espécies vegetais de Asteraceae contra o
Trypanosoma cruzi. Phytother. Res. v. 10, p. 636-638, 1996.

COILE, N. C.; JONES, S. B. Lychnophora (Compositae: Vernonieae), a genus endemic to
the Brasilian Planalto. Brittonia. v. 33, n.4, p. 528-542, 1981.

CRF-SP. Comissão Assessora de Fitoterapia do Conselho Regional de Farmácia do Estado
de São Paulo. Julho de 2009. Disponível no site http://www.crfsp.org.br/joomla/index.php,
acesso em 14 de dezembro de 2010.
47

CUNHA, W. R.; LOPES. J. L. C.; VICHNEWSKI, W., DiAZ, J.; HERZ, W.
Eremantholides and a guaianolide from Lychnophora rupestris. Phytochem. v. 39, n. 2, p.
387-389, 1995.

DA COSTA, F. B.; DIAS, D. A. Constituintes químicos de Lychnophora diamantiana Coile
& Jones. In: REUNIÃO ANUAL DA SBQ, 15, 1992. Caxambu, Resumos..., [s.n.], p.70,
1992.

DA COSTA, F. B.; DIAS, D. A.; LOPES, J. L. C.; VICHNEWSKI, W. Flavonoids and
heliangolides from Lychnophora diamantiana. Phytochem. v. 34, p. 261, 1993.

EV, L. S. Estabilidade de Medicamentos. In: Maria José V. de Magalhães Gomes; Adriano
Max Moreira Reis. (Org.). Ciências Farmacêuticas. Uma Abordagem em Farmácia
Hospitalar. São Paulo: Atheneu, p. 235-251, 2000.

FARIAS, M. R.; SCHENKEL, E. P.; BERGOLD, A. M.; PETROVICK, P. R. O problema
da qualidade dos fitoterápicos. Cad. Farm. UFRGS, v. 1, n. 2, p. 73-82, 1985.

Febrafarma
2007.
Fitoterápico
atrai
investimentos.
Disponível
em
http://www.febrafarma.org.br/areas.php?area=pu&secao=38&modulo=materiais. Acesso em
agosto de 2007.
 FERRARI, F. C. Estudo fitoquímico da fração acetato de etila, avaliação da atividade antiinflamatória in vitro e in vivo e da toxicidade em camundongos de Lychnophora
trichocarpha Spreng. 2008. Dissertação (Mestrado em ciências Farmacêuticas) - UFOP,
Ouro Preto, MG. 2008.

FERRAZ FILHA, Z. S.; VITOLO, I. F.; FIETTO, L. G.; LOMBARDI, J. A.; SAÚDEGUIMARÃES, D. A.. Xanthine oxidase inhibitory activity of Lychnophora species from
Brazil (“Arnica”). J. Ethnopharm. v. 107, n. 1, p. 79-82, 2006.

GIL, E.S. Controle físico-químico de qualidade de medicamentos. São Paulo: Pharmabooks,
2007.

GOBBO-NETO, L.; LOPES, N. P. Online identification of chlorogenic acids, sesquiterpene
lactones, and flavonoids in the Brazilian arnica Lychnophora ericoides Mart. (Asteraceae)
leaves by HPLC-DAD-MS and HPLC-DAD-MS/MS and a validated method for their
simultaneous analysis. J. Agric. Food Chem. v. 56, n. 4, p. 1193-1204, 2008.

GOBBO-NETO, L.; SANTOS, M. D.; KANASHIRO, A.; LUCISANO-VALIM, Y. M.;
LOPES, J. L. C.; ALMEIDA, M. C.; SOUZA, G. E. P., LOPES, N. P. Evaluation of the
anti-inflammatory and antioxidant activities – C-glucosylflavones from Lychnophora
ericoides (Asteraceae). Planta Med. v. 71, n. 1, p. 3, 2005.
48

GRAEL, C.F.F.; ALBUQUERQUE, S.; LOPES, J.L.C. Chemical constituentes from
Lychnophora pohlii and trypanocidal activity of crude plant extracts and isolated
compounds. Fitoter. v. 76, n. 1, p. 73-82, 2005.

GUZZO, L. S.; SAÚDE-GUIMARÃES, D. A.; SILVA, A. C. A.; LOMBARDI, J. A.;
GUIMARÃES, H. N.; GRABE-GUIMARÃES, A. Antinociceptive and anti-inflammatory
activities of ethanolic extracts of Lychnophora species. J. Ethnopharm. v. 116, p. 120–124,
2008.

HERZ, W.; GOEDKEN, V. L. Structure of goyazensolide and its congeners. J. Org. Chem.
v. 47, p. 2798-2800, 1982.

INMETRO - Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial.
Orientações sobre Validação de Métodos de Ensaios Químicos. DOQ-CGCRE-008. 2003.

