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Atividade desinfetante do decocto de Hypericum caprifoliatum Cham. e Shclecht. –
Guttiferae (“escadinha/sinapismo”), frente diferentes doses infectantes de
Staphylococcus aureus (agente infeccioso em mastite bovina)
1
2
AVANCINI, C.A.M. ; WIEST, J.M.
1
Departamento de Medicina Veterinária Preventiva/Faculdade de Veterinária/ Universidade Federal do Rio Grande do
Sul. Av. Bento Gonçalves, 9.090. Bairro Agronomia, Porto Alegre, RS. CEP 91.540-000. E-mail: [email protected]
2
Departamento de Ciência dos Alimentos/Instituto de Ciência e Tecnologia dos Alimentos/Universidade Federal do Rio
Grande do Sul.
RESUMO: Objetivou-se verificar in vitro se extração de Hypericum caprifoliatum Cham. e Schlecht.
- Guttiferae, espécie nativa no sul do Brasil, possui atividade antibacteriana para ser usada como
desinfetante nos ambientes de saúde e produção animal. O decocto (proporção 1:10 m/v) das
partes aéreas da planta foi avaliado usando o método de diluição, pelo teste de suspensão, tendo
como indicador uma amostra de Staphylococcus aureus. Simulou-se condições práticas de uso
relacionadas aos fatores: oito doses infectantes do inóculo, cinco tempos de contato, ausência
e presença de matéria-orgânica (soro bovino/leite integral) e suporte (tecido de algodão). Na
ausência de matéria orgânica, aos cinco minutos o decocto inativou o inóculo na mais alta dose
infectante confrontada, de 3,1x108 UFC mL-1, e na presença do suporte a dose de 3,1x104 UFC
mL-1 com sessenta minutos de contato. Com matéria orgânica, os piores resultados foram na
presença de leite integral. Os resultados indicam que, na proporção planta:volume usada, deve
ser melhor a eficácia de aplicação do decocto em ambientes limpos e superfícies não porosas,
sugerindo a possibilidade de utilização desta solução como antimicrobiano/desinfetante em
determinadas situações-problemas em saúde relacionando ao agente transmissível e aos fatores
matéria orgânica e suporte estudados.
Palavras-chave: desinfetante, antimicrobiano, saúde animal, plantas medicinais, Hypericum
caprifoliatum
ABSTRACT: Disinfecting activity of the decocto of Hypericum caprifoliatum Cham. and
Shclecht.-Guttiferae (“escadinha/sinapismo”) with different infecting doses of
Staphylococcus aureus (infectious agent in bovine mastitis). Hypericum caprifoliatum Cham.
and Schlecht. - Guttiferae is a native species from southern Brazil. Our objective was to verify in
vitro whether its extraction presents antibacterial activity when employed to sanitize health and
animal production environments. The decocto (1:10 w/v) of the aerial parts of the plant was evaluated
applying the dilution method and the suspension test. A sample of Staphylococcus aureus was
used as an indicator and practical use conditions were simulated in relation to the following
factors: eight infecting doses of the inoculants, five periods of contact, absence or presence of
organic material (bovine serum/whole milk) and support (cotton cloth). In the absence of organic
material, the decoct deactivated the inoculants at the highest infecting dose tested (3.1x108 CFU
mL-1). In the presence of support, the decoct deactivated the inoculants after sixty minutes of
contact with a dose of 3.1x104 CFU mL-1. With organic material, the worst results were in the
presence of whole milk. Considering the proportion plant per volume used, better efficacy may be
achieved from the application of the decoct in clean environments and non-porous surfaces. It
suggests the decoct could be used as antimicrobial and disinfectant power in particular ill-health
situations related to the transmissible agent and, organic matter factors and support studied.
Key words: disinfectant, antimicrobial activity, animal soundness, medicinal plants, Hypericum
caprifoliatum
Recebido para publicação em 19/11/2006
Aceito para publicação em 13/09/2007
Rev. Bras. Pl. Med., Botucatu, v.10, n.1, p.64-69, 2008.
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INTRODUÇÃO
O principal problema que afeta os rebanhos
leiteiros, mundialmente, é a inflamação da glândula
mamária ou mastite, a qual, freqüentemente, tem
origem bacteriana (Fagundes & Oliveira, 2004). As
bactérias do gênero Staphylococcus ocupam um
papel destacado na etiologia das infecções
intramamárias do gado leiteiro, sendo a espécie S.
aureus considerada um patógeno primário e tem sido
o agente mais freqüentemente isolado tanto de
infecções clínicas como subclínicas (Brito et al.,
2002). Os quartos mamários infectados, a pele do
úbere e dos tetos são os principais sítios de
localização desses agentes. Da mesma forma, os
bocais da ordenhadeira e as mãos dos ordenhadores
são considerados como as mais importantes vias de
transmissão (Ferreira et al., 2006)
Na implementação de programas sanitários
para a prevenção e controle de enfermidades, como
é o caso da mastite bacteriana, os objetivos
perseguidos são os de impedir a sua ocorrência ou,
quando ela já está acontecendo, a transmissão dos
agentes causais a hospedeiros suscetíveis sadios.
Para tanto, entre os procedimentos adotados estão
ações sobre os agentes causais transmissíveis ao
nível das fontes de infecção e reservatórios existentes
no ambiente onde os animais são manejados. Os
procedimentos com essas características são
denominados como desinfecção e antissepsia, e
sevem como recursos para eliminar ou diminuir as
doses infectantes de microrganismos quando em vida
livre. Quanto ao uso da antibioticoterapia, ela é
reservada a ser empregada no corpo dos animais
visando à limitação da invalidez provocada (Wiest,
1984).
No entanto, a implantação de programas
sanitários de saneamento ambiental freqüentemente
enfrenta limitações, como por exemplo, os referentes
ao custo ou até mesmo possível resistência dos
agentes causais (Chapmann, 1998; O.I.E., 2003) aos
antimicrobianos. Neste sentido, desenvolvem-se
projetos para se verificar se extrações de espécies
vegetais utilizadas em sistemas tradicionais/
populares de saúde possuem viabilidade de uso,
cientificamente assegurada, ecológica, econômica e
socialmente sustentáveis como desinfetante ou
antisséptico para aplicação em saúde pública e
animal, substituindo ou complementando os produtos
convencionais.
Com esta abordagem, Avancini (2002)
realizou pesquisa qualitativa etnográfica
(etnoveterinária) para recolher informações sobre o
conhecimento tradicional/popular no uso de plantas
em enfermidades de pele nos animais. Entre as
extrações das plantas indicadas e testadas em
triagem quanto ao critério atividade biológica
antibacteriana, pelo método de diluição com técnica
do sistema de tubos múltiplos o decocto de H.
caprifoliatum Cham. e Schlecht. (Avancini et al., 2002)
apresentou ação sobre nove amostras de bactérias
do grupo das Gram-positivas sendo cinco padrões
internacionais e quatro amostras “de campo”, isoladas
de situações-problema sanitários (materiais de
animais enfermos e de alimentos de origem animal).
O Hypericum L. é um gênero botânico
cosmopolita contendo aproximadamente 400
espécies, principalmente herbáceas e arbustos, vinte
delas com ocorrência descrita no sul do Brasil
(Robson apud Ferraz, 2004). Deste gênero,
compostos antifúngicos (Décosterd et al. 1986),
antibióticos (Rocha et al., 1995), antidepressivos
(Daudt et al., 2000) e anti-virais (Schmitt et al., 2001)
já foram isolados. Dall´agnol et al. (2003), estudando
o extrato metanólico de 6 espécies do sul do Brasil
(entre elas o H. caprifoliatum), pela da técnica de
ágar-difusão encontraram atividade antimicrobiana
variada e os compostos polifenólicos como taninos,
flavonóides e ácidos fenólicos como os mais
proeminentes do extrato bruto investigado os quais
poderiam estar contribuindo para a atividade
encontrada.
Quanto ao presente trabalho objetivou-se
especificamente verificar a atividade desinfetante do
decocto de H. caprifoliatum Cham. e Schlechtl. Guttiferae frente uma amostra de Staphylococcus
aureus, submetendo-o ao teste de suspensão básico
e teste de suspensão simulando in vitro algumas
condições práticas de uso.
