JULIANA DE MAGALHÃES BANDEIRA
Compatibilidade reprodutiva e micropropagação de ameixeiras japonesas
Tese apresentada ao Programa de PósGraduação
em
Agronomia
da
Universidade Federal de Pelotas, como
requisito parcial à obtenção do título de
Doutor em Ciências: Fruticultura de Clima
Temperado.
Orientador: Valmor João Bianchi
Co-Orientador: José Antonio Peters
Co-Orientador: Maria do Carmo Bassols Raseira
Pelotas/RS, 2010
Dados de catalogação na fonte:
(Marlene Cravo Castillo – CRB-10/744)
B214c Bandeira, Juliana de Magalhães
Compatibilidade reprodutiva e micropropagação de ameixeiras
japonesas/Juliana de Magalhães Bandeira; orientador Valmor João
Bianchi; co-orientadores José Antonio Peters e Maria do Carmo
Bassols Raseira. - Pelotas, 2010. -120f.; il..- Tese (Doutorado) –
Programa de Pós-Graduação em Agronomia. Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas,
2010.
1. Prunus salicina 2. Cultivo in vitro 3.Polinização controlada I Bianchi, Valmor João (orientador) II. Título.
CDD 634.22
Banca examinadora:
__________________________
__________________________
Dr. Elizete Beatriz Radmann
Dr. Leonardo Ferreira Dutra
Universidade Federal de Pelotas
Embrapa Clima Temperado
__________________________
__________________________
Dr. Márcia Wulff Schuch
Dr. Paulo Vitor Dutra de Souza
Universidade Federal de Pelotas
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
__________________________
Valmor João Bianchi
Orientador
Aos meus pais, Celso e Ieda,
Aos meus irmãos, Rafael, Carolina, Letícia e Felipe
Dedico.
Ao meu namorado, Sérgio Renato
Ofereço.
Agradecimentos
Em primeiro lugar, agradeço a minha família pelo apoio, incentivo e
compreensão em todos os momentos da minha vida;
A minha avó Ieda de Magalhães por ser o alicerce de uma família tão
grande quanto a nossa, mantendo-nos unidos, sempre com o espírito alegre e
batalhador, servindo de exemplo a todos nós;
A todos os meus familiares pelo apoio, educação, base familiar e
valores morais, através dos quais pude formar meu caráter. Agradeço, em
especial, aos meus pais Celso e Ieda, e irmãos (Rafael, Carolina, Letícia e
Felipe) por sempre terem acreditado em mim, me incentivando e vibrando a
cada conquista. Aos meus tios Ariano Martins de Magalhães Jr. e Airton José
Rombaldi pelo apoio, incentivo e acima de tudo por serem pessoas
maravilhosas, grandes pesquisadores e ótimos exemplos a serem seguidos;
Ao meu namorado Sérgio Renato pelo companheirismo, apoio, garra,
incentivo, compreensão, se fazendo presente durante todas as etapas desta
caminhada;
À Universidade Federal de Pelotas (UFPel) pela oportunidade de
realizar o curso de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em
Fruticultura de Clima Temperado, em especial ao Departamento de Botânica e à
Embrapa Clima Temperado pela oportunidade e disponibilização de suas
dependências físicas para o desenvolvimento deste trabalho;
Ao Prof Dr. Valmor João Bianchi pela imprescindível orientação,
profissionalismo, colaboração, incentivo, auxílio e amizade, assim como aos
professores co-orientadores Dr. José Antônio Peters e Drª. Maria do Carmo
Bassols
Raseira,
por
sua
especial
atenção,
confiança,
dedicação
e
ensinamentos durante a realização do curso;
À Profª. Drª. Eugênia Jacira Bolacel Braga e ao Prof. Dr. Marcos Antonio
Bacarin pela colaboração, apoio, incentivo, disposição e amizade;
Aos demais professores e pesquisadores do curso de Pós-Graduação
em Agronomia, concentração em Fruticultura de Clima Temperado que fizeram
parte do meu crescimento profissional, Andrea de Rossi Rufato, Caroline
Marques Castro, Flávio Herter, Márcia Wulff Schuch e José Carlos Fachinello
devido ao profissionalismo e ensinamentos transmitidos, imprescindíveis à
realização do curso de doutorado;
Aos colegas e amigos do Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas
pelo apoio e incentivo. Em especial à Carina da Silva, Daiane Benneman,
Elizete Radmann, Ilda da Silva, Isabel Rodrigues, Letícia Benitez, Letícia
Barbosa, Luciane Arantes, Luciana Nogueira, Luis Willian Arge, Márcia Ribeiro,
Monalize Mota, Rodrigo Danielowski e Simone Wendt, os quais tornaram este
período muito mais prazeroso e agradeço em especial, à bolsista Liane Bahr
Thurow pela dedicação, apoio, amizade e incansável ajuda;
Aos funcionários, pesquisadores, colegas e estagiários, mas, sobretudo
amigos, do Laboratório de Melhoramento Genético Vegetal, da Embrapa Clima
Temperado, Gisely Correia, Daiana Finkenauer, Diego Borges Duarte, Everton
Pederzol, José Martins Pereira, Luciane Leitzk, Maicon Bonemann, Maria de
Fátima Tavares da Silveira, Marcelo Couto, Patrícia Einhardt, Rodrigo Franzon e
Tiago da Silveira, por terem me recebido gentilmente na Embrapa, pelo apoio,
dedicação e amizade;
Aos demais colegas e amigos do curso de Pós-Graduação em
Agronomia pelo apoio, dedicação e cooperativismo André de Souza, Andressa
Comiotto, Cari Timm; Cláudia Lima, Doralice Fischer, Evandro Schneider,
Fernanda Azevedo, Fernando Hawerroth, Ivan Pereira, Juliano Shimitz, Mateus
Pasa, Poliana Francescatto, Luciano Picolotto, Simone Galarca, Thaís
Cappellaro, Tânia Pelizza e Zeni Tomaz, por mais breve que tenha sido o nosso
convívio, valeu a pena cada momento;
Aos meus amigos que muitas vezes sem entender as preocupações que
me acercavam, sempre estiveram presentes me auxiliando, apoiando e vibrando
a cada conquista, amenizando os percalços desta caminhada;
E é claro, a todos que de alguma forma contribuíram para realização
deste trabalho e do meu crescimento profissional.
Saibam que eu carrego comigo um
pouquinho de cada um de vocês.
Muito obrigada a todos!
“... Porque se a estrada me cobra, pago seu preço
E desabrigo o caminho pra o meu sustento
Mesmo que o mundo desabe num tempo feio
Sei o que as asas do poncho trazem por dentro...”
Gujo Teixeira E Luiz Marenco
“... Carrego nas costas meu mundo
E junto umas coisas que me fazem bem
Fazendo da minha janela
Imenso horizonte, como me convém ...”
Luiz Marenco
“A vida é curta,
A arte é longa,
A oportunidade fugaz,
A experiência falaciosa,
O julgamento difícil.”
Hipócrates
Resumo Geral
BANDEIRA,
Juliana
de
Magalhães.
Compatibilidade
reprodutiva
e
micropropagação de ameixeiras japonesas. 2010. 120f. Tese (Doutorado) –
Programa de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em Fruticultura
de Clima Temperado. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas/RS.
A ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.) tem papel de destaque na fruticultura
mundial. Possui grande importância no mercado brasileiro e vem ganhando adeptos
à sua produção, principalmente no Rio Grande do Sul e Santa Catarina onde as
condições de inverno favorecem o seu cultivo. Porém, existem alguns problemas
enfrentados pelos produtores e melhoristas que limitam o aumento da produção
nacional de ameixeiras, entre esses, destacam-se a autoincompatibilidade
gametofítica, devido à presença de um loco multialélico (contendo os denominados
alelos-S) e a suscetibilidade à Xillela fastidiosa Wells, que afeta a qualidade do material
propagativo. Frente a esses problemas, o objetivo da realização deste trabalho foi
identificar fisiologicamente os alelos-S de seis cultivares de ameixeira japonesa e
desenvolver um protocolo de micropropagação para a cv. América. Desta forma,
foram realizados experimentos de polinização controlada nos campos experimentais
da Embrapa Clima Temperado (Pelotas/RS) e polinização in vivo, em laboratório, de
seis cultivares copa de ameixeira japonesa (América, Rosa Mineira, Pluma 7,
Amarelinha, Reubennel e Santa Rosa), onde foram avaliados a frutificação efetiva e
o crescimento do tubo polínico (CTP), respectivamente. Também foram realizados
experimentos no Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas (UFPel/RS), visando
identificar um protocolo adequado para a micropropagação da cv. América. Nos
estudos de compatibilidade reprodutiva, a frutificação efetiva foi muito baixa para
todos os cruzamentos, sendo observado maior valor na autopolinização da
‘Reubennel’ (8,41%). ‘América’ somente apresentou frutificação quando polinizada
com as cvs. Rosa Mineira, Amarelinha, Santa Rosa e Reubennel, sendo que essa
última apresentou compatibilidade mútua com a cv. América. ‘Amarelinha’ e ‘Rosa
Mineira’ mostraram-se compatíveis com o pólen da ‘Rosa Mineira’ e ‘Reubennel’.
Houve interação significativa para o grau de CTP e o pólen utilizado para polinizar
cada um dos genitores femininos, sendo que os cruzamentos entre ‘América’ x
‘Pluma 7’ e ‘Rosa Mineira’ x ‘Santa Rosa’ foram incompatíveis enquanto que a cv.
América apresentou-se autoincompatível. Alguns cruzamentos que não
apresentaram polinização e frutificação no campo, atingiram o óvulo (grau 6) ou o
ovário (grau 5) durante a polinização in vivo, tais como ‘Reubennel’ x ‘Rosa Mineira’;
9
‘Rosa Mineira’ e ‘Amarelinha’ x ‘América’ e ‘Amarelinha’ e ‘Pluma 7’, e ‘Santa Rosa’ x
‘América’. Estes resultados, juntamente com os dados moleculares dos alelos-S,
permitem um melhor entendimento a respeito da biologia reprodutiva de P. salicina.
Nos experimentos de micropropagação verificou-se que o estabelecimento in vitro
de explantes basais da cv. América em meio MS, é superior ao de explantes apicais.
Concentrações de BAP entre 0,25 e 0,50mg dm-3 são mais adequadas para sua
multiplicação enquanto que o meio MS suplementado com 1,0mg dm-3 de AG3 e 2,0g
dm-3 de carvão vegetal é o mais adequado para o alongamento in vitro de suas
brotações. A metade da concentração dos sais e vitaminas do meio MS com a
adição de 1,0mg dm-3 de AIB é o mais eficiente para o enraizamento in vitro de
brotações de ameixeira japonesa, cv. América, por períodos inferiores a 20 dias,
atingindo 88% de sobrevivência após 30 dias de aclimatização.
Palavras-Chave: Prunus salicina. Cultivo in vitro. Polinização controlada.
10
General Abstract
BANDEIRA, Juliana de Magalhães. Reproductive compatibility and
micropropagation of Japanese plum. 2010. 120p. Tese (Doutorado) – Programa
de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em Fruticultura de Clima
Temperado. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas/RS.
The Japanese plum (Prunus salicina Lindl.) has an important role in the horticulture
worldwide. It has great importance in Brazilian market and is gaining fans for its
production, especially in Rio Grande do Sul and Santa Catarina where winter
conditions are propicious to its cultivation. However, there are some problems faced
by farmers and breeders, which limit the increase in domestic production of plum
trees, among these, there are the gametophytic self-incompatibility, due to the
presence of a codominant multi-site (containing the so-called S-alleles) and
susceptibility to Xillela fastidiosa Wells, which affects quality of propagation material. In
face of these problems, the objective of this work was to identify physiologically Salleles of six cultivars of Japanese plum and develop a micropropagation protocol for
the cv. America. Thus, experiments of controlled pollination were carried out in
experimental fields at Embrapa Clima Tempreado (Pelotas/RS) and the in vivo
pollination were carried out in the laboratory of six cup cultivars of Japanese plum
(America, Rosa Mineira, Pluma 7, Amarelinha, Reubennel and Santa Rosa), to
evaluate the fruit set and pollen tube growth (CTP), respectively. Additionaly, were
also performed experiments of micropropagation in the Laboratory of Plant Tissue
Culture (UFPel/RS) to identify an appropriate protocol for micropropagation of cv.
America. In studies of reproductive compatibility, the fruit set was very low for all
crosses, with the larger value had occur in the autopollination of 'Reubennel' (8.41%).
'America' only formed fruit when pollinated with the cvs. Rosa Mineira, Amarelinha,
Santa Rosa and Reubennel, these last one had mutual compatibility with cv.
America. 'Amarelinha' and 'Rosa Mineira' proved to be compatible with the pollen of
'Rosa Mineira' and 'Reubennel'. There was significant interaction for CTP level and
pollen used to pollinate each female parents, and the crosses between 'America' x
'Pluma 7' and 'Rosa Mineira' x 'Santa Rosa' were incompatible while cv. America is
self-incompatible. Some crosses that showed no pollination and fruiting in the field,
hit the egg (level 6) or ovary (level 5) during in vivo pollination, such as 'Reubennel' x
'Rosa Mineira', 'Rosa Mineira' and 'Amarelinha' x 'America' and 'Amarelinha' and
'Pluma 7', and 'Santa Rosa' x 'America'. These results, together with the molecular
data of S-alleles, allow a better understanding of the reproductive biology of P. salicina.
In the micropropagation experiments we found that the in vitro establishment of basal
11
explants of cv. America in MS medium is higher than the apical explants. BAP
concentrations between 0.25 and 0.50mg dm-3 are more appropriate for the
multiplication while MS medium supplemented with 1.0mg dm-3 GA3 and 2.0g dm-3 of
vegetal charcoal is the most appropriate to in vitro elongation of their shoots. Half of
concentration of salts and vitamins of MS medium with the addition of 1.0mg dm-3 of
IBA is the most efficient for the in vitro rooting of Japanese plum, cv. America, during
periods of less than 20 days, reaching 88% survival after 30 days of acclimatization.
Keywords: Prunus salicina. In vitro cultivation. Controlled pollination.
12
Lista de Figuras
Capítulo 1
Caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de
seis cvs. copa de ameixeira japonesa
Figura 1
Percentagem de grãos de pólen germinados no estigma de
cultivares de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), nas
genitoras femininas ‘América’ (a), ‘Amarelinha’ (b), ‘Reubennel’
(c), ‘Rosa Mineira’ (d), ‘Pluma 7’ (e) e ‘Santa Rosa’ (f) após
120h das polinizações controladas, realizadas in vivo e
mantidas em temperatura ambiente. As barras representam o
erro
padrão
da
média.
Embrapa/Pelotas/RS,
2010..............................................................................................
35
Desenvolvimento do tubo polínico no pistilo de flores das
cultivares de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), após
120h das polinizações controladas realizada in vivo e mantidas
em temperatura ambiente (a). Germinação dos grãos de pólen
na superfície estigmática (b), no estilete demonstrando o
depósitos de calose (c) e interrupção do crescimento do tubo
polínico no estilete (d, e), tubo polínico atingindo o ovário (grau
5) (f) e tubo polínico atingindo o óvulo (grau 6) (g).
Embrapa/Pelotas/RS, 2010..........................................................
36
Percentagem de incidência do tubo polínico em cada etapa do
percurso estigma-óvulo de ameixeiras japonesas (Prunus salicina
Lindl.), em função das polinizações controladas, realizadas in
vivo, após 120h, e mantidas em temperatura ambiente nas
genitoras femininas ‘América’ (a), ‘Santa Rosa’ (b), ‘Pluma 7’
(c), ‘Amarelinha’ (d), ‘Rosa Mineira’ (e) e ‘Reubennel’ (f). As
barras
representam
o
erro
padrão
da
média.
Emrapa/Pelotas/RS, 2010............................................................
38
Figura 2
Figura 3
13
Capítulo 2
Estabelecimento, multiplicação e alongamento in vitro da
ameixeira japonesa, cv. América
Figura 1
Comprimento médio das brotações (cm), número médio de
folhas e de gemas formadas nos explantes de gemas apicais e
basais (a) e aspecto das brotações iniciais de ameixeira
japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, a partir de
explantes apicais (b) e basais (c), após 30 dias do
estabelecimento in vitro em meio MS. As barras representam o
erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010.........................
53
Comprimento médio das brotações de ameixeira japonesa
(Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in
vitro, em função do tipo de regulador de crescimento (BAP e
2iP) e suas concentrações (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm-3). As
barras representam o erro padrão da média. ns* equação de
regressão polinomial não significativa. UFPel, Pelotas/RS,
2010..............................................................................................
54
Número médio de brotos (a) e de gemas (b) por explante das
brotações de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv.
América, aos 40 dias de cultivo in vitro em função do tipo de
regulador de crescimento (BAP e 2iP) e suas concentrações (0;
0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm-3). As barras representam o erro
padrão da média. ns* equação de regressão polinomial não
significativa. UFPel, Pelotas/RS, 2010.........................................
55
Brotações de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv.
América, aos 40 dias de cultivo in vitro em meio MS acrescido
de citocininas (BAP e 2iP) em diferentes concentrações (0;
0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm-3). UFPel, Pelotas/RS,
2010..............................................................................................
56
Média da massa seca (mg) das brotações de ameixeira
japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de
cultivo in vitro em função da adição de citocininas (BAP e 2iP)
(a) e suas concentrações (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm-3) (b).
As barras representam o erro padrão da média. UFPel,
Pelotas/RS, 2010.........................................................................
58
Comprimento médio das brotações (cm) (a); número médio de
gemas e de brotações por explante (b); média da massa seca
das brotações (mg) (c); aspecto geral das brotações de
ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40
dias de cultivo in vitro em função dos diferentes meios de
cultura. As barras representam o erro padrão da média. UFPel,
Pelotas/RS, 2010.........................................................................
59
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 6
14
Figura 7
Figura 8
Comprimento médio das brotações (a) e aspecto das brotações
(b) de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América,
aos 40 dias de cultivo in vitro em função da adição AG3 nas
concentrações de 0; 0,25; 0,50; 0,75; 1,0mg dm-3, acrescido de
2,0mg dm-3 de carvão vegetal ativado. As barras representam o
erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010.........................
61
Comprimento médio (a) e aspecto das brotação (b) de
ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40
dias de cultivo in vitro em meio MS suplementado com AG3 nas
concentrações de 0; 1; 5 e 10mg dm-3 na presença ou ausência
de carvão vegetal ativado. As barras representam o erro
padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010................................
62
Capítulo 3
Enraizamento in vitro e aclimatização de brotações de ameixeira
japonesa cv. América
Figura 1
Percentagem de enraizamento, de formação de raízes
secundárias, de primórdios radiculares e de calos (a), e número
de raízes por brotação (b) de ameixeira japonesa (Prunus salicina
Lindl.), cv. América, aos 20 dias de cultivo in vitro no meio
MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIA (0; 0,5 e
1,0mg dm-3). As barras representam o erro padrão da média.
UFPel, Pelotas/RS, 2010.............................................................
71
Percentagem de sobrevivência após 20 dias de aclimatização
(a); volume (cm3) e massa seca das raízes (g) (b), e aspecto
geral das plantas (c) de ameixeira japonesa (Prunus salicina
Lindl.), cv. América, micropropagadas e enraizadas in vitro em
meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIA (0;
0,5 e 1,0mg dm-3) , após 120 de aclimatização. As barras
representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS,
2010.............................................................................................
72
Número de raízes por brotação (a) e percentagem de
enraizamento de brotações de ameixeira japonesa (Prunus
salicina Lindl.), cv. América, aos 20 dias de cultivo in vitro no
meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIB e AIA
(0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0mg dm-3). As barras representam o
erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010.........................
74
Comprimento médio das raízes de plantas de ameixeira
japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 20 dias de
cultivo in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes
concentrações de AIB e AIA (0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0mg dm-3).
As barras representam o erro padrão da média. ns* equação de
regressão polinomial não significativa. UFPel, Pelotas/RS,
2010.............................................................................................
75
Figura 2
Figura 3
Figura 4
15
Figura 5
Figura 6
Plantas de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv.
América, após 20 dias de cultivo in vitro no meio MS/2
acrescido de diferentes concentrações de AIB (a-e) e AIA (f-j)
(0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0mg dm-3). UFPel, Pelotas/RS, 2010.....
76
Percentagem de sobrevivência após 20 (a) e 30 (b) dias de
aclimatização de plantas de ameixeira japonesa (Prunus salicina
Lindl.), cv. América, micropropagadas e enraizadas in vitro em
meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIA (0;
0,5 e 1,0mg dm-3). UFPel, Pelotas/RS, 2010...............................
78
16
Lista de Tabelas
Capítulo 1 Caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis
cvs. copa de ameixeira japonesa
Tabela 1
Tabela 2
Tabela 3
Genótipos de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.) utilizados
para a polinização controlada e posterior caracterização
fisiológica da compatibilidade reprodutiva. Embrapa/Pelotas/RS,
2010................................................................................................
29
Notas atribuídas ao grau de desenvolvimento do tubo polínico
através do pistilo das cultivares de ameixeira japonesa (Prunus
salicina Lindl.) polinizadas in vivo. Embrapa/Pelotas/RS,
2010................................................................................................
30
Percentagem de frutificação efetiva dos cruzamentos
controlados, realizados a campo, nos pomares de ameixeira
japonesa (Prunus salicina Lindl.) da Embrapa Clima Temperado,
no ano de 2008. Embrapa/Pelotas/RS, 2010.................................
32
Capítulo 2 Estabelecimento, multiplicação e alongamento in vitro de
ameixeira japonesa, cv. América
Tabela 1
Percentagem de contaminação e de oxidação dos explantes
com gemas apicais e basais de ameixeira japonesa (Prunus
salicina Lindl.), cv. América, após 30 dias do estabelecimento in
vitro em meio MS. UFPel, Pelotas/RS, 2010..................................
51
17
Sumário
Resumo Geral ............................................................................................................8
General Abstract .....................................................................................................10
Lista de Figuras.......................................................................................................12
Lista de Tabelas ......................................................................................................16
Sumário....................................................................................................................17
Introdução Geral......................................................................................................19
Capítulo 1 - Caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis
cvs. copa de ameixeira japonesa...........................................................................24
1.1 Introdução ......................................................................................................25
1.2 Material e Métodos.........................................................................................28
1.3 Resultados e Discussão................................................................................31
1.4 Conclusão ......................................................................................................43
Capítulo 2 - Estabelecimento, multiplicação e alongamento in vitro de
ameixeira japonesa, cv. América ...........................................................................44
2.1 Introdução ......................................................................................................45
2.2 Material e métodos ........................................................................................48
2.2.1 Experimento 1 – Estabelecimento in vitro de ameixeira japonesa cv.
América.................................................................................................................48
2.2.2 Experimento 2 – Multiplicação in vitro de ameixeira japonesa cv.
América.................................................................................................................49
2.2.3 Experimento 3 – Alongamento in vitro de brotações de ameixeira
japonesa cv. América ..........................................................................................50
2.3 Resultados e discussão ................................................................................51
18
2.3.1 Experimento 1 – Estabelecimento in vitro de ameixeira japonesa cv.
América.................................................................................................................51
2.3.2 Experimento 2 – Multiplicação in vitro de ameixeira japonesa cv.
América.................................................................................................................53
2.3.3 Experimento 3 – Alongamento in vitro de brotações de ameixeira
japonesa cv. América ..........................................................................................60
2.4 Conclusão ......................................................................................................64
Capítulo 3 - Enraizamento in vitro e aclimatização de brotações de ameixeira
japonesa cv. América..............................................................................................65
3.1 Introdução ......................................................................................................66
3.2 Material e Métodos.........................................................................................69
3.3 Resultados e Discussão................................................................................70
3.4 Conclusão ......................................................................................................79
Considerações Finais .............................................................................................80
Referências ..............................................................................................................81
Apêndices ..............................................................................................................100
Apêndice A – Capítulo 1....................................................................................101
Apêndice B – Capítulo 2....................................................................................107
Apêndice C – Capítulo 3....................................................................................112
Anexos ...................................................................................................................115
Anexo A ..............................................................................................................116
Anexo B ..............................................................................................................117
Anexo C ..............................................................................................................119
Anexo D ..............................................................................................................120
19
Introdução Geral
Dentre as plantas lenhosas cultivadas, as espécies frutíferas apresentam um
importante papel econômico no Brasil, pois contribuem significativamente para
manter o país como terceiro maior produtor de frutas do mundo, depois da China e
da Índia (PORTOCARRERO, 2005). Em 2007 os pomares brasileiros produziram
43.112.804 toneladas de frutas, em uma área plantada de 2.260.154ha (IBGE,
2009). Devido ao potencial de geração de emprego e renda, a fruticultura ocupa hoje
posição estratégica na expansão do agronegócio brasileiro. A base agrícola da
cadeia produtiva gera 5,6 milhões de empregos, ou seja, 27% do total da mão-deobra agrícola ocupada no País (PORTOCARRERO, 2005).
Dentre as frutíferas exploradas no mundo, várias espécies do gênero Prunus
(P. persica L. Bastch, P. salicina Lindl. e P. domestica L.) são largamente cultivadas por
apresentarem grande aceitação pelos consumidores e por sua rentabilidade, fatos
que têm contribuído para uma notável expansão da produção e também consumo de
frutas no Brasil. Como essas espécies são originárias de locais de clima temperado,
a adaptação ocorre de forma mais fácil nas regiões mais frias do país,
principalmente nos estados do Sul e Sudeste, como Rio Grande do Sul, Santa
Catarina, Paraná, São Paulo e Sul de Minas Gerais, que apresentam condições
edafoclimáticas favoráveis ao cultivo e graças ao uso de cultivares próprias para
microclimas dessas regiões (SEGANFREDO, 1995; BIASI, 2004).
A ameixeira pertence à família Rosaceae, subfamília Prunoidae, gênero Prunus,
que compreende mais de 20 espécies (WEINBERGER, 1975). As espécies mais
importantes são P. salicina Lindl. (ameixeira japonesa), P. domestica L. (ameixeira
européia), P. insititia Linn. (ameixeira européia) e P. cerasifera Ehrn. (ameixeira
mirabolão) (JOLY, 1993).
20
Muitos botânicos indicam a ameixeira como núcleo central de divergência do
gênero Prunus que, por sucessivas variações, originou as diferentes frutíferas da
família Rosaceae. A maioria das cultivares de interesse comercial pertence ao grupo
das ameixeiras japonesas, diplóides (2n=16), originárias do Extremo Oriente, e das
ameixeiras européias, hexaplóides (2n=48), originárias da região do Cáucaso, da
Turquia e da Pérsia (CASTRO et al., 2008a).
As cultivares de ameixeira japonesa são as mais exploradas no Brasil por
possuírem variedades com menor exigência em frio, as quais foram introduzidas
e/ou selecionadas de acordo com as condições climáticas das regiões com potencial
para sua produção. Por outro lado, as ameixeiras européias são pouco cultivadas,
devido à alta exigência em frio para a superação da dormência, no entanto,
apresentam
grande
importância
econômica
em
outros
países
(REVERS;
MACHADO, 2005).
Em virtude das várias espécies existentes e do resultado de hibridações
ocorridas ao longo do desenvolvimento da cultura, principalmente pelo plantio de
variedades selecionadas, a ameixeira é considerada uma das frutíferas arbóreas que
mais se difundiu pelo mundo (CASTRO et al., 2008a). Entretanto, a produção
brasileira de ameixa japonesa é pequena e insuficiente para suprir a demanda do
mercado interno e destina-se, na quase totalidade, ao consumo in natura. Os frutos
prestam-se também ao aproveitamento industrial, em forma de passas, geléias,
licores e destilados. Em 2008, o país importou cerca de 18.367.942Kg de ameixas in
natura, ocupando terceiro lugar de fruta fresca mais importada, logo após a pêra e a
maçã (IBRAF, 2009). O volume médio de ameixeira comercializado no país entre
2002 e 2007, de acordo com a CEAGESP/SP, foi de 1.904,33t ano-1 (INSTITUTO
FNP, 2007).
Dentre os fatores associados à baixa produção e produtividade da maioria
das cultivares de ameixeira japonesa no Brasil encontra-se a autoincompatibilidade
reprodutiva do tipo gametofítica (GSI - gametofitic self incompatibility) (SCHIFINOWITTMANN; DALL’AGNOL, 2002; RASEIRA, 2003; SAPIR et al., 2004; TAKAYAMA;
ISOGAI, 2005) e a suscetibilidade à escaldadura das folhas, causada pela bactéria
Xillela fastidiosa Wells,
que afeta a qualidade do material propagativo (SILVEIRA et al.,
2003), sendo que uma das principais formas de disseminação desse patógeno é por
meio da propagação de material contaminado.
21
A autoincompatibilidade reprodutiva (SI - self-incompatibility) é um dos
maiores problemas no manejo das culturas que apresentam esta característica e em
programas de melhoramento genético de várias espécies frutíferas, podendo
comprometer significativamente a frutificação efetiva e a produtividade dos cultivos.
No sistema de incompatibilidade gametofítica o determinante feminino é uma RNAse
- a S-RNAse - que se expressa exclusivamente no pistilo e suas proteínas são
localizadas principalmente na parte superior do estilete onde atuam inibindo ou
degradando o RNA do tubo polínico que compartilha o mesmo alelo-S do pistilo
(SCHIFINO-WITTMANN;
DALL’AGNOL,
2002;
TAKAYAMA;
ISOGAI,
2005;
BRUCKNER et al., 2006).
Dentre as espécies pertencentes à família Rosaceae, a qual inclui mais de
110 gêneros e 2.000 espécies, a maioria das cultivares de P. salicina apresentam o
sistema de GSI (SAPIR et al., 2004). Desta forma, a identificação dos alelos-S é
importante para o estabelecimento de pomares com cultivares compatíveis
reprodutivamente e, assim, reduzir perdas no campo, devido a baixa frutificação
efetiva.
Considerando a importância econômica desta cultura para o país, deve-se
procurar compreender melhor o mecanismo reprodutivo que envolve a combinação
entre cultivares polinizadoras, para obtenção de uma produção satisfatória de frutas
(RASEIRA, 2003), utilizando plantas livres de patógenos. Deste modo, metodologias
que permitam avaliar antecipadamente a compatibilidade genética entre cultivares
são de grande interesse, na medida que permitem selecionar previamente cultivares
totalmente compatíveis (MOTA; OLIVEIRA, 2005).
Por meio de ensaios de polinização controlada a campo e in vivo, e
avaliação molecular dos alelos-S das cultivares, é possível tornar o processo de
seleção de uma polinizadora muito mais eficiente (BROOTHAERTS et al., 1995;
ISHIMIZU et al., 1999; YAEGAKI et al., 2001).
Instituições governamentais vêm investindo em pesquisas com a finalidade
de melhorar os sistemas de produção atualmente empregados. A introdução de
novas espécies, o melhoramento genético e a produção de mudas sadias
contribuem para o aumento da eficiência do sistema produtivo. A muda de qualidade
potencializa a resposta à tecnologia aplicada no pomar, auxiliando na redução de
custos e na produção de frutas com alta qualidade e produtividade (OLIVEIRA et al.,
2004).
22
A micropropagação tem sido desenvolvida para inúmeras espécies frutíferas,
como um método alternativo e rápido de propagação vegetativa a partir de uma
célula ou de segmentos de tecidos de plantas (ERIG et al., 2004; ERIG; SCHUCH,
2005a), com a finalidade de multiplicar plantas com as mesmas características
genéticas da planta-matriz, livres de patógenos, independente da época do ano
(SCHUCH; ERIG, 2005), permitindo a produção de matrizes com qualidade genética
e sanitária comprovadas, quando comparado aos métodos convencionais de
enxertia e estaquia (ERIG; SCHUCH, 2005b; GRIMALDI et al.,2008).
A propagação in vitro permite o controle de variáveis responsáveis pelo
desenvolvimento da planta, produzindo material vegetal clonal homogêneo e com
elevada qualidade sanitária (ASSIS; TEIXEIRA, 1998; OLIVEIRA et al., 2006;
SOUZA et al., 2006; SOUZA et al., 2008).
Além disso, esse método de propagação pode ser utilizado para vários
estudos biotecnológicos, a exemplo da transformação genética para características
de interesse. Porém, o uso prático da propagação in vitro de plantas lenhosas,
principalmente prunoídeas, requer domínio da tecnologia de propagação in vitro, o
qual é o resultado de estudos realizados com os fatores que afetam o crescimento e
o desenvolvimento para cada espécie e/ou cultivar, entre eles, a constituição do
meio de cultura, tipo e concentração de reguladores de crescimento (ERIG et al.,
2002; DONINI et al., 2008b).
Dentre as cultivares adaptadas a região sul do país, a ameixeira japonesa (P.
salicina)
devido
cv. América é considerada uma das preferidas do mercado sul-brasileiro,
às
suas
características
organolépticas,
porém,
é
uma
cultivar
autoincompatível, que apresenta grande flutuação na produtividade e exige
polinização cruzada para que ocorra a frutificação (RASEIRA, 2003). É uma das
cultivares recomendadas para o plantio no Rio Grande do Sul, considerada região
de clima ameno, já que exige cerca de 500 a 600 horas de acúmulo de frio
(temperaturas inferiores a 7,2ºC) e suas principais polinizadoras são as cultivares
Reubennel e Rosa Mineira (CASTRO et al., 2008a).
Diante do exposto, a caracterização fisiológica da compatibilidade
reprodutiva entre cultivares de ameixeira japonesa é de grande valia para a
confirmação da caracterização molecular dos alelos-S, a qual foi realizada
previamente no Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas da UFPel (MOTA,
2008), além de possibilitar seu uso como subsídios para programas de
23
melhoramento genético, já que estudos relacionados a caracterização fisiológicas da
compatibilidade reprodutiva das cultivares de ameixeira japonesa adaptadas a
região sul do país são bastante escassos e desatualizados em virtude das
mudanças climáticas.
Por outro lado, a técnica de micropropagação permite a multiplicação clonal
de plantas em larga escala, com alta qualidade genético-sanitária para a formação
de pomares, além de fornecer material para experimentos de regeneração, que é
uma etapa crucial para o melhoramento via transformação genética, almejando
selecionar novos genótipos com características de interesse.
Dentre as características desejadas para a ameixeira está a obtenção de
plantas autoférteis, que pode ser obtida por meio do silenciamento gênico via RNAi
(RNA de interferência), responsável pela degradação dos RNAs homólogos no
citosol, impedindo, desta forma, que ocorra a tradução do RNA alvo (VAUCHERET
etal., 2001), podendo promover, neste caso, o bloqueio da tradução dos alelos-S
envolvidos na incompatibilidade reprodutiva. Para este estudo foi eleita a cv.
América por ser bem adaptada a região sul do país, com boa produção e aceitação
do
mercado
consumidor,
reprodutivamente.
além
de
ser
categoricamente
autoincompativel
24
Capítulo 1
Caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis cvs.
copa de ameixeira japonesa
25
Caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis cvs. copa de
ameixeira japonesa
1.1 Introdução
Dentre as espécies de ameixeira, Prunus salicina Lindl. (2n=18), também
conhecida como ameixeira japonesa, é a mais cultivada no Brasil por possuir
genótipos com menor exigência em frio, os quais foram introduzidos e/ou
selecionados de acordo com as condições climáticas das regiões aptas para o
cultivo (REVERS; MACHADO, 2005). Entretanto, as cultivares de ameixeira
japonesa apresentam diferentes graus de compatibilidade reprodutiva, determinada
por um loco multialélico, contendo os denominados alelos-S (TAKAYAMA; ISOGAI,
2005), necessitando de plantio de cultivares polinizadoras durante a instalação do
pomar, a fim de garantir a fecundação e níveis de produção aceitáveis
economicamente.
É indicada a implantação de pelo menos uma planta polinizadora para cada
quatro produtoras (CASTRO et al., 2008a), com compatibilidade e período de
floração total ou parcialmente sincronizadas (CARVALHO; RASEIRA, 1989; SAPIR
et al., 2004). O uso de mais de uma cultivar polinizadora também é recomendável
para se ter maior garantia de cobertura de todo o período de floração da cultivar
principal (DALBÓ; FELDBERG, 2009).
O sucesso da polinização cruzada é influenciado por fatores genéticos de
incompatibilidade, pela ação de insetos polinizadores (SPIERS, 1983; HARDER;
THOMSON, 1989; GOLDWAY et al., 1999), fatores ambientais (chuva,vento, baixas
temperaturas após a floração, carência de acúmulo de frio durante o período de
dormência, alternância de temperatura após a polinização), além de possíveis
deficiências de caráter fisiológico, conforme verificado em outras culturas, como por
26
exemplo em macieira (WHILLIAM; MAIER, 1977; PETRI; PASCOAL, 1981;
SCHRAMM, 1985; SOLTÉSZ et al., 1997). De acordo com os mesmos autores,
esses fatores afetam o crescimento e a penetração do tubo polínico até o óvulo.
Para que ocorra a polinização e a fecundação, o grão de pólen deve ser
transportado adequadamente até o estigma, onde emitirá o tubo polínico através do
pistilo, fertilizando o óvulo. Alterações em qualquer um destes processos poderão
impedir
a
formação
do
fruto
(SANZOL;
HERRERO,
2001),
reduzindo
significativamente a frutificação efetiva ou fruit set.
A velocidade de crescimento do tubo polínico (CTP) até o ovário é variável
em angiospermas, podendo ser de poucas horas a dias. Em Acacia retinodes Schltr. o
crescimento do tubo até o ovário leva em torno de 11 horas, enquanto que em
Banksia coccinea
R.Br. pode levar até seis dias. Pound et al. (2003) verificaram que em
Eucalyptus nitens
(Deane & Maiden) o pólen alcançou o óvulo duas semanas após a
polinização.
Em ameixeiras o CTP é relativamente lento, cerca de 120h (CARVALHO,
1989). A velocidade de crescimento é de extrema importância para o sucesso
reprodutivo da planta, pois quanto mais rápido minimiza-se os danos por fatores
desfavoráveis (TANGMITCHAROEN; OWENS, 1997), os quais podem provocar a
abscisão do estilete, antes da fecundação (CARVALHO, 1989).
A identificação da região do pistilo onde o CTP é interrompido pode
evidenciar o sistema de autoincompatibilidade atuante. Este mecanismo é
considerado um dos sistemas mais importantes, estando presente na maioria das
angiospermas para evitar a autofecundação, produzindo e mantendo a diversidade
dentro das espécies (DE NETTANCOURT, 1977; RICHARDS, 1986; BARRETT,
1988).
De acordo com Bittencourt Júnior. et al. (2003), no sistema de
incompatibilidade reprodutiva do tipo gametofítico os tubos polínicos incompatíveis
têm o seu desenvolvimento cessado no estilete. Por possuir como determinante
feminino uma RNAse - a S-RNAse - a qual segrega junto com os alelos-S e se
expressa exclusivamente no pistilo. Estas proteínas estão presentes desde a
superfície das papilas estigmáticas até o ovário, mas localizam-se principalmente na
parte superior do estilete (HARING et al., 1990; DE NETTANCOURT, 2000;
SHIFINOWITTMANN; DALL’AGNOL, 2002), onde atuam inibindo ou degradando o
RNA do tubo polínico que compartilha o mesmo alelo-S do pistilo (ZISOVICH et al.,
27
2004; ZUCCHERELLI et al., 2002; TAKAYAMA; ISOGAI, 2005; BRUCKNER et al.,
2006).
Este sistema de incompatibilidade é considerado o mais distribuído nas
angiospermas, a exemplo das famílias Rosaceae, Solanaceae, Papaveraceae,
Liliaceae, dentre outras (GIBBS, 1986), constituindo uma das principais barreiras
para programas de melhoramento genético que buscam a obtenção de novas
cultivares, bem como para o manejo reprodutivo dos pomares.
O reconhecimento do pólen incompatível opera no nível de interação
proteína-proteína dos dois determinantes (masculino e feminino), sendo que a
resposta de autoincompatibilidade ocorre quando ambos determinantes estão
carregados com o mesmo alelo-S (BATLLE et al., 1995; BROOTHAERTS et al.,
1995; TAKAYAMA; ISOGAI, 2005). Os grãos de pólen mostram expressão
independente, segregando 1:1, e assim os cruzamentos podem ser compatíveis quando os alelos do grão de pólen e do pistilo são diferentes; semicompatíveis quando pelo menos um alelo-S do grão de pólen é idêntico ao do pistilo e, desta
forma, metade dos grãos de pólen germinam e desenvolvem o tubo polínico normal;
ou totalmente incompatíveis - quando os dois alelos-S do grão de pólen são
idênticos aos do pistilo (RICHARDS, 1986).
A análise da fertilidade do grão de pólen é indispensável para o
melhoramento genético clássico. Portanto, dados sobre a viabilidade e o
desenvolvimento de grãos de pólen são fundamentais para os estudos da biologia
reprodutiva e para o desenvolvimento de programas de melhoramento genético
(FLANKLIN et al., 1995).
A viabilidade do pólen pode ser determinada por diferentes métodos: através
da utilização de corantes, germinação in vitro, germinação in vivo e percentagem de
frutificação efetiva (DAFNI, 1992; KEARNS; INOUYE; 1993; LEITE; SOUZA, 2003).
A avaliação das plantas polinizadoras envolve polinizações controladas a
campo, combinadas com análises laboratoriais, para determinar a viabilidade dos
grãos de pólen (SOUZA; RASEIRA, 1998). Além disso, técnicas de microscopia
permitem analisar características associadas à germinação dos tubos polínicos e
suas taxas de crescimento, servindo também para analisar hibridações efetivas em
programas de melhoramento genético e, assim, elucidar características referentes a
incompatibilidade reprodutiva (KEARS; INOUYE, 1993), sendo considerado um teste
de grande valia, já que elimina resultados falsos de incompatibilidade por não ser
28
influenciados pelos fatores ambientais, os quais, a polinização realizada a campo
está sujeita.
Com base no que foi exposto, a realização deste trabalho teve por objetivo a
caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis cvs. copa de
ameixeira japonesa, por meio da avaliação da frutificação efetiva e do crescimento
do tubo polínico (CTP), após a polinização in vivo, a fim de confirmar alguns dados
da caracterização molecular dos alelos-S destas cultivares, realizada previamente
em nosso laboratório, além de possibilitar seu uso como subsídio para programas de
melhoramento genético.
1.2 Material e Métodos
Para as análises de caracterização fisiológica dos alelos-S foram utilizadas
cultivares de P. salicina (Tab. 1, Anexo A e B) do Campo Experimental da Embrapa
Clima Temperado (CPACT) (Pelotas/RS), tanto para os experimentos realizados a
campo quanto para aqueles realizados em laboratório. As polinizações foram
executadas no momento em que os genótipos a serem polinizados possuíam
número suficiente de flores em estádio de balão para compor os tratamentos.
Durante a hibridação controlada, realizada a campo, para garantir que o
pólen fosse inoculado no período de receptividade máxima do pistilo, as polinizações
foram realizadas repetidamente durante o período de floração. Desta forma, botões
florais foram emasculados e a polinização foi realizada manualmente, passando-se
levemente o dedo indicador contendo o pólen de interesse sobre o estigma. Os
ramos foram ensacados com tecido não tecido (TNT) branco e devidamente
identificadas com fitas plásticas. Após cada cruzamento, as mãos foram lavadas
com álcool 70% para evitar a contaminação de um pólen com o outro. Como
controle, foi realizada a autopolinização das cultivares produtoras, onde os botões
florais foram emasculados e polinizados com o pólen da própria cultivar.
Para verificar a percentagem de fecundação foram polinizadas 150 flores,
em estádio de balão para cada cruzamento, conforme metodologia descrita para
gramíneas, por Wilson e Brown (1957), adaptada para frutíferas como ameixeira,
pereira, pessegueiro e damasqueiro (CARVALHO, 1989; GONÇALVES, 2008). Após
uma semana da polinização retirou-se o TNT para permitir o crescimento normal dos
ramos e desenvolvimento dos frutos, os quais foram contados após 40 dias da
29
polinização, determinando-se a percentagem de frutificação efetiva em relação ao
número de flores polinizadas e ensacadas (fruit set).
Tabela 1 – Genótipos de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.) utilizados para a
polinização controlada e posterior caracterização fisiológica da
compatibilidade reprodutiva. Embrapa/Pelotas/RS, 2010
Genitores femininos
Genitores masculinos
América
Rosa Mineira
Pluma 7
América
Amarelinha
Reubennel
Santa Rosa
The First
Reubennel
Reubennel
América
Rosa Mineira
Reubennel
América
Amarelinha
Amarelinha
Rosa Mineira
América
Reubennel
Rosa Mineira
Rosa Mineira
Amarelinha
Santa Rosa*
América
Pluma 7
Pluma 7
América
Santa Rosa
Santa Rosa**
* Cruzamento realizado apenas in vivo, no laboratório.
** Cruzamento realizado apenas a campo.
A determinação do ponto onde ocorreu a interrupção do CTP foi avaliada por
meio da polinização in vivo e testes de CTP, utilizando o método empregado por
Wilson e Brown (1957), com algumas adaptações. Quatro ramos de cada plantamãe foram coletados a campo, de acordo com a disponibilidade de ramos contendo
dez flores em estádio de balão. Os mesmos foram levados para o laboratório, à
temperatura ambiente (18-20ºC), e mantidos com a base submersa em água para
evitar a desidratação. As flores foram emasculadas e polinizadas manualmente com
o pólen de interesse, conforme as combinações descritas na tab. 1.
30
Os pistilos foram coletados 120 horas após a polinização, colocados em
frascos contendo solução fixativa composta por formol, ácido acético e álcool etílico
(1:1:8) e armazenados em geladeira (4ºC) para, posteriormente, avaliar o CTP por
meio de coloração histoquímica.
Para o preparo das lâminas e visualização do CTP, os pistilos, previamente
fixados, foram lavados três vezes em água destilada e submersos em uma solução
de NaOH (8N) por 24h, à temperatura ambiente, para o amolecimento dos tecidos,
sendo novamente lavados três vezes com água destilada e transferidos para uma
solução de hipoclorito de sódio a 0,5%, durante 10 minutos, para descoloração dos
tecidos. A seguir, foram novamente lavados em água destilada e imersos em
solução aquosa do corante diferencial Lacmóide (Resorcina azul) 1%, por 10
minutos, lavados uma vez com água destilada para retirar o excesso de corante dos
tecidos, para finalmente proceder a montagem da lâmina. O pistilo foi posicionado
em lâmina de vidro, em seguida, acrescentou-se uma ou duas gotas de solução
Lacmóide diluída em água (1:2). Posteriormente, foi coberto com uma lamínula, a
qual foi levemente pressionada, para que rompesse os tecidos do pistilo, permitindo
a visualização do CTP no interior do mesmo.
Após o preparo das lâminas, as mesmas foram visualizadas em microscópio
óptico (Carl Zeiss Ind Brasileira) com ocular de 10x e objetiva de 40x. Foram
observadas 20 lâminas para cada combinação de cruzamento, avaliando-se a
percentagem de grãos de pólen germinados e o grau de desenvolvimento do tubo
polínico. Para esta última variável foram atribuídas notas de 1 a 6, baseado na
classificação de Fraken et al. (1988), com algumas alterações, conforme ilustrado na
tab. 2.
Tabela 2 – Notas atribuídas ao grau de desenvolvimento do tubo polínico através do
pistilo das cultivares de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.)
polinizadas in vivo. Embrapa/Pelotas/RS, 2010
Notas*
Grau de desenvolvimento do tubo polínico
1
Tubo polínico no estigma, sem penetrar no estilete
2
Tubo polínico no 1º terço do estilete
3
Tubo polínico no 2º terço do estilete
4
Tubo polínico no 3º terço do estilete
5
Tubo polínico no interior do ovário
6
Tubo polínico próximo ao óvulo
7
Tubo polínico no óvulo
* Adaptado de Fraken et al., 1988.
31
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com quatro
repetições de cinco flores. As médias foram submetidas à análise de variância e
comparação de médias pelo teste de Duncan com 5% de probabilidade de erro, por
meio do software WinStat 2.0 (MACHADO; CONCEIÇÃO, 2003). Os dados da
variável percentagem de grãos de pólen germinados foram transformados para
(x/100)1/2 enquanto que os graus de desenvolvimento do tubo polínico foram
transformados para log (x), onde x, em ambos os casos, representa o valor
observado.
1.3 Resultados e Discussão
Os resultados das polinizações controladas encontram-se na tab. 3, onde
é possível verificar que a maior percentagem de frutificação efetiva foi obitdo na
autopolinização da cv. Reubennel (8,41%), enquanto que todos os demais
cruzametos apresentaram valores inferiores a 3,5%. De acordo com Van e Bester
(1979), na polinização livre, apenas 5% de frutificação efetiva em cultivares de
ameixeira seria suficiente para assegurar uma boa produção comercial. Embora
estes autores tenham realizado o trabalho em regiões tipicamente de clima
temperado, onde a floração é mais abundante e uniforme do que no Brasil, verificase que ’Reubennel’ é mais adaptada às condições de inverno ameno, do que as
demais cultivares e não é totalmente autoincompatível. Mesmo assim, quando a
floração não é abundante, a pesquisa recomenda o uso de uma cultivar polinizadora.
Em todas as combinações, a autopolinização foi realizada manualmente,
utilizando o pólen da própria cultivar, ao invés de apenas o ensacamento dos botões
florais, o que permitiu depositar grande quantidade de grãos de pólen no estigma,
pois segundo Stephenson e Bertin (1983), Bawa e Webb (1984) e Waser e Price
(1991) em polinizações naturais, o número de grãos de pólen alocados no estigma
nem sempre é suficiente para que haja penetração do tubo polínico no óvulo.
No presente trabalho, durante a autofecundação, obteve-se frutificação
somente nas cvs. Reubennel e Rosa Mineira (Tab. 3), sendo um indicativo de que
são autocompatíveis reprodutivamente. Tal resultado está de acordo com Raseira
(2003), a qual afirma que ambas cultivares são moderadamente compatíveis,
podendo produzir uma boa colheita comercial, mesmo sem a utilização de
32
polinizadora, desde que haja um florescimento abundante e condições climáticas
favoráveis.
Tabela 3 – Percentagem de frutificação efetiva dos cruzamentos controlados,
realizados a campo, nos pomares de ameixeira japonesa (Prunus salicina
Lindl.) da Embrapa Clima Temperado, na safra de 2007/2008.
Embrapa/Pelotas/RS, 2010
Genitores femininos
América
Reubennel
Amarelinha
Rosa Mineira
Pluma 7
Santa Rosa
Genitores masculinos
América
Rosa Mineira
Pluma 7
Amarelinha
Reubennel
Santa Rosa
The First
Reubennel
América
Rosa Mineira
Reubennel
América
Amarelinha
Rosa Mineira
América
Reubennel
Rosa Mineira
Amarelinha
América
Pluma 7
América
Santa Rosa
Frutificação efetiva (%)
0
0,66
0
0,63
2,44
1,33
0
8,41
0,68
0
3,47
0
0
1,28
0
3,47
1,28
0
0
0
0
0
Nos cruzamentos realizados a campo, ‘América’ apresentou frutificação
quando polinizada com as cvs. Rosa Mineira (0,66%), Amarelinha (0,63%), Santa
Rosa (1,33%) e Reubennel (2,44%), sendo que esta última apresentou
compatibilidade mútua com ‘América’ (0,68%). As cvs. Amarelinha e Rosa Mineira se
mostraram compatíveis com ‘Rosa Mineira’ e ’Reubennel’, apresentando 1,28% e
3,47% de frutificação efetiva em ambos cruzamentos, para cada genitora feminina,
respectivamente (Tab. 3). Nos demais cruzamentos não houve frutificação. Mesmo
assim não é possível afirmar que a falta de frutificação tenha ocorrido devido à
autoincompatibilidade reprodutiva, já que existem inúmeros fatores ambientais que
podem influenciar no sucesso da frutificação.
33
Além da incompatibilidade reprodutiva existente entre as cultivares, as
condições climáticas no momento da polinização (WEINBERGER, 1975) e após o
florescimento, tais como chuva, vento, geadas, seca, entre outros, também podem
ocasionar variação na polinização efetiva (THOMPSON; LIV, 1973; BARBOSA,
2006). A pseudocompatibilidade também pode ocorrer, influenciada por fatores
ambientais e fisiológicos que permitem ou não a ocorrência de fertilização entre
cultivares, neste caso, não existe influência de fatores genéticos para a fecundação
(LARSEN, 1983; WHILLIAM; MAIER, 1977; EGEA; BURGOS, 1996).
Ademais, a emasculação, realizada durante os cruzamentos dirigidos, pode
causar injúria no pistilo devido à delicada constituição das flores de ameixeira
(THIELE; STRYDROM, 1964), sendo um importante fator associado à baixa
frutificação observada nos cruzamentos dirigidos.
Diferenças de frutificação efetiva e pegamento do fruto são bastante comuns
de um ano para o outro, sendo influenciado pelas condições ambientais no momento
da polinização e após o florescimento (WEINBERGER, 1975).
Segundo Nava et al. (2009), recentemente tem sido verificada baixa taxa de
frutificação efetiva e/ou irregularidades de produção nos pomares brasileiros de
ameixeiras, pessegueiros, e nectarineiras, principalmente em algumas áreas da
região sul do Brasil. Ressaltam que dentre os possíveis motivos para este
acontecimento está a antecipação do florescimento devido a elevada temperatura
durante o período que antecede a floração, acarretando no retardamento do
desenvolvimento do gametófito feminino e na formação de anomalias dos
gametófitos masculinos. Estes fatores promovem redução da viabilidade do grão de
pólen e baixa produção de sacos embrionários viáveis, resultando na falta de
sincronia no processo de fecundação, reduzindo, desta forma, a frutificação efetiva.
Portanto, esta pode ter sido outra razão para a baixa frutificação efetiva nos
cruzamentos realizados no presente estudo, uma vez que na safra 2007/2008 nos
pomares de ameixeira da Embrapa Clima Temperado (Pelotas/RS) foram muito
prejudicados devido ao rápido aquecimento, no final do inverno, após o acúmulo de
frio hibernal, além da incidência de chuvas no período de florescimento, entre os
meses de agosto a início de novembro.
De acordo com o Laboratório de Agrometeorologia da Embrapa Clima
Temperdo (CPACT) (Pelotas/RS) houve acúmulo de 700h de frio, entre os meses de
maio a setembro de 2007, apresentando em média 4h de frio por dia no mês de
34
maio, 8h nos meses de junho e julho, e 3h no mês de agosto, a partir deste mês as
temperaturas começaram a subir, iniciando, desta forma, a floração de diversas
cultivares, enquanto que no mês de setembro o acúmulo de horas de frio foi de 13h
em apenas três dias do final do mês, causando a queima de diversos botões florais
que já haviam florecido. Quanto ao índice pluviométrico foi verificado que durante a
época de floração houve um acúmulo de precipitação de 206mm no mês de agosto,
no início do florescimento, 148,1mm em setembro, 149,3mm em outubro e 76,9mm
em novembro, as chuvas foram bem distribuídas ao longo de cada mês,
prejudicando a polinização controlada, realizada a campo (Anexo C).
Em relação aos cruzamentos in vivo, realizados no laboratório, foi
observada uma elevada percentagem de grãos de pólen germinados na região
estigmática do pistilo, entre 60-100%, exceto para o pólen da cv. Santa Rosa
(21,67%) e para a cv. Rosa Mineira (40,23%) quando utilizada para polinizar as cvs.
Rosa Mineira e Reubennel, respectivamente. Entretanto, ‘Santa Rosa’ apresentou
70,56% de grãos de pólen germinados na região estigmática da cv. América (Fig. 1),
demonstrando que os grãos de pólen utilizados, quando polinizados nos pistilos das
respectivas genitoras femininas, estavam viáveis e foram capazes de germinar.
De acordo com a análise de variância houve diferença significativa pelo teste
de Duncan para a percentagem de grãos de pólen germinados na região estigmática
da planta-mãe apenas entre os cruzamentos realizados com as genitoras femininas
‘América’, ‘Reubennel’ e ‘Rosa Mineira’ (Fig. 1, ilustração na Fig. 2b).
Na genitora feminina ‘América’ o pólen da cv. Amarelinha teve 100% de
germinação, diferindo das cultivares Rosa Mineira (71,61%), Santa Rosa (70,56%),
América (67,86%) e Reubennel (60%) (Fig. 1a, Apêndice A1). Dentre os
cruzamentos realizados com a cv. Amarelinha, a ‘Rosa Mineira’ apresentou 100% de
germinação dos grãos de pólen na região estigmática, diferindo apenas do
cruzamento com ‘América’ (88,89%) (Fig. 1b, Apêndice A2). Já, em relação à cv.
Reubennel houve diferença na percentagem de germinação do grão de pólen no
estigma entre os três cruzamentos realizados, com maior percentagem de
germinação do pólen da cv. América (94,66%) e menor da cv. Rosa Mineira
(40,23%) (Fig. 1c, Apêndice A3). Nos cruzamentos realizados na ‘Rosa Mineira’ os
grãos de pólen da própria cultivar e das cvs. Amarelinha e Reubennel apresentaram
100% de germinação no estigma diferindo apenas do pólen da ‘Santa Rosa’
(21,67%) (Fig. 1d, Apêndice A4).
35
a
120
100
Genitor feminino cv. Amarelinha
100
90,65
84,23
71,61
80
67,86
70,56
60
60
40
20
0
t
a
el
sa
ca
ira
ir s
a7
nn
inh
Ro
éri
ine
eF
um
be
rel
l
a
m
h
M
t
u
a
P
A
n
T
sa
Re
Am
Sa
Ro
cultivares doadoras de pólen
100
97,27
97,69
100
Reubennel
Amarelinha
Rosa Mineira
60
40
20
0
América
cultivares doadoras de pólen
Genitor feminino cv. Rosa Mineira
120
94,66
100
80,46
80
60
40,23
40
20
0
América
Grãos de pólen germinados no
estigma (%)
Genitor feminino cv. Reubennel
Rosa Mineira
120
100
100
100
100
89,29
80
60
21,67
40
20
0
Reubennel
Reubennel
Amarelinha Rosa Mineira
América
Santa Rosa
cultivares doadoras de pólen
cultivares doadoras de pólen
e
f
120
85
100
80
71,42
60
40
20
0
Pluma 7 x América
Pluma 7 x Pluma 7
Grãos de pólen germinados
no estigma (%)
Grãos de pólen germinados
no estigma (%)
88,9
80
d
c
Grãos de pólen germinados no
estigma (%)
120
Grãos de pólen germinados no
estigma (%)
Grãos de pólen germinados no
estigma (%)
b
Genitor feminino cv. América
120
100
80,14
70,56
80
60
40
20
0
Santa Rosa x América
América x Santa Rosa
Figura 1 – Percentagem de grãos de pólen germinados no estigma de cultivares de
ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), nas genitoras femininas
‘América’ (a), ‘Amarelinha’ (b), ‘Reubennel’ (c), ‘Rosa Mineira’ (d), ‘Pluma
7’ (e) e ‘Santa Rosa’ (f) após 120h das polinizações controladas,
realizadas in vivo e mantidas em temperatura ambiente. As barras
representam o erro padrão da média. Embrapa/Pelotas/RS, 2010.
Nos cruzamentos realizados nas cultivares ‘Pluma 7’ e ‘Santa Rosa’ não
houve diferença significativa, apresentando média de 78,20% e 75,35% dos grãos
de pólen germinados na região estigmática, respectivamente (Fig. 1e, 1f e
Apêndices A5 e A6, respectivamente).
36
De acordo com estes resultados pode-se verificar que os grãos de pólen de
qualquer uma das cultivares utilizadas no presente estudo, foram capazes de
germinar no estigma (Fig. 2b), demonstrando sua viabilidade, porém o crescimento
do tubo polínico durante o percurso entre o estigma até os óvulos (Fig. 2a), etapa
essencial para que ocorra a fecundação e consequente frutificação, pode ser
bloqueado por barreiras pré-zigóticas, a exemplo da autoincompatibilidade
reprodutiva do tipo gametofítica que é considerada de maior incidência nas
angiospermas (GIBBS, 1986).
a
b
c
d
e
f
g
Figura 2 – Desenvolvimento do tubo polínico no pistilo de flores das cultivares de
ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), após 120h das polinizações
controladas realizada in vivo e mantidas em temperatura ambiente (a).
Germinação dos grãos de pólen na superfície estigmática (b), no estilete
demonstrando o depósitos de calose (c) e interrupção do crescimento do
tubo polínico no estilete (d, e), tubo polínico atingindo o ovário (grau 5) (f)
e tubo polínico atingindo o óvulo (grau 6) (g). Embrapa/Pelotas/RS,
2010.
A
autoincompatibilidade
gametofítica
é
um
mecanismo
controlado
geneticamente que impede a autopolinização, tornando-se necessária a polinização
37
cruzada, garantindo, desta forma, a variabilidade genética. Quando os alelos-S do
gametófito feminino (pistilo) e masculino (grão de pólen) forem diferentes, ocorre a
síntese de um polissacarídeo (calose) na parte basal do tubo polínico protegendo-o,
permitindo, desta forma, o desenvolvimento do mesmo para que ocorra a
fecundação. Já, quando os alelos são iguais, promoverá a inibição ou paralisação do
desenvolvimento dos tubos polínicos no estilete, devido a um engrossamento na
extremidade dos tubos polínicos, os quais podem romper-se devido a excessiva
deposição da própria calose (RAMALHO et al., 1996; WESTWOOD, 1982) (Fig. 2c,
2d e 2e).
O mecanismo de ação que confere a autoincompatibilidade ainda não está
bem elucidado. Pode ser que o mecanismo de rejeição envolva a destruição da
parede interna do estilete, devido ao acúmulo de calose, ou ainda, o aumento da
calose pode ocorrer devido à degeneração prematura do citoplasma em resposta a
inibição do CTP (VITI et al., 1997).
Foi verificado o desenvolvimento do tubo polínico alcançando cada um dos
pontos, para os quais foram atribuídas notas para o grau de desenvolvimento ao
longo do pistilo, após 120h da polinização em temperatura ambiente de 25ºC (Tab. 2
e Fig. 2). De acordo com a análise de variância houve interação significativa para o
grau de desenvolvimento do tubo polínico e o pólen utilizado, em cada genitor
feminino (Fig. 3).
Nos cruzamentos realizados não foi observada penetração no óvulo e sim, o
tubo polínico bem próximo ao óvulo, conforme pode ser observado na fig. 2g. Este
fato pode ser justificado pelo tempo decorrido após a polinização, uma vez que em
estudos realizados por Carvalho (1989), em relação ao desenvolvimento dos tubos
polínicos, em cruzamentos entre cultivares de ameixeira, constatou que nem sempre
o tempo de 120 horas é suficiente, sendo necessárias 144 horas, para que os
mesmos fecundem os óvulos.
Dentre outros fatores que também podem influenciar a não penetração no
óvulo está a imaturidade do órgão reprodutor feminino. Entretanto, este fato não
influenciou negativamente os resultados do presente estudo, o qual foi realizado
com intuito de verificar se as cultivares apresentavam ou não a incompatibilidade
reprodutiva do tipo gametofítica através do CTP. Para tanto, observou-se apenas se
o tubo polínico ultrapassou a barreira da incompatibilidade, que conforme
mencionado anteriormente, se localiza no terço médio do estilete.
38
a
b
c
Genitor feminino ameixeira japonesa cv. América
Rosa Mineira
Santa Rosa
The First
d
América
Incidência do tubo
polínico em cada etapa
(%)
e
Genitor feminino ameixeira japonesa cv. Amarelinha
Amarelinha
Reubennel
55
80
60
60
35
30
20
40
20
0
0 0 0 0
1
0
5
10
0 0
0 0
10
0
5
0
2
3
4
5
Grau de desenvolvimento do tubo polínico
5
0
6
85
Genitor feminino ameixeira japonesa cv. Pluma 7
60
80
60
40
40
20
30
25
15
10
10
5
0
0
1
América
100
América x Santa Rosa
5
0
0
2
3
4
5
Grau de desenvolvimento do tubo polínico
Amarelinha
Reubennel
Rosa Mineira
60
20
0
10
10
0 0 0
1
0 0 0
2
5
10
0 0
20
15
5
0 0
5
5
3
4
Grau de desenvolvimento do tubo polínico
0
5
45
30
40
20
25
20
10
20
0
0
0
0
0
0
2
3
4
5
Grau de desenvolvimento do tubo polínico
6
Genitor feminino ameixeira japonesa cv. Reubennel
América
60
60
35
25
50
60
Santa Rosa
70
40
Pluma 7
f
100
60
80
1
100
80
América
100
6
Genitor feminino ameixeira japonesa cv. Rosa Mineira
Rosa Mineira
100
Santa Rosa x América
100
Incidência do tubo
polínico. em cada etapa
(%)
Reubennel
5
0
0
6
Incidência do tubo
polínico. em cada etapa
(%)
Pluma 7
% de incidência do tubo
polínico em cada etapa
Amarelinha
Incidência do tubo
polínico em cada etapa
(%)
Incidência do tubo polínico
em. cada etapa (%)
América
100
90
80
55
70
60
40 40 35
35
40
30
35 35
35 30
50
30
25
25
25
20
40
20
15 15
15
30
20
15
15
10
10
10
20 10
55
10
0 0
0
00 0
0
0
0 0
0 0
0
0
1
2
3
4
5
6
Grau de desenvolvimento do tubo polínico
Reubennel
Rosa Mineira
100
70
80
55
60
40
0
10
10
20
0
0
1
15
0
0
30
20
10
0
5
5
2
3
4
5
Grau de desenvolvimento do tubo polínico
30
35
10
6
Figura 3 – Percentagem de incidência do tubo polínico em cada etapa do percurso estigma-óvulo de ameixeiras japonesas
(Prunus salicina Lindl.), em função das polinizações controladas, realizadas in vivo, após 120h, e mantidas em
temperatura ambiente nas genitoras femininas ‘América’ (a), ‘Santa Rosa’ (b), ‘Pluma 7’ (c), ‘Amarelinha’ (d), ‘Rosa
Mineira’ (e) e ‘Reubennel’ (f). As barras representam o erro padrão da média. Embrapa/Pelotas/RS, 2010.
38
39
Nos cruzamentos realizados com a cv. América como genitor feminino (Fig.
3a, Apêndice A7), o pólen da própria cultivar apresentou CTP apenas até o estádio
3, que representa o terço médio do estilete, com 55% de incidência, não diferindo
estatisticamente do estádio 2, e não apresentando crescimento nos estádios 4, 5 e
6, o que caracteriza a autoincompatibilidade reprodutiva do tipo gametofítica desta
cultivar (RASEIRA, 2003; MOTA, 2008). O tubo polínico da cv. Pluma 7 atingiu 40%
de incidência no grau 3, não diferindo dos graus 2 e 4, portanto não apresentou
crescimento nos graus 5 e 6. Já com a cv. Santa Rosa houve 40% de incidência
também no estádio 3, o qual não diferiu significativamente dos estádios 1 e 2,
apresentando CTP até o estágio 5, não havendo nenhuma incidência no estádio 6,
evidenciando que o CTP destas duas últimas cultivares, quando polinizadas na cv.
América, é mais lento e, provavelmente, seria necessário mais tempo para que
chegasse ao óvulo (Fig. 2f e ilustração na Fig. 3a).
Thiele e Stridom (1964) observaram que em casos de incompatibilidade
entre ameixeiras, mesmo ocorrendo germinação dos grãos de pólen em 24 horas
após a polinização, depois de 48 horas o tubo polínico ainda não atingiu a metade
do pistilo, e após 72, 96 e 120 horas os tubos polínicos ainda continuam se
desenvolvendo
lentamente,
podendo,
desta
forma,
indicar certo
grau
de
compatibilidade, concordando com resultados obtidos por Modlibowska (1945),
Teskey e Shoemaker (1978), Stott (1972) e Silveira (2008), os quais sugerem que o
desenvolvimento dos tubos polínicos nos cruzamentos incompatíveis apresenta
crescimento mais lento do que os compatíveis.
De acordo com Frankel e Galum (1977), quando os alelos-S são idênticos, a
velocidade de CTP torna-se mais lenta, ou mesmo nula, retardando a sua
penetração até o ovário, e quando atinge o mesmo, dificilmente ocorrerá a
fecundação, porque geralmente a fase de receptividade do óvulo já passou.
As demais polinizadoras da cv. América apresentaram desenvolvimento do
tubo polínico até o estádio 6, ou seja, até o óvulo, porém a cv. Reubennel
apresentou 40% de incidência do CTP no estádio 1, não diferindo do 3. A cv. The
First também apresentou 35% no estádio 3, diferindo apenas dos estádios 1 e 2, nos
quais não apresentaram nenhuma incidência, demonstrando que não houve
interrupção do CTP nestes estádios. Quando utilizado a cv. Rosa Mineira como
polinizadora, houve 35% de incidência de CTP nos estádios 6 (próximo ao óvulo) e 4
(no último terço do estilete), não diferindo do 3 (no terço médio do estilete),
40
enquantoque a polinizadora ‘Amarelinha’ apresentou 30% de incidência do tubo
polínico no estádio 3, diferindo apenas do 1.
Dentre as cultivares utilizadas na polinização da cv. América, todas atingiram
o ovário após 120h, exceto no caso de autopolinização dessa cultivar que teve o
CTP interrompido no terço médio do estilete, e a cv. Pluma 7, no último terço do
estilete. O tubo polínico da cv. Santa Rosa apresentou o crescimento até o ovário,
demonstrando que haveria a capacidade de fecundação, porém seu crescimento foi
mais lento.
De acordo com Souza (1999), estudos realizados com a autopolinização das
cultivares de Pyrus spp. ‘Ya-li’, ‘Carrick’ e ‘Kieffer’, a reação de incompatibilidade
reprodutiva está concentrada na região do estilete dos pistilos, o que concorda com
os resultados encontrados no presente trabalho. O mesmo autor observou que o
CTP em pereira, após 120 horas da polinização, alcançou no máximo 1/3 do
comprimento do estilete.
Segundo Raseira (2003) e Castro et al. (2008b), a campo, as cultivares
polinizadoras recomendadas para a cv. América são as cvs. Reubennel e Rosa
Mineira. Porém, no presente trabalho, foi possível observar que as cvs. Amarelinha e
The First também podem ser utilizadas como possíveis polinizadoras em trabalhos
de melhoramento, sendo que de acordo com Carvalho (1989), a primeira é
considerada de floração precoce, ou seja, floresce no início de agosto até meados
de setembro, enquanto que a segunda, é considerada de floração mediana, porém
apresenta floração precoce em anos frios e floração tardia quando o frio é
insuficiente para superação da dormência.
As cultivares Santa Rosa e América são consideradas autoincompatíveis
(RASEIRA, 2003; MOTA, 2008). Entretanto, nos cruzamentos ‘Santa Rosa’ x
‘América’ houve 60% de incidência do tubo polínico no grau 6, apresentando
diferença estatística em relação aos demais graus, demonstrando compatibilidade
entre elas. Porém, a total reciprocidade não é verdadeira, sendo que no cruzamento
‘América’ x ‘Santa Rosa’ 40% dos tubos polínicos estavam no grau 3, não diferindo
dos graus 1 e 2, apresentando baixa incidência de CTP no grau 5, caracterizando
um cruzamento semi-compatível (Fig. 3b, Apêndice A8). Conforme Modliboswka
(1945), cruzamentos semi-compatíveis ocorrem quando pelo menos um dos alelos-S
do genitor masculino, neste caso a cv. Santa Rosa, apresenta um alelo-S diferente
ao dos tecidos diplóides dos pistilos da genitora feminina. Desta forma 50% dos
41
grãos de pólen são capazes de germinar e fecundar o óvulo, enquanto que os outros
50% terão o seu crescimento interrompido no estilete, conforme observado no
presente estudo, confirmando os resultados encontrados por Mota (2008) que
identificou os alelos-S de algumas cultivares de ameixeira japonesa, dentre elas a
‘Santa Rosa’ e ‘América’ que apresentam um alelo idêntico Sc ou S4 (Anexo D).
Conforme os dados apresentados no presente estudo, a cultivar América
pode ser considerada polinizadora da ‘Santa Rosa’, o que seria de grande valia já
que esta última possui o alelo Se (MOTA, 2008), o qual está associado a
autocompatibilidade reprodutiva, determinando uma relativa autofertilidade nas
condições de cultivo da região sul do Brasil, em pomares plantados sem
polinizadoras ou mesmo na ausência de coincidência de floração com possíveis
polinizadoras (BEPPU et al., 2002). Desta forma, através da segregação deste alelo,
existe a possibilidade da produção de um híbrido que possa quebrar parcialmente
esta barreira de incompatibilidade gametofítica de cultivares autoincompatíveis como
a cultivar América.
Quando utilizada a cv. Pluma 7 como genitor feminino, os grãos de pólen da
cv. América apresentaram CTP até o grau 6, apresentando maior incidência no grau
5 (45%), diferindo significativamente apenas dos graus 1 e 2, enquanto que na
autopolinização, 50% dos tubos polínicos se desenvolveram apenas até o grau 3,
sendo que a sua incidência não diferiu dos graus 1 e 2, caracterizando a
autoincompatibilidade reprodutiva (Fig. 3c, Apêndice A9), nas condições em foi
desenvolvido o experimento, diferindo dos dados disponíveis na literatura, já que
Raseira (2003) e Mota (2008) afirmam que a cv. Pluma 7 é moderadamente
autocompatível.
As cultivares utilizadas como polinizadoras da cv. Amarelinha apresentaram
elevada incidência do tubo polínico próximo ao óvulo (grau 6). Com exceção da
autopolinização que apresentou 55% de incidência do tubo polínico no grau 3, não
diferindo do grau 4, havendo CTP somente até o grau 5, podendo indicar a
autocompatibilidade desta cultivar, porém com um crescimento mais lento do tubo
polínico. As cvs. Reubennel e Rosa Mineira apresentaram 100% e 85% de
incidência do tubo polínico no grau 6, respectivamente, diferindo dos demais
estádios de desenvolvimento (Fig. 3d, Apêndice A10).
Da mesma forma, os tubos polínicos do pólen da cv. América tiveram um
crescimento até o grau 6 em 60% das amostras, não diferindo dos graus 3 e 5 (Fig.
42
3d, Apêndice A10), caracterizando um crescimento mais acelerado em relação a
autofecundação
e
demonstrando
que
estas
cultivares
são
compatíveis
reprodutivamente com a cv. Amarelinha, para uso no melhoramento, uma vez que
de acordo com Raseira (2003) e Castro et al. (2008b), as polinizadoras
recomendadas para esta cultivar são ‘Pluma 7’, ‘Friar’ e ‘Blood Plum’.
Os cruzamentos realizados com a cv. Rosa Mineira apresentaram elevada
incidência do CTP até o grau 6, chegando a 100% com a polinizadora Reubennel, e
60% com as cvs. América, Amarelinha e a própria Rosa Mineira. Em todos estes
cruzamentos houve diferença estatística em relação aos demais graus de
desenvolvimento. Entretanto, no cruzamento desta cultivar com o pólen da Santa
Rosa, não houve CTP nos estádios 5 e 6, havendo 70% de incidência de tubos
polínicos no estádio 1, diferindo dos demais estádios (Fig. 3e, Apêndice A11). Porém
acredita-se que este cruzamento seja compatível já que de acordo com Mota (2008),
ambas cultivares (Rosa Mineira e Santa Rosa) possuem alelos-S completamente
distintos.
Todas as polinizações realizadas com a cv. Reubennel apresentaram CTP
até o grau 6, sendo que a autopolinização apresentou 55% de incidência do tubo
polínico no grau 5, diferindo dos demais graus e 10% no grau 6. A polinização
realizada com a cv. Rosa Mineira apresentou 70% no grau 6, diferindo dos demais
graus, enquanto que a cv. América apresentou 35%, não diferindo dos graus 3, 4 e
5, demonstrando a capacidade de polinização da cv. Reubennel com estas
polinizadoras (Fig. 3f, Apêndice A12).
As polinizadoras recomendadas para a cv. Reubennel de acordo com
Raseira (2003) são ‘Rosa Mineira’, ‘Amarelinha’ e ‘Pluma 7’ e de acordo com Castro
et al. (2008b), ‘Blood Plum’ e ‘Amarelinha’. Dentre estas apenas a ‘Rosa Mineira’ foi
utilizada no presente trabalho, confirmando a sua compatibilidade.
Nas condições em que foi realizado o experimento, diante dos resultados da
polinização in vivo, foi observado que os cruzamentos entre ‘América’ x ‘Pluma 7’ e
‘Rosa Mineira’ x ‘Santa Rosa’ são incompatíveis e que as cultivares América e
Pluma
7
são
autoincompatíveis,
apesar
desta
última
ser
considerada
moderadamente compatível (RASEIRA, 2003; MOTA, 2008). Além disso, foi
verificado que em alguns cruzamentos apesar de não terem apresentado frutificação
quando realizados no campo, foi visualizado o crescimento do tubo polínico até o
óvulo (grau 6) ou ovário (grau 5) na polinização in vivo, tais como ‘Reubennel’ x
43
‘Rosa Mineira’; ‘Rosa Mineira’ e ‘Amarelinha’ x ‘América’ e ‘Amarelinha’; e ‘Pluma 7’
e ‘Santa Rosa’ x ‘América’, confirmando a sua compatibilidade reprodutiva.
No presente estudo, de acordo com os resultados encontrados, foram
apresentadas diversas possibilidades de plantas polinizadoras para cada uma das
cultivares genitoras femininas de P. salicina testadas, permitindo aprimorar o
conhecimento a respeito das interações de incompatibilidade existente entre as
cultivares de ameixeira japonesa.
Estes dados obtidos são válidos para uso em programas de melhoramento
genético, através de hibridações controladas, utilizando pólen colhido em anos
anteriores e devidamente armazenados, para polinizar as cultivares de floração
precoce, ou então para as que não apresentam coincidência na época de floração
em uma determinada região de produção. Já que para poder recomendar uma
cultivar como polinizadora ela deve apresentar, principalmente, período de floração
coincidente e pólen compatível com a cultivar produtora. Além disso, deve produzir
grande quantidade de pólen, florescimento anual regular e frutos preferencialmente
de interesse e valor comercial (CARVALHO; RASEIRA, 1989; WREGE, 2005).
Diante destes resultados de caracterização fisiológica e associados aos da
caracterização molecular dos alelos-S, desenvovida previamente no Laboratório de
Cultura de Tecidos de Plantas (LCTP) da UFPel, foram realizados experimentos de
micropropagação da cv. América com o intuito de obter material para experimentos
de regeneração de plantas a partir de explantes foliares, visando a realização de
futuros trabalhos para obter o silenciamento desses alelos, através da tranformação
genética, uma vez que esta cultivar é comprovadamente autoincompatível.
1.4 Conclusão
Por meio do presente estudo conclui-se que:
- A caracterização fisiológica realizada por meio dos cruzamentos das
cultivares de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.) confirmam a caracterização
molecular de seus alelos-S;
- Apenas os cruzamentos entre ‘América’ x ‘Pluma 7’ e ‘Rosa Mineira’ x
‘Santa Rosa’ são incompatíveis;
- A cultivar América é autoincompatível.
44
Capítulo 2
Estabelecimento, multiplicação e alongamento in vitro de ameixeira
japonesa, cv. América
45
Estabelecimento, multiplicação e alongamento in vitro de ameixeira japonesa,
cv. América
2.1 Introdução
A cultura de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.) destacou-se no
mercado nacional, principalmente no Rio Grande do Sul e Santa Catarina onde as
condições de invernos favorecem seu cultivo (SEGANFREDO, 1995; CASTRO,
2003). A cultivar América é considerada uma das preferidas no mercado sulbrasileiro devido às suas características organolépticas e adaptação às condições
edafoclimáticas do RS (REVERS; MACHADO, 2005), porém apresenta problemas
de produção quando o pomar não é manejado adequadamente. Dentre os fatores
limitantes destacam-se a susceptibilidade à escaldadura das folhas, causada pela
bactéria Xylella fastidiosa Wells, que afeta a qualidade do material propagativo
(SILVEIRA et al., 2003) e a autoincompatibilidade gametofítica, prejudicando o
sucesso do empreendimento (LEWIS, 1994; RASEIRA, 2003; SAPIR et al., 2004;
TAKAYAMA; ISOGAI, 2005).
Instituições governamentais vêm investindo em pesquisas com a finalidade
de melhorar os sistemas de produção atualmente empregados. Desta forma, a
introdução de novas espécies, o melhoramento genético e a produção de mudas
sadias poderão contribuir para o aumento da eficiência do sistema produtivo. Mudas
de qualidade potencializam a resposta à tecnologia aplicada no pomar, auxiliando na
redução de custos e na produção de frutas com alta qualidade e produtividade
(OLIVEIRA et al., 2004).
Uma das principais formas de disseminação de X. fastidiosa é por meio de
material propagativo contaminado. Sendo assim, o cultivo in vitro possibilita
46
propagar rapidamente espécies de interesse, além de promover a limpeza clonal,
permitindo a produção de matrizes com qualidade genética e sanitária comprovadas,
quando comparado aos métodos de enxertia e estaquia, devido ao maior controle
sobre as várias etapas do processo de micropropagação, além de proporcionar a
formação de pomares clonais (ASSIS; TEIXEIRA, 1998; OLIVEIRA et al., 2006;
SOUZA et al., 2006; SOUZA et al., 2007; SOUZA et al., 2008). Além disso, esse
método de propagação pode ser utilizado para vários estudos biotecnológicos, a
exemplo da transformação genética para características de interesse.
Porém, o uso prático da propagação in vitro de plantas lenhosas,
principalmente prunoídeas, requer o estudo e adaptação das condições de cultivo,
específico para cada espécie e/ou cultivar. Essa tecnologia é afetada por diversos
fatores, entre eles, a constituição do meio de cultura, tipo e concentração de
reguladores de crescimento.
Um aspecto fundamental para realizar a micropropagação de uma espécie
frutífera, visando maximizar sua multiplicação, é o domínio da tecnologia de
propagação em laboratório, que é resultado de estudos realizados com os fatores
que afetam o crescimento e o desenvolvimento das plantas in vitro (ERIG et al.,
2002; DONINI et al., 2008b). Esta técnica tem sido desenvolvida, para inúmeras
frutíferas, como um método alternativo e rápido de propagação vegetativa a partir de
uma célula ou de segmentos de tecidos de plantas (ERIG et al. 2004; ERIG;
SCHUCH, 2005b), com a finalidade de multiplicar plantas com características
genéticas idênticas a planta-matriz e livres de patógenos, independente da época do
ano (SCHUCH; ERIG, 2005).
Para micropropagar uma espécie, um dos primeiros passos é o
estabelecimento de plantas in vitro, o que se inicia com a seleção dos explantes
mais adequados (ERIG; SCHUCH, 2003b) e, também, com o protocolo de
descontaminação.
Após o estabelecimento, durante o cultivo in vitro, os meios nutritivos
fornecem aos explantes substâncias essenciais para o seu crescimento e controlam,
em grande parte, o padrão de desenvolvimento da cultura. O meio MS
(MURASHIGE; SKOOG, 1962) é o mais utilizado para diversas espécies
(GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Entretanto, na micropropagação do gênero
Prunus
são utilizadas composições mais diluídas desse meio, ou mesmo, meios com
formulações contendo menores concentrações de sais e vitaminas, a exemplo do
47
WPM – Wood Plant Medium (LLOYD; McCOWN, 1980). Mesmo assim cada cultivar
apresenta uma resposta de crescimento diferenciada necessitando de ajustes
específicos no protocolo de propagação (SILVEIRA et al., 2001; COUTO, 2003;
SILVA, 2004; ROCHA, 2006a).
Além da concentração de sais e vitaminas, os reguladores de crescimento
também são fatores determinantes no crescimento e no padrão de desenvolvimento
para a maioria dos sistemas de cultura de tecidos (MARTINELLE, 1985; CALDAS et
al., 1990; GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).
As citocininas atuam na divisão celular e são necessárias na regulação da
síntese de proteínas que está diretamente relacionada com a formação de fibras do
fuso mitótico (GEORGE; SHERRINTON, 2008). Na cultura de ápices caulinares,
potencializam a proliferação de gemas axilares, por meio da capacidade de
superação da dominância apical (BHOJWANI; RAZDAN, 1996). Compõem uma das
classes de reguladores de crescimento mais utilizadas na cultura de tecidos, sendo o
BAP (6-benizilaminopurina) responsável pela indução da formação de brotos e alta
taxa de multiplicação em muitos sistemas de micropropagação (MARTINELLE, 1985;
GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998; GEORGE; SHERRINTON, 2008), enquanto
que o 2iP (Isopenteniladenina) é uma citocinina considerada de ação mais fraca
(HU; WANG, 1998).
Entretanto, uma das formas de aumentar a taxa de multiplicação dos
explantes é por meio de ajustes no protocolo, modificando o tipo e a concentração
de citocininas a serem acrescidas ao meio de cultura (SILVEIRA et al., 2001). A
citocinina é, na maioria das vezes, indispensável nesta fase, para a superação da
dominância apical e a indução da proliferação de gemas axilares (HU; WANG,
1983).
O BAP contribui eficientemente na multiplicação de explantes, geralmente
apresentando melhores resultados, além de ser mais barata que outras citocininas
(SCHUCH; ERIG, 2005). Neste sentido, estudos realizados por Rogalski et al.
(2003), permitiram obter maior número de brotos de P. salicina cv. Santa Rosa,
utilizando 2,0mg dm-3 de BAP, enquanto que a maior altura das brotações foi
registrada na menor concentração utilizada (0,5mg dm-3). Em ameixeira européia
(Prunus domestica L.) as maiores taxas de multiplicação in vitro foram observadas
utilizando BAP nas concentrações entre 0,5 e 1,5mg dm-3, evidenciando que
48
concentrações crescentes de citocininas inibem o alongamento de brotações de
prunoídeas cultivadas in vitro (LEONTIEV-ORLOV et al., 2000a e 2000b).
Durante a multiplicação in vitro, as brotações formadas podem ser pequenas
em comprimento, ocasionando baixo percentual de enraizamento se forem
transferidas diretamente para meio de enraizamento, ou mesmo, dar origem a
mudas de baixa qualidade para a fase de aclimatização (SILVA, 2004). Entretanto,
uma das formas de estimular o crescimento das brotações é através da adição do
ácido giberélico (AG3) ao meio de cultura, o qual promove o aumento do
comprimento das mesmas, devido ao estímulo da expansão e alongamento das
células (MÉTRAUX, 1987).
Diante do exposto, objetivou-se, com o presente trabalho, desenvolver um
protocolo de estabelecimento, de multiplicação, onde foram testadas duas fontes de
citocinina e diferentes meios de cultivo, e de alongamento in vitro de brotações de
ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, com a finalidade de obter de
material micropropagado para realizar experimentos de regeneração, a patir de
explantes foliares, e produzir mudas em larga escala através do enraizamento das
brotações.
2.2 Material e métodos
Mudas da ameixeira japonesa (P. salicina Lindl.), cv. América, enxertadas
sobre porta-enxerto de caroços de pessegueiros oriundos da indústria de conserva
com 10 meses de idade, foram cultivadas em casa-de-vegetação, tratadas com
fungicida e bactericida (benlate 0,6mg dm-3 e agrimicina 2,4mg dm-3), a cada dois
dias, por duas semanas antecedentes à coleta do material para o estabelecimento in
vitro.
2.2.1 Experimento 1 – Estabelecimento in vitro de ameixeira japonesa cv.
América
Ramos vegetativos semi-estiolados, em desenvolvimento, com cerca de
50cm de comprimento, foram colhidos e transferidos para o laboratório, sendo então
retiradas as folhas e descartada a parte apical com os dois primeiros nós. O restante
dos ramos foi dividido em dois segmentos: do terceiro ao sexto nó, a contar-se do
ápice para a base, constituindo os explantes apicais e do sétimo ao décimo nó,
49
constituindo os explantes basais. Estes explantes constituíram-se de segmentos
nodais, com aproximadamente 0,5cm de comprimento, contendo uma gema axilar.
Em câmara de fluxo laminar, os explantes foram desinfestados sendo
inicialmente imersos em álcool 70% por um minuto, em hipoclorito de sódio 1,5%
durante 20 minutos, sob agitação e, posteriormente, lavados com água destilada
autoclavada três vezes.
Os explantes apicais e basais foram inoculados em tubos de ensaio
contendo 5cm3 de meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) solidificado com ágar (7g
dm-3) e pH ajustado para 5,8. O material foi mantido em sala de crescimento, por
sete dias no escuro, para evitar a oxidação, posteriormente transferidos para luz com
condições de luz e temperatura controladas (42µmol m-2 s-1 de densidade de fluxo
de fótons, fotoperíodo de 16 horas de luz e temperatura de 25 ± 1ºC, durante o
período de luz e 23 ± 1ºC, durante o período de escuro).
Após 30 dias, foram avaliados os seguintes parâmetros: porcentagem de
explantes brotados, oxidados e contaminados, comprimento médio das brotações
iniciais (cm), número médio de gemas e de folhas formadas. O delineamento
experimental foi inteiramente casualizado, sendo analisadas 100 repetições para
cada tipo de explante. Cada repetição foi constituída pelo tubo de ensaio contendo
um segmento nodal. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as
médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey com 5% de
probabilidade de erro.
2.2.2 Experimento 2 – Multiplicação in vitro de ameixeira japonesa cv.
América
Segmentos nodais das brotações estabelecidas e multiplicadas in vitro, com
aproximadamente 0,5cm de comprimento contendo uma gema, foram inoculados em
frascos contendo meio MS suplementado com duas citocininas, BAP e 2iP, nas
concentrações de 0; 0,25; 0,5; 0,75 e 1,0mg dm-3, constituindo o primeiro
experimento de multiplicação. O mesmo tipo de explante foi empregado no segundo
experimento, os quais foram inoculados nos meios MS, MS com ⅓ da concentração
dos sais de NH4NO3 e KNO3 (MS ⅓ do N), e WPM, acrescidos de 100mg dm-3 de
inositol, 3% de sacarose e 0,3mg dm-3 de BAP.
O pH de todos os meios foi ajustado para 5,8 antes da adição do ágar (7g
dm-3) e autoclavado a 121ºC por 20 minutos. Em capela de fluxo laminar, procedeu-
50
se a inoculação dos explantes nos meios de cultura, os quais foram posteriormente
mantidos em sala de crescimento com temperatura de 25 ± 2ºC, fotoperíodo de 16
horas de luz e densidade de fluxo de fótons de 48µmol m-2 s-1.
Avaliou-se, após 40 dias o comprimento médio das brotações (cm), número
médio de brotos (sendo considerados brotos, as gemas com internó alongado, com
cerca de 0,5cm de comprimento) e de gemas por explante, assim como média da
massa seca das brotações (mg), obtida com auxílio de estufa de ventilação forçada,
mantida a 70ºC, e balança analítica com quatro casas de precisão, até que a massa
das brotações se tornasse constante.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, para ambos os
experimentos. O primeiro, composto por um fatorial 2x5, representado por duas
citocininas e cinco concentrações, contendo oito repetições, cada uma representada
por um frasco com cinco explantes. O segundo experimento foi unifatorial (tipo de
meio), constituído por 12 repetições por tratamento, cada uma representada por um
frasco com cinco explantes.
Os experimentos foram repetidos duas vezes e os dados obtidos foram
submetidos à análise de variância. No primeiro experimento foi realizada análise de
regressão polinomial e, para o segundo ensaio, teste de médias, onde as médias
dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey com 5% de probabilidade de
erro, através do programa estatístico WinStat 2.0 (MACHADO; CONCEIÇÃO, 2003).
2.2.3 Experimento 3 – Alongamento in vitro de brotações de ameixeira
japonesa cv. América
Depois de multiplicadas, devido às brotações apresentarem aspecto de
roseta, com internós muito curtos e folhas pequenas, as mesmas foram utilizadas
para realizar dois experimentos independentes de alongamento, onde brotações
(aproximadamente 0,5cm) cultivadas em meio MS com 0,3mg dm-3 de BAP foram
inoculados em frascos contendo meio MS suplementado com ácido giberélico (AG3)
nas concentrações de 0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0mg dm-3, com adição de 2,0g dm-3 de
carvão vegetal ativado, para realizar o primeiro experimento de alongamento.
Como não foi observado um alongamento desejado com os meios citados
acima, foi realizado um segundo experimento, com concentrações mais elevadas de
AG3 (0; 1; 5 e 10mg dm-3), na presença ou ausência de carvão ativado. Para ambos
51
os experimentos de alongamento, os frascos foram mantidos por 40 dias em sala de
crescimento, nas condições descritas anteriormente.
Após o período de incubação, foram avaliados: comprimento médio das
brotações (cm), número médio de brotos (sendo considerados brotos, as gemas com
internó alongado, com cerca de 0,5cm de comprimento) e de gemas por explante e
massa seca das brotações (mg), onde o material vegetal foi seco em estufa de
ventilação forçada à 70ºC.
O delineamento experimental, para os experimentos de alongamento foram
inteiramente casualizados, contendo, no primeiro ensaio, cinco repetições,
representadas por um frasco com cinco explantes e, no segundo, um fatorial 4x2,
com quatro concentrações de AG3 e meios acrescidos ou não de carvão vegetal,
contendo quatro repetições, cada uma compostas por um frasco com seis explantes.
Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e de regressão
polinomial, através do programa estatístico WinStat 2.0 (MACHADO; CONCEIÇÃO,
2003).
2.3 Resultados e discussão
2.3.1 Experimento 1 – Estabelecimento in vitro de ameixeira japonesa cv.
América
No estabelecimento in vitro obteve-se 76,19% e 83,33% de sobrevivência
dos explantes apicais e basais, respectivamente. Em valores absolutos, a
percentagem de contaminação foi maior para os explantes apicais (20%) do que
para os basais (9,38%), ocorrendo, entretanto, maior percentagem de oxidação nos
explantes basais (Tab. 1), sendo que este fenômeno pode estar relacionado à maior
lignificação do material e maior presença de compostos fenólicos.
Tabela 1 - Percentagem de contaminação e de oxidação dos explantes com gemas
apicais e basais de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv.
América, após 30 dias do estabelecimento in vitro em meio MS. UFPel,
Pelotas/RS, 2010
Tipo de
Explantes
Contaminação (%)
Oxidação (%)
explantes
sobreviventes (%)
Fungo
Bactéria
Apicais
76,19
6,67
13,33
3,81
Basais
83,33
3,13
6,25
7,29
52
O percentual de contaminação observado no presente trabalho foi maior do
que os registrados por Rocha et al. (2007b), no estabelecimento in vitro de portaenxerto de Prunus, cv. Tsukuba, os quais obtiveram 3,32% explantes contaminados
por fungo e bactéria. Enquanto que Silva et al. (2003) obtiveram percentuais de
contaminação que variaram de 14,8% a 29,8% no estabelecimento in vitro dos portaenxertos Capdeboscq, GF677 e VP411, respectivamente.
Conforme Erig e Schuch (2003a), e Donini et al. (2008a), as espécies
frutíferas lenhosas apresentam dificuldades para o estabelecimento in vitro,
principalmente devido à contaminação e oxidação (ERIG; SCHUCH, 2003a; DONINI
et al., 2008a).
De acordo com Montarroyos (2000), Couto et al. (2004) e Fachinello e
Bianchi (2005) o alto percentual de contaminação (bacteriana e fúngica) e oxidação
dos explantes são os principais problemas observados durante o estabelecimento in
vitro de Prunus. Entretanto, esses autores, citam que a redução de explantes
contaminados durante esta etapa pode ser obtida pela manutenção das plantasmatrizes sob condições controladas, em casa-de-vegetação, com realização
periódica de tratamento fitossanitário, conforme realizado no presente estudo.
As variáveis comprimento médio das brotações, número de folhas e de gemas
apresentaram diferença estatística significativa em relação ao tipo de explante
utilizado, sendo que os explantes basais apresentaram médias superiores aos
apicais (Fig. 1, Apêndice B1).
No presente trabalho os explantes utilizados para o estabelecimento in vitro
continham meristemas secundários, indicados para propagação clonal in vitro, por
possuírem determinação para o crescimento vegetativo e, quando supridas as
necessidades nutricionais e hormonais, irão se desenvolver em novas brotações e
plantas (GRATAPAGLIA; MACHADO, 1998; TAIZ; ZEIGER, 2009).
Seu desenvolvimento se dá através de divisões celulares que requerem
substâncias de reserva, por isso o tamanho do explante é um fator que pode
determinar sua possibilidade de sobrevivência e capacidade de crescimento inicial in
vitro. Assim, é possível considerar que o resultado obtido no presente trabalho esteja
relacionado, provavelmente, à maior quantidade de reservas presentes nos
explantes mais lignificados (basais), do que nos explantes apicais.
53
a
b
Explantes apicais
16
Explantes basais
13,21
14
12
8,65
10
c
8
6
4
2
0,82
1,25
1,83
2,48
0
Comprimento médio das
brotações iniciais (cm)
Número médio de folhas Número médio de gemas
Figura 1 - Comprimento médio das brotações (cm), número médio de folhas e de
gemas formadas nos explantes de gemas apicais e basais (a) e aspecto
das brotações iniciais de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv.
América, a partir de explantes apicais (b) e basais (c), após 30 dias do
estabelecimento in vitro em meio MS. As barras representam o erro
padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010.
2.3.2 Experimento 2 – Multiplicação in vitro de ameixeira japonesa cv.
América
A multiplicação in vitro é uma etapa muito importante que promove um
aumento clonal das brotações, mantendo a integridade genética e sanitária do
material vegetal.
Sendo assim, no primeiro experimento, com base no resultado da análise de
variância, verificou-se interação significativa entre os fatores para todas as variáveis
analisadas, comprovando que, nas condições em que foi realizado esse
experimento, as diferentes concentrações e tipos de citocininas utilizadas
proporcionam respostas distintas nas brotações de ameixeira japonesa, cv. América,
exceto para a variável média da massa seca das brotações (Apêndice B2).
Para o comprimento médio das brotações as maiores médias foram
observadas quando o cultivo foi realizado em meio de cultura com adição de BAP,
independente da concentração utilizada. Explantes cultivados em meio acrescido de
BAP apresentaram uma resposta quadrática para esta variável, onde o valor máximo
estimado foi de 1,34cm com 0,68mg dm-3 de BAP (Fig. 2, Apêndice B3). Esse
resultado foi melhor que o obtido por Leontiev-Orlov et al. (2000b), na multiplicação
in vitro de prunáceas, que obtiveram comprimento médio dos brotos de 0,44cm,
54
utilizando 0,25mg dm-3 de BAP. Já, nos tratamentos com adição de 2iP, não houve
efeito significativo nas diferentes concentrações, obtendo-se 0,92cm de comprimento
Comprimento médio das
brotações (cm)
médio das brotações (Fig. 2, Apêndice B3).
BAP
2iP
yBAP = 0,7493 + 1,743x - 1,28x2
y2iP = 0,916 ns*
2
R = 76,54
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
0,25
0,5
0,75
-3
Concentrações dos reguladores de crescimento (mg dm )
1
Figura 2 - Comprimento médio das brotações de ameixeira japonesa (Prunus salicina
Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro, em função do tipo de
regulador de crescimento (BAP e 2iP) e suas concentrações (0; 0,25;
0,5; 0,75; 1,0mg dm-3). As barras representam o erro padrão da média.
ns* equação de regressão polinomial não significativa. UFPel,
Pelotas/RS, 2010.
Assim como no presente trabalho, para multiplicação in vitro de Prunus spp.,
Rogalski e Leontiev-Orlov (1999), Leontiev-Orlov et al. (2000a) e Rogalski et al.
(2003), obtiveram um maior comprimento de brotos por explante em meios
suplementados BAP nas concentrações entre 0,5 - 1,0mg dm-3. Enquanto que,
Arena e Caso (1992), obtiveram maior comprimento de brotos do mesmo gênero
com adição de 1,0mg dm-3 de BAP.
Com relação ao número médio de brotos e de gemas, os meios
suplementados com BAP apresentaram uma tendência linear crescente para o
número de brotos variando de 1,28 a 4,01 e uma resposta quadrática para o número
de gemas por explante com valor máximo estimado de 14,16 na concentração de
0,61mg dm-3 de BAP (Fig. 3a, 3b e Apêndice B4). Em contrapartida, as brotações
mantidas em meio com 2iP, mais uma vez, não apresentaram respostas
significativas, indepedente das concentrações testadas, com médias menores que
55
as obtidas nas brotações cultivadas em meio suplementado com BAP, com 1,17
brotos e 9,02 gemas por explante (Fig. 3a, 3b e Apêndice B4).
a
BAP
b
2iP
BAP
y2iP = 1,168 *ns
yBAP = -14,4314x2 + 17,5764x + 8,8126
R2 = 97,78
5
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Número médio de gemas por
explante
Número médio de brotos por
explante
yBAP = 2,8895x + 1,3077
0
0,25
0,5
0,75
-3
Concentrações dos reguladores de crescimento (mg dm )
1
2iP
y2iP = 9,02 *ns
R2 = 74,46
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
0,25
0,5
0,75
-3
Concentrações dos reguladoresde crescimento (mg dm )
1
Figura 3 - Número médio de brotos (a) e de gemas (b) por explante das brotações
de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de
cultivo in vitro em função do tipo de regulador de crescimento (BAP e
2iP) e suas concentrações (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm-3). As barras
representam o erro padrão da média. ns* equação de regressão
polinomial não significativa. UFPel, Pelotas/RS, 2010.
Os resultados do presente trabalho foram semelhantes aos encontrados por
Souza et al. (2008), em estudos de multiplicação in vitro de Eugenia uniflora L.
submetida a diferentes citocininas (BAP, zeatina e 2iP) e suas concentrações (0, 5 e
10µM), onde o acréscimo de BAP apresentou as melhores respostas para o número
de gemas (3,96). Enquanto que, para o número de brotos o BAP gerou melhores
resultados (2,35 na concentração de 0,5mg dm-3), seguido da zeatina e 2iP.
Entretanto, Erig et al. (2002), obtiveram o maior número de brotações em estudos
com Rubus idaeus L., em meios suplementados com BAP nas concentrações de 0,5 e
1,0mg dm-3 (0,67 e 0,87, respectivamente) e maior número de gemas (6,26) na
concentração de 0,5mg dm-3 de BAP.
Novák e Juvová (1983) comprovaram que, em videira, o BAP foi a citocinina
mais eficiente, sendo superior à cinetina e 2iP para estimular a proliferação de novas
brotações. Diversos autores tais como Barlass e Skene (1980), Goussard (1981) e
Gray e Benton (1990), também observaram a superioridade de BAP em relação a
outras citocininas no cultivo in vitro de videiras (Vitis vinifera L.).
O tipo e concentração de citocinina utilizado nos meios de cultura são
específicos para espécies e/ou cultivar. Na multiplicação de porta-enxertos de
ameixeiras, Morini e Loretti (1991) obtiveram bons resultados utilizando 0,4mg dm-3
56
de BAP, enquanto Alderson et al. (1987) e Arena e Caso (1992) obtiveram melhores
resultados utilizando 1,0mg dm-3 de BAP.
O cultivo dos explantes na presença de BAP, em concentrações entre 0,61 0,68mg dm-3, proporcionou a obtenção de um maior número de brotações e de
gemas, com um razoável alongamento, quando comparadas àquelas cultivadas em
meios com adição de 2iP. Entretanto, explantes cultivados nas concentrações de
0,5mg dm-3 de BAP, e acima desta, desenvolveram brotações com elevado número
de gemas (12,88) e com 2,19 brotos por explante, o que indicaria uma elevada taxa
de multiplicação. Porém, as brotações formadas nestas condições, apresentaram
internós curtos, dando à planta um aspecto de roseta (Fig. 4), dificultando o
manuseio das mesmas e reduzindo a taxa de sobrevivência das brotações muito
pequenas, durante as repicagens.
Figura 4 - Brotações de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos
40 dias de cultivo in vitro em meio MS acrescido de citocininas (BAP e
2iP) em diferentes concentrações (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm-3).
UFPel, Pelotas/RS, 2010.
Resultados similares foram encontrados por Leontiev-Orlov et al. (2000b) e
Pérez-Tornero et al. (2000) na multiplicação in vitro de prunáceas, onde observaram
que a presença de BAP no meio ocasionou alta taxa de multiplicação, formando um
grande número de brotos por explante, porém, concentrações crescentes desta
citocinina inibiram o alongamento das brotações. A redução no alongamento das
brotações com o aumento da concentração de BAP também foi observada por
Dustan et al. (1992) em espécies de frutíferas lenhosas.
Geralmente, o alongamento das brotações é inibido com o aumento da
concentração de BAP no meio de cultura. De acordo com Rocha et al. (2007a) isso
ocorre porque, em alguns casos, o aumento do número de brotações formadas por
57
explante faz com que ocorra uma competição pela absorção de sais minerais e
vitaminas do meio de cultura, tornando-se fator limitante para o seu alongamento.
Mesmo assim, o BAP é um componente essencial do meio de multiplicação para
Prunus
spp., sendo sua presença necessária para a sobrevivência e subsequente
multiplicação das gemas (CHIARIOTTI; ANTONELLI, 1988; WAGNER JÚNIOR, et
al., 2003).
Além disso, essa resposta é justificada pelo fato de que as citocininas, de
modo geral, induzem a produção da parte aérea dos cultivos in vitro, mas seu
excesso pode ser tóxico e levar a formação de um grande número de brotações com
tamanho muito pequeno, caracterizado por internós curtos, folhas de tamanho
reduzido e engrossamento exagerado dos caules, causando sérios problemas para
as demais etapas da micropropagação (LESHEN et al., 1988; PASQUAL, 2001;
LIMA et al., 2008), inclusive na fase de enraizamento (SANTO-SEREJO et al., 2006;
LESHEM et al., 2008).
Na multiplicação in vitro de ameixeiras, Rogalski e Leontiev-Orlov (1999) e
Leontiev-Orlov et al. (2000a) observaram que a presença de BAP no meio provoca
alta taxa de multiplicação, formando um grande número de brotos por explante,
porém com um pequeno comprimento médio das brotações. Esse efeito também foi
observado por Dustan et al. (1992), comprovando que a adição de BAP ao meio,
nem sempre proporciona alongamento adequado.
O BAP é uma das citocininas de menor custo, além de ser encontrada
naturalmente nas plantas, por isso tem sido muito eficaz na multiplicação de diversas
espécies, provavelmente, devido à capacidade dos tecidos vegetais metabolizarem
os
hormônios
de
ocorrência
natural
mais
rapidamente
(GRATTAPAGLIA;
MACHADO, 1998).
Não houve diferença significativa entre os fatores tipo de citocinina e suas
concentrações para a média da massa seca das brotações (Apêndice B2). Porém,
foi possível observar diferença significativa entre os fatores quando analisados
isoladamente. As brotações cultivadas no meio acrescido de BAP apresentaram
maiores médias de massa seca (19,08mg) em relação às brotações submetidas ao
2iP (14,26mg) (Fig. 5a).
Em relação às diferentes concentrações de citocininas utilizadas, foi possível
observar uma relação diretamente proporcional entre o aumento da matéria seca
das brotações e as crescentes concentrações das citocininas (Fig. 5b). Esse
58
comportamento justifica-se pelo fato das citocininas estimularem a multiplicação
celular e proliferação de gemas axilares, promovendo maior produção de parte aérea
e, consequentemente, de massa seca (TORRES et al., 1998). A resposta observada
para essa variável, no presente trabalho, diverge da encontrada por Dutra et al.
(2004), em trabalhos de multiplicação in vitro de oliveira (Olea europaea L.), no qual, a
medida em que se aumentou a concentração de BAP, houve redução dessa
variável.
a
b
20
19,08
14,26
15
10
5
0
BAP
Tipo de citocinina
2iP
Média da massa seca das
brotações (mg)
Média da massa seca das
brotações (mg)
25
25
yBAP = 13,894 + 5,555x
20
R = 82,17
2
15
10
5
0
0
0,25
0,5
0,75
-3
Concentrações dos reguladores de crescimento (mg dm )
1
Figura 5 - Média da massa seca (mg) das brotações de ameixeira japonesa (Prunus
salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro em função da
adição de citocininas (BAP e 2iP) (a) e suas concentrações (0; 0,25; 0,5;
0,75; 1,0mg dm-3) (b). As barras representam o erro padrão da média.
UFPel, Pelotas/RS, 2010.
No segundo experimento de multiplicação, no qual foram testados diferentes
meios de cultura, a análise de variância foi significativa apenas para o número de
brotos por explante e para a massa seca das brotações, apresentando melhores
resultados no meio MS com 11,65 brotos por brotação e 24,42mg, respectivamente
(Fig. 6b, 6c e Apêndice B5). Enquanto que o comprimento médio das brotações e o
número de gemas apresentaram em média 1,53cm e 10,65 brotos por explante,
respectivamente (Fig. 6a e 6c, respectivamente, Apêndice B5).
Esses resultados foram superiores ao encontrados por Radmann et al.
(2009) em porta-enxertos de Prunus ‘GxN-9’, onde o maior índice de brotos por
brotação foi de 3,37 nos meios MS e QL, superiores as brotações cultivadas nos
meios WPM e MS com ½ dos sais nitrogenados. Em contrapartida, Machado et al.
(2007) identificaram que meios com concentrações inferiores de sais, como o QL,
proporcionaram maior número de brotos e comprimento das brotações em relação
59
aos meios MS e WPM no cultivo in vitro de videira. Assim como Couto et al. (2004),
constataram maior multiplicação de porta-enxertos de Prunus ‘Barrier’ e ‘Cadaman’
com 50% de redução dos sais do meio MS, da mesma forma, o porta-enxerto ‘GxN22’ apresentou respostas superiores, quando explantes foram cultivados em meio
MS ¾, comparado ao meio MS na sua concentração plena (SILVEIRA et al., 2001).
Já, Rocha (2006b) não constatou efeito com diferença significativa entre os meios
QL e MS para os porta-enxertos de Prunus ‘Mr. S. 2/5’ e ‘Sírio’.
b
2
1,5
1,5
Média da massa seca das
brotações (mg)
C omprimento médio das
brotações (cm)
a
1,65
1,44
1
0,5
0
MS
MS ⅓ do N
WPM
c
24,42
21,16
25
20
14,38
15
10
5
0
MS
MS ⅓ do N
WPM
d
Número de brotos por explante
14
12
10
8
6
4
2
0
30
11,65
Número de gemas por explante
10,11
4,05
1,99
MS
MS ⅓ do N
10,2
2,69
WPM
Figura 6 - Comprimento médio das brotações (cm) (a); número médio de gemas e
de brotações por explante (b); média da massa seca das brotações (mg)
(c); aspecto geral das brotações de ameixeira japonesa (Prunus salicina
Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro em função dos
diferentes meios de cultura. As barras representam o erro padrão da
média. UFPel, Pelotas/RS, 2010.
Quando cultivados em meio MS, os explantes produziram maior número de
brotos e massa seca das brotações, diferindo significativamente dos demais
tratamentos (Fig. 6c e 6b, respectivamente), além de apresentarem melhores
características morfológicas das brotações (Fig. 6d), em relação aos demais meios
testados no presente trabalho. Essa resposta, provavelmente, ocorreu devido a
60
maior concentração de sais do meio MS, característica destacada por Krikorian
(2002), que proporciona ganhos significativos no crescimento de tecidos e células
em diversas espécies de plantas, tornando-o o meio nutritivo mais utilizado em
trabalhos de cultura de tecidos vegetais (PASQUAL, 2001). Os dados obtidos estão
de acordo com os encontrados por Santa-Catarina et al. (2001), os quais
observaram que o meio MS promoveu maior indução de brotos (2,5) quando
comparado às brotações cultivadas no meio QL (1,4), para o porta-enxerto de
macieira ‘Seleção 69’.
Dentre os vários elementos minerais que compõem os meios de cultura, o
nitrogênio é o componente mais importante (CHAWALA, 2002). Entretanto, a
insuficiência de qualquer um dos minerais pode causar mudanças bioquímicas,
fisiológicas e morfológicas nas plantas, de acordo com o nutriente e a deficiência
causada (PREECE, 1995; MONTEIRO et al., 2000). Apesar de não ter sido
verificado
desordens
no
desenvolvimento
da
cv.
América,
diluições
nas
concentrações dos sais são frequentemente utilizadas para espécies lenhosas,
sendo que a redução da concentração da fonte de nitrogênio, principalmente na
forma amoniacal, tem sido utilizada para combater a vitrificação (GRATTAPAGLIA;
MACHADO, 1998).
De acordo com Radmann et al. (2009), o meio MS, que apresenta elevada
concentração de sais em sua composição, propiciou a vitrificação de brotações de
porta-enxerto de Prunus ‘GxN-9’ quando comparado com o meio MS com apenas ¾
da concentração dos sais e vitaminas. Os mesmos autores também verificaram
diminuição da vitrificação das brotações cultivadas no meio MS com ½ dos sais
nitrogenados em relação ao meio MS em sua constituição completa, não
apresentando sintomas de vitrificação nas brotações cultivadas no meio MS. Sendo
que estas características não foram observadas no presente trablho.
2.3.3 Experimento 3 – Alongamento in vitro de brotações de ameixeira
japonesa cv. América
Diante dos resultados obtidos no experimento de multiplicação, uma etapa
adicional - de alongamento – tornou-se necessária, uma vez que o BAP, nas
maiores concentrações testadas, proporcionou aumento na taxa de multiplicação,
porém ocorreu a produção de brotações com internós curtos o que ocasiona a
redução no comprimento das brotações.
61
No primeiro experimento de alongamento, houve diferença significativa
apenas para a variável comprimento médio das brotações, apresentando uma
resposta linear crescente com o aumento da concentração de AG3 (Fig. 7a, 7b,
Apêndices B6 e B7), variando de 1,12 a 1,82cm.
Comprimento médio das brotações
(cm)
a
b
2,3
y = 0,637x + 1,07
2
R = 85,75
2,1
1,9
1,7
1,5
1,3
1,1
0,9
0,7
0,5
0
0,25
0,5
0,75
1
-3
Concentrações de AG3 (mg dm )
Figura 7 - Comprimento médio das brotações (a) e aspecto das brotações (b) de
ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de
cultivo in vitro em função da adição AG3 nas concentrações de 0; 0,25;
0,50; 0,75; 1,0mg dm-3, acrescido de 2,0mg dm-3 de carvão vegetal
ativado. As barras representam o erro padrão da média. UFPel,
Pelotas/RS, 2010.
Para as demais variáveis analisadas não houve diferença significativa, em
relação às diferentes concentrações de giberelina adicionadas ao meio de cultivo,
apresentando em média 9,98 gemas por explante, 1,12 brotos por explante e massa
seca de 20,09mg por brotação formada por explante (Apêndices B6 e B7).
No segundo experimento de alongamento, houve interação significativa
entre os fatores apenas para a variável comprimento médio das brotações (Apêndice
B8). Verificou-se incremento linear dessa variável para as brotações cultivadas em
meio com adição de carvão vegetal, de acordo com o aumento da concentração
AG3, apresentando valores entre 1,14 a 3,50cm. Entretanto, as brotações mantidas
em meio sem adição de carvão vegetal, de acordo com a análise de regressão
polinomial, apresentaram uma resposta quadrática, com um valor máximo estimado
em 2,41cm com a adição de 6,74mg dm-3 de AG3 (Fig. 8a, Apêndice B9).
62
Comprimento médio das
brotações (cm)
a
Com carvão ativado
y = 0,202x + 1,26
2
R = 83,19
5
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
1
2
3
4
Sem carvão ativado
y = -0,027x2 + 0,3641x + 1,1847
2
R = 96,29
5
6
7
8
9
b
10
-3
Concentração de AG3 (mg dm )
Figura 8 - Comprimento médio (a) e aspecto das brotação (b) de ameixeira japonesa
(Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro em meio
MS suplementado com AG3 nas concentrações de 0; 1; 5 e 10mg dm-3 na
presença ou ausência de carvão vegetal ativado. As barras representam o
erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010.
Provavelmente esta resposta diferencial tenha ocorrido pelo fato do carvão
vegetal funcionar como um adsorvedor dos produtos provenientes do metabolismo
vegetal, bem como substâncias hormonais e vitaminas (GEORGE; SHERRINGTON,
1984; TORRES et al., 2001). O carvão vegetal tem a capacidade de reter os
nutrientes no meio de cultura, disponibilizando estes compostos de forma gradual
para a absorção da brotação.
Desta forma, explica-se a resposta observada no presente estudo, onde os
explantes submetidos ao meio de cultura acrescido de carvão vegetal possivelmente
tiveram a disponibilização do regulador de crescimento de forma controlada, de
maneira que durante o período de exposição ao AG3, não foi suficiente para
determinar o ponto máximo e posterior queda no alongamento, enquanto que os
explantes cultivados na ausência do mesmo, atingiram um ponto de máximo para o
comprimento das brotações (2,41cm), com posterior decréscimo, demonstrando que
concentrações acima de 6,74mg dm-3 de AG3 na ausência de carvão vegetal são
prejudiciais para esta característica.
Assim como no presente trabalho, diversos estudos relataram o efeito
benéfico do carvão ativado no alongamento de brotações para inúmeras espécies
frutíferas. De acordo com Roy (1995), o carvão vegetal já foi empregado na
multiplicação in vitro videira, ameixeira, framboeseira, morangueiro, macieira,
63
abacaxizeiro e bananeira. Outros autores relatam que o carvão vegetal ativado, no
meio de cultivo, proporcionou aumento no comprimento das brotações de Podocarpus
henkelii
Stapf ex Dallim. Jacks (KOWALSKI; STADEN, 2001), Zea mays L.
(MOHAMED-YASSEEN, 2001) e Acacia mearnsii (De Wild.) (QUOIRIN et al., 2001).
O número médio de gemas e de brotos, assim como a massa seca das
brotações, não apresentou diferença significativa em relação aos níveis dos fatores
analisados (concentração de AG3 e presença ou ausência de carvão vegetal no meio
de cultivo), no quarto experimento. Sendo registrado, em média, 1,34 brotos, 10,01
gemas e 16,53mg de matéria seca por brotação (Apêndice B8).
Mesmo tendo promovido aumento significativo no comprimento das
brotações, concentrações de ácido giberélico iguais ou superiores a 5mg dm-3 foram
prejudiciais para o seu desenvolvimento, por promoverem abscisão foliar e, com
10mg dm-3, além desta característica, foi possível observar necrose apical,
demonstrando o efeito tóxico dessas concentrações no cultivo in vitro da cultivar
América (Fig. 8b).
A necrose apical e abscisão foliar são efeitos que podem ter sido
provocados pelo excesso de etileno, o qual é estimulado pelas auxinas, sendo que a
síntese desse regulador pode, por sua vez, ser estimulada pelas giberelinas, as
quais foram adiciondas em excesso no meio de cultivo, causando um efeito em
cascata (TAIZ; ZEIGER, 2009). Outra possível causa para a necrose apical pode ser
decorrente da má distribuição do cálcio na planta (COLLIER; TIBBITTS, 1982). Já
que esse nutriente é translocado juntamente com a água pelos vasos do xilema
(COLLIER; HUNTINGTON, 1983) e, uma vez depositado, não apresenta
redistribuição para outras partes da planta, sendo acumulado principalmente nos
tecidos que tranpiram mais facilmente (MILLAWAY; WIERSHOLM, 1979).
Desta forma, o seu teor nos tecidos ocorre de acordo com a taxa de
transpiração, os órgãos que apresentam dificuldade para transpirar, como no caso
de plantas micropropagadas, por estarem sujeitas a microclima com elevada
umidade relativa, apresentam baixa translocação de cálcio acarretando fornecimento
inadequado para os tecidos, ocasionando a necrose apical, principalmente nas
extremidades das folhas em desenvolvimento (COLLIER; TIBBITTS, 1982). Além
disso, segundo Thibodeau e Minotti (1969) e Nagata e Stratton (1994), condições
que favoreçam o rápido crescimento da planta também aumentam a incidência deste
fenômeno.
64
Este efeito prejudicial ao desenvolvimento das brotações, também foi
observado por Mishra et al. (1999), em estudos realizados com Emblica officinalis
Gaertn., onde 1,0mg dm-3 de AG3 promoveu o alongamento dos internós, enquanto
que 3,0mg dm-3 causou desfolhamento de algumas brotações. Da mesma forma,
Deccetti (2000) relatou o efeito danoso do AG3 no desenvolvimento de brotações de
Annona glabra
L., causando queda das folhas e necrose apical. No entanto, vários
autores tais como Reeves et al. (1985), Figueredo et al. (2001) e Rocha et al. (2009)
ressaltam a necessidade da adição de AG3 no meio para o alongamento das
brotações de Prunus cv. ‘St. Julien A’; Rollinia mucosa Jacq. e Prunus, cv. Mr. S. 2/5,
respectivamente.
2.4 Conclusão
Nas condições em que foram realizados os experimentos, é possível concluir
que:
- O estabelecimento in vitro de explantes basais de P. salicina, cv. América, é
superior ao de explantes apicais, formando brotações iniciais maiores, com maior
número de gemas e de folhas;
- O BAP é a citocinina que induz a formação de brotações com melhor
aspecto, maior número de brotos e de gemas, em relação ao 2iP;
- Concentrações elevadas de BAP induzem altas taxas de multiplicação,
porém com brotos pequenos que inviabilizam sua utilização nas etapas posteriores
do processo de multiplicação;
- O meio MS acrescido de 0,3mg dm-3 de BAP é mais adequado para a
multiplicação in vitro de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América.
- O meio de cultivo MS suplementado com carvão vegetal ativado, acrescido
de 1,0mg dm-3 de AG3, é o mais adequado para o alongamento in vitro de brotações
de ameixeira japonesa, cv. América.
65
Capítulo 3
Enraizamento in vitro e aclimatização de brotações de ameixeira
japonesa cv. América
66
Enraizamento in vitro e aclimatização de brotações de ameixeira japonesa cv.
América
3.1 Introdução
O Brasil, apesar de ser o maior produtor mundial de frutas, possui uma
pequena participação no mercado internacional, sendo que nos últimos anos, a
quantidade de frutas tropicais para exportação, vem aumentando (REETZ et al.,
2007). Dentre as frutíferas, a cultura da ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.)
ocorre principalmente nos Estados do Rio Grande do Sul e Santa Catarina
(CASTRO, 2003). A cultivar América é umas das preferidas no sul do RS, devido às
suas características organolépticas e adaptação às condições edafoclimáticas dessa
região (REVERS; MACHADO, 2005), porém, apresenta problemas de produção
quando o pomar não é manejado adequadamente ou as mudas são de baixa
qualidade genético-sanitária.
A produção de mudas de espécies frutíferas está baseada na multiplicação
vegetativa,
por
assegurar
a
uniformidade
genética
dos
indivíduos
e
as
características da planta-matriz (DUTRA et al., 1999; MAYER et al., 2001). Na
ameixeira, a produção de mudas é realizada principalmente por enxertia de gema
ativa, nos meses de novembro a janeiro (NACHTIGAL; PEREIRA, 2000).
No Brasil, devido a ausência de um sistema de certificação da produção de
mudas de prunoídeas, não existe um adequado controle genético-sanitário do
material utilizado na propagação, potencializando a disseminação de pragas e
patógenos via material propagativo, além de resultar em mudas de baixa qualidade
(BIANCHI; FACHINELLO, 2005).
Instituições governamentais vêm investindo em pesquisas com a finalidade
de melhorar esse sistema de produção. Desta forma, a cultura de tecidos tem se
67
apresentado como uma alternativa potencialmente viável para clonagem de
espécies lenhosas e produção comercial de mudas clonais, permitindo controlar
diversas variáveis responsáveis pelo desenvolvimento da planta (ASSIS; TEIXEIRA,
1999), possibilitando a multiplicação de plantas livres de doenças, em um curto
espaço de tempo, independente da época do ano (COUTO et al., 2004).
Dentre as etapas da micropropagação, o enraizamento in vitro é controlado
e determinado geneticamente, variando entre espécies e cultivares (ASSIS;
TEIXEIRA, 1999), sendo considerado um dos principais fatores limitantes para o
estabelecimento de protocolos gerais desse processo para espécies do gênero
Prunus
(ROGALSKI et al., 2003b). Portanto, o sucesso dessa tecnologia em escala
comercial, depende da capacidade de aclimatização das plantas cultivadas in vitro
com baixo custo e com elevadas taxas de sobrevivência, tendo em vista que,
geralmente, ocorre um alto índice de mortalidade dessas plantas durante o
transplantio (HAZARIKA, 2006).
Após a rizogênese das brotações é que são constituídas as plantas
completas, aptas a serem aclimatizadas às condições ex vitro (HU; WANG, 1983;
RADMANN et al., 2002). Logo, a obtenção de uma planta com um sistema radicular
bem desenvolvido é de grande importância para a sua sobrevivência e crescimento
nas novas condições ambientais.
Foi observado, em espécies florestais, que a sobrevivência das plantas na
fase de aclimatização, também depende do desenvolvimento de um bom sistema
vascular entre a parte aérea e as raízes (SOMMER; CALDAS, 1991), pois raízes
originadas a partir de calos apresentam a função de absorção de água e nutrientes
comprometida, resultando na morte das mudas quando transferidas para o solo
(RADMANN et al., 2002).
Para a indução do enraizamento in vitro, geralmente, os meios de cultura
são acrescidos de diferentes tipos e concentrações de auxinas, sendo esses fatores
que mais influenciam no sucesso do enraizamento (HARTMANN et al., 2002;
ROCHA, 2006b). Essas substâncias atuam na expansão, divisão e alongamento
celular na cultura de tecidos, principalmente durante a etapa de enraizamento
(KRIKORIAN, 1991; ROSS, 1992), além de estimularem a síntese do etileno que
favorece a emissão das raízes (HINOJOSA, 2000; NORBERTO et al., 2001).
Na maioria das vezes, os explantes não iniciam o processo de enraizamento
em meios com concentrações altas de sais no meio de cultivo, mesmo na presença
68
de auxinas. Portanto, durante a rizogênese, o meio utilizado tem as concentrações
de sais reduzidas para 1/2, 1/3 ou 1/4, melhorando esse processo (ZIMMERMAN;
BROOME, 1982; DRUART et al., 1982; HU; WANG, 1983; ANDERSON, 1984;
VALLES; BOXUS, 1987; McCOWN, 1988; GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998;
PINTO; LAMEIRA, 2001; PASQUAL, 2001; SOUZA et al., 2004; LIMA, 2004;
SOUZA; PEREIRA, 2007).
Durante a aclimatização a maioria das plantas oriundas do cultivo in vitro
sofre desidratação, por não serem capazes de manter o equilíbrio hídrico,
prejudicando, desta forma, a sobrevivência das plantas em condição ex vitro
(MALDA et al., 1999; POSPÍSILOVÁ et al., 1999; HAZARIKA, 2006). Isso ocorre
devido ao cultivo in vitro proporcionar um microclima controlado, em ambiente
fechado, sem trocas gasosas, com alta umidade do ar, baixa intensidade luminosa e
disponibilidade de açúcares, como fonte de carbono e energia, no meio de cultivo
(PREECE; SUTTER, 1991; SCIUTTI; MORINI, 1993; POSPÍSILOVÁ et al., 1999;
HAZARIKA, 2006). Estas condições especiais podem provocar alterações na
morfologia, anatomia e fisiologia das plantas (MARÍN et al., 1988; PREECE;
SUTTER, 1991; DESJARDINS, 1995; POSPÍSILOVÁ et al., 1999; 2000; HAZARIKA,
2006), dificultando o processo de aclimatização ao ambiente externo.
Alguns autores afirmam que o processo de aclimatização no gênero Prunus
tem apresentado bons resultados com índice de sobrevivência variável de 84-93%
(BORKOWSKA, 1985; CAMPANA et al., 1994; RADICE et al., 1999). Além disso,
Marín et al. (1988) demonstraram que plantas micropropagadas de Prunus cerasus L.
apresentavam xilema radicular contínuo e funcional. O emprego de auxinas na fase
de indução do enraizamento in vitro tem revelado eficiência, promovendo acréscimo
na taxa de sobrevivência das plantas na aclimatização (AL-MAARRI et al., 1994;
CAMPANA et al., 1994; YEPES; ALDWINCKLE, 1994; MURAI et al., 1997).
Deste modo, o desenvolvimento do presente trabalho teve como objetivo
testar o enraizamento in vitro e aclimatização de brotações micropropagadas de
ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, para a produção de mudas
em larga escala.
69
3.2 Material e Métodos
Foram realizados dois experimentos, onde brotações de ameixeira japonesa
(Prunus salicina Lindl.), cv. América, com 3 a 4cm de comprimento, oriundas do cultivo
in vitro, multiplicadas em meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) suplementado
com 0,3mg dm-3 de BAP (6-benzilaminopurina) e alongadas no mesmo meio com
adição 1,0mg dm-3 de AG3 (ácido giberélico), tiveram a base cortada em bisel e
então, utilizadas como fonte de explante para os experimentos. Estas brotações
foram inoculadas em frascos contendo 40cm3 de meio MS com a metade da
concentração dos sais e vitaminas (MS/2), acrescido de 20g dm-3 de sacarose,
100mg dm-3 de inositol, 7g dm-3 de ágar e pH 5,8.
No primeiro experimento, as brotações foram cultivadas em meio MS/2
suplementado com diferentes concentrações de AIA (0; 0,5 e 1,0mg dm-3), enquanto
que no segundo foram testadas concentrações de AIA e AIB intermediárias ao
experimento anterior de 0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0mg dm-3. Os explantes foram
mantidos, por 20 dias, em sala de crescimento com condições de luz e temperatura
controladas (42µmol m-2 s-1 de densidade de fluxo de fótons, fotoperíodo de 16 horas
de luz e temperatura de 25 ± 1ºC, durante o período de luz e 23 ± 1ºC, durante o
período de escuro) para indução do enraizamento. Posteriormente, as plantas foram
transplantadas para bandejas alveoladas de poliestireno contendo como substrato
uma mistura de Plantmax® com casca de arroz carbonizada (1:1, v:v), autoclavados,
as quais foram mantidas em câmara de nebulização intermitente dentro da casa-devegetação durante 30 dias para aclimatização das plantas. Após esse período, as
bandejas foram retiradas da câmara nebulizadora e mantidas em casa-de-vegetação
a 22-28ºC, 80-95% de umidade relativa do ar e com a frequência de irrigação
reduzida.
No primeiro experimento, 20 dias após o enraizamento in vitro, foi avaliado o
comprimento das raízes (cm), número de raízes por brotação, percentagem de
enraizamento, número de plantas com raízes secundárias, com formação de
primórdios radiculares (< 0,5cm) e com calos na base. Ao completar 20 dias de
aclimatização, foi avaliada a percentagem de sobrevivência das plantas, e aos 120
dias de aclimatização, foi avaliado o volume das raízes (cm3) e massa seca das
raízes (mg), em cinco plantas de cada tratamento.
No segundo experimento, as plantas foram avaliadas, após 20 dias de
cultivo in vitro, quanto ao comprimento das raízes (cm), número de raízes por
70
brotação e percentagem de enraizamento. Durante a fase de aclimatização foi
avaliada a percentagem de sobrevivência aos 20 e 30 dias em casa-de-vegetação.
No primeiro experimento, o delineamento experimental tanto para o
enraizamento como para aclimatização foi inteiramente casualizado, contendo oito
repetições, cada uma representada por um frasco/parcela com cinco explantes. Os
dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias dos tratamentos
comparadas pelo teste de Tukey, com 5% de probabilidade de erro.
Enquanto que o delineamento experimental do segundo experimento tanto
para indução do enraizamento quanto para aclimatização foi inteiramente
casualizado, composto por um fatorial 2x5, duas fontes de auxina e cinco
concentrações, contendo cinco repetições, representadas por um frasco/parcela com
cinco explantes. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e de
regressão polinomial. As análises estatísticas para ambos experimentos foram
realizadas através do programa estatístico WinStat 2.0 (MACHADO; CONCEIÇÃO,
2003).
3.3 Resultados e Discussão
3.3.1 Experimento 1 – Enraizamento in vitro com diferentes concentrações de
AIA
De acordo com a análise de variância, não houve diferença estatística para
as variáveis analisadas após os 20 dias de enraizamento in vitro, exceto para a
percentagem de enraizamento (Apêndices C1 e C2).
Foi observada resposta crescente com o aumento das concentrações de AIA
para percentagem de enraizamento, variando de 52,48% a 82,29%, porém, não
houve diferença significativa pelo teste de Tukey com 5% de probabilidade de erro
(Fig. 1a). Apesar de não ocorrer diferença significativa entre tratamentos, verificouse resposta similar para a variável número de raízes por brotação, a qual apresentou
maior média de 2,8, na concentração de 1,0mg dm-3 (Fig. 1b), demonstrando o efeito
promotor de enraizamento do AIA nos explantes desta cultivar. Estes resultados
concordam com a afirmação de Hu e Wang (1983) que dizem que o AIA é a auxina
mais eficaz para estimular o enraizamento in vitro, embora não seja a mais utilizada.
71
a
b
Raízes secundárias
Percentagem
100
80
60
40
Primórdios radiculares
Calos
82,29
76,67
52,08
44,79
21,88
10
20
34,52
28,54
14,58
7,29
2,5
0
0
0,5
1
-3
Concentrações de AIA (mg dm )
5
Número de raízes por brotação
Enraizamento
3,5
2,8
3
2,5
2,49
1,83
2
1,5
1
0,5
0
0
0,5
1
-3
Concentrações de AIA (mg dm )
Figura 1 - Percentagem de enraizamento, de formação de raízes secundárias, de
primórdios radiculares e de calos (a), e número de raízes por brotação
(b) de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 20 dias
de cultivo in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações
de AIA (0; 0,5 e 1,0mg dm-3). As barras representam o erro padrão da
média. UFPel, Pelotas/RS, 2010.
Em contrapartida, a percentagem de formação de primórdios radiculares
apresentou valores decrescentes (Fig. 1a), evidenciando que as concentrações mais
elevadas de AIA, utilizadas no presente estudo, não foram tóxicas a ponto de inibir o
alongamento das raízes (SALISBURY; ROOS, 1991; FETT NETO et al., 1992).
A percentagem de formação de raízes secundárias e formação de calos
apresentaram maiores valores (44,79 e 10%, respectivamente) no meio sem adição
do regulador de crescimento, e menores (28,54 e 2,5%, respectivamente) quando as
brotações foram expostas a 0,5mg dm-3 de AIA (Fig. 1a), permitindo demonstrar que,
neste caso, não são respostas influenciadas pela exposição ao regulador de
crescimento AIA.
A indução do enraizamento no tratamento sem adição de regulador de
crescimento pode ter ocorrido em virtude do acúmulo de auxinas endógenas
provenientes das folhas ou gemas. Tal acúmulo pode promover o aumento da
atividade metabólica dos tecidos e, consequentemente, a formação de raízes
(WAREING; PHILLIPS, 1981). Este fato também foi observado por Centellas et al.
(1999) no enraizamento in vitro de macieira onde, na ausência de reguladores de
crescimento, cerca de 5% de brotações enraizaram. Outro fator que pode ter
favorecido o enraizamento dessas brotações é o rejuvenecimento dos tecidos
causado por sucessivos subcultivos durante a micropropagação (GONÇALVES,
1982; BONGA; VON ADERKAS, 1992; ASSIS; TEIXEIRA, 1998; GRATTAPAGLIA;
72
MACHADO, 1998), visto que, o material utilizado neste experimento passou por seis
subcultivos consecutivos. A restauração das características juvenis, promovendo
maior potencial de enraizamento, tem sido constatado em Eucalyptus, com o aumento
do número de subcultivos (CHAPERON, 1987; ZOBEL, 1993; HACKETT; MURRAY,
1993; XAVIER; COMÉRIO, 1996; ASSIS, 1996).
Com relação à percentagem de sobrevivência após 20 dias durante a fase
de aclimatização, houve diferença significativa entre as concentrações de AIA, onde
a maior percentagem de sobrevivência (67,5%) foi observada na concentração de
1,0mg dm-3 de AIA, diferindo significativamente apenas do tratamento sem a adição
do regulador de crescimento (Fig. 2a, Apêndice C3).
a
b
Volume das raízes (cm3 )
Sobrevivência (%)
3
100
80
60
Massa seca da raízes (g)
60 ab
67,5 a
2
40 b
2,5
2,5
1,9
1,66
1,5
40
1
20
0,5
0
0,141
0,227
0,194
0
0
0,5
1
-3
c
Concentrações de AIA (mg dm )
0mg dm-3 de AIA
0,5mg dm-3 de AIA
0
0,5
1
-3
Concentrações de AIA (mg dm )
1,0mg dm-3 de AIA
Figura 2 - Percentagem de sobrevivência após 20 dias de aclimatização (a); volume
(cm3) e massa seca das raízes (g) (b), e aspecto geral das plantas (c) de
ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, micropropagadas e
enraizadas in vitro em meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações
de AIA (0; 0,5 e 1,0mg dm-3) , após 120 de aclimatização. As barras
representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010.
73
Depois de aclimatizadas, ou seja, ao final do período de 120 dias em casade-vegetação, as plantas de ameixeira foram avaliadas quanto ao volume e massa
seca das raízes. Ambas as variáveis apresentaram aumento de acordo com o
aumento
da
concentração
de
AIA,
embora
não
apresentando
diferenças
significativas (Fig. 2a, 2b, 2c e Apêndice C3). Demonstrando que na maior
concentração de AIA, houve uma melhor formação do sistema radicular.
O papel das auxinas na indução e no desenvolvimento de raízes tem sido
bastante estudado. Conforme já mencionado anteriormente, o AIA é a auxina
natural, encontrada nas plantas, tanto na forma livre quanto conjugada, a qual foi
identificada em 1928. Posteriormente, auxinas sintéticas análogas ao AIA, como o
AIB e ANA foram preconizados como fitorreguladores de enraizamento (LEOPOLD;
KRIEDEMANN, 1975; SOUZA; PEREIRA, 2007).
Entretanto, o sucesso do enraizamento dos explantes é pré-requisito para
qualquer protocolo de micropropagação, por facilitar o estabelecimento da muda no
solo (PATI et al., 2006). Nesse sentido, verificou-se que no primeiro experimento, a
percentagem de sobrevivência não foi tão alta quanto esperava-se, motivando a
realização do segundo experimento.
3.3.2 Experimento 2 – Enraizamento in vitro com diferentes concentrações de
AIA e AIB
Não houve interação significativa entre os fatores para as variáveis número
de raízes por brotação e percentagem de enraizamento, apresentando resultado
significativo apenas para o tipo de auxina utilizado (Apêndice C4). Os melhores
resultados foram obtidos a partir de brotações cultivadas em meio suplementado
com AIB em relação às cultivadas em meio com AIA, para ambas variáveis (0,87 e
41,95%, respectivamente) (Fig. 3a e 3b). Esses resultados foram inferiores aos do
primeir experimento.
Esta resposta diferenciada frente à exposição ao mesmo regulador de
crescimento (AIA), pode ser justificada em virtude dos diferentes estádios de
maturação do material utilizado em cada um dos experimentos. Sendo que no
primeiro, foi utilizado material oriundo de seis subcultivos, o que justifica a melhor
capacidade para enraizar em virtude do maior rejuvenescimento das brotações,
enquanto que para o segundo, utilizou-se material proviniente de dois subcultivos.
74
b
1,2
1
0,874 a
100
0,8
0,6
0,28 b
0,4
0,2
Enraizamento (%)
Número médio de raízes por
brotação
a
80
60
41,95 a
40
15,33 b
20
0
0
AIB
AIA
Auxinas
AIB
AIA
Auxinas
Figura 3 - Número de raízes por brotação (a) e percentagem de enraizamento de
brotações de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos
20 dias de cultivo in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes
concentrações de AIB e AIA (0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0mg dm-3). As barras
representam o erro padrão da média. UFPel, Pelotas/RS, 2010.
Entretanto, foi verificado, no segundo experimento, a superioridade do AIB
em relação ao AIA, por induzir maior número de raízes por brotação e percentagem
de enraizamento. Em estudos realizados por Miranda et al. (2004), foi demonstrado
aumento no percentual de enraizamento de estacas de porta-enxertos de
pessegueiro utilizando AIB, o que confirma o efeito benéfico desse regulador no
enraizmento de prunoídeos. Em contrapartida, Tofanelli et al. (2002) observaram um
baixo potencial de enraizamento para cultivares de pessegueiro utilizando AIB,
evidenciando que não é apenas o tipo de auxina que tem influência sobre o
enraizamento mas que, as características intrínsecas de cada espécie e/ou cultivar
também são determinates.
De acordo com Radmann et al. (2002) o AIA proporcionou a formação de um
bom sistema radicular de porta-enxertos de macieira 'M-9', sem a formação de
raízes grossas, com maior formação de raízes secundárias, menor formação de
calos e um bom desenvolvimento da parte aérea. Os mesmos autores salientam que
brotações enraizadas com AIB e ANA apresentam melhor enraizamento em
concentrações mais baixas em relação ao AIA. Provavelmente devido a maior
degradação e menor taxa de absorção do AIA em relação as demais auxinas
(NISSEN; SUTTER, 1990).
Entretanto, verificou-se interação significativa entre os fatores para a variável
comprimento médio das raízes, comprovando que nas condições em que foi
75
realizado este experimento, as diferentes concentrações e tipos de auxinas
utilizadas provocaram respostas distintas para essa variável (Apêndice C4).
O maior comprimento das raízes foi observado nas brotações cultivadas no
meio de cultura com adição de AIB em relação ao AIA, em todas as concentrações
utilizadas. As brotações cultivadas em meio acrescido de AIB apresentaram uma
tendência linear crescente para o comprimento médio das raízes, variando de 1,45 a
5,73cm. Já nos tratamentos com adição de AIA não houve efeito significativo nas
diferentes concentrações testadas, obtendo-se uma média de comprimento das
Comprimento médio das raízes
(cm)
raízes bastante inferior, de 0,86cm (Fig. 4, Apêndice C5).
AIB
AIA
yAIB = 4,9205x + 1,6614
yAIA = 0,8556 ns*
2
R = 86,15
7
6
5
4
3
2
1
0
0
0,25
0,5
0,75
1
-3
Concentrações das auxinas (mg dm )
Figura 4 - Comprimento médio das raízes de plantas de ameixeira japonesa (Prunus
salicina Lindl.), cv. América, aos 20 dias de cultivo in vitro no meio MS/2
acrescido de diferentes concentrações de AIB e AIA (0; 0,25; 0,50; 0,75
e 1,0mg dm-3). As barras representam o erro padrão da média. ns*
equação de regressão polinomial não significativa. UFPel, Pelotas/RS,
2010.
As brotações que foram submetidas ao tratamento com AIB, formaram
plantas mais alongadas com maior número de folhas. Estas características se
tornam mais marcantes à medida que a concentração deste regulador aumentou
(dados não demonstrados). Enquanto isso, as brotações cultivadas em meio com
AIA em concentrações maiores que 0,75mg dm-3, formaram plantas com baixo
desenvolvimento da parte aérea, com entrenós curtos, dando o aspecto de roseta
(Fig. 5). Esta diferença entre as auxinas pode ser devida à maior degradação e
76
menor taxa de absorção de AIA em relação às outras auxinas, que determinaria
acúmulo de ANA e AIB nas células dos explantes (NISSEN; SUTTER, 1990).
a
b
f
g
c
d
e
h
i
j
Figura 5 - Plantas de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, após 20
dias de cultivo in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes
concentrações de AIB (a-e) e AIA (f-j) (0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0mg dm-3).
UFPel, Pelotas/RS, 2010.
De acordo com Mohammed e Vidaver (1990), não é apenas o tipo de
sistema radicular que influencia na sobrevivência das plantas após a transferência
para o cultivo ex vitro, mas o bom desenvolvimento da parte aérea também é
extremante importante.
Considerando que o AIA é a principal aixina encontrada nas plantas, sendo
ativa em concentrações extremamente baixas. Além do processo de síntese, esse
fitohormônio também é inativado durante os processos de crescimento e
diferenciação das células, estando sujeito a oxidação através do processo de fotooxidação e reações de oxidação catalisadas por enzimas (AIA-oxidase). Além dos
processos de oxidação, o AIA pode ligar-se a outras moléculas na planta,
produzindo conjugados que podem reter ou mesmo perder a atividade auxínica
(SALISBURY, 1991; TAIZ; ZEIGER, 2009).
O AIB também proporcionou melhores resultados no enraizamento in vitro
de macieira, quando comparado ao ANA e AIA (CENTELLAS et al., 1999). Nesse
estudo, o AIA proporcionou melhores respostas em altas concentrações,
corroborando com os resultados observados no presente trabalho.
77
Segundo Leopold e Kriedemann (1975), a reduzida capacidade de indução
de enraizamento pelo AIA, comparado ao ANA e AIB, é atribuída aos diversos
mecanismos metabólicos para reduzir ou anular os efeitos do AIA através da
conjugação e/ou degradação, pela ação da AIA-oxidase nos tecidos do explantes
(GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1990; SALISBURY, 1991), sendo considerada fraca
comparada ao AIB e ANA (CALDAS et al., 1990). Além disso, o AIA exógeno,
quando aplicado no meio de cultura, apresenta baixa estabilidade degradando-se
mais facilmente pela ação da luz do que o AIB (NISSEN; SUTTER, 1990; CALDAS
et al., 1998), o que pode justificar, em parte, as melhores respostas quando se
utilizou concentrações mais altas desta auxina.
Como a cultura in vitro fornece condições especiais para o crescimento e
desenvolvimento das brotações com ótimas condições e estabilidade para
multiplicação das brotações com o mínimo de estresse (PREECE; SUTTER, 1991;
SCIUTTI; MORINI, 1993; POSPÍSILOVÁ et al., 1999; HAZARIKA, 2006), a
aclimatização destas plantas, ou seja, a capacidade de sobreviverem fora dos
frascos de cultivo, faz com que esta seja uma etapa bastante delicada e de grande
importância para o estabelecimento de protocolos de micropropagação (HAZARIKA,
2006). A maioria das plantas sofre desidratação nesta fase, tornando-se uma etapa
crucial para a produção de mudas (MALDA et al., 1999).
Conforme mencionado anteriormente, a obtenção de uma planta com
sistema radicular bem desenvolvido é de grande importância para a sua adaptação e
sobrevivência nas novas condições ambientais. No presente trabalho, 20 dias após
a transferência para o solo, a percentagem de sobrevivência foi maior para as
plantas cultivadas em meio com adição de AIB, a não ser na concentração de 0,5mg
dm-3, chegando a 100% na concentração de 1,0mg dm-3 (Fig. 6a). Entretanto, este
quadro apresentou pequena variação após 30 dias da transferência, apresentando
92% de sobrevivência no meio com AIA e 88% com AIB, na maior concentração
(Fig. 6b). Essa queda, pouco acentuada, da sobrevivência das brotações enraizadas
com AIB pode ter ocorrido devido a uma má formação do sistema vascular entre as
brotações e as raízes, já que o enraizamento ocorreu de forma mais rápida. De
acordo com Sommer e Caldas (1991), em estudos com espécies florestais, a
sobrevivência das plantas não depende apenas da formação de um sistema
radicular bem definido, mas de uma boa conexão vascular entre raiz/broto.
78
AIB
120
Aclimatização (%)
b
Após 20 dias de aclimatização
84 100
84
100
AIB
100
100
94,12
96
85
80
54,17
60
40
16
20
20
Após 30 dias de aclimatização
AIA
Aclimatização (%)
a
AIA
88,89
80
80
92
88
68
52
60
50
47,06
40
20
20
12
0
0
0
0,25
0,5
0,75
-3
Concentrações das auxinas (mg dm )
0
1
Figura 6 - Percentagem de sobrevivência após
de plantas de ameixeira japonesa
micropropagadas e enraizadas in
diferentes concentrações de AIA
Pelotas/RS, 2010.
0,25
0,5
0,75
-3
Concentrações das auxinas (mg dm )
1
20 (a) e 30 (b) dias de aclimatização
(Prunus salicina Lindl.), cv. América,
vitro em meio MS/2 acrescido de
(0; 0,5 e 1,0mg dm-3). UFPel,
Mesmo o AIB tendo proporcionado a formação de maior número de raízes e
com maior comprimento durante a indução in vitro, a maior porcentagem de
sobrevivência das plantas após 30 dias do transplantio foi das brotações
provenientes do meio com adição de AIA, o que pode ter ocorrido por ter formado
raízes mais curtas, as quais são mais facilmente manipuladas, proporcionando
menores danos quando manipuladas na fase de aclimatização.
A rápida formação das raízes nas brotações cultivadas em meio com adição
de AIB pode ter prejudicado, de certa forma, a aclimatização, pois normalmente
raízes longas são facilmente danificadas durante o transplantio. Além disso, o
rompimento dos tecidos propicia infecções por patógenos podendo, desta forma,
prejudicar a sobrevivência das plantas durante a aclimatização, uma vez que não se
fez uso de fungicidas ou bactericidas nessa etapa.
Outro fator a considerar seria pelo fato do AIA ser uma auxina naturalmente
encontrada nas plantas podendo ser mais facilmente absorvida e menos prejudicial
durante o processo de crescimento e diferenciação das raízes (SALISBURY, 1991)
devido ao metabolismo diferencial das auxinas nas células vegetais onde o AIA é
conjugado e oxidado enquanto que o AIB é conjugado e metabolizado (SMULDERS
et al., 1990).
O AIB promoveu o enraizamento de forma mais eficiente que o AIA durante
o cultivo in vitro, portanto, para melhorar a eficiência de aclimatização, o ideal seria
que o período de cultivo in vitro para a formação da raiz fosse menor, provavelmente
79
inferior a 10 dias na concentração de 1,0mg dm-3, pois, segundo De Klerk et al.
(1997), a indução das raízes adventícias ocorre nos primeiros cinco dias após a
transferência para o meio de enraizamento.
Desta forma, seria possível promover a indução e a formação apenas de
primórdios radiculares, os quais são mais adequados para o transplantio e
pegamento da planta, por se encontrarem em fase de crescimento ativo e evitarem a
quebra no momento da retirada do meio de cultura (GRATTAPAGLIA; MACHADO,
1998), facilitando a lavagem e retirada do meio aderido na base, bem como a
introdução da planta no substrato (ASSIS; TEIXEIRA, 1999). Conforme Rocha et al.
(2006c), o tamanho adequado das raízes para serem transplantadas para o
substrato é de aproximadamente 0,2 a 0,3cm.
Existem relatos de brotações de porta-enxerto de Prunus spp. submetidas ao
enraizamento in vitro com adição de AIB em concentrações entre 0,1 e 0,5mg dm -3,
que, mesmo não apresentando formação de raízes aparentes, quando transferidas
para o substrato durante a fase de aclimatização, foram capazes de formar raízes e
sobreviverem (ROGALSKI et al., 2003a). Pietropaolo e Reisch (1984) também
observaram a mesma resposta na aclimatização de Prunus domestica L., onde
brotações de ameixeira ‘Stanley’ não enraizadas in vitro desenvolveram sistema
radicular no substrato, apresentando alta taxa de sobrevivência das plantas nas
condições ex vitro.
Em contrapartida, Radmann et al. (2003), em trabalhos de enraizamento in
vitro de amoreira, relataram que mesmo havendo 100% de brotações com formação
de raízes bem desenvolvidas com a adição de AIB, estas plantas não sobreviveram
após terem sido transplantadas para as condições ex vitro, tendo atribuído esta
resposta ao longo comprimento das raízes na ocasião do transplante.
3.4 Conclusão
Com o desenvolvimento deste trabalho conclui-se que para ameixeira
japonesa, cv. América, o enraizamento in vitro ocorreu de forma mais rápida com a
adição de 1,0mg dm-3 de AIB.
Enquanto que a maior percentagem de sobrevivência, após 30 dias, foi
obtida com a adição de 1,0mg dm-3 de AIA.
80
Considerações Finais
Os resultados apresentados no primeiro capítulo deste trabalho são de
grande valia, tendo em vista a ausência de publicações atualizadas sobre a
compatibilidade reprodutiva entre cultivares adaptadas a nossa região; servindo de
subsídio para programas de melhoramento genético, uma vez que podem ser
contrastados com informações de sequenciamento dos alelos-S de cada uma das
cultivares, aprimorando, desta forma, o conhecimento a respeito da compatibilidade
reprodutiva entre cultivares de ameixeira japonesa (P. salicina).
Os estudos fisiológicos confirmaram dados da caracterização molecular dos
alelos-S de algumas cultivares dessa espécie, entretanto seria necessário
caracterizar molecularmente esses alelos de outras cultivares de interesse para a
região, comparando com os resultados obtidos neste trabalho.
A identificação desses alelos é muito importante para reduzir perdas no
campo, bem como para serem utilizados com o intuito de realizar transformação
genética, para o silenciamento dos alelos-S de interesse, objetivando obter plantas
autoférteis, o que facilitaria o manejo dos pomares, aumentando a produtividade e
uniformizando a produção dos frutos.
Para tanto, o desenvolvimento do protocolo de micropropagação é de
extrema importância, visando estudos de regeneração a partir de explantes foliares.
Com o presente estudo foi desenvolvido protocolo de micropropagação da cv.
América, que é uma cultivar de grande interesse para o estudo de silenciamento
gênico, por ser autoincompatível reprodutivamente. Tentativas para definir
protocolos de regeneração da cv. América, a partir de explantes foliares estão sendo
desenvolvidos, porém ainda não produziram resultados satisfatórios, necessitando,
para isso, maiores estudos.
81
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YEPES, L. M.; ALDWINCKLE, H. S. Micropropagation of thirteen Malus cultivars
and rootstock, and effect of antibiotics on proliferation, Plant Growth Regulation,
New York, v. 15, p. 55-67, 1994.
ZIMMERMAN, R. H.; FORDHAM, I. Simplified method for rooting apple cultivars in
vitro. Journal of the American Society for Horticultural Science, Mount Vernon,
v. 110, p. 34-38. 1985.
99
ZISOVICH, A.; STERN, R.; SHAFIR, S. Identification of seven S-alleles from the
European pear (Pyrus communis) and the determination of compatibility among
cultivars. Journal of Horticultural Science & Biotechnology, United Kingdom, n.
79, p. 101-106, 2004.
ZUCCHERLLI, S.; TASSINARI, P.; BROOTHAERTS, W. TARTARINI, S; DONDINI,
L.; SANSAVINI, S. S-allele characterization in self-incompatible pear (Pyrus
communis L.). Sexual Plant Reproduction, Zurich, n. 15, p. 153-158, 2002.
100
Apêndices
101
Apêndice A – Capítulo 1
Caracterização fisiológica da compatibilidade reprodutiva de seis cvs. copa de
ameixeira japonesa
Apêndice A1 – Resumo da análise de variância e testes de significância para a
variável percentagem de grãos de pólen germinados na região
estigmática do pistilo de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.),
cv. América, após 120h das polinizações controladas, realizadas in
vivo e mantidas em temperatura ambiente. Pelotas/ RS, 2010
Percentagem de grãos de pólen germinados na região
Causas da
GL
estigmática da cv. América
variação
QM
QM**
Estatística F Estatística F**
Cruzamentos
6
4018,91
0,38
3,06*
3,38*
Resíduos
133
1.314,71
0,11
Média geral
77,84
0,81
Cv (%)
46,58
41,23
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
** Análise dos dados transformados para (x/100)1/2.
Apêndice B2 – Resumo da análise de variância e testes de significância para a
variável percentagem de grãos de pólen germinados na região
estigmática do pistilo de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.),
cv. Amarelinha, após 120h das polinizações controladas, realizadas
in vivo e mantidas em temperatura ambiente. Pelotas/ RS, 2010
Percentagem de grãos de pólen germinados na região
Causas da
GL
estigmática da cv. Amarelinha
variação
QM
QM**
Estatística F Estatística F**
Cruzamentos
3
472,62
0,02
2,22ns
2,36ns
Resíduos
76
212,58
0,01
Média geral
95,96
0,97
cv (%)
15,19
10,25
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
** Análise dos dados transformados para (x/100)1/2.
102
Apêndice A3 – Resumo da análise de variância e testes de significância para a
variável percentagem de grãos de pólen germinados na região
estigmática do pistilo de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.),
cv. Reubennel, após 120h das polinizações controladas, realizadas
in vivo e mantidas em temperatura ambiente. Pelotas/ RS, 2010
Percentagem de grãos de pólen germinados na região
Causas da
GL
estigmática da cv. Reubennel
variação
QM
QM**
Estatística F Estatística F**
Cruzamentos
2
1.5941,99
0,61
34,38*
16,48*
Resíduos
57
463,42
0,04
Média geral
71,78
0,81
cv (%)
30,00
23,56
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
** Análise dos dados transformados para (x/100)1/2.
Apêndice A4 – Resumo da análise de variância e testes de significância para a
variável percentagem de grãos de pólen germinados na região
estigmática do pistilo de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.),
cv. Rosa Mineira, após 120h das polinizações controladas,
realizadas in vivo e mantidas em temperatura ambiente. Pelotas/
RS, 2010
Percentagem de grãos de pólen germinados na região
Causas da
GL
estigmática da cv. Rosa Mineira
variação
QM
QM**
Estatística F Estatística F**
Cruzamentos
4
23.325,06
2,14
49,65*
41,68*
Resíduos
95
469,79
0,05
Média geral
82,19
0,83
cv (%)
26,37
27,33
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
** Análise dos dados transformados para (x/100)1/2.
Apêndice A5 – Resumo da análise de variância e testes de significância para a
variável percentagem de grãos de pólen germinados na região
estigmática do pistilo de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.),
cv. Pluma 7, após 120h das polinizações controladas, realizadas in
vivo e mantidas em temperatura ambiente. Pelotas/ RS, 2010
Percentagem de grãos de pólen germinados na região
Causas da
GL
estigmática da cv. Pluma 7
variação
QM
QM**
Estatística F Estatística F**
Cruzamentos
1
1.845,07
0,01
1,65ns
0,09ns
Resíduos
38
1.121,28
0,09
Média geral
78,21
0,84
cv (%)
42,82
35,20
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
** Análise dos dados transformados para (x/100)1/2.
103
Apêndice A6 – Resumo da análise de variância e testes de significância para a
variável percentagem de grãos de pólen germinados na região
estigmática do pistilo de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.),
cv. Santa Rosa, após 120h das polinizações controladas, realizadas
in vivo e mantidas em temperatura ambiente. Pelotas/ RS, 2010
Percentagem de grãos de pólen germinados na região
Causas da
GL
estigmática da cv. Santa Rosa
variação
QM
QM**
Estatística F Estatística F**
Cruzamentos
1
864,90
24,75
6,58*
11,31*
Resíduos
38
131,51
2,19
Média geral
8,70
2,55
cv (%)
131,82
58,02
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
** Análise dos dados transformados para (x/100)1/2.
Apêndice A7 – Resumo da análise de variância e testes de significância para a
variável percentagem de incidência do tubo polínico em cada etapa
do percurso estigma-óvulo de ameixeira japonesa (Prunus salicina
Lindl.), após 120h das polinizações controladas, realizadas in vivo
na cv. América, mantidas em temperatura ambiente. Pelotas/ RS,
2010
Percentagem de incidência do tubo polínico em cada
Causas da variação
GL
etapa do percurso estigma-óvulo da cv. América
QM
QM**
Estatística F Estatística F**
Cruzamentos
6
0
0,01
0ns
0,10ns
Etapa
5
2.403,81
0,46
8,91*
8,71*
Cruzamentos x Etapa 30
883,81
0,21
3,27*
3.,97*
Resíduos
126
269,84
0,05
Média geral
16,67
0,28
cv (%)
98,56
83,17
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
** Análise dos dados transformados para log (x).
104
Apêndice A8 – Resumo da análise de variância e testes de significância para a
variável percentagem de incidência do tubo polínico em cada etapa
do percurso estigma-óvulo de ameixeira japonesa (Prunus salicina
Lindl.), após 120h das polinizações controladas, realizadas in vivo
na cv. Santa Rosa, mantidas em temperatura ambiente. Pelotas/
RS, 2010
Percentagem de incidência do tubo polínico em cada
Causas da variação
GL
etapa do percurso estigma-óvulo da cv. Santa Rosa
QM
QM**
Estatística F Estatística F**
Cruzamentos
1
0
0,01
0ns
0,19ns
Etapa
5
793,33
0,12
2,38*
2,00ns
Cruzamentos x Etapa
5
2.300,00
0,40
6,90*
6,76*
Resíduos
36
333,33
0,06
Média geral
16,67
0,26
cv (%)
109,55
93,22
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
** Análise dos dados transformados para log (x).
Apêndice A9 – Resumo da análise de variância e testes de significância para a
variável percentagem de incidência do tubo polínico em cada etapa
do percurso estigma-óvulo de ameixeira japonesa (Prunus salicina
Lindl.), após 120h das polinizações controladas, realizadas in vivo
na cv. Pluma 7, mantidas em temperatura ambiente. Pelotas/ RS,
2010
Percentagem de incidência do tubo polínico em cada
Causas da variação
GL
etapa do percurso estigma-óvulo da cv. Pluma 7
QM
QM**
Estatística F Estatística F**
Cruzamentos
1
0
0,07
0ns
1,20ns
Etapa
5
1.113,33
0,21
3,28*
3,59*
5
1.780,00
0,34
5,25*
5,95*
Cruzamentos x Etapa
Resíduos
36
338,89
0,06
Média geral
16,67
0,26
cv (%)
110,45
91,65
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
** Análise dos dados transformados para log (x).
105
Apêndice A10 – Resumo da análise de variância e testes de significância para a
variável percentagem de incidência do tubo polínico em cada
etapa do percurso estigma-óvulo de ameixeira japonesa (Prunus
salicina Lindl.), após 120h das polinizações controladas, realizadas
in vivo na cv. Amarelinha, mantidas em temperatura ambiente.
Pelotas/ RS, 2010
Percentagem de incidência do tubo polínico em cada
Causas da variação
GL
etapa do percurso estigma-óvulo da cv. Amarelinha
QM
QM**
Estatística F Estatística F**
Cruzamentos
3
0
0,856
0ns
1,06ns
Etapa
5
7.026,67
0,04
30,48*
24,23*
Cruzamentos x Etapa 15
2.453,33
0,30
10,64*
8,50
Resíduos
72
230,56
0,04
Média geral
16,67
0,22
cv (%)
91,10
86,33
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
** Análise dos dados transformados para log (x).
Apêndice A11 – Resumo da análise de variância e testes de significância para a
variável percentagem de incidência do tubo polínico em cada
etapa do percurso estigma-óvulo de ameixeira japonesa (Prunus
salicina Lindl.), após 120h das polinizações controladas, realizadas
in vivo na cv. Rosa Mineira, mantidas em temperatura ambiente.
Pelotas/ RS, 2010
Percentagem de incidência do tubo polínico em cada
Causas da variação GL etapa do percurso estigma-óvulo da cv. Rosa Mineira
QM
QM**
Estatística F Estatística F**
Cruzamentos
4
0
0,04
0ns
1,42ns
Etapa
5
7.845,33
0,91
44,13*
32,06*
2.092,00
0,31
11,77*
10,93*
Cruzamentos x Etapa 20
Resíduos
90 16.000,00
0,03
Média geral
16,67
0,23
cv (%)
80,00
71,85
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
** Análise dos dados transformados para log (x).
106
Apêndice A12 – Resumo da análise de variância e testes de significância para a
variável percentagem de incidência do tubo polínico em cada
etapa do percurso estigma-óvulo de ameixeira japonesa (Prunus
salicina Lindl.), após 120h das polinizações controladas, realizadas
in vivo na cv. Reubennel, mantidas em temperatura ambiente.
Pelotas/ RS, 2010
Percentagem de incidência do tubo polínico em cada
Causas da variação
GL
etapa do percurso estigma-óvulo da cv. Reubennel
QM
QM**
Estatística F Estatística F**
Cruzamentos
2
5,56
0,01
0,02ns
0,17ns
Etapa
5
3.378,89
0,61
13,93*
11,52*
Cruzamentos x Etapa 10
1.052,22
0,15
4,34*
2,89*
Resíduos
54
242,59
0,15
Média geral
16,94
0,26
cv (%)
91,92
88,68
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
** Análise dos dados transformados para log (x).
107
Apêndice B – Capítulo 2
Estabelecimento, multiplicação e alongamento in vitro de ameixeira japonesa,
cv. América
Experimento 1 – Estabelecimento in vitro de ameixeira japonesa cv. América
Apêndice B1 – Resumo da análise de variância e testes de significância para as
variáveis comprimento médio das brotações (cm), número de folhas
e de gemas formadas nos explantes de gemas apicais e basais de
ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, após 30 dias
do estabelecimento in vitro em meio MS. UFPel, Pelotas/ RS, 2010
Comprimento das
Causas da
Número de folhas
Número de gemas
brotações iniciais
GL
variação
(cm)
QM
QM
QM**
QM
QM**
Explante
1
2,61*
300,41*
7,21*
6,22*
0,66*
Resíduo
56
0,05
10,19
0,26
0,52
0,05
Média geral
1,03
10,93
3,33
2,15
1,61
cv (%)
22,61
29,21
15,29
33,61
14,48
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
** Análise dos dados transformados para (x+0,5)1/2.
108
Experimento 2 – Multiplicação in vitro de ameixeira japonesa cv. América
Apêndice B2 – Resumo da análise de variância e testes de significância para as
variáveis comprimento das brotações (cm) e número de brotos, e de
gemas e média da massa seca (mg) por brotação de ameixeira
japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo
in vitro em função do tipo de regulador de crescimento (BAP e 2iP)
e suas concentrações (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm-3).UFPel,
Pelotas/ RS, 2010
Comprimento
Massa seca
Número de
Número de
Causas da
das brotações
por brotação
GL
brotos
gemas
variação
(cm)
(mg)
QM
QM QM**
QM
QM**
QM
Citocinina
1
1,01*
50,32* 4,65* 201,04* 4,28*
463,20*
Concentrações 4
0,30*
5,94* 0,49* 21,15* 0,45*
93,87*
Citocinina x
4
0,30*
4,81* 0,38* 26,48* 0,58*
39,26ns
Conc.
Resíduo
70
0,03
0,36 0,03
2,21
0,05
22,39
Média geral
1,028
1,96 1,53
10,60
3,31
16,67
cv (%)
16,72
30,58 10,66 14,01
6,48
28,73
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
** Análise dos dados transformados para (x+0,5)1/2.
Apêndice B3 – Análise de regressão polinomial para a variável comprimento médio
das brotações (cm) e massa seca das brotações (mg) de ameixeira
japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo
in vitro em função do tipo de regulador de crescimento (BAP e 2iP)
e suas concentrações (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0mg dm-3). UFPel,
Pelotas/ RS, 2010.
Quadrados médios
Massa seca das
Causas da variação
GL Comprimento das brotações
(cm)
brotações (mg)
BAP
2iP
Concentrações
Regressão Linear
1
1,07*
0,003ns
308,55*
Regressão Quadrática 1
0,71*
0,01ns
62,64ns
ns
Desvio de Regressão
1
0,19*
0,006
2,72ns
Resíduo
70
2,07
2,07
1567,65
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
109
Apêndice B4 – Análise de regressão polinomial para as variáveis número de brotos e
de gemas por brotação de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.),
cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro em função do tipo de
regulador de crescimento (BAP e 2iP) e suas concentrações (0; 0,25;
0,5; 0,75; 1,0mg dm-3). UFPel, Pelotas/ RS, 2010.
Número de brotos
Número de gemas
Causas da variação GL
QM
QM**
QM
QM**
BAP 2iP BAP 2iP BAP 2iP BAP
2iP
ns
ns
ns
Regressão Linear
1 41,75* 0,12 3,32* 0,02 49,45* 0,21 1,17* 0,01ns
Regressão Quadrática 1 0,38ns 0,02ns 0,07ns 0,003ns91,12* 0,72ns 1,92* 0,02ns
Desvio de Regressão 1 0,03ns 0,13ns 0,01ns 0,02ns 19,18* 0,09ns 0,39* 0,003ns
Resíduo
70
0,36
0,03
2,21
0,05
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
Apêndice B5 – Resumo da análise de variância e testes de significância para as
variáveis comprimento médio das brotações (cm), número médio de
gemas e de brotos formados por explante e massa seca das
brotações (mg) ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv.
América, após 40 dias de cultivo in vitro em função dos diferentes
meios de cultura (MS, MS com ⅓ do N e WPM). UFPel, Pelotas/
RS, 2010
Quadrados Médios
Causas da
Comprimento
Massa seca
GL
Número de
Número de
variação
das brotações
por brotação
brotos
gemas
(cm)
(mg)
Meios
2
0,14ns
13,17*
8,95ns
314,00*
Resíduo
33
0,05
0,57
14,34
48,99
Média geral
1,53
2,91
10,65
19,98
cv (%)
14,68
25,96
35,55
35,03
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
110
Experimento 3 – Alongamento in vitro de brotações de ameixeira japonesa cv.
América
Apêndice B6 – Resumo da análise de variância e testes de significância para as
variáveis comprimento das brotações (cm) e número de brotos, e de
gemas e média da massa seca por brotação de ameixeira japonesa
(Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro
com diferentes concentrações de AG3 (0; 0,25; 0,50; 0,75; 1,0mg
dm-3), acrescido de 2,0mg dm-3 de carvão vegetal ativado. UFPel,
Pelotas/ RS, 2010
Massa seca
Comprimento
Número de
Número de
por
Causas da
das brotações
GL
brotos
gemas
brotação
variação
(cm)
(mg)
QM
QM
QM**
QM
QM**
QM
AG3
4
0,36*
0,03ns 0,01ns 0,67ns 0,02ns
49,04ns
Resíduo
20
0,07
0,03
0,01
1,35
0,03
19,63
Média geral
1,39
1,12
1,27
9,98
3,23
20,09
cv (%)
19,08
16,37
5,64
11,65
5,52
22,05
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
** Análise dos dados transformados para (x+0,5)1/2.
Apêndice B7 – Análise de regressão polinomial para as variáveis comprimento das
brotações e número de brotos, e de gemas e média da massa seca
por brotação de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv.
América, aos 40 dias de cultivo in vitro com diferentes
concentrações de AG3 (0; 0,25; 0,50; 0,75; 1,0mg dm-3), acrescido
de 2,0mg dm-3 de carvão vegetal ativado. UFPel, Pelotas/ RS, 2010
Comprimento
Massa seca
Número de
Número de
Causas da
das brotações
por brotação
GL
brotos
gemas
variação
(cm)
(mg)
QM
QM
QM**
QM
QM**
QM
Regressão
1
1,27*
0,13ns 0,02ns 0,05ns 1.10-3ns
14,80ns
Linear
Regressão
1
0,11ns
1.10-3ns 3.10-4ns 1,19ns 0,03ns
166,81*
Quadrática
Desvio de
1
0,01ns
2.10-4ns 3.10-5ns 0,31ns 0,01ns
11,51ns
Regressão
Resíduo 20
0,07
0,03
0,001
1,35
0,03
19,63
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
111
Apêndice B8 – Resumo da análise de variância e testes de significância para as
variáveis comprimento das brotações (cm) e número de brotos, e de
gemas e média da massa seca por brotação de ameixeira japonesa
(Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 40 dias de cultivo in vitro
com diferentes concentrações de AG3 (0, 1, 5 e 10mg dm-3),
acrescido de 2,0mg dm-3 de carvão vegetal ativado. UFPel, Pelotas/
RS, 2010
Comprimento
Massa seca
Número de
Número de
Causas da
das brotações
por brotação
GL
brotos
gemas
variação
(cm)
(mg)
QM
QM
QM**
QM
QM**
QM
Carvão
1
0,33ns
0,13ns 0,09ns 19,51ns 0,44ns
54,80ns
AG3
3
1,96*
0,20ns 0,06ns 3,83ns 0,11ns
52,51ns
AG3 x
3
0,64*
0,10ns 0,01ns 2,39ns 0,07ns
11,49ns
Carvão
Resíduo
8
0,06
0,14
0,04
7,22
0,16
98,79
Média geral 1,93
1,34
1,29
10,01 3,22
16,53
Cv (%)
12,87
27,66 14,65 26,85 12,51
60,12
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
** Análise dos dados transformados para (x+0,5)1/2.
Apêndice B9 – Análise de regressão polinomial para a variável comprimento médio
das brotações (cm) de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv.
América, aos 40 dias de cultivo in vitro com diferentes concentrações
de AG3 (0, 1, 5 e 10mg dm-3), acrescido de 2,0mg dm-3 de carvão
vegetal ativado. UFPel, Pelotas/ RS, 2010
Quadrados médios
Causas da variação
GL
Comprimento das brotações (cm)
Com carvão
Sem carvão
Regressão Linear
1
5,07*
1,03*
Regressão Quadrática
1
0,41*
1,62*
Desvio de Regressão
1
0,62*
0,06ns
Resíduo
8
0,06
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
112
Apêndice C – Capítulo 3
Enraizamento in vitro e aclimatização de brotações de ameixeira japonesa cv.
América
Apêndice C1 – Resumo da análise de variância e testes de significância para as
variáveis número de brotações enraizadas e de raízes por brotação,
e percentagem de enraizamento das brotações de ameixeira
japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 20 dias de cultivo
in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIA
(0; 0,5 e 1,0mg dm-3). UFPel, Pelotas/ RS, 2010
Número raízes por brotação
Causas da
% de enraizamento
GL
variação
QM
QM**
QM
QM***
ns
ns
AIA
2
1,96
0,20
2.064,64*
0,12ns
Resíduo
21
0,82
0,09
586,70
0,04
Média geral
2,37
1,67
70,35
0,81
cv (%)
38,11
17,92
34,43
24,87
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
** Análise dos dados transformados para (x+0,5)1/2.
*** Análise dos dados transformados para (x/100)1/2.
Apêndice C2 – Resumo da análise de variância e testes de significância para as
variáveis percentagem de formação de raízes secundárias, de
primórdios radiculares e de calos das brotações de ameixeira
japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 20 dias de cultivo
in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes concentrações de AIA
(0; 0,5 e 1,0mg dm-3). UFPel, Pelotas/ RS, 2010
% de raízes
% de primórdios
Causas da
% de calos
GL
secundárias
radiculares
variação
QM
QM***
QM
QM***
QM
QM***
AIA
2
539,30ns
0,06ns
425,37ns 0,10ns
116,67ns
0,06ns
Resíduo
21
679,35
0,09
377,80
0,09
83,33
0,04
Média geral
36,01
0,51
14,58
0,24
5,83
0,13
cv (%)
72,37
59,89
133,29
122,94
156,49
156,49
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
*** Análise dos dados transformados para (x/100)1/2.
113
Apêndice C3 – Resumo da análise de variância e testes de significância para as
variáveis percentagem sobrevivência após 120 dias de
aclimatização volume (cm3) e massa seca das raízes (g) das
plantas de ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América,
micropropagadas e enraizadas in vitro em meio MS/2 acrescido de
diferentes concentrações de AIA (0; 0,5 e 1,0mg dm-3), após 120
dias de aclimatização. UFPel, Pelotas/ RS, 2010
Volume das
Massa seca
Causas da
Sobrevivência (%)
3
GL
raízes (cm )
das raízes (g)
variação
QM
QM***
QM
QM
ns
AIA
2
1.616,67*
0,13*
0,81
0,01ns
Resíduo
21
454,76
0,04
0,40
0,01
Média geral
55,83
0,72
1,99
0,19
Cv (%)
38,19
26,11
31,89
0,08
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
*** Análise dos dados transformados para (x/100)1/2.
Apêndice C4 – Resumo da análise de variância e testes de significância para as
variáveis número de raízes por brotação, percentagem de
enraizamento e comprimento das raízes (cm) de brotações de
ameixeira japonesa (Prunus salicina Lindl.), cv. América, aos 20 dias
de cultivo in vitro no meio MS/2 acrescido de diferentes
concentrações de AIB e AIA (0; 0,25; 0,50; 0,75 e 1,0mg dm-3).
UFPel, Pelotas/ RS, 2010
Comprimento
Número de raízes
Enraizamento (%)
das raízes
Causas da variação GL
por brotação
(cm)
QM
QM**
QM
QM***
QM
Auxina
1
4,41*
1,01* 8.855,68* 1,57*
133,34*
Concentração
4
0,21ns
0,03ns 505,38ns 0,06ns
9,955*
ns
ns
ns
ns
Auxina x Conc.
4
0,57
0,12
1.110,79
0,17
13,59*
Resíduo
40
0,28
0,05
566,08
0,07
2,44
Média geral
0,58
1,00
28,64
0,42
2,49
cv (%)
92,02
23,21
83,07
64,21
62,80
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
** Análise dos dados transformados para (x+0,5)1/2.
*** Análise dos dados transformados para (x/100)1/2.
114
Apêndice C5 – Análise de regressão polinomial para a variável comprimento das
raízes (cm) de brotações de ameixeira japonesa (Prunus salicina
Lindl.), cv. América, aos 20 dias de cultivo in vitro no meio MS/2
acrescido de diferentes concentrações de AIB e AIA (0; 0,25; 0,50;
0,75 e 1,0mg dm-3). UFPel, Pelotas/ RS, 2010.
Quadrados médios
Causas da variação
GL
AIB
AIA
Regressão Linear
1
75,66*
2,32ns
Regressão Quadrática
1
5,97ns
3,13ns
Desvio de Regressão
1
1,00ns
0,78ns
Resíduo
40
2,443
* Significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
ns
Não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.
115
Anexos
116
Anexo A
Anexo A – Percentagem de germinação in vitro dos grãos de pólen de cultivares de
ameixeira japonesa (P. salicina Lindl.), utilizados nos experimentos de
polinização controlada realizada in vivo e no campo experimental da
Embrapa Clima Temperada (CPACT) no ano de 2008. Pelotas/RS, 2010
Cultivar ♂
América
Amarelinha
Pluma 7
Reubennel
Rosa Mineira
Santa Rosa
The First
Viabilidade do grão de pólen (%)
17
39
19
39
41
20
18
117
Anexo B
Anexo B –
Descrição de algumas características das cultivares utilizadas no
presente trabalho:
América: Originada do cruzamento entre P. munsoniana e P. salicina, foi obtida
no final do século passado por Luther Burbank, através de uma semente do
cruzamento entre as cvs. Robinson x Abundance. A fruta é de tamanho médio
(4,5cm de diâmetro), esférico-oblonga, achatada na base e no ápice, com cavidade
peduncular pouco profunda. A película é facilmente removível, amarga, fina e forte,
com cor vermelho intenso sobre fundo amarelo. Enquanto que a polpa é amarela,
muito densa, sucosa, doce-acidulada e aromática. Caroço com 2cm de comprimento
e 1,5cm de largura, com faces rugosas (NAKASU et al., 2003).
Árvore de crescimento muito vigoroso, brotos glabros e avermelhados.
Folhas ovaladas, com bordos crenados, com 8,5cm de comprimento e 4cm de
largura, com pecíolos de 1,5cm de comprimento. Com duas a três flores por gema,
com pecíolo muito fino e pétalas brancas. Apresenta grande flutuação na
produtividade, sendo exigente em polinização cruzada para que ocorra frutificação
(NAKASU et al., 2003).
Reubennel: Altamente produtiva com frutos de tamanho médio a grande,
com formato redondo cônico. A epiderme é amarelo-esverdeada com 10 a 20% de
vermelho. Apresentando polpa amarela, firme, doce levemente ácida e bom sabor.
Amadurece em fins de janeiro. A planta é vigorosa, semiaberta e suscetível à
bacteriose (NAKASU et al., 2003).
Amarelinha: Produz frutos de tamanho médio a grande, arredondados e
levemente simétricos. A película é de cor predominante amarela, com manchas
vermelhas, e polpa amarela. É de boa qualidade, doce, amadurece na segunda
semana de janeiro. A planta é semivigorosa, de hábito semiaberto e sucetível à
bacteriose (NAKASU et al., 2003).
Rosa Mineira: Fruto de tamanho pequeno a médio, formato globosocordiforme; satura pouco nítida, dividindo o fruto em duas partes iguais; cavidade
peduncular rasa e pedúnculo curto. Epiderme de coloração vermelho-rósea, com
pontuações amareladas; pruína escassa; aspecto bem atraente. A polpa é tenra e
118
sucosa, de cor avermelhada, brilhante quando madura, com algumas fibras
esbranquiçadas. Sabor doce-acidulado equilibrado, aromático; acidez presente junto
à película e à semente, que é bem pequena e aderente à polpa. Foi desenvolvida
pelo IAC, originária de semente de polinização aberta do cv. Kelsey Paulista. Planta
bem vigorosa, com abundância de folhas e com alta produtividade (OJIMA et al.,
1983).
Pluma 7: Bastante produtiva, com frutos de tamnho médio a grande,
redondos com sutura e ponta levemente depressivas, com epiderme 100%
vermelha. A polpa é firme, 100% vermelho-escuro, agridoce a doce quando madura
e de bom sabor. A planta é vigorosa e altamente suscetível à bacteriose. Amadurece
em princípio de janeiro (NAKASU et al., 2003).
Santa Rosa: Obtida em 1907 por Luther Burbank, na localidade de Santa
Rosa, na Califórnia. Produz frutos de tamanho médio, redondos, ligeiramente
oblatos, com epiderme pruinosa, 100% vermelha. A polpa é firme, amarela,
aromática e de muito bom sabor. A planta é de vigor médio, hábito ereto, suscetível
à bacteriose. A maturação ocorre no final de dezembro (NAKASU et al., 2003).
119
Anexo C
Anexo C – Distribuição das temperaturas mínimas, médias e máximas mensais no
período de abril de 2007 a março de 2008 (A). Representação mensal da
pluviosidade (mm) e umidade relativa (UR) no período de abril de 2007 a
março de 2008. (FONTE: Estação Agroclimatológica de Pelotas)
a
b
120
Anexo D
Anexo D – Caracterização molecular dos alelos-S de cultivares de ameixeira
japonesa (P. salicina Lindl.). Extraído de Mota (2008)