UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
MESTRADO EM BIOQUÍMICA
ROBERTA LUCIANA DO NASCIMENTO GODONE
ISOLAMENTO DE UMA QUITINASE EXTRAÍDA DO
CEFALOTÓRAX DO CAMARÃO MARINHO Litopenaeus schmitti
(BURKENROAD, 1936): AVALIAÇÃO DE SUAS ATIVIDADES
ANTIMICROBIANA E LARVICIDA
NATAL/RN
2011
ROBERTA LUCIANA DO NASCIMENTO GODONE
ISOLAMENTO DE UMA QUITINASE EXTRAÍDA DO
CEFALOTÓRAX DO CAMARÃO MARINHO Litopenaeus schmitti
(BURKENROAD, 1936): AVALIAÇÃO DE SUAS ATIVIDADES
ANTIMICROBIANA E LARVICIDA
Dissertação
Departamento
apresentada
de
Bioquímica
ao
da
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte como requisito parcial à obtenção
do título de Mestre em Bioquímica.
Orientadora: Profa. Dra. Adriana Ferreira Uchôa
Co-orientadora: Profa. Dra. Luciana Duarte Martins da Matta
Natal/RN
2011
Catalogação da Publicação na Fonte
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Biblioteca Central Zila Mamede
Godone, Roberta Luciana do Nascimento.
Isolamento de uma quitinase extraída do cefalotórax do camarão marinho
Litopenaeus Schmitti (BURKENROAD, 1936) : avaliação de suas atividades
antimicrobiana e larvicida / Roberta Luciana do Nascimento Godone. – Natal, 2011.
100 f. : il.
Orientadora: Adriana Ferreira Uchôa.
Co-orientadora: Luciana Duarte Martins da Matta.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro
de Biociências. Departamento de Bioquímica. Mestrado em Bioquímica.
1. Biotecnologia – Caracterização e aplicação – Dissertação. 2. Invertebrado –
Dissertação. 3. Enzimas – Dissertação. 4. Glicosidases – Dissertação. I. Uchôa,
Adriana Ferreira. II. Matta, Luciana Duarte Martins. III. Universidade Federal do Rio
Grande do Norte. IV. Título.
RN/UF/BCZM
CDU 577.15(043.3)
Dedico esta obra
A Deus,
Deus fonte de aguá viva, meu pai fiel, estais comigo e eu
contigo a todo o momento, seja ao meu lado ou me carregando
nos braços, obrigada por todas as graças derramadas em minha
vida. Amém!
À minha mãe Aneide e o meu irmão Matheus,
Matheus por toda paciência,
carinho e compreensão, durante toda a minha vida, agradeço a
Deus todos os dias desde o momento que acordo ate ir dormir, sei
que sou uma pessoa abençoada, pois tenho vocês.
À minha Orientadora, Profa. Dra. Luciana Duarte Martins da
Matta,
Matta pela grande oportunidade de ingressar na ciência, pela
amizade, atenção, carinho, compreensão e ensinamentos. Para
mim é uma honra inesplicavél, fazer parte do seu tão
maravilhoso grupo de pesquisa, e sinto-me mais honrada ainda
em poder dizer que fui preparada pela senhora. Quando vejo este
trabalho concluído, me emociono, pois trabalhamos juntas e
finalmente conseguimos o que tanto sonhavamos. Obrigada
sempre...
Ao Prof. Dr. Maurício Pereira de Sales (in memoriam), pela
oportunidade que me ofereceu, me aceitando como aluna de
mestrado e me fazendo participar de seu grupo de pesquisa. Por
depositar em mim, uma grande confiança, por acreditar no meu
potencial, e ainda me fazer mais forte e determinada. Sou muito
grata porisso e levarei comigo grandes lições de vida que aprendi
convivendo ao seu lado. Muito obrigada e sinto saudades.
AGRADECIMENTOS
A Deus meu pai e amigo sinto-me tão feliz, pois sei que nunca me
abandonaste e nunca me abandonará.Te amo Deus.
À minha mãezinha e meu irmãozinho por sempre acreditarem em mim,
até quando eu não acreditava. Obrigada!
Á minha Orientadora Profa. Dra. Luciana da Matta (Profa),
(Profa) pela
confiança e apoio, em minha caminhada científica. A senhora é
simplesmente Demais!!!!
Aos meus grandes amigos e cúmplices: Caroline Gabriela (Gabi
(Gabi)
Gabi),
Nerivaldo (Nerí
(Nerí)
Nerí), Stélio (Stelhinho
(Stelhinho)
Stelhinho) e Simony (Júlia) que a todo tempo
sempre estão de prontidão a me ouvir e ajudar, vocês são exemplo de
caráter e otimismo. Simplesmente adoro vocês.
Ao Prof. Dr. Luiz Roberto pela ajuda, disponibilidade e contribuições
valiosas em minha banca de qualificação, obrigada por ter participado
desta etapa tão importante de minha vida.