JORDÃO, C. O.; LOPES, J. L. C.; ALBUQUERQUE, S.; VICHNEWSKI, W. Biological
activity of the crude extracts and isolated substances from Lychnophora salicifolia Mart.
Boll. Chim. Farm. v. 136, p. 56, 1997.

LE QUESNE, P. W.; LEVERY, S. B.; MENACHERY, M. D.; BRENNAN, T. F.;
RAFFAUF, R. F. Novel modified germacranolides and other constituents of Eremanthus
elaegnus Schultz-Bip. (Compositae). J. C. S. Perkin I, p. 1572-1580, 1978.

LIBERTINO, M. V. S.; ALZAMORA, A. C.; SOARES, E. R.; SAÚDE-GUIMARÃES, D.
A.; MACHADO, R. P.; OLIVEIRA, L. B. No cardiovascular effects observed after
intragastric adminstration of Lychnophora trichocarpha in unanesthetized rats. In: FESBE,
2009, Águas de Lindóia. Anais da FESBE, 2009, v. 1, p. 1-1.

LIBERTINO, M. V. S. L.; ALZAMORA, A. C.; SOARES, E. R.; SAÚDE-GUIMARÃES,
D. A.; MACHADO, R. P.; OLIVEIRA, L. B. Efeito anti-hipertensivo do extrato de
Lychnophora trichocarpha (arnica) em ratos com hipertensão renovascular. In: XVIII
SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA DA UFOP, 2010, Ouro Preto. Anais.... Ouro
Preto : UFOP, 2010.

LIMA, V. L. A. G.; MELO, E. A.; LIMA, D. E. S. Efeito da luz e da temperatura de
congelamento sobre a estabilidade das antocianinas da pitanga roxa. Ciênc. Tecnol. Alim.
Campinas, v. 25, n. 1, p. 92-94, 2005.

MACIEL, R. L.; MOREIRA-CAMPOS, L. M.; SILVA, B. C.; BRANDAO, M. G. L.
Características físico-químicas e químicas e estudo preliminar de estabilidade de tinturas
preparadas com espécies de arnica Lychnophora em comparação com Arnica montana. Rev.
Bras. Farmacogn. João Pessoa, v. 16, n. 1, p. 99-104, 2006.

MINISTÉRIO DA SAÚDE. A fitoterapia no SUS e o Programa de Pesquisas de Plantas
Medicinais da Central de Medicamentos. Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos
49
Estratégicos. Departamento de Assistência Farmacêutica e Insumos Estratégicos. Série B.
Textos Básicos de Saúde. Brasília, 149 p., 1ª ed., 2006.

MOHAMMADI, A.; MEHRAMIZI, F.; MOGHADDAM, A.; ERFANI-JABARIAN, L.;
POURFARZIB, M.; KASHANI, H. N. Development and validation of a stability-indicating
high performance liquid chromatographic (HPLC) assay for biperiden in bulk form and
pharmaceutical dosage forms. J. Chromat. B. v. 854, p. 157-157, 2007.

OLIVEIRA, A. B.; SAÚDE, D. A.; PERRY, K. S. P.; DUARTE, D. S.; RASLAN, D. S.;
BOAVENTURA, M. A. D.; CHIARI, E. Trypanocidal sesquiterpenes from Lychnophora
species. Phytother. Res. v. 10, p. 292, 1996.

PAULA, D. C. C.; SOUZA, A. C. M.; GUIMARAES, H. N.; SAÚDE-GUIMARÃES, D.
A.; GRABE-GUIMARAES, A. Avaliação das alterações da pressão arterial e do ecg em
ratos Wistar induzidas por Lycnhophora trichocarpha. In: XVII SEMINÁRIO DE
INICIAÇÃO CIENTÍFICA DA UFOP, 2009, Ouro Preto. Anais..., v. 1, p. 1, 2009.

RIBANI, M.; BOTTOLI, C. B. G.; COLLINS, C. H.; JARDIM, I. C. S. F.; MELO, L. F. C.
Validação em métodos cromatográficos e eletroforéticos. Quim. Nova. v. 27, n. 5, p. 771780, 2004.

ROBBINS, L. S.; COTRAN, R. S.; KUMAR, V.; COLLINS, T. Patologia Estrutural e
Funcional. 6ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p. 44-45, 2000.
 ROBINSON, H. Generic and Subtribal Classification of American Vernonieae. Smithsonian
Contributions to Botany no. 89. Washington DC: Smithsonian Institute Press, 1999.
 RÜNGELER, P.; CASTRO, V.; MORA, G.; GÖREN, N.; VICHNEWSKI, W.; PAHL, H.
L.; MERFORT, I.; SCHMIDT, T. J. Inhibition of Transcription Factor NF-kB by
Sesquiterpene Lactones: a Proposed Molecular Mechanism of Action. Bioorg. Med. Chem.
v. 7, p. 2343, 1999.
 SAKAMOTO, H.T.; FLAUSINO, D.; CASTELLANO, E. E.; STARK, C. B. W.; GATES,
P. J., LOPES, N. P. Sesquiterpene lactones from Lychnophora ericoides. J. Nat. Prod. v. 66,
p. 693, 2003.
 SANTOS, M. D.; GOBBO-NETO, L.; ALBARELLA, L.; SOUZA, G. E. P.; LOPES, N. P.
Analgesic activity of di-caffeoylquinic acids from roots of Lychnophora ericoides (arnica
da serra). J. Ethnopharm. v. 96, p. 545, 2005.
 SANTOS, P. A.; AMARANTE, M. F. C.; PEREIRA, A. M. S.; BERTONI, B.; FRANÇA,
S. C.; PESSOA, C.; MORAES, M. O.; LOTUFO, L. V. C.; PEREIRA, M. R. P.; LOPES, N.
P. Produção de um furanoeliangolido antiproliferativo de Lychnophora ericoides em cultura
de células. Chem. Pharm. Bull. v. 52, p. 1433-1435, 2004.
50
 SANTOS, P. A.; LOPES, J. L. C.; LOPES, N. P. Triterpenoids and flavonoids from
Lychnophoriopsis candelabrum (Asteraceae). Biochem. Syst. Ecol. v. 32, p. 509, 2004.
 SANTOS, P. A.; TURATI, I. C. C.; TOMAZ, J. C.; LOPES, N. P. Quantification of
furanoheliangolides by HPLC and GC. Rev. Bras. Ciênc. Farm. v. 39, n. 3, p. 341, 2003.

SARTORI, F. T.; BARRACHI, A. C.; SACILOTTO, C.; LOPES, J. L. C.; LOPES, N. P.;
VICHNEWSKI, W. Phytochemical study of Lychnophora markgravii (Asteraceae).
Biochem. Syst. Ecol. v. 30, p. 609–612, 2002.

SAÚDE, D. A. Estudo químico e atividade tripanossomicida de Lychnophora trichocarpha
Spreng. 1994. Dissertação (Mestrado em Química) - UFMG, Belo Horizonte, 1994.

SAÚDE, D. A.; RASLAN, D. S.; DE SOUZA FILHO, J. D.; DE OLIVEIRA, A. B.
Constituents from the aerial parts of Lychnophora trichocarpha. Fitoter. v. 69, n.1, 1998.

SAÚDE-GUIMARÃES, D. A.; RASLAN, D. S.; SOUZA FILHO, J. D.; OLIVEIRA, A. B.
Constituents from the aerial parts of Lychnophora trichocarpha. Fitoter. v. LXIX, n. 1, p.
90-91, 1998.

SAÚDE-GUIMARÃES, D. A.; BARRERO, A. F.; OLTRA, J. E.; JUSÍCIA, J.; RASLAN,
D. S.; SILVA, E. A. Atividade antibacteriana de furanoeliangolidos. Rev. Bras. Farmacogn.
v.12, n. 1, p. 7-10, 2002.

SEMIR, J. Revisão taxonômica de Lychnophora Mart. (Vernoniae : Compositae). 1991. Tese Instituto de Biologia, Unicamp, Campinas. 500 p, 1991.

SCHMIDT, T. J.; MATTHIENSEN, U.; WILLUHN, G. On the stability of sesquiterpene
lactones in the official Arnica tincture of the German Pharmacopoeia. Planta Med. v. 66, p.
678-681, 2000.

SIMOES, C. M. O.; SCHEKEL, E. P.; GOSMAN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTIZ, L. A.;
PETROVICK, P. R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5a Ed. Editora da UFSC e
da UFRGS, 1102 p., 2003.

SOLOMONS, T. W. G.; FRYHLE, C. B. Quím. Org. v. 1-2, 6 ed. Rio de Janeiro: LTC,
1996.

SOUZA, V.C.; LORENZI, H. Botânica Sistemática: guia ilustrado para identificação das
famílias de Angiospermas da flora brasileira, baseado em APG II. Nova Odessa, SP:
Instituto Plantarum de Estudos da Flora Ltda. p. 572-601, 2005.

SPRINGFIELD, E. P.; EAGLES, P. K. F.; SCOTT, G. Quality assessment of South African
herbal medicines by means of HPLC fingerprinting. J. Ethnopharm. v. 101, p. 75, 2005.

SWARTZ, M. E., KRULL, I. S. Validação de métodos cromatográficos. Pharm. Technol.
São Paulo, v. 2, n. 3, p.12-20, 1998.
51

UNITED STATES PHARMACOPEIA: USP 27: The National Formulary: NF 22.
Rockville: United States Pharmacopeial Convention, 2003.

VERPOORTE, R. Exploration of nature's chemodiversity: the role of secondary metabolites
as leads in drug development. Drug Discov. Today. v. 3, p. 232-238, 1998.
 VICHNEWSKI, W.; TAKAHASHI, A. M.; NASI, A. M. T.; GONÇALVES, D. C. R. G.;
DIAS, D. A.; LOPES, J. N. C.; GOEDKEN, A. B.; GUTIERREZ, A. B.; HERZ, W.
Sesquiterpene lactones and other constituints from Eremanthus seidelii, E. goyazensis and
Vanillosmopsis erythropappa. Phytochem. Oxford. v. 28, n. 5, p. 1441, 1989.
 ZDERO, C.; BOHLMANN, F. Systematics and evolution within the Compositae, seen with
the eyes of a chemist. Plant System. Evol. v. 171, p.1-14, 1990.
52
VIII – ANEXOS
53
ANEXO A
RESOLUÇÃO - RE Nº. 1, DE 29 DE JULHO DE 2005.
O Diretor-Presidente da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, no uso de suas
atribuições e tendo em vista o disposto no art. 111, inciso II, alínea "a" do Regimento
Interno da ANVISA aprovado pela Portaria nº 593, de 25 de agosto de 2000, republicada
em 22 de dezembro de 2000, resolve:
Art. 1º Autorizar ad referendum, a publicação do Guia para a Realização de Estudos de
Estabilidade, em anexo.
Art. 2° Fica revogada a Resolução - RE n° 398, de 12 de novembro de 2004, publicada no
Diário Oficial da União de 16 de novembro de 2004.
Art. 3° Esta Resolução entra em vigor na data de sua publicação.
DIRCEU RAPOSO DE MELLO
Anexo
GUIA PARA A REALIZAÇÃO DE ESTUDOS DE ESTABILIDADE
A estabilidade de produtos farmacêuticos depende de fatores ambientais como
temperatura, umidade e luz, e de outros relacionados ao próprio produto como
propriedades físicas e químicas de substâncias ativas e excipientes farmacêuticos, forma
farmacêutica e sua composição, processo de fabricação, tipo e propriedades dos materiais
de embalagem.
APLICABILIDADE
Guia para realização dos testes de estabilidade de produtos farmacêuticos a fim de prever,
determinar ou acompanhar o seu prazo de validade.
1. DEFINIÇÕES
ESTUDO DE ESTABILIDADE ACELERADO
Estudo projetado para acelerar a degradação química e/ou mudanças físicas de um produto
farmacêutico em condições forçadas de armazenamento. Os dados assim obtidos,
juntamente com aqueles derivados dos estudos de longa duração, podem ser usados para
avaliar efeitos químicos e físicos prolongados em condições não aceleradas e para avaliar
54
o impacto de curtas exposições a condições fora daquelas estabelecidas no rótulo do
produto, que podem ocorrer durante o transporte.
ESTUDO DE ESTABILIDADE DE ACOMPANHAMENTO
Estudo realizado para verificar que o produto farmacêutico mantém suas características
físicas, químicas, biológicas, e microbiológicas conforme os resultados obtidos nos
estudos de estabilidade de longa duração.
ESTUDO DE ESTABILIDADE DE LONGA DURAÇÃO
Estudo projetado para verificação das características físicas, químicas, biológicas e
microbiológicas de um produto farmacêutico durante e, opcionalmente, depois do prazo
de validade esperado. Os resultados são usados para estabelecer ou confirmar o prazo de
validade e recomendar as condições de armazenamento.
LOTE
Quantidade de um produto obtido em um único processo ou série de processos, cujas
características essenciais são a homogeneidade e qualidade dentro dos limites
especificados.
LOTE EM ESCALA PILOTO
Um lote de produto farmacêutico produzido por um processo totalmente representativo
simulando o lote de produção industrial e estabelecido por uma quantidade mínima
equivalente a 10% do lote industrial previsto, ou quantidade equivalente à capacidade
mínima do equipamento industrial a ser utilizado.
PRAZO DE VALIDADE
Data limite para a utilização de um produto farmacêutico definida pelo fabricante, com
base nos seus respectivos testes de estabilidade, mantidas as condições de armazenamento
e transporte estabelecidos.
TESTE DE ESTABILIDADE
Conjunto de testes projetados para obter informações sobre a estabilidade de produtos
farmacêuticos visando definir seu prazo de validade e período de utilização em
embalagem e condições de armazenamento especificadas.
2. DISPOSIÇÕES GERAIS
2.1 O prazo de validade de um produto a ser comercializado no Brasil é determinado por
um estudo de estabilidade de longa duração de acordo com os parâmetros definidos em
tabela abaixo. Por ocasião do registro poderá ser concedido um prazo de validade
55
provisório de 24 meses se aprovado o relatório de estudo de estabilidade de longa duração
de 12 meses ou relatório de estudo de estabilidade acelerado de 6 meses acompanhado dos
resultados preliminares do estudo de longa duração com, conforme parâmetros definidos
em tabela abaixo.
Forma
Condição de
Farmacêutica
armazenamento*
Embalagem
Temperatura e Temperatura e
umidade
umidade
Acelerado**
Longa
Duração**
Sólido
15°C -30°C
Semi-permeável 40ºC ± 2ºC /
30ºC ±2ºC /
75% ± 5% UR 75% ±5% UR
Sólido
15°C -30°C
Impermeável
Semi-sólido
15°C -30°C
Semi-permeável 40ºC ± 2ºC /
***
40ºC ± 2ºC
30ºC ± 2ºC
30ºC ±2ºC /
75% ± 5% UR 75% ±5% UR
Semi-sólido
15°C -30°C
Impermeável
Líquidos
15°C -30°C
Semi-permeável 40ºC ± 2ºC /
***
40ºC ± 2ºC
30ºC ± 2ºC
30ºC ±2ºC /
75% ± 5% UR 75% ±5% UR
Líquidos
15°C -30°C
Impermeável
40ºC ± 2ºC
30ºC ± 2ºC
Gases
15°C -30°C
Impermeável
40ºC ± 2ºC
30ºC ± 2ºC
Impermeável
25ºC ± 2ºC
5ºC ± 3ºC
Semi-permeável 25ºC ± 2ºC
5ºC ± 3ºC
Todas as formas 2°C - 8°C
farmacêuticas
Todas as formas 2°C - 8°C
farmacêuticas
Todas as formas -20 °C
60% ± 5% UR
Todas
-20ºC ± 5ºC
20ºC ± 5ºC
farmacêuticas
*Qualquer recomendação de armazenamento em temperatura dentro destas faixas deve
constar de bulas e rótulos. A temperatura recomendada não exime de que os testes de
estabilidade sejam realizados com as temperaturas definidas nas duas últimas colunas da
tabela.
** Os valores de temperatura e umidade são fixos e as variações são inerentes às
oscilações esperadas pela câmara climática e por eventuais aberturas para retirada ou
colocação de material.
*** Líquidos e semi-sólidos de base aquosa devem realizar o estudo com umidade a 25%
56
UR ou 75% UR. Caso se opte por 75% UR, o valor da perda de peso deverá ser
multiplicado por 3,0.
2.2. O prazo de validade deve ser confirmado mediante a apresentação de um estudo de
estabilidade de longa duração de 24 meses de duração, protocolado na forma de
complementação de informações ao processo. A presença desta documentação no
processo é necessária para a renovação do registro.
2.3. O estudo de estabilidade deve ser executado com o produto farmacêutico em sua
embalagem primária.
2.4. Os produtos importados a granel devem descrever nos seus rótulos a data de
fabricação, a validade e a condição de armazenamento até a execução da embalagem
primária para serem liberados pela autoridade sanitária de portos e aeroportos. O estudo
será avaliado durante a inspeção na empresa fabricante.
2.5. Para produtos importados, os estudos de estabilidade podem ser realizados no exterior
de acordo com os parâmetros definidos nesta Resolução. Nos caso de produtos importados
a granel, o prazo de validade deve levar em consideração o tempo máximo de
armazenamento até a execução da embalagem primária.
2.6. Para produtos importados, a granel ou em embalagem primária, os estudos de
estabilidade de acompanhamento devem ser realizados em solo brasileiro de acordo com
os parâmetros definidos nesta Resolução.
2.7. Estudos adicionais, tais como fotoestabilidade que se façam pertinentes de acordo
com as propriedades do produto em questão, poderão ser necessárias para a comprovação
da estabilidade de produtos farmacêuticos. Nestes casos sugerimos seguir recomendação
técnica disponível no portal da Anvisa. A não apresentação de estudo de fotoestabilidade
deve vir acompanhada de justificativa técnica com evidência científica de que o(s)
ativos(s) não sofre(m) degradação em presença de luz ou de que a embalagem primária
não permite a passagem de luz.
2.8. É facultado utilizar modelos reduzidos de plano de estudo de estabilidade, baseados
57
nos princípios estabelecidos na recomendação técnica disponível no portal da Anvisa.
2.9. Todo relatório de estudo de estabilidade, independente da forma farmacêutica, deve
apresentar as seguintes informações ou justificativa técnica de ausência:
Descrição do produto com respectiva especificação da embalagem primária
Número do lote para cada lote envolvido no estudo
Descrição do fabricante dos princípios ativos utilizados
Aparência
Plano de estudo: material, métodos (desenho) e cronograma.
Data de início do estudo
Teor do princípio ativo e método analítico correspondente
Quantificação de produtos de degradação e método analítico correspondente
Limites microbianos
Para toda a forma farmacêutica sólida a empresa deve acrescentar as seguintes
informações ou justificativa técnica de ausência:
Dissolução
Dureza
Para as formas farmacêuticas líquídas e semi-sólidas, a empresa deve acrescentar as
seguintes informações ou justificativa técnica de ausência:
pH
Sedimentação pós agitação em suspensões
Claridade em soluções
Separação de fase em emulsões e cremes
Perda de peso em produtos de base aquosa
2.10. Para fins de prazo de validade provisório de 24 meses será aprovado o relatório de
estabilidade acelerado ou de longa duração de 12 meses que apresentar variação menor ou
igual a 5,0% do valor de análise da liberação do lote, mantidas as demais especificações.
Caso as variações de doseamento estejam entre 5,1% e 10,0% no estudo de estabilidade
acelerado, o prazo de validade provisório será reduzido à metade, ou seja, será de 12
meses. O doseamento no momento zero não pode ultrapassar as especificações do produto
de acordo com farmacopéias reconhecidas pela Anvisa ou, na ausência de informação
farmacopeica, com método validado de acordo com o Guia para validação de métodos
analíticos e bioanalíticos. Caso a especificação farmacopeica e/ou proveniente de método
validado permitir que o momento zero seja acima de 10% do declarado a variação da
58
queda será analisada caso a caso.
2.11. Para fins de prazo de validade definitivo, somente será aprovado o relatório de
estabilidade que apresentar a variação do doseamento dos princípios ativos dentro das
especificações farmacopeicas e/ou proveniente de método validado do produto de acordo
com o Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos, e mantidas as demais
características do produto.
2.12. Em caso de produtos que requeiram reconstituição ou diluição deve-se apresentar
informações iniciais e finais que comprovem o período de utilização pelo qual o produto
mantém a sua estabilidade depois da reconstituição, nas condições de armazenamento
determinadas. Os estudos devem ser conduzidos utilizando o diluente especificado para
reconstituição do produto farmacêutico. Se existir a opção de mais de um diluente, o
estudo deve ser conduzido com aquele que apresente o produto farmacêutico reconstituído
menos estável.
2.13. Em caso de comprimidos efervescentes deve-se apresentar informações iniciais e
finais que comprovem o período de utilização pelo qual o produto remanescente mantém a
sua estabilidade depois da abertura da embalagem primária nas condições de
armazenamento determinadas. Estes estudos devem ser realizados com os parâmetros e
testes definidos por esta Resolução.
2.14. Excepcionalmente, para os produtos cujos cuidados de conservação sejam inferiores
a 25°C e de uso exclusivo em hospitais e clínicas médicas, serão aceitos estudos de
estabilidade nas condições especificadas para Zona II (25°C/60%UR), desde que seja
devidamente comprovado que o produto não suporta as condições estabelecidas nesta
Resolução. Entretanto o titular do registro do produto deve assegurar a conservação
recomendada durante o transporte e a distribuição.
3. SELEÇÃO DE LOTES
3.1. Para fins de registro e alterações pós-registro, nos estudos de estabilidade acelerado e
longa duração: um ou três lotes, de acordo com as normas legais e regulamentares
pertinentes.
59
3.2. Os lotes a serem amostrados devem ser representativos do processo de fabricação,
tanto em escala piloto quanto escala industrial.
3.3. Para os produtos cuja concentração do princípio ativo esteja na ordem de dosagem
abaixo de 0.99 miligramas por unidade posológica, não serão permitidos lotes pilotos com
quantitativos diferentes dos lotes industriais. Não aplicável a soluções.
3.4. Os estudos de acompanhamento deverão ser realizados nas condições climáticas
preconizadas neste Guia. A amostragem deve seguir os parâmetros abaixo descritos:
a) Um lote anual, para produção acima de 15 lotes/ano.
b) Um lote a cada 2 anos, produção abaixo ou igual de 15 lotes/ano.
c) Para produtos com diferentes concentrações e formulações proporcionais, poderá ser
utilizado como critério de escolha, aquele que apresentar o maior número de lotes
produzidos ao ano.
3.5. O estudo de acompanhamento somente poderá ser realizado se o produto não sofrer
nenhuma alteração após a conclusão do estudo de estabilidade de longa duração. Caso
ocorra qualquer alteração no produto deverá ser realizado novo estudo de estabilidade de
longa duração conforme preconizado neste Guia.
4. FREQÜÊNCIA DOS TESTES
4.1. Estudo acelerado: 0, 3 e 6 meses para doseamento, quantificação de produtos de
degradação, dissolução (quando aplicável) e pH (quando aplicável). Para as demais provas
apresentar estudo aos 6 meses comparativo ao momento zero.
4.2. Estudo de longa duração: 0, 3, 6, 9, 12, 18, 24 meses para doseamento, quantificação
de produtos de degradação, dissolução (quando aplicável) e pH (quando aplicável). Para
as demais provas, apresentar estudo no prazo de validade requerido comparativo ao
momento zero.
4.3. Estudo de acompanhamento: a cada 12 meses deverão ser realizados todos os testes
de um relatório de estudo de estabilidade, relatório que deve ser disponibilizado no
momento da inspeção.
5. DA ADEQUAÇÃO
60
5.1. É obrigatória a apresentação de estudos de estabilidade no momento da primeira
renovação de registro após a publicação desta Resolução caso este estudo não conste do
dossiê do registro, mesmo que conduzidos de acordo com os parâmetros vigentes quando
do início dos estudos.
5.2. A Anvisa aceitará até 31 de julho de 2007, no momento do registro, pós-registro ou
da renovação de registro, estudos de estabilidade de longa duração que já estejam em
andamento com o parâmetro de umidade abaixo de 75%. Entretanto as câmaras climáticas
devem ser re-qualificadas para umidade de 75% a partir da data de publicação desta
Resolução. Fica a critério da empresa reiniciar ou não estes estudos.
5.3. Caso os estudos de estabilidade de longa duração tenham sido realizados somente
com parâmetros de umidade distintos do definido nesta Resolução, as empresas deverão
na primeira renovação de registro após 1 de agosto de 2007, apresentar estudos de
estabilidade de acompanhamento em um lote, de acordo com esta Resolução. Para
produtos que atendam a esta circunstância, o momento da renovação é entre 1 de agosto
de 2007 e 31 de julho de 2008 e já tenham validade igual ou superior a 36 meses, é
possível aprovar um período de validade de 36 meses com a apresentação de estudos de
no mínimo de 24 meses.
5.4. Caso os estudos de estabilidade de longa duração tenham sido realizados com
parâmetros de temperatura e umidade distintos do definido nesta Resolução, as empresas
deverão na primeira renovação de registro após 1 de agosto de 2007, apresentar estudos de
estabilidade de longa duração de 12 meses, ou estudo acelerado de 6 meses acompanhado
do respectivo estudo de longa duração de acordo com esta Resolução. Caso as condições
de estabilidade não forem comprovadas na submissão da renovação de registro, a empresa
deverá solicitar suspensão de comercialização para manter o registro, caso contrário o
registro não será renovado.
5.5. Casos os estudos de longa duração, realizados através das condições desta Resolução,
comprovem um prazo de validade menor que o estabelecido no registro do produto, a
empresa deverá imediata e provisoriamente implementar e solicitar alteração pós-registro
para alteração de prazo de validade com base nos dados obtidos.
61
ANEXO B
GUIA PARA REALIZAÇÃO DE ESTUDOS DE FOTOESTABILIDADE
ESTUDO DE FOTOESTABILIDADE
1. FOTOESTABILIDADE
O teste tem como objetivo demonstrar que uma exposição à luz não resulta em alterações
significantes no produto.
São recomendados testes em:
a) Produto exposto
b) Produto em sua embalagem primária
Em alguns produtos onde tem sido demonstrado que a embalagem primária é
completamente fotoprotetora, tais como: tubos de alumínio ou enlatados; os testes não precisam ser
realizados, mediante levantamento bibliográfico, demonstrando que os componentes da formulação
não apresentam problemas de fotoestabilidade. Este produto será isento do estudo.
1.1. AS FONTES DE LUZ E CÂMARA DE TESTES
São descritas duas opções para fontes de luz.
OPÇÃO 1: utilizar uma fonte de luz similar ao padrão de emissão D65/ID65, como uma lâmpada
fluorescente artificial combinando emissão visível e UV. D65 é o padrão internacional reconhecido
para luz do dia como definido na ISO 10977(1993). ID65 é o equivalente ao padrão de luz indireta
de interiores. Para fonte de luz emitindo radiação significativa abaixo de 320nm, deve ser utilizado
filtro(s) para eliminar tais radiações.
OPÇÃO 2: a amostra deve ser exposta à combinação descrita abaixo:
a) Lâmpada branca fluorescente fria similar à ISO 10977(1993)
b) Lâmpada fluorescente UV com espectro distribuído entre 320nm e 400nm, e emissão máxima
de energia entre 350nm e 370nm.
Para realização dos testes, deve-se manter um controle apropriado da temperatura, a fim de
minimizar os efeitos de alterações localizadas deste fator. As amostras devem ser expostas em
uma câmara oticamente isolada do ambiente externo com ventilação apropriada e a câmara, por
sua vez, deve estar em uma sala com temperatura controlada.
1.2. PROCEDIMENTO
62
As amostras devem ser expostas a não menos que 1,2 milhões de lux. hora, integrados a uma
energia de ultra-violeta próxima de não menos que 200 watt horas/m2.
As amostras devem ser expostas lado a lado utilizando o sistema químico validado actinométrico,
assegurando que a exposição foi garantida; ou a uma duração apropriada quando as condições
são monitoradas por radiômetros ou luxímetros calibrados.
Se amostras protegidas - por exemplo, em papel alumínio; forem utilizadas como controles
para avaliação das alterações provocadas pela temperatura induzida no processo, estas devem ser
colocadas junto com as amostras em teste.
1.2.1. SISTEMA ACTINOMÉTRICO
Trata-se de um sistema para monitoramento de exposições próximas à lâmpada fluorescente
UV.
OPÇÃO 1:
a) Prepare uma solução aquosa de quinino monocloridrato dihidratado 2% peso/volume em água
(se necessário, dissolva à quente).
b) Amostra: Adicione 10ml da solução de quinino em ampolas de 20mL incolor, selada
hermeticamente. Prepare um número suficiente de ampolas para execução do teste.
c) Controle: Adicione 10ml da solução de quinino em ampolas de 20mL incolor, selada
hermeticamente, e embrulhada em papel alumínio. Prepare um número suficiente de ampolas para
execução do teste.
d) Promova a exposição luminosa das ampolas contendo a amostra e o controle na câmara de
testes.
e) Em intervalos apropriados de tempo, determine as absorbâncias da amostra (Aa) e do controle
(Ac) a 400 nm em cubeta de quartzo de 1 cm, usando água como branco.
f) Determine ΔA = (Ac - Aa) para tempos distintos (T1, T2, T3, ..., Tn).
g) Trate de forma estatística apropriada os dados obtidos (ΔA versus T) e estime o tempo de
exposição necessário para que se tenha ΔA ≥ 0,9 AU. Este será o tempo de exposição das
amostras de fármacos.
Exemplo: Conforme gráfico abaixo, das cinco medidas feitas, estima-se um valor de t = 9 para que
se tenha ΔA= 0,9
63
OPÇÃO 2:
a) Preencha uma cubeta de quartzo de 1cm com a solução de quinino, citada na opção 1. Tampe a
cubeta com tampa apropiada ;
b) Separadamente preencha uma outra cubeta de quartzo de 1cm, com a mesma solução, tampe-a
e embrulhe em papel alumínio para proteger completamente da luz, e use como controle;
c) Exponha a amostra e o controle à fonte de luz por um número apropriado de horas;
d) Depois de exposição determinar as absorbâncias da amostra (Aa) e do controle (Ac) a 400 nm;
e) Calcule a mudança em absorbância, ΔA = Ac - Aa.
f) Estime o tempo necessário para assegurar um ΔA mínimo de 0,5 AU, conforme descrito na
opção 1. Este será o tempo de exposição das amostras de fármacos.
1.3. CONSIDERAÇÕES PARA EXECUÇÃO DO TESTE
Os estudos são tratados iniciando com o teste de exposição total do produto e em seguida, se
necessário na embalagem primária.
Pode ser apropriado testar certos produtos como infusões líquidas, cremes tópicos, etc. para
garantir sua fotoestabilidade em uso. A extensão destes testes depende do uso dos produtos.
Os processos analíticos usados devem ser adequadamente validados.
Os testes devem ser executados, inicialmente em três diferentes lotes do produto e depois,
periodicamente ou por alguma modificação relevante no processo de fabricação e/ou alteração de
matéria prima, em um lote do produto.
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Cuidados devem ser tomados para garantir preservadas as características físicas das
amostras sob teste, tais como resfriamento e/ou posicionamento das amostras em recipientes
lacrados, propiciando minimizar alterações de estado físico, a citar: sublimação, evaporação ou
fusão. Estas ações são tomadas a fim de estabelecer o mínimo de interferência com a irradiação das
amostras sob teste.
Possíveis interações entre as amostras e materiais utilizados em sua proteção ou
componentes dos recipientes devem sempre ser consideradas e quando não relevantes ao processo,
descartadas.
Quando as amostras estão sendo testadas fora da embalagem primária, devem ser
posicionadas de maneira a promover o máximo de exposição à fonte de luz.
Se a exposição direta não é adequada, por exemplo: devido oxidar o produto; a amostra deve
ser colocada em um recipiente inerte, transparente e protegido adequadamente.
Se houver necessidade de testar o produto nas embalagens primárias, as amostras devem ser
colocadas horizontalmente ou transversalmente em relação à fonte de luz, definidas pela maior
uniformidade na exposição. Alguns ajustes devem ser necessários, tratando-se de recipientes
maiores.
As amostras devem ser expostas pelo tempo necessário conforme potência da fonte de luz
utilizada.
1.4. ANÁLISE DAS AMOSTRAS
Ao final do período de exposição, as amostras devem ser examinadas para qualquer
alteração das propriedades físicas, em geral: aparência, limpidez ou cor da solução; ou
dissolução/desintegração para formas como cápsulas, teor e produtos de degradação, por métodos
validados adequadamente para produtos desejados resultantes de processos de degradação
fotoquímica.
Tratando-se de pós, as amostras devem utilizar porções representativas nos testes
individuais.
Para comprimidos, os testes devem ser conduzidos com 20 comprimidos ou cápsulas. Caso
tenham sido utilizadas amostras protegidas como controle, as análises devem ser realizadas
concomitantemente.
1.5. AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS
Dependendo das alterações obtidas durante os estudos de fotoestabilidade, rótulos ou
embalagens especiais devem ser utilizados para evitar a exposição à luz, de maneira a assegurar a
estabilidade do produto durante o prazo de validade proposto.
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