MATERIAL E MÉTODO
Amostra vegetal
Amostras foram colhidas no ano de 2003 de
vegetação espontânea na região metropolitana de
Porto Alegre RS/BR. A região localiza-se na latitude
30”01’39”, longitude 51”13’40” e a uma altitude de 4,71
m. Foi organizada esxicata e identificação botânica,
sendo incluída no herbário do Instituto de Biociências
da Universidade Federal do Rio Grande do Sul sob o
número ICN 122.196. As amostras foram secas à
sombra, e armazenadas em local protegido da luz e
da umidade.
O decocto
A solução das partes aéreas da planta (caule,
folhas e flores) obteve-se por extração a quente, na
forma decocto. O processo de decocção procedeuse conforme Farmacopéia (1959), esgotando a planta
fragmentada em água destilada, na proporção 1 g:10
mL, levada à ebulição em fogo brando por 15 minutos
em frasco Erlenmeyer (com boca coberta),
recompondo-se o volume inicial perdido pela
evaporação.
Rev. Bras. Pl. Med., Botucatu, v.10, n.1, p.64-69, 2008.
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Amostra bacteriana
Foi usada a amostra padronizada
Staphylococcus aureus ATCC 6.538, por ser esta
referencia para avaliação de desinfetantes (Brasil,
1988; Fundação Oswaldo Cruz, 1997). A dose
infectante na cultura com 18 - 24 h foi de 3,1 x 109
UFC mL-1. Para o teste a cultura foi diluída (Neder,
1992) em oito diluições logarítmicas, sendo que cada
experimento somente era validado se ao final da linha
de diluição (10-8 UFC mL-1) houvesse crescimento
bacteriano.
O método e as técnicas
O método para avaliação da atividade
antibacteriana foi o de diluição, com técnicas do teste
de suspensão padronizado para verificação da
atividade desinfetante (Brasil, 1993; Reybrouck, 1998;
CEN, 1999). Modificação foi introduzida na técnica
original, confrontando o decocto com 8 diluições (10-1
a 10-8 UFC mL-1) do inóculo (Avancini et. al, 2000), ao
invés de uma única e elevada dose infectante.
Para o teste de suspensão básico 8 tubos
de ensaio foram preenchidos com 9 mL do decocto,
sendo em cada um deles adicionado 1 mL da diluição
logarítmica do inóculo. Foram usados controles de
contaminação do decocto e crescimento bacteriano.
Nos tempos de contato 5, 15, 30 e 60 minutos,
utilizando-se alça bacteriológica, uma alíquota era
transferida para tubos de ensaio contendo 1 mL de
BHI (Oxoid® - Código: CM225B). Esta infusão de
cérebro e coração era incubada em condições de
aeróbiose a 37oC, por 24 h, e observada presença ou
ausência de turvação. Deste modo, para cada diluição
e tempo de contato, os resultados foram qualificados,
respectivamente, como não inativação do inóculo, ou
diluição do inóculo inativada.
Simulando in vitro as condições práticas de
uso, nos testes de suspensão foram introduzidas as
matérias orgânicas 20% de soro bovino e de 20% de
leite integral (visando simular alta quantidade de
“sujeira”, no ambiente). Como suporte (simulação de
materiais e superfícies), foram usados recortes de
pano de algodão com 1 cm2 e o teste foi realizado do
mesmo modo como acima descrito, mas em placas
de Petri.
Foram feitas três repetições para cada
experimento e as médias obtidas pela análise
estatística descritiva.
RESULTADO E DISCUSSÃO
Na Tabela 1 podem ser observados os
resultados da eficácia do decoto de H. caprifoliatum
pelo teste de suspensão básico. Sem a presença de
matéria orgânica, o decocto promoveu a inativação
tanto da mais alta dose infectante da bactéria quanto
no menor fator tempo de contato.
No entanto, conforme comenta Bessems
(1998), na avaliação de aplicação do desinfetante ou
antisséptico também se devem levar em consideração
as condições ambientais onde ele será utilizado. Se,
por exemplo, em condições de ambiente limpo ou
sujo, se para saúde animal ou na indústria de
alimentos. Tendo essa observação, na avaliação da
eficácia e fatores condicionantes da atividade do
decocto de H. caprifoliatum foram introduzidos
material orgânico como soro e leite integral bovino,
que estão presentes em vários ambientes,
relacionados à saúde do homem e animal, bem como
no processamento de seus subprodutos.
Quando o decocto foi confrontado com o
inóculo na presença de matéria orgânica, os valores
de intensidade de inativação bacteriana reduziramse. Já Spaulding (apud Pianta & Wiest, 1986) anotou
este fenômeno, considerando a limpeza dos
instrumentos médicos e outros materiais a serem
desinfetados como fundamental para melhor atuação
de diversos produtos químicos pois matéria orgânica
como sangue, plasma e fezes, entre outras, podem
alterar as moléculas do desinfetante, tornando-o
inativo, ou servir de barreira mecânica de proteção
aos microrganismos. Em experimento mais recente,
Bessems (1998) fez semelhante verificação com
compostos halogênicos. Tendo adicionando ao meio
0,3% de albumina sérica bovina, observou que para
obter a mesma redução logarítmica de microrganismo
que na ausência de proteína a concentração desses
compostos e o tempo de contato necessário foi de,
pelo menos, o dobro.
Frente ao fator tempo de contato na presença
do soro bovino percebe-se que quanto maior o tempo
de contato maior a intensidade da atividade
antibacteriana, chegando a ser seis vezes maior com
60 minutos de contato do que com cinco minutos.
Segundo Bessems (1998), a influência do tempo de
contato no efeito antimicrobiano de desinfetantes é
frequentemente referida nos trabalhos científicos. Em
se usando uma concentração constante do
antimicrobiano no teste, seu efeito aumentaria com
o maior tempo de contato, o que coincide com o que
foi encontrado neste experimento.
Já na presença do leite, o decocto inativou o
S. aureus sempre com a mesma dose infectante,
sendo esta quatro vezes menor do que na ausência
de matéria orgânica e três vezes menor que na
presença do soro bovino. Uma possibilidade de
explicação para esse evento está em Brasil (1993),
que alerta para o fato de que em soluções aquosas o
leite integral oferece concentrações de matéria
orgânica bem maiores do que o soro bovino.
Os resultados indicam que foi válido
confrontar a planta frente à diversas doses infectantes
do inoculo, simulando diversas situações em
produção e saúde animal. Observando os resultados
Rev. Bras. Pl. Med., Botucatu, v.10, n.1, p.64-69, 2008.
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apresentados na Tabela 1, e mesmo os apresentados
na Tabela 2, se a confrontação ocorresse com única
dose infectante de 3,1x108 UFC mL-1, o resultado seria
a não atividade do decocto e a solução não teria
demonstrado potencialidade de uso em ambientes
menos contaminados. Para melhor compreensão
desse fenômeno recorre-se a Tortora et al. (2000),
quando explicam que a taxa de morte microbiana está
na dependência das suas características genotípicas,
do tempo de exposição mas também na da carga/
densidade populacional.
Sobre a interferência dos materiais das
superfícies na atividade dos desinfetantes ela referese principalmente à porosidade por eles apresentada,
o que favorece maior ou menor possibilidade dos
microrganismos permanecerem albergados e
protegidos. Por esse motivo entre os testes de
avaliação da atividade antimicrobiana de um produto,
assim como acontece com a introdução do fator
matéria orgânica, simula-se a superfície dos materiais
por meio de suportes.
Na Tabela 2 pode-se visualizar a intensidade
de inativação do decocto de H. caprifoliatum, na
presença do suporte pano de algodão.
Na presença do suporte a intensidade de
atividade de inativação frente ao S. aureus foi de
metade da dose infectante, quando comparado com
o contato direto do decocto com o inóculo. No teste
com suporte utilizando-se 20% de soro bovino
inativou-se dois logaritmos menos do que na
confrontação do decocto com a bactéria apenas na
presença do soro bovino. Já na presença do suporte
mais leite integral, o ambiente favoreceu
completamente a viabilidade biológica do inóculo.
Explicação possível para esses resultados refere-se,
além da presença de matéria orgânica, a grande
porosidade apresentada pelas fibras do tecido de
algodão, o que promove proteção mecânica dos
microrganismos. Reforça esta explicação relato de
experimento (W iest, 1984) com desinfetantes
convencionais na concentração de 5%, no qual amostra
de Staphylococcus sobreviveu mesmo após 120 minutos
de contato quando albergado em suporte de madeira.
Considera-se que diferentes resultados
obtidos entre os testes são coerentes se comparados
com os de outros estudos com produtos químicos
convencionais. Por exemplo, Fotheringhan (1995),
relatando sobre a eficácia antimicrobiana de
desinfetantes, informa que enquanto algumas
avaliações apresentam resultados similaridades entre
o teste de suspensão básico, os testes de simulação
em laboratório e os testes “de campo”, outras têm
resultados muito diferentes entre os testes exigindo
concentrações até dez ou mais vezes superiores para
obterem os mesmos resultados.
A presente pesquisa foi tratada como uma
investigação preliminar do H. caprifoliatum, que devido
à atividade antibacteriana por ele apresentada visase a possível utilização de seu decocto como
desinfetante em sanidade animal. Entende-se ser
necessário aprofundar o conhecimento sobre esta
solução, como pelo mesmo teste confronta-la com
outros microrganismos (inclusive eucariotos) além de
analisar a composição química ativa para essa
atividade biológica bem como o seu mecanismo de
ação.
TABELA 1. Dose infectante de Staphylococcus aureus ATCC 6.538 inativada pelo decocto de Hypericum caprifoliatum
Cham. e Schlechtl. - Guttiferae, usado teste de suspensão com quatro tempos de contato.
-1
Teste de Suspensão
básico
5 min
8
3,1x10
com 20% de soro bovino
3,1x10
com 20% de leite integral
3,1x10
UFC mL
15 min
30 min
8
8
3,1x10
3,1x10
1
3,1x10
3
3,1x10
2
3,1x10
2
3,1x10
60 min
8
3,1x10
5
3,1x10
6
2
3,1x10
2
TABELA 2. Dose infectante de Staphylococcus aureus ATCC 6.538 inativada pelo decocto de Hypericum caprifoliatum
Cham. e Schlechtl. - Guttiferae, usado teste de suspensão com suporte em quatro tempos de contato.
-1
UFC mL
15 min.
30 min.
3
4
3,1x10
3,1x10
Teste de Suspensão
suporte
5 min.
3
3,1x10
com 20% de soro bovino
3,1x10
3,1x10
3,1x10
3,1x10
com 20% de leite integral
n.a
n.a
n.a
n.a
1
1
2
n.a.= não atividade.
Rev. Bras. Pl. Med., Botucatu, v.10, n.1, p.64-69, 2008.
60 min.
4
3,1x10
4
68
CONCLUSÃO
Verificou-se que a dose infectante bacteriana
inativada pelo decocto de H. caprifoliatum no teste
de suspensão com ausência de matéria orgânica foi
superior a inativada nos testes de suspensão com
matéria orgânica e nos testes com suporte. Esse
resultado indica que, na proporção planta:volume
usada, deve ser melhor a eficácia de aplicação do
decocto em ambientes limpos e superfícies não
porosas. Também, a intensidade de inativação do
inóculo confrontado foi, na maior parte das vezes,
mais intensa conforme aumentava o tempo de contato
do decocto com o inóculo. Estes resultados são
coerentes quando comparados com estudos
realizados com produtos químicos antimicrobianos/
desinfetantes convencionais.
Os resultados obtidos sugerem a
continuidade da investigação para a possível utilização
deste decocto como antimicrobiano/desinfetante em
determinadas situações-problemas em saúde, com
possibilidades e limites relacionando ao agente
transmissível e aos fatores matéria orgânica e suporte
estudados.
AGRADECIMENTO
A Sr a Maria Nunes, pela acolhida e
participação nesta atividade.
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