Ao Prof. Dr. Maurício Pereira de Sales (in memorian) por ter me
aceitado como aluna de mestrado e ter acreditado no meu potencial.
Obrigada!
À Profa. Dra. Adriana Uchôa por ter me aceitado como orientanda. Serei
sempre grata porisso.
À Profa. Dra. Ana Heloneida por ter aceitado participar de minha banca
de qualificação, muitíssimo obrigada.
À Profa. Dra. Vânia Andrade , por ter aberto as portas de seu laboratório,
pela orientação nos ensaios microbiológicos, por ter colocando uma de
suas melhores alunas para me ajudar e por ter aceitado em participar
de minha banca de qualificação, fazendo apontamentos valiosíssimos.
Muito Obrigada.
Aos Professores Doutores José Luiz Lima Filho e João Paulo Matos,
Matos por
terem aceitado participar de minha banca de defesa. Muito Obrigada.
As meninas do LAMEA: Gabriela (Gabi), Raísa e Luiza.
Luiza Obrigada
meninas!!!
O anjinho de candura, Gabriela (Gabi), a qual sem ela eu não teria
conseguido realizar nem entender os experimentos na Microbiologia.
Obrigada pela paciência e percistência. Gabi você é mil...
À Profa. Dra. Fátima Ximenes,
Ximenes por ter disponibiizado o seu laboratório
para a realização dos ensaios com os Aedes aegypti.
À Veterinária Patrícia Barra (Pati),
(Pati) pela amizade incondicional, pelos
momentos de descontração e passeios tão divertidos. Sem sua ajuda e
ídeias tão pespícazes, eu não teria feito muita coisa. Sei que além de
uma colega de trabalho, ganhei uma amiga para vida toda, você foi
imprecindível na realização deste trabalho.
A Rafaella (Rafinha),
(Rafinha) pela amizade, palavras de força e dedicação, sei
que sempre poderei contar contigo. E como eu ando dizendo pra você
“Tô aqui viu”...
A Joyce,
Joyce pela amizade tão sincera e carinho para comigo, adorei ter te
conhecido e ser sua amiga, conta sempre comigo!
A Henrique,
Henrique pela amizade tão querida, pela companhia no Lab e pelas
conversas tão divertidas e peculiares, que por muitas vezes me fizeram
rir horrores... Te amo Lindão!!
Aos
meus
queridos
amigos
e
companheiros
da
tão
maravilhosa
convivência no nosso “céuzinho” chamado LQFP: Bruna (Brunete),
(Brunete),
Henrique (Amore),
(Amore), Juliana (Jú),
(Jú), Paula, Leonardo (Léo),
(Léo), Daniela
(Dani) e Sílvia
Sílvia,
lvia obrigada pelo apoio e ajuda nos experimentos, saibam
que estarão sempre em meu coração.
À minha “IC/especial preferida” Bruna (Bruninha/Brunete),
(Bruninha/Brunete) pela ajuda
incondicional nos experimentos, força, amizade e companheirismo,
sempre me colocando pra cima. Sem sua ajuda não sei o que seria de
mim. Adoro você minha florzinha.
A Ticiana (Tici) e a Carol (De boa na lagoa) pela convivência,
paciência e carinho que sempre tiveram comigo, me lembrarei de vocês
com carinho imenso, Obrigada.
A Sheyla Varela e a Dayse Caroline,
Caroline pela acolhida em minha mudança
de laboratório, no início do mestrado e pela convivência tão especial,
vocês duas foram muito importantes nesta etapa de minha vida.
Meninas, muito obrigada!
Ao pessoal tão querido do BIOPOL Prof
Prof.
of. Dr. Hugo Oliveira,
Oliveira, Sara,
Mariana, Leandro, Popó,
Popó, Rafael, Nedinaldo,
Nedinaldo, Arthur e Jailma.
Jailma
A Jailminha
Jailminha minha amiguinha do peito, muito obrigada pelo apoio,
amizade e carinho, nunca esquecerei o que você fez e até hoje faz por
mim, pode ter certeza você nunca sairá de meu coração. Convivendo
com pessoas como você, só me faz ter mais certeza que ainda existem “os
puros de coração”. Os meus mais sinceros agradecimentos.
Aos
professores
do
Departamento
de
Bioquímica
que
direta
ou
indiretamente contribuirão na minha formação.
Aos amigos de departamento que colaborarão com a realização de
experimentos: Patrícia, Norberto, Nathália, Raf
RafaelL
aelLa, Joyce, Rafael e
Ana Paula (minha 1º IC/querida).
Ao querido amigo Paulo Ricardo (Paulindo),
(Paulindo) pela amizade e ajuda na
utilização dos programas estatísticos. Se não fosse você, nem sei.
Brigadinha....
Aos companheiros da turma de Mestrado 2009: Clarissa, Alisson,
Renata, Ana Keyla, Larissa, Leandro Karlan, Dayse, Dayse Caroline,
Dayse Santos, Nathália, Janisson, Angélica, Jana, Rafael, Leonardo
Nobre,
Nobre, Marcos Felipe,
Felipe, Ruth, Luciana, Leonardo Rêgo e Diego
Diego.
go
Aos funcionários do Departamento de Bioquímica: Seu Marcos, Creuza,
Seu Itamar,
Itamar, Jonas, Ângela, Eliene, Ricardo, Seu Rogério e Dona
Margarita.
Margarita
Aos amigos queridos do DBQ, Virgínia, Raquel, Érika, Ricardo, Marília,
Tuane, Luiza, Celina,
Celina, Carol, Gabriel, Raniere, Cínthia, Richelle,
Alexandre, Jéssica,Thiago,
Jéssica,Thiago, Rafael Russi, Hugo e Vanessa.
Vanessa
A todos que contribuíram de alguma forma para realização deste
trabalho.
A UFRN e agências financiadoras CAPES e CNPq.
“... Não desanime de você, ainda que a colheita de hoje não seja
muito feliz. Não coloque um ponto final nas suas esperanças.
Ainda há muito o que fazer, ainda há muito o que plantar, e o
que amar nessa vida. Ao invés de ficar parado no que você fez de
errado, olhe para frente, e veja o que ainda pode ser feito...
A vida ainda não terminou. E já dizia o poeta "que os sonhos não
envelhecem...por isso devemos sonhar sempre, sonhar grande,
sonhar lindo, sonhar rindo..."
Padre Fábio de Melo
RESUMO
As quitinases são enzimas envolvidas na degradação da quitina e estão presentes
em uma gama de organismos, inclusive os que não contêm quitina, tais como
bactérias, vírus, plantas e animais desempenhando importantes papeis fisiológicos e
ecológicos. A quitina é hidrolisada por um sistema quitinolítico classificado como:
Endo-quitinases, Exo-quitinases e N-acetil-β-D-glucosaminidases. Neste trabalho, a
Litochitinase1 foi extraída do cefalotórax do camarão marinho Litopenaeus schmitti e
purificada 987,32 vezes utilizando-se cromatografia de troca iônica DEAE-Biogel e
de exclusão molecular Sephacryl S-200. Esta apresentou massa molecular em torno
de 28,5 kDa. Os resultados obtidos, após os testes cinéticos com a Litochitinase1
utilizando-se como substrato o p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminideo, mostraram
Km aparente de 0,51 mM, atividade ótima em pH variando de 5,0 a 6,0, temperatura
ótima a 55°C e estabilidade de atividade quando pré-incubada nas temperaturas de
25, 37, 45, 50 e 55°C. A enzima apresentou uma faixa de estabilidade nos pHs de
4,0 a 5,5. O HgCl2, inibiu significativamente a Litochitinase1 enquanto que o MgCl2
potencializa levemente sua atividade. Os testes antimicrobianos realizados
mostraram que a Litochitinase1 apresenta atividade contra a bactéria gram-negativa
Escherichia coli numa concentração que varia 800 a 500 µg/mL. A atividade larvicida
contra Aedes aegypti foi investigada com os extratos brutos, F-III (50-80%) e na
Litochitinase1 com tempo de 24 e 48 horas. Os resultados obtidos mostraram
atividade larvicida em todas estas amostras com valores de EC50 de 6,59 mg/mL
para o extrato bruto, 5,36 mg/mL para F-III e 0,71 mg/mL para Litochitinase1 com 24
horas de ensaio e 3,22 e 0,49 mg/mL, para F-III e Litochitinase1 no tempo de 48
horas. Outros experimentos realizados confirmaram a presença de quitina no
intestino médio das larvas de Aedes aegypti, as quais podem estar sofrendo a ação
da Litochitinase1 provocando suas mortes, como ainda a ausência de proteínas
bioativas como inibidores de proteases serínicas e lectinas no extrato bruto, F-III e
Litochitinase1, indicando que a morte das larvas é mesmo por ação da
Litochitinase1. Observou-se ainda que, as enzimas extraídas do homogenato
intestinal das larvas não interferiram na atividade da Litochitinase1. Estes resultados
indicam que esta enzima pode ser usada como alternativa para controlar infecções
causadas por Escherichia coli, como também na redução da infestação do mosquito
vetor da dengue.
Palavras Chaves: Glicosidases, Invertebrados, Purificação, Caracterização e
Aplicação Biotecnológica.
ABSTRACT
Chitinases are enzymes involved in degradation of chitin and are present in a range
of organisms, including those that do not contain chitin, such as bacteria, viruses,
plants and animals, and play important physiological and ecological roles. Chitin is
hydrolyzed by a chitinolytic system classified as: endo-chitinases, exo-chitinases and
N-acetyl-β-D-glucosaminidases. In this study a Litochitinase1 extracted from the
cephalotorax of the shrimp Litopenaeus Schmitt was purified 987.32 times using ionexchange chