Universidade Federal do Rio de Janeiro
Instituto de Bioquímica Médica
Biologia Estrutural de Flavivírus:
Propriedades Biofísicas da Interação de Peptídeos de Fusão
com Membranas Biomiméticas
e
Implicações para o Desenvolvimento de uma Vacina Inativada
por Alta Pressão Hidrostástica
Ygara da Silva Mendes
*2009*
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Biologia Estrutural de Flavivírus:
Propriedades Biofísicas da Interação de Peptídeos de Fusão com
Membranas Biomiméticas
e
Implicações para o Desenvolvimento de uma Vacina Inativada por Alta
Pressão Hidrostástica
Ygara da Silva Mendes
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Química Biológica, Instituto de
Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de
Janeiro, como parte dos requisitos necessários à
obtenção do Título de Doutor em Química
Biológica.
Orientação: Andréa Cheble de Oliveira
Co-Orientação: Jerson Lima da Silva
Rio de Janeiro
*Março/2009*
ii
Biologia Estrutural de Flavivírus: Propriedades Biofísicas da Interação de Peptídeos de
Fusão com Membranas Biomiméticas e Implicações para o Desenvolvimento de uma
Vacina Inativada por Alta Pressão Hidrostástica
Ygara da Silva Mendes
Orientação: Andréa Cheble de Oliveira
Co-Orientação: Jerson Lima da Silva
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química Biológica,
Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte
dos requisitos necessários à obtenção do Título de Doutor em Química Biológica.
Banca Examinadora:
......................................................................................
Dra. Andrea Thompson Da Poian
Profa. Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ
(Presidente da banca)
......................................................................................
Dra. Ana Paula Canedo Valente
Profa. Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ
(Revisora e Suplente interno)
......................................................................................
Dr. José Daniel Figueroa Villar
Prof. Associado do Instituto Militar de Engenharia
......................................................................................
Dr. Fábio Ceneviva Lacerda Almeida
Prof. Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ
......................................................................................
Dra. Izabel Chistina Nunes de Palmer Paixão
Profa. Associada do Departamento de Biologia Celular e Molecular - UFF
......................................................................................
Dr. Davis Fernandes Ferreira
Prof. Adjunto do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes/CCS/UFRJ
(Suplente externo)
......................................................................................
Dra. Andréa Cheble de Oliveira
Profa. Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ
(Orientadora)
......................................................................................
Dr. Jerson Lima da Silva
Prof. Titular do Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ
(Co-orientador)
Rio de Janeiro
*Março/2009*
iii
Ficha Catalográfica
Mendes, Ygara da Silva
Biologia Estrutural de Flavivírus: Propriedades Biofísicas da Interação de
Peptídeos de Fusão com Membranas Biomiméticas e Implicações para o
Desenvolvimento de uma Vacina Inativada por Alta Pressão Hidrostástica/
Ygara da Silva Mendes – Rio de Janeiro: UFRJ/IBqM, 2009
Xxv, 201 f., il., 31 cm
Orientador: Andréa Cheble de Oliveira
Co-Orientador: Jerson Lima Silva
Tese (Doutorado) – UFRJ / Instituto de Bioquímica Médica/ Programa de
Pós-Graduação em Química Biológica, 2009.
Referências Bibliográficas: f. 177-202
1. Flavivírus; 2. Vacina Inativada; 3. Peptídeo de Fusão; 4.
Espectroscopia; 5. Alta Pressão Hidrostática; 6. Dinâmica Molecular; 7.
Calorimetria. I. Oliveira, Andréa Cheble de. II. Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Instituto de Bioquímica Médica, Programa de Pós-Graduação em
Química Biológica. III. Título.
iv
Esta tese foi desenvolvida no Laboratório de Termodinâmica de Proteínas e
Estruturas Virais Gregorio Weber, Programa de Biologia Estrutural, Instituto de
Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação
da Professora Andréa Cheble de Oliveira e co-orientação do Professor Jerson
Lima da Silva, sob a vigência dos auxílios do Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Programa Nacional de
Excelência (PRONEX), Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP),
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES),
Instituto Milênio de Biologia Estrutural em Biomedicina e Biotecnologia
(IMBEBB), e Fundação Universitária José Bonifácio (FUJB).
v
A maior recompensa do nosso trabalho não é o que nos pagam por ele,
mas aquilo em que ele nos transforma.
(John Ruskin)
vi
Dedico esta tese...
Ao meu amado filho Pedro, que me faz viver intensamente e muito mais
feliz. Você fez mais sentido à minha vida. Longe de você o tempo passa tão
devagar... No trabalho, rezo para que chegue logo a hora de te reencontrar.
Nos fins de semana, para que o tempo demore mais a passar...
Te amo incondicionalmente!
Ao meu querido maridinho Ivan, por toda dedicação e preocupação.
Confesso que muitas vezes racional além da conta, mas esta é a base do
equilíbrio da nossa união, o balanço entre o racional e o irracional, a
paciência e a inpaciência, o sonho e a realidade. Você é meu apoio, meu
incentivo, meu consolo, meu alicerce, meu guia... Minhas vitórias eu
dedico essencialmente a você.
Te Amo Muito! E por isso serei eternamente sua...
À minha mãezinha Vanda, por todo carinho, apoio e disponibilidade nos
momentos mais corridos da minha vida. A quem sempre recorro e que
sempre está disposta a me ajudar. Obrigada pelo seu amor e pela sua
dedicação por todos esses anos.
Ao meu querido pai Jamil, por todo incentivo e preocupação quanto à
minha educação, que trilhou meu caminho até aqui. Este presente eu
carregarei comigo para sempre. Muito obrigada por tudo!
À minha irmã Yramaia, que mesmo de longe está sempre torcendo pelas
minhas conquistas. Sinto muita saudade e gostaria muito de poder estar
mais ao seu lado...
vii
Agradecimentos
A Deus, por toda força e conquista, pela felicidade da minha família, pela
saúde do meu filho, pelo amor do meu marido e pelo carinho de grandes
amigos que já conquistei até o momento. Sem todos vocês, nada faz
sentido... E tudo isso eu devo ao Senhor.
À minha querida orientadora Andréa, que por tantas vezes foi meu apoio
emocional e psicológico para um simples desabafo, familiar ou profissional.
Encantadora, sublime... Sua Ternura me encanta. Tem sempre ótimas
palavras para confortar seu coração. Seus conselhos são sempre muito bem
vindos e foram eles que me fizeram crescer a cada momento, de alegria ou de
tristeza, de vitórias ou de derrotas. Forte ou frágil? Ainda não sei. Mas
talvez sua fortaleza esteja na simplicidade de seus sentimentos, de odiar ou
de amar, de chorar ou de sorrir, de se irritar ou de se emocionar. Espero
poder viver sempre ao seu lado. É impossível contar minha história de vida
sem falar de você. Linda. Linda por suas vitórias, linda por sua garra,
linda por ser exatamente como você é: Verdadeiramente Encantadora!
Obrigada pela sua amizade, pela sua dedicação e por amar o Pedro. Mas
se você está precisando de férias de mim, tudo bem. Seu pedido é uma
ordem. Só volto mês que vem...
À minha querida (ex) aluna Nathalia, uma menina doce e que por
incontáveis vezes foi meu braço direito e meu braço esquerdo juntos.
Obrigada por cobrir toda minha ausência no momento mais importante e
recompensador da minha vida. Obrigada por tudo! Esta tese também é
sua!
viii
Ao grande amigo Théo. Difícil imaginar sua vida sem enter, shift e
control, mas sei que você é brasileiro e não desiste nunca! Mineirinho,
chegou de mansinho, e conquistou o coração de muitos (as). Nem sei como
agradecer tudo o que você fez por mim. É inacreditável sua generosidade e
sua disponibilidade. Era capaz de largar o que tivesse fazendo para
atender a um pedido meu. Por quantas vezes fez overnight pra mim...
Você foi meu último suspiro neste trabalho. Suas explicações muitas
vezes faziam minha cabeça dar um ‘tilct’. Você é demais! Muito obrigada
do fundo do meu coração...
Ao querido compadre Andre, por todas as oportunidades de ouvir suas
brilhantes explicações. Suas críticas e muitas vezes ‘broncas’ de verdade
fazem desse laboratório mais cauteloso e organizado. Homem de
personalidzade forte, mas que me encanta por sua integridade moral.
Muito obrigada por agora fazer parte da minha família. Você é
sensacional!
Ao Jerson, pela grande oportunidade de me permitir chegar até aqui.
Apesar de longe nestes últimos anos, sempre busca estar presente e ciente
dos pequenos grandes problemas do laboratório.
À Professora Débora Foguel, que na ausência do Jerson, frequentemente
procurou tomar a frente para resolver os problemas do laboratório sempre
com muita objetividade. Parabéns pelo seu empenho e dedicação ao IBqM.
À querida amiga Shana, pelos abraços apertados e carinhosos. Não sei se
com alguma outra intenção, mas eram sempre bem vindos. A última
massagem, então, foi inesquecível! rsrsrs Obrigada!
ix
À doce amiga Cris Latgé, com seu jeitinho meigo e sempre carinhosa
conquistou meu coração. É sempre muito bom estar do seu lado, mas nunca
irei contar pra você um só segredo. “Não vou falar, não vou falar, já
falei...”. Desejo que você seja muito feliz e que seus sonhos sejam sempre
concretizados.
Ao querido e futuro papai Daniel, que sempre está com sua carteira
aberta para nossas festinhas surpresa. Desculpas se te cobrei sempre o
valor dobrado. Muito obrigada por toda sua atenção e por me fazer rir com
suas piadinhas sempre oportunas.
À minha companheira de sempre, Ana Paula, que na correria do dia-adia sempre paramos para nos amparar e conversar sobre a tese. Muito
esforçada com seu trabalho, abdicava do aconchego do seu maridinho para
trabalhar noite a dentro, finais de semana, feriados... Precisamos
‘bebemorar’ muito por mais essa etapa cumprida.
Ao Carlos, que foi essencial para a confecção de nossos posters e
apresentações em geral. Qualquer problema é só chamá-lo que ele resolve.
Mas ah se não existisse paint... Não sei o que seria dele...
À Vanessa, uma menina super dedicada e que por muitas vezes teve que
abdicar de seu orientador para me emprestá-lo, nem que fosse por um dia
inteiro. “Ai gente, o que foi que eu fiz?!?!?!”
À Pati, pelas comidas maravilhosas, caronas, festinhas. Mas como gosta
de dançar, uma verdadeira duracell.
À Clara, com seu sorriso encantador e carismático, que sempre faz alegrar
o meu dia.
x
À Milena, uma menina com uma maturidade exemplar, que sempre está
disposta a ajudar e a contribuir para a organização do nosso espaço.
À Mari, que apesar de seu coração gelado, sempre foi muito atenciosa
comigo.
À Tuane, por toda conversa jogada fora. Fofocas do IBqM... contrate
Tuane. Não porque ela seja fofoqueira, mas sim uma boa informante...
À Mônica, que sempre esteve disponível para tirar minhas muitas
dúvidas.
À Susanna, pelas histórias engraçadas. È uma verdadeira comédia.
Ao Samir, um rapaz muito educado, que está sempre bem humorado e por
sempre se mostrar prestativo nas tarefas do laboratório.
À Amanda, uma menina muito especial e carinhosa e que está sempre com
um sorriso lindo no rosto.
À equipe que tenta manter nosso espaço mais organizado e produtivo,
Emerson, D. Silvia e Márcia. Sem a ajuda de vocês tudo seria muito
mais difícil. Muito obrigada pela limpeza, pelos pedidos de esterilização e
meio, muitas vezes em cima da hora. Muito obrigada por tudo!
Ao corpo burocrático do LTPV/LAPA, Rosey, Rberta e Sr. Áureo,
pelos pedidos de papel, compras...
Ao restante dos companheiros de longa estrada do laboratório
LTPV/LAPA, Dani, Keron, Thais, Vivian, Diego, Guilherme,
xi
Marisa, Adrielly, Ana Cris, Carol Léo, Priscila, Fernando,
Estefânia, Nathália, Ricardo, Carlos, Aline, Rogério, Carlos
Henrique, Elias e Marcos, que foram de alguma forma importantes na
minha caminhada e que colaboraram de maneira direta ou indireta para a
realização deste trabalho.
Aos queridíssinmos amigos Rafa e Wal, que apesar de bem distantes,
sempre davam uma palavra de consolação, incentivo ou esperança. Muito
obrigada por ontem, por hoje e tenho certeza que pelo amanhã também.
Voltem logo, vocês fazem muita falta!
Aos amigos que por aqui passaram, mas que ainda permanecem nas minhas
boas lembranças, Sheilinha, Cris Rocha, Karinne e Viveca.
À Luciane Gaspar e a todos do LATEV/FIOCRUZ, pela
colaboração super produtiva nos projetos de inativação viral, pelos
experimentos de imunogenicidade, pelos vírus gentilmente cedidos e por
todo apoio.
À Professora Maria Lúcia Bianconi, pela sua grande colaboração e que
sempre se propunha a pensar sobre meus resultados de calorimetria.
Muito obrigada!
À Mariana e à Karla, pela luta semanal nas marcações dos calorímetros
e por sempre concederem seus dias para a realização dos nossos
experimentos.
Ao Professor Pedro Pascutti, pela oportunidade de colaborar com seu
grupo nos experimentos de simulação.
xii
Ao Rafael Bernardi, pela grande colaboração nos experimentos de
simulação. Que difícil cruzar as informações de um físico com uma
biomédica. Mas acho que superamos, apesar dos encontros e desencontros
frequentes... Muito obrigada pela paciência e pelo trabalho.
Ao Professor Marcius Almeida e a suas alunas Vivi e Laíses, por
sempre nos concederem o uso do espectrofotômetro, fundamental para
iniciar nossos experimentos.
A todo grupo do CNRMN, por todo apoio que com certeza foi essencial
para este trabalho.
A todos do IBqM, que de alguma forma foram fundamentais para a
realização dos experimentos desta tese.
À Professora Ana Paula Valente, pela sua revisão e sugestões. E
interessantemente, nos Encontros que ocorriam na Universidade, era você
a nossa avaliadora, que acabava ficando sempre ciente do andamento deste
trabalho.
Aos Professores Daniel Figueroa, Fábio Almeida, Izabel Paixão e
Davis Ferreira por aceitarem gentilmente compor a banca examinadora da
minha defesa.
Às minhas amadas afilhadas Letícia e Luísa, minhas verdadeiras
paixões. Apesar da dindinha nunca ter muito tempo para ver vocês, vocês
estão sempre aqui, no meu coração. Amo muito vocês!
À Júlia, uma menininha tão linda e delicada. A titia morre de saudades
de você. Volta logo, tá?
xiii
À família Sousa, Rosilda, Lek, Marília, Wagner e Fábio, por toda
dedicação que tiveram durante todo este tempo. Vocês foram muito
importantes para esta caminhada. Obrigada por tudo!
À Marcela, pelas palavras de incentivo de que tudo iria dar certo.
xiv
Abreviações e Siglas
Cp – variação de capacidade calorífica
G – variação da energia livre de Gibbs
H – variação de entalpia
S – variação de entropia
17D-204 – cepa vacinal da Febre Amarela distribuída no mundo (exceto no Brasil)
17DD - cepa vacinal da Febre Amarela distribuída no Brasil
2K – proteína não estrutural 2K
AAS – ácido acetilsalicílico
ADN – ácido desoxirribonucléico
AIDS – Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
APH – alta pressão hidrostática
ARN – ácido ribonucléico
ATCC – banco de cultura de células americano
C – proteína capsídica
CD – dicroísmo circular
CDC – Centro de Controle de Doenças
CEUA - Comitê Institucional de Experimentação e Cuidados com os Animais
CMC – carboxi-metil-celulose
cmc – concentração micelar crítica
C-terminal – terminal carboxi
DEN - Dengue
DENV - Vírus da Dengue
DMEM – meio de cultura Eagle modificado por Dulbecco
DPPC – di-palmitoil-fosfatidilcolina
DSC – Calorimetria Diferencial de Varredura
DTT - ditiotreitol
E – proteína de envelope
ELISA – ensaio imunoenzimático
FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz
FLAG – peptídeo de fusão de Flavivírus que possui um resíduo de Gly na posição 104
xv
FLAH - peptídeo de fusão de Flavivírus que possui um resíduo de His na posição 104
FMDV – Vírus da Febre Aftosa
G – proteína G
gp – glicoproteína
HA - hemaglutinina
HIV1 – Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1
HIV2 – Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 2
i.c. - intracerebral
ITC – Calorimetria Isotérmica de Titulação
JE - Encefalite Japonesa
JEV - Vírus da Encefalite Japonesa
KSV – constante de Stern-Volmer
L - fase líquido-cristalina
LATEV – Laboratório de Tecnologia Virológica
Lc – fase lamelar cristalina
Lβ’ – fase gel inclinada
M – proteína de membrana
MD – dinâmica molecular
MLD50 - dose mínima letal capaz de matar 50% dos animais
MLVs - vesículas multilamelares
n-OGP - n-octil-β-D-glicopiranosídeo
NS1 – proteína não estrutural 1
NS2A – proteína não estrutural 2A
NS2B – proteína não estrutural 2B
NS3 – proteína não estrutural 3
NS4A – proteína não estrutural 4A
NS4B – proteína não estrutural 4B
NS5 – proteína não estrutural 5
N-terminal – terminal amino
ORF – região aberta de leitura
PC - fosfatidilcolina
PDB - Banco de Dados de Proteínas
xvi
PG – Fosfatidilglicerol
PME – método “Particle-Mesh Ewald” para tratamento das interações eletrostáticas
POPE - Palmitoil-Oleoil-Fosfatidiletanolamina
prM – proteína precursora da proteína de membrana
PRNT - teste de neutralização de redução de 50% dos plaques
Pβ’ – fase gel ondulada
RE – retículo endoplasmático
RMN – ressonância magnética nuclear
RMSD – desvio quadrático médio da estrutura
SDS - dodecil sulfato de sódio
SIV – Virus da Imunodeficiência de Símios
SLE - Encefalite de St. Louis
TBE - Encefalite transmitida por carrapato
TBEV - Vírus da Encefalite Transmitida por Carrapato
TFE - 2, 2, 2-trifluoretanol
Tm – temperatura de transição
TMV - Vírus do Mosaico do Tabaco
Tpre – temperatura de transição média
UFP – unidade formadora de plaque
UV - ultravioleta
VSV – Vírus da Estomatite Vesicular
WHO – Organização Mundial de Saúde
WNE - Encefalite do Oeste do Nilo
WNV - Vírus do Oeste do Nilo
YF - Febre Amarela
YFV - Vírus da Febre Amarela
xvii
Resumo
Biologia Estrutural de Flavivírus: Propriedades Biofísicas da Interação de Peptídeos de
Fusão com Membranas Biomiméticas e Implicações para o Desenvolvimento de uma
Vacina Inativada por Alta Pressão Hidrostástica
Ygara da Silva Mendes
Orientador: Andréa Cheble de Oliveira
Co-Orientador: Jerson Lima Silva
Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em
Química Biológica, Instituto de Bioquímica Médica, da Universidade Federal do Rio de
Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do Título de Doutor
em Química Biológica.
Os Flavivírus são responsáveis por causar doenças de grande impacto global,
como Febre Amarela, Dengue e Febre do Oeste do Nilo. Estes arbovírus entram nas
células por endocitose, onde as proteínas de envelope sofrem uma alteração
conformacional e expõem um peptídeo de fusão (PF), que se insere dentro de uma
membrana alvo e induz o processo de fusão. Embora este mecanismo geral da fusão
seja bem aceito, o modo pelo qual os PFs de Flavivírus executam este papel
permanece desconhecido. Este trabalho foi dividido em duas partes: (1) as
propriedades de interação de dois PFs de Flavivírus foram estudadas através de
metodologias biofísicas; e (2) a imunogenicidade do Vírus da Febre Amarela vacinal (YF
17DD) inativado por alta pressão hidrostática (APH) foi avaliada em modelo murino. Na
primeira parte, os resultados indicam que ambos os peptídeos foram capazes de
interagir com diferentes modelos de micelas e membranas, induzindo o processo de
desmicelização e alterando a fluidez da membrana. O aumento da força iônica induz a
perda da contribuição entálpica em todas as temperaturas analisadas, apresentandose como um processo endotérmico e entropicamente favorecido. Em solução, os
peptídeos exibem essencialmente uma conformação randômica, entretanto, na
presença de membranas, os peptídeos apresentaram uma estrutura em dobra mais
estável. Apesar de existir uma vacina atenuada bastante eficaz contra o vírus da Febre
Amarela (YFV), sérios eventos adversos têm sido relatados nos últimos anos. Na
segunda parte deste trabalho, mostramos que o vírus vacinal YF 17DD, inativado por
APH (310 MPa por 3 h a 4°C), induz uma completa proteção em camundongos, apesar
destes apresentarem baixos títulos de anticorpos neutralizantes. A principal vantagem
da APH é não introduzir agentes exógenos abolindo o risco de toxicidade. Como não
existe um tratamento específico contra os Flavivírus, tentativas para produção de
vacinas são certamente necessárias. Além disso, para identificar moléculas que inibam
especificamente etapas cruciais do ciclo de infecção destes vírus, é necessário
conhecer detalhes bioquímicos e caracterizar estruturalmente as proteínas virais
essenciais neste processo.
Palavras-chave: Flavivírus, Vacina Inativada, Peptídeo de Fusão, Espectroscopia, Alta
Pressão Hidrostática, Dinâmica Molecular, Calorimetria.
Rio de Janeiro
*Março/2009*
xviii
Abstract
Structural Biology of Flavivirus: Biophysical Properties of Fusion Peptide- Mimetic
Membrane Interaction and Implications for the Development Inactivated Vaccine by
High Hydrostatic Pressure
Ygara da Silva Mendes
Orientador: Andréa Cheble de Oliveira
Co-Orientador: Jerson Lima Silva
Abstract da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em
Química Biológica, Instituto de Bioquímica Médica, da Universidade Federal do Rio de
Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do Título de Doutor
em Química Biológica.
Flaviviruses are responsible for causing diseases of great global impact, such as
Yellow Fever, Dengue and West Nile fever. These arboviruses entry into the cells by
endocytosis, when the envelope proteins undergo conformational changes and expose
a fusion peptide, which inserts itself into an appropriate target membrane and induces
the fusion process. Although this main fusion mechanism has been accepted, the
process by which fusion peptides of Flaviviruses execute this role remains elusive. The
present work was divided into two parts: (1) the interaction properties of two fusion
peptides (FP) of Flavivirus were studied through biophysical methodologies; and (2)
the immunogenicity of YFV 17DD inactivated by High Hydrostatic Pressure (HHP) was
evaluated in murine model. In the first part, the results indicate that both FP were able
to interact with different micelles and membranes models, inducing a demicellization
process and changing the membrane fluidity. The increase of ionic strength induces
loss of enthalpic contribution in all temperatures analyzed, shows an endotermic
process and largely entropy-driven. In solution, the peptides exhibit essentially random
coil conformation, however, in membrane-mimetic environment, the FPs show a bend
structure with higher stability. Despite the excellente record of efficacy and safety of
the successful Yellow Fever (YF) attenuated vaccine, serious adverse events have been
reported and influenced extensive vaccination in endemic areas. In the second part,
we demonstrate that the YF 17DD vaccine virus inactivated by HHP (310 MPa for 3 h at
4°C), exhibits a complete protection in mice, although with low neutralizing antibody
titers. The main advantage of HHP is that it does not introduce exogenous substances
into the vaccine, abolishing the risk of toxicity of the inactivant agent. Since an efficient
treatment against most of Flaviviruses is not available, the efforts to produce
inactivated vaccines are certainly necessary. Moreover, to identify molecules that
inhibit specifically critical steps of viral life cycle, it is necessary to know biochemistry
details and characterize structurally the essential viral proteins in this process.
Key-word: Flavivirus, Inactivated Vaccine, Fusion Peptide, Spectroscopy, High
Hydrostatic Pressure, Molecular Dynamics, Calorimetry.
Rio de Janeiro
*Março/2009*
xix
Índice
1. INTRODUÇÃO GERAL...............................................................................................1
1.1. A História da Virologia: o desenvolvimento dos conceitos de vírus......................1
1.2. Epidemiologia.........................................................................................................5
1.3. A Febre Amarela...................................................................................................10
1.3.1. Histórico da Doença.............................................................................................10
1.3.2. As Características da Doença...............................................................................12
1.3.3. A Vacinação: suas vantagens e seus problemas..................................................14
1.4. A Estrutura dos Flavivírus.....................................................................................24
1.5. Ciclo de Infecção: entrada, replicação do genoma e processamento das
proteínas.........................................................................................................................33
1.6. A Fidelidade e a Diversidade dos Peptídeos de Fusão.........................................41
1.6.1. Peptídeos de Fusão..............................................................................................41
1.6.2. Os Peptídeos de Fusão dos Flavivírus..................................................................43
1.6.3. Interação Peptídeo-Membrana...........................................................................48
2. OBJETIVOS............................................................................................................55
2.1.
2.2.
Objetivos: Parte I..................................................................................................55
Objetivos: Parte II.................................................................................................57
3. MATERIAL E MÉTODOS..........................................................................................60
3.1. Reagentes.............................................................................................................60
3.2. Células e Vírus......................................................................................................60
3.3. Peptídeos de Fusão..............................................................................................61
3.4. Ensaio com Micelas..............................................................................................63
3.5. Preparação das Vesículas Multilamelares...........................................................65
3.6. Espectroscopia de Fluorescência.........................................................................65
3.6.1. Supressão de Fluorescência por Acrilamida........................................................68
3.7. Dicroísmo Circular (CD)........................................................................................72
3.8. Calorimetria Isotérmica de Titulação (ITC)..........................................................75
3.9. Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC)......................................................77
3.10. Simulações por Dinâmica Molecular...................................................................78
3.11. Inativação Viral por Alta Pressão Hidrostática....................................................82
3.11.1. Ensaio de Infecciosidade.....................................................................................86
3.11.2. Avaliação da Infecciosidade Residual do YFV Inativado.....................................87
3.12. Ensaios em Camundongos..................................................................................88
3.12.1. Ensaios de Inocuidade........................................................................................88
xx
3.12.2. Imunização..........................................................................................................89
3.12.3. Ensaio de Proteção.............................................................................................89
3.13. Ensaios para Detecção de Neutralização dos Anticorpos...................................90
3.14. Análises Estatísticas............................................................................................91
4. RESULTADOS.........................................................................................................92
Parte I.............................................................................................................................92
“Propriedades Biofísicas da Interação de Peptídeos de Fusão com Membranas
Biomiméticas”
4.1.
Análise Teórica da Estrutura e da Hidrofobicidade dos Peptídeos de Fusão
Virais...............................................................................................................................93
4.2. Análise das Propriedades Estruturais da Interação Peptídeo-Micela.................96
4.3. Termodinâmica da Interação Peptídeo-Micela.................................................105
4.4. Análise das Mudanças Conformacionais dos Peptídeos...................................113
4.5. Perturbação da Bicamada Lipídica Promovida pela Interação dos Peptídeos de
Fusão............................................................................................................................122
4.6. Análise Computacional da Interação Peptídeo-Membrana através de Simulação
por Dinâmica Molecular...............................................................................................128
Parte II..........................................................................................................................142
Apresentação do artigo intitulado:
“Pressure-Inactivated Yellow Fever Virus: Implications for Vaccine Development”
5. DISCUSSÃO..........................................................................................................150
Parte I...........................................................................................................................150
“Propriedades Biofísicas da Interação de Peptídeos de Fusão com Membranas
Biomimética”
Parte II..........................................................................................................................162
“Febre Amarela: Implicações para o Desenvolvimento de uma Vacina Inativada por Alta
Pressão Hidrostástica”
6. CONCLUSÕES.......................................................................................................172
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................175
8. ANEXOS...............................................................................................................202
xxi
Índice de Tabelas
I. Parâmetros Espectroscópicos Medidos para a Ligação dos Peptídeos de Fusão FLAG e
FLAH a Diferentes Micelas......................................................................................103
II. Parâmetros Termodinâmicos da Interação Peptídeo-Micela...................................109
xxii
Índice de Esquemas
1. Estrutura do SDS.........................................................................................................64
2. Estrutura do n-octil-β-glicopiranosídeo......................................................................64
3. Estrutura Química da Acrilamida................................................................................70
xxiii
Índice de Figuras
1. Distribuição Global de Flavivírus Dominantes e Potencialmente Importantes.........7
2. Uma Década da Doença Dengue (1995-2005)...........................................................7
3. Estrutura do Vírus da Dengue Maduro....................................................................25
4. Estrutura do Ectodomínio da Proteína E dos Flavivírus e seus Diferentes Estados
Oligoméricos............................................................................................................28
5. Sequência de Eventos Mostrando as Mudanças Conformacionais de Diferentes
Proteínas de Fusão de Vírus....................................................................................32
6. O Ciclo Replicativo dos Flavivírus.............................................................................35
7. Representação Esquemática da Organização do Genoma e do Processamento da
Poliproteína dos Flavivírus.......................................................................................37
8. Esquema das Etapas do Processo de Fusão de Flavivírus........................................44
9. Reconhecimento Molecular de Peptídeos na Superfície da Membrana.................52
10. Estrutura da Proteína E do WNV e dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH................62
11. Representação do Peptídeo de Fusão FLAH em Caixa d’água ou em Bicamada
Lipídica Composta por POPE...................................................................................81
12. Loop de Fusão da Glicoproteína E dos Flavivírus.....................................................81
13. Sistema de Alta Pressão Hidrostática......................................................................85
14. Análise Teórica da Estrutura e da Hidrofobicidade de Peptídeos de Fusão
Virais........................................................................................................................95
15. Espectros de Absorção e de Emissão de Fluorescência dos Peptídeos de Fusão de
Flavivírus..................................................................................................................97
16. Interação entre os Peptídeos FLAG e FLAH com Micelas de SDS, Monitorada por
Supressão de Fluorescência por Acrilamida..........................................................100
17. Interação entre os Peptídeos FLAG e FLAH com Micelas de n-octil-β-Dglicopiranosídeo, Monitorada por Supressão de Fluorescência por Acrilamida...104
18. Calorimetria Isotérmica de Titulação (ITC) de Micelas de SDS com os Peptídeos de
Fusão FLAG e FLAH..................................................................................................107
19. Calorimetria Isotérmica de Titulação (ITC) de Micelas de n-octil-β-Dglicopiranosídeo com os Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH....................................108
20. Efeito da Temperatura na Entalpia de Ligação Peptídeo-Micela...........................111
21. Calorimetria Isotérmica de Titulação (ITC) de Micelas de SDS com os Peptídeos de
Fusão FLAG e FLAH na Presença de NaCl................................................................112
xxiv
22. Análise da Estrutura Secundária dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH na Presença
de TFE....................................................................................................................116
23. Análise da Estrutura Secundária dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH Submetidos à
Alta Temperatura..................................................................................................117
24. Análise da Estrutura Secundária dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH na Presença
de Micelas de SDS..................................................................................................119
25. Análise da Estrutura Secundária dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH na Presença
de Micelas de n-octil-β-D-glicopiranosídeo...........................................................120
26. Termograma de Vesículas Multilamelares na Presença e na Ausência dos
Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH............................................................................126
27. Análise da Estrutura Secundária dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH durante
Simulações em Água..............................................................................................130
28. Número de Ligações de H e Distância Mínima entre os resíduos de Trp e Phe....132
29. Representação da Simulação da Interação dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH
com membrana de POPE.......................................................................................133
30. Análise da Estrutura Secundária dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH durante
Simulações em Membrana....................................................................................135
31. Distância Mínima dos Resíduos Gly104 e His104 em Relação à Membrana.........137
32. Número de Ligações de H entre os Componentes do Sistema..............................139
33. Distância Mínima dos Resíduos Arg99, Trp101 e Phe108 entre si e em Relação à
Membrana....................................................................................................................141
xxv
Introdução Geral
1.
Introdução Geral
1.1.
A História da Virologia: o desenvolvimento dos conceitos de vírus
Na última metade do século XIX, a existência de um mundo
microbiológico diverso de bactérias, fungos e protozoários foi bem
estabelecida. Por volta de 1840, o anatomista alemão Jacob Henle sugeriu
a existência de agentes infecciosos que seriam muito pequenos para
serem observados por um microscópio e que eram capazes de causar
doenças específicas. Como não encontrou nenhuma evidência direta para
tal entidade, esta idéia não foi bem sucedida.
O primeiro avanço na Microbiologia para a descoberta destes
agentes submicroscópicos foi dado por Louis Pasteur, através da
demonstração de que a geração espontânea de microorganismos não
ocorre. Joseph Lister contribuiu para a técnica de diluição limite para
obter culturas puras de organismos, e Robert Koch, um estudante de
Jacob Henle, dentre outras descobertas, desenvolveu o meio sólido e o
isolamento de colônias individuais de bactérias. Embora muitos cientistas
daquela época tenham contribuído para diversas técnicas e conceitos,
foram principalmente Pasteur, Lister e Koch que propuseram juntos uma
nova tecnologia experimental para a Ciência Médica.
1
Introdução Geral
Estes estudos formalizaram algumas idéias originais de Henle e são
hoje conhecidas como os postulados de Koch que definem se um
determinado organismo é de fato o agente causador de uma doença. Os
postulados de Koch determinam que (a) o organismo deve ser
regularmente encontrado nas lesões da doença, (b) o organismo deve ser
isolado em cultura pura, (c) a inoculação de tal cultura pura em
hospedeiros deveria iniciar a doença, e (d) o organismo deve ser
recuperado novamente a partir das lesões do hospedeiro (Levine & Enquist,
2007).
Em 1879, Adolf Mayer, um cientista alemão, começou sua pesquisa
com a doença do tabaco e, embora ele não fosse o primeiro a descrever
tal doença, nomeou a Doença do Mosaico do Tabaco após observar e
estudar pontos claros e escuros sobre a folhagem infectada. Em um de
seus experimentos, foi inoculado extrato das plantas doentes em plantas
sadias. Este é o primeiro relato de transmissão experimental de uma
doença viral. Porém, embora estes estudos estabelecessem a natureza
infecciosa da doença, nenhum agente bacteriológico ou fúngico pode ser
cultivado ou detectado nestes extratos, o que não satisfazia os postulados
de Koch (Levine & Enquist, 2007).
2
Introdução Geral
O segundo passo foi dado por Dimitri Ivanofsky, um cientista russo.
Em 1887, Ivanofsky repetiu as observações de Mayer demonstrando que a
seiva das plantas infectadas continha um agente capaz de transmitir a
doença para as plantas saudáveis e passou esta seiva através de um filtro
que bloqueava a passagem de bactérias, o filtro de Chamberland. Assim,
em fevereiro de 1892, Ivanofsky relatou à Academia de Ciências de St.
Petersburg que a seiva das folhas infectadas com a Doença do Mosaico do
Tabaco retinha sua propriedade infecciosa mesmo após a passagem pelo
filtro. Este experimento forneceu uma definição funcional de vírus (Levine
& Enquist, 2007).
Contudo, Ivanofsky, assim como Mayer, fracassou em cultivar um
organismo a partir de um extrato filtrado e, portanto, não satisfez os
postulados de Koch. Na época, muitos refutaram seus experimentos,
sugerindo que o filtro utilizado poderia estar defeituoso ou até mesmo
que sua metodologia pudesse estar errada. Por esta razão, o próprio
Ivanofsky sugeriu a possibilidade de que uma toxina (não um agente vivo
ou reprodutor) poderia passar através do filtro e causar a doença. Como
no fim do século XIX os conceitos de Koch se tornaram paradigmas
dominantes da Microbiologia Médica, muitos cientistas interpretavam
3
Introdução Geral
erroneamente seus resultados. Somente quando estas regras foram
quebradas é que o conceito de um vírus nasceu (Levine & Enquist, 2007).
O terceiro cientista a ter um papel importante no desenvolvimento
dos conceitos de vírus foi Martinus Beijerinck, que repetiu os
experimentos de Mayer e Ivanofsky, mas estendeu seus estudos
mostrando que o extrato filtrado poderia ser diluído e então recuperar sua
“força” após replicação em tecido vivo da planta hospedeira, não em
extrato sem célula, indicando que o agente não era uma simples toxina.
Este foi o progresso para a descoberta de um organismo menor que uma
bactéria (um agente filtrável), não observável em microscópio comum, e
capaz de se reproduzir em células ou tecidos vivos. Beijerinck nomeou
este agente como um líquido vivo contagioso. O conflito sobre a natureza
dos vírus serem líquidos ou partículas durou 25 anos, até d’Her elle
desenvolver o ensaio de plaque, em 1917, e o surgimento das primeiras
micrografias eletrônicas do Vírus do Mosaico do Tabaco (TMV), em 1939.
Loeffler e Frosch descreveram e isolaram o primeiro agente filtrável a
partir de animais, o Vírus da Febre Aftosa (FMDV), e Walter Reed
identificou o primeiro vírus filtrável humano, o Vírus da Febre Amarela
(YFV) (Levine & Enquist, 2007).
4
Introdução Geral
Os vírus, devido à sua natureza predatória, têm formado a história e
a evolução de seus hospedeiros. As consequências médicas das infecções
virais humanas têm alterado nossa história e têm resultado em grandes
esforços por parte dos virologistas para estudar, compreender e erradicar
estes agentes patogênicos (Levine & Enquist, 2007).
1.2.
Epidemiologia
Flaviviridae é uma grande família de patógenos virais responsável
por causar severas doenças e mortalidade em humanos e animais. A
família consiste de três gêneros: Flavivírus, Pestivírus e Hepacivírus.
Flavivírus é o maior gênero existente na família, composto por 53 espécies
de vírus que abrigam mais de 70 vírus já descritos. A classificação é
baseada em conceitos das espécies virais que consideram a morfologia, a
organização genômica, a relação das sequências de nucleotídeos, a
associação dos vetores e a ecologia dos vírus. Neste gênero, ganham
destaque o Vírus da Dengue (DENV), o Vírus da Encefalite Japonesa (JEV),
o Vírus da Encefalite Causada por Carrapato (TBEV), o Vírus do Oeste do
Nilo (WNV) e o Vírus da Febre Amarela (YFV). O nome Flavivírus é
derivado do latim, onde a palavra flavus significa amarelo, devido à
icterícia causada pelo YFV, o protótipo da família (Lindenbach & Rice, 2001).
5
Introdução Geral
Os Flavivírus, em sua grande maioria, são patógenos transmitidos
por artrópodes, onde 27 espécies de vírus são transmitidas por mosquito,
12 são transmitidas por carrapato e 14 ainda não possuem seu vetor
identificado (Gubler et al., 2007). Os sintomas da infecção podem alcançar
desde febre moderada e mal-estar até encefalite fatal e febre
hemorrágica.
Os Flavivírus encefalíticos JEV e WNV são vírus zoonóticos,
possuindo os pássaros como seus hospedeiros vertebrados naturais e
mosquitos da espécie Culex como vetores. YFV e DENV são vírus mais
viscerotrópicos e podem causar febre hemorrágica. Estes vírus
apresentam um ciclo florestal, possuindo os primatas inferiores como seus
hospedeiros vertebrados e mosquitos Aedes como vetores principais.
As doenças causadas pelos Flavivírus estão emergindo em novas
áreas e populações, ou estão aumentando em frequência e na distribuição
geográfica (Figura 1) (Mackenzie et al., 2004).
6
Introdução Geral
Figura 1 – Distribuição Global de Flavivírus Dominantes e Potencialmente
Importantes.
JE, Encefalite Japonesa; SLE, Encefalite de St. Louis; TBE, Encefalite Causada por
Carrapato; WNE, Encefalite do Oeste do Nilo; YF, Febre Amarela; DEN, Dengue.
Adaptado de Ghosh & Basu, 2008.
Figura 2 – Uma Década da Doença Dengue (1995-2005).
O vírus da Dengue é endêmico na maioria das áreas tropicais e subtropicais do mundo.
Os números de casos de febre provocada pela Dengue, incluindo os casos de dengue
hemorrágica no período entre 1995 e 2005 estão mostrados. Uma falta de vigilância
dos casos de dengue durante a década passada dificulta avaliar os níveis endêmicos de
Dengue nesta região. Extraído de Whitehead et al., 2007.
7
Introdução Geral
O DENV, que é transmitido por mosquito, é responsável pelas
maiores taxas de doença e mortalidade entre os membros do gênero
(Burke & Monath, 2001). Epidemias globais do DENV têm ocorrido, em parte,
devido a uma diminuição do empenho no que diz respeito ao controle dos
mosquitos acoplada a fatores sociais, como o aumento da densidade
urbana (Lindenbach et al., 2007). Mais de 50 milhões de casos da infecção
causada pelo DENV são estimados ocorrer anualmente (Figura 2) (Burke &
Monath, 2001; Gubler, 2002; WHO, 2002a). Infecções sequenciais por múltiplos
sorotipos do DENV podem levar a um quadro de febre hemorrágica, dos
quais existe uma estimativa de 500 mil casos anuais no mundo inteiro
(Burke & Monath, 2001).
WNV tem origem africana, mas sua distribuição é quase global, uma
vez que já foi isolado em quase todos os continentes, exceto na Antártica
(Figura 1). Este vírus é transportado por aves migratórias e tem emergido
em regiões temperadas da Europa e da América do Norte. A doença era
geralmente moderada, onde danos neurológicos eram raros. A partir da
década de 1990, o padrão epidemiológico mudou. Epidemias associadas a
altas taxas de doenças neurológicas e morte em cavalos e humanos
começaram a ocorrer no Norte da África. Em outubro de 2005, mais de 16
mil pessoas foram infectadas com WNV nos Estados Unidos, 7 mil das
8
Introdução Geral
quais foram afetadas por doenças neurológicas e mais de 600 pessoas
morreram (Gubler et al., 2007).
A Febre Amarela é uma doença zoonótica, cujo ciclo de transmissão
primária envolve primatas não humanos e mosquitos silvestres.
Alternativamente, os mosquitos domésticos, Aedes aegypti, podem
transmitir o vírus, sendo os humanos os únicos hospedeiros que
apresentam viremia no ciclo urbano. A Febre Amarela ocorre em muitos
países tropicais da América do Sul e da África Sub-Saariana (Gubler et al.,
2007). A Organização Mundial da Saúde estima que a cada ano existam
cerca de 200 mil casos de Febre Amarela, com aproximadamente 30 mil
mortes em todo o mundo (WHO, 2001). O oeste da África, uma região
bastante incidente, já experimentou cinco epidemias urbanas de Febre
Amarela desde 2000 (WHO, 2005).
O JEV apresenta uma ampla distribuição pela Ásia. Cerca de 50 mil
casos e 10 mil mortes são identificados anualmente por toda a Ásia,
porém a doença é fracamente relatada. A incidência no Japão, na Coréia
do Sul e em Taiwan tem declinado consideravelmente desde a década de
1980 devido à expansão do uso da vacina em crianças, além de outras
medidas preventivas. Apesar disso, a incidência de Encefalite Japonesa na
China ainda é alta e alcança mais de 10 mil casos por ano (Gubler et al.,
9
Introdução Geral
2007). Em 2001, mais de 50 mil casos da doença foram reportados ( WHO,
2002b). Além disso, em 2004, uma pequena epidemia ocorreu em Hong
Kong. Em países mais pobres da Ásia, 68% das crianças estão em risco.
Estudos na Índia mostram que 70% dos pacientes com Encefalite Japonesa
podem morrer ou apresentar deficiência neurológica (Gubler et al., 2007).
O TBEV apresenta uma distribuição natural por todo norte central
da Eurásia, incluindo pelo menos 16 países na Europa, que geralmente
segue a distribuição geográfica dos principais carrapatos vetores. Na
Rússia, a maior incidência ocorre no oeste da Sibéria, com mais de 10 mil
casos anualmente. Nos países da Escandinávia, o número de casos tem
aumentado possivelmente devido aos invernos mais quentes e à chegada
precoce da primavera (Gubler et al., 2007).
1.3.
A Febre Amarela
1.3.1. Histórico da Doença
A Febre Amarela foi reconhecida como uma entidade clínica em
1648, em Yucatan. As áreas tropicais das Américas foram sujeitas a
grandes epidemias desde o século XVII até início do século XX, e a doença
ocorreu em focos epidêmicos até o norte de Boston e Halifax. Ela também
apareceu durante o século XVIII na Itália, França, Espanha e Inglaterra. Em
10
Introdução Geral
1905, ainda houve 5000 casos e 1000 mortes nos portos das cidades do
sul dos EUA. Os mosquitos foram sugeridos como vetor da Febre Amarela
por Nott em 1848, mas esta teoria só foi seriamente proposta por Carlos
Finlay, em 1881. Em 1900, Walter Reed demonstrou a existência de um
agente filtrável no sangue de pacientes (Gubler et al., 2007).
Os Flavivírus têm sido experimentalmente estudados desde inícios
do século passado. O Vírus da Febre Amarela (YFV) foi o primeiro agente
filtrável mostrado como sendo um causador de doença em humanos, e o
primeiro vírus demonstrado ser transmissível por um vetor artrópode
(Theiler & Downs, 1973). Essas descobertas ocorreram no limiar do século XX,
cerca de 350 anos após a primeira descrição da doença.
Em 1927, Mahaffy e Bauer isolaram o primeiro Flavivírus, o YFV, por
inoculação de um macaco Rhesus com sangue de um paciente em Ghana.
Esta foi a fonte da cepa Asibi, origem da vacina 17D (Stokes et al., 1928). Em
1937, Theiler e Smith relataram a atenuação da cepa Asibi por passagens
em embriões de galinha e demonstraram o uso dos vírus modificados
(17D) para imunização humana (Theiler
& Smith, 1937a).
Durante a primeira
década do século passado, o Vírus da Dengue foi também mostrado ser
um agente filtrável e transmitido por artrópodes, mas ele não foi isolado
até 1943.
11
Introdução Geral
A Febre Amarela continuou sendo um dos maiores problemas de
saúde pública nas Américas. Os maiores casos são do tipo selvagem, e
nenhuma epidemia ocasionada por Aedes aegypti tem sido relatada nos
últimos 50 anos. Entretanto, na África, grandes epidemias envolvendo
milhares de casos continuam ocorrendo, e a incidência da doença tem
sido dramaticamente aumentada nos últimos anos (Lindenbach & Rice, 2001).
O Aedes aegypti e vários vetores silvestres têm sido responsáveis pelas
transmissões epidêmicas neste continente.
1.3.2. As Características da Doença
A Febre Amarela é uma doença infecciosa, não contagiosa, que se
mantém endêmica ou enzoótica nas florestas tropicais da América e
África, causando periodicamente surtos isolados ou epidemias de maior
ou menor impacto em saúde pública, sendo transmitida ao homem
mediante a picada de insetos hematófagos da família Culicidae, em
especial dos gêneros Aedes e Haemagogus (Monath,
2001).
Humanos e
primatas são os principais animais infectados pelo vetor, o mosquito.
O Vírus da Febre Amarela se insere no grupo dos arbovírus,
apresentando-se em sua forma clássica com febre hemorrágica de elevada
letalidade. A Febre Amarela constitui a febre hemorrágica original, a
12
Introdução Geral
primeira descrita e que mais temor provoca na sociedade moderna
(Monath, 2001).
Sob o ponto de vista epidemiológico, a Febre Amarela se divide em
duas formas, rural e urbana, que diferem entre si quanto à natureza dos
transmissores e dos hospedeiros vertebrados, e o local de ocorrência
(Monath,
1988).
Embora apenas um sorotipo do vírus amarílico seja
conhecido, há pequenas alterações genéticas entre as cepas da América e
da África, que permitem atualmente caracterizar dois e cinco genótipos,
respectivamente, não se sabendo se um é mais patogênico que o outro
(Wang et al., 1996; Mutebi et al., 2001).
Eliminou-se a forma urbana na América em 1954, mas ainda hoje
ela ocorre na África (Monath,
2001).
A letalidade global varia entre 5-10%,
percentual elevado quando comparado a outras viroses. Entre os casos
graves que evoluem com síndromes ictero-hemorrágica e hepato-renal, a
letalidade pode chegar a 50%. Os pacientes mais acometidos são
geralmente indivíduos jovens, do sexo masculino, realizando atividades
agropecuárias e de extração de madeira, bem como ecoturistas que se
embrenham nas matas sem vacinação prévia.
A África responsabiliza-se por mais de 90% dos casos de Febre
Amarela anualmente notificados à Organização Mundial de Saúde, o que
13
Introdução Geral
corresponde a cerca de 5000 casos anuais. Na América do Sul, estima-se a
ocorrência de 300 casos por ano. E em alguns países da África há
transmissão urbana da doença (Robertson et al., 1996).
O vírus inicialmente se replica nos nódulos linfáticos, então se
espalha para o fígado, baço, medula óssea e miocárdio (Shoff et al., 2001). Ele
permanece silencioso durante uma fase de incubação que dura de 3 a 6
dias, e então o indivíduo apresenta um quadro de febre, mialgia, dor de
cabeça, anorexia e vômito. Geralmente a febre ocorre em pulsos lentos.
Muitos pacientes melhoram após 3 a 4 dias. Contudo, 15% entram na
“fase tóxica” dentro de 24 horas, e sua condição progride para coagulação
intravascular disseminada (Shoff et al., 2001). A febre reaparece, e a icterícia
hemolítica e hepática se desenvolve rapidamente, e é acompanhada por
dores abdominais e vômitos. A hemorragia pode ocorrer no nariz, boca,
olhos ou estômago, e o funcionamento do rim deteriora. O tratamento é
mantido, mas metade dos pacientes morrem na “fase tóxica”, dentro de
duas semanas.
1.3.3. A Vacinação: suas vantagens e seus problemas
O controle da transmissão dos Flavivírus tem sido realizado
principalmente por medidas de controle do vetor e pela vacinação.
14
Introdução Geral
Entretanto, um número ainda limitado de vacinas está disponível,
incluindo a vacina contra a Febre Amarela (YF), que usa o vírus YF 17D
atenuado, as vacinas inativadas contra a Encefalite causada por carrapato
(TBE) e a Encefalite Japonesa (JE), todas para uso em humanos, além da
vacina inativada contra a Febre do Oeste do Nilo (WN), para uso em
animais (Mackenzie et al., 2004; Pugachev et al., 2005).
Apesar disso, as doenças provocadas por estes vírus são ainda
proeminentes no mundo inteiro (Lindenbach
& Rice, 2001).
Grandes esforços
vêm sendo empenhados para o desenvolvimento de uma vacina contra
DENV e este tem sido um desafio constante há décadas. A principal
questão é desenvolver uma vacina que proteja simultaneamente contra os
quatro sorotipos existentes (Sampath & Padmanabhan, 2009).
Na ausência de vacinas, fármacos para terapias específicas se
tornam necessários, mas nenhuma medicação antiviral está aprovada para
uso contra os Flavivírus. Ribavirina suprime a replicação de alguns agentes
in vitro, mas demonstrações de atividade in vivo têm tornado este
fármaco limitante para uns poucos modelos de roedores (Leyssen et al., 2008).
Existe, então, uma necessidade de identificação e desenvolvimento de
novos antivirais que possam reduzir a viremia durante os estágios iniciais
da infecção, bloqueando a replicação viral no cérebro no caso de uma
15
Introdução Geral
possível encefalite, ou modulando a resposta do hospedeiro para evitar ou
combater a doença (Bray, 2008).
Desta maneira, não havendo tratamento específico para o paciente
acometido pela doença, o médico deve tratar os sintomas, como as dores
de cabeça e no corpo, com analgésicos e antitérmicos. Porém, devem ser
evitados os salicilatos (AAS e Aspirina), já que seu uso pode favorecer o
aparecimento de manifestações hemorrágicas.
Em 1927, uma cepa do YFV foi isolada, a qual mais tarde resultou na
vacina usada para imunização humana: a cepa Asibi (Stokes
et al., 1928)
isolada de um jovem africano, assim chamado, por passagens em macacos
Rhesus (Macaca mulatta).
Em 1935, a cepa Asibi foi adaptada para o crescimento em tecido
embrionário de camundongos (Lloyd et al., 1936). Após 17 passagens, o vírus,
nomeado 17D, foi cultivado até a passagem 58 em tecido embrionário
sadio de galinha e depois disso, até a passagem 114, somente em tecido
embrionário de galinha denervado. Nesta época, verificou-se uma redução
acentuada no viscero- e neurotropismo viral quando o vírus foi injetado
intracerebralmente em macacos (Theiler
& Smith, 1937b).
Além disso, estes
vírus foram subcultivados até passagens 227 e 229, que foram usados em
8 voluntários (Theiler
& Smith, 1937a)
com resultados satisfatórios, como
16
Introdução Geral
mostrado pela ausência de reações adversas e soroconversão para Febre
Amarela dentro de duas semanas. A imunização em larga escala foi então
realizada no Brasil (Smith et al., 1938; Soper & Smith, 1938).
O desenvolvimento da primeira vacina atenuada contra Flavivírus,
YFV cepa 17D, levou ao reconhecimento de Max Theiler através de um
Prêmio Nobel em 1951. Atualmente, duas cepas são usadas na produção
de vacinas contra a Febre Amarela: 17DD no Brasil e 17D-204 no resto do
mundo. A diferença entre elas é que a cepa 17DD possui 81 passagens a
mais (Galler et al., 2001).
YF 17D é uma vacina viral atenuada, segura e eficaz, preparada a
partir de embriões de galinha infectados sob os padrões desenvolvidos
pela Organização Mundial de Saúde (Lindenbach
& Rice, 2001).
A imunidade
ocorre em cerca de 95% dos vacinados dentro de 10 dias. Pela proposta
do certificado internacional, a imunização é válida por 10 anos, mas vários
estudos têm mostrado persistência dos anticorpos por mais de 30 anos
(Lindenbach
& Rice, 2001).
Muitos países da América do Sul conduzem
campanhas de vacinação e uma grande cobertura da vacina em áreas
enzoóticas tem limitado a incidência da doença em humanos.
O princípio da vacina de vírus atenuado é que o patógeno é
suficientemente deficiente, sendo incapaz de provocar doença. As
17
Introdução Geral
maiores preocupações no desenvolvimento de vacinas atenuadas são o
grau de atenuação e o potencial para reversão da virulência. Utilizando a
tecnologia convencional, a atenuação é realizada por passagens do agente
in vitro, e os variantes são selecionados pela sua virulência reduzida. Uma
vez que o agente deve se replicar in vivo com o objetivo de induzir uma
resposta imune efetiva, a super-atenuação limitaria a replicação, e a
magnitude e a qualidade da resposta imune não seriam adequadas para
fornecer proteção contra o vírus selvagem. Em contraste, a baixa
atenuação resultaria em doença clínica. Então, deve existir um balanço
fino entre a atenuação de magnitude suficiente para reduzir os sinais
clínicos e a super-atenuação, que limitaria a eficiência da vacina (Babiuk et
al., 2002).
Infelizmente, esta maneira de abordar é puramente empírica, já que
os genes podem ser alterados como resultado de mutações, o que leva a
dois problemas. Primeiro, cada mutante deve ser testado in vivo para
avaliar se seu nível de atenuação é suficiente para não causar doença, e
ainda assim ser capaz de estimular a imunidade e a memória. Segundo,
uma vez que a atenuação ocorre ao acaso e ela não é caracterizada, existe
a possibilidade do agente voltar a mutar e reverter a virulência (Babiuk et
al., 2002).
18
Introdução Geral
Assim, apesar destas vacinas serem geralmente muito eficientes,
existe uma preocupação em relação ao seu potencial satisfatório. Isto é o
caso
de
alguns
indivíduos
que
possam
estar
parcialmente
imunossuprimidos devido ao estresse ou a outros fatores que possam
torná-los susceptíveis à vacina atenuada. Algumas destas vacinas não
podem ser usadas em grávidas, já que podem induzir aborto (Straub, 1990).
É por esta razão que algumas companhias, produtores e países não são
favoráveis às vacinas atenuadas. Se a estabilidade genética para estas
vacinas fosse bem controlada, elas seriam consideradas melhores que as
vacinas inativadas, uma vez que elas induzem uma ampla resposta imune
(celular e humoral), similar àquela induzida pela infecção natural. Outra
vantagem da vacina é que os vírus se replicam normalmente no
hospedeiro e isto geralmente induz uma maior duração da imunidade.
Existem
também
outras
desvantagens,
como
a
presença
de
contaminantes estranhos aos vírus, já que a vacina é crescida em cultura
de tecido (Babiuk et al., 2002).
Estudos comparativos das cepas selvagens e variantes vacinais
indicaram somente 13 substituições nos aminoácidos, sendo 5 deles
localizados na proteína de envelope (Duarte dos Santos et al., 1995), o que pode
estar associado com a atenuação. Simulação computacional do
19
Introdução Geral
enovelamento e da estrutura secundária do ARN viral derivado da região
3’ não-codificante tem mostrado diferenças entre as cepas atenuada e
virulenta, que podem ser de importância funcional (Proutski
et al., 1997).
Contudo, apesar de muitos estudos, o conhecimento dos fatores virais que
implicam na atenuação ainda está incompleto.
Os vírus vacinais são testados em macacos Rhesus para ausência de
neurotropismo e efeitos clínicos, e para garantir que alguma viremia
resultante seja baixa. Desde o declínio dos programas de controle dos
mosquitos na década de 80, a vacina 17D tem sido o elemento chave no
controle da Febre Amarela. A vacina não é recomendada para crianças
menores de 9 meses, devido à grande incidência de neurotropismo. Em
1994, uma cepa isolada de um caso fatal de encefalite associada à vacina
apresentou diferenças na sequência quando comparada ao vírus vacinal, e
foi associada com o aumento da virulência em camundongos e macacos
(Jennings et al., 1994).
Por mais de 50 anos a vacina contra a Febre Amarela foi quase além
da censura. Entretanto, recentemente, sete casos associados à vacina,
sendo seis fatais, têm desafiado a reputação dessa vacina: dois foram
brasileiros (Vasconcelos
et al., 2001),
quatro foram turistas norte-americanos
(Martin et al., 2001), e um foi um turista australiano (Chan et al., 2001). Assim,
20
Introdução Geral
uma maneira de resolver o problema da segurança e reversão da
virulência é o uso de vacinas inativadas, que são produzidas pela
inativação dos agentes infecciosos, de maneira que este não se replica no
hospedeiro e não altera a imunogenicidade das proteínas protetoras. A
maior desvantagem das vacinas inativadas é que elas não são muito
imunogênicas e, portanto, necessitam ser combinadas a fortes adjuvantes
para melhorar sua eficácia. E apesar de existir uma constante busca por
novos adjuvantes, somente poucos têm sua eficiência comprovada, e
muitos deles são caros e frequentemente levam a reações colaterais
adversas (Babiuk et al., 2002).
As vacinas inativadas consistem de agentes íntegros, que tenham
sido “mortos” por aquecimento ou por substâncias químicas (como é o
caso da vacina inativada contra a Poliomielite), ou são simplesmente a
parte importante do agente infeccioso que promove resposta através do
sistema imune (como na vacina contra Hepatite B). Ao contrário das
vacinas atenuadas, as vacinas inativadas não são capazes de se replicar e,
portanto, não causam nem os casos brandos da doença, porém sua
presença promove uma resposta rápida do sistema imune. Entretanto,
estas vacinas causam uma resposta relativamente fraca, de maneira que a
vacinação deve ser repetida. Diferente das vacinas atenuadas, as vacinas
21
Introdução Geral
inativadas são seguras para as pessoas que têm seu sistema imune
enfraquecido, para mulheres grávidas e para crianças com menos de um
ano. Os efeitos colaterais geralmente são apresentados na forma de dores
apenas onde a vacina foi injetada e, possivelmente, alguma febre breve
após a vacinação.
De fato, cinco são os problemas das vacinas que utilizam os vírus
“vivos”: 1) a possibilidade de reversão da linhagem da vacina, o que causa
aumento da virulência; 2) desenvolvimento da doença em indivíduos
imunosuprimidos; 3) má formação fetal, particularmente se a vacina é
dada no primeiro trimestre; 4) disseminação da linhagem vacinal a
pessoas não vacinadas; e 5) o descobrimento de complicações anteriores
desconhecidas (Seligman & Gould, 2004).
Apesar disso, a vacinação permanece altamente aconselhável para
moradores e turistas de áreas endêmicas e epidêmicas. Contudo, esses
relatos levantam questões relevantes sobre os mecanismos de atenuação
do Vírus da Febre Amarela que precisam ser urgentemente investigados.
Por este motivo, o Ministério da Saúde solicitou à Fundação
Oswaldo Cruz, maior produtor da vacina atualmente utilizada no Brasil, o
desenvolvimento de uma vacina inativada contra o YFV. Embora as vacinas
inativadas apresentem algumas vantagens como o reduzido custo de
22
Introdução Geral
produção e um baixo risco de reversão da doença, elas têm sido
correlacionadas com algumas desvantagens, como o risco de uma
incompleta inativação, toxicidade dos agentes químicos que normalmente
são utilizados para inativar as partículas virais, e alterações nas
propriedades imunogênicas dos vírus.
A alta pressão hidrostática (APH) tem sido apontada como uma
ferramenta alternativa para inativação viral e o desenvolvimento de uma
possível vacina (Masson et al., 2001; Silva et al., 2002; Ishimaru et al., 2004; Murchie et al.,
2005).
Como um método físico, a APH apresenta como vantagem não
introduzir substâncias exógenas dentro da vacina, além de ser
frequentemente seletiva na sua ação sobre estruturas macromoleculares,
o que geralmente resulta em preparações altamente imunogênicas (Silva et
al., 1992; Tian et al., 1999; Pontes et al., 2001; Ishimaru et al., 2004).
Com este objetivo, iniciamos uma colaboração com o Laboratório
de Tecnologia Virológica (LATEV) de Bio Manguinhos, que apresenta uma
grande experiência nesta área. Nossa intenção era buscar a condição ideal
de inativação do YFV 17DD utilizando como ferramenta a APH. A partir
deste resultado que foi bastante satisfatório, este trabalho endereçou
duas questões importantes: será que as partículas virais inativadas são
capazes de gerar uma resposta imunológica eficiente? Qual o grau de
23
Introdução Geral
modificação que a pressão promove na estrutura das partículas? Esta
última questão foi abordada em minha dissertação de mestrado, onde
mostramos que a pressão é capaz de induzir uma mudança
conformacional sutil parcialmente reversível, mantendo as partículas
íntegras (Mendes, 2005). Assim, a possível resposta imunogênica induzida
pelo YFV 17DD inativado por APH será abordada na segunda parte desta
tese.
1.4.
A Estrutura dos Flavivírus
Os virions do gênero Flavivírus possuem aproximadamente 50 nm
de diâmetro e são compostos por um genoma ARN de fita simples,
polaridade positiva, que é empacotado por proteínas capsídicas virais e
uma bicamada lipídica derivada da célula hospedeira, onde se encontram
inseridas 180 cópias de duas glicoproteínas virais (Figura 3) (Lindenbach &
Rice, 2001; Mukhopadhyay et al., 2005).
A proteína E consiste de um dímero em que cada monômero
apresenta três domínios em β-barril: um domíno estrutural central
(domínio I) contém o N-terminal e é flanqueado pelos outros dois
domínios; um domínio de dimerização alongado (domínio II), que contém
um peptídeo de fusão em sua extremidade; e um domínio III, que é um
24
Introdução Geral
domínio tipo imunoglobulina e contém o sítio de ligação ao receptor
(Whitehead et al., 2007).
Glicoproteína de Envelope
―
Domínio I – estrutura central
―
Domínio II – dimerização
―
Domínio III – ligação ao receptor
―
Peptídeo de Fusão
Figura 3- Estrutura do Vírus da Dengue Maduro.
Empacotamento da glicoproteína E no vírus maduro. O DENV é um vírus esférico e
envelopado, apresentando um diâmetro de aproximadamente 50 nm. Um dos 90
domínios compostos por um dímero da glicoproteína E dispostos paralelamente está
em evidência. Os domínios I, II e III estão coloridos em vermelho, amarelo e azul
respectivamente. O peptídeo de fusão está representado em verde. Adaptado de
Whitehead et al., 2007.
25
Introdução Geral
O genoma em torno de 10,8 kb é uma região aberta de leitura
flanqueada por regiões 5’ e 3’ não traduzidas, que apresentam estruturas
secundárias essenciais para a iniciação da tradução e para a replicação. A
tradução do genoma pela maquinaria da célula hospedeira codifica uma
única poliproteína. Cerca de ¼ do terminal amino desta poliproteína
codifica três proteínas estruturais – capsídica (C), de membrana (M, que é
expressa como prM, o precursor da M) e de envelope (E) – que
constituem a partícula viral. O restante do genoma codifica as proteínas
não-estruturais – NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, 2K, NS4B e NS5 - que são
essenciais para a replicação viral (Lindenbach et al., 2007).
A proteína capsídica é altamente básica, consiste de cerca de 120
aminoácidos (massa molecular  11 kDa) e está envolvida no
empacotamento do genoma viral e na formação do nucleocapsídeo
(Lindenbach & Rice, 2001). A proteína C nascente contém uma âncora
hidrofóbica C-terminal que serve como um peptídeo sinal para a
translocação de prM pelo retículo endoplasmático (RE). Este domínio
hidrofóbico é clivado pela serino-protease viral (Lobigs, 1993). A proteína C
se enovela em dímeros compactos e cada monômero possui quatro hélices (Jones et al., 2003; Dokland et al., 2004; Ma et al., 2004). Ainda não está
claro como os dímeros da proteína C se organizam em nucleocapsídeos,
26
Introdução Geral
mas a interação com ARN ou ADN pode induzir dímeros isolados a se
montarem em partículas como nucleocapsídeos (Kiermayr et al., 2004).
prM e E são duas glicoproteínas que ficam ancoradas no envelope
lipídico viral através de duas hélices transmembranares e que, durante a
montagem dos virions no RE, ficam complexadas, formando partículas
imaturas. A glicoproteína prM ( 26 kDa) é a proteína precursora da
proteína M e funciona como uma chaperona para auxiliar no perfeito
enovelamento e montagem da proteína E (Lorenz et al., 2002). Assim, a
principal função da prM é evitar que a proteína E sofra um rearranjo
estrutural, catalisado pelo meio ácido, para a forma fusogênica durante a
transição através da via secretória (Guirakhoo et al., 1992; Heinz et al., 1994).
A conversão das partículas imaturas em maduras (Figura 4) ocorre
na via secretória e coincide com a clivagem de prM pela protease furina
do Golgi, produzindo o peptídeo pr e a proteína M (~ 75 aminoácidos)
(Stadler et al., 1997). Após a clivagem, o heterodímero prM-E se dissocia, o
fragmento pr é liberado e ocorre a formação de homodímeros da proteína
E (Wengler & Wengler, 1989; Stiasny et al., 1996).
27
Introdução Geral
B
A
C
Ativação
da Fusão
Maturação
Vírus Imaturo
Trímero de Heterodímeros prM-E
Vírus Maduro
Homodímero E
Vírus Pós-Fusão
Trímero de E
Figura 4 – Estrutura do Ectodomínio da Proteína E dos Flavivírus e seus Diferentes
Estados Oligoméricos.
Estado oligomérico da proteína E na partícula imatura (A), na partícula madura (B) e na
conformação fusogênica (C). Na partícula imatura, a proteína E forma um trímero de
heterodímeros prM-E, que deve se dissociar e formar homodímeros de proteína E
durante a maturação. Em seguida, ocorre uma reorganização para formar
homotrímeros de proteína E anterior ao processo de fusão e entrada do vírus na
célula. Em um monômero da proteína E, os domínios I, II e III estão coloridos em
vermelho, amarelo e azul, respectivamente, e o peptídeo de fusão está mostrado em
verde. A proteína prM, colorida em ciano, só é encontrada nos vírus imaturos e está
mostrada em seu papel como uma estrutura protetora do peptídeo de fusão. Extraído
de Perera et al., 2008.
28
Introdução Geral
A glicoproteína E ( 53 kDa), a maior proteína da superfície dos
Flavivírus, é o maior representante antigênico da partícula viral e contém
um sítio de ligação ao receptor celular e um peptídeo de fusão importante
para a entrada do vírus na célula hospedeira (Allison et al., 2001). A forma
nativa de E se enovela em uma estrutura alongada rica em folhas-β,
formando homodímeros que se dispõem paralelamente à superfície viral
(Rey et al., 1995). Cada subunidade da proteína E é composta por três
domínios: I, que forma uma estrutura barril-β; II, que se projeta ao longo
da superfície do vírus entre as regiões transmembranares das subunidades
homodiméricas; e III, que mantém um enovelamento tipo imunoglobulina.
O Domínio III parece estar envolvido na ligação ao receptor e é o maior
alvo de anticorpos neutralizantes.
Os vírus envelopados infectam as células via fusão da membrana
viral com a membrana da célula hospedeira (Earp et al., 2005; Harrison, 2005).
Este evento de fusão, essencial para o ciclo de infecção destes vírus,
entrega o genoma viral para dentro do citoplasma para iniciar a infecção.
A fusão de membranas dos vírus pode ocorrer tanto na membrana
plasmática ou em uma localização intracelular após internalização do vírus
por endocitose mediada por receptor (Smith & Helenius, 2004; Earp et al., 2005;
Sieczkarski & Whittaker, 2005). A fusão é mediada pelas proteínas virais
29
Introdução Geral
transmembranares conhecidas como proteínas de fusão. Sob condições
apropriadas, as proteínas de fusão interagem com a membrana alvo
através
de
um
segmento
hidrofóbico
e
sofre
uma
mudança
conformacional que governa a reação de fusão de membrana (Earp et al.,
2005).
Baseado em características estruturais importantes, as proteínas de
fusão de membrana dos vírus envelopados são divididas dentro de três
grupos (Figura 5): as proteínas de fusão da classe I, exemplificadas pela
hemaglutinina (HA) do vírus Influenza e pela gp41 do HIV-1, as proteínas
de fusão da classe II dos Alfavírus e dos Flavivírus, e as proteínas de fusão
da classe III, que foi descrita mais recentemente e tem como
representante a proteína G do VSV (Lescar et al., 2001; Da Poian et al., 2005;
Kielian, 2006; Harrison, 2008). Dentre todas as proteínas de fusão, a
hemaglutinina do vírus Influenza é a proteína de fusão melhor
caracterizada.
As proteínas de fusão da classe II são moléculas alongadas com três
domínios globulares compostos praticamente por folhas-β que se
arranjam em dímeros antiparalelos à superfície viral e sofrem uma
mudança conformacional para formarem uma estrutura trimérica durante
a reação de fusão. Em contraste, as proteínas de fusão da classe I são
30
Introdução Geral
homotrímeros que se projetam verticalmente da membrana viral e
contêm principalmente estrutura em
-hélice. Uma importante
característica é que estas proteínas são trímeros antes e após a reação de
fusão. As proteínas da classe III são muito similares às da classe I, mas sua
principal diferença está na reversibilidade conformacional do seu estado
fusogênico (Skehel & Wiley, 2000; Da Poian et al., 2005; Kielian, 2006; Harrison,
2005; 2008).
31
Introdução Geral
A
B
C
Figura 5 – Sequência de Eventos Mostrando as Mudanças Conformacionais de
Diferentes Proteínas de Fusão de Vírus.
(A) Alterações sofridas pelas proteínas de fusão classe I, mostrando sua conformação
de pré-fusão (a), a dissociação da proteína HA1 (b), a estrutura intermediária de fusão
(c) e a conformação de pós-fusão (d). O inserto ilustra algumas características da
região proximal de membrana da HA2 após o término da fusão. O asterisco ilustra o
peptídeo de fusão. Cada subunidade é mostrada em cores diferentes. (B) Alterações
das proteínas classe II, mostrando a estrutura viral com as 180 subunidades da
proteína E com os seus respectivos domínios I (vermelho), II (amarelo) e III (azul) (a),
visão lateral da conformação pré-fusão (b), transição monomérica entre o dímero préfusogênico e estado intermediário trimérico (c), estado intermediário estendido (d) e a
conformação pós-fusão (e). (C) Alterações conformacionais das proteínas classe III,
mostrando o trímero pré-fusogênico (a), a conformação pré-fusogênica (b), a
conformação intermediária estendida (c), a conformação pós-fusão de uma
subunidade (d) e a conformação pós-fusão do trímero (e). As três subunidades são
mostradas em cores diferentes e o asterisco denota o loop de fusão. Extraído de
Harrison et al., 2008.
32
Introdução Geral
1.5.
Ciclo de Infecção: entrada,
processamento das proteínas
replicação
do
genoma
e
Os Flavivírus se ligam à superfície da célula hospedeira e
subsequentemente entram por endocitose mediada por receptor (Figura
6). Diversas moléculas de superfície celular, atuando como receptores
primários e co-receptores de baixa afinidade, vêm sendo descritas por
interagirem com partículas de Flavivírus, mas somente poucas vêm sendo
de fato caracterizadas. Os Flavivírus podem utilizar múltiplos receptores
para diferentes tipos celulares e em diferentes espécies de hospedeiro
(Mukhopadhyay et al., 2005; Lindenbach et al., 2007).
A infecção por DENV e WNV de células dendríticas, um provável
alvo primário da infecção, diferentemente para o YFV-17D, depende da
expressão celular de lectina tipo C, que funcionaria apenas como um
receptor de ligação, já que sua internalização não é necessária
(Tassaneetrithep et al., 2003; Lozach et al., 2005; Davis et al., 2006; Barba-Spaeth et
al., 2005). Desta maneira, outras moléculas seriam essenciais para a
endocitose ocorrer. Glicosaminoglicanos altamente sulfatados, como
heparan sulfato, parecem exercer um papel importante na ligação inicial
de diversos Flavivírus às células alvo (Chen et al., 1997; Kroschewski et al.,
2003).
33
Introdução Geral
Os Flavivírus são internalizados via invaginações cobertas por
clatrina e trafegam para um compartimento endocítico pré-lisossomal,
onde o baixo pH induz a fusão entre o vírus e a membrana da célula
hospedeira para liberar o nucleocapsídeo (Gollins & Porterfield, 1986; Chu &
Ng,
2004).
A acidificação endossomal promove uma trimerização
irreversível da proteína E, que resulta na fusão do envelope viral com a
membrana da célula hospedeira (Figura 3) (Allison et al., 1995, Stiasny et al.,
1996). Após a fusão ter ocorrido, o nucleocapsídeo é liberado para dentro
do citoplasma, onde a proteína capsídica e o ARN se dissociam (Figura 6)
(Lindenbach et al., 2007).
34
Introdução Geral
Figura 6 – O Ciclo Replicativo dos Flavivírus.
Os virions se ligam a moléculas e receptores da célula hospedeira e são internalizados
por endocitose. No pH endossomal, a glicoproteína E medeia a fusão entre o envelope
viral e a membrana celular, permitindo a desmontagem do virion e a liberação do ARN
no citoplasma. O ARN viral é traduzido em uma poliproteína que é processada por
proteases virais e celulares. As proteínas não-estruturais, então, replicam o genoma
viral. A montagem do virion ocorre na membrana do RE. A proteína capsídica e o ARN
viral são envelopados pelas glicoproteínas E e prM inseridas na membrana para formar
partículas imaturas, que então são transportadas através da via secretória. Na rede
trans-Golgi, prM é clivada pela furina. Virions maduros são agora liberados por
exocitose. Extraído de Sampath & Padmanabhan, 2009.
35
Introdução Geral
Uma vez o genoma liberado dentro do citoplasma, o ARN
polaridade positiva é traduzido diretamente para uma única poliproteína
que é co- e pós-traducionalmente processada pela serino-protease viral
(NS2B/NS3) e por proteases hospedeiras (sinalase e furina) em pelo
menos dez proteínas. A peptidase sinal do hospedeiro é responsável pelas
clivagens entre C/prM, prM/E, E/NS1 e 2K-NS4B. Uma serino-protease
codificada pelo vírus é responsável pelas clivagens entre NS2A/NS2B,
NS2B/NS3, NS3/NS4A, NS4A/2K e NS4B/NS5 (Figura 7). A enzima
responsável pela clivagem NS1/NS2A permanece desconhecida até o
momento (Lindenbach et al., 2007).
36
Introdução Geral
Figura 7 – Representação Esquemática da Organização do Genoma e do
Processamento da Poliproteína dos Flavivírus.
O genoma ARN (~ 11 kb) de fita simples polaridade positiva contém região aberta de
leitura (ORF) que codifica proteínas estruturais – Capsídica (C), precursor de
Membrana (prM) e Envelope (E) – e não-estruturais - NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, 2K,
NS4B e NS5. ORF é rodeado por regiões não traduzidas. Os sítios de clivagem da
poliproteína pela NS2B-NS3 viral e pelas sinalase e furina do hospedeiro estão
indicados. As atividades enzimáticas de NS3 e NS5 também estão mostradas. Extraído
de Sampath & Padmanabhan, 2009.
37
Introdução Geral
NS3 (70 kDa) e NS5 (104 kDa) são as proteínas não-estruturais mais
bem caracterizadas, com múltiplas atividades enzimáticas necessárias à
replicação viral. NS3 apresenta três atividades distintas: (1) serinoprotease (junto com o co-fator NS2B), essencial para o processamento da
poliproteína; (2) atividade helicase/NTPase, importante para desenrolar a
forma dupla fita replicativa do ARN; (3) ARN trifosfatase, necessária para
proteger o ARN viral nascente (Falgout et al., 1991; Zhang et al., 1992; Arias et al.,
1993; Li et al., 1999; Benarroch et al., 2004). Mutações que afetam cada
atividade impedem a replicação viral (Matusan et al., 2001a,b). NS5 é a
proteína maior e mais conservada dos Flavivírus, com mais de 75% de
identidade de sequência em relação a todos os sorotipos de DENV. Esta
proteína apresenta duas atividades enzimáticas distintas: metiltransferase
e ARN polimerase dependente de ARN (Egloff et al., 2002; Grun & Brinton,
1986; Tan et al., 1996).
NS1 (46 kDa) é importante para a replicação dos Flavivírus, já que
está envolvida na síntese de ARN fita negativa por um mecanismo ainda
desconhecido (Muylaert et al., 1997). NS2A (22 kDa) é uma proteína
transmembrana pequena e hidrofóbica, que está envolvida na geração de
membranas induzidas por vírus durante a montagem viral (Leung et al.,
2008). NS4A (16 kDa) é uma proteína de membrana integral, que induz a
38
Introdução Geral
reorganização da membrana para formar o complexo de replicação viral
(Miller et al., 2007; Roosendaal et al., 2006). NS4B (27 kDa) inibe a resposta de
interferon tipo I da célula hospedeira e pode modular a replicação viral
por interagir com NS3 (Munoz-Jordan et al., 2005; Umareddy et al., 2006).
A replicação do genoma ocorre sobre membranas intracelulares e a
montagem das novas partículas virais ocorre sobre a superfície do RE,
quando as proteínas estruturais e os novos ARNs sintetizados brotam para
dentro do lúmen do RE (Lindenbach & Rice, 2001; Lindenbach & Rice, 2003;
Brinton, 2002).
As novas partículas geradas, contendo as proteínas E e prM,
membrana lipídica e nucleocapsídeo, ainda não são capazes de induzir a
fusão na célula hospedeira, portanto, não são infecciosas (Guirakhoo et al.,
1991; 1992). Estas partículas imaturas apresentam suas glicoproteínas E e
prM em uma conformação heterodimérica. Este processo de replicação é
capaz de gerar também partículas subvirais, contendo apenas as
glicoproteínas e o envelope lipídico, não possuindo, portanto, nem a
proteína capsídica, nem o genoma viral, o que também as tornam nãoinfecciosas (Schalich et al., 1996).
Por conseguinte, as partículas resultantes não-infecciosas, imaturas
e subvirais, são transportadas através da rede trans-Golgi. Os virions
39
Introdução Geral
imaturos são clivados pela protease furina hospedeira, gerando partículas
maduras infecciosas, onde suas glicoproteínas E assumem uma
conformação homodimérica na superfície do virion. As partículas subvirais
também são clivadas pela furina, sendo, desta forma, subsequentemente
liberadas por exocitose, assim como os virions maduros (Stadler et al., 1997;
Elshuber et al. 2003; Stiasny & Heinz, 2006).
Avanços na técnica de crio-microscopia eletrônica têm fornecido
importantes informações sobre a estrutura de vírus envelopados (Mancini
et al., 2000; Zhang et al., 2002; 2003). Além disso, muitas das proteínas
estruturais destes vírus vêm sendo determinadas a nível atômico (Ma et al.,
2004; Modis et al., 2003; Rey et al., 1995; Zhang et al., 2004; Lescar et al., 2001; Choi
et al., 1996; Dokland et al., 2004). Isto tem permitido as estruturas atômicas
serem fitadas dentro de mapas de densidade da crio-microscopia
eletrônica, resultando em estruturas “pseudo-atômicas” de vírus
envelopados. Desta forma, analisando diferentes intermediários na
montagem e na via de entrada dos vírus, estes processos dinâmicos
podem ser entendidos a nível molecular.
40
Introdução Geral
1.6. A Fidelidade e a Diversidade dos Peptídeos de Fusão
1.6.1. Peptídeos de Fusão
Muitos processos biológicos importantes envolvem a partição de
fragmentos de proteínas bastante hidrofóbicos dentro de membranas
lipídicas. Os peptídeos de fusão são segmentos moderadamente
hidrofóbicos de proteínas de fusão de membrana, viral ou não-viral, que
capacitam estas proteínas a romperem e conectarem duas membranas
biológicas próximas. Este processo, que resulta na fusão de membranas,
ocorre de maneira bem controlada com uma pequena quantidade de
extravazamento de conteúdo dos volumes encapsulados para o lado
externo. A questão chave é entender como os peptídeos de fusão, que são
ditos como a extensão funcional mais crítica das proteínas de fusão,
executam esta complexa tarefa (Tamm & Han, 2000).
As sequências dos peptídeos de fusão são altamente conservadas
dentro de diferentes grupos de proteínas de fusão, por exemplo, dentro
de diferentes famílias de vírus, mas não entre elas. A maioria dos
peptídeos de fusão estão localizados na extremidade N-terminal de
subunidades transmembranares de proteínas de fusão. Entretanto, em
alguns casos, peptídeos de fusão internos são encontrados, como é o caso
da proteína fertilina- de esperma, da proteína G do Vírus da Estomatite
41
Introdução Geral
Vesicular (VSV), da proteína gp64 do Baculovírus e da proteína gp37 do
Vírus do Sarcoma de Rous (Tamm & Han, 2000).
A deleção da sequência completa do peptídeo de fusão ou, até
mesmo, alterações em um único aminoácido conservado no peptídeo de
fusão podem abolir completamente a fusão de membranas, enquanto
outras propriedades estruturais e funcionais desta proteína de fusão
podem permanecer intactas. Tais experimentos de mutagênese apontam
claramente para o papel central dos peptídeos de fusão na fusão de
membranas. Mesmo peptídeos de fusão isolados podem sustentar a idéia
de fusão de membranas em sistemas modelo. Desta forma, estes estudos
tentam elucidar o papel preciso dos peptídeos de fusão no mecanismo de
fusão de membranas mediado por proteínas. Diversos pesquisadores têm
desenvolvido muitos sistemas modelo nos últimos vinte anos com o
objetivo de estabelecer a relação estrutura-função de peptídeos de fusão
em sistemas simples de bicamada lipídica (Tamm & Han, 2000).
Embora muitas propriedades importantes dos peptídeos de fusão já
tenham sido descritas há anos, algumas questões a respeito da estrutura e
da função destes peptídeos permanecem sem respostas. Recentes
progressos no desenho de peptídeos têm gerado esperança sobre o
42
Introdução Geral
entendimento baseado na estrutura de como os peptídeos de fusão
funcionam sobre a membrana (Tamm & Han, 2000).
O Vírus Influenza é um exemplo de um vírus típico que utiliza a
acidificação endossomal para ter acesso ao citoplasma da célula
hospedeira. Este processo tem sido extensivamente explorado, e o
mecanismo de escape ocorre através da fusão de membranas. O baixo pH
endossomal induz alterações conformacionais na proteína de envelope
Hemaglutinina (HA2), resultando na exposição de um segmento de 20-25
aminoácidos. Este segmento é conhecido como o peptídeo de fusão deste
vírus devido a sua capacidade em mediar a fusão entre vesículas lipídicas,
mesmo na ausência do restante da proteína. Em vários subtipos do Vírus
Influenza tipo A, a sequência dos peptídeos de fusão é altamente
conservada (Tamm, 2003).
1.6.2. Os Peptídeos de Fusão dos Flavivírus
Estudos cristalográficos mostram a presença de um loop CD na
ponta do domínio II da glicoproteína E dos Flavivírus. Este loop, contendo
os aminoácidos 98-113, foi interpretado como sendo o peptídeo de fusão
destes vírus (Rey et al., 1995).
43
Introdução Geral
No virion maduro, o peptídeo de fusão de um monômero está
escondido sob a superfície dos domínios I e II no monômero adjacente
(Seligman, 2008). Na presença do baixo pH endossomal, a proteína E sofre
trimerização com exposição do peptídeo de fusão e posterior inserção na
membrana alvo. Este mecanismo induz a aproximação entre o envelope
viral e a membrana do endossomo facilitando o processo de mistura de
lipídios entre as membranas (hemifusão), formação do poro e liberação do
nucleocapsídeo no citoplasma celular (Figura 8).
Figura 8 – Esquema das Etapas do Processo de Fusão de Flavivírus.
Desenho esquemático da configuração da proteína E sobre a superfície dos vírions em
um pH neutro no estado de pré-fusão (a); dissociação dos dímeros de E em
monômeros induzida pelo baixo pH, havendo projeção dos monômeros com exposição
e interação dos peptídeos de fusão com a membrana alvo (b); formação do trímero (c);
formação do intermediário de hemifusão com mistura dos folhetos externos (d);
formação do estágio final de pós-fusão e abertura do poro de fusão (e). Proteína E
colorida como na Figura 3. Membrana viral: folheto externo em amarelo, folheto
interno em azul; membrana alvo: folheto externo em preto, folheto interno em
vermelho. Extraído de Stiasny et al., 2009.
44
Introdução Geral
A estrutura cristal da proteína E do vírus da Dengue na conformação
pós-fusão foi determinada por Modis et al. (2004). Os loops de fusão nos
trímeros inseridos em um modelo de membrana apresentam a mesma
conformação que nos dímeros (Modis et al., 2003). Como os dímeros podem
se dissociar reversivelmente, o loop de fusão é estável quando
completamente exposto, sugerindo que ele retenha essencialmente a
mesma conformação quando escondido por outra subunidade, quer esteja
inserido em uma bicamada lipídica ou exposto ao solvente aquoso (Modis
et al., 2004).
Baseado na conservação dos aminoácidos entre os Flavivírus, no
elevado conteúdo de resíduos de Glicina, na flexibilidade molecular e em
características químicas similares a peptídeos de fusão já conhecidos,
sugere-se que os aminoácidos de 98 a 120 da proteína E sejam capazes de
mediar a fusão de membranas (Roehrig et al., 1989). Análises subsequentes
dos peptídeos de fusão incluíram os aminoácidos 98-110 (Roehrig et al.,
1990) e 99-116 (Ledizet et al., 2007).
Avaliações funcionais para alguns aminoácidos que influenciam a
fusão ou a replicação viral já foram reportadas, por exemplo, para os
aminoácidos 104, 106 e 107 (Pletnev et al., 1993; Allison et al., 2001; Trainor et
al., 2007). Acredita-se que o N-terminal do peptídeo de fusão seja o resíduo
45
Introdução Geral
D98. Isto porque esta região é o início de uma sequência de aminoácidos
conservados e devido à sua participação em uma ponte salina com o
resíduo K110. O C-terminal ainda não tem funcionalidade definida
(Seligman, 2008).
Uma sequência canônica é definida como uma sequência
conservada em uma variedade de vírus quando comparada a uma
sequência selvagem. De acordo com esta definição, 12 dos 16
aminoácidos que englobam o peptídeo de fusão dos Flavivírus
compreendem uma sequência canônica,
98
DRGWGNXCGXFGKGXX113
(onde X representa os aminoácidos variáveis). Em Flavivírus transmitidos
por mosquito, o aminoácido 104 é uma Glicina, enquanto nas cepas
transmitidas por carrapato, 104 é uma Histidina. Independente do vetor,
107 é um resíduo de Leucina, exceto no Vírus de Powassan (transmitido
por carrapato), em que na posição 107 existe uma Fenilalanina (Seligman,
2008).
Somente 18% dos aminoácidos são completamente conservados
entre as glicoproteínas E dos Flavivírus patogênicos (Seligman & Bucher,
2003). Embora o peptídeo de fusão contenha somente 3,2% dos
aminoácidos nesta proteína, ele contém 13% dos aminoácidos
46
Introdução Geral
conservados em E, tornando-o a sequência mais conservada na proteína E
e possivelmente no genoma inteiro dos Flavivírus (Seligman, 2008).
Seis dos aminoácidos conservados do peptídeo de fusão são Glicinas
(cinco nos vírus transmitidos por carrapato). Uma vez que os resíduos de
Glicina podem permitir a rotação ao redor de suas ligações C-C e C-N, sua
presença
provavelmente
facilita
as
alterações
conformacionais
necessárias para a fusão ocorrer. Desta maneira, do ponto de vista
evolucionário, a conservação destes aminoácidos associada a estas
mudanças conformacionais altamente organizadas foi extremamente
importante, principalmente porque a partícula viral deve ser capaz de
fundir tanto com células de mamífero como com células de artrópodes
(Seligman, 2008).
Como uma consequência da entrada na célula via endocitose
mediada por clatrina, durante a maturação, o endossoma se torna ácido,
causando liberação da extremidade escondida do peptídeo de fusão. Os
monômeros da proteína E agora se associam como um trímero, e a fusão
com a membrana da célula hospedeira ocorre, permitindo a transferência
do genoma para o interior do citoplasma. O requisito para a grande
mudança conformacional no peptídeo de fusão acoplado ao seu elevado
47
Introdução Geral
nível de conservação entre os Flavivírus, sugere que peptídeos de fusão
mutantes devem ser raros (Seligman, 2008).
1.6.3. Interação Peptídeo-Membrana
Os fosfolipídios são de importância fundamental para compor a
base estrutural de todas as membranas celulares, além de funcionarem
como precursores de diversas moléculas sinalizadoras intracelulares. As
classes majoritárias de fosfolipídios de membrana podem variar
significativamente de um tipo celular para outro ou até mesmo de uma
organela para outra dentro de uma mesma célula. Fosfolipídios de
membrana são moléculas anfipáticas, que tendem a se auto-organizar em
solução aquosa para formar uma bicamada lipídica (Huang & Li, 1999).
Uma bicamada lipídica composta por um único fosfolipídio, em
excesso de água, pode sofrer múltiplas transições de fase termotrópicas
sob aquecimento (Chapman, 1993). Destas diversas transições, a transição
do estado em gel para líquido-cristalino é a transição de fase principal que
é acompanhada pela maior mudança entrópica. A literatura disponibiliza
os estudos de transições de fase de bicamadas lipídicas principalmente
para fosfolipídios de cadeias saturadas idênticas. Estas transições podem
ser detectadas por uma ampla variedade de técnicas físicas, tais como
48
Introdução Geral
calorimetria diferencial de varredura (DSC), difração por raio-X,
espalhamento de luz dinâmico, ressonância magnética nuclear (RMN) e
espectroscopia de fluorescência. Embora cada uma destas técnicas físicas
possa fornecer informações específicas, as mudanças termodinâmicas que
ocorrem em uma transição de fase lipídica são avaliadas por DSC (Huang &
Li, 1999).
As propriedades físicas de membranas, tais como fluidez, carga e
curvatura, podem influenciar sua função. Proteínas e peptídeos podem
modular estas propriedades e, ao mesmo tempo, o ambiente hidrofóbico
e a interação lipídio-proteína (ou peptídeo) pode afetar sua atividade e/ou
sua estrutura. Muitas metodologias biofísicas estão disponíveis para
estudar estes efeitos utilizando sistemas de lipídio reconstituído (Lins et al.,
2008).
Por um lado, modificar a organização lamelar dos lipídios e,
portanto, a estabilidade da membrana poderia favorecer o processo de
fusão de membranas, por exemplo. Por outro lado, alguns fatores
intrínsecos de peptídeos, tais como a hidrofobicidade e a carga
influenciam a interação peptídeo-lipídio, modulando sua partição entre a
membrana e o ambiente aquoso. Além disso, a flexibilidade estrutural
49
Introdução Geral
também é um parâmetro importante na interação entre peptídeos e
lipídios (Lins et al., 2008).
A proteína gp41 do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) catalisa
a fusão de membranas através da indução de estruturas não-lamelares
transientes no ponto de encontro entre duas membranas (Eckert & Kim,
2001; Gallo et al., 2003). A sequência desta proteína é altamente conservada
e contém diferentes regiões funcionais essenciais para a fusão de
membranas, como o peptídeo de fusão (Bosch et al., 1989). Estas regiões da
glicoproteína gp41 têm a capacidade de ligação e partição na superfície de
membranas fosfolipídicas modelo, alterando sua conformação e induzindo
a formação de estruturas não-lamelares. Dependendo da composição
fosfolipídica da membrana modelo, estes segmentos mudam sua
conformação após ligação e modulam o comportamento da bicamada
lipídica (Pascual et al., 2005a, b).
Lipídios aniônicos são componentes integrais de membranas
biológicas
e
estão
presentes
invariavelmente
em
quantidades
substanciais, apresentando funções específicas em membranas biológicas
(Lakey et al., 1994; Pinheiro & Watts, 1994). A proposta é de que as interações
eletrostáticas entre as cabeças de lipídios aniônicos e resíduos de
proteínas ou peptídeos carregados positivamente sejam cruciais na
50
Introdução Geral
associação de proteínas ou peptídeos com membranas (Liu & Deber, 1997).
Neste sentido, os lipídios aniônicos têm sido amplamente utilizados como
sistemas modelo. Assim, a fusão de membrana viral é um importante
tópico de pesquisa, uma vez que ela serve como um modelo para eventos
de fusão celular, além de ser um excelente alvo para intervenções
terapêuticas (Earp et al., 2005).
Desta forma, a termodinâmica da interação peptídeo-membrana
depende da natureza química dos lipídios, peptídeos e carboidratos
envolvidos. As forças eletrostáticas, a formação de ligações de hidrogênio
e as interações hidrofóbicas apresentam papéis igualmente importantes
(Seelig, 2004).
A interação de um peptídeo com uma membrana lipídica pode ser
dividida em três etapas termodinâmicas, como ilustrado na Figura 9. Na
primeira etapa, a ligação é iniciada pela atração eletrostática de um
determinado peptídeo catiônico a uma membrana aniônica. Dependendo
da carga do peptídeo e do tamanho do potencial de membrana da
superfície, a atração (ou repulsão) eletrostática aumentará (ou diminuirá)
significativamente a concentração de peptídeo próximo à superfície da
membrana. Entretanto, a atração eletrostática não é um pré-requisito
para a interação, já que a ligação pode ocorrer também entre um
51
Introdução Geral
peptídeo não carregado e uma membrana neutra. Sob estas condições, a
concentração do peptídeo próximo à superfície da membrana é idêntica à
da solução estoque (Seelig, 2004).
atração
eletrostática
adsorção
mudança
conformacional
Figura 9 – Reconhecimento Molecular de Peptídeos na Superfície da Membrana.
O diagrama mostra diferentes estágios de ligação de peptídeo à membrana-alvo. O
peptídeo carregado é atraído eletrostaticamente para a superfície da membrana,
interage e sofre uma determinada alteração conformacional. Extraído de Seelig, 2004.
A próxima etapa é a transição do peptídeo dentro do plano de
ligação. A localização exata desta camada é difícil de ser definida e
depende do balanço hidrofóbico/hidrofílico dos grupos moleculares e da
força envolvida. A terceira etapa no processo de ligação é uma mudança
da conformação do peptídeo ligado. Em muitos casos, os peptídeos estão
em uma conformação randômica em solução e adotam uma determinada
estrutura secundária quando associados à membrana lipídica. A ligação,
52
Introdução Geral
incluindo estas alterações conformacionais, acarreta em mudanças nos
parâmetros termodinâmicas (Seelig, 2004).
As forças dirigidas para a adsorção e ligação de peptídeos são as
interações hidrofóbicas, eletrostáticas e ligações de hidrogênio. A inserção
de um peptídeo baseado em uma interação exclusivamente hidrofóbica
pode ser descrita por um simples equilíbrio de partição. Entretanto, se o
peptídeo e a membrana são carregados, as interações eletrostáticas se
tornam dominantes e a curva de ligação fica não-linear (Seelig, 2004).
Embora muita informação tenha sido fornecida nestes últimos anos
acerca das diferentes conformações das proteínas de fusão dos Flavivírus,
pouco ainda se conhece sobre os mecanismos de fusão de membranas
induzidos por eles. Desta maneira, é importante elucidar a natureza das
interações entre as proteínas de membrana e as membranas e os
mecanismos pelos quais os peptídeos de fusão aceleram a formação dos
intermediários de fusão.
Neste trabalho, nós descrevemos uma análise comparativa
estrutural e termodinâmica sobre a interação de duas diferentes
sequências internas de peptídeos de fusão de Flavivírus com sistemas
biomiméticos de membrana de diferentes cargas. Os peptídeos
apresentam 13 resíduos cada um e uma diferença de um único
53
Introdução Geral
aminoácido (Gly x His). As Histidinas de diversas proteínas de fusão de
vírus têm sido avaliadas como interruptores moleculares devido a sua
mudança de estado de protonação desde não carregada a duplamente
carregada em pH ligeiramente ácido encontrado em endossomas (Carneiro
et al., 2003; Bressanelli et al., 2004; Kampmann et al., 2006; Mueller et al., 2008; Fritz
et al., 2008).
54
Objetivos
2. Objetivos
2.1.
Objetivos: Parte I
Propriedades Biofísicas da Interação de Peptídeos de Fusão de Flavivírus
com Membranas Biomiméticas
Os arbovírus se mantêm na natureza em ciclos complexos que
envolvem vetores artrópodes, como mosquito e carrapato. Os peptídeos
de fusão dos Flavivírus são extremamente conservados dentro do seu
gênero, apresentando, de uma forma geral, apenas uma modificação na
posição 104 da sequência, onde os vírus que são transmitidos por
mosquito possuem uma Glicina e os que são transmitidos por carrapato
possuem uma Histidina.
Neste sentido, o objetivo geral deste trabalho foi avaliar a estrutura
e caracterizar o modo de interação de dois peptídeos de fusão de
Flavivírus, FLAG e FLAH, em modelos biomiméticos de membrana. A única
diferença entre eles está exatamente neste resíduo na posição 104, onde
FLAG possui uma Glicina e tem como representantes YFV, DENV e WNV, e
FLAH, que apresenta uma Histidina, onde o TBEV é o representante de
maior importância. Desta forma, o interesse neste estudo também se
55
Objetivos
deve à protonação/desprotonação da cadeia lateral da His, o que poderia
modular a diferença de interação entre os dois peptídeos estudados.
Portanto, nossos objetivos específicos para este estudo foram:
 Avaliar a acessibilidade dos resíduos de Trp presentes na sequência
dos peptídeos, através de espectroscopia de fluorescência intrínseca do
Trp e, assim, inferir características da interação com diferentes modelos
de membrana alvo.
 Investigar os parâmetros termodinâmicos (entalpia da ligação) que
regem a interação peptídeo-micela, através de calorimetria isotérmica de
titulação (ITC), utilizando alvos com diferentes propriedades físicas.
 Analisar possíveis mudanças na temperatura de transição de
vesículas lipídicas de diferentes composições, através de calorimetria
diferencial de varredura (DSC). Desta forma, é possível avaliar o grau de
perturbação da membrana promovida pelos peptídeos.
 Aferir a conformação do peptídeo em solução, através da
espectroscopia de dicroísmo circular, e avaliar uma possível mudança
estrutural após sua interação com modelos de membrana alvo.
 Avaliar parâmetros espaciais e acompanhar, em função do tempo,
as mudanças conformacionais da interação dos peptídeos de fusão com
56
Objetivos
bicamadas lipídicas, utilizando como ferramenta simulações por dinâmica
molecular.
2.2.
Objetivos: Parte II
Febre Amarela: Implicações para o Desenvolvimento de uma Vacina
Inativada por Alta Pressão Hidrostástica
A Febre Amarela é uma doença infecciosa aguda que representa um
importante problema de saúde pública, especialmente na África. Apesar
de existir uma vacina até certo ponto satisfatória e eficaz, a doença ainda
permanece incontrolável. Em diferentes períodos da história humana, a
Febre Amarela tem causado incontroláveis sofrimentos entre as
populações nas Américas, Europa e África.
Nos trópicos, a maior frequência da doença ocorre no período das
chuvas, entre os meses de janeiro e abril, quando a densidade vetorial
(quantidade de mosquitos) é elevada, coincidindo com a época de maior
atividade agrícola. No Brasil, no período de 1982 a novembro de 2004,
foram confirmados 594 casos de febre amarela, com ocorrência de 286
óbitos, representando uma taxa de letalidade de 48% no período. O
estado de Minas Gerais é o campeão de casos no Brasil.
57
Objetivos
A vacinação é a principal estratégia de controle da doença.
Entretanto, como a vacina é feita a partir de vírus atenuado, que tem a
capacidade de se replicar, vários eventos de reações adversas à vacina
vêm ocorrendo nos últimos anos. Como a alta pressão hidrostática tem
sido apontada como um método eficiente para a inativação de diversos
vírus, esta ferramenta foi utilizada para inativar o YFV com bastante
sucesso pelo nosso grupo. Entretanto, o grande problema de uma vacina
inativada é não oferecer uma proteção eficaz. Assim, o principal objetivo
deste estudo foi avaliar a imunogenicidade do Vírus da Febre Amarela
inativado por Alta Pressão Hidrostática. Para avaliar esta questão,
destacamos nossos objetivos específicos:
 Avaliar a perda total de infecciosidade dos vírus inativados por
pressão através de um ensaio para detecção de infecciosidade residual
realizado em células Vero e C6/36.
 Analisar a presença de alguma infecção promovida pela amostra
viral inativada através de um ensaio de detecção de infecciosidade
residual em camundongos.
 Realizar ensaios de imunização dos animais através de inoculação
subcutânea.
58
Objetivos
 Avaliar a resposta dos animais através de um ensaio de
neutralização dos anticorpos por redução de plaques.
 Aferir a proteção promovida pela inoculação do vírus inativado
através da inoculação intracerebral de uma dose letal.
59
Material e Métodos
3. Material e Métodos
3.1.
Reagentes
2, 2, 2-trifluoretanol (TFE), Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) e n-octilβ-D-glicopiranosídeo (n-OGP) foram obtidos da Sigma Co. (St. Louis, MO).
Os lipídios Di-Palmitoil-Fosfatidilcolina (DPPC) e Fosfatidilglicerol (PG)
foram adquiridos da Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Acrilamida foi
obtida da Amersham Bioscience. Todos os reagentes utilizados foram de
grau analítico. A água era deionizada e purificada através de um
equipamento Milli-Q da Millipore (Molsheim, France).
3.2.
Células e Vírus
As células Vero (rim de macaco verde africano) (CCL 81) e C6/36
(Aedes albopictus) foram obtidas a partir da American Type Culture
Collection (ATCC, Manassas, VA). As células Vero foram mantidas em meio
199 com sais de Earle (M199, Gibco), tamponado com bicarbonato de
sódio e suplementado com 5% de soro fetal bovino (Cultilab), penicilina
(100 U/mL) e estreptomicina (100 g/mL). As células C6/36 foram
cultivadas em meio L-15 suplementado com 10% de soro fetal bovino,
0,02 mM de L-glutamina (Gibco), penicilina (100 U/mL) e estreptomicina
(100 g/mL).
60
Material e Métodos
O Vírus da Febre Amarela utilizado neste estudo é derivado da
vacina YFV 17DD (035VFA035P) produzida em Bio-Manguinhos, Fundação
Oswaldo Cruz. Para os estudos de inativação, os vírus foram crescidos em
garrafas tipo roller com uma multiplicidade de infecção de 0,02 UFP/célula
a 37°C. Após 7 dias de infecção, o sobrenadante era coletado e clarificado
dos restos celulares por centrifugação a 1000 x g por 10 minutos a 4°C em
uma centrífuga Beckman usando o rotor JA-10.
3.3.
Os
Peptídeos de Fusão
peptídeos,
98
DRGWGNHCGLFGK110
(FLAH
-
TBEV)
e
98
DRGWGNGCGLFGK110 (FLAG – YFV, DENV, WNV) (Figura 10) foram
sintetizados pela Genemed Synthesis Inc. (South San Francisco, CA). A
identidade e a pureza (> 95%) foram determinadas por análise de
aminoácidos, espectrometria de massa e cromatografia líquida de alta
resolução. Para os experimentos, as soluções estoques de peptídeo foram
preparadas diluindo-os em tampão fosfato de sódio 20 mM pH 7,4. A
concentração dos peptídeos em solução aquosa foi determinada a partir
dos valores de absorbância a 280 nm, levando-se em consideração o
coeficiente de extinção molar teórico ( = 5500 M-1 cm-1) baseado na
cadeia lateral de um Trp presente em cada sequência.
61
Material e Métodos
A
FLAG 98DRGWGNGCGLFGK110
FLAH 98DRGWGNHCGLFGK110
loop CD
B
FLAG
Resíduos 98-110
FLAH
Resíduos 98-110
Figura 10 - Estrutura da Proteína E do WNV e dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH.
(A) A glicoproteína E monomérica adota uma topologia típica de outras glicoproteínas
de envelope de Flavivírus, onde o loop de fusão está mostrado (PDB: 2hg0). (B)
Sequência (vermelho) dos peptídeos de fusão FLAG e FLAH colorida no programa
RasMol. Os dois primeiros resíduos de Glicina estão mostrados em amarelo e o único
triptofano em azul.
62
Material e Métodos
3.4.
Ensaio com Micelas
As micelas constituem um sistema mimético para o estudo de
atividade e toxicidade por serem semelhantes a bicamadas lipídicas. Além
disso, são muito utilizadas em metodologias biofísicas justamente como
mimetizantes de membrana. As micelas possuem um cerne hidrofóbico e
flexível, uma interface hidrofílica e são normalmente usados como
monocamadas ou bicamadas em métodos experimentais (Langham et al.,
2007). A formação das micelas é dirigida pelo efeito hidrofóbico, devido à
interação dos grupos não polares com a água.
O SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) (Esquema 1) é um detergente que
possui grupamentos aniônicos polares em uma das extremidades de sua
estrutura e uma cadeia apolar na outra. Quando uma quantidade
suficiente de SDS é dissolvida em água, diversas propriedades são
modificadas, em particular a tensão superficial (que diminui) e a
habilidade da solução solubilizar hidrocarbonetos (que aumenta). Esta
concentração é denominada concentração micelar crítica (cmc). A cmc do
SDS é dependente de sal, sendo em água de 8 mM, em 10 mM de NaCl de
3,5 mM, e em 100 mM de NaCl de 1,4 mM.
63
Material e Métodos
Esquema 1 - Estrutura do SDS.
Extraído de www.sigmaaldrich.com
O n-octil-β-D-glicopiranosídeo (Esquema 2) é um detergente não
desnaturante e não iônico muito utilizado para solubilizar proteínas de
membrana. As micelas destes detergentes possuem baixo peso molecular
e são facilmente removidas por diálise. A cmc deste detergente varia de
20 a 25 mM.
Esquema 2 – Estrutura do n-octil-β-D-glicopiranosídeo.
Extraído de www.sigmaaldrich.com
64
Material e Métodos
A ligação do peptídeo de fusão às diferentes micelas foi analisada
através da variação da fluorescência emitida pelo triptofano, sendo este
excitado a 280 nm e sua emissão sendo coletada de 300 a 420 nm.
3.5.
Preparação das Vesículas Multilamelares
Uma
determinada
quantidade
de
fosfolipídio
diluído
em
clorofórmio é inicialmente seca sob um fluxo de nitrogênio no fundo de
um tubo de vidro cônico para a completa remoção do solvente orgânico e
formação de um filme lipídico. A solubilização deste filme em tampão
fosfato de sódio 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, contendo ou não uma
quantidade apropriada de peptídeo, gera as vesículas multilamelares
(MLVs) para a realização das medidas de DSC. A concentração dos
fosfolipídios foi calculada baseada no peso do lipídio liofilizado.
3.6.
Espectroscopia de Fluorescência
Há cerca de 30 anos vem ocorrendo um crescimento importante no
uso de fluorescência aplicada à Biologia, onde a espectroscopia de
fluorescência vem sendo aplicada nas áreas de Bioquímica e Biofísica. A
fluorescência é muito utilizada para sequenciar ADN, análises genéticas
por hibridização in situ, identificação celular em citometria de fluxo e
65
Material e Métodos
análises de imagens celulares para revelar a localização e o tráfego de uma
determinada molécula. Devido à alta sensibilidade de detecção da
fluorescência, diversos testes baseados no fenômeno da fluorescência são
hoje aplicados à clínica, como o ELISA. A aplicação da fluorescência
associada ao contínuo desenvolvimento de instrumentações e marcadores
fluorescentes
torna
possível
analisar
a
dinâmica
de
diversas
macromoléculas em diferentes processos, desvendando intermediários do
enovelamento de proteínas importantes no ciclo celular, por exemplo
(Lakowicz, 1999).
A luminescência é a emissão de luz de alguma substância e ocorre a
partir dos estados excitados eletronicamente. Este fenômeno é
formalmente dividido em duas categorias, a fluorescência e a
fosforescência, dependendo da natureza do estado excitado. No estado
excitado singlete, o elétron no orbital excitado está pareado (com spins
opostos) com o segundo elétron no orbital do estado fundamental.
Consequentemente,
o
retorno
ao
estado
fundamental
ocorre
rapidamente pela emissão de um fóton. O tempo de vida de um
fluoróforo é próximo de 10 ns e representa o tempo médio entre sua
excitação e seu retorno ao estado fundamental. A fosforescência é a
emissão da luz a partir dos estados triplete, em que o elétron no orbital
66
Material e Métodos
excitado tem a mesma orientação de spin que o elétron no estado
fundamental. Além disso, o tempo de vida fosforescente é maior e varia
de milisegundos a segundos (Lakowicz, 1999).
As proteínas contêm três resíduos de aminoácidos que contribuem
para sua fluorescência: Tirosina (Tyr ou Y), Triptofano (Trp ou W) e
Fenilalanina (Phe ou F). A emissão de fluorescência das proteínas é
dominada pelo Trp, que absorve em comprimento de onda mais longo e
apresenta o maior coeficiente de extinção. Além disso, devido ao seu
longo comprimento de onda, a energia absorvida pela Phe e pela Tyr é
frequentemente transferida para os resíduos de Trp na mesma proteína. O
rendimento quântico da Phe em proteínas é pequeno (0,03), enquanto os
rendimentos quânticos da Tyr e do Trp são muito maiores (0,14 e 0,13,
respectivamente) (Lakowicz, 1999).
A fluorescência de proteínas é geralmente excitada no máximo de
absorção próximo a 280 nm ou a comprimentos de onda maiores. O
máximo de emissão do Trp em água ocorre próximo a 350 nm e é
altamente dependente da polaridade e/ou do ambiente local. Como o Trp
é um aminoácido bastante sensível a qualquer mudança de polaridade do
meio, em ambientes apolares, este resíduo emite em comprimentos de
onda menores (próximo a 320 nm) e, portanto, mais energéticos.
67
Material e Métodos
Entretanto, à medida que a proteína expõe seu Trp para o meio aquoso,
por exemplo, em uma desnaturação, ocorre um desvio de espectro para o
vermelho, já que o Trp passa a emitir fluorescência em comprimentos de
onda maiores e menos energéticos. Isto ocorre porque parte desta
energia é gasta para orientar as moléculas no solvente (Lakowicz, 1999).
Todos os experimentos de fluorescência foram realizados em um
espectrofluorímetro ISS K2 (ISS Inc., Champaign, IL) a 37°C. Comprimento
de onda de excitação de 280 nm foi utilizado e a emissão coletada de 300
a 420 nm, com um intervalo de 1 nm. A fenda utilizada na excitação foi de
2 nm e na emissão de 1 nm. A concentração final dos peptídeos foi de 10
M diluído em tampão fosfato de sódio 20 mM nos pHs 7,4 ou 5,5. A
solução estoque das micelas foi preparada no mesmo tampão. Os valores
de pH foram aferidos antes e após cada experimento. n-octil-β-Dglicopiranosídeo foi preparado em água Milli Q em uma concentração
muito acima da concentração micelar crítica (cmc).
3.6.1. Supressão de Fluorescência por Acrilamida
A intensidade de fluorescência pode ser diminuída por uma ampla
variedade de processos. Esta diminuição na intensidade é denominada de
supressão, que pode ocorrer por diferentes mecanismos. A supressão
68
Material e Métodos
colisional ocorre quando o fluoróforo no estado excitado é “desativado”
sob contato com outra molécula em solução, conhecida como supressor
de fluorescência. Neste caso, o fluoróforo retorna ao estado fundamental
durante uma colisão com o supressor sem emitir fluorescência. As
moléculas não são quimicamente alteradas no processo (Lakowicz, 1999).
Uma ampla variedade de pequenas moléculas ou íons pode atuar
como supressores colisionais de fluorescência, tais como o iodeto (I-), o
oxigênio, halogênios, aminas e a acrilamida (Esquema 3). A acessibilidade
dos fluoróforos por um determinado agente supressor pode ser usada
para determinar a localização de marcadores sobre macromoléculas ou a
porosidade de proteínas e membranas ao supressor. A intensidade da
emissão de fluorescência de um Trp sobre a superfície de uma proteína ou
sobre a superfície de uma membrana diminuirá na presença de um
supressor solúvel em água, como a acrilamida. Entretanto, a intensidade
de um resíduo de Trp escondido no interior de uma membrana será
menos afetada pelo supressor dissolvido (Lakowicz, 1999).
69
Material e Métodos
Esquema 3 – Estrutura Química da Acrilamida.
Extraído de Besaratinia & Pfeifer, 2005
O mecanismo da supressão varia com o par fluoróforo-supressor.
Por exemplo, a supressão do anel indol pela acrilamida é provavelmente
devido à transferência de elétrons do indol para a acrilamida, que não
ocorre no estado fundamental. Além da supressão colisional, os
fluoróforos podem formar complexos não fluorescentes com os agentes
supressores. Este processo é conhecido como supressão estática, uma vez
que ele ocorre no estado fundamental e não depende de difusão ou
colisão molecular (Lakowicz, 1999).
O fenômeno da supressão fornece informações importantes sobre o
tempo de vida do estado excitado, importante para detectar processos
dinâmicos em solução ou em macromoléculas. A idéia fundamental é que
a absorção é um evento instantâneo e ocorre tão rápido que não existe
tempo para movimento molecular durante este processo (Lakowicz, 1999).
Para a supressão colisional, a diminuição na intensidade é descrita pela
equação de Stern-Volmer:
70
Material e Métodos
F0 / F = 1 + KSV [Q] = 1 + kq τ0 [Q]
(1)
onde F e F0 são as intensidades de fluorescência na presença e na ausência
de acrilamida, respectivamente; KSV representa a constante de supressão
de Stern-Volmer [Q] é a concentração molar total do agente supressor em
solução, kq é a constante de supressão bimolecular e τ0 é o estado não
suprimido (Lakowicz, 1999).
Os dados de supressão geralmente são apresentados como gráficos
de F0 / F versus [Q]. Isto é porque F0 / F é esperado ser linearmente
dependente da concentração do agente supressor. Um gráfico de F0 / F
versus [Q] produz um intercepto de 1 sobre o eixo y e uma inclinação igual
a KSV. Um gráfico de Stern-Volmer linear geralmente é indicativo de uma
classe simples de fluoróforos, todos igualmente acessíveis ao supressor
(Lakowicz, 1999).
Para os experimentos de supressão de fluorescência do Trp,
pequenas alíquotas de acrilamida solubilizadas em água foram
adicionadas a partir de uma solução estoque de 5 M na ausência e na
presença de micelas. Comprimento de onda de excitação de 280 nm foi
utilizado e as intensidades de fluorescência foram monitoradas a cada
adição de acrilamida a 349 nm em tampão, a 334 nm na presença de
micelas de SDS e a 346 nm na presença de micelas de n-octil-β-D-
71
Material e Métodos
glicopiranosídeo. As constantes de supressão de fluorescência (KSV), uma
medida da acessibilidade do Trp ao ambiente polar onde se encontra a
acrilamida, foram obtidas a partir de uma regressão linear usando a
equação de Stern-Volmer para um processo de supressão dinâmico (Eftink
& Ghiron, 1976; Lakowicz, 1999).
3.7.
Dicroísmo Circular (CD)
O fenômeno de Dicroísmo Circular (CD) consiste da absorção
diferencial de luz polarizada circularmente para a esquerda e para a
direita por uma molécula quiral. Na ausência de um campo magnético, a
molécula deve ser quiral para dar para uma diferença na interação com os
dois tipos de luz polarizada circularmente. CD é a diferença na absorção da
luz polarizada circularmente para a esquerda e para a direita e é definido
como:
() = E() – D()
(2)
onde E e D são os coeficientes de extinção para os componentes
polarizados
circularmente
para
a
esquerda
e
para
a
direita,
respectivamente, a um determinado comprimento de onda . As unidades
para CD, quando definidas como , são M-1·cm-1, onde M é a
concentração molar.
72
Material e Métodos
Baseado na energia das transições eletrônicas que dominam uma
determinada faixa, os espectros de proteína por CD são geralmente
divididos dentro de três faixas de comprimento de onda, (i) a região UV
distante (abaixo de 250 nm), onde as contribuições peptídicas dominam,
(ii) a região UV próximo (250-300 nm), onde as cadeias laterais dos
resíduos aromáticos contribuem, e (iii) a região visível (300-700 nm), onde
os cromóforos extrínsecos contribuem.
A cadeia polipeptídica em uma proteína é primariamente
constituída por amidas secundárias. Polipeptídeos formam diferentes
estruturas secundárias baseadas no arranjo dos grupos amida ditados pela
conformação do esqueleto carbônico. -hélices e folhas-β são as duas
mais
importantes
estruturas
secundárias
em
proteínas,
sendo
estabilizadas, respectivamente, por ligações de hidrogênio intra- e intercadeia. Elas são caracterizadas por um conjunto de ângulos diedro  e 
(: -57°, -47°; β: -120°, +120°) que se repetem ao longo da cadeia
polipeptídica
formando
grupos
amidas
sucessivos
orientados
identicamente em toda direção da cadeia (Sreerama & Woody, 2004).
Os grupos amida em -hélices formam uma superfície cilíndrica com
ligações de hidrogênio intra-cadeia paralelas ao eixo da hélice, e grupos
amida em folhas-β estendem-se por uma superfície planar. Em geral, -
73
Material e Métodos
hélices são maiores e mais rígidas que as folhas-β devido à natureza das
ligações de hidrogênio que as estabilizam. Outra importante estrutura
secundária é a volta-β, geralmente formada por três resíduos, podendo
ser estabilizada ou não por uma ligação de hidrogênio entre o primeiro e o
terceiro grupamento amida, que efetivamente reverte a direção da
cadeia. Aminoácidos que não formam nenhuma estrutura secundária
existente em proteínas são chamados de desordenados por não
possuírem uma conformação ordenada (Sreerama & Woody, 2004).
As medidas de CD foram realizadas em um espectropolarímetro
Jasco J-715/1505 entre 190 e 260 nm em uma cubeta de quartzo
cilíndrica, com caminho óptico de 0,02 cm, ou cúbica de 0,2 cm (apenas
para as análises em alta temperatura). Os espectros foram gravados com
0,2 nm de resolução e a 50 nm/min de velocidade. O tempo de resposta
utilizado foi de 8 s com 100 mgrau de sensibilidade. A passagem do feixe
de luz foi de 2 nm. Cada espectro representa uma média de 10 varreduras.
A concentração dos peptídeos utilizada foi de 1 mM ou 50 M (para as
análises a 85°C) e os espectros foram adquiridos à temperatura ambiente
(~ 25°C), em tampão fosfato de sódio 20 mM pH 5,5 ou 7,4. A contribuição
do sinal do tampão na ausência e na presença de cada reagente foi
subtraída dos espectros de CD adquiridos para cada amostra.
74
Material e Métodos
3.8.
Calorimetria Isotérmica de Titulação (ITC)
A elucidação dos princípios energéticos da afinidade e da
especificidade de ligação é uma questão central em muitas áreas da
ciência atual. A Calorimetria Isotérmica de Titulação (ITC) é uma valiosa
técnica experimental que facilita a quantificação dos parâmetros
termodinâmicos que caracterizam os processos de reconhecimento
envolvendo macromoléculas. A técnica de ITC é utilizada para investigar
todos os tipos de interações de proteínas, incluindo interações proteínaproteína, proteína-ácido nucléico, interações de proteínas com pequenas
moléculas, além de cinéticas enzimáticas (Liang, 2008; Bjelić & Jelesarov, 2008).
ITC é uma excelente técnica bastante utilizada para obter
informações
importantes
sobre
os
parâmetros
termodinâmicos
fundamentais que governam a ligação de peptídeos a bicamadas lipídicas
(Seelig, 2002). Titulando o peptídeo para um excesso de lipídio, é possível
obter a entalpia da ligação, e ao contrário, titulando lipídio em peptídeo
até a saturação, é possível calcular a energia livre da ligação. A entropia da
ligação pode então ser deduzida a partir da relação G = H – TS (Li et al.,
2003).
Os dados de ITC foram adquiridos utilizando um calorímetro de
titulação MicroCal VP-ITC (MicroCal, Northampton, MA), titulando o
75
Material e Métodos
peptídeo em uma solução de micelas. O calorímetro foi calibrado
eletricamente e as amostras foram tituladas em uma solução com
agitação contínua. No primeiro caso de titulação, alíquotas de 5 L de
peptídeo foram adicionadas, a partir de uma solução estoque de 100 M,
à cela calorimétrica contendo SDS a 20 mM ou n-octil-β-Dglicopiranosídeo a 40 mM, ambos diluídos em tampão fosfato de sódio 20
mM pH 7,4 ou 5,5. Cada injeção era realizada em um período de 5 s, com
um espaço de 360 s entre cada injeção.
Os resultados foram analisados utilizando o programa Origin 7.0, e
os valores de entalpia (H) e de variação da capacidade calorífica (Cp)
foram obtidos a partir da integração da área de cada pico de calor em
diferentes temperaturas (37°C, 25°C e 15°C). Para descontar o calor de
diluição, experimentos controle foram realizados titulando as micelas
dentro de uma solução tampão na ausência de peptídeo em todos os pHs
e em todas as temperaturas. O calor de diluição era sempre muito
pequeno quando comparado ao da amostra, e foi subtraído a partir da
reação de calor do experimento de titulação real.
76
Material e Métodos
3.9.
Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC)
A Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) tem emergido como
uma poderosa técnica experimental para determinar propriedades
termodinâmicas de macromoléculas. DSC é uma técnica de análise térmica
capaz de determinar a pureza, as formas polimórficas e o ponto de fusão
de diversas amostras. Além disso, esta técnica capacita monitorar
detalhes do processo de desenovelamento de proteínas. Através de
medidas dos parâmetros termodinâmicos e sob condições que afetam a
estabilidade do sistema, é possível estudar também o comportamento
térmico de bicamadas lipídicas e sistemas de entrega de drogas lipídicas,
como lipossomos (Demetzos, 2008; Spink, 2008).
Os dados de DSC foram coletados em um calorímetro Microcal VPDSC de alta sensibilidade (Microcal, Northampton, MA). As vesículas de
DPPC e PG foram utilizadas em tampão fosfato de sódio 20 mM, NaCl 150
mM, pH 7,4. A razão molar de lipídio:peptídeo utilizada nos experimentos
foi de 100:1. Para as amostras contendo vesículas de DPPC, a velocidade
de varredura utilizada foi de 10°C/h, enquanto que, para as vesículas
DPPC:PG, a velocidade foi de 30°C/h. A aquisição dos dados e a análise
foram realizadas usando o programa Origin 7.0. A concentração de lipídios
totais utilizada nas medidas de DSC foi de 1 mM
77
Material e Métodos
3.10. Simulações por Dinâmica Molecular
A dinâmica molecular (MD) consiste em acompanhar a evolução
temporal de um determinado sistema molecular. Este método trata os
átomos em um meio contínuo, com as ligações químicas vibrando, ângulos
de ligação variando e a molécula rodando (Leach, 1996). Com o
desenvolvimento de novos computadores, os métodos de modelagem
molecular vêm se aprimorando e sendo amplamente utilizados nas
pesquisas científicas. Seus conceitos fundamentais se baseiam em
equações muito conhecidas no mundo da física há muito tempo e seus
métodos constituem poderosas ferramentas no estudo de propriedades
atômicas e moleculares.
O avanço na área de modelagem molecular busca, através das
equações de Newton, uma metodologia para descrever propriedades
moleculares quânticas em função de um campo de força clássico e, assim,
encontrar a representação mais próxima do real (Mundin, 2002). No método
de mecânica molecular, as ligações químicas são representadas por
potenciais harmônicos. As moléculas funcionam como uma coleção de
massas ligadas por “molas” com suas propriedades representadas através
de potenciais harmônicos e anarmônicos (Levine, 2003).
78
Material e Métodos
No início, a MD consistia de um modelo de esferas rígidas com
choques perfeitamente elásticos representando as interações atômicas
(Alder & Wainwright, 1957). Nesta época, as equações de movimento de
Newton já eram utilizadas para descrever um sistema de n átomos
interagindo. Entretanto, com o avanço nesta área, o número de átomos
aumentou e, consequentemente, a complexidade dos sistemas estudados.
Por este motivo, existe a necessidade de computadores cada vez mais
potentes que tenham a capacidade de processar um número enorme de
átomos. As técnicas também devem ser cada vez mais rebuscadas para
resolver problemas quânticos de forma clássica a fim de tornarmos a
simulação possível e confiável.
As simulações neste estudo foram realizadas a 35°C ou a 85°C
utilizando os peptídeos de fusão em caixas d’água (Figura 11A) ou em
bicamadas lipídicas compostas por Palmitoil-Oleoil-Fosfatidiletanolamina
(POPE) (Figura 11B) obtidas utilizando o programa GROMACS (van der Spoel
et al., 2001). A configuração da bicamada, composta por 340 unidades
lipídicas (170 em cada folheto), e os parâmetros de simulação foram
ajustados como descrito anteriormente (Marrink et al., 1996; Tieleman &
Berendsen, 1996; Kandt et al., 2007). Este modelo de bicamada foi escolhido
porque é o mais bem equilibrado em um modelo grande de simulação.
79
Material e Métodos
Contra-íons foram utilizados para manter a eletroneutralidade dos
sistemas e os peptídeos foram modelados através da utilização do campo
de força GROMOS45A3. O passo de integração utilizado foi de 2 ƒs. As
interações de van der Waals foram simuladas por uma função Switch a um
raio de até 1 nm, e as interações eletrostáticas foram consideradas até 1,1
nm utilizando o método de PME (“Particle-Mesh Ewald”). Para as
simulações utilizando o peptídeo FLAH, os resíduos de His foram
protonados, mimetizando um ambiente ácido (pH < 6). O método de
Berendsen, que realiza a correção da temperatura no sistema, foi aplicado
a cada 0,1 ps. Para o acoplamento de pressão, foi utilizado o método de
Parrinelo-Rahman, o mais utilizado em membranas. As condições
periódicas de contorno foram mantidas constantes utilizando o método
“ensemble statistico NPT”. E para manter os átomos ligados, o algoritmo
de vínculo Lincs foi utilizado.
As coordenadas do peptídeo de fusão FLAG foram adquiridas a partir
da estrutura cristalográfica da proteína E do WNV depositada no Banco de
Dados de Proteínas (PDB) (Nybakken et al., 2006; pdb: 2HG0) e o FLAH foi
obtido a partir de uma mudança de um resíduo de Gly por um resíduo de
His na posição 104 do peptídeo. Este processo foi realizado minimizando a
energia nas vizinhanças do resíduo de His (Figura 12).
80
Material e Métodos
A
B
Figura 11 – Representação do Peptídeo de Fusão FLAH em Caixa d’água ou em
Bicamada Lipídica Composta por POPE.
Representação da estrutura do peptídeo FLAH (vermelho) antes de iniciar a simulação
em água (A) ou na presença de bicamada lipídica de POPE (B). Em azul, está
representada a água, em cinza, os ácidos graxos dos fosfolipídios da membrana e, em
verde e amarelo, os íons Cl- e Na+.
Figura 12 – Loop de Fusão da Glicoproteína E dos Flavivírus.
Estrutura cristalográfica da proteína E do WNV depositada no Banco de Dados de
Proteínas (Nybakken et al., 2006; pdb: 2HG0). Do lado direito estão os dois peptídeos
de fusão dos Flavivírus sobrepostos evidenciando os resíduos de Gly (vermelho – FLAG)
e de His (azul - FLAH).
81
Material e Métodos
3.11. Inativação Viral por Alta Pressão Hidrostática
Recentes estudos têm emergido sobre o uso da alta pressão
hidrostática (APH) para tentar revelar estados intermediários na via de
montagem e desmontagem de vários vírus, proteínas multiméricas e
complexos proteína-ácido nucléico, endereçando muitas questões de
reconhecimento macromolecular (Silva et al., 1996). Além disso, vários
estudos têm mostrado a importância de comparar complexos protéicos e
integrar informações sobre estrutura, dinâmica e energética (Silva et al,
2001; 2002).
A alta pressão pode promover eficientemente a dissociação tanto
de proteínas oligoméricas (Silva & Weber, 1993; Robinson & Sligar, 1995), como
de estruturas virais (Silva et al., 1996). Ela tem uma propriedade única, onde
a perturbação das estruturas macromoleculares em solução depende
exclusivamente
da
variação
de
volume
do
processo
de
dissociação/desnaturação (Silva et al., 2001).
A perturbação por pressão pode produzir novas informações acerca
da estabilidade, volume e empacotamento de macromoléculas em uma
extensa variedade de fenômenos biológicos, e tem sido particularmente
útil na investigação de transições conformacionais em proteínas (Jonas &
Jonas, 1994; Heremans & Smeller, 1998; Desai et al., 1999). Em geral, a pressão
82
Material e Métodos
mantém o conjunto de estruturas secundárias, mas é desfavorável às
interações hidrofóbicas, que são predominantemente responsáveis pela
manutenção da estrutura terciária de uma proteína (Silva et al., 1996;
Mozhaev et al., 1996). A variação de volume negativa que ocorre com a
dissociação ou desenovelamento protéico procede integralmente de
interações mais íntimas entre a cadeia polipeptídica e a água. Assim, a
pressão desestabiliza interações hidrofóbicas e eletrostáticas, além de
eliminar as cavidades existentes (Silva et al., 1996; 2001; Frye & Royer, 1998;
Hummer et al., 1998).
Recentemente, a pressão hidrostática tem sido usada para estudar a
montagem de vírus icosaédricos, com o objetivo de entender como a
plasticidade necessária para a perfeita montagem de uma partícula viral
está codificada dentro da conformação enovelada de uma subunidade
protéica do capsídeo (Foguel et al., 1995; Da Poian et al., 1995; Gaspar et al., 1997;
Oliveira et al., 1999a). Esta combinação dos estudos termodinâmicos e
estruturais tem sido utilizada para tentar identificar as regras gerais que
governam a montagem viral. Em linhas gerais, as proteínas do capsídeo
isoladas (monômeros ou dímeros) são muito menos estáveis frente aos
efeitos da pressão do que as partículas icosaédricas montadas (Silva et al.,
1996).
83
Material e Métodos
Assim, apesar de encontrar-se disponível uma vacina de vírus
atenuado bastante imunogênica e eficaz contra o Vírus da Febre Amarela,
recentemente têm sido registradas frequentes ocorrências de casos fatais
devido a reações adversas e reversão da doença em pacientes recémvacinados (Vasconcelos et al., 2001; Martin et al., 2001; Chan et al., 2001). Muitos
destes casos de morte associados à vacina são de turistas que vão visitar
áreas endêmicas e são recomendados pelo governo a se vacinar. Para
tentar solucionar este problema, o Ministério da Saúde solicitou à
Fundação Oswaldo Cruz o desenvolvimento de uma vacina inativada
contra o Vírus da Febre Amarela.
A cela de alta pressão (Figura 13A) utilizada em nossos estudos foi
descrita por Paladini & Weber (1981) e fabricada pela ISS Inc. (Champaign,
IL). A cela é de aço vascomax e equipada com três janelas ópticas de
quartzo
ou
safira
(Silva et al., 1992),
para
eventuais
análises
espectroscópicas. Além disso, a cela possui uma abertura superior por
onde é aclopado um tubo apropriado contendo a amostra, que equaliza a
pressão entre o meio hidrostático (etanol) e a amostra que se encontra no
interior do tubo, e por onde é acoplado uma haste flexível que conecta a
cela ao gerador de pressão. A cela também suporta diferentes
84
Material e Métodos
temperaturas pelo acoplamento de um banho-maria circulatório (Fisher
Scientific).
Figura 13 - Sistema de Alta Pressão Hidrostática.
Ilustração dos componentes do sistema de alta pressão. (A) Cela de pressão e as suas
janelas ópticas. (B) Componentes do gerador de pressão: (A) reservatório de etanol;
(B) válvula que controla a saída do etanol para o gerador de pressão; (C) gerador
manual de pressão; (D) válvula que controla a saída do etanol do gerador de pressão
para a bomba de pressão; (E) cela de pressão onde é colocada a amostra; (F)
manômetro que afere a pressão aplicada na amostra.
O segundo componente do sistema de pressão é o gerador de
pressão propriamente dito (Figura 13B). Ele é composto por um pistão
operado manualmente, que tem por objetivo comprimir o etanol no
interior da tubulação e, consequentemente, a amostra. Esta compressão
se dá por duas válvulas que controlam o fluxo de etanol no tubo
conectado à cela. A pressão gerada no sistema é acompanhada por um
manômetro.
85
Material e Métodos
A pressão utilizada para inativar o YFV 17DD foi de 310 MPa (3,1
kbar = 45 kPSI). Além disso, durante o tempo de pressurização, as
amostras foram mantidas a 4°C com auxílio de um banho-maria
circulatório.
3.11.1. Ensaio de Infecciosidade
Este método foi utilizado com o objetivo de avaliar o grau de
infecciosidade das partículas virais antes e após serem submetidas à alta
pressão hidrostática. Os ensaios foram realizados em placas estéreis de 6
poços (Corning) com uma monocamada semi-confluente de células Vero.
Foram realizadas diluições seriadas da ordem de 101 a 1010, onde 100 L
da amostra a ser avaliada são colocados em cada poço correspondente à
diluição.
Após o tempo de adsorção de 1 h a 37°C, são adicionados 2 mL de
meio semi-sólido (DMEM a 10% de soro fetal bovino, em uma
concentração final de 3% de carboxi-metil-celulose - CMC) a cada poço da
placa. Após 7 dias a 37°C em uma atmosfera de 5% de CO2, as placas são
reveladas corando-se as células com uma solução de cristal violeta 1% e
formaldeído 20% por 30 min. O meio semi-sólido é utilizado para diminuir
a difusão do vírus pela placa. Isto permite observar placas de lise celular
86
Material e Métodos
sobre a monocamada, que representam a infecção de apenas uma
partícula que iniciou o ciclo. Desta maneira, após os 7 dias, as placas de
lise são então contadas.
O título viral é expresso em unidades formadoras de placa por
unidade de volume (UFP/mL). Assim, o grau de infecciosidade era avaliado
através de ensaios de infecciosidade, onde quanto maior a diluição do
vírus, e ainda assim sendo capaz de induzir efeito citopático, maior é o seu
título. A maioria das preparações gerava amostras com títulos próximos a
107 UFP/mL e, além disso, podíamos aferir também o grau de
infecciosidade das amostras submetidas à alta pressão hidrostática.
3.11.2. Avaliação da Infecciosidade Residual do YFV Inativado
A fim de confirmar a inativação viral, a infecciosidade residual do
YFV inativado foi avaliada pela incubação de 1 mL do vírus em células Vero
e C6/36. Assim, monocamadas destas células cultivadas em garrafas de 25
cm2 foram inoculadas em triplicatas com amostras virais inativadas pela
pressão. Após 1 h de adsorção, as partículas virais não adsorvidas foram
retiradas e meio 199 ou L-15 eram adicionados às células Vero e C6/36,
respectivamente. Após 7 dias, o sobrenadante da cultura era coletado e a
infecciosidade viral era avaliada por um ensaio de titulação em
87
Material e Métodos
monocamadas de células Vero (Caufour et al., 2001). A inativação viral foi
realizada com diferentes preparações do vírus 17DD clarificado e os
resultados apresentam valores obtidos a partir de três experimentos
independentes.
3.12. Ensaios em Camundongos
Todos os ensaios utilizando animais foram realizados de acordo com
o protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Experimentação e
Cuidados com os Animais (CEUA – FIOCRUZ: P0152/02). As preparações
inativadas do vírus (310 MPa por 3 h a 4˚C) eram administradas
diretamente após o tratamento de alta pressão.
3.12.1. Ensaios de Inocuidade
Para os estudos de inocuidade, camundongos suíços webster (Mus
musculus) de 3 a 7 dias foram inoculados por via intracerebral (i.c.) com
YFV 17DD da vacina produzida em Bio-Manguinhos (número do lote
035VFA035P), YFV 17DD inativado por pressão ou meio 199 (controle
negativo). Os vírus foram diluídos em meio 199 e o inóculo era novamente
titulado logo após o procedimento. A quantidade de vírus em UFP
necessária para matar 50% dos camundongos foi estabelecida como
88
Material e Métodos
descrito anteriormente (Caufour et al., 2001). Os animais foram monitorados
durante 21 dias e as eventuais mortes foram registradas. Animais
visivelmente letárgicos foram mortos por exposição a CO2.
3.12.2. Imunização
Os estudos de imunogenicidade foram realizados com o vírus 17DD
produzido em células Vero. Neste ensaio, grupos de fêmeas de
camundongos suíços com idade de 3 a 7 semanas foram imunizados por
via subcutânea (s.c.) com doses de 0,1 mL. A programação consistiu de 3
doses com intervalos de 2 semanas. Os vírus diluídos em meio de cultura
199 completo foram inoculados com aproximadamente 104 UFP/dose. O
grupo dos animais que serviram como controle negativo receberam
apenas meio de cultura 199 completo. Os vírus foram titulados
novamente, logo após o procedimento de imunização. Os camundongos
foram sangrados a partir do plexo retro-orbital, utilizando uma pipeta de
vidro estéril antes da primeira dose e após 2 semanas de cada imunização.
3.12.3. Ensaio de Proteção
Para avaliar a proteção possivelmente concedida pela imunização,
ensaios de desafio dos animais foram realizados 45 dias após a
89
Material e Métodos
imunização. Camundongos de 9 semanas, previamente imunizados, foram
inoculados por via intracerebral (i.c.) com 30 L de uma dose letal de 5.0
log10 UFP do YFV 17DD cepa vacinal (número do lote 035VFA035P). Os
animais foram monitorados diariamente durante 21 dias. A dose mínima
letal capaz de matar 50% dos animais (MLD50) foi calculada de acordo com
protocolo descrito anteriormente (Freire et al., 2005). Assim, a MLD50 foi
calculada a partir da quantidade de animais mortos para cada diluição
juntamente com os títulos em UFP após a imunização para estabelecer a
quantidade de vírus (em UFP) necessária para matar 50% dos
camundongos.
3.13. Ensaios para Detecção de Neutralização dos Anticorpos
O título dos anticorpos foi determinado pelo teste de neutralização
de redução de 50% dos plaques (PRNT) em células Vero. O PRNT foi
calculado a partir de diluições seriadas começando em 1:10 em placas de
96 poços, como já descrito (Stefano et al., 1999). O título dos anticorpos
neutralizantes foi expresso em unidades internacionais por mL (IU/mL),
usando uma preparação de soro para YFV 17DD contendo 111,5 IU/mL.
Este soro foi padronizado de acordo com um soro de referência contendo
90
Material e Métodos
14,300 mIU/mL, seguindo os procedimentos da Organização Mundial da
Saúde (Copenhagen Serum Institute) (Freire et al., 2005).
3.14. Análises Estatísticas
As médias e os desvios padrão foram calculados para os
experimentos de espectroscopia de fluorescência de supressão por
acrilamida e para os ensaios de detecção de infecciosidade residual e
imunogenicidade do YFV em camundongos. O teste Student t foi usado
para
comparar
as
médias.
As
diferenças
foram
consideradas
estatisticamente significativas se os valores de P fossem iguais ou menores
que 0,05. As análises estatísticas foram realizadas usando o programa
Statistica 6.0 (Stata Corporation, College Station, TX. 1999).
91
Resultados – Parte I
4. Resultados
Parte I
Propriedades Biofísicas da Interação de Peptídeos de Fusão com
Membranas Biomiméticas
Os vírus envelopados entram nas células através da fusão entre o
envelope viral e a membrana da célula hospedeira. Uma ou mais proteínas
de membrana viral facilitam as várias etapas de fusão. A fusão entre duas
membranas é termodinamicamente favorável, mas existe uma barreira
energética alta. As proteínas de fusão viral conseguem diminuir esta
barreira energética utilizando a energia livre liberada durante a alteração
conformacional da proteína (Chernomordik et al., 2003; 2006).
As proteínas de fusão de vírus possuem uma sequência, bastante
conservada dentro de cada gênero, importante para a atividade de fusão.
Este fragmento é conhecido como peptídeo de fusão, e seu caráter
hidrofóbico facilita sua inserção em membranas alvo. Os Flavivírus
possuem esta sequência conservada que varia majoritariamente em
apenas uma posição. De uma forma geral, os vírus transmitidos por
mosquito apresentam um resíduo de Glicina na posição 104, enquanto os
vírus que possuem como vetor o carrapato apresentam um resíduo de
Histidina.
92
Resultados – Parte I
Embora a idéia geral do processo de fusão dos vírus envelopados
seja bem aceita, os mecanismos que regem a interação são pobremente
entendidos. Portanto, neste estudo, as propriedades da interação de dois
peptídeos de fusão de Flavivírus, FLAG e FLAH, com membranas
biomiméticas foram investigadas.
4.1.
Análise Teórica da Estrutura e da Hidrofobicidade dos Peptídeos
de Fusão
A sequência dos peptídeos de fusão consiste de um intervalo de 13
aminoácidos, sendo dois resíduos carregados positivamente (Arg99 e
Lys110) e um resíduo carregado negativamente (Asp98), além de um
aminoácido aromático (Trp101) importante para as medidas de
fluorescência neste estudo (Figura 14A). Em pH neutro, estes peptídeos
exibem carga +1, entretanto, a presença de um resíduo de His na posição
104 torna o peptídeo FLAH mais carregado (+2) em pHs abaixo de 6. Uma
característica bastante comum em peptídeos de fusão de vírus é que
ambos os peptídeos estudados aqui são ricos em Gly, o que os tornam
altamente flexíveis e conformacionalmente polimórficos (Figura 14A).
A partição de oligopeptídeos dentro de interfaces de membrana
promove a formação de estrutura secundária. Uma descrição quantitativa
do acoplamento da formação de estrutura para particionar, que pode
93
Resultados – Parte I
fornecer uma base para o entendimento de enovelamento e inserção de
proteínas de membrana, requer uma escala de energia livre apropriada
para partição. Wimley e White (1996), levando em consideração a
contribuição das ligações peptídicas, descreveram uma escala de
hidrofobicidade interfacial completa determinada a partir de duas séries
de pequenos peptídeos modelo dentro da interface de membranas
fosfolipídicas zwiteriônicas. Neste trabalho, eles mostraram que a
interação dos resíduos aromáticos é favorável dentro da interface de
membranas, enquanto os resíduos carregados são desfavoráveis. Além
disso, a redução do alto custo de partição das ligações peptídicas através
de ligações de hidrogênio pode ser importante para promover a formação
de estrutura na interface da membrana (Wimley & White, 1996).
De acordo com a escala de hidrofobicidade (Figura 14B), os
aminoácidos carregados, presentes nas porções terminais de cada
sequência, mostram uma pequena tendência para particionar dentro da
bicamada lipídica. Isto sugere que os peptídeos de fusão dos Flavivírus,
FLAG e FLAH, podem adotar uma estrutura curvada na interface de
membranas.
94
Resultados – Parte I
(A)
Sequências de Peptídeos de Fusão de Vírus
Vírus
Sequência
Resíduos
Gly
FLAG
DRGWGNGCGLFGK
13
38%
FLAH
DRGWGNHCGLFGK
13
31%
SFV
GVYPFMWGGAYCFCDSEN
18
17%
GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGF
24
29%
AVGIGAIFLGFLGAAGSTMGAASMTLTVQA
30
20%
HIV-1
Influenza A
(B)
FLAG
FLAH
Hidrofobicidade
2
1
0
-1
98
100
102
104
106
108
110
Aminoácido
Figura 14 – Análise Teórica da Estrutura e da Hidrofobicidade de Peptídeos de
Fusão Virais.
(A) Sequências de diferentes peptídeos de fusão de vírus. A diferença entre FLAG e
FLAH é um resíduo de Gly que está na posição de uma His. Neles, o Trp101, a Gly104 e
a His104 estão indicados em negrito, enquanto os aminoácidos conservados dentro do
gênero estão sublinhados. (B) Gráfico de hidrofobicidade para os peptídeos de fusão
de Flavivírus FLAG e FLAH, conforme escala descrita por Wimley & White (1996).
95
Resultados – Parte I
4.2.
Análise das Propriedades Estruturais da Interação PeptídeoMicela
O espectro de emissão de fluorescência de peptídeos que
apresentam resíduos aromáticos em suas sequências pode fornecer
informações valiosas acerca das propriedades estruturais locais (Lakowicz,
1999). Em solução, ambos os peptídeos estudados apresentam um máximo
de absorção a 280 nm, valor utilizado para excitar as amostras em todos
os nossos experimentos de fluorescência. Além disso, ambos mostraram
um máximo de emissão a 349 nm (Figura 15A), valor bastante desviado
para o vermelho, o que indica uma exposição dos resíduos de Trp ao meio
aquoso.
Há muitos anos, diversos estudos vêm mostrando que detergentes
iônicos, como o Dodecil Sulfato de Sódio (SDS), são capazes de se ligar a
muitas proteínas com alta afinidade e utilizados para diversas finalidades
estruturais (Decker & Foster, 1966; Reynolds et al., 1967; Parker & Song, 1992). As
interações são governadas pelo estado agregado do detergente (micelas),
que se liga a proteínas via interações entre seu grupamento sulfato e a
cadeia lateral de aminoácidos carregados positivamente, e entre a cadeia
alquila e as cadeias laterais hidrofóbicas (Yonath et al., 1977; Wang et al.,
1996).
96
Resultados – Parte I
Absorbância
0,15
A
FLAG
0,10
0,05
0,00
-0,05
260
280
300
320
1,0
B
0,8
0,6
0,4
0,2
300
320
340
360
380
400
Intensidade de Fluorescência (U.A.)
Intensidade de Fluorescência
Normalizada
Comprimento de Onda (nm)
300
0 mM SDS
10 mM SDS
0 mM SDS
10 mM SDS
C
250
200
150
100
50
0
420
300
320
1,0
0 mM n-OGP
40 mM n-OGP
D
340
360
380
400
420
Comprimento de Onda (nm)
0,8
0,6
0,4
0,2
140
Intensidade de Fluorescência (U.A.)
Intensidade de Fluorescência
Normalizada
Comprimento de Onda (nm)
120
0 mM n-OGP
40 mM n-OGP
E
100
80
60
40
20
0
300
320
340
360
380
Comprimento de Onda (nm)
400
420
300
320
340
360
380
400
420
Comprimento de Onda (nm)
Figura 15 – Espectros de Absorção e de Emissão de Fluorescência dos Peptídeos de
Fusão de Flavivírus.
(A) Espectro de absorção do peptídeo FLAG. Espectros de emissão de fluorescência dos
resíduos de Trp dos peptídeos FLAG (B e D) e FLAH (C e E) adquiridos em tampão (linhas
pretas), na presença de micelas de SDS 10 mM (B e C) e n-octil-β-D-glicopiranosídeo 40
mM (D e E) (linhas azuis). A concentração dos peptídeos utilizada foi de 10 M diluídos
em tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4. Em ambas as micelas, não existe diferença
significativa entre os pHs 5,5 e 7,4. Exc: 280 nm; Em: 300-420 nm. Os dados mostrados
são muito similares ao peptídeo FLAH.
97
Resultados – Parte I
Para determinar a extensão relativa da interação dos resíduos de
Trp com micelas de diferentes características, experimentos de supressão
de fluorescência foram realizados. A fluorescência intrínseca do Trp de
ambos os peptídeos obedece à equação linear de Stern-Volmer, utilizando
acrilamida como um agente supressor neutro, hidrofílico e dinâmico.
Na presença de micelas aniônicas de SDS, o pico do comprimento de
onda de emissão é desviado de 349 nm para cerca de 334 nm em ambos
os peptídeos (Figura 15B) e não existe diferença significativa entre os pHs
analisados. Este desvio para o azul é representativo dos resíduos de Trp,
completamente expostos à água em tampão, sendo particionado dentro
de um ambiente mais hidrofóbico fornecido pelas micelas (Lakowicz, 1999).
Além disso, a intensidade de fluorescência aumenta cerca de três vezes,
sugerindo um ambiente mais rígido em torno dos resíduos de Trp (Figura
15B).
Em solução e em ambos os pHs, os valores das constantes de
supressão de Stern-Volmer (KSV) foram próximos a 12 M-1 e 15 M-1 para
FLAG e FLAH, respectivamente (Figuras 16 e 17; Tabela I). Quando micelas
de SDS estão presentes no meio, a extensão da supressão diminui,
indicando uma diminuição na probabilidade de colisão entre o fluoróforo
e o agente supressor. Portanto, a proteção parcial frente ao solvente
98
Resultados – Parte I
aquoso é também suportada pela diminuição da constante de SternVolmer (KSV) para cerca de 11 M-1, alteração mais evidente para o
peptídeo FLAH (Figura 16). As intensidades de fluorescência de ambos os
peptídeos na presença de micelas de SDS são muito similares e existe
pouca diferença entre a eficiência de supressão dos resíduos de Trp pela
acrilamida, indicando que o pH não tem efeito significativo sobre a
acessibilidade do supressor, pelo menos, no que diz respeito ao estudo de
pequenos peptídeos sintéticos individuais.
99
Resultados – Parte I
FLAG
A
B
FLAG
5,5
7,4
*
**
**
*
Acrilamida (mM)
C
FLAH
FLAH 5,5
***
7,4
D
****
***
****
Acrilamida (mM)
Figura 16 – Interação entre os Peptídeos FLAG e FLAH com Micelas de SDS,
Monitorada por Supressão de Fluorescência por Acrilamida.
Supressão da fluorescência por acrilamida dos triptofanos presentes nos peptídeos
FLAG (A) e FLAH (C) na presença ou na ausência de micelas de SDS. 10 M de peptídeo
foram incubados com concentrações crescentes de acrilamida a 37°C, excitados em
280 nm e a emissão foi analisada em 349 nm (ausência) e 334 nm (presença). Em preto
e em azul, representação na ausência e na presença de concentração micelar de SDS
em pH 5,5, respectivamente. Em vermelho e em verde, representação dos peptídeos
na ausência e presença de concentração micelar de SDS em pH 7,4, respectivamente.
(B e D) Quantificação da supressão utilizando a constante de Stern-Volmer. Análise
estatística utilizando o teste t (Student’s t-test). * P = 0,0426; ** P = 0,0056; *** P =
0,0002; **** P < 0,0001.
100
Resultados – Parte I
Por outro lado, na presença de micelas neutras de n-octil-β-Dglicopiranosídeo, os espectros de ambos os peptídeos apresentaram um
desvio para o azul de apenas 3 nm (Figura 15C e Tabela I). Esta
observação sugere que os peptídeos na presença de micelas estão
parcialmente protegidos da água, mas ainda permanecem em contato
com o solvente através de ligações de hidrogênio, o que está consistente
com a imersão do fluoróforo dentro da interface micela-água. Estes
resultados indicam que o desvio para o azul é mais substancial com
micelas de SDS do que com micelas de n-octil-β-D-glicopiranosídeo (334
vs. 346 nm), sugerindo uma maior interação do anel indol do Trp com
detergentes carregados negativamente e uma interação diferenciada com
as micelas neutras (Lakowicz, 1999).
101
Resultados – Parte I
Tabela I – Parâmetros Espectroscópicos Medidos para a Ligação dos
Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH a Diferentes Micelas
Ksv (M-1) Calculado
Condição
Tampão (tp)
Experimental
SDS
razão
n-OGP
razão
(10 mM)
(tp/SDS)
(40 mM)
(tp/n-OGP)
FLAG em pH 7,4
12,72  0,285
11,76  0,319
1,08
10,51  0,199
1,21
FLAG em pH 5,5
12,13  0,38
10,73  0,203
1,13
11,72  0,212
1,03
FLAH em pH 7,4
14,95  0,206
12,23  0,126
1,22
14,25  0,22
1,05
FLAH em pH 5,5
16,17  0,312
11,75  0,373
1,38
11,3  0,668
1,43
Comprimento de
onda de emissão
(nm)
Desvio do espectro
a
(nm)
349
334
-
15
346
-
3
-
Estes experimentos foram realizados em tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4 e
5,5, usando 10 M de peptídeo.
a
O desvio do espectro foi determinado após subtração do espectro controle.
O desvio padrão foi obtido através de replicatas independentes (n ≥ 3) para cada
experimento.
102
Resultados – Parte I
Entretanto, a constante de supressão mostrou uma mudança
estatisticamente significativa, principalmente para o peptídeo FLAH em pH
5,5 (11 M-1) quando comparada com o controle (16 M-1). A razão entre as
constantes de Stern-Volmer em tampão e na presença de micelas de noctil-β-D-glicopiranosídeo, calculada como uma média entre aquelas
obtidas a partir dos gráficos de intensidade (Tabela I), é maior para o
peptídeo FLAH em pH 5,5 em ambas as micelas analisadas. Estes
resultados podem ser interpretados como uma indicação de que a
acessibilidade do supressor ao fluoróforo diminui devido à inserção do
FLAH dentro de regiões não polares das micelas nesta condição (Figura 17
e Tabela I). Ao contrário, nenhuma variação significativa foi observada em
pH 7,4, sugerindo que, na presença de micelas de SDS, os resíduos de Trp
de ambos os peptídeos estão mais escondidos nesta condição.
103
Resultados – Parte I
FLAG
FLAG
B
7,4
5,5
*
*
A
FLAH
FLAH
**
5,5
7,4
D
**
C
Acrylamide (mM)
Figura 17 - Interação entre os Peptídeos FLAG e FLAH com Micelas de n-octil-β-Dglicopiranosídeo, Monitorada por Supressão de Fluorescência por Acrilamida.
Experimento de supressão da fluorescência por acrilamida dos triptofanos presentes
nos peptídeos FLAG (A) e FLAH (C) na presença ou na ausência de micelas de n-octil-βD-glicopiranosídeo. 10 M de peptídeo foram incubados com concentrações
crescentes de acrilamida a 37°C, excitados em 280 nm e a emissão foi analisada em
349 nm (ausência) e 346 nm (presença). Em preto e em azul, representação na
ausência e na presença de concentração micelar de n-octil-β-D-glicopiranosídeo em pH
5,5, respectivamente. Em vermelho e em verde, representação dos peptídeos na
ausência e presença de concentração micelar de n-octil-β-D-glicopiranosídeo em pH
7,4, respectivamente. (B e D) Quantificação da supressão de acrilamida utilizando a
constante de Stern-Volmer. Análise estatística utilizando o teste t (Student’s t-test). * P
= 0,0003; ** P = 0,0038.
104
Resultados – Parte I
Juntos, estes resultados indicam que para os peptídeos FLAG e FLAH
a associação à membrana é parcialmente dependente de carga. Além
disso, os dados sugerem que os peptídeos podem interagir de forma
distinta na presença de diferentes micelas, podendo envolver ou não o
ambiente do Trp. Embora a supressão de fluorescência tenha diminuído
significativamente na maioria dos casos, a baixa diferença nos valores das
constantes de Stern-Volmer indica que parte dos resíduos de Trp estão
expostos ao ambiente polar, sugerindo que a interação peptídeo-micela
esteja ocorrendo mais superficialmente.
4.3.
Termodinâmica da Interação Peptídeo-Micela
A adsorção à superfície, a inserção na membrana e a ligação
específica são geralmente acompanhadas por alterações no conteúdo de
calor do sistema e podem ser medidas através de calorimetria isotérmica
de titulação (ITC), evitando a necessidade de marcação de peptídeos. ITC
foi utilizado para avaliar e comparar a entalpia de interação dos peptídeos
FLAG e FLAH com diferentes micelas. Devido à própria característica de
equilíbrio das micelas, a interação, neste caso, não alcança um nível de
saturação, já que existirá sempre muito mais detergente do que peptídeo,
e por este motivo não é possível calcular as constantes de ligação.
105
Resultados – Parte I
A entalpia de ligação (H) de cada reação foi calculada a partir dos
fluxos de calor resultantes de quatro injeções de peptídeo em micela em
diferentes temperaturas e em ambos os pHs, 7,4 e 5,5. Em todos os casos,
experimentos controle foram realizados e subtraídos com o objetivo de
descontar o calor de diluição da amostra.
Na presença de micelas de SDS, o processo de ligação é
endotérmico a 37°C e exotérmico a 25°C e 15°C (Figura 18). Por outro
lado, a interação com micelas de n-octil-β-D-glicopiranosídeo produz um
calor de reação exotérmico em todas as temperaturas analisadas,
indicando que esta ligação é amplamente governada por entalpia (Figura
19). Surpreendentemente, os valores das entalpias de todas as ligações
foram extremamente elevados, variando desde 50 kcal/mol até -830
kcal/mol (Tabela II). Além disso, em todos os experimentos de ITC, o pH
não influenciou nos resultados e não houve diferença significativa entre os
dois peptídeos estudados.
106
Resultados – Parte I
2
Fluxo de Calor (cal s-1)
FLAG
SDS - 15°C
SDS - 25°C
SDS - 37°C
1
0
-1
A
0
500
1000
1500
2000
Fluxo de Calor (cal s-1)
Tempo (seg)
FLAH
SDS - 15°C
SDS - 25°C
SDS - 37°C
1
0
-1
B
0
500
1000
1500
2000
Tempo (seg)
Figura 18 – Calorimetria Isotérmica de Titulação (ITC) de Micelas de SDS com
os Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH.
Perfis calorimétricos após a injeção de alíquotas de 5 L de peptídeo, a partir de um
estoque a 100 M, à cela calorimétrica contendo micelas de SDS em tampão em pH
5,5. Cada injeção representa a adição de aproximadamente 0,003 M de peptídeo. Em
(A), peptídeo FLAG adicionado à cela contendo 20 mM de SDS em tampão fosfato pH
5,5. Em (B), peptídeo FLAH adicionado à cela contendo 20 mM de SDS em tampão
fosfato pH 5,5. As temperaturas analisadas foram 15°C (verde), 25°C (vermelho) e 37°C
(azul). Em todos os painéis, a primeira injeção foi de 1 L de peptídeo. Os resultados
foram muito similares em pH 7,4. As medidas de ITC foram realizadas utilizando um
calorímetro VP-ITC da MicroCal, Llc (Northamptom, MA).
107
Resultados – Parte I
A
Fluxo de Calor (cal s-1)
0
-5
-10
-15
n-OGP - 15°C
n-OGP - 25°C
n-OGP - 37°C
-20
0
500
FLAG
1000
1500
2000
Tempo (seg)
B
Fluxo de Calor (cal s-1)
0
-5
-10
-15
n-OGP - 15°C
n-OGP - 25°C
n-OGP - 37°C
-20
0
500
FLAH
1000
1500
2000
Tempo (seg)
Figura 19 – Calorimetria Isotérmica de Titulação (ITC) de Micelas de n-octil-βD-glicopiranosídeo com os Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH.
Perfis calorimétricos após a injeção de aproximadamente 0,003 M de peptídeo à cela
calorimétrica contendo micelas de n-octil-β-D-glicopiranosídeo em tampão em pH 5,5.
Em (A), peptídeo FLAG adicionado à cela contendo 20 mM de SDS em tampão fosfato
pH 5,5. Em (B), peptídeo FLAH adicionado à cela contendo 20 mM de SDS em tampão
fosfato pH 5,5. As temperaturas analisadas foram 15°C (verde), 25°C (vermelho) e 37°C
(azul). Em todos os painéis, a primeira injeção foi de 1 L de peptídeo. Os resultados
foram muito similares em pH 7,4. As medidas de ITC foram realizadas utilizando um
calorímetro VP-ITC da MicroCal, Llc (Northamptom, MA).
108
Resultados – Parte I
Tabela II – Parâmetros Termodinâmicos da Interação Peptídeo-Micela
H (kcal/mol)
Condição
Experimental
37°C
25°C
15°C
pH
Cp (kcal/mol x K)
7,4
85,6
-2,26
-76,07
7,35
5,5
70,73
-8,46
-84,24
7,03
7,4
45,24
-22,29
-78,75
5,64
5,5
50,44
-22,59
-73,17
5,63
FLAG (SDS/NaCl)
5,5
77
109
303
-10,02
FLAH (SDS/NaCl)
5,5
41,3
80,4
216,1
-7,79
7,4
-199,4
-503,7
-780
26,36
5,5
-215,2
-510,8
-752,4
24,42
7,4
-197,1
-491,4
-830,3
28,64
5,5
-196,5
-492
-794
27,07
FLAG (SDS)
FLAH (SDS)
FLAG (n-OGP)
FLAH (n-OGP)
Estes experimentos foram realizados em tampão fosfato de sódio 20 mM, pH
7,4 e 5,5, na presença ou na ausência de NaCl 250 mM.
109
Resultados – Parte I
A entalpia de ligação obtida em diferentes temperaturas (Figura 20
A e B) possibilita encontrar os valores de variação da capacidade calorífica
(Cp) para cada sistema de reação. Todos os valores de Cp foram
expressivamente positivos (Tabela II), indicando que as interações dos
peptídeos FLAG e FLAH com micelas de SDS e n-octil-β-D-glicopiranosídeo
são predominantemente não-hidrofóbicas (Cooper, 2000).
Neste sentido, para avaliar a presença de interações eletrostáticas,
NaCl 250 mM foi incluído no sistema de reação contendo micelas de SDS
nesta condição. A perda entálpica da interação dos peptídeos com micelas
de SDS pode ser observada (Tabela II), uma vez que a reação se mostrou
endotérmica em todas as temperaturas analisadas (Figura 21). Portanto, a
presença de sal é capaz de reverter a termodinâmica do sistema, tornando
os
valores
de
Cp
completamente
negativos,
sugerindo
uma
predominância de interações hidrofóbicas nesta condição (Figura 20A).
110
Resultados – Parte I
400
FLAG - SDS
FLAH - SDS
-1
H (kcal mol )
300
FLAG - SDS/NaCl
FLAH - SDS/NaCl
200
100
0
-100
A
-200
15
20
25
30
35
40
Temperatura (°C)
-100
-200
FLAG - n-OGP
FLAH - n-OGP
-1
H (kcal mol )
-300
-400
-500
-600
-700
-800
B
-900
15
20
25
30
35
40
Temperatura (°C)
Figura 20 - Efeito da Temperatura na Entalpia de Ligação Peptídeo-Micela.
A variação da capacidade calorífica é descrita pela variação do H em função da
temperatura. As medidas foram realizadas a 15°C, 25°C e 37°C. Em vermelho e azul, os
peptídeos FLAG e FLAH, respectivamente, foram adicionados à cela contendo 20 mM de
SDS (A) ou 40 mM de n-octil-β-D-glicopiranosídeo (B) em tampão fosfato de sódio pH
5,5; já em verde e ciano, os peptídeos FLAG e FLAH, respectivamente, foram
adicionados à cela contendo 20 mM de SDS em tampão fosfato de sódio, NaCl 250
mM, pH 5,5.
111
Resultados – Parte I
Fluxo de Calor (cal s-1)
6
FLAG
SDS/NaCl - 15°C
SDS/NaCl - 25°C
SDS/NaCl - 37°C
5
4
3
2
1
0
A
0
500
1000
1500
2000
Fluxo de Calor (cal s-1)
Tempo (seg)
FLAH
SDS/NaCl - 15°C
SDS/NaCl - 25°C
SDS/NaCl - 37°C
4
3
2
1
0
B
0
500
1000
1500
Tempo (seg)
Figura 21 - Calorimetria Isotérmica de Titulação (ITC) de Micelas de SDS com
os Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH na Presença de NaCl.
Perfis calorimétricos após a injeção de alíquotas de 5 L de peptídeo, a partir de um
estoque a 100 M, à cela calorimétrica contendo micelas de SDS em tampão em pH
5,5. Em (A), peptídeo FLAG adicionado à cela contendo 20 mM de SDS em tampão
fosfato de sódio, NaCl 250 mM, pH 5,5. Em (B), peptídeo FLAH adicionado à cela
contendo 20 mM de SDS em tampão fosfato de sódio, NaCl, 250 mM, pH 5,5. As
temperaturas analisadas foram 15°C (verde), 25°C (vermelho) e 37°C (azul). Em todos
os painéis, a primeira injeção foi de 1 L de peptídeo. Os resultados foram muito
similares em pH 7,4. As medidas de ITC foram realizadas utilizando um calorímetro VPITC da MicroCal, Llc (Northamptom, MA).
112
Resultados – Parte I
4.4.
Análise das Mudanças Conformacionais dos Peptídeos
Apesar das contribuições aromáticas serem muitas vezes fracas em
comparação a outras estruturas amidas, alterações no ambiente de
cadeias laterais de resíduos aromáticos em proteínas causadas por uma
ligação, por exemplo, podem levar a mudanças detectáveis em seu sinal
de dicroísmo circular (CD). Tais contribuições são geralmente monitoradas
na região de UV próximo, onde o esqueleto amida não contribui. Apesar
da aparente estrutura randômica observada no espectro de CD, a faixa
positiva na região entre 225 e 235 nm se deve às cadeias laterais dos
resíduos Trp ou Tyr, ou a ligações dissulfeto, uma vez que contribuições
amidas nesta região geralmente são negativas (Sreerama & Woody, 2004).
As cadeias laterais aromáticas frequentemente formam interações
pareadas ou clusters em proteínas. O acoplamento de dois grupos
aromáticos depende da distância que os separa e da orientação de seus
anéis aromáticos. Normalmente, distâncias mais curtas levam a sinais de
CD mais fortes (Sreerama & Woody, 2004). Além disso, interações aromáticoaromático fazem uma maior contribuição para a estabilidade de β-hairpin
do que as interações alifático-aromático (Cochran et al., 2001; 2002; Hughes &
Waters, 2006).
113
Resultados – Parte I
As medidas de CD neste estudo revelam que os peptídeos FLAG e
FLAH em solução aquosa exibem uma conformação randômica, devido ao
forte pico negativo próximo à região de 200 nm (Figura 22). Além disso,
um pico positivo aparece na região entre 225-230 nm, o que poderia
indicar presença de pontes dissulfeto ou uma interação entre resíduos
aromáticos. De fato, os peptídeos apresentam um resíduo de Cys na
posição 105, e a formação de oligômeros entre eles através de ligações
dissulfeto seria possível. Entretanto, esta hipótese foi descartada porque o
pico positivo permanece no espectro mesmo após tratamento dos
peptídeos com DTT, um agente redutor (dados não mostrados).
Portanto, a possível interação entre os resíduos aromáticos Trp101
e Phe108 presentes em cada sequência foi investigada. A interação
aromático-aromático
pode
ser
rompida
de
maneira
reversível
submetendo os peptídeos a altas temperaturas (Takekiyo et al., 2009), como
mostra a Figura 23. Desta maneira, é provável que o aparecimento do pico
positivo seja reflexo da interação Trp-Phe. Como estes resíduos
aromáticos estão presentes em cada extremidade das sequências dos
peptídeos, a provável interação entre eles indica que ambos os peptídeos
adotariam, em solução, uma conformação curvada.
114
Resultados – Parte I
2, 2, 2-trifluoretanol (TFE) é um álcool muito utilizado em estudos
de enovelamento de proteínas por afetar fortemente sua estrutura
tridimensional. Sua presença pode promover o aumento das populações
de hélices. Acredita-se que o TFE se agrega ao redor da proteína na
mistura água-álcool, levando à formação de uma matriz que excluiria
parcialmente a água e promoveria interações locais, via ligação de
hidrogênio, que ordenariam a estrutura secundária da molécula,
tornando-a mais estável (Roccatano et al., 2002). Desta forma, a estrutura
dos peptídeos foi avaliada na presença de TFE, e análises de CD
mostraram que TFE não é capaz de induzir a formação de hélices (Figura
22). Isto indica fortemente que estes peptídeos não possuem propensão
para formarem tal estrutura.
115
Resultados – Parte I
Elipticidade Bruta (mgrau)
4
FLAG
A
2
0
-2
-4
-6
-8
controle
100% TFE
-10
200
210
220
230
240
250
260
Comprimento de Onda (nm)
Elipticidade Bruta (mgrau)
4
FLAH
B
2
0
-2
-4
-6
-8
controle
100% TFE
-10
200
220
240
260
Comprimento de Onda (nm)
Figura 22 - Análise da Estrutura Secundária dos Peptídeos de Fusão FLAG e
FLAH na Presença de TFE.
Espectro de dicroísmo circular dos peptídeos de fusão FLAG (A) e FLAH (B) em tampão
(preto) ou na presença (azul) de 100% de TFE. A concentração de peptídeo utilizada foi
de 1 mM diluído em tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 5,5, a 25°C.
116
Resultados – Parte I
Elipiticidade Bruta (mgrau)
FLAG
A
2
0
-2
-4
25°C
85°C
retorno
-6
200
210
220
230
240
250
260
Comprimento de Onda (nm)
Elipiticidade Bruta (mgrau)
2
FLAH
B
1
0
-1
-2
-3
-4
25°C
85°C
retorno
-5
-6
200
210
220
230
240
250
260
Comprimento de Onda (nm)
Figura 23 - Análise da Estrutura Secundária dos Peptídeos de Fusão FLAG e
FLAH Submetidos à Alta Temperatura.
Espectro de dicroísmo circular dos peptídeos de fusão FLAG (A) e FLAH (B) em tampão a
25°C (preto) ou a 85°C (azul). O retorno a temperatura de 25°C está mostrado em
vermelho. A concentração de peptídeo utilizada foi de 1 mM diluído em tampão
fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4.
117
Resultados – Parte I
A presença de um ambiente hidrofóbico refletido pelas micelas de
SDS induz um ganho de estrutura na região próxima a 218 nm (Figura 24),
sugerindo uma possível conformação adicional em volta-β, que é
geralmente formada por três resíduos e estabilizada por uma ligação de
hidrogênio entre o primeiro e o terceiro grupamento amida, revertendo a
direção da cadeia (Sreerama & Woody, 2004). Isto poderia indicar a presença
de uma estrutura mais estável, formada por duas fitas-β, que em um
ambiente apolar estariam conectadas por uma volta-β, ambas formando
uma estrutura em β-hairpin, já que o pico positivo próximo à região de
230 nm permanece no espectro, indicando a interação entre os
aromáticos. Entretanto, a presença de micelas neutras de n-octil-β-Dglicopiranosídeo não é capaz de induzir tal estrutura, uma vez que seu
espectro é muito similar ao controle (Figura 25).
118
Resultados – Parte I
2
FLAG
Elipiticidade Bruta (mgrau)
A
1
0
-1
-2
-3
-4
controle
SDS 10 mM
-5
200
220
240
260
Comprimento de Onda (nm)
2
FLAH
Elipiticidade Bruta (mgrau)
B
0
-2
-4
-6
controle
SDS 10 mM
-8
200
220
240
260
Comprimento de Onda (nm)
Figura 24 - Análise da Estrutura Secundária dos Peptídeos de Fusão FLAG e
FLAH na Presença de Micelas de SDS.
Espectro de dicroísmo circular dos peptídeos de fusão FLAG (A) e FLAH (B) em tampão
(preto) ou na presença de micelas de SDS a 10 mM (azul). A concentração de peptídeo
utilizada foi de 1 mM, diluído em tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4, a 25°C. Perfil
similar foi observado para o pH 5,5.
119
Resultados – Parte I
Elipiticidade Bruta (mgrau)
2
FLAG
A
0
-2
-4
controle
n-OGP 40 mM
-6
200
220
240
260
Comprimento de Onda (nm)
2
FLAH
Elipiticidade Bruta (mgrau)
B
1
0
-1
-2
-3
-4
controle
n-OGP 40 mM
-5
200
220
240
260
Comprimento de Onda (nm)
Figura 25 - Análise da Estrutura Secundária dos Peptídeos de Fusão FLAG e
FLAH na Presença de Micelas de n-octil-β-D-glicopiranosídeo.
Espectro de dicroísmo circular dos peptídeos de fusão FLAG (A) e FLAH (B) em tampão
(preto) ou na presença de micelas de n-octil-β-D-glicopiranosídeo a 40 mM (azul). A
concentração de peptídeo utilizada foi de 1 mM, diluído em tampão fosfato de sódio
20 mM, pH 7,4. O mesmo perfil foi observado para o pH 5,5.
120
Resultados – Parte I
Em modelos de peptídeos em hélice, a estabilização da estrutura
ocorre principalmente por uma consequência das interações locais. Ao
contrário, as folhas-β são propagadas por resíduos em partes
completamente diferentes da sequência dos peptídeos. Um β-hairpin
representa o modelo mais simples aceito de uma folha-β antiparalela,
consistindo de duas fitas-β ligadas por um pequeno loop ou por uma volta
reversa (Griffiths-Jones et al., 1999; Takekiyo et al., 2009).
β-hairpin apresenta estabilidade marginal (G°  0 a 30°C),
fornecendo um sistema modelo sensível para avaliar a natureza de
interações relevantes que estabilizam uma estrutura em folha-β, e, assim,
entender a estabilidade e os eventos iniciais de enovelamento de uma
proteína (Minor & Kim, 1994). A origem da estabilidade tem sido atribuída a
um número de fatores chave, incluindo o papel das ligações de hidrogênio
entre as fitas, o efeito das interações hidrofóbicas devido à cadeia lateral
(Searle et al., 1995; Ramirez-Alvarado et al., 1996; Maynard et al., 1998) e as
preferências conformacionais amplamente associadas às sequências de
volta-β (de Alba et al., 1997a, b; Haque & Gellman, 1997).
Vários exemplos têm ilustrado como as sequências de uma volta
podem ditar não somente a estabilidade do hairpin e a própria
conformação da volta, mas também o registro das ligações de hidrogênio
121
Resultados – Parte I
entre as fitas e o pareamento dos resíduos entre as duas fitas-β (Blanco et
al., 1993; Searle et al., 1995; de Alba et al., 1997a, b; Haque & Gellman, 1997).
Hairpin é uma estrutura altamente resistente a desnaturação,
permanecendo significativamente enovelada em 7 M de uréia (GriffithsJones et al., 1999).
Enquanto sequências arbitrárias extraídas de proteínas raramente
formam β-hairpins estáveis em solução aquosa, muitos pesquisadores têm
mostrado que pequenos peptídeos projetados podem se enovelar em
uma estrutura em β-hairpin (Muñoz et al., 1997; Gellman, 1998; Cheng et al.,
2001; Hughes & Waters, 2006). Estudos de interações aromáticas ganham
destaque através da agregação de folhas-β, que leva à formação de placas
amilóides
e
resulta
em
agregação
de
proteínas
e
doenças
neurodegenerativas (Gazit, 2002; Tracz et al., 2004).
4.5.
Perturbação da Bicamada Lipídica Promovida pela Interação dos
Peptídeos de Fusão
Em um termograma de aquecimento por DSC, a temperatura de
transição corresponde à altura máxima do pico de transição e a entalpia
de transição corresponde à área integrada do pico dividida pela
concentração
lipídica.
As
vesículas
compostas
por
Di-Palmitoil-
122
Resultados – Parte I
Fosfatidilcolina (DPPC) são bicamadas bem caracterizadas e bastante
utilizadas como modelo para diversos estudos.
Um termograma para uma dispersão aquosa de bicamadas de
DPPC, ou C(16):C(16)PC, mostra três transições endotérmicas. O pico de
menor temperatura, com uma temperatura de transição de 21,5°C e uma
entalpia de transição (H) de 6 kcal/mol, é pequeno e mais alargado. Esta
transição de menor temperatura é chamada de sub-transição. A
temperatura de transição média, conhecida como pré-transição (Tpre), é
muito pequena e é caracterizada por uma temperatura de transição de
35°C e uma entalpia de 1 kcal/mol. O pico maior e mais estreito que
aparece em uma temperatura superior é a transição de fase principal, com
uma temperatura de transição (Tm) de 41,5°C e uma entalpia de transição
de 8,7 kcal/mol (Huang & Li, 1999).
Como aparecem três transições diferenciadas, quatro fases
lamelares, designadas como Lc, Lβ’, Pβ’ e L, podem ser definidas para uma
bicamada de DPPC dentro de uma faixa de 0°C a 50°C sob pressão
atmosférica. Lc, Lβ’, Pβ’ e L são as fases lamelares cristalina, gel inclinada,
gel ondulada e líquido-cristalina, respectivamente. Portanto, as transições
de fase sub-, pré- e principal são atribuídas às transições Lc  Lβ’, Lβ’ 
Pβ’, Pβ’  L, respectivamente. Como a pré-transição é muito pequena, a
123
Resultados – Parte I
transição de fase gel para líquido-cristalino (Lβ’  L) é freqüentemente
chamada de transição principal (Huang & Li, 1999).
A temperatura de transição de fase de uma bicamada composta
apenas por lipídios insaturados é baixa, podendo chegar a valores abaixo
de zero, dificultando as análises por DSC. Apesar disso, sistemas binários
compostos por lipídios saturados e insaturados podem ser utilizados
porque a tendência é haver uma temperatura de transição principal
intermediária.
O comportamento de fase termotrópico de membranas modelo foi
estudado por DSC, uma técnica muito sensível para avaliar efeitos
causados por pequenos componentes que particionam dentro da matriz
lipídica (McElhaney, 1982). Desta maneira, para avaliar a interação dos
peptídeos e uma possível perturbação da membrana, foram realizados
termogramas através de DSC utilizando vesículas multilamelares
compostas por DPPC e DPPC:PG (1:1) (Figura 26).
A temperatura de transição principal de membranas formadas
unicamente por DPPC é em torno de 41°C. Isto significa que abaixo desta
temperatura a membrana encontra-se em fase gel, o que poderia impedir
a interação dos peptídeos. Entretanto, o peptídeo FLAG foi capaz de se
ligar à membrana, afetando o comportamento de fase das vesículas por
124
Resultados – Parte I
diminuir a Tpre, indicando que a interação é capaz de influenciar a fluidez
da membrana analisada (Figura 26A). Além disso, podemos observar que
o pico da transição principal é maior, mostrando um aumento da variação
de entalpia para a mudança de transição de fase principal.
125
Resultados – Parte I
16
DPPC FLAH
12
Cp (kcal/mol/°C)
A
DPPC puro
DPPC FLAG
14
10
8
6
4
2
0
20
25
30
35
40
45
50
Temperatura (°C)
0,5
B
DPPC:PG puro
DPPC:PG FLAG
Cp (kcal/mol/°C)
0,4
DPPC:PG FLAH
0,3
0,2
0,1
0,0
-0,1
0
10
20
30
40
50
Temperatura (°C)
Figura 26 – Termograma de Vesículas Multilamelares na Presença e na
Ausência dos Peptídeos de Fusão FLAG e FLAH.
Termograma realizado através de Calorimetria Diferencial de Varredura utilizando
vesículas multilamelares compostas por DPPC (A) e DPPC:PG (B) na presença do
peptídeo FLAG (vermelho) e FLAH (azul). A razão molar lipídio:peptídeo utilizada foi de
100:1.
126
Resultados – Parte I
Uma vez que nossos dados espectroscópicos indicam que os
peptídeos
apresentam
uma
preferência
por
grupos
carregados
negativamente, experimentos de DSC utilizando vesículas aniônicas
compostas por DPPC:PG (1:1) foram realizados. O termograma destas
vesículas se mostrou bastante alargado, comum para membranas
compostas, apresentando duas transições. Isto é bem característico da
presença de duas fases de membrana, onde ocorre segregação dos lipídios
(Figura 26B). Sob adição dos peptídeos, o comportamento de fase das
vesículas formadas por DPPC:PG foi significativamente afetado. A fase de
transição principal em torno de 26°C é desviada significativamente para
temperaturas menores no peptídeo FLAH, além de diminuir a variação de
entalpia da transição. Já o peptídeo FLAG apresentou pouca variação em
relação ao controle, entretanto, diminuiu a segregação dos peptídeos,
homogeneizando mais a membrana, já que as duas transições
desapareceram do termograma.
Estes dados confirmam a existência de uma interação preferencial
por membranas carregadas negativamente, uma vez que ambos os
peptídeos são capazes de perturbar com mais intensidade o
comportamento de fase de membranas que contenham lipídios
negativamente carregados, como o PG.
127
Resultados – Parte I
4.6.
Análise Computacional da Interação Peptídeo-Membrana através
de Simulação por Dinâmica Molecular
Recentemente, o avanço das técnicas de modelagem molecular
computacional tem fornecido uma ferramenta alternativa para simular as
estruturas estáticas e dinâmicas de fosfolipídios na presença de água. A
natureza dinâmica de bicamadas lipídicas no estado líquido-cristalino
pode ser simulada pelos métodos de dinâmica molecular (Tieleman &
Berendsen,
1996).
Consequentemente,
torna-se
possível
estudar
simultaneamente a estrutura e o comportamento de fase dos
fosfolipídios.
Para se compreender as características da interação peptídeomembrana, simulações por dinâmica molecular dos peptídeos FLAG e FLAH
foram realizadas utilizando as coordenadas do fragmento de interesse da
proteína E do WNV (Nybakken et al., 2006; pdb: 2HG0), para análise de uma
estrutura de menor energia. O modelo utilizado para este estudo foi uma
bicamada lipídica zwiteriônica composta unicamente por Palmitoil-OleoilFosfatidiletanolamina (POPE) e formada por 340 unidades lipídicas.
As simulações foram realizadas para ambos os peptídeos em caixas
d’água e na presença de uma bicamada lipídica. Três sistemas diferentes
foram montados para cada peptídeo: (1) peptídeos na caixa d’água a 35°C;
128
Resultados – Parte I
(2) peptídeos na caixa d’água a 85°C; e (3) peptídeos a uma determinada
distância da interface da bicamada lipídica de POPE a 35°C.
Para avaliar o comportamento dos peptídeos em solução, a primeira
simulação realizada foi com os peptídeos de fusão dentro de uma caixa
d’água a 35°C. Analisando os resultados, é possível observar que ambos os
peptídeos apresentaram predominantemente uma estrutura curvada, e,
eventualmente, adquiriam estrutura em volta. Além disso, seus resíduos
terminais se mostraram muito instáveis, apresentando estrutura ao acaso
durante todo o tempo de simulação (Figura 27A e B).
Como nossos resultados de dicroísmo circular indicam que esta
estrutura se encontra em uma conformação dobrada, provavelmente
favorecida pela interação entre os aromáticos Trp101 e Phe108, uma
simulação também em água foi realizada a 85°C. A alta temperatura
favorece a quebra de interações, tornando a estrutura mais aberta,
conforme já foi sugerido com a perda do sinal positivo do espectro de CD.
Analisando a estrutura secundária dos peptídeos durante a simulação em
água, podemos notar claramente que eles se mantiveram muito instáveis
ao longo de toda simulação, apresentando muitas oscilações de estruturas
secundárias momentâneas, porém prevalecendo uma conformação
randômica (Figura 27C e D).
129
Resultados – Parte I
A
Tempo (ps)
B
Tempo (ps)
C
D
Tempo (ps)
Tempo (ps)
Figura 27 – Análise da Estrutura Secundária dos Peptídeos de Fusão FLAG e
FLAH durante Simulações em Água.
Estrutura secundária dos peptídeos de fusão FLAG (A) e FLAH (B) durante simulações
em água a 35°C. Estrutura secundária dos peptídeos de fusão FLAG (C) e FLAH (D)
durante a simulação em água a 85°C. As análises de simulação foram realizadas
utilizando o programa GROMACS.
130
Resultados – Parte I
As interações não covalentes são essenciais para a manutenção da
estrutura de proteínas, para os processos de reconhecimento e para as
interações proteína/ligante. A ligação de hidrogênio é um tipo essencial de
interação entre átomos não-ligados, possuindo um papel muito
importante na afinidade de uma molécula por uma proteína e na
determinação da estrutura tridimensional de proteínas nativas (Voet et al.,
2002). Uma ligação de hidrogênio pode ser representada por doadores
fracamente ácidos e um átomo aceptor fracamente básico.
Assim, as interações presentes nestes dois sistemas podem ser
melhor visualizadas pela formação/rompimento de ligações de hidrogênio
ao longo da simulação, onde é possível observar que, em média, estas
interações estão em menor quantidade nas simulações realizadas a 85°C,
quando comparadas ao controle a 35°C (Figura 28A e B). Esta quebra das
ligações de H é mais evidente para o peptídeo FLAH. Observando o gráfico
de distância mínima entre os átomos, é possível avaliar a aproximação dos
resíduos aromáticos Trp-Phe e comparar o perfil entre as duas simulações
realizadas em diferentes temperaturas (Figura 28C e D). Podemos notar
que o sistema na temperatura de 35°C foi mais estável, enquanto que a
85°C o perfil da curva oscilou significativamente, indicando que a alta
131
Resultados – Parte I
temperatura rompeu diversas ligações de hidrogênio, o que desfavoreceu
a aproximação dos resíduos Trp101 e Phe108.
A
B
C
D
Figura 28 – Número de Ligações de H e Distância Mínima entre os resíduos de Trp e
Phe.
Número de ligações de hidrogênio internas dos peptídeos FLAG (A) e FLAH (B) formadas
durante a simulação em água a 35°C (vermelho) e a 85°C (preto). A distância mínima
entre os resíduos Trp101 e Phe108 dos peptídeos FLAG (C) e FLAH (D) em cada sistema
simulado. As análises de simulação foram realizadas utilizando o programa GROMACS.
132
Resultados – Parte I
Buscando compreender as características da interação peptídeomembrana, simulações por dinâmica molecular dos peptídeos FLAG e FLAH
foram realizadas utilizando como modelo uma bicamada lipídica formada
por Palmitoil-Oleoil-Fosfatidiletanolamina (POPE) (Figura 29).
Figura 29 – Representação da Simulação da Interação dos Peptídeos de Fusão
FLAG e FLAH com membrana de POPE.
Representação da interação do peptídeo FLAG (azul) e FLAH (vermelho) a cada 5 ns de
simulação. As cabeças polares dos fosfolipídios do folheto externo da membrana estão
mostradas em cinza. Em cada peptídeo estão destacadas as cadeias laterais dos
resíduos Trp101 e Phe108. As análises das simulações foram realizadas utilizando o
programa GROMACS.
133
Resultados – Parte I
Através da análise da energia e RMSD, que representa o desvio
quadrático médio, ou seja, o quanto a estrutura variou ao longo do tempo
de simulação, podemos verificar que um tempo de simulação de 1 ns é
suficiente para revelar a interação entre os peptídeos e a bicamada
lipídica, onde eles permanecem ligados durante o tempo restante da
simulação. A energia necessária para a interação peptídeo-membrana
diminui mais conforme o peptídeo avança para dentro da bicamada,
comparada à energia dos peptídeos em água. Isto sugere que um simples
modelo hidrofóbico pode favorecer a interação do peptídeo.
Analisando a arquitetura dos peptídeos durante o tempo de
simulação com membrana, podemos observar que a estrutura curvada
dos peptídeos se mantém bastante estável, indicando que a membrana,
de fato, é um ambiente favorável que estabiliza os peptídeos de fusão
(Figura 30).
134
Resultados – Parte I
A
Tempo (ps)
B
Tempo (ps)
Figura 30 – Análise da Estrutura Secundária dos Peptídeos de Fusão FLAG e
FLAH durante Simulações em Membrana.
Estrutura secundária dos peptídeos de fusão FLAG (A) e FLAH (B) durante simulações
em bicamada lipídica composta unicamente por POPE a 35°C. As análises de simulação
foram realizadas utilizando o programa GROMACS.
135
Resultados – Parte I
A única diferença entre os peptídeos estudados é a presença de um
resíduo de Gly ou de His na posição 104 da sequência. Por este motivo, é
interessante analisar a diferença destes resíduos em relação à membrana
alvo. Através de um gráfico da distância mínima de cada resíduo em
relação à cabeça polar dos lipídios POPE que compõem a membrana, mais
precisamente do fósforo presente na sua estrutura, é possível comparar
os peptídeos FLAG e FLAH e perceber que a Gly, por ser um resíduo
pequeno, provavelmente interage melhor sobre a cabeça polar dos
lipídios que formam a membrana. Ao contrário, a His, que possui uma
cadeia lateral grande, fica bastante afastada da membrana. Isto sugere
que o peptídeo FLAG é capaz de se acomodar melhor na interface
membrana-água (Figura 31).
136
Resultados – Parte I
Figura 31 – Distância Mínima dos Resíduos Gly104 e His104 em Relação à
Membrana.
Distância mínima dos resíduos Gly104 (preto) e His104 (vermelho) de cada peptídeo
em relação ao fósforo da cabeça polar do lipídio (POPE). As análises de simulação
foram realizadas utilizando o programa GROMACS.
137
Resultados – Parte I
Avaliando a formação das ligações de hidrogênio durante o tempo
de simulação, podemos notar que ambos os peptídeos formam
predominantemente ligações de H com a água. Isto sugere que, mesmo
após 28 ns de simulação, os peptídeos permanecem na superfície da
membrana (dados não mostrados). As ligações de H entre o peptídeo
FLAG e a água diminuem sutilmente logo nos primeiros 2 ns de simulação
e, consequentemente, ele aumenta sua interação com a membrana
(Figura 32). Após 2 ns, parte das ligações de H que estavam sendo
formadas dentro da cadeia do peptídeo é perdida e ocorre um leve
aumento das ligações de H entre o peptídeo e a membrana. O peptídeo
FLAH também apresenta majoritariamente ligações de H com a água, e,
portanto, também tem uma tendência a ficar na interface da membrana.
Entretanto, quando chega à membrana, sua estabilidade é alcançada mais
rapidamente quando comparado ao peptídeo FLAG.
138
Resultados – Parte I
A
B
Figura 32 – Número de Ligações de H entre os Componentes do Sistema.
Número de ligações de hidrogênio dos peptídeos FLAG (A) e FLAH (B) entre o peptídeo
e a água (preto), entre o peptídeo e a membrana (vermelho) e internas na sequência
(verde) durante a simulação em membrana de POPE.
139
Resultados – Parte I
Além disso, como podemos visualizar para o peptídeo FLAG através
da distribuição mínima de alguns resíduos em relação à membrana (Figura
33), os aminoácidos que mais se aproximaram da membrana e se
mantiveram próximos foram exatamente o Trp e a Phe, ao contrário da
Arg99, presente no N-terminal da sequência, que se encontra bem mais
afastada da membrana. No peptídeo FLAG, os dois resíduos aromáticos
alcançam rapidamente a interface da membrana e se acomodam bem,
permanecendo muito estáveis durante o restante da simulação. Porém, a
interação Trp-Phe não ocorreu durante o tempo de simulação. No
peptídeo FLAH, ambos os resíduos chegam rapidamente à membrana e
permaneceram estáveis. Entretanto, apenas o Trp parece interagir de
alguma forma com a membrana, uma vez que ele fica mais perto da
cabeça polar. Além disso, os resíduos Trp e Phe estão muito próximos um
do outro, sugerindo uma possível interação.
140
Resultados – Parte I
A
B
Figura 33 – Distância Mínima dos Resíduos Arg99, Trp101 e Phe108 entre si e em
Relação à Membrana.
Distância mínima dos resíduos Arg99 (azul), Trp101 (preto) e Phe108 (vermelho) em
relação à membrana, e dos resíduos Trp101 e Phe108 entre si (verde) durante a
simulação em membrana de POPE a 35°C. O peptídeo FLAG está mostrado em A e FLAH
em B. As análises de simulação foram realizadas utilizando o programa GROMACS.
141
Resultados – Parte II
Parte II - Apresentação do artigo intitulado:
Pressure-Inactivated Yellow Fever Virus: Implications for Vaccine
Development
Luciane P. Gaspara,*, Ygara S. Mendesb, Anna M. Y. Yamamuraa, Luiz F. C.
Almeidaa, Elena Caridea, Rafael B. Gonçalvesb#, Jerson L. Silvab, Andréa C.
Oliveirab, Ricardo Gallera, Marcos S. Freirea
a
Programa de Vacinas Virais, Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos,
Fundação Oswaldo Cruz, RJ 21045-900, Brazil
b
Programa de Biologia Estrutural, Instituto de Bioquímica Médica and
Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear de Macromoléculas
Jiri Jonas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ,
21941-590, Brazil
Publicado no periódico Journal of Virological Methods 150, 57-62 (2008)
142
Resultados – Parte II
A vacina contra a Febre Amarela é utilizada há mais de 60 anos e
efeitos colaterais graves (incluindo óbitos) são extremamente raros.
Apesar de sua grande eficácia, cerca de 5% das pessoas pode desenvolver
sintomas da doença. Nos últimos anos, sérios eventos adversos vêm
sendo relatados, o que tem influenciado a reputação da vacina. Portanto,
por sugestão do Ministério da Saúde, estratégias alternativas devem ser
tomadas, o que inclui o desenvolvimento de uma vacina produzida a partir
de vírus inativados.
A alta pressão hidrostática (APH) tem sido apontada como uma
ferramenta alternativa para inativação viral e o desenvolvimento de uma
possível vacina (Masson et al., 2001; Silva et al., 2002; Ishimaru et al., 2004; Murchie et al.,
2005).
Assim, o principal objetivo deste trabalho foi avaliar a inativação por
APH e a imunogenicidade do vírus YF 17DD em modelo murino. Este vírus
foi inativado por uma pressão de 310 MPa por 3 h a 4°C, que abole a
infecciosidade do vírus e elimina sua capacidade de causar a doença.
Nossos dados indicam que os vírus inativados por APH suscitam uma
proteção completa contra uma inoculação letal de vírus YF 17DD em
modelo murino. Nossos resultados discutem as possíveis implicações para
o desenvolvimento de uma vacina inativada por alta pressão contra o
Vírus da Febre Amarela.
143
Resultados – Parte II
Gaspar et al., 2008. Journal of Virological Methods 150, 57-62.
144
Resultados – Parte II
Gaspar et al., 2008. Journal of Virological Methods 150, 57-62.
145
Resultados – Parte II
Gaspar et al., 2008. Journal of Virological Methods 150, 57-62.
146
Resultados – Parte II
Gaspar et al., 2008. Journal of Virological Methods 150, 57-62.
147
Resultados – Parte II
Gaspar et al., 2008. Journal of Virological Methods 150, 57-62.
148
Resultados – Parte II
Gaspar et al., 2008. Journal of Virological Methods 150, 57-62.
149
Discussão – Parte I
5. Discussão
Parte I
Propriedades Biofísicas da Interação de Peptídeos de Fusão com
Membranas Biomiméticas
Apesar do relativo sucesso inicial no desenvolvimento de uma
vacina de vírus atenuado contra a Febre Amarela há mais de 50 anos, além
de amplos estudos epidemiológicos, os Flavivírus permaneceram até
muito recentemente entre os mais pobremente caracterizados dos vírus
de ARN que infectam humanos. Eles são os menores dos vírus
envelopados (40-60 nm), mas compreendem um dos maiores grupos
(cerca de 70 espécies), incluindo muitas espécies patogênicas para
humanos e animais domésticos e selvagens (Lindenbach & Rice, 2001).
Os peptídeos de fusão virais têm um papel chave no mecanismo de
glicoproteínas em mediar a fusão de membranas e proceder com o ciclo
de infecção viral. De acordo com o atual modelo de fusão viral, os
peptídeos de fusão sustentam uma capacidade intrínseca de romper a
arquitetura da bicamada lipídica alvo após sua inserção, e diretamente
mediar a fusão de membranas (White, 1990; Tamm & Han, 2000; Nieva & Agirre,
2003). Estes peptídeos se inserem nas bicamadas lipídicas de células alvo,
150
Discussão – Parte I
onde adotam uma determinada conformação distinta da conformação
nativa.
Os peptídeos de fusão de vírus são considerados a peça chave para
iniciar o processo de fusão de membranas permitindo, assim, que o vírus
continue seu ciclo infeccioso. Os Flavivírus possuem uma sequência
extremamente conservada, representada pelo peptídeo de fusão, que
apresenta majoritariamente uma variação na posição 104 de sua
sequência. Estudos de sequência de diversos Flavivírus indicam que esta
modificação está relacionada ao vetor transmissor de cada vírus, podendo
ser uma Gly nos vírus transmitidos por mosquito ou uma His nos vírus
transmitidos por carrapato (Seligman, 2008).
Os estudos apresentados aqui fornecem uma análise estrutural e
termodinâmica da ligação de dois peptídeos de fusão de Flavivírus a
diferentes modelos biomiméticos de membrana. Uma vez que os
Flavivírus infectam e se replicam muito eficientemente no fígado, onde a
membrana plasmática contém muitos lipídios carregados negativamente
(Jain, 1988), nós inicialmente empregamos como alvo micelas aniônicas e
utilizamos para comparação micelas neutras.
O Triptofano é um resíduo muito sensível às variações de polaridade
do meio em que se encontra. Ele é muito utilizado como uma sonda
151
Discussão – Parte I
intrínseca de proteínas, o que facilita investigar diversos processos de
desenovelamento protéico, interação proteína-proteína e proteína-ácido
nucléico. Quando excitado em solução, este resíduo emite luz em
comprimentos de onda de maiores. Entretanto, sua inserção em um meio
apolar desvia seu espectro de emissão para comprimentos de onda
menores e mais energéticos, podendo também haver um aumento em seu
rendimento quântico representado pelo aumento na intensidade de
fluorescência. De uma forma geral, a interação de peptídeos com
membranas e micelas, que reproduzem muito bem um ambiente
hidrofóbico, induz um aumento na intensidade de fluorescência do
peptídeo e um desvio para o azul do pico máximo de emissão.
A acessibilidade do Trp ao solvente também pode ser inferida
utilizando agentes supressores, como a acrilamida. Em solução, à medida
que a concentração do supressor aumenta, mais a fluorescência do Trp é
suprimida. Entretanto, se este resíduo está escondido do ambiente polar,
como é o caso de proteínas bem enoveladas, interação com outra
molécula ou inserção em membrana, a fluorescência do Trp é menos
suprimida. Esta supressão pode ser visualizada com a diminuição da
constante de Stern-Volmer (KSV), que reflete a acessibilidade do resíduo
152
Discussão – Parte I
ao solvente. A presença de um ambiente apolar refletido pelas micelas
promove uma diminuição da constante KSV.
Portanto, o aumento na intensidade de fluorescência e o desvio
para o azul do pico máximo de emissão, além da diminuição significativa
da constante KSV, indicam que os peptídeos FLAG e FLAH são capazes de
interagir com ambas as micelas de SDS e n-octil-β-D-glicopiranosídeo de
maneiras diferenciadas, onde o resíduo de Trp nem sempre parece estar
envolvido nesta interação. Além disso, nossos resultados indicam que os
peptídeos
têm
uma
preferência
por
membranas
carregadas
negativamente, e embora sejam capazes de interagir com bicamadas
neutras, esta interação poderia ocorrer sem que o processo de fusão de
membranas procedesse com sucesso.
Além disso, nossos dados sugerem que a interação ocorre de
maneira superficial à membrana. De fato, Modis et al. (2004) mostraram
que, no trímero, os três resíduos hidrofóbicos no loop de fusão – Trp101,
Leu107 e Phe108 – estão completamente expostos na superfície
molecular. Eles formam uma concavidade na ponta do trímero,
apresentando uma borda hidrofóbica formada por resíduos carregados.
Neste mesmo trabalho, foi proposto que os trímeros de E penetram cerca
de 6 Å dentro da camada de hidrocarboneto da membrana alvo, e que o
153
Discussão – Parte I
loop de fusão é mantido na interface da membrana principalmente por
uma âncora aromática formada pelos resíduos Trp101 e Phe108 (Modis et
al., 2004).
Nossos dados de simulação também nos permitem concluir que, até
28 ns de análise, os peptídeos permaneceram na interface da membrana,
uma vez que grande parte de suas ligações de H eram realizadas com a
água. Isto indica que um simples sistema hidrofóbico favorece a interação
dos peptídeos de fusão.
Esta interação mais superficial é extremamente interessante
quando comparado a outros peptídeos de fusão virais pertencentes à
classe I, como os peptídeos de fusão do SIV (Brasseur et al., 1990; Martin et al.,
1994), HIV-1 (Martin et al., 1996; Lins et al., 2001), Influenza (Luneberg et al., 1995;
Efremov et al., 1999) e Ebola (Lins et al., 2001), que assumem uma
conformação em hélice e apresentam uma inserção oblíqua à bicamada
lipídica. Isto também vai de encontro a estudos de simulação por
modelagem molecular que propõem que a fusogenicidade depende não
somente da inserção do peptídeo, mas também da capacidade destes
peptídeos desestabilizarem os dois folhetos da membrana (Lorin et al.,
2007).
154
Discussão – Parte I
A proposta é que para o processo de fusão acontecer, a inserção do
loop de fusão deve produzir uma distorção na bicamada lipídica, que é
favorecida por um cluster de loops formado pela trimerização de E. Assim,
as cadeias de ácidos graxos do folheto interno da membrana devem se
estender para fazer contato com a base da cavidade do loop de fusão, ou
as cadeias dos ácidos graxos do folheto externo devem se inclinar sobre
esta base (Modis et al., 2004).
De fato, os peptídeos de fusão interagem com modelos de
membrana lipídica artificiais de diferentes composições, onde sua
interação é capaz de perturbar a bicamada lipídica, diminuindo a
temperatura de transição de fases, tornando-a mais fluida. Para a
interação do peptídeo FLAH com vesículas contendo PG, uma diminuição
da variação de entalpia da transição é observada. Isto sugere que o
peptídeo é capaz de desestabilizar a bicamada lipídica, já que um menor
H indica um menor número de ligações que estabilizam a membrana. É
possível que estas perturbações ajudem a promover a distorção na
bicamada, importante para desencadear o processo de fusão entre
membranas.
Para melhor compreender como as membranas podem ser
convertidas a intermediários de alta energia durante a fusão, é
155
Discussão – Parte I
interessante conhecer como tanta energia, entalpia e entropia, é
fornecida pela inserção de peptídeos de fusão em bicamadas lipídicas (Li et
al., 2003). Os experimentos realizados na ausência de sal são sistemas
predominantemente exotérmicos, à exceção da temperatura de 37°C.
Entretanto, a força iônica é capaz de reverter a termodinâmica desta
interação, tornando a reação endotérmica e a interação entropicamente
dirigida.
Estes perfis entálpicos estão relacionados a três etapas principais
durante a interação peptídeo-micela: 1) interação dos peptídeos com as
micelas; 2) mudanças estruturais no peptídeo; e 3) alterações na dinâmica
de equilíbrio das micelas. Entretanto, o calor da interação é predominante
do processo de desestabilização das micelas promovido pela ligação dos
peptídeos, uma vez que estes perfis são muito similares ao calor de
desmicelização de ambas as micelas nas diferentes temperaturas
analisadas (dados não mostrados). A variação de entalpia associada à
dissociação das micelas de SDS também foi dependente da temperatura
analisada, a 37°C o processo foi endotérmico, enquanto que a baixas
temperaturas o processo foi exotérmico. Esta característica poderia
explicar os valores de variação de entalpia extremamente elevados e está
156
Discussão – Parte I
de acordo com alguns estudos de desmicelização já mostrados para outras
micelas (Beyer et al., 2006; Bordbar et al., 2008).
Em solução, ambos os peptídeos mostram uma estrutura
predominantemente randômica. Além disso, o pico positivo a 225 nm nos
espectros de CD sugere fortemente a formação de uma conformação
curvada, que é provavelmente devido à interação de dois aminoácidos
aromáticos presentes em sua sequência, o Trp e a Phe. Nossos dados de
CD utilizando alta temperatura confirmam a presença de interações nãocovalentes na estrutura do peptídeo, uma vez que a altas temperaturas o
pico positivo nesta região desaparece de forma reversível. Esta
aproximação entre os resíduos aromáticos também pode ser observada
em nossas simulações em água, onde o aumento da temperatura
promove o rompimento de interações, como as ligações de H,
distanciando os resíduos Trp e Phe, o que torna a estrutura com uma
conformação mais aberta e instável.
A presença de um ambiente apolar que favoreça a interação,
representado por micelas de SDS, leva à formação adicional de uma
estrutura β, onde os peptídeos assumiriam possivelmente uma
conformação de β-hairpin, o que oferece uma maior estabilidade ao
peptídeo quando ligado. Contudo, através de análises de CD, não foi
157
Discussão – Parte I
possível observar modificações na estrutura dos peptídeos na presença de
micelas neutras de n-octil-β-D-glicopiranosídeo. A presença de TFE não foi
capaz de induzir a formação de hélices como mostrado para muitos
peptídeos de fusão de vírus, como o HIV-1 e o vírus da Hepatite G (Gordon
et al., 2002; Mazzini et al., 2007). Isto confirma nossa idéia sobre o modo de
interação dos peptídeos, que pode ocorrer de maneira diferenciada
dependendo das propriedades físicas da membrana alvo.
Analisando os dados de dinâmica molecular dos peptídeos
simulados na presença de bicamada lipídica composta por POPE, não
podemos afirmar que exista uma conformação em β-hairpin, mas
podemos verificar que os peptídeos apresentam predominantemente uma
estrutura curvada bastante estável, com eventuais formações de voltas.
Além disso, podemos notar que os resíduos aromáticos estão
intimamente ligados à membrana. Entretanto foi possível observar que a
interação entre os resíduos Trp-Phe foi significativamente mais evidente
para o peptídeo FLAH. A influência da interação aromático-aromático
também foi estudada para o peptídeo de fusão do vírus Ebola, onde a
interação entre o anel aromático do Trp e a cadeia lateral da Phe parece
ser importante para a manutenção da estabilidade da estrutura
158
Discussão – Parte I
secundária do peptídeo sob interação com membranas miméticas (Freitas
et al., 2007).
A Glicina também é um importante resíduo presente em peptídeos
de fusão de muitos vírus envelopados, como os vírus Influenza, SIV e HIV-2
(Tamm et al., 2002), embora seu exato papel ainda não tenha sido
determinado. A alta porcentagem deste resíduo tem sido correlacionada
com a flexibilidade conformacional dos peptídeos de fusão, que é
necessária para a atividade de fusão (Wong, 2003). De fato, mutações nos
resíduos de Gly nas posições 104 e 106 do vírus da Encefalite de St. Louis
abolem o processo de fusão (Trainor et al., 2007). Nossos resultados indicam
que a Gly104 é capaz de se acomodar melhor sobre a cabeça polar da
bicamada lipídica, ao contrário da His104. Isto é consistente com sua
característica, já que os resíduos de Gly não particionam favoravelmente
dentro de uma membrana (White & Wimley, 1999).
Embora exista uma diferença na sequência de aminoácidos destes
peptídeos de fusão de Flavivírus, eles apresentam comportamentos
similares quando analisados pelos diferentes métodos aplicados neste
estudo,
mostrando
uma
preferência
por
grupos
carregados
negativamente, apesar de serem capazes de se ligar a alvos hidrofóbicos
neutros. É proposto que os resíduos de His atuem como um sensor de pH
159
Discussão – Parte I
na fusão de membranas para diversos vírus. Entretanto, a presença da
His104 no peptídeo FLAH parece representar pouca importância para a
interação, principalmente porque, na partícula madura, ambos os
peptídeos são capazes de prosseguir com o processo de fusão de seus
respectivos vírus. De fato, um recente estudo, utilizando análises
mutacionais em Histidinas conservadas da proteína E de Flavivírus,
destaca apenas a His323 e provavelmente a His146 por atuarem como um
sensor de pH na fusão de membrana de Flavivírus (Fritz et al., 2008).
Ao contrário, os resíduos de Arg e/ou Lys presentes em ambos os
peptídeos, poderiam apresentar mérito substancial para a interação. Os
resíduos Trp e Arg parecem apresentar papéis muito importantes na
atividade de diversos peptídeos antimicrobianos (Jing et al., 2003).
Peptídeos ricos em Arg, como a penetratina (Derossi et al., 1996), têm sido
interesse de diversos estudos pelas suas capacidades de penetrarem em
membranas celulares. A capacidade destes peptídeos de se translocarem
através de membranas parece ser o resultado do grupamento de
guanidina da cadeia lateral da Arg, que foi mostrada ser mais eficiente que
outros aminoácidos carregados positivamente (Mitchell et al., 2000). Esta
interpretação foi também sugerida para dois peptídeos antimicrobianos,
160
Discussão – Parte I
que podem se ligar e parcialmente penetrar na superfície de membranas
(Rezansoff et al., 2005).
Além disso, cadeias laterais aromáticas, particularmente o anel
indol do Trp, preferem fortemente particionar na região de interface de
membranas. Sendo assim, as propriedades de ancoramento na membrana
das cadeias laterais do Trp nestes peptídeos podem contribuir para suas
capacidades de ligar e desestabilizar membranas miméticas e adotar uma
estrutura bem definida (Rezansoff et al., 2005). De fato, já foi sugerido que o
Trp101 é importante para a capacidade infecciosa dos Flavivírus (Modis et
al., 2004).
Assim, enquanto a função do resíduo de Trp é promover a inserção
do peptídeo na interface da membrana, o resíduo básico de Arg poderia
estabilizar esta ligação, atuando como uma âncora hidrofílica para as
interações eletrostáticas. Desta forma, ambas as interações eletrostáticas
da Arg pelas micelas e a presença do anel indol do Trp na superfície da
membrana alvo devem governar o processo de associação peptídeomembrana.
161
Discussão – Parte II
Parte II
Febre Amarela: Implicações para o Desenvolvimento de uma
Vacina Inativada por Alta Pressão Hidrostástica
Embora vacinas humanas estejam disponíveis para as doenças Febre
Amarela, Encefalite Japonesa e Encefalite causada por Carrapato, por
exemplo, a incidência e a distribuição geográfica das doenças causadas
por Flavivírus têm aumentado nos últimos anos (Chang et al., 2004).
A Febre Amarela é uma doença infecciosa causada por um
flavivírus, que não tem tratamento específico e que apresenta
aproximadamente 20% de mortalidade (Vasconcelos, 2003). A doença está
re-emergindo devido à re-infestação do mosquito e à falta de cobertura
vacinal adequada (Gubler et al., 2004). Entre o fim de 2007 e início de 2008,
o Brasil passou por um abrupto aumento no número de mortes de
macacos em matas próximas de cidades, e por um aumento no registro da
contaminação por Febre Amarela silvestre de pessoas não vacinadas que
residem próximo a esses locais ou que adentraram áreas de mata
selvagem. A grande preocupação é com o possível aumento do vírus
circulante da doença nas florestas ou cerrado, havendo, então, a
necessidade de intensificação da vacinação das pessoas que irão entrar
em contato com áreas de matas, florestas ou cerrado nas áreas de risco,
162
Discussão – Parte II
uma vez que a vacinação ainda é o método mais eficaz para prevenir a
doença (Ministério da Saúde, 2008).
Hoje, a vacinação mundial é realizada com dois tipos diferentes de
vacinas existentes, 17D e 17DD, baseadas em vírus “vivo” atenuado e que
têm fornecido bastante eficácia. Apesar disso, a presença do vírus ainda
infeccioso na vacina representa um risco de reversão da doença,
principalmente para pessoas imuno-comprometidas. Por mais de 50 anos
a vacina atenuada contra a Febre Amarela era tida como segura e
eficiente, e as reações adversas leves ocorriam em apenas 2 a 5% das
pessoas vacinadas. Entretanto, a ocorrência de eventos adversos
associados aos vírus vacinais 17D e 17DD justifica o desenvolvimento de
uma vacina alternativa elaborada a partir de vírus inativados,
principalmente, para as pessoas imuno-comprometidas e turistas com
destino a áreas endêmicas.
Entretanto, ao contrário das vacinas inativadas, as vacinas feitas a
partir de vírus atenuados oferecem excelente proteção, uma vez que estes
vírus são capazes de se replicar dentro do organismo. Por este motivo,
uma possibilidade é o uso de uma vacina inativada como uma dose
primária de vacinação conjugada a uma segunda dose da vacina atenuada
comercial. Isto deve evitar riscos de eventos adversos causados pela
163
Discussão – Parte II
replicação do Vírus da Febre Amarela e, por outro lado, garante uma
proteção imunogênica mais eficaz e mais longa, característica mais difícil
de obter apenas com uma vacina inativada.
Os métodos mais comuns de inativação viral em células, meio de
cultura ou tampões específicos incluem o uso de β-propil-lactona,
etilenimina binária, formol, irradiação, iodino, ozônio, ultravioleta (UV) e
compostos fotoativos. Tentativas para desenvolver uma vacina inativada
contra YF são realizadas desde 1928, preparadas pelo tratamento de
fígado e/ou rim de macaco infectado com fenol ou formaldeído (Hindle,
1928). Em 1936, um estudo de vacina inativada contra YF usando
aquecimento ou UV foi realizado em macacos (Gordon & Hughes, 1936).
Entretanto, os problemas descritos para estas vacinas foram a presença de
infecciosidade residual sobre as preparações ou a ausência de proteção
imunogênica.
A alta pressão tem emergido como uma importante técnica para
tentar resolver vários problemas na Medicina e na Biotecnologia, e tem
revelado ser uma poderosa ferramenta para o estudo das interações
proteína-proteína e proteína-ácido nucléico (Da Poian et al., 1993; 1995; Silva
et al., 1996), estando voltada mais recentemente para o estudo de
estruturas virais, vias de montagem, estados intermediários do ciclo de
164
Discussão – Parte II
infecção e inativação de vírus envelopados e não envelopados (Da Poian et
al., 1995; Oliveira et al., 1999b; Gaspar et al., 2002; Silva et al., 2002; Schwarcz et al.,
2004; Ishimaru et al., 2004).
Trabalhos recentes vêm mostrando que a alta pressão, além de
levar à inativação, induz um estado intermediário de fusão de vírus
envelopados como Influenza, Sindbis e VSV. O que se propõe é que a
pressão
hidrostática
induz
uma
alteração
conformacional
nas
glicoproteínas destes vírus, a pH neutro, muito similar à alteração
alcançada pelo baixo pH, ou seja, o efeito da pressão pode mimetizar a
etapa que ocorre dentro do endossoma (Gaspar et al., 2002; Gomes et al.,
2003). Assim, o uso da pressão para atingir o estado ativo de fusão pode
ser utilizado no desenvolvimento de novas drogas e vacinas antivirais.
Uma vez que a pressão causa uma perturbação sutil quando
comparada a agentes desnaturantes químicos e alta temperatura (Silva &
Weber, 1993; Silva et al., 2001), geralmente ela não produz alterações tão
drásticas na estrutura da partícula viral. Ela apenas desvia o equilíbrio
entre as formas desnaturada e/ou dissociada e a forma nativa, na direção
daquela que ocupa o menor volume, ou seja, as formas dissociadas (Weber
& Drickamer, 1983; Silva & Weber, 1993; Mozhaev et al., 1996; Jonas & Jonas, 1994;
Silva et al., 2002).
165
Discussão – Parte II
Desta forma, em colaboração com os Drs. Marcos Freire e Luciane
Gaspar e o Laboratório de Tecnologia Virológica (LATEV) de Bio
Manguinhos, envolvido no desenvolvimento de vacinas, realizamos
estudos de imunogenicidade visando ao desenvolvimento de uma vacina
inativada contra o Vírus da Febre Amarela. Sendo assim, o principal
objetivo deste estudo foi avaliar a imunogenicidade do YFV 17DD
inativado por alta pressão, além de investigar a eficácia da proteção em
modelo murino.
Os resultados apresentados neste trabalho discutem o uso da APH,
um método relativamente novo para a inativação de vírus. A cinética do
YFV foi dependente do tempo e da pressão, similar a outros vírus animais
já estudados (Jurkiewicz et al., 1995; Tian et al., 2000; Ishimaru et al., 2004; Freitas
et al., 2006). Além disso, a inativação por APH foi rápida e irreversível
quando comparado a outros vírus envelopados previamente estudados
(Silva et al., 1992; Gaspar et al., 2002). Além disso, o processo produziu
preparações
satisfatórias,
como
mostradas
pelos
ensaios
de
infecciosidade, inoculação de amostras inativadas utilizando linhagens
celulares permissivas (ensaio cego), teste para avaliar infecciosidade viral
residual em camundongos, e ensaio de neutralização em células Vero.
166
Discussão – Parte II
De fato, após submeter o YFV 17DD às condições de inativação (310
MPa por 3 h a 4°C) não foi possível detectar nenhuma partícula infecciosa,
muito importante para confirmar a ausência de infecciosidade residual. A
maioria dos estudos anteriores não foram controlados desta maneira
(Hindle, 1928; Gordon & Hughes, 1936). Este controle é de extrema importância
porque garante a eliminação de eventos adversos severos causados pela
presença de vírus infecciosos na vacina atenuada contra YF comercial.
Modelos animais têm sido extensivamente utilizados em testes préclínicos de vacinas para obtenção do “proof of concept” (prova de
conceito). Nossos resultados mostram que os camundongos suíços
imunizados com três doses subcutaneamente com o vírus inativado por
pressão foram tão efetivos quanto o vírus vacinal atenuado em relação à
proteção contra uma dose letal do YFV. Porém, como a produção de
anticorpos neutralizantes foi baixa, possivelmente a imunização com o YF
17DD inativado não produz uma resposta humoral protetora. A duração
desta resposta do anticorpo está sendo examinada. Estudos de pressão
realizados para outros vírus já foram previamente demonstrados e
sustentam nossos dados (Silva et al., 1992; Jurkiewicz et al., 1995; Tian et al.,
1999; 2000; Gomes et al., 2003; Freire et al., 2005, Grove et al., 2006).
167
Discussão – Parte II
Juntos, nossos resultados mostram que APH é capaz de inativar as
partículas virais de YF, além de produzir partículas imunogênicas. O
tratamento por pressão parece preservar importantes epítopos sobre a
superfície do vírus, permitindo às partículas inativadas estimularem uma
produção de anticorpos neutralizantes protetores contra a YF em
camundongos. Nossa proposta para a perda da infecciosidade destas
partículas é que a estrutura viral é preservada, entretanto a pressão deve
afetar o rearranjo dimérico da proteína E, como previamente
demonstrado para outros vírus que induzem o estado ativo de fusão
(Gaspar et al., 2002; Gomes et al., 2003; Freitas et al., 2006; Grove et al., 2006).
De fato, nossos resultados de caracterização estrutural das
partículas inativadas por APH, que foram previamente apresentados em
minha dissertação de mestrado (Mendes, 2005), indicam que a estrutura
parece ser pouco afetada, característica muito importante para a
manutenção do interesse em desenvolver a vacina. Não há dúvidas de que
as partículas são inativadas pela alta pressão nas condições estudadas, e a
manutenção de sua integridade pode ajudar a favorecer uma resposta
imune eficaz quando um indivíduo for infectado pela forma virulenta.
Além disso, já que a pressão pode ser capaz de mimetizar alguma etapa do
ciclo de infecção natural do vírus, ela pode “congelar” o vírus numa
168
Discussão – Parte II
conformação, sutilmente diferente da nativa, que expõe mais resíduos
hidrofóbicos, o que torna estas partículas mais imunogênicas. Essa
hipótese é corroborada pelos ensaios que realizamos utilizando bis-ANS,
uma sonda capaz de se ligar a segmentos hidrofóbicos estruturados
próximos a cargas positivas, e que se encontra mais ligado à partícula
pressurizada (Mendes, 2005).
Problemas metodológicos durante o desenvolvimento de vacinas
inativadas são principalmente relacionados à produção de antígenos, à
inativação viral e à falta de potência antigênica. Devido à dificuldade em
obter altos títulos virais em uma linhagem celular apropriada, as vacinas
inativadas não são valorizadas (Putnak et al., 2005). Contudo, esta concepção
pode ser mudada pelas novas ferramentas para cultivar células em meio
livre de soro em micro-transportadores, como mostrado para as vacinas
contra os vírus da Raiva, da Encefalite Japonesa, Enterovírus tipo 71 e
Influenza (Merten et al., 1999; Frazatti-Gallina et al., 2004; Wu et al., 2004; Mohler et
al., 2005; Trabelsi et al., 2006; Liu et al., 2007).
Neste estudo existem dois problemas que necessitam de mais
tentativas: a produção de antígeno (devido à quantidade limitada de vírus
propagado) e a necessidade para múltiplas doses de quantidades maiores
de vírus inativado para produzir uma resposta imune mais eficaz. Grandes
169
Discussão – Parte II
esforços para a produção de vacinas inativadas são certamente
necessários. Nas próximas etapas serão utilizados adjuvantes para
fornecer uma resposta imune mais eficaz, avaliadas as respostas de
anticorpos neutralizantes por estudos de dose-resposta em camundongos
e utilizados micro-transportadores para melhorar a produção de vírus.
Como estas doenças constituem uma séria questão de saúde
pública e vêm causando um impacto na economia mundial, grandes
investimentos estão voltados para o desenvolvimento de uma vacina que
extermine com as epidemias de Flavivírus, que atualmente estão
disseminadas em várias partes do mundo, seja através da tecnologia da
engenharia genética, seja pelo método convencional (atenuada ou
inativada).
A vantagem da ferramenta de alta pressão hidrostática está
justamente em seu custo reduzido, inclusive para processamento de
grandes volumes, além de ser um processo limpo por não fazer uso de
agentes químicos, como o formol. Além disso, o aparato de pressão em
larga escala já está sendo amplamente utilizado em indústrias alimentícias
como forma de inativação de enzimas. Assim, este trabalho pode abrir
portas para a inativação de diversos vírus com o objetivo de desenvolver
vacinas que ainda não existem, mas que estão sendo amplamente
170
Discussão – Parte II
pesquisadas, como é o caso do Vírus da Dengue, que já vem sendo um dos
focos de nossos estudos.
171
Conclusões Gerais
7. Conclusões Gerais
A infecção por Flavivírus resulta em manifestações clínicas que vão
desde febre moderada até encefalite e febre hemorrágica, apresentando
um impacto global sobre a saúde pública como um resultado de sua ampla
distribuição e sua capacidade de causar significante morbidade e
mortalidade em humanos (Mackenzie et al., 2004). Por esta razão, estudos
voltados para o desenvolvimento de vacinas e tratamentos antivirais
eficazes se tornam necessários.
Devido à ocorrência de alguns casos de reversão da doença após a
vacinação contra a Febre Amarela, grandes investimentos estão sendo
tomados no sentido de desenvolver uma vacina alternativa que não
ofereça risco à saúde. Para isto, a imunogenicidade do YFV inativado por
alta pressão hidrostática foi investigada através de estudos in vivo. Nossos
dados mostram que a inoculação destas partículas oferece uma proteção
completa em modelo murino.
Portanto, nossos resultados indicam fortemente uma metodologia
de sucesso para o desenvolvimento de uma vacina promissora contra o
Vírus da Febre Amarela e, possivelmente, contra outros Flavivírus de
importância médica.
172
Conclusões Gerais
Além disso, neste estudo, a interação de dois peptídeos de fusão
diferentes de Flavivírus com membranas miméticas foi investigada. Este
segmento interage com a membrana da célula hospedeira, levando à
desestabilização da membrana e, consequentemente, ao processo de
fusão (Seligman, 2008). Através de análises biofísicas, foi possível
caracterizar a interação destes peptídeos com micelas e bicamadas
lipídicas aniônicas e neutras.
Como conclusão, a conformação destes peptídeos ligados a
membranas
eletrostáticas
miméticas
e
suporta
hidrofóbicas
a
com
contribuição
a
cabeça
das
interações
lipídica
carregada
negativamente e com a cauda de ácidos graxos das membranas,
respectivamente.
Assim,
a
alta
hidrofobicidade
dos
peptídeos
provavelmente favorece sua partição sobre a bicamada lipídica.
Entretanto, a localização exata dos peptídeos sobre a bicamada pode
variar com a carga e a estrutura dos grupamentos polares lipídicos.
Neste sentido, nossos resultados sugerem que a fusão dos Flavivírus
é promovida por uma inserção superficial dos peptídeos de fusão dentro
das bicamadas lipídicas, com seu concomitante enovelamento em uma
estrutura na forma de grampo (β-hairpin).
173
Conclusões Gerais
Um grande exemplo de sucesso de estudos estruturais básicos está
na tentativa de desenvolver novos inibidores de entrada mais eficazes
contra o HIV, por exemplo. Até então, a principal estratégia para combater
a AIDS se baseava em terapias químicas para inibir a transcriptase reversa
ou protease do HIV. Todavia, um peptídeo sintético de 36 aminoácidos, o
Enfuvirtide, que bloqueia a entrada do vírus em células-alvo, foi o primeiro
inibidor de entrada do HIV aprovado para uso em pacientes (Fletcher, 2003;
Mattews et al., 2004). Enfuvirtide mimetiza uma determinada sequência de
aminoácidos da proteína gp41, que é um domínio importante para a fusão
de membranas (Esté & Telenti, 2007), e inibe a mudança conformacional da
glicoproteína, evitando, assim, a fusão entre o envelope do HIV e a
membrana da célula CD4 e, consequentemente, sua entrada na célula
hospedeira (Raffi, 2004).
Dessa forma, para se identificar pequenas moléculas que
especificamente inibam etapas críticas no ciclo de infecção dos vírus como
esta, é necessário conhecer detalhes bioquímicos e caracterizar
estruturalmente as proteínas virais essenciais neste processo, neste caso,
a glicoproteína E, mais precisamente o seu peptídeo de fusão.
174
Referências Bibliográficas
8. Referências Bibliográficas
Alder, B. J. & Wainwright, T. E. Phase transition for a hard sphere system.
J. Chem. Phys. 27, 1208-1209 (1957).
Allison, S. L., Schalich, J., Stiasny, K., Mandl, C. W. & Heinz, F. X.
Mutational evidence for an internal fusion peptide in flavivirus envelope
protein E. J. Virol. 75, 4268–4275 (2001).
Allison, S. L., Schalich, J., Stiasny, K., Mandl, C. W., Kunz, C. & Heinz, F. X.
Oligomeric rearrangement of tick-borne encephalitis virus envelope
proteins induced by an acidic pH. J. Virol. 69, 695–700 (1995).
Arias, C. F., Preugschat, F. & Strauss, J. H. Dengue-2 virus NS2b and NS3
form a stable complex that can cleave NS3 within the helicase domain.
Virology 193, 888–899 (1993).
Babiuk, L. A., Babiuk, S. L. & Baca-Estrada, M. E. Novel vaccine strategies.
Advances in Virus Research 58: 29-80 (2002).
Barba-Spaeth, G., Longman, R. S., Albert, M. L. & Rice, C. M. Live
attenuated yellow fever 17D infects human DCs and allows for
presentation of endogenous and recombinant T-cell epitopes. J. Exp. Med.
202, 1179-1184 (2005).
Benarroch, D., Selisko, B., Locatelli, G. A., Maga, G., Romette, J. L. &
Canard, B. The RNA helicase, nucleotide 5’-triphosphatase, and RNA 5’triphosphatase activities of dengue virus protein NS3 are Mg2+-dependent
and require a functional Walker B motif in the helicase catalytic core.
Virology 328, 208–218 (2004).
Besaratinia, A. & Pfeifer, G. P. DNA adduction and mutagenic properties
of acrylamide. Mutation Research 580, 31–40 (2005).
Beyer, K., Leine, D., Blume, A. The demicellization of
alkyltrimethylammonium bromides in 0.1M sodium chloride solution
studied by isothermal titration calorimetry. Colloids and Surfaces B:
Biointerfaces 49, 31–39 (2006).
175
Referências Bibliográficas
Bjelić, S & Jelesarov, I. A survey of the year 2007 literature on applications
of isothermal titration calorimetry. J. Mol. Recognit. 21, 289-312 (2008).
Blanco, F. J., Jiménez, M. A., Herranz, J., Rico, M., Santoro, J. & Nieto, J. L.
NMR evidence of a short linear peptide that folds into a b-hairpin in
aqueous solution. J. Am. Chem. Soc. 115, 5887–5888 (1993).
Bordbar, A-K., Taheri-Kafrani, A., Mousavi, S. H-A. & Haertlé, T.
Energetics of the interactions of human serum albumin with cationic
surfactant. Archives Biochem. Biophys. 470, 103–110 (2008).
Bosch, M. L., Earl, P. L., Fargnoli, K., Picciafuoco, S., Giombini, F., WongStaal, F. & Franchini, G. Identification of the fusion peptide of primate
immunodeficiency viruses. Science 244, 694-697 (1989).
Brasseur, R., Vanderbranden, M., Cornet, B., Burny, J. M. & Ruysschaert,
J. M. Orientation into the lipid bilayer of an asymmetric amphipathic
helical peptide located at the N-terminus of viral fusion proteins. Biochim.
Biophys. Acta 1029, 267-273 (1990).
Bray, M. Highly pathogenic RNA viral infections: challenges for antiviral
research. Antiviral Res. 78, 1–8 (2008).
Bressanelli, S. K., Staisny, K., Allison, S. L., Stura, E. A., Duquerroy, S.,
Lescar, J., Heinz, F. X. & Rey, F. A. Structure of a flavivirus envelope
glycoprotein in its low-pH-induced membrane fusion conformation. EMBO
J. 23, 728-738 (2004).
Brinton, M. A. The molecular biology of West Nile virus: a new invader of
the western hemisphere. Annu. Rev. Microbiol. 56, 371–402 (2002).
Burke, D. S. & Monath, T. P. em Fields Virology (eds Knipe, D. M. &
Howley, P. M.) 1043–1125 (Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia,
2001).
Carneiro, F. A., Stauffer, F., Lima, C. S. Juliano, M. A., Juliano, L. & Da
Poian A. T. Membrane fusion induced by vesicular stomatitis virus
depends on histidine protonation. J. Biol. Chem. 278, 13789-13794 (2003).
176
Referências Bibliográficas
Caufour, P. S., Motta, M. C., Yamamura, A. M., Vasquez, S., Ferreira, I. I.,
Jabour, A. V., Bonaldo, M. C., Freire, M. S. & Galler, R. Construction,
characterization and immunogenicity of recombinant yellow fever 17 Ddengue type 2 viruses. Virus Res. 79, 114 (2001).
Chan, R. C., Penney, D. J., Little, D., Carter, I. W., Roberts, J. A. &
Rawlinson, W. D. Hepatitis and death following vaccination with 17D-204
yellow fever vaccine. Lancet 358, 121-122 (2001).
Chang, G. J., Kuno, G., Purdy, D. E. & Davis, B. S. Recent advancement in
flavivirus vaccine development. Expert. Rev. Vaccines 3, 199220 (2004).
Chapman, D. Em: M. Shinitzky (Ed.), Biomembranes: Physical Aspects,
Balaban Publishers, Weinheim, Germany, pp. 29-62 (1993).
Chen, Y., Maguire, T., Hileman, R. E., Fromm, J. R., Esko, J. D., Linhardt, R.
J. & Marks, R. M. Dengue virus infectivity depends on envelope protein
binding to target cell heparin sulfate. Nat Med. 3, 866-871 (1997).
Cheng, R. P., Gellman, S. H. & DeGrado, W. F. β-Peptides: From structure
to function. Chem. Rev. 101, 3219– 3232 (2001).
Chernomordik, L. V. & Kozlov, M. M. Protein-lipid interplay in fusion and
fission of biological membranes. Annu. Rev. Biochem. 72, 175–207 (2003).
Chernomordik, L. V., Zimmerberg, J. & Kozlov, M. M. Membranes of the
world unite! J. Cell Biol. 175, 201–207 (2006).
Choi, H. K., Lee, S., Zhang, Y. P., McKinney, B. R., Wengler, G., Rossmann,
M. G. & Kuhn, R. J. Structural analysis of Sindbis virus capsid mutants
involving assembly and catalysis. J. Mol. Biol. 262, 151–167 (1996).
Chu, J. J. & Ng, M. L. Infectious entry of West Nile virus occurs through a
clathrin-mediated endocytic pathway. J. Virol. 78 (19), 10543-10555
(2004).
Cochran, A. G., Skelton, N. J. & Starovasnik, M. A. correction: Tryptophan
zippers: Stable, monomeric β-hairpins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99,
9081–9082 (2002).
177
Referências Bibliográficas
Cochran, A. G., Skelton, N. J. & Starovasnik, M. A. Tryptophan zippers:
Stable, monomeric β-hairpins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5578–5583
(2001).
Cooper, A. Heat capacity of hydrogen-bonded networks: an alternative
view of protein folding thermodynamics. Biophys. Chem. 85, 25-39 (2000).
Da Poian, A. T., Carneiro, F. A. & Stauffer, F. Viral membrane fusion: is
glycoprotein G of rhabdoviruses a representative of a new class of viral
fusion proteins? Braz. J. Med. Biol. Res. 38, 813-23 (2005).
Da Poian, A. T., Oliveira, A. C. & Silva, J. L. Cold desnaturation of an
icosahedral virus. the role of entropy in virus assemble. Biochemistry 34,
2672-2677 (1995).
Da Poian, A. T., Oliveira, A. C., Gaspar, L. P., SIilva, J. L. & Weber, G.
Reversible pressure dissociation of R17 bacteriophage: the physical
individuality of virus particles. J. Mol. Biol. 231, 999-1008 (1993).
Davis, C. W., Nguyen, H. Y., Hanna, S. L., Sánchez, M. D., Doms, R. W. &
Pierson, T. C. West Nile virus discriminates between DC-SIGN and DCSIGNR for cellular attachment and infection. J. Virol. 80, 1290-1301 (2006).
de Alba, E., Jiménez, M. A. & Rico, M. Turn residue sequence determines
β-hairpin conformation in designed peptides. J. Am. Chem. Soc. 119, 175–
183 (1997a).
de Alba, E., Rico, M. & Jiménez, M. A. Cross-strand side-chain interactions
versus turn conformation in β-hairpins. Protein Sci. 6, 2548–2560 (1997b).
Decker, R. V. & Foster, J. F. The interaction of bovine plasma albumin with
detergent anions. Stoichiometry and mechanism of binding of
alkylbenzenesulfonates. Biochemistry 5, 1242-1249 (1966).
Demetzos, C. Differential Scanning Calorimetry (DSC): a tool to study the
thermal behavior of lipid bilayers and liposomal stability. J. Liposome Res.
18, 159-173 (2008).
178
Referências Bibliográficas
Derossi, D., Calvet, S., Trembleau, A., Brunissen, A., Chassaing, G. &
Prochiantz, A. Cell internalization of the third helix of the Antennapedia
homeodomain is receptor-independent. J. Biol. Chem. 271, 18188-18193
(1996).
Desai, G., Panick, G., Zein, M., Winter, R. & Royer, C. A. pressure-jump
studies of the folding/unfolding of trp repressor. J. Mol. Biol. 288, 461-475
(1999).
Dokland, T., Walsh, M., Mackenzie, J. M., Khromykh, A. A., Ee, K. H. &
Wang, S. West Nile virus core protein; tetramer structure and ribbon
formation. Structure 12, 1157-1163 (2004).
Duarte dos Santos, C., Post, P. R., Carvalho, R., Ferreira, I. I., Rice, C. M. &
Galler, R. Complete nucleotide sequence of yellow fever virus vaccine
strains 17DD and 17D-213. Virus Research 35, 35-41 (1995).
Earp, L. J., Delos, S. E., Park, H. E. & White, J. M. The many mechanisms of
viral membrane fusion proteins. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 285, 25–66
(2005).
Eckert, D. M. & Kim, P. S. Mechanisms of viral membrane fusion and its
inhibition. Annu. Rev. Biochem. 70, 777-810 (2001).
Efremov, R. G., Nolde, D. E., Volynsky, P. E., Chernyavsky, A. A.,
Dubovskii, P. V. & Arseniev, A. S. Factors important for fusogenic activity
of peptides: molecular modeling study of analogs of fusion peptide of
influenza virus hemagglutinin. FEBS Lett. 462, 205-210 (1999).
Eftink, M. R. & Ghiron, C. A. Fluorescence quenching of indole and model
micelle systems. J. Phys. Chem. 80, 486-493 (1976).
Egloff, M. P., Benarroch, D., Selisko, B., Romette, J. L. & Canard, B. An
RNA cap (nucleoside-2’-O-)-methyltransferase in the flavivirus RNA
polymerase NS5: crystal structure and functional characterization. EMBO
J. 21, 2757–2768 (2002).
Elshuber, S., Allison, S. L., Heinz, F. X. & Mandl, C. W. Cleavage of protein
prM is necessary for infection of BHK-21 cells by tick-borne encephalitis
virus. J. Gen. Virol. 84, 183–191 (2003).
179
Referências Bibliográficas
Esté, J. A. & Telenti, A. HIV entry inhibitors. Lancet 370, 81-88 (2007).
Falgout, B., Pethel, M., Zhang, Y. M. & Lai, C. J. Both nonstructural
proteins NS2b and NS3 are required for the proteolytic processing of
dengue virus nonstructural proteins. J. Virol. 65, 2467–2475 (1991).
Fletcher, C. V. Enfuvirtide, a new drug for HIV infection. Lancet 361, 1577–
1578 (2003).
Foguel, D., Teschke, C. M., Prevelige, P. E. & Silva, J. L. Role of entropic
interactions in viral capsids single amino acid substitutions in P22
bacteriophage coat protein resulting in loss of capsid stability.
Biochemistry 34, 1120-1126 (1995).
Frazatti-Gallina, N. M., Mourão-Fuches, R. M., Paoli, R. L., Silva, M. L.,
Miyaki, C., Valentini, E. J., Raw, I. & Higashi, H. G. Vero-cell rabies vaccine
produced using serum-free medium. Vaccine 23, 51117 (2004).
Freire, M. S., Mann, G. F., Marchevsky, R. S., Yamamura, A. M., Almeida,
L. F., Jabor, A. V., Malachias, J. M., Coutinho, E. S. & Galler, R. Production
of yellow fever 17DD vaccine virus in primary culture of chicken embryo
fibroblast: yields, thermo and genetic stability, attenuation and
immunogenicity. Vaccine 23, 250112 (2005).
Freitas, M. S., Da Poian, A. T., Barth, M. O., Rebello, M. A., Silva, J. L. &
Gaspar, L. P. The fusogenic state of Mayaro virus induced by low pH and
by hydrostatic pressure. Cell Biochem. and Biophys. 44, 20511 (2006).
Freitas, M. S., Gaspar, L. P., Lorenzoni, M., Almeida, F. C. L., Tinoco, L. W.,
Almeida, M. S., Maia, L. F., Degrève, L., Valente, A. P. & Silva, J. L.
Structure of the ebola fusion peptide in a membrane-mimetic
environment and the interaction with lipid rafts. J. Mol. Biol. 282, 2730627314 (2007).
Fritz, R., Stiasny, K. & Heinz, F. X. Identification of specific histidines as pH
sensors in flavivirus membrane fusion. J. Cell Biol. 183, 353-361 (2008).
Frye, K. J. & Royer, C. A. Probing the contribution of internal cavities to
the volume change of protein unfolding under pressure. Protein Science 7,
2217-2222 (1998).
180
Referências Bibliográficas
Galler, R., Pugachev, K. V., Santos, C. L. S., Ochran, S. W., Jabor, A. V.,
Rodrigues, S. G., Marchevsky, R. S., Freire, M. S., Almeida, L. F. C., Cruz,
A. C. R., Yamamura, A. M. Y., Rocco, I. M., Rosa, E. S. T., Souza, L. T. M.,
Vasconcelos, P. F. C., Guirakhoo, F. & Monath, T. P. Phenotypic and
molecular analyses of yellow fever virus 17DD vaccine viruses associated
with serious adverse events in Brazil. Virology 290, 309-319 (2001).
Gallo, S. A., Finnegan, C. M., Viard, M., Raviv, Y., Dimitrov, A., Rawat, S.
S., Puri, A., Durell, S. & Blumenthal, R. The HIV env-mediated fusion
reaction. Biochim. Biophys. Acta 1614, 36–50 (2003).
Gaspar, L. P., Johnson, J. E., Silva, J. L. & Da Poian, A. T. Different partially
folded states of the capsid protein of Cowpea Severe Mosaic Virus in the
disassembly pathway. J. Mol. Biol. 273, 456-466 (1997).
Gaspar, L. P., Silva, A. C. B., Gomes, A. M. O., Freitas, M. S., Ano Bom, A.
P. D., Schwarcz, W. D., Mestecky, J., Novak, M. J., Foguel, D. & Silva, J. L.
Hydrostatic pressure induces the fusion-active state of enveloped viruses.
J. Biol. Chem. 277, 8433-8439 (2002).
Gazit, E. A possible role for PI-stacking in the self-assembly of amyloid
fibrils. FASEB J. 16, 77 –83 (2002).
Gellman, S. H. Minimal model systems for β-sheet secondary structure in
proteins. Curr. Opin. Chem. Biol. 2, 717– 725 (1998).
Ghosh, D & Basu, A. Present perspectives on flaviviral chemotherapy.
Drug Discov. Today 13, 619-624 (2008).
Gollins, S. W. & Porterfield, J. S. The uncoating and infectivity of the
flavivirus West Nile on interaction with cells: effects of pH and ammonium
chloride. J. Gen. Virol. 67, 1941-1950 (1986).
Gomes, A. M. O., Pinheiro, A. S., Bonafe, C. F. S. & Silva, J. L. Pressureinduced fusogenic conformational of vesicular stomatitis virus
glycoprotein. Biochemistry 42, 5540-5546 (2003).
Gordon, J. E. & Hughes, T. P. A study of inactivated yellow fever virus as
an immunizing agent. J. Immun. 30, 221 (1936).
181
Referências Bibliográficas
Gordon, L. M., Mobley, P. W., Pilpa, R., Sherman, M. A. & Waring, A. J.
Conformational mapping of the N-terminal peptide of HIV-1 gp41 in
membrane environments using (13)C-enhanced Fourier transform infrared
spectroscopy. Biochim Biophys Acta. 1559, 96-120 (2002).
Griffiths-Jones, S. R., Maynard, A. J. & Searle, M. S. Dissecting the
stability of a β-hairpin peptide that folds in water: NMR and molecular
dynamics analysis of the β-turn and β-strand contributions to folding. J.
Mol. Biol. 292, 1051-1069 (1999).
Grove, S. F., Lee, A., Lewis, T., Stewart, C. M., Chen, H. & Hoover, D. G.
Inactivation of foodborne viruses of significance by high pressure and
other processes. J. Food Prot. 69, 95768 (2006).
Grun, J.B. & Brinton, M. A. Characterization of West Nile virus RNAdependent RNA polymerase and cellular terminal adenylyl and uridylyl
transferases in cell-free extracts. J. Virol. 60, 1113–1124 (1986).
Gubler, D. J. Epidemic dengue/dengue hemorrhagic fever as a public
health, social and economic problem in the 21st century. Trends Microbiol.
10, 100–103 (2002).
Gubler, D. J. The changing epidemiology of yellow fever and dengue, 1900
to 2003: full circle? Comp. Immunol.Microbiol. Infect. Dis. 27, 319-30
(2004).
Gubler, D. J., Kuno, G. & Markoff, L. em Fields Virology (eds Knipe, D. M.
& Howley, P. M.) 1153–1252 (Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia,
2007).
Guirakhoo, F., Bolin, R. A. & Roehrig, J. T. The Murray Valley encephalitis
virus prM protein confers acid resistance to virus particles and alters the
expression of epitopes within the R2 domain of E glycoprotein. Virology
191 (2), 921–931 (1992).
Guirakhoo, F., Heinz, F. X., Mandl, C. W., Holzmann, H. & Kunz, C. Fusion
activity of flaviviruses: comparison of mature and immature (prMcontaining) tick-borne encephalitis virions. J. Gen. Virol. 72, 1323–1329
(1991).
182
Referências Bibliográficas
Haque, T. S. & Gellman, S. H. Insights on b-hairpin stability in aqueous
solution from peptides with enforced type I9 and type II9 β-turns. J. Am.
Chem. Soc. 119, 3301–3302 (1997).
Harrison, S. C. Mechanism of membrane fusion by viral envelope proteins.
Adv. Virus Res. 64, 231–261 (2005).
Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 690-698
(2008).
Heinz, F. X., Stiasny, K., Püschner-Auer, G., Holzmann, H., Allison, S. L.,
Mandl, C. W. & Kunz, C. Structural changes and functional control of the
tick-borne encephalitis virus glycoprotein E by the heterodimeric
association with protein prM. Virology 198, 109-117 (1994).
Heremans, K. & Smeller, L. Protein structure and dynamics at high
pressure. Biochim. et Biophys. Acta 1386: 353-370 (1998).
Hindle, E. A yellow fever vaccine. Brit. Med. J. 1, 976 (1928).
Huang, C-H. & Li, S. Calorimetric and molecular mechanics studies of the
thermotropic phase behavior of membrane phospholipids. Biochim.
Biophys. Acta 1422, 273-307 (1999).
Hughes, R. M. & Waters, M. L. Model systems for β-hairpins and β-sheets.
Curr. Opin. Struct. Biol. 16, 514–524 (2006).
Hummer, G., Garde, S., García, A. E., Paulaitis, M. E. & Pratt, L. R. The
Pressure dependence of hydrophobic interactions is consistent with the
observed pressure denaturation of proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,
1552-1555 (1998).
Ishimaru, D., Sa-Carvalho, D. & Silva, J. L. Pressure-inactivated FMDV: a
potencial vaccine. Vaccine 22, 2334-2339 (2004).
Jain, M. K. Introduction to biological membranes (2nd ed. John Wiley &
Sons, New York, 1988).
Jain, M. K. Introduction to Biological Membranes. Ed. John Wiley & Sons,
New York, NY. (1988).
183
Referências Bibliográficas
Jennings, A. D., Gibson, C. A., Miller, B. R., Mathews, J. H., Mitchell, C. J.,
Roehrig, J. T., Wood, D. J., Taffs, F., Sil, B. K., Whitby, S. N., Minor, P. D.,
Monath, T. P. & Barrett, A. D. T. Analysis of a yellow fever virus isolated
from a fatal case of vaccine-associated human encephalitis. Journal of
Infection Disease 169, 512-518 (1994).
Jing, W., Hunter, H. N., Hagel, J. & Vogel H. J. The structure of the
antimicrobial peptide Ac-RRWWRF-NH2 bound to micelles and its
interactions with phospholipid bilayer. J. Peptide Res. 61, 219-229 (2003).
Jonas, J. & Jonas, A. High-pressure NMR spectroscopy of proteins and
membrane. Annual Review Biophys. Biomol. Struct. 23, 287-318 (1994).
Jones, C. T., Ma, L., Burgner, J. W., Groesch, T. D., Post, C. B. & Kuhn, R. J.
Flavivirus capsid is a dimeric alpha-helical protein. J. Virol. 77, 7143-7149
(2003).
Jurkiewicz, E., Villas-Boas, M., Silva, J. L., Weber, G., Hunsmann, G. &
Clegg, R. M. Inactivation of simian immunodeficiency virus by hydrostatic
pressure. Proc. Natl.. Acad. Sci. USA 92, 693537 (1995).
Kampmann, T., Mueller, D. S., Mark, A. E., Young, P. R. & Kobe, B. The
role of histidine residues in low-pH-mediated viral membrane fusion.
Structure 14, 1481-1487 (2006).
Kandt, C., Ash, W. L. & Tieleman, D. P. Setting up and running molecular
dynamics simulations of membrane proteins, Methods 41, 475-488 (2007).
Kielian, M. Class II virus membrane fusion proteins. Virology 344, 38-47
(2006).
Kiermayr, S., Kofler, R. M., Mandl, C. W., Messner, P. & Heinz, F. X.
Isolation of capsid protein dimers from the tick-borne encephalitis
flavivirus and in vitro assembly of capsid-like particles. J. Virol. 78, 80788084 (2004).
Kroschewski, H., Allison, S. L., Heinz, F. X. & Mandl, C. W. Role of heparin
sulfate for attachment and entry of tick-borne encephalitis virus. Virology
308, 92-100 (2003).
184
Referências Bibliográficas
Kuhn, R. J., Zhang, W., Rossmann, M. G., Pletnev, S. V., Corver, J.,
Lenches, E., Jones, C. T., Mukhopadhyay, S., Chipman, P. R., Strauss, E.
G., Baker, T. S. & Strauss, J. H. Structure of dengue virus: implications for
flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell 108, 717-725 (2002).
Lakey, J. H., Parker, M. W., González-Mañas, J. M., Duché, D., Vriend, G.,
Baty, D. & Pattus, F. The role of electrostatic charge in the membrane
insertion of colicin A. Calculation and mutation. Eur. J. Biochem. 220, 155163 (1994).
Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Plenum Press,
New York, NY (1999).
Langham, A., Waring, A. J. & Kazneiss, Y. N. Comparison of interactions
between beta-hairpin decapeptides and SDS/DPC micelles from
experimental and simulation data. BMC Biochemistry 8, 11 (2007).
Leach, A. R. Molecular modeling principles and applications, Addison
Wesley Longman, Essex, England, 1996.
Ledizet, M., Kar, K., Foellmer, H. G., Bonafé, N., Anthony, K. G., Gould, L.
H., Bushmich, S. L., Fikrig, E. & Koski, R. A. Antibodies Targeting Linear
Determinants of the Envelope Protein Protect Mice against West Nile
Virus. The Journal of Infectious Diseases 196, 1741-1748 (2007).
Lescar, J., Roussel, A., Wien, M. W., Navaza, J., Fuller, S. D., Wengler, G,
Wengler, G. & Rey, F. A. The fusion glycoprotein shell of Semliki Forest
virus: an icosahedral assembly primed for fusogenic activation at
endosomal pH. Cell 105, 137–148 (2001).
Leung, J. Y., Pijlman, G. P., Kondratieva, N., Hyde, J., Mackenzie, J. M. &
Khromykh, A. A. Role of nonstructural protein NS2A in flavivirus assembly.
J. Virol. 82, 4731–4741 (2008).
Levine, A. J. & Enquist, L. W. em Fields Virology (eds Knipe, D. M. &
Howley, P. M.) 3–23 (Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2007).
Levine, I. N. Quantum Chemistry. Pearson Education, New York, 2003.
185
Referências Bibliográficas
Leyssen, P., De Clercq, E. & Neyts, J. Molecular strategies to inhibit the
replication of RNA viruses. Antiviral Res. 78, 9–25 (2008).
Li, H., Clum, S. R., You, S., Ebner, K. E. & Padmanabhan, R. The serine
protease and RNA-stimulated nucleoside triphosphatase and RNA helicase
functional domains of dengue virus type 2 NS3 converge within a region of
20 amino acids. J. Virol. 73, 3108–3116 (1999).
Li, Y., Han, X. & Tamm, L. K. Thermodynamics of fusion peptidemembrane interactions. Biochemistry 42, 7245-7251 (2003).
Liang, Y. Appications of isothermal titration calorimetry in protein scince.
Acta Biochim. Biophys. Sin. 40, 565-576 (2008).
Lindenbach, B. D. & Rice, C. M. em Fields Virology (eds Knipe, D. M. &
Howley, P. M.) 991–1041 (Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia,
2001).
Lindenbach, B. D. & Rice, C. M. Molecular biology of flaviviruses. Adv.
Virus Res. 59, 23–61 (2003).
Lindenbach, B. D., Thiel, H-J. & Rice, C. M. em Fields Virology (eds Knipe,
D. M. & Howley, P. M.) 1101–1152 (Lippincott Williams & Wilkins,
Philadelphia, 2007).
Lins, L. Decaffmeyer, M., Thomas, A. & Brasseur, R. Relationships
between the orientation and the structural properties of peptides and
their membrane interactions. Biochi. Biophys. Acta 1778, 1537-1544
(2008).
Lins, L., Charloteaux, A., Thomas, R. & Brasseur, R. Computational study
of lipid-destabilizing protein fragments: towards a comprehensive view of
tilted peptides. Proteins-Structure Function and Genetics 44, 435-447
(2001).
Liu, C. C., Lian, W. C., Butler, M. & Wu, S. C. High immunogenic
enterovirus 71 strain and its production using serum-free microcarrier
Vero cell culture. Vaccine 25, 19-24 (2007).
186
Referências Bibliográficas
Liu, L. P. & Deber, C. M. Anionic phspholipids modulate peptide insertion
into membranes. Biochemistry 36, 5476-5482 (1997).
Lloyd, W., Theiler, M. & Ricci, N. I. Modification of the virulence of yellow
fever virus by cultivation in tissues. Transactions of the Royal Society of
tropical Medicine and Hygiene 29, 481-529 (1936).
Lobigs, M. Flavivirus premembrane protein cleavage and spike
heterodimer secretion requires the function of the viral proteinase NS3.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6218-6222 (1993).
Lorenz, I. C., Allison, S. L., Heinz, F. X. & Helenius, A. Folding and
dimerization of tick-borne encephalitis virus envelope proteins prM and E
in the endoplasmic reticulum. J. Virol. 76, 5480–5491 (2002).
Lorin, A., Charloteaux, B., Fridmann-Sirkis, Y., Thomas, A., Shai, Y. &
Brasseur, R. Mode of membrane interaction and fusogenic properties of a
de novo transmembrane model peptide depend on the length of the
hydrophobic core. J. Biol. Chem. 282, 18388-18396 (2007).
Lozach, P. Y., Burleigh L., Staropoli, I., Navarro-Sanchez, E., Harriaque, J.,
Virelizier, J. L., Rey, F. A., Desprès, P., Arenzana-Seisdedos, F. & Amara,
A. Dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule 3-grabbing nonintegrin (DC-SIGN)-mediated enhancement of dengue virus infection is
independent of DC-SIGN internalization signals. J. Biol. Chem. 280, 2369823708 (2005).
Luneberg, J., Martin, I., Nussler, F., Ruysschaert, J. M. & Herrmann, A.
Structure and topology of the influenza virus fusion peptide in lipid
bilayers. J. Biol. Chem. 270, 27606-27614 (1995).
Ma, L., Jones, C. T., Groesch, T. D., Kuhn, R. J. & Post, C. B. Solution
structure of dengue virus capsid protein reveals another fold. Proc. Natl
Acad. Sci. USA 101, 3414–3419 (2004).
Mackenzie, J. S., Gubler, D. J. & Petersen, L. R. Emerging flaviviruses: the
spread and resurgence of Japanese encephalitis, West Nile and dengue
viruses. Nat. Med. 10, S98–S109 (2004).
187
Referências Bibliográficas
Mancini, E. J., Clarke, M., Gowen, B. E., Rutten, T. & Fuller, S. D. Cryoelectron microscopy reveals the functional organization of an enveloped
virus, Semliki Forest virus. Mol. Cell 5, 255–266 (2000).
Marrink, S. J., Tieleman, D. P., van Buuren, A. R. & Berendsen, H. J. C.
Membranes and water: an interesting relationship, Faraday Discussions
103, 191-201 (1996).
Martin, I., Dubois, M. C., Defrisequertain, F., Saermark, T., Burny, A.,
Brasseur, R. & Ruysschaert, J. M. Correlation between fusogenicity of
synthetic modified peptides corresponding to the NH2-terminal extremity
of simian immunodeficiency virus gp32 and their mode of insertion into
the lipid bilayer – an infrared-spectroscopy study. J. Virol. 68, 1139-1148
(1994).
Martin, I., Schaal, H., Scheid, A. & Ruysschaert, J. M. Lipid membrane
fusion induced by the human immunodeficiency virus type 1 gp41 Nterminal extremity is determined by its orientation in the lipid bilayer. J.
Virol. 70, 298-304 (1996).
Martin, M., Tsai, T. F., Cropp, B., Chang, G. J., Holmes, D. A., Tseng, J.,
Shieh, W., Zaki, S. R., Al-Sanouri, I., Cutrona, A. F., Ray, G., Weld, L. H. &
Cetron, M. S. Fever and multisystem organ failure associated with 17D204 yellow fever vaccination: a report of four cases. Lancet 358, 98-104
(2001).
Masson, P., Tonello, C. & Balny, C. High pressure biotechnology in
medicine and pharmaceutical science. J. Biomed. Biotech. 1, 8588 (2001).
Matthews, T., Salgo, M., Greenberg ,M., Chung, J., DeMasi ,R. &
Bolognesi, D. Enfuvirtide: the first therapy to inhibit the entry of HIV-1
into host CD4 lymphocytes. Nat Rev Drug Discovery 3, 215–225 (2004).
Matusan, A. E., Kelley, P. G., Pryor, M. J., Whisstock, J. C., Davidson, A. D.
& Wright, P. J. Mutagenesis of the dengue virus type 2 NS3 proteinase and
the production of growth-restricted virus. J. Gen. Virol. 82, 1647–1656
(2001a).
188
Referências Bibliográficas
Matusan, A. E., Pryor, M. J., Davidson, A. D. & Wright, P. J. Mutagenesis
of the Dengue virus type 2 NS3 protein within and outside helicase motifs:
effects on enzyme activity and virus replication. J. Virol. 75, 9633–9643
(2001b).
Mazzini, S., Fernandez-Vidal, M., Galbusera, V., Castro-Roman, F.,
Bellucci, M. C., Ragg, E. & Haro, I. 3D-Structure of the interior fusion
peptide of HGV/GBV-C by 1H NMR, CD and molecular dynamics studies.
Arch. Biochem. Biophys. 465, 187-96 (2007).
McElhaney, R. N. The use of differential scanning calorimetry and
differential thermal analysis in studies of model and biological
membranes. Chem. Phys. Lipids 30, 229-259 (1982).
Mendes, Y. S. Mudanças estruturais do vírus da febre amarela (YFV)
induzidas por alta pressão hidrostática – obtenção de partículas
inativadas. Mestrado em Bioquímica Médica. Departamento de
Bioquímica Médica. Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2005.
Merten, O. W., Manuguerra, J. C., Hannoun, C. & van der Werf, S.
Production of influenza virus in serum-free mammalian cell cultures. Dev.
Biol. Stand. 98, 2337 (1999).
Miller, S., Kastner, S., Krijnse-Locker, J., Buhler, S. & Bartenschlager, R.
The nonstructural protein 4A of dengue virus is an integral membrane
protein inducing membrane alterations in a 2K-regulated manner. J. Biol.
Chem. 282, 8873–8882 (2007).
Ministério da Saúde (2008). Acessado em 19 de Janeiro de 2008, em:
http://bvsms.saude.gov.br/bvs/febreamarela/index.php
Minor, D. L., Jr & Kim, P. S. Measurement of the beta-sheet-forming
propensities of amino acids. Nature (London) 367, 660–663 (1994).
Mitchell, D. J., Kim, D. T., Steinman, L., Fathman, C. G. & Rothbard, J. B.
Poliarginine enters cells more efficiently than other polycationic
homopolymers. J. Peptide Res. 56, 318-325 (2000).
189
Referências Bibliográficas
Modis, Y., Ogata, S., Clements, D. & Harrison, S. C. A ligand-binding
pocket in the dengue virus envelope glycoprotein. Proc. Natl Acad. Sci.
USA 100, 6986–6991 (2003).
Modis, Y., Ogata, S., Clements, D. & Harrison, S. C. Structure of the
dengue virus envelope protein after membrane fusion. Nature 427, 313–
319 (2004).
Mohler, L., Flockerzi, D., Sann, H. & Reichl, U. Mathematical model of
influenza A virus production in large-scale microcarrier culture. Biotechnol.
Bioeng. 90, 4658 (2005).
Monath, T. P. Yellow fever. Em: Monath, T.P. (ed) Arboviruses: ecology
and epidemiology, Volume V, CRC Press, Boca Raton, p. 139-241 (1988).
Monath, T. P. Yellow fever. Lancet Infectious Diseases 1, 11-20 (2001).
Mozhaev, V. V., Heremans, K., Frank, J., Masson, P. & Balny, C. High
pressure effects on protein structure and function. Proteins 24, 81-91
(1996).
Mueller D. S., Kampmann, T., Yennamalli, R., Young, P. R., Kobe, B. &
Mark, A. E. Histidine protonation and the activation of viral fusion
proteins. Biochem. Soc. Trans. 36, 43-45 (2008).
Mukhopadhyay, S., Kuhn, R. J. & Rossmann, M. G. A structural
perspective of the flavivirus life cycle. Nat. Rev. Microbiol. 3, 13–22 (2005).
Mundim, K. In Anais da IV Escola do CBPF; CBPF: Rio de Janeiro, RJ - Brasil,
2002.
Muñoz, V., Thompson, P. A. & Hofrichter, J. Folding dynamics and
mechanism of β-hairpin formation. Nature 390, 196– 199 (1997).
Munoz-Jordan, J. L., Laurent-Rolle, M., Ashour, J., Martinez-Sobrido, L.,
Ashok, M., Lipkin,W. I. & Garcia-Sastre, A. Inhibition of alpha/beta
interferon signaling by the NS4B protein of flaviviruses. J. Virol. 79, 8004–
8013 (2005).
190
Referências Bibliográficas
Murchie, L. W., Cruz-Romero, M., Kerry J. P., Linton, M., Patterson, M. F.,
Smiddy, M. & Kelly, A. L. High pressure processing of shellfish: a review of
microbiological and other quality aspects. Innovative Food Science and
Emerging technologies 6, 257270 (2005).
Mutebi, J. P., Wang, H., Li, L., Bryant, J.E. & Barrett, A. D. T. Phylogenetic
and evolucionary relationships among yellow fever virus isolates in Africa.
Journal of Virology 75, 6999-7008 (2001).
Muylaert, I. R., Galler, R. & Rice, C. M. Genetic analysis of the yellow fever
virus NS1 protein: identification of a temperature-sensitive mutation
which blocks RNA accumulation. J. Virol. 71, 291–298 (1997).
Nieva, J. L. & Agirre, A. Are fusion peptides a goog model to study viral
cell fusion? Biochim. Biophys. Acta 1614, 104-115 (2003).
Nybakken, G. E., Nelson, C. A., Chen, B. R., Diamond, M. S. & Fremont, D.
H. Crystal structure of the west nile virus envelope glycorpotein. J. Virol.
80, 11467-11474 (2006).
Oliveira, A. C., Valente, A. P., Almeida, F., Lima, S. M. B., Ishimaru, D.,
Gonçalves, R. B., Peabody, D. S., Foguel, D. & Silva, J. L. Hydrostatic
pressure as a tool to study virus assembly: inactived vaccines and viral
drugs. High Pressure Molecular Science, NATO ASI series c, 497-513
(1999b).
Oliveira, A.C., Ishimaru, D, Gonçalves, R. B., Smith, T.J., Mason, P.,
Carvalho, D. & Silva, J. L. Low temperature and pressure stability of
Picornavirus: implications for virus uncoating. Biophysical Journal 76,
1270-1279 (1999a).
Paladini, A. A. & Weber, G. Pressure-induced reversible dissociation of
enolase. Biochemistry 20, 2587-2593 (1981).
Parker, W. & Song, P. S. Protein structures in SDS micelle-protein
complexes. Biophysical Journal 61, 1435-1439 (1992).
191
Referências Bibliográficas
Pascual, R., Contreras, M., Fedorov, A., Prieto, M. & Villalain, J.
Interaction of a peptide derived from the N-heptad repeat region of gp41
Env ectodomain with model membranes. Modulation of phospholipid
phase behavior. Biochemistry 44, 14275–14288 (2005a).
Pascual, R., Moreno, M. R. & Villalain, J. A peptide pertaining to the loop
segment of human immunodeficiency virus gp41 binds and interacts with
model biomembranes: implications for the fusion mechanism. J. Virol. 79,
5142–5152 (2005b).
Perera, R., Khaliq, M. & Kuhn, R. J. Closing the door on flaviviruses: Entry
as a target for antiviral drug design. Antiviral Res. 80, 11-22 (2008).
Pinheiro, T. J. & Watts, A. Lipid specificity in the interaction of
cytochrome c with anionic phospholipid bilayers revealed by solid-state
31P NMR. Biochemistry 33, 2451-2458 (1994).
Pletnev, A. G., Bray, M. & Lai, C. J. Chimeric tick-borne encephalitis and
dengue type 4 viruses: effects of mutations on neurovirulence in mice. J.
Virol. 67, 4956-4963 (1993).
Pontes, L., Cordeiro, Y., Giongo, V., Villas-Boas, M., Barreto, A., Araújo, J.
R. & Silva, J.L. Pressure-induced formation of inactive triple-shelled
rotavirus particles is associated with changes in the spike protein Vp4. J.
Mol. Biol. 307, 1171-9 (2001).
Proutski, V., Gaunt, M. W., Gould, E. A. & Holmes, E. C. Secundary
structure of the 3’-untranslated region of yellow fever virus: implications
for virulence, attenuation and vaccine development. J. Gen. Virol. 78,
1543-1549 (1997).
Pugachev, K. V., Guirakhoo, F. & Monath, T. P. New developments in
flavivirus vaccines with special attention to yellow fever. Curr. Opin. Infect.
Dis. 18, 387–394 (2005).
192
Referências Bibliográficas
Putnak, R. J., Coller, B. A., Voss, G., Vaughn, D. W., Clements, D., Peters,
I., Bignami, G., Houng, H. S., Chen, R. C., Barvir, D. A., Seriwatana, J,
Cayphas, S., Garcon, N., Gheysen, D., Kanesa-Thasan, N., McDonell, M.,
Humphreys, T., Eckels, K. H., Prieels, J. P. & Innis, B. L. An evaluation of
dengue type-2 inactivated, recombinant subunit, and live-attenuated
vaccine candidates in the rhesus macaque model. Vaccine 23, 444252
(2005).
Raffi, F. Enfuvirtide, first fusion inhibitor in the treatment of human
immunodeficiency virus infection: mechanism of action and
pharmacokinetics. Med. Mal. Infect. 34, 3-7 (2004).
Ramirez-Alvarado, M., Blanco, F. J. & Serrano, L. De novo design and
structural analysis of a model beta-hairpin peptide system. Nature Struct.
Biol. 3, 604–612 (1996).
Rey, F. A., Heinz, F. X., Mandl, C., Kunz, C. & Harrison, S. C. The envelope
glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2-Å resolution. Nature
375, 291–298 (1995).
Reynolds, J. A., Herbert, S., Polet, H. & Steinhardt, J. The binding of
drivers detergent anions to bovine serum albumin. Biochemistry 6, 937943 (1967).
Rezansoff, A. J., Hunter, H. N., Jing, W., Park, I. Y., Kim, S. C. & Vogel, H. J.
Interactions of the antimicrobial peptide Ac-FRWWHR-NH2 with model
membrane systems and bacterial cells. J. Peptide Res. 65, 491-501 (2005).
Robertson, S. E., Hull, B. P., Tomori, O., Bele, O., Leduc, J. W. & Esteves,
K. Yellow fever. A decade of reemergence. Journal of the American
Medical Association 276, 1157-1162 (1996).
Robinson, C. R. & Sligar, S. G. Hydrostatic and osmotic pressure as tools to
study macromolecular recognition. Em Methods in Enzymology: Energetics
of Biological Macromolecules, Vol. 259. Academic Press, New York. pg.
395-427 (1995).
193
Referências Bibliográficas
Roccatano, D., Colombo, G., Floroni, M. & Mark, A. E. Mechanism By
Which 2,2,2 – Trifluorethanol/Water Mixtures Stabilize SecondaryStructure Formation In Peptides: A Molecular Dynamics Study. Proc. Natl
Acad. Sci. USA 99, 12179-12184 (2002).
Roehrig, J. T., Hunt, A. R., Johnson, A. J. & Hawkes, R. A. Synthetic
peptides derived from the deduced amino acid sequence of the Eglycoprotein of Murray Valley encephalitis virus elicit antiviral antibody.
Virology 171, 49-60 (1989).
Roehrig, J. T., Johnson, A. J., Hunt, A. R., Bolin, R. A. & Chu, M. C.
Antibodies to dengue 2 virus E-glycoprotein synthetic peptides identify
antigenic conformation. Virology 177, 668-675 (1990).
Roosendaal, J., Westaway, E. G., Khromykh, A. & Mackenzie, J. M.
Regulated cleavages at the West Nile virus NS4A-2K-NS4B junctions play a
major role in rearranging cytoplasmic membranes and Golgi trafficking of
the NS4A protein. J. Virol. 80, 4623–4632 (2006).
Sampath, A. & Padmanabhan, R. Molecular target for flavivirus drug
discovery. Antiviral Res. 81, 6-15 (2009).
Schalich, J., Allison, S. L., Stiasny, K., Mandl, C. W., Kunz, C. & Heinz, F. X.
Recombinant subviral particles from tick-borne encephalitis virus are
fusogenic and provide a model system for studying flavivirus envelope
glycoprotein functions. J. Virol. 70, 4549–4557 (1996).
Schwarcz, W. D., Barroso, S. P., Gomes, A. M., Johnson, Schneemann, A.,
Oliveira, A. C. & Silva J. L. Virus stability and protein-nucleic acid
interaction as studied by high-pressure effects on nodaviruses. Cell Mol.
Biol. 50, 419-427 (2004).
Searle, M. S., Williams, D. H. & Packman, L. C. A short linear peptide
derived from the N-terminal sequence of ubiquitin folds into a waterstable non-native beta-hairpin. Nature Struct. Biol. 2, 999–1006 (1995).
Seelig, J. Peptide-lipid interaction, em Current Topics in Membranes (eds
Simon, S. A. & McIntosh, T. J.) 52, 31-56 (Academic Pres, New York, 2002).
194
Referências Bibliográficas
Seelig, J. Thermodynamics of lipid-peptide interactions. Biochim. Biophys.
Acta 1666, 40-50 (2004).
Seligman, S. J. & Bucher, D. J. The importance of being outer:
consequences of the distinction between the outer and inner surfaces of
flavivirus glycoprotein E. Trends Microbiol. 11, 108-110 (2003).
Seligman, S. J. & Gould, E. A. Live flavivirus vaccines: reasons for caution.
Lancet 363, 2073-2075 (2004).
Seligman, S. J. Constancy and diversity in the flavivirus fusion peptide.
Virol. J. 5, 27 (2008).
Shoff, W., Hinfey, P., Behrman, A. J. & Shepherd, S. Yellow fever. Emed.
Journal 2 (2001). http://www.emedicine.com/emerg/topic645.htm
Sieczkarski, S. B. & Whittaker, G. R. Viral entry. Curr. Top. Microbiol.
Immunol. 285, 1-23 (2005).
Silva, J. L. & Weber, G. Pressure stability of proteins. Annual Review Phys.
Chem. 44, 89-113 (1993).
Silva, J. L., Foguel, D. & Royer, C. A. Pressure provides new insights into
protein folding, dynamics and structure. Trends in Biochemistry Science 26,
612-618 (2001).
Silva, J. L., Foguel, D., Da Poian, A.T. & Prevelige, P. E. The use of
hydrostatic pressure as a tool to study viruses and other macromolecular
assemblages. Current Opinion Structure Biology 6, 166-175 (1996).
Silva, J. L., Luan, P., Glaser, M., Voss, E. W. & Weber, G. Effects of
hydrostatic pressure on a membrane-enveloped virus: high
immunogenicity of the pressure-inactivated virus. J. Virol. 66, 211117
(1992).
Silva, J. L., Oliveira, A. C., Gomes, A. M. O., Lima, L. M. T. R., MohanaBorges, R., Pacheco, A. B. F. & Foguel, D. Pressure induces folding
intermediates that are crucial for protein-DNA recognition and virus
assembly. Biochim. Biophys. Acta 1595, 250-265 (2002).
195
Referências Bibliográficas
Skehel, J. J. & Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus
entry: the influenza hemagglutinin. Annu. Rev. Biochem. 69, 531–569
(2000).
Smith, A. E. & Helenius, A. How viruses enter animal cells. Science 304,
237-242 (2004).
Smith, H. H., Penna, H. & Paolielolo, A. Yellow fever vaccination with
cultured virus (17D) without immune serum. American Journal of tropical
Medicine and Hygiene 18, 437-468 (1938).
Soper, F. L. & Smith, H. H. Vaccination with virus 17D in the control of
jungle yellow fever in Brazil. Transactions of the Third International
Congress of tropical Medicine and Malaria, Amsterdam, 1, 295-313 (1938).
Spink, C. H. Differential scanning calorimetry. Methods Cell Biol. 84, 115141 (2008).
Sreerama, N. & Woody, R. W. Computation and Analysis of Protein
Circular Dichroism Spectra. Methods in Enzymology 383, 318-351 (2004).
Stadler, K., Allison, S. L., Schalich, J. & Heinz, F. X. Proteolytic activation of
tick-borne encephalitis virus by furin. J. Virol. 71, 8475–8481 (1997).
Stefano, I., Sato, H. K., Pannuti, C. S., Omoto, T. M., Mann, G., Freire, M.
S., Yamamura, A. M., Vasconcelos, P. F., Oselka, G. W., Weckx, L. W.,
Salgado, M. F., Noale, L. F. & Souza, V. A. Recent immunization against
measles does not interfere with the sero-response to yellow fever vaccine.
Vaccine 17, 104246 (1999).
Stiasny, K. & Heinz, F. X. Flavivirus membrane fusion. J. Gen. Virol. 87,
2755–2766 (2006).
Stiasny, K., Allison, S. L., Marchler-Bauer, A., Kunz, C. & Heinz, F. X.
Structural requirements for low-pH-induced rearrangements in the
envelope glycoprotein of tick-borne encephalitis virus. J. Virol. 70(11),
8142-8147 (1996).
Stiasny, K., Fritz, R., Pangerl, K. & Hans, F. X. Molecular mechanisms of
flavivirus membrane fusion. Amino Acids (2009).
196
Referências Bibliográficas
Stokes, A., Bauer, J. H. & Hudson, J. H. Transmission of yellow fever to
Macacus rhesus. JAMA 90, 253-254 (1928).
Straub, O. C. Infectious bovine rhinotracheitis. Em: Virus Infections of
Ruminants (Dinter, A & Morein, B., eds.), pp. 71-108. Elsevier, Amsterdam
(1990).
Takekiyo, T., Wu, L., Yoshimura, Y., Shimizu, A. & Keiderling, T. A.
Relationship between hydrophobic interactions and secondary structure
stability for Trpzip β-hairpin peptides. Biochemistry 48, 1543-1552 (2009).
Tamm, L. K. & Han, X. Viral fusion peptides: a tool set to disrupt and
connect biological membranes. Biosci. Rep. 20, 501-518 (2000).
Tamm, L. K. Hypothesis: spring-loaded boomerang mechanism of
influenza hemagglutinin-mediated membrane fusion. Biochim. Biophys.
Acta 1614, 14-23 (2003).
Tamm, L. K., Han, X., Li, Y. & Lai, L. A. Structure and function of
membrane fusion peptides. Bioplymers 66, 249-260 (2002).
Tan, B. H., Fu, J. L., Sugrue, R. J., Yap, E. H., Chan, Y. C. & Tan, Y. H.
Recombinant dengue type 1 virus NS5 protein expressed in Escherichia coli
exhibits RNA-dependent RNA polymerase activity. Virology 216, 317–325
(1996).
Tassaneetrithep, B., Burgess T. H., Granelli-Piperno, A., Trumpfheller, C.,
Finke, J., Sun, W., Eller, M. A., Pattanapanyasat, K., Srarasombath, S.,
Birx, D. L., Steinman, R. M., Schlesinger, S. & Marovich, M. A. DC-SIGN
(CD209) mediates dengue virus infection oh human dendritic cells. J. Exp.
Med. 197 (7), 823-829 (2003).
Theiler, M. & Downs, W. G. Part II. The arthropod-borne viruses of
vertebrates: an account of the Rockefeller Foundation Virus Program
1951-1970. Yale University Press, New Haven, CT (1973).
Theiler, M. & Smith, H. H. The effect of prolonged cultivation in vitro upon
the pathogenicity of yellow fever virus. Journal of Experimental Medicine
65, 767-786 (1937b).
197
Referências Bibliográficas
Theiler, M. & Smith, H. H. The use of yellow fever virus modified by in
vitro cultivation for human immunization. Journal of Experimental
Medicine 65,787-800 (1937a).
Tian, S. M., Qian, J. F., Shao, G. Q. & Ruan, K. C. High immunogenicity of
the pressure-inactivated virus. Acta Biochim. Biophys. Sinica 31, 33436
(1999).
Tian, S. M., Ruan, K. C., Qian, J. F., Shao, G. Q. & Balny, C. Effects of
hydrostatic pressure on the structure and biological activity of infectious
bursal disease virus. Eur. J. Biochem. 267, 448694 (2000).
Tieleman, D. P. & Berendsen, H. J. C. Molecular dynamics simulations of a
fully hydrated dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer with different
macroscopic boundary conditions and parameters, J. Chemical Physics
105, 4871-4880 (1996).
Trabelsi, K, Rourou, S., Loukil, H., Majoul, S. & Kallel, H. Optimization of
virus yield as a strategy to improve rabies vaccine production by Vero cells
in a bioreactor. J. Biotech. 121, 26171 (2006).
Tracz, S. M., Abedini, A., Driscoll, M. & Raleigh, D. P. Role of aromatic
interactions in amyloid formation by peptides derived from human
Amylin. Biochemistry 43, 15901–15908 (2004).
Trainor, N. B., Crill, W. D., Roberson, J. A. & Chang, G. J. Mutation
analysis of the fusion domain region of St. Louis encephalitis virus
envelope protein. Virology 360, 398-406 (2007).
Umareddy, I., Chao, A., Sampath, A., Gu, F. & Vasudevan, S. G. Dengue
virus NS4B interacts with NS3 and dissociates it from single-stranded RNA.
J. Gen. Virol. 87, 2605–2614 (2006).
van der Spoel, D., Lindahl, E. & Hess, B. Gromacs 3.0: a package for
molecular simulation and trajectory analysis. J. Mol. Model. 7, 306-317
(2001).
Vasconcelos, P. F. C. Yellow Fever. Revista da Sociedade Brasileira de
Medicina Tropical 36, 275-293 (2003).
198
Referências Bibliográficas
Vasconcelos, P. F., Luna, E. J., Galler, R., Silva, J. L., Coimbra, T. L., Barros,
V. L. R., Monath, T. P., Rodrigues, S. G., Laval, C., Costa, Z. G., Vilela, M. F.
G., Santos, C. L. S., Papaiordanou, C. M. O., Alves, V. A., Andrade, L. D.,
Sato, H. K., Rosa, E. S. T., Froguas, G. B., Lacava, E., Almeida, L. M. R.,
Cruz, A. C. R., Rocco, I. M., Santos, R. T. M. & Oliva, O. F. P. Serious
adverse events associated with yellow fever 17DD vaccine in Brazil: a
report of two cases. Lancet 358, 91-97 (2001).
Voet, D., Voet, G. V. & Pratt, C. W. Proteínas: Estrutura Tridimensional.
Fundamentos de Bioquímica, Artmed Editora p. 139-140 (2002).
Wang, E., Weaver, S. C., Shope, R. E., Tesh, R. B., Watts, D.M. & Barrett,
A. D. T. Genetic variation in yellow fever virus: duplication in the 3’
noncoding region of strains from Africa. Virology 225, 274-281 (1996).
Wang, G., Treleaven, W. D. & Cushley, R. J. Conformation of human
serum apolipoprotein A-I(166-185) in the presence of sodium dodecyl
sulfate or dodecylphosphocoline by 1H-NMR and CD. Evidence for specific
peptide-SDS interactions. Biochim. Biophys. Acta 1301, 174-184 (1996).
Weber, G. & Drickamer, H. G. The effect of high pressure upon proteins
and other biomolecules. Q. Rev. Biophys. 16, 89-112 (1983).
Wengler, G. & Wengler, G. Cell-associated West Nile flavivirus is covered
with E+pre-M protein heterodimers which are destroyed and reorganized
by proteolytic cleavage during virus release. J. Virol. 63 (3), 2521-2526
(1989).
White, J. Viral and cellular membrane fusion proteins. Annu. Rev. Physiol.
52, 675-697 (1990).
White, S. H. & Wimley, W. C. Membrane protein folding and stability:
physical principles. Annu. Rev. Biomol. Struct. 28, 319-365 (1999).
Whitehead, S. S., Blaney, J. E., Durbin, A. P. & Murphy, B. R. Prospects for
a dengue virus vaccine. Nature Reviews Microbiology 5, 518-528 (2007).
WHO. Dengue factsheet.
<http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs117/en/> (2002a).
199
Referências Bibliográficas
WHO. Immunization, vaccines and biologicals: Japanese encephalitis.
<http://www.who.int/vaccinesdiseases/diseases/je.shtml> (2002b).
WHO. The yellow fever situation in Africa and South America in 2004.
Wkly Epidemiol. Rec. 80, 250-256 (2005).
WHO. Yellow fever factsheet.
<http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs100/en/> (2001).
Wimley, W. & White, S. H. Experimentally determined hydrophobicity
scale for proteins at membrane interfaces. Nat. Struct. Biol. 3, 842-848
(1996).
Wong, T. C. Membrane structure of the human immunodeficiency virus
gp41 fusion peptide by molecular dynamics simulation. II. The glycine
mutants. Biochim. Biophys. Acta 1609, 45-54 (2003).
Wu, S. C., Liu, C. C. & Lian, W. C. Optimization of microcarrier cell culture
process for the inactivated enterovirus type 71 vaccine development.
Vaccine 22, 385864 (2004).
Yonath, A., Podjarny, A., Honig, B., Sielecki, A. & Traub, W.
Crystallographic studies of protein denaturation and renaturation. 2.
Sodium dodecyl sulfate induced structural changes in triclinic lysozyme.
Biochemisry 16, 1418-1424 (1977).
Zhang, L. W., Mohan, P. M., Padmanabhan, R. Processing and localization
of dengue virus type-2 polyprotein precursor NS3-NS4a-NS4b-NS5. J. Virol.
66, 7549–7554 (1992).
Zhang, W., Chipman, P. R., Corver, J., Johnson, P. R., Zhang, Y.,
Mukhopadhyay, S., Baker, T. S., Strauss, J. H., Rossmann, M. G. & Kuhn,
R. J. Visualization of membrane protein domains by cryo-electron
microscopy of dengue virus. Nature Struct. Biol. 10, 907–912 (2003).
Zhang, W., Mukhopadhyay, S., Pletnev, S. V., Baker, T. S., Kuhn, R. J. &
Rossmann, M. G. Placement of the structural proteins in Sindbis virus. J.
Virol. 76, 11645–11658 (2002).
200
Referências Bibliográficas
Zhang, Y., Zhang, W., Ogata, S., Clements, D., Strauss, J. H., Baker, T. S.,
Kuhn, R. J. & Rossmann, M. G. Conformational changes of the flavivirus E
glycoprotein. Structure (Camb) 12, 1607–1618 (2004).
201
Anexos
202
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo