MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
SECRETARIA DE EDUCAÇÃO MÉDIA E TECNOLÓGICA
CENTRO FEDERAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA DE BENTO GONÇALVES
CURSO SUPERIOR DE TECNOLOGIA EM VITICULTURA E ENOLOGIA
DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES SOMÁTICOS DE BRS CLARA EM DIFERENTES
MEIOS DE CULTURA
VALÉRIA AQUINO CANTERLE
Bento Gonçalves
2007
VALÉRIA AQUINO CANTERLE
DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES SOMÁTICOS DE VIDEIRA BRS CLARA EM
DIFERENTES MEIOS DE CULTURA
Monografia apresentada como um dos
requisitos para a conclusão do Curso
Superior de Tecnologia em Viticultura e
Enologia
Orientador: Eduardo Giovannini
Supervisora: Regina Beatriz Bernd
Bento Gonçalves
2007
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me acompanhar nos momentos difíceis e por ter me permitido
chegar até aqui.
A minha família e amigos, que sempre compartilharam comigo meus sonhos,
vitórias e derrotas, alegrias e tristezas, incentivando-me a prosseguir a jornada,
independente dos obstáculos. A eles, que mantiveram-se sempre ao meu lado,
dedico essa conquista com a mais profunda admiração e gratidão.
Aos mestres, por compartilharem comigo suas próprias experiências. O meu
sincero agradecimento pela orientação constante, pelo auxílio nas lutas e por não se
limitarem a ser apenas professores.
“O que importa de verdade na vida não são os objetivos a que nos propomos,
mas os caminhos pelos quais seguimos para consegui-los”. (Peter Bamm)
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 6
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................... 8
2.1 CARACTERIZAÇÃO DA CULTIVAR BRS CLARA ............................................. 8
2.2 EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA E REGENERAÇÃO DE PLANTAS
8
3 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 12
3.1 CONDUÇÃO DO EXPERIMENTO E VARIEDADE........................................... 12
3.2 TRATAMENTOS ............................................................................................... 13
3.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E ANÁLISE ESTATÍSTICA...................... 13
3.4 VARIÁVEIS ANALISADAS ............................................................................. 14
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 15
CONCLUSÃO............................................................................................................ 19
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 20
5
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Médias dos valores das avaliações de reatividade dos explantes ao meio
de cultura, formação de raízes, formação de folhas e regeneração de plantas por
tratamento .................................................................................................................15
Tabela 2 – Freqüências observadas e relativas (%) de reatividade dos explantes ao
meio de cultura, formação de raízes, formação de folhas e regeneração de plantas
por tratamento ...........................................................................................................17
1 INTRODUÇÃO
A viticultura mundial está concentrada em regiões de clima temperado, porém é
uma atividade com grande potencial para as regiões tropicais. No Brasil, a cultura da
videira situa-se entre os paralelos 9oS e 32oS. As uvas de mesa constituem em
grande oportunidade para cultivo sob condições tropicais. No Vale do São Francisco
esta atividade já tem uma certa tradição, porém ressente-se de cultivares com alto
valor mercadológico (apirênicas) e adaptadas às condições regionais.
A falta de cultivares de uvas sem sementes (apirênicas) adaptadas às condições
fitossanitárias e ambientais do Brasil, além de limitar a capacidade de exportação da
fruta in natura, afeta a competitividade da uva brasileira, também no mercado
interno, aberto à comercialização de uvas importadas (Mello, 2002).
As moléstias fúngicas constituem em um dos principais problemas fitossanitários
em todas as regiões produtoras de uva do Brasil, onde as condições climáticas são
favoráveis ao desenvolvimento de fungos. O controle destes pode atingir 30% do
custo da uva (Grigoletti e Sônego, 1993).
Os mecanismos de controle utilizados para impedir as infecções por fungos
envolvem, na sua maior parte, pulverizações repetidas de produtos químicos
combinados com as práticas de manejo do dossel. O uso de produtos químicos, se
repetido regularmente, pode induzir resistência na população de patógenos. Além
disso, a aplicação de produtos químicos está se tornando cada vez mais indesejável
e um número crescente de consumidores prefere produtos mais saudáveis e
naturais. Os efeitos adversos, a longo prazo, de agrotóxicos no ambiente ainda não
são conhecidos (Vivier,1999).
Ao lançar as três primeiras cultivares brasileiras de uva sem semente (BRS
Clara, BRS Linda e BRS Morena), a Embrapa Uva e Vinho deu um passo importante
para assegurar a competitividade, a sustentabilidade e a independência tecnológica
da viticultura de mesa nas regiões tropicais e subtropicais do Brasil (Camargo et al.,
2003a, 2003b, 2003c).
7
No entanto, a busca de novas cultivares com características agronômicas que
atendam as demandas da cadeia produtiva da viticultura brasileira é um desafio
constante.
O melhoramento genético de plantas através da transformação genética surge
como uma nova alternativa para o controle de moléstias fúngicas na cultura da
videira. A incorporação de genes de interesse em plantas por técnicas da
engenharia genética tem grande potencial para a melhoria da videira (Gutoranov,
2001).
Através da transformação genética de plantas, pode-se transferir um único gene,
mantendo as características da cultivar inalteradas. Seria difícil conseguir resultado
similar por métodos convencionais devido ao genótipo altamente heterozigótico
(Franks et al., 1998).
Para o sucesso da engenharia genética, a regeneração de plantas a partir de
células ou tecidos somáticos é um pré-requisito necessário. Entre os dois caminhos
de regeneração existentes, a organogênese in vitro foi considerada imprópria para a
transformação, enquanto a embriogênese in vitro tem sido usada com sucesso
(Torregrosa, 1998).
Aumentar a eficiência da regeneração de plantas a partir de embriões somáticos
produzidos via embriogênese somática constitui um ponto importante para o sucesso
da transformação genética da videira.
Este trabalho apresenta as atividades desenvolvidas no Laboratório de Cultura
de Tecidos da Embrapa Uva e Vinho com objetivo de avaliar o desenvolvimento de
embriões somáticos da cultivar BRS Clara em meios de regeneração de plantas,
avaliar a formação de raízes, desenvolvimento da parte aérea, bem como avaliar
diferentes estádios de desenvolvimento do embrião no processo de regeneração de
plantas.
8
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 CARACTERIZAÇÃO DA CULTIVAR BRS CLARA
A cultivar BRS Clara foi obtida através do cruzamento entre as cultivares
CNPUV 154-147 e Centennial Seedless, através do método clássico de
melhoramento, realizado em 1998, na Estação Experimental de Viticultura Tropical
EEVT, da Embrapa Uva e Vinho, em Jales, SP.
Caracteriza-se por ser uma cultivar vigorosa e fértil, adaptada ao cultivo nas
condições tropicais, onde foi testada. Apresenta um ou dois cachos por ramo, sendo
que o primeiro atinge cerca de 500 a 600 gramas. Com manejo adequado, produz
facilmente 30 toneladas/hectare/ano nas regiões de Jales e de Pirapora (duas podas
e uma colheita) e no Vale do São Francisco (duas colheitas de 15 ton/ha/ano).
Em relação às moléstias fúngicas, esta cultivar apresenta comportamento
similar à cv. Itália, devendo ser adequadamente protegida, com atenção para o
Míldio (Plasmopara viticola).
2.2 EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA E REGENERAÇÃO DE PLANTAS
Embriogênese somática, adventícia ou assexual são termos usualmente
empregados para designar o processo pelo qual células haplóides ou somáticas
desenvolvem-se por meio de diferentes estádios embriogênicos, dando origem a
uma planta, sem que ocorra fusão de gametas (Williams e Maheswaran, 1986).
Esta técnica foi descrita pela primeira vez por Steward et al (1958) e Reinert
(1958), em cenoura. Atualmente é relatada em mais de 300 espécies.
A embriogênese somática é um método importante de propagação de plantas
in vitro. Também é uma estratégia para estudos básicos relacionados com a
fisiologia de desenvolvimento do embrião, apresentando facilidade de manipulação
experimental em relação a embriões zigóticos, já que estes precisam ser localizados
9
no saco embrionário. A embriogênese somática vem sendo utilizada para a
produção de plantas transgênicas e sementes sintéticas (Schultheis et al., 1990).
A embriogênese somática constitui um exemplo da expressão da totipotência
das células das plantas, ou seja, qualquer célula contém informações genéticas
necessárias e pode regeneração de uma planta completa (Krikorian e Berquam,
1969).
Em geral, quase todas as partes da planta podem ser usadas como explante
inicial na indução da embriogênese somática: ápices caulinares, discos foliares,
segmentos foliares, inflorescências e raízes, dentre outros (Chu et al, 1984).
O padrão de desenvolvimento de um embrião somático em dicotiledôneas
apresenta muitas características morfológicas semelhantes a do embrião zigótico.
Inicialmente, ambos são caracterizados pela diferenciação de uma estrutura bipolar,
constituída de ápice caulinar e radicular. Ambos passam pelos estádios de
desenvolvimento pró-embrionário: globular e embrionário: cordiforme, torpedo e
cotiledonar.
Dois padrões básicos de expressão da embriogênese somática ocorrem in
vitro. O primeiro corresponde ao modelo direto, no qual os embriões somáticos
originam-se dos tecidos matrizes sem a formação de estádios intermediários de calo.
(Guerra & Handro, 1991). O segundo padrão corresponde ao modelo indireto, no
qual os embriões somáticos se formam a partir de um calo, que apresenta células
em distintos estágios de diferenciação, as quais podem adquirir novas competências
mediadas por mensageiros químicos específicos (Steward et al, 1958).
Na maioria dos modelos de embriogênese induzida in vitro, as auxinas e entre
elas o ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), são consideradas as substâncias
responsáveis por desencadearem os processos de diferenciação e desdiferenciação
(modelos indiretos) alterando determinação e conferindo novas competências às
células responsivas presentes nos explantes.
Uma vez que cada clone apresenta características únicas, determinadas por
fatores genéticos, as necessidades para seu cultivo in vitro parecem estar
associadas não apenas ao genótipo, mas também à atividade fisiológica na plantamatriz, sob o controle de diversos fatores endógenos. O verdadeiro desafio,
portanto, está no material vegetal e na sua manipulação antes de excisar o explante
inicial, e em todos os passos até o transplantio da planta produzida. Esta
10
manipulação inclui o manejo da planta matriz, as características do explante
utilizado, o procedimento da subcultura adotado, as condições ambientais e
microambientes dentro do frasco de cultura e o transplantio. Todas essas etapas são
influenciadas por diversas variáveis imponderáveis, que frequentemente restringem
a repetição dos resultados e dificultam a determinação de um protocolo efetivo de
micropropagação (Torres et al. 1998).
Cada espécie vegetal, ou mesmo diferentes genótipos dentro de uma mesma
espécie, tem diferentes exigências nutricionais e hormonais para sua regeneração.
O agente e a metodologia de seleção a serem utilizados também dependem do tipo
de explante e do genótipo estudados.
Mesmo para espécies cujos protocolos de regeneração e transformação já
estejam estabelecidos, sua reprodução em outras condições de laboratório nem
sempre é possível. Assim, o domínio da regeneração é um problema geral, qualquer
que seja a espécie vegetal considerada, existindo ou não uma metodologia de
transformação previamente descrita.
Os principais fatores que afetam a indução de embriogênese somática são:
o explante, o genótipo, a composição química do meio nutritivo (sais minerais,
carboidratos, reguladores de crescimento), concentração osmótica e as condições
físicas.
O meio de cultura pode ser definido como uma formulação entre sais
inorgânicos e compostos orgânicos requeridos para a nutrição e manipulação das
culturas. Existem numerosas formulações, cada uma delas compreende entre 6 e 40
compostos. Os meios de cultura se compõem de uma fonte de carbono, nutrientes
minerais, substâncias vitamínicas, substâncias reguladoras de crescimento, agente
gelificante (em caso de meio semi-sólido), entre outros compostos.
Praticamente todos os cultivos são heterotróficos e por isso necessitam de
uma fonte de carbono. A sacarose é a mais utilizada. O myo-inositol pode ser
incorporado em meios de cultura resultando em um melhor crescimento dos cultivos.
Os macro e micronutrientes compreendem altas concentrações de
nitrogênio, na forma de íon amônio ou nitrato de potássio. O ferro é incorporado
conjuntamente com um agente quelante (Na2EDTA), que se faz disponível em ampla
faixa de pH.
11
Entre as substâncias vitamínicas, a tiamina é a única indispensável para o
bom crescimento das culturas. Também incorporara-se ácido nicotínico, piridoxina
HCl, Glicina.
Os reguladores de crescimento comumente usados são as auxinas (ácido
naftalenoacético - ANA, ácido 2,4-diclorofenoxiacético - 2,4-D, ácido indolacético AIA, ácido indol-butírico - IBA, ácido β-naftoxiacetico - NOA, Dicamba e Picloram),
as citocininas (Benzilaminopurina – BA e Thiadizurón) e as giberelinas,
especialmente o ácido giberélico.
Entre os agentes gelificantes mais utilizados em meios semi-sólidos são: o
ágar, o agargel, o transfergel, o phytagel, a agarose e a gelrite.
Muitas outras substâncias de variada composição química são adicionadas
ao meio de cultura. O carvão ativado pode ser incorporado ao meio para a absorção
de metabólitos tóxicos ao cultivo. Em alguns casos é necessário adicionar
antioxidantes (L-cisteína, ácido ascórbico, polivinilpirrolidona) para prevenir o
escurecimento do tecido causado pela oxidação de polifenóis presentes nos
explantes.
Entre as condições físicas pode-se mencionar os efeitos da temperatura:
quanto mais próximas das ótimas para a espécie, maior será a resposta esperada; a
umidade relativa: sua queda pode promover uma perda de água do meio, variando a
concentração de seus compostos até chegar a níveis tóxicos; luminosidade: deve
ser avaliada quanto à qualidade, intensidade e tempo de administração. A luz
favorece a diferenciação de órgãos. (Echenique e Rubinstein, 2004).
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 CONDUÇÃO DO EXPERIMENTO
Os embriões somáticos da cultivar BRS Clara foram obtidos a partir de: Flores
jovens (10 dias antes da antese) desta cultivar, as quais foram removidas de estacas
cultivadas em câmara de nebulização. Cada flor foi retirada da haste principal da
inflorescência, a fim de que todas flores fossem igualmente esterilizadas.
A esterilização superficial procedeu-se com a imersão das flores em solução
de hipoclorito de sódio 30% e Tween (1 gota/100 ml), detergente utilizado para a
quebra de tensão superficial da flor, durante 10 minutos. Após realizaram-se 3
lavagens consecutivas com água destilada estéril em ambiente asséptico.
As anteras foram removidas sob microscópio estereoscópio em câmara de
fluxo laminar horizontal. As flores foram abertas na parte superior ao cálice (na
inserção com a corola) e as anteras retiradas com o filete. As mesmas foram
inoculadas em placa de Petri (100 x 20mm) contendo meio de cultura inicial (PIV)
para indução de calogênese, com o filete voltado para cima.
O meio PIV foi utilizado segundo o protocolo de Franks et al.(1998) e possui
macronutrientes de Nitsch e Nitsch (1969), micronutrientes e FeEDTA de Murashige
e Skoog (1962), vitaminas de Gamborg et al (1968), 6% de sacarose, caseína
hidrolisada (1g/L), agente gelificante Gelrite® (Sigma), reguladores de crescimento
2-4D (ácido 2,4 – diclorofenoxiacético) e BAP (benzilaminopurina).
Após a inoculação em meio inicial, as anteras foram mantidas em sala de
cultura com temperatura 24 a 28°C, no escuro. Durante o período de indução da
calogênese, os explantes foram mantidos no mesmo meio, sendo transferidos para
novo meio de cultura a cada 30 dias. As avaliações para verificar a formação de
calos foram feitas a cada repicagem.
Os calos com diâmetro superior a dois milímetros foram transferidos para meio
GS1CA, de Franks et al.(1998) mantidos nas mesmas condições de temperatura e
luminosidade. Esse procedimento foi utilizado para o desenvolvimento dos calos e
13
posterior formação de embriões somáticos. Estes embriões foram individualizados,
com auxílio de instrumentos cirúrgicos (pinças e bisturís estéreis) e separados de
acordo com seu estádio de desenvolvimento.
Depois de individualizados, foram transferidos em número de 20 por placa de
Petri para os diferentes meios de regeneração de plantas.
3.2 TRATAMENTOS
Os tratamentos foram compostos por 2 fatores:
Fator 1: Meio de regeneração de plantas
- Murashige e Skoog (1962) -MS ½ sais;
- Murashige e Skoog (1962) com vitaminas do complexo vitamínico B5 de
Gambog et al.(1968) - MS ½ sais e B5 vitaminas;
- Galzy (1964) - Galzy;
- Woody Plant Medium de Lloyd e McCown (1986)-WPM
Todos os meios de cultura foram preparados com adição de 3% de sacarose,
0,6% de ágar, pH 5.7, e expostas a fotoperíodo de 16 horas de luz e temperatura de
26°C.
Fator 2: Estádio de desenvolvimento do embrião
- Estádio imaturo, com predominância de estádios iniciais do tipo globular;
- Estádio maduro, com predominância de estádios mais desenvolvidos do tipo
torpedo;
3.3 DELINEAMENTO E ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os tratamentos do fator 1, meios de regeneração de plantas, foram
combinados com os tratamentos do fator 2, estádio de desenvolvimento do embrião,
em um delineamento fatorial 4x2, correspondendo a 8 tratamentos. Cada tratamento
com 5 repetições.
Cada placa constituiu uma parcela, sendo cada uma composta por 20
embriões, o que resultou em 40 placas úteis para o experimento. Os respectivos
tratamentos foram distribuídos aleatoriamente sobre 800 embriões de acordo com o
delineamento inteiramente casualisado.
14
Foram feitas repicagens para novos meios aos 30 e 60 dias de cultura. Os
embriões foram avaliados aos 60 dias de cultivo.
Os tratamentos foram submetidos à análise de variância e as médias foram
comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Desta forma, os tratamentos são os seguintes:
T1 - MS ½ sais maduro
T2 - MS ½ sais imaturo
T3 - MS ½ sais e B5 vitaminas maduro
T4 - MS ½ sais e B5 vitaminas imaturo
T5 - Galzy maduro
T6 - Galzy imaturo
T7 - WPM maduro
T8 - WPM imaturo
3.4 VARIÁVEIS ANALISADAS
-
Formação de raízes ou radículas a partir do embrião.
-
Formação de folhas a partir do embrião.
-
Regeneração de plântulas inteiras. Conjunto entre formação de raízes,
parte aérea e desenvolvimento de folhas.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados de regeneração de plantas obtidos no meio de cultura WPM
foram significativamente maiores do que os verificados nos demais meios de cultura.
Estes resultados diferem daqueles obtidos por Amaral et al. (2001), com embriões
zigóticos, que obteve 15% de embriões regenerados neste meio. O observado neste
trabalho foi uma taxa de, aproximadamente, 33% de regeneração de plantas para o
meio de cultura WPM (Tabela 1).
Tabela 1 – Médias dos valores das avaliações de reatividade dos explantes ao meio
de cultura, formação de raízes, formação de folhas e regeneração de plantas por
tratamento
•
Tratamentos
Raízes
Folhas
Regeneração
T1-MS maduro
6,2 b
4,0 b
4,0 ab
T2-MS imaturo
6,0 b
2,6 b
1,4 b
T3-MS e B5 maduro
16,4 a
3,6 b
3,6 ab
T4-MS e B5 imaturo
14,0 a
0,8 b
0,8 b
T5-Galzy maduro
6,4 b
4,0 b
4,0 ab
T6-Galzy imaturo
6,2 b
3,6 b
1,0 b
T7-WPM maduro
7,8 b
12,4 a
6,6 a
T8-WPM imaturo
7,8 b
10,8 a
1,8 b
Médias seguidas por mesma letra na coluna não diferem significativamente entre si
pelo teste de a Tukey 5% de probabilidade. Não significativo.
Para a obtenção de plantas provenientes de cruzamento entre genitores
apirênicos, videiras que produzem frutos com ausência de sementes, Amaral et al.
(2001) fez o cultivo in vitro de embriões zigóticos em meio de cultura Woody Plant
(WP), de Lloyd e McCown (1986), modificado pelo acréscimo de 0,65% de ágar, 3%
de sacarose, 0,3% de carvão ativado e suplementado com BAP (Benzilaminopurina)
1uM. Estes embriões foram mantidos em sala de crescimento com controle de
16
temperatura (26°C), fotoperíodo de 16 horas de luz, por um período de 1 a 3 meses
até desenvolverem plântulas.
Amaral et al. (2001) ainda sugere subcultivar em meio Galzy (1964) as
plantas que não apresentarem desenvolvimento normal, tais como aquelas
parcialmente albinas, com cotilédones hiperhidratados, com deformidades nas folhas
ou no sistema radicular. Conforme Oliveira et al. (1994), este subcultivo possibilitou a
recuperação das partes da planta com germinação anormal, o que pode ser
atribuído às características do meio nutritivo, reconhecido pela eficácia com que
promove enraizamento e desenvolvimento da videira in vitro.
Conforme Torregrosa (1998), para executar a técnica da engenharia
genética em videira, a regeneração de plantas completas através de células ou
tecidos somáticos é um pré-requisito fundamental. Para a regeneração de plantas
das cultivares de Vitis vinifera Portan, Danuta, Syrah e Ugni Blanc, o autor sugere
transferir os embriões somáticos para meio MS (Murashige e Skoog, 1962) com
metade dos sais, sem a utilização de reguladores de crescimento e expostos às
seguintes condições de cultura: fotoperíodo de 15 horas, temperatura 26°C,
humidade 70%. Usualmente, 50 a 70% dos embriões somáticos transferidos para
estas condições de germinação, tiveram um desenvolvimento normal suficiente para
promover a micropropagação de plantas.
Para a regeneração de plantas de videira, Franks et al (1998) transferiu
embriões somáticos da cultivar Vitis vinifera Sultana para meio de regeneração com
com macroelementos, microelementos, FeEDTA de MS (Murashige e Skoog, 1962),
B5 Vitaminas (Gamborg et al, 1968), 1,5% de sacarose. Nas primeiras 4 semanas
com carvão ativo e sem reguladores de crescimento, para estimular a germinação.
Após iniciarem a germinação, os embriões foram transferidos para mesmo meio,
com adição de 10 uM de BAP e sem carvão ativo, sob iluminação para estimular a
brotação. Uma vez iniciada a brotação, os embriões foram transferidos para mesmo
meio de cultura contendo 0,5 uM de ANA (ácido naftalenoacético) para estimular o
desenvolvimento de raízes.
Conforme Scorza et al. (1995), embriões somáticos formados a partir de
embriões zigóticos de Vitis vinifera Thompson Seedless, após a transformação
genética, foram transferidos para meio de indução da germinação, WP (Lloyd e
17
McCown, 1981) com 1,5% de sacarose, 1 uM de BAP, 0,3% de carvão ativado e
0,75% de ágar conforme o protocolo de Emershad e Ramming (1994).
A associação de meio de cultura e o estádio de desenvolvimento do embrião
apresentou resultado com diferença significativa no teste de médias para
regeneração de plantas apenas para o meio WPM. Os estádios mais desenvolvidos
do embrião (T7, maduro) apresentaram maior desenvolvimento do que o verificado
em embriões menos desenvolvidos (T8, imaturos). Os embriões maduros
apresentaram
33%
de
regeneração
enquanto
que
os
embriões
imaturos
apresentaram 9% de regeneração, aproximadamente. (Tabela 2).
Tabela 2 – Freqüências observadas e relativas (%) de reatividade dos explantes ao
meio de cultura, formação de raízes, formação de folhas e regeneração de plantas
por tratamento
Tratamentos
Raízes
Folhas
Regeneração
T1-MS maduro
31
20
20
T2-MS imaturo
30
13
7
T3-MS e B5 maduro
82
18
18
T4-MS e B5 imaturo
70
4
4
T5-Galzy maduro
32
20
20
T6-Galzy imaturo
31
18
5
T7-WPM maduro
39
62
33
T8-WPM imaturo
39
54
9
O fato de os embriões em estádio de desenvolvimento mais avançados serem
mais eficientes em regenerar plantas, pode estar relacionado com as menores
exigências em balanço nutricional dos meios de cultura e ao tempo de permanência
em cultura. Ramming (1990) se referiu à necessidade de meios mais complexos
quanto menores e mais imaturos os embriões e de uma simulação in vitro das
condições encontradas no interior da semente.
Da mesma forma, Raghavan (1976) distinguiu duas fases no desenvolvimento
do embrião, com necessidades diferenciadas para o cultivo in vitro. Na primeira fase,
heterotrófica, as exigências para o desenvolvimento do embrião seriam maiores, na
18
segunda, autotrófica, o embrião se caracterizaria por não depender mais de fontes
exógenas de reguladores de crescimento.
Nos demais tratamentos não foram observadas diferenças significativas no
teste de médias.
Na formação de folhas e desenvolvimento da parte aérea verificou-se
superioridade do meio de cultura WPM, como pode ser observado nos tratamentos 7
e 8 da tabela 1, em relação aos demais tratamentos, na média do experimento. O
meio WPM proporcionou a formação de folhas em 62% dos embriões, enquanto que
nos demais, esta taxa não ultrapassou 20%.
A formação de raízes observada no meio de cultura MSB5 (tratamentos 3 e 4,
Tabela 1), foi significativamente maior em relação aos demais tratamentos. Este
meio de cultura proporcionou o desenvolvimento de raízes em até 82% dos
embriões, enquanto que nos demais tratamentos esta taxa não ultrapassou 39%.
Verificou-se neste trabalho uma relação entre o desenvolvimento da parte
aérea e a formação de raízes. Há maior dificuldade para a planta desenvolver a
parte aérea quando a raíz se encontra formada, como pode ser observado nos
tratamentos 3 e 4, nos quais houve o desenvolvimento da raiz em até 82% enquanto
que para os mesmos tratamentos a taxa de formação de folhas não ultrapassou
20%.
5 CONCLUSÃO
O meio de cultura Woody Plant medium mostrou-se eficiente no processo de
regeneração de plantas de BRS Clara. Este meio de cultura também apresentou
resultados com diferença significativa na formação de folhas e desenvolvimento da
parte aérea nas condições estabelecidas para este experimento.
A
formação
de
raízes
observada
no
meio
de
cultura
MSB5
foi
significativamente maior em relação aos demais tratamentos.
Os
estádios
mais
desenvolvidos
do
embrião
apresentaram
maior
desenvolvimento do que o verificado em embriões menos desenvolvidos. Os
embriões maduros apresentaram 33% de regeneração enquanto que os embriões
imaturos apresentaram 9% de regeneração, aproximadamente.
4 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AMARAL, A. L.; OLIVEIRA, P. R. D.; CZERMAINSKI, A. B. C.; CAMARGO, V. A.
Estádios de desenvolvimento de embriões na obtenção de plantas em cruzamentos
entre genitores apirênicos de videira. Revista Brasileira de fruticultura.
Jaboticabal, v. 23, n. 3, p. 647-651, 2001.
CAMARGO, U.A.; NACHTIGAL, J.C.; MAIA, J.D.G.; OLIVEIRA, P.R.D.; PROTAS,
J.F.S. 2003a. BRS Clara – Nova cultivar de uva branca de mesa sem semente.
Embrapa Uva e Vinho, Comunicado Técnico 46.
CAMARGO, U.A.; NACHTIGAL, J.C.; MAIA, J.D.G.; OLIVEIRA, P.R.D.; PROTAS,
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Embrapa Uva e Vinho, Comunicado Técnico 46.
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Embrapa Uva e Vinho, Comunicado Técnico 46.
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