Gabriela da Silva Dias
Análise proteômica da variação individual em
venenos de filhotes de Bothrops jararaca
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-graduação em Toxinologia do
Instituto Butantan, para obtenção do
título de Mestre em Toxinologia.
São Paulo
2013
Gabriela da Silva Dias
Análise proteômica da variação individual em venenos de
filhotes de Bothrops jararaca
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-graduação em Toxinologia do
Instituto Butantan, para obtenção do
título de Mestre em Toxinologia.
Orientadora: Solange Maria de Toledo
Serrano
São Paulo
2013
FICHA CATALOGRÁFICA
Dias, Gabriela
Análise proteômica da variação individual em venenos de filhotes de
Bothrops jararaca/Gabriela da Silva Dias/ orientadora: Solange Maria de Toledo
Serrano. – São Paulo, 2013
143 fls. : il. color. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação
em Toxinologia. Instituto Butantan, 2013
1. Bothrops. 2. Veneno de Serpente. 3. Proteômica 4. Filhotes. 5. Variabilidade
Individual. I. Orientadora: de Toledo Serrano, Solange Maria. II. Programa de PósGraduação em Toxinologia. Instituto Butantan. III. Título.
CDC 615.9
Elaborada com instruções fornecidas pela Biblioteca do Instituto Butantan
POS-GRADUAÇÃO EM TOXINOLOGIA
INSTITUTO BUTANTAN
RESULTADO DA DEFESA DE DISSERTAÇÃO
MESTRADO
NOME DO ALUNO(A): Gabriela da Silva Dias
DATA DO EXAME:.............../................ /.................
BANCA EXAMINADORA: Profs. Drs.
NOME
Assinatura
________________________
(Presidente)
______________________
________________________
________________________
Aprovado(a) Reprovado(a)
(
______________________
______________________
DECISÃO FINAL: APROVADO(A) (
)
)
(
)
(
)
REPROVADO(A)
(
(
)
(
)
(
)
)
Comentários da Banca (opcional):
Av. Vital Brasil, 1500 São Paulo,05503-­‐900 Tel/Fax: (11) 3726-­‐7222 r 2064 [email protected] http://posgrad.butantan.gov.br Dias G.S. 2013 AUTORIZAÇÃO PARA REPRODUÇÃO DO TRABALHO
Eu, Gabriela da Silva Dias, mestranda
pelo Programa de Pós-
Graduação em Toxinologia, autorizo a reprodução deste trabalho no site da
Secretaria da Saúde do Estado de São Paulo.
______________________________
Gabriela da Silva Dias
Aluna
______________________________
Solange de Maria Toledo Serrano
Orientador
Dias G.S. 2013 Dedicatória Aos meus pais que me ensinaram
a lição que nenhuma escola pode
ensinar, às minhas amadas irmãs,
Camila e Luciane, ao meu eterno
namorado
Alexandre
pequenas
Molly
e
e
minhas
Miney
(em
memória)
Dias G.S. 2013 Dedicatória À minha orientadora Dra. Solange
Maria de Toledo Serrano pela
oportunidade
aprendizado,
Zelanis
pela
grandiosa
e
ao
Dr.
impecável
e
André
co-
orientação.
Dias G.S. 2013 Agradecimentos Agradecimentos
Esse pequeno espaço jamais representará a imensa gratidão que existe no
meu coração para cada uma dessas pessoas citadas abaixo.
Primeiramente agradeço a Deus por sempre me abençoar e guiar meus
caminhos.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
À diretora do Laboratório Especial de Toxinologia Aplicada do Instituto
Butantan, Dra. Solange Maria de Toledo Serrano, que me deu essa grandiosa
oportunidade de conhecer o mundo da pesquisa científica e me abrir os
horizontes para o que é a vida.
Ao Programa de Pós Graduação em Toxinologia do Instituto Butantan e seus
funcionários: Kimie e Rosana.
Ao Dr. Hugo Armelin, diretor do CAT/cepid por permitir desenvolver o trabalho.
Aos membros da banca de qualificação, Dra. Ana Maria Moura da Silva
(Laboratório de Imunopatologia), Dr. Marcelo Santoro (Laboratório de
Fisiopatologia) e a Dr. Ida Shigueko (Laboratório de Fisiopatologia) pelas
sugestões, pelas críticas valiosas e elogios.
Ao Dr. André Zelanis, pela paciência e dedicação que teve desde quando eu
nem pensava em começar o mestrado até finalizar o mesmo.
Aos colegas do Laboratório de Herpetologia que forneceram gentilmente os
filhotes para que pudéssemos fazer a extração do veneno e desenvolver esse
projeto. Em especial ao Dr. Sávio Stefanini e a Dra. Marisa Rocha que
dispenderam um tempo precioso comigo.
Dias G.S. 2013 Agradecimentos À todos meus amigos do Laboratório Especial de Toxinologa Aplicada, Dr.
Alexandre Tashima, Dra. Aline Lopes, Dra. Amanda Asega, Debora Andrade,
Edson Takeshi, Eduardo Kitano, que me acolheram tão bem desde o primeiro
momento que entrei, e sem excessão, me ajudaram, apoiaram em todos os
momentos que passei por aqui e se tornaram uma agradável extensão da
minha casa.
À Dra Ana Helena que teve uma contribuição valiosa para esse projeto.
À Dra Milene Menezes pela amizade, carinho e risadas. À Msc Ana Karina
pela amizade, conselhos e inúmeras conversas. À Dra. Eliana Blini Marengo
pela doçura e Dra. Fernanda Bruni pela calma que transmite. E que juntas
fazem uma quinta feira ótima.
À Luciana Bertholim pela companhia no Alemão.
Aos funcionários da Laboratório Especial de Toxinoliogia Aplicada, em especial
Isaías, Zezé, Cissa e Dona Cida que me acompanham desde o começo.
Aos meus amigos da pós graduação, Hugo Vigerelli, Karina Kodama e Tarcísio
Liberato que dividiram comigo as angústias e alegrias do dia-a-dia na vida de
um estudante de pós graduação.
Aos meus pais, Nilo Dias e Eliete da Silva Dias por serem exemplos de vida e
por sempre me proporcionar mais do que poderiam.
Às minhas irmãs, Camila e Luciane que sempre estiveram presentes em todos
os momentos da minha vida dividindo sorrisos e lágrimas.
Ao meu namorado, Alexandre, por sempre me apoiar nas decisões difíceis e
incentivar meus estudos.
Dias G.S. 2013 Agradecimentos Aos meus padrinhos Eliane e Saulo, que sempre foram como segundos pais
pra mim. E a toda minha família que é meu alicerce de vida.
À minha prima-amiga querida Simone Beu.
Às minha amigas queridas Karen e Patrícia, que me acompanham desde a
época que não sabíamos das responsabilidades da vida.
À família do Alexandre: Zê, Sui, Fábio e Dona Almira que se tornou minha
família também.
Às amigas Jussara Santana, Paula Gouvêa e Fernanda Sasaki.
Dias G.S. 2013 Epígrafe “Ela acreditava em anjo e,
porque
acreditava,
eles
existiam”.
A Hora da estrela - Clarice
Lispetor
Dias G.S. 2013 Resumo RESUMO
DIAS G.S. Análise proteômica da variação individual em venenos de
filhotes de Bothrops jararaca. 2013. 144 fls. (Mestrado em Toxinologia) Programa de Pós-graduação em Toxinologia do Instituto Butantan, São PauloSP.
Venenos do gênero Bothrops causam, além de efeitos locais, efeitos
sistêmicos sobre os sistemas hemostático e cardiovascular. Mudanças
ontogenéticas, além de variações relacionadas ao sexo do animal, na
composição individual e atividades dos venenos de adultos, são características
frequentemente reportadas na literatura, entretanto, a variação na composição
individual de venenos de filhotes de serpentes deste gênero não é conhecida.
Para este estudo, o veneno de 21 filhotes de B. jararaca foi extraído e
estocado individualmente a -20°C até o uso. A quantificação de proteínas nos
venenos variou entre os indivíduos, porém a maioria apresentou valores de
110-120 mg/ml. Os perfis eletroforéticos foram analisados com e sem redução
das pontes de dissulfeto das proteínas e diversas diferenças foram visualizadas
entre os venenos. O perfil eletroforético dos venenos com coloração para
glicoproteínas mostrou sutis diferenças. A análise por Western blot utilizando
um anticorpo anti-bothropasina mostrou reconhecimento significativo, porém
variável, de bandas contendo metaloproteinases, na maioria dos venenos. Da
mesma forma, a análise utilizando o anticorpo anti-MSP1/MSP2, revelou
variação com relação às massas moleculares e intensidades das bandas
reconhecidas contendo serinoproteinases.
Considerando a importância da atividade proteolítica nos
envenenamentos, foram utilizados dois substratos diferentes para a
determinação dessa atividade: a proteína caseína, que pode ser degradada
tanto por serinoproteinases como metaloproteinases e o substrato sintético LBenzoil-Arginil-pNA
(L-BAPNA)
que
é
degradado
somente
por
serinoproteinases. Valores de atividade caseinolítica específica não
apresentaram variação expressiva entre os venenos, porém quanto à atividade
amidolítica sobre o substrato L-BAPNA os venenos mostraram
significantemente diferentes, e alguns deles não apresentaram atividade
enzimática sobre este substrato. Da mesma forma, a atividade coagulante
sobre o plasma humano, determinada pela Dose Mínima Coagulante, mostrouse bastante variável entre os indivíduos.
A análise dos venenos por cromatografia líquida acoplada a
espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) apresentou diferenças
significativas entre algumas amostras, contudo uma característica ubíqua foi a
presença do tripeptídeo <EKW em todos os venenos, um importante
tripeptídeo, que é inibidor de metaloproteinases.
O perfil eletroforético dos venenos, analisados com as proteínas
submetidas à redução de pontes de dissulfeto, mostrou significativa
variabilidade e a identificação de proteínas por digestão in gel com tripsina
seguida de análise por LC-MS/MS foi realizada com o objetivo de identificar
proteínas diferencialmente expressas nos venenos individuais de filhotes. Por
outro lado, a análise eletroforética comparativa dos venenos em condições não
Dias G.S. 2013 Resumo redutoras mostrou perfis individuais menos variáveis, quando comparados com
a análise com redução, e a identificação de proteínas presentes em uma região
do gel, que era semelhante entre os venenos, levou à identificação de
metaloproteinases, L-aminoácido-oxidase, e aminopeptidase, que seriam
toxinas comuns entre eles.
Em conjunto, os resultados deste estudo demonstram a expressiva
variabilidade individual nos venenos de filhotes de B. jararaca, fato que já
havia sido demonstrado em venenos individuais de adultos desta espécie, e
sugerem que a variação individual nos venenos está presente desde o
nascimento, não sendo um reflexo da ontogenia do animal. Estes achados
servem como subsídios para o entendimento das bases moleculares da
variabilidade de venenos de serpentes, sobretudo da B. jararaca.
Palavras-chave: Bothrops,
filhotes,variabilidade individual.
veneno
de
serpente,
proteômica,
Dias G.S. 2013 Abstract ABSTRACT
DIAS G.S. Analysis of the individual variation of the venom proteome of
Bothrops jararaca newborn specimens. 2013.144 p (Mestrado em
Toxinologia) - Programa de Pós-graduação em Toxinologia do Instituto
Butantan, São Paulo-SP.
Envenomation by Bothrops snakes cause local damage as well as
systemic, hemostatic and cardiovascular effects. Ontogenetic changes and
variations related to animal gender, composition and activities of individual
adult venoms are features commonly reported in the literature, however, the
variation in the composition of newborn snake venom is still unknown.
For this study, venom from 21 newborn specimens of B. jararaca was
milked and stored at -20°C until use. Protein quantification in the fresh venoms
varied among individuals however most of them showed values between 110
and 120 mg/ml. Venom electrophoretic profiles were analyzed under reducing
and non-reducing conditions and showed various differential protein bands
among the venoms. Glycoprotein staining showed some subtle variations in the
individual venom glycoproteomes. Comparison of the venoms by Western blot
analysis using an anti-metalloproteinase antibody (anti-bothropasin) showed
intense recognition of various protein bands, however their molecular masses
varied among the venoms. Likewise, recognition of serine proteinases in the
venoms by an anti-serine proteinase antibody (anti-MSP1/MSP2) revealed
bands of variable molecular masses in newborn venoms.
Considering the importance of the proteolytic activity in B. jararaca
accidents, two different substrates were used for measuring this activity: i)
casein, a protein that can be degraded by both metalloproteinases and serine
proteinases; ii) benzoyl-L-arginyl-pNA (L-BAPNA), a synthetic substrate which
is only degraded by trypsin-like serine proteinases. The caseinolytic activity did
not vary among the venoms, however, individual values of amidolytic activity
upon L-BAPNA were significantly different among the venoms and some of
them did not hydrolyze this substrate. Similarly, the coagulant activity was
assessed by the determination of the Minimum Coagulant Dose and showed
remarkable variability among the venoms.
Analysis of the venoms by liquid chromatography coupled to tandem
mass spectrometry (LC-MS/MS) showed significant differences between some
samples, however, an interesting finding was the ubiquitous presence in these
venoms of the tripeptide <E-K-W, which is an important inhibitor of venom
metalloproteinases. The electrophoretic profiles of proteins submitted to
reduction of disulfide bonds showed significant variability among the venoms
and identification of proteins by in gel trypsin digestion followed by LC-MS/MS
was carried out to identify proteins differentially expressed in the individual
newborn venoms. On the other hand, the electrophoretic profiles of venoms
analyzed under non-reducing conditions showed less individual variability and
the identification of proteins present in a region of the gel which contained a
broad protein band present in all venoms revealed the presence of
metalloproteinases, L-amino acid oxidase, and amino peptidase as common
components of these venoms.
Dias G.S. 2013 Abstract Taken together, the results of this study demonstrate the significant
individual variability in the venom of newborn B. jararaca specimens, a feature
that has also been shown in adult specimens of this snake. Moreover, the
findings of this work suggest that individual venom variability in B. jararaca exist
since very early animal age and is not a result of ontogenetic changes. These
findings can contribute for the understanding of the molecular basis of the
variability of snake venoms, especially in B. jararaca.
Keywords: Bothrops, snake venom, proteomics, newborn, individual
variability. Dias G.S. 2013 Lista de Figuras LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Serpente Bothrops jararaca filhote. ................................................... 11
Figura 2. Perfil eletroforético dos venenos de filhotes de B. jararaca (proteínas
não submetidas à redução) ............................................................................... 25
Figura 3. Perfil eletroforético dos venenos de filhotes de B. jararaca (proteínas
submetidas à redução) ..................................................................................... 27
Figura 4. Perfil eletroforético dos venenos de filhotes de B. jararaca com
coloração fluorescente para glicoproteínas. ...................................................... 29
Figura 5. Análise por Western blot dos venenos de filhotes de B. jararaca
utilizando o anticorpo anti- bothropasina.. ......................................................... 31
Figura 6. Análise por Western blot dos venenos de filhotes de B. jararaca
utilizando o anticorpo anti-MSP1/MSP2. ........................................................... 33
Figura 7. Atividade proteolítica de venenos de filhotes de B. jararaca utilizando
como substrato a caseína.................................................................................. 35
Figura 8. Atividade amidolítica de venenos de filhotes de B. jararaca utilizando
como substrato Benzoil-Arginil-p-nitroanilida. ................................................... 36
Figura 9. Perfis de LC-MS dos venenos de filhotes de B. jararaca .................. 39
Figura 10. Espectro representativo (MS/MS) do sequenciamento do íon
correspondente ao peptídeo <E-K-W. ............................................................... 40
Figura 11. Perfil eletroforético dos venenos de filhotes de B. jararaca em gel de
SDS-poliacrilamida (proteínas submetidas à redução) com indicação das
bandas de proteínas recortadas para identificação por LC-MS/MS. ................. 42
Figura 12. Perfil eletroforético dos venenos de filhotes de B. jararaca em gel de
SDS-poliacrilamida (proteínas não submetidas à redução) com indicação das
bandas de proteínas recortadas para identificação por LC-MS/MS.. ................ 49
Figura 13. Comparação de características dos venenos de filhotes de B.
jararaca machos e fêmeas utilizando o Teste T não pareado. .......................... 57
Figura 14. Dendrograma do agrupamento hierárquico dos venenos de filhotes
de B. jararaca, evidenciando a divisão em dois grupos principais .................... 59 Dias G.S. 2013 Lista de Tabelas LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Toxinas isoladas do veneno de B. jararaca, com atuação sobre a
hemostasia. ......................................................................................................... 7
Tabela 2. Dados dos espécimes de serpentes B. jararaca filhotes utilizados
neste estudo. ..................................................................................................... 22
Tabela 3. Quantificação de proteínas presentes nos venenos individuais de B.
jararaca filhotes. ................................................................................................ 23
Tabela 4. Atividade coagulante dos venenos de 21 filhotes de B. jararaca sobre
o plasma humano. ............................................................................................. 37
Tabela 5. Identificação de diferentes bandas de proteínas dos venenos de
filhotes de B. jararaca, indicadas na Figura 11, por LC-MS/MS. ....................... 43
Tabela 6. Identificação de diferentes bandas de proteínas dos venenos de
filhotes de B. jararaca, indicadas na Figura 12, por LC-MS/MS ........................ 50
Dias G.S. 2013 Lista de Abreviaturas e Siglas LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BPP: Bradykinin Potentiating Peptide (Peptídeo potenciador de bradicinina)
BSA: Bovine Serum Albumin (soroalbumina bovina)
CRISP: Cysteine- rich secretory protein ( Proteína secretada rica em cisteína)
CTL: C-Type Lectin (Lectina tipo-C)
DMC: Dose mínima coagulante
DTT: DL-ditiotreitol
FII: Fator II / Protrombina
FIIa: Fator II ativado / trombina
FLA2: Fosfolipase A2
FX: Fator X / Fator de Stuart
FXa: Fator X ativado
IAA: Iodoacetamina
IgG: Imunoglobulina G
kDa: Kilodalton
LAAO: L-aminoácido oxidase
L-BAPNA: L-Benzoil-Arginil-pNitroAnilida
LC: Liquid chromatography (cromatografia líquida).
LC-MS/MS: Liquid Chromatography coupled to tandem mass spectrometry
(Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas seqüencial)
m/z: razão massa/carga
MP: Metaloproteinase
nm: nanômetro
NPU: Número de peptídeos únicos
PBS: Phosphate Buffered Saline (tampão fosfato-salina)
pNa: para-nitroanilina
Q-ToF: Quadrupole-Time of Flight (Quadrupolo- tempo de vôo)
rpm: Rotações Por Minuto
SDS: Sodium Dodecyl Sulfate (dodecil sulfato de sódio)
Dias G.S. 2013 Lista de Abreviaturas e Siglas SDS-PAGE: Sodium Dodecil Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis
(Eletroforese em Gel de Poliacrilamida com Dodecil Sulfato de Sódio)
SP: Serinoproteinase
TFA: Trifluoracetic acid (ácido trifluoroacético)
Tris: Tris (hidroximetil) aminometano
VEGF: Vascular Endothelium Growth Factor (Fator de crescimento vascular
endotelial)
Dias G.S. 2013 Sumário SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................... 1 1.1. Proteoma e variabilidade dos venenos de serpentes do gênero
Bothrops ................................................................................................... 1 1.2. Bothrops jararaca e seu veneno ....................................................... 6 1.3. Variabilidade no proteoma do veneno de B. jararaca ....................... 8 2. OBJETIVOS ....................................................................................... 12 3. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................. 13 3.1. Extração dos venenos de filhotes ................................................... 13 3.2. Quantificação de proteínas ............................................................. 13 3.3. Eletroforese de proteínas em gel de SDS-poliacrilamida ............... 14 3.4. Atividade caseinolítica .................................................................... 14 3.5. Atividade amidolítica ....................................................................... 14 3.6. Atividade coagulante sobre o plasma– Dose Mínima Coagulante
(DMC) .................................................................................................... 15 3.7. Análise do glicoproteoma................................................................ 15 3.8. Análise por Western blot ................................................................. 15 3.9. Digestão tripsínica in gel e identificação de proteínas por LC-MS/MS
............................................................................................................... 16 3.10. Análise do perfil proteico dos venenos por espectrometria de
massas (LC-MS) .................................................................................... 19 3.11. Critério para identificação dos peptídeos e análise em banco de
dados ..................................................................................................... 19 3.12. Análise estatística comparativa de algumas propriedades dos
venenos ................................................................................................. 20 4. RESULTADOS ................................................................................... 21 4.1. Quantificação da concentração proteica nos venenos individuais de
filhotes de B. jararaca ............................................................................ 21 4.2. Comparação do perfil eletroforético individual de venenos de filhotes
de B. jararaca ......................................................................................... 24 4.3. Sub-proteoma de metaloproteinases. Análise por Western blot com
o anticorpo anti-bothropasina ................................................................ 30 4.4. Sub-proteoma de serinoproteinases. Análise por Western blot com o
anticorpo anti-MSP1/MSP2.................................................................... 32 4.5. Atividade proteolítica dos venenos individuais de filhotes de B.
jararaca .................................................................................................. 34 4.5.1. Atividade caseinolítica ................................................................. 34 4.5.2. Atividade amidolítica .................................................................... 35 Dias G.S. 2013 Sumário 4.6. Atividade coagulante dos venenos individuais de filhotes de B.
jararaca .................................................................................................. 36 4.7. Análise dos venenos de B. jararaca filhotes por espectrometria de
massas (LC-MS) .................................................................................... 38 _Toc3495774384.8. Identificação de proteínas por espectrometria de massas
em bandas diferenciais dos venenos..................................................... 41 4.9. Identificação de proteínas por espectrometria de massas em bandas
comuns dos venenos ............................................................................. 48 4.10. Análise estatística comparativa de algumas propriedades dos
venenos ................................................................................................. 56 4.10.1. Teste de comparação de médias entre machos e fêmeas ........ 56 4.10.2. Análise multivariada ................................................................... 57 5. DISCUSSÃO ...................................................................................... 60 6. CONCLUSÕES .................................................................................. 68 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................. 69 Dias G.S. 2013 Introdução 1. INTRODUÇÃO
1.1. Proteoma e variabilidade dos venenos de serpentes do
gênero Bothrops
O gênero Bothrops pertence à família Viperidae, compreende mais de 30
espécies de serpentes, e tem esta denominação decorrente da língua grega:
“Bothros” significa fosseta ou cavidade e “ops”, que significa olho ou face, uma
alusão à fosseta loreal, localizada entre a narina e os olhos destas serpentes.
(Carrasco et al, 2012). São caracterizadas pela ‘cabeça em formato de lança’, e
estão amplamente distribuídas em regiões tropicais como América Latina, mais
específicamente do nordeste do México até a Argentina e parte das ilhas do Caribe
(Campbell e Lamar, 2004). Diversas espécies pertencentes a este gênero são
responsáveis pelos acidentes ofídicos no continente Sul americano (Salomão et al.
1997; Warrel 2004). No Brasil, esse gênero compreende diversas espécies, dentre
as quais estão: Bothrops jararaca (jararaca), B. jararacussu (jararacussu), B.
alternatus (urutu-cruzeiro ), B. neuwiedi (jararaca-pintada) e B. moojeni (caissaca)
(Melgarejo, 2003). O veneno dessas serpentes, que é produzido por glândulas
exócrinas especializadas, consiste em uma secreção que contêm uma mistura
complexa de proteínas e peptídeos bioativos que auxiliam a digestão de uma presa
“não triturada”; constitui um mecanismo de defesa contra predadores/agressores e é
o fator responsável pela subjugação das presas (Gans e Elliot, 1968; Thomas e
Pough, 1979; Mackessy, 1993; Fry et al., 2006; Vonk et al., 2008).
Algumas das proteínas presentes nos venenos do gênero Bothrops são
enzimas, como serinoproteinases (Markland, 1998; Serrano e Maroun, 2005),
metaloproteinases (Moura-da-Silva et al., 2007; Gutiérrez et al., 2005; Fox e
Serrano, 2008), fosfolipases A2 (Kini, 2003, 2005), L-aminoácido oxidases (Du e
Clemetson, 2002), e nucleotidases (Rael, 1998). Esses venenos contêm ainda
outras proteínas como lectinas (Ogawa et al, 2005; Morita, 2005; Lu, 2005) e
disintegrinas (Calvete et al, 2005). Os venenos produzidos por serpentes
pertencentes à família Viperidae são conhecidos por conterem proteínas que
1 Dias G.S. 2013 Introdução interferem com o funcionamento normal do sistema hemostático (Markland, 1998;
Braud et al, 2000; Fox e Serrano, 2005).
As serinoproteinases de venenos de serpentes são classificadas no clan SA,
família S1 da quimiotripsina (Barrett et al., 1995; Rawlings et al., 2008). A tripsina de
mamíferos e as enzimas de venenos apresentam fold semelhante e, acredita-se,
evoluíram a partir de um ancestral comum (Itoh et al., 1988). Estas enzimas
possuem uma tríade catalítica bem conservada formada pelos resíduos His57,
Asp102 e Ser195 (Serrano e Maroun, 2005). As serinoproteinases de venenos
interferem especificamente nos mecanismos hemostáticos e apresentam resistência
à inibição por inibidores plasmáticos de serinoproteinases (Parry et al., 1998). Em
contraste com a tripsina, que apresenta uma vasta especificidade de substrato, as
enzimas de venenos são caracterizadas pela alta especificidade, assim como as
serinoproteinases de mamíferos que regulam a hemostasia (Serrano e Maroun,
2005).
As metaloproteinases de venenos de serpentes são classificadas na família
M12 das metaloproteinases, juntamente com outros dois grupos dessas enzimas: A
Disintegrin and Metalloproteinase (ADAM) e A Disintegrin and Metalloproteinase with
Thrombospondin Motifs (ADAMTS). As metaloproteinases são componentes
abundantes em venenos de viperídeos e possuem em seu domínio catalítico um íon
inorgânico (normalmente zinco) coordenado pelas cadeias laterais de três resíduos
de histidina presentes na seqüência HEXXHXXGXXH, que é altamente conservada
nessas proteínas (Hite et al. 1994; Bjarnason e Fox, 1995; Fox e Serrano, 2008).
Com base na estrutura de seus precursores e das proteínas em forma madura (pósprocessamento) as metaloproteinases são divididas em três classes: P-I a P-III. Os
precursores destas proteínas contém em comum um peptídeo sinal, e um pródomínio, que mantém a enzima em estado latente, sem atividade proteolítica (Grams
et al, 1993; Stocker e Bode, 1995). Enzimas da classe P-I apresentam apenas o
domínio catalítico, com massa molecular entre 20 kDa e 25 kDa (Bjarnason e Fox,
1995; Fox e Serrano, 2008). Enzimas da classe P-II possuem um domínio
disintegrina na porção carboxil do domínio catalítico. Os precursores de enzimas da
classe P-II podem gerar proteínas maduras formadas somente pelo domínio
catalítico ou somente o domínio disintegrina (P-IIa), como a atrolisina-E, e também
proteínas que conservam o domínio disintegrina na proteína madura como as
2 Dias G.S. 2013 Introdução metaloproteinases jerdonitina (proteína monomérica da classe P-IIb) e bilitoxina-1
(proteína dimérica da classe P-IIc). Estes precursores ainda podem gerar proteínas
maduras compostas por disintegrinas homo-diméricas, como a contortrostatina, ou
hetero-diméricas, como a acostatina, das classes P-IId e P-IIe, respectivamente (Fox
e Serrano, 2005, 2008). Já as enzimas da classe P-III são proteínas com massa
molecular entre 50 kDa e 110 kDa que apresentam na sua forma madura, além do
domínio catalítico, o domínio tipo-disintegrina seguido de um domínio rico em
resíduos de cisteínas na região C-terminal (Bjarnason e Fox, 1995; Fox e Serrano,
2008). A esta classe pertencem proteinases formadas pelos domínios citados, na
forma monomérica (classe P-IIIa) como a atrolisina-A, HF3, e também na forma
dimérica (classe P-IIIc), como a VAP1. Ainda, foi encontrada em venenos de
viperídeos uma proteína composta somente pelos domínios tipo-disintegrina e rico
em cisteínas, formada pelo processamento proteolítico de proteinases da classe PIIIb, como jarharagina, bothropasina e catrocollastatina, porém, o domínio catalítico
destas enzimas ainda não foi isolado do veneno (Usami et al., 1994; Shimokawa et
al., 1997). A antiga classe P-IV, hoje denominada classe P-IIId, é composta por
enzimas que apresentam uma cadeia contendo os domínios encontrados nas
proteinases da classe P-III, e mais duas cadeias de lectinas ligadas ao domínio rico
em cisteínas por pontes dissulfeto. São representantes desta classe as proteinases
RVV-X (Russell’s viper venom factor X activator) da Vipera russelli e VLFXA (Vipera
lebetina venom factor X activator) da Vipera lebetina, ambas com atividade de
ativação do fator X da coagulação (Fox e Serrano, 2005, 2008). As fosfolipases A2 (FLA2) são enzimas que hidrolisam glicerofosfolipídeos na
posição sn-2 da cadeia de glicerol liberando lisofosfolípides e ácidos graxos (Kini e
Iwanaga, 1986; Kini, 2003). São divididas em duas classes: citósólicas e secretadas,
sendo as de veneno des serpentes, secretadas. As FLA2 de veneno apresentam
similaridade de estrutura química e função catalítica com enzimas de mamíferos,
entretanto as FLA2 de venenos são tóxicas e responsáveis por diversos efeitos
farmacológicos, tais como interferência na agregação plaquetária, miotoxicidade,
neurotoxicidade, entre outros (Gutiérrez e Lomonte, 1995; Kini, 1997, 2005).
As lectinas tipo-C são proteínas que requerem íons de Ca+2 para sua
interação
com
carboidratos
específicos.
Estas
proteínas
apresentam
uma
conformação típica em sua estrutura (um loop) cujos resíduos coordenam a ligação
3 Dias G.S. 2013 Introdução com íons de cálcio (Drickamer, 1988). A maioria das lectinas encontradas em
venenos de serpentes não apresenta o loop de ligação com íons de Ca+2 e nem
todas se ligam a carboidratos (Clemetson et al. 2001). As lectinas tipo-C são
proteínas diméricas, e apresentam massa molecular de cerca de 30 kDa. Estas
proteínas
estão
envolvidas
principalmente
nas
alterações
de
processos
hemostáticos decorrentes do envenenamento, interagindo principalmente com
receptors plaquetários (Zingali et al. 2001).
A variação em proteomas de venenos animais ocorre em diversos níveis,
includindo interfamília, intergênero, interespécie, intersubspécie e intraespécie. A
variação intraespécie pode acontecer ainda individualmente, devido à variação
sazonal, dieta, habitat, idade e dimorfismo sexual (Chippaux et al, 1991). A
complexidade
dos
venenos
de
serpentes
tem
sido
analisada
pela
complementaridade das abordagens de transcriptômica e proteômica, que permitem
a elucidação da composição e variabilidade das proteínas e peptídeos, identificação
de modificações pós-traducionais, avaliação do processamento de precursores e de
proteínas maduras, análises de filogenia molecular, entre outras (Tubbs et al., 2000;
Ho, 2002; Kashima et al., 2004; Francischetti et al., 2004; Serrano et al., 2005;
Menezes et al., 2006; Fox et al., 2006; Ching et al., 2006; Cidade et al., 2006).
Considerando que a diversidade e abundância de proteínas presentes nos
venenos é extremamente variável, a análise proteômica é uma ferramenta
importante para o entendimento da complexidade dos venenos. Análises
proteômicas de venenos de serpentes têm revelado aspectos importantes em
relação à variabilidade da composição do veneno, seja ela inter-específica ou intraespecífica (Fox e Serrano, 2008; Calvete et al, 2009; Gutiérrez et al., 2009).
Neste contexto, diversos grupos têm estudado a complexidade e variabilidade
dos proteomas de venenos de serpentes. Gutiérrez et al (2009) compararam o
proteoma de venenos de B. asper, provenientes do Caribe e Costa Rica e
verificaram variação geográfica com relação à presença de diversas classes de
proteínas , tais como disintegrinas, FLA2, serinoproteinases, lectinas tipo-C,
Cysteine-Rich
Secretory
Protein
(CRISP),
L-amino
acido
oxidase
e
metaloproteinases. Além disso, esses autores observaram ainda uma variação
ontogenética importante, em que o veneno de espécimes neonatos apresentou uma
alta proporção de metaloproteinases da classe P-III em relação ao veneno dos
4 Dias G.S. 2013 Introdução espécimes adultos, que por outro lado, apresentou maior expressão de
metaloproteinases da classe P-I e FLA2 do tipo Lys-49. Guércio et al. (2006)
analisaram o perfil proteômico de venenos de exemplares juvenis, sub-adultos e
adultos de B. atrox, evidenciando uma pronunciada expressão de metaloproteinases
no veneno dos adultos.
De acordo com Vellard (1937) a variação intraespecífica do veneno de B.
atrox, resultou na variabilidade do quadro clínico e isso evidencia-se em espécies
que tem uma distribuição geográfica mais ampla, como é o caso da espécie citada
acima. Sendo assim a diversidade intraespecífica interfere na variabilidade clínica do
envenenamento, logo, merece mais consideração uma vez que os acidentes podem
requerer diferentes tipos de tratamento. Estudos de Saldarriaga et al. (2003)
relataram maior atividade coagulante nos venenos de exemplares jovens de B.
asper e B. atrox da Colômbia.
A variabilidade geográfica e intra-específica de venenos de serpentes B.
asper provenientes da Costa Rica foi demonstrada principalmente no que diz
respeito à toxicidade (Jimenez-Porras, 1964; Gutierrez et al., 1980; Aragon e
Gubensek, 1981; Moreno et al., 1988). Gutiérrez et al (1980) mostraram que
venenos de serpentes provenientes de regiões do Caribe causavam nos pacientes
maiores efeitos hemorrágico e mionecrótico do que aqueles advindos de diferentes
partes do Pacífico, que por sua vez apresentavam alta atividade proteolítica sobre a
caseína.
O processo de desenvolvimento de um indivíduo até a sua fase adulta
(ontogenia) tem também importante reflexos na composição dos venenos. A
variação ontogenética foi observada também no veneno de B. atrox, em que a
atividade coagulante foi mais intensa para os espécimes jovens em relação ao
veneno dos adultos (Lopez-Lozano et al., 2002). Em conjunto, esses trabalhos e
outros demonstraram que de fato o conhecimento sobre os proteomas do venenos
bem como sua variabilidade, seja de que tipo for, podem impactar a pesquisa
básica, não só para aqueles que estudam evolução de espécies e a relação entre o
conteúdo dos venenos e os efeitos observados no envenenamento, como também
as ações relacionadas ao tratamento, incluindo a seleção dos antissoros e também a
seleção de espécimes para a produção dos antissoros.
5 Dias G.S. 2013 Introdução 1.2. Bothrops jararaca e seu veneno
A B. jararaca é uma das mais importantes espécies causadoras de acidentes
ofídicos no Brasil. Os acidentes botrópicos correspondem a mais de 75% dos
acidentes ofídicos no Brasil, segundo estatísticas do Sistema de Informação e
Notificação de Agravos (SINAN) (Ministério da Saúde, 2010). As serpentes B.
jararaca são solenóglifas e possuem hábitos predominantemente noturnos e
generalistas, no entanto, exibem uma notável mudança na dieta associada ao
desenvolvimento
ontogenético,
alimentando-se
de
presas
ectotérmicas
(principalmente artrópodes, lagartos e pequenos anfíbios) durante a fase juvenil, e
de animais endotérmicos (principalmente pequenos mamíferos) durante a vida
adulta (Sazima, 1992; Martins e Sazima, 2002). Distribuem-se desde o Sudeste da
Bahia até a porção nordeste do Rio Grande do Sul, ocupando uma diversidade de
habitats, desde Mata Atlântica até regiões abertas e áridas, com domínio
predominantemente de cerrado (Campbell e Lamar, 1989).
A característica principal do veneno de B. jararaca é a intensa atividade
proteolítica. Cidade et al. (2006) analisaram um transcriptoma da glândula de
veneno de B. jararaca e identificaram que 53% dos transcritos de toxinas é
constituído de metaloproteinases, e 28% é constituído de serinoproteinases. Grande
parte das toxinas isoladas do veneno de B. jararaca tem ação sobre componentes
da cascata de coagulação sanguínea ou sobre componentes da matriz extracelular e
do epitélio vascular (Theakston e Kamiguti, 2002; Serrano e Maroun, 2005; Mourada-Silva et al. 2007). Do veneno da B. jararaca foram isolados e caracterizados
diversos componentes que mostraram interferir em eventos envolvidos na
hemostasia (Tabela 1), incluindo metaloproteinases, serinoproteinases, fosfolipases
A2, lectinas tipo-C e uma nucleotidase.
6 Dias G.S. 2013 Introdução Tabela 1. Toxinas isoladas do veneno de B. jararaca, com atuação sobre a hemostasia.
Toxina
Classe
Atividade biológica
Referência
Bothrombina
SP
Atividade coagulante (liberação do
fibrinopeptídeo A) sem efeito direto sobre
Nishida et al.,
plaquetas a menos que haja presença de
(1994)
fibrinogênio
PA-BJ
SP
Indução da agregação plaquetária pela
interação com os receptores plaquetários
PAR1 e PAR4
Serrano et al.,
(1995); Santos et
al., (2000)
TL-BJ
SP
Atividade coagulante (liberação do
fibrinopeptídeo A ) sobre plasma e
fibrinogênio
Serrano et al.,
(2000)
KN-BJ
SP
Liberação de bradicinina do cininogênio
bovino de baixo peso molecular e atividade
coagulante (liberação do fibrinopeptídeo A)
Serrano et al.,
(1998)
Bothrops
protease A
SP
Atividades amidolítica e fibrinogenolítica
Bothropasina
MP (P-IIIb)
Hemorragia
Mandelbaum e
Henriques (1964);
Murayama et al.,
2003; Paes-Leme et
al., (2008)
Mandelbaum et al.,
1982; Assakura et
al., 2003
Jararhagina
MP (P-IIIb)
Hemorragia
Paine et al., 1992 e
HF1
MP (P-III)
Hemorragia
HF2
MP (P-III)
Hemorragia
HF3
MP (P-III)
Hemorragia
Assakura et al.,
1986
Assakura et al.,
1986
Assakura et al.,
1986; Silva et al,
2004
Jararafibrase I
MP (P-III)
Hemorragia e fibrinólise
Maruyama et al.,
1992
Jararafibrase II,
III, IV
MP (P-II)
Hemorragia e fibrinólise
Maruyama et al.,
1992; Maruyama et
al., 1993
J proteinase
MP (P-II)
Atividade caseinolítica
Tanizaki et al., 1989
BJ-PI
MP (P-I)
Atividade fibrinogenolítica
Oliveira et al., 2009
7 Dias G.S. 2013 Introdução BJ-PI2
MP (P-I)
Atividade fibrinogenolítica; pró-inflamatória
Da Silva et al., 2012
Bothrojaracina
CTL
Bloqueio da atividade da trombina sobre o
fibrinogênio, bem como da ativação
plaquetária mediada por fibrinogênio
Zingali et al., 1993
Bothrocetina
CTL
Indução da agregação plaquetária pela
interação com o fator de von Willebrand
Brinkhous et al.,
1981
Jararaca GPIbBP
BJ-FLA2
CTL
FLA2
Bothrojaractivase
MP (P-II)
Inibição da agregação plaquetária pela
Fujimura et al., 1995
interação com a glicoproteína plaquetária Ib
Indução de agregação plaquetária
Serrano et al., 1999
Ativação do fator II da cascata de
coagulação sanguínea e fibrinólise
Berger et al., (2008)
NT
NPP-BJ
Inibição da agregação plaquetária induzida
por ADP
Santoro et al.,
(2009)
CTL –Lectina tipo-C; MP – Metaloproteinase; FLA2- Fosfolipase A2; SP- Serinoproteinase;
NT nucleotidase. Tabela adaptada de Zelanis (2011) e atualizada.
1.3. Variabilidade no proteoma do veneno de B. jararaca
A variabilidade individual do veneno de serpentes não é um assunto muito
pesquisado; isso se dá pela dificuldade de manter os animais de forma individual
nos biotérios. Embora o veneno de B. jararaca tenha sido alvo de diversos estudos,
a extensão da variação individual de seu proteoma ainda é pouco conhecida. Em um
estudo de Menezes et al. (2006) o proteoma do veneno de 18 espécimes de B.
jararaca, provenientes de uma única ninhada, foi avaliado de forma individual,
utilizando técnicas de eletroforese (unidimensional e bidimensional) e análise da
atividades proteolíticas do veneno. Foi mostrado que venenos de fêmeas
apresentavam um perfil eletroforético mais homogêneo quando comparado aos
8 Dias G.S. 2013 Introdução machos, bem como uma maior atividade proteolítica sobre a caseína. Ainda, a
variabilidade do proteoma do veneno desses 18 espécimes de B. jararaca não pôde
ser atribuída a condições do meio ambiente, idade ou até mesmo a dieta, já que
todas nasceram e foram criadas sob as mesmas condições em biotério, fato que
aponta para a herança genética das serpentes exercendo um importante papel no
fenótipo do veneno. De acordo com Pimenta et al. (2007) o perfil de LC-MS desses
18 venenos individuais apresentou expressiva variabilidade. A análise da fração
peptídica dos venenos por espectrometria de massas mostrou a presença de 11
peptídeos potenciadores da bradicinina (BPPs) (9a, 10b, 10c, 11a, 11d, 11e, 12b,
12c, 13a, 13b, 14a) distribuídos pelos venenos, porém o único peptídeo que foi
encontrado em todas as amostras analisadas foi o BPP13a.
Em outro estudo, Furtado et al. (1991) mostraram que o veneno de filhotes de
B. jararaca apresentava um valor 12 vezes mais alto para a atividade coagulante
sobre o plasma quando comparado com o veneno dos adultos desta mesma
espécie. No estudo de Zingali (1993) variações individuais também puderam ser
vistas nos perfis de expressão de isoformas de bothrojaracina, um inibidor de
trombina isolado do veneno de B. jararaca. Embora hajam estudos de variações
individuais em venenos de serpentes, nada se sabe sobre essas variações em
venenos de filhotes.
Em um estudo recente sobre a variabilidade do veneno de B. jararaca foi
demonstrado que os venenos de espécimes filhotes e adultos apresentam atividade
hemorrágica similar enquanto que o veneno de adultos tem uma atividade letal
discretamente mais alta sobre camundongos, embora o veneno de filhotes seja
extremamente mais potente sobre aves (Zelanis et al., 2010). Outro fato interessante
é que a atividade coagulante do veneno de filhotes é cerca de dez vezes mais alta
do que a do veneno de adultos. Essas diferenças nas atividades biológicas dos
venenos foram também evidenciadas pelos perfis de eletroforese bidimensional,
zimografia de gelatina, imunocoloração com anticorpos específicos, padrões de
glicosilação e afinidade de glicoproteínas à concanavalina A. A análise da fração
peptídica desses venenos revelou conteúdos diferentes de peptídeos em geral,
enquanto que perfis semelhantes foram obtidos com relação aos BPPs. Em
conjunto, esses resultados indicaram que a variação na dieta da B. jararaca,
passando de presas ectotérmicas na idade juvenil para presas endotérmicas na vida
9 Dias G.S. 2013 Introdução adulta, está associada a mudanças no proteoma e peptidoma do veneno (Zelanis et
al., 2010). Ainda, foi demonstrado que metaloproteinases estão entre as principais
toxinas diferencialmente expressas nos venenos de indivíduos filhotes e adultos de
B. jararaca e que o quociente de metaloproteinases da classe P-III/P-I é maior no
veneno de filhotes do que no veneno de adultos (Zelanis et al, 2011).
Em outro estudo foi mostrado que o transcriptoma de glândulas de veneno de
espécimes adultos de B. jararaca apresenta principalmente transcritos de
metaloproteinases (30%), precursor de peptídeos potenciadores de bradicinina
(23%), lectinas tipo-C (22%), fosfolipases A2 (9%), e serinoproteinases (8%) (Zelanis
et al., 2012). Por outro lado, em filhotes de B. jararaca, os transcritos de
metaloproteinases são muito mais abundantes (53%), enquanto que outras classes
de toxinas (fosfolipases A2, lectinas tipo-C, serinoproteinases e precursores de
peptídeos potenciadores de bradicinina) aparecem em menor abundância. Esses
achados, mostrando uma mudança substancial na composição do veneno durante o
desenvolvimento do animal, correlacionam-se com análises de venenos de filhotes e
adultos desta serpente, realizadas por abordagens proteômicas (Zelanis et al., 2010,
2011). Utilizando abordagem proteômicas e peptidômicas, este trabalho visa analisar
a variabilidade individual do veneno da serpente B. jararaca obtido de filhotes
(Figura 1).
10 Dias G.S. 2013 Introdução Figura 1. Serpente Bothrops jararaca filhote. (Foto:Sávio Stefanini) Considerando a variabilidade do veneno de B. jararaca relatada em diversos
trabalhos e as implicações em aspectos clínicos e terapêuticos dos acidentes
causados por filhotes e adultos de B. jararaca, torna-se importante um estudo
detalhado, com um enfoque especial para a variabilidade individual dos venenos de
filhotes. Uma abordagem proteômica associada a técnicas tradicionais de química
de proteínas e ensaios biológicos pode evidenciar diferenças qualitativas ou
quantitativas nos venenos de filhotes, fornecendo subsídios para o entendimento da
variabilidade individual verificada nesta espécie e em venenos de outras espécies do
mesmo gênero, no caso de venenos de espécimes adultos. Como regra geral na
toxinologia, a exploração do conteúdo dos venenos de serpentes tem sido realizada
com pools de venenos obtidos de espécimes adultos das serpentes, fato que aponta
para o desconhecimento do conteúdo proteômico dos venenos de filhotes, e de sua
variabilidade individual.
11 Dias G.S. 2013 Objetivos 2. OBJETIVOS
O objetivo geral deste trabalho foi analisar as variações proteômicas
individuais em venenos de espécimes filhotes de B. jararaca, nascidos na
mesma época e mantidos nas mesmas condições de biotério.
Objetivos específicos:
- Analisar o perfil proteômico do veneno de cada espécime.
- Analisar as variações proteômicas relacionadas ao sexo.
12 Dias G.S. 2013 Material e Métodos 3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Extração dos venenos de filhotes
A extração dos venenos de filhotes de B. jararaca foi realizada
mensalmente,
durante
nove
meses
consecutivos
no
Laboratório
de
Herpetologia do Instituto Butantan, sob a coordenação do Pesquisador MSc.
Savio Stefanini Sant'Anna. Foram selecionados espécimes filhotes (machos e
fêmeas) de diferentes regiões do Estado de São Paulo, Santa Catarina e Minas
Gerais e o estudo foi realizado com indivíduos cujo volume de veneno coletado
era suficiente para a realização das análises, totalizando 21 amostras. Esses
animais foram mantidos individualmente em cativeiro no Biotério de Serpentes
do Laboratório de Herpetologia do Instituto Butantan. Para a extração de
venenos, os animais foram inicialmente anestesiados com o auxílio de gás
carbônico segundo protocolo descrito por Biasi et al. (1976) e, em seguida, o
veneno foi extraído com o auxílio de capilares de vidro.
Após a coleta, as amostras de veneno foram centrifugadas a 2000 x g,
4°C, por 30 min, para remoção do muco salivar, bem como presas ou escamas
que eventualmente estavam presentes no veneno extraído. Após este processo
os venenos foram acondicionados a temperatura de -20°C até o momento do
uso. Os venenos não passaram pelo processo de liofilização devido ao pouco
volume obtido, e foram aliquotados para evitar repetitivos processos de
descongelamento.
3.2. Quantificação de proteínas
A quantificação de proteínas presentes nos venenos foi realizada com
diferentes quantidades de veneno, em triplicata, utilizando o reagente de
Bradford (Bradford, 1976), adquirido da Sigma. Para estimar o teor protéico das
amostras utilizamos uma curva padrão, construída com concentrações
crescentes de soroalbumina bovina (Sigma).
13 Dias G.S. 2013 Material e Métodos 3.3.
Eletroforese
de
proteínas
em
gel
de
SDS-
poliacrilamida
As análises eletroforéticas foram realizadas como descrito por Laemmli
(1970). Foram utilizados géis de 10 x 8 cm x 1.5 mm e um sistema de
eletroforese Hoefer (GE Healthcare). As amostras foram aquecidas a 95 °C
durante 5 min e aplicadas em volume máximo de 30 µl. As corridas foram
realizadas a temperatura ambiente. Para a coloração do gel foi utilizado o
Coomassie Coloidal [(NH4)2SO4 8%, ácido fosfórico 0,68%, Coomassie Brilliant
Blue-G250 (Sigma) 0,08%, metanol 25%]. A análise das imagens foi feita
utilizando o software Image Master Platinum 6.0 (GE Healthcare).
3.4. Atividade caseinolítica
Para este ensaio foi utilizada a caseína N,N-Dimetilada (Sigma) como
substrato, numa solução que continha 0,5 ml de solução tampão (Tris–HCl 0,1
M, pH 8,8, CaCl2 0,01 M), contendo 0,01 mg ou 0,02 mg do veneno e 0,5 ml de
caseína 2% (solubilizada no mesmo tampão), por 30 min, a 37 °C. A reação foi
interrompida com 1 ml de ácido tricloroacético 5%, a mistura foi centrifugada a
14.000 rpm, por 15 min e a absorbância do sobrenadante foi medida a 280 nm.
Uma unidade de atividade foi definida como o aumento de 1 U da densidade
óptica (DO) por min a 280 nm. A atividade específica foi expressa em
unidades/mg de proteína.
3.5. Atividade amidolítica
A atividade amidolítica foi determinada utilizando como substrato
Benzoil-Arginil-p-nitroanilida (L-BAPNA) (Sigma), na concentração de 0,002 M
em solução tampão de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0. O veneno foi utilizado nas doses
de 0,01 mg e 0,02 mg de proteína em 450 µl de solução tampão. Após a adição
da amostra de veneno à solução do substrato (450 µl), esta permaneceu por 30
min a 37°C. A reação foi interrompida com 100 µl de ácido acético 30% e a p 14 Dias G.S. 2013 Material e Métodos nitroanilina que é liberada pela atividade amidolítica de serinoproteinases foi
medida a 405 nm no espectrofotômetro (Gene Quant- Amersham Biosciences).
3.6. Atividade coagulante sobre o plasma– Dose Mínima
Coagulante (DMC)
A Dose Mínima Coagulante (DMC) é definida como a menor quantidade
de veneno capaz de coagular uma solução padronizada de fibrinogênio ou
plasma citratado em 60 seg a 37°C (Theakston e Reid, 1983). Para este ensaio
foi utilizado plasma humano citratado (contendo citrato de sódio 3,8%) e o
ensaio foi realizado em triplicata. A 200 µL de plasma foram adicionados 100
µL de veneno em diferentes concentrações (obtidas através de diluições
seriadas). As soluções de plasma foram mantidas em banho de gelo durante o
uso, e a 37°C, quando nas cubetas do fibrômetro (BBL Fibrosystem, Becton
Dickinson).
3.7. Análise do glicoproteoma
Para a visualização das bandas de glicoproteínas presentes nas
amostras de veneno analisadas por eletroforese foi utilizada a coloração
fluorescente Pro-Q-Emerald (Invitrogen), seguindo as instruções do fabricante.
A coloração para glicoproteínas foi realizada após a separação das proteínas
por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida 12%. A visualização das bandas
foi obtida após a exposição dos géis em transiluminador de ultravioleta (UV) a
300 nm.
3.8. Análise por Western blot
A
visualização
do
sub-proteoma
de
metaloproteinases
e
serinoproteinases das amostras de veneno de B. jararaca foi realizada por
imunocoloração
com
um
antissoro
policlonal
anti-bothropasina
(metaloproteinase da classe P-III do veneno de B. jararaca; (Mandelbaum et
15 Dias G.S. 2013 Material e Métodos al., 1982) e um antissoro policlonal anti-MSP1/MSP2 (serinoproteinases do
veneno de B. moojeni; Serrano et al., 1993), respectivamente. Após a
eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida 12 % as proteínas dos venenos
foram transferidas eletroforeticamente para uma membrana de nitrocelulose
(GE Healthcare) em uma cuba miniVE (GE Healthcare) preenchida com
tampão de transferência (Tris 25 mM, glicina 192 mM, metanol 20% e SDS
0,037%). A transferência ocorreu sob voltagem fixa de 20V por 18 horas. Após
este período, as membranas foram imersas em uma solução 0,5% de corante
Ponceau S em ácido acético 1%, para se verificar a correta transferência das
proteínas. Em seguida, as membranas foram lavadas com água destilada e
imersas em uma solução de leite desnatado 5% em PBS (fosfato de sódio
monobásico 0,05M, fosfato de sódio dibásico 0,05M, NaCl 0,15M) por 30 min,
sob agitação.
O anticorpo primário (policlonal, preparado em coelhos foi adicionado
seguindo a diluição de 1:500 em uma solução de PBS contendo Tween 0,1%.
As membranas foram incubadas por uma hora nesta solução, sob agitação. Em
seguida, foram lavadas por 30 min com uma solução de PBS contendo Tween
0,1%. Finalmente, foi adicionado o anticorpo secundário (anti-IgG de coelho
conjugado à peroxidase) na diluição de 1:1000 em solução de PBS contendo
Tween 0,1% e as membranas foram imersas nesta solução por uma hora. A
revelação se deu com a adição da solução de 4-cloro-1-naftol (Sigma) em TrisHCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 e 0,5% de peróxido de hidrogênio.
3.9. Digestão tripsínica in gel e identificação de proteínas
por LC-MS/MS
Bandas de proteínas de interesse, presentes no gel de SDSpoliacrilamida, foram recortadas e submetidas ao processo de digestão in gel
segundo o protocolo descrito por Hanna et al., (2000), com algumas
modificações. Todos os reagentes que foram utilizados foram preparados no
momento do uso.
16 Dias G.S. 2013 Material e Métodos Inicialmente os fragmentos de gel recortados foram incubados em 500
µL de uma solução de metanol 50% /ácido acético 5% em água MilliQ® por
duas horas. Em seguida, essa solução foi removida por aspiração com pipeta e
500 µL foram adicionados aos fragmentos de gel, permanecendo por mais uma
hora nesta solução. Em seguida, os fragmentos de gel foram desidratados pela
incubação por 10 min (2 vezes de 5 min) em 200 µL de acetonitrila (100%). A
solução de acetonitrila foi aspirada com pipeta e o restante evaporado em um
sistema de concentração a vácuo (speed vac). Após esta etapa, os pedaços de
gel foram reidratados por 30 min em 30 µL (por fragmento de gel) da solução
redutora (ditiotreitol 10 mM em bicarbonato de amônio 100 mM). Decorrido o
tempo de reidratação com DTT, a solução foi aspirada com pipeta e os
fragmentos de gel foram incubados por 30 min em 30 µL (por fragmento de gel)
da solução alquilante (Iodoacetamida 50 mM em bicarbonato de amônio 100
mM). Em seguida, a solução alquilante foi removida por aspiração com pipeta
e, os fragmentos de gel submetidos à incubação, por 10 min, em 100 µL (por
fragmento de gel) de uma solução de bicarbonato de amônio 100 mM. Após
esta etapa, a solução de bicarbonato de amônio foi retirada e 200 µL (por
fragmento de gel) de acetonitrila 100% foram adicionados e os fragmentos de
gel incubados nesta solução por 5 min. A solução de acetonitrila foi retirada e,
novamente, os fragmentos de gel incubados, por 10 min, em 200 µL (por
fragmento de gel) da solução de bicarbonato de amônio 100 mM. Na última
etapa de desidratação, a solução de bicarbonato de amônio foi retirada e os
fragmentos de gel incubados por 10 min (duas vezes de 5 min) em 200 µL de
acetonitrila 100%. A solução de acetonitrila foi retirada por aspiração com
pipeta e o restante evaporado em sistema speed vac. Os fragmentos de gel
foram reidratados em 5 µL de uma solução de tripsina (50 ng/µL em
bicarbonato de amônio 50 mM), em banho de gelo, por 30 min. Em seguida, a
solução de tripsina foi retirada, uma solução de bicarbonato de amônio 50mM
foi adicionada (em um volume suficiente para cobrir os fragmentos de gel) e os
tubos
contendo
os
fragmentos
de
gel
foram
incubados
em
banho
termostatizado (a 37°C) por 18 horas.
A extração dos peptídeos do gel foi feita com a adição de 30 µL (por
fragmento de gel) da solução 1 - acido fórmico 5% (em água MilliQ) - e
17 Dias G.S. 2013 Material e Métodos incubação dos pedaços de gel por 10 min nesta solução, a temperatura
ambiente. Em seguida, a solução contendo os peptídeos foi transferida para
um novo tubo e, ao pedaço de gel do tubo anterior foram adicionados 12 µL
(por fragmento de gel) da solução 2 - acido fórmico 5% em acetonitrila 50%. Os
fragmentos de gel foram incubados por 20 min (duas vezes de 10 min) nesta
solução, e a solução que foi transferida para o tubo contendo os peptídeos que
foram extraídos com a solução 1. A solução será concentrada em speed vac e
os peptídeos resultantes foram ressuspendidos em 20µL (por amostra) de
ácido fórmico 0,1% e analisados em um espectrômetro de massas do tipo
Quadrupolo – Tempo de Vôo com fonte de ionização nanospray (Q-ToF Ultima,
Waters).
Uma alíquota de 4,5 µl da solução de peptídeos foi aplicada numa
coluna de trapping (coluna C-18; 180 µm x 20 mm, diâmetro interno e
comprimento, respectivamente, Waters) com fluxo de 15 µl /min, ajustado
diretamente no programa do cromatógrafo nano Acquity (Waters). Em seguida
a mistura de peptídeos foi submetida à cromatografia líquida de fluxo
nanométrico, utilizando coluna C-18 capilar de 100 µm x 100 mm (Waters),
num fluxo de 600 nl/min, com um gradiente de 0 a 80 % de acetonitrila
(solvente B) em ácido fórmico 0,1 %, (Solvente A) durante um total de 20 min
(3 % de B em 1 min; 60 % de B em 14 min; 80 % de B em 2 min e 30
segundos; 80% de B em 1 min e de 80-3% de B em 1 min e 30 segundos).
Como calibrante foi utilizada a infusão constante de uma solução de ácido
fosfórico 0,1% / acetonitrila 25 % em água MilliQ®, num fluxo de 700 nl/min.
No espectrômetro, a voltagem e a temperatura da fonte de ionização
foram ajustadas para 3.4 kV e 100 °C, respectivamente. O espectrômetro foi
operado no modo DDA, utilizando uma varredura de massas na região de m/z
de 200 a 2000, seguida da dissociação induzida por colisão dos 3 íons mais
intensos. O espectrômetro foi ajustado para operar com um tempo de exclusão
dinâmica de 90 segundos (para se diminuir a aquisição repetitiva de um mesmo
valor de m/z).
18 Dias G.S. 2013 Material e Métodos 3.10.
Análise
do
perfil
proteico
dos
venenos
por
espectrometria de massas (LC-MS)
Uma alíquota de 4,5 µl da solução de veneno (contendo 1 µg, em ácido
fórmico 0,1 %) foi aplicada numa coluna de trapping (conforme descrito no item
3.9.). A cromatografia ocorreu utilizando um gradiente de 0 a 80 % de
acetonitrila (solvente B) em ácido fórmico 0,1 %, (Solvente A) durante um total
de 60 min (3 % de B em 1 min; 45 % de B por 57,5 min; 80 % de B por 1 min e
voltando a condição inicial de 80-3% de B em 1 min). A análise de massas foi
realizada utilizando o espectrômetro Q-TOF Ultima (Waters), utilizando os
mesmos parâmetros descritos anteriormente (item 3.9).
3.11. Critério para identificação dos peptídeos e análise
em banco de dados
Para identificação dos peptídeos gerados pela digestão das proteínas
com tripsina utilizamos o banco não redundante do National Center for
Biotechnology Information (nrNCBI Databank) e restringimos o universo de
busca à taxonomia Serpentes, que contava com 25211 proteínas depositadas
na data 20 de Junho de 2011. Como parâmetros de busca foram utilizados: i)
uma clivagem perdida pela tripsina; ii) resíduos de cisteína carbamidometilados
(que foram escolhidos como uma modificação fixa) e resíduos de metionina
oxidados (que foram escolhidos como uma modificação variável). Utilizando o
programa Mascot (Matrix Science), acessado através de um servidor instalado
no Laboratório Especial de Toxinologia Aplicada (Mascot Server versão 2.2),
para identificação, foram considerados os peptídeos cujos íons individuais
excederam os valores de homology score associados e cujos scores para os
íons de carga +1,+2, +3 e +4 e apresentaram valores maiores ou iguais a 10,
20, 20 e 40, respectivamente.
19 Dias G.S. 2013 Material e Métodos 3.12.
Análise
estatística
comparativa
de
algumas
propriedades dos venenos
As amostras foram divididas em dois grupos: machos (n= 9) e fêmeas
(n= 12). As variáveis analisadas foram: concentração proteica, atividade
caseinolítica, atividade amidolítica e atividade coagulante. Para cada variável,
foi realizado o teste de normalidade Kolmogorov-Smirnov (Henderson, 2006),
que mostrou que todas apresentavam distribuição normal.
Para a comparação de médias entre os dois grupos, empregou-se o
Teste T com amostras independentes, considerando igualdade de variâncias
em todas as comparações, fator este definido através da análise de igualdade
de variâncias (estatística F). Para o Teste T, considerou-se um intervalo de
confiança de 95%.
Para a realização das análises estatísticas foi utilizado o pacote Action®
(Estatcamp), que é um software livre (URL: http://www.portalaction.com.br),
instalado como suplemento do MicrosoftTM Excel.
Para a análise de cluster, foi utilizado o método de agrupamento
hierárquico,
considerando
como
parâmetros
a
distância
euclidiana
e
encadeamento completo. As variáveis utilizadas na análise foram: sexo,
atividade caseinolítica, atividade amidolítica e atividade coagulante. Foi omitida
da análise a informação acerca da procedência geográfica das amostras, de
modo que qualquer agrupamento que porventura separasse as amostras de
acordo com a região de procedência seria baseado um reflexo das
características do veneno e/ou sexo das serpentes.
20 Dias G.S. 2013 Resultados 4. RESULTADOS
4.1. Quantificação da concentração proteica nos venenos
individuais de filhotes de B. jararaca
Para este estudo foram coletadas amostras individuais de veneno de 21
filhotes de B. jararaca. A coleta foi realizada mensalmente, durante 9 meses
consecutivos, juntamente com o Pesquisador Msc. Sávio Sant´anna. Embora
nascidas no Instituto Butantan, no Laboratório de Herpetologia, sua
progenitoras (que chegaram em estado de prenhez) são provenientes de 9
regiões diferentes (Tabela 2). A quantificação de proteínas foi feita utilizando
duas concentrações do veneno em triplicata. A concentração de proteínas nos
venenos frescos variou entre os indivíduos, porém a maioria deles apresentou
valores entre 110 a 120 mg/ml, enquanto que dois espécimes apresentaram
valores extremos abaixo (87 mg/ml) e acima (135 mg/ml) de concentração
proteica (Tabela 3).
21 Dias G.S. 2013 Resultados Tabela 2. Dados dos espécimes de serpentes B. jararaca filhotes utilizados neste estudo.
Amostras
Procedência
Sexo
1
São Bento do Sul-SC
♂
2
São Bento do Sul-SC
♀
3
São Bento do Sul-SC
♂
4
São Bento do Sul-SC
♂
5
São Bento do Sul-SC
♀
6
São Bento do Sul-SC
♂
7
São Bento do Sul-SC
♂
8
São Bento do Sul-SC
♂
9
Pilar do Sul-SP
♂
10
Pilar do Sul-SP
♀
11
Ibiúna-SP
♀
12
Ibiúna-SP
♀
13
São Lourenço da Serra-SP
♂
14
São Lourenço da Serra-SP
♀
15
São Lourenço da Serra-SP
♀
16
Extrema-MG
♀
17
Pilar do Sul-SP
♂
18
Araçariguama-SP
♀
19
Santana do Parnaíba-SP
♀
20
Ribeirão Pires-SP
♀
21
Tapiraí-SP
♀
22 Dias G.S. 2013 Resultados Tabela 3. Quantificação de proteínas presentes nos venenos individuais de B. jararaca
filhotes.
Venenos
Concentração proteica
(mg/ml)
1
86,64 ± 3,9
2
108,28 ± 4,4
3
113,15 ± 3,3
4
90,9 ± 10,7
5
110,86 ±14,2
6
128,16 ± 3,9
7
116,67 ± 16,2
8
131,24 ± 12,0
9
118,97 ± 10,0
10
122,38 ± 11,5
11
110,09 ±5,7
12
129,71 ± 8,7
13
123,35 ± 10,1
14
110,50 ± 11,4
15
118,91 ± 16,6
16
127,76 ± 17,4
17
127,24 ± 18,0
18
106,15 ± 10,3
19
134,66 ± 13,1
20
119,13 ± 15,9
21
108,92 ± 15,7
Os valores representam a média ± desvio padrão de 3 determinações.
23 Dias G.S. 2013 Resultados 4.2. Comparação do perfil eletroforético individual de
venenos de filhotes de B. jararaca
Para a comparação dos proteomas dos venenos, a análise do perfil
eletroforético, seja ela realizada com ou sem redução das pontes de dissulfeto
das proteínas, é uma técnica útil para se entender a natureza da complexidade
dos componentes do veneno. Para visualização inicial do perfil protéico
individual dos venenos, 20 µg de cada amostra foram submetidos à
eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida 12% e os géis foram corados com
Azul de Coomassie Coloidal.
Diversas diferenças foram visualizadas entre as 21 amostras de venenos
de filhotes, sendo elas pertencentes à mesma ninhada ou à ninhadas
diferentes. A variabilidade também pôde ser vista de acordo com o sexo e a
região. Na Figura 2, pode-se verificar bandas distintas no perfil eletroforético,
em condições não redutoras, desde a região de massa molecular abaixo de 10
kDa, até acima de 70 kDa. Foram visualizadas bandas similares, mas não
idênticas em intensidade, em todas as amostras, como aquelas presentes na
região de 45-50 kDa. Verificamos também que todas os venenos apresentaram
perfil de bandas bem distinto na região de 18 a 22 kDa. Na Figura 2, as massas
moleculares indicadas para as bandas de proteínas dos venenos não são
exatas já que as proteínas não foram submetidas à redução de suas pontes de
dissulfeto e assim não são comparáveis exatamente àquelas das proteínas
marcadoras de massa molecular que foram submetidas à redução.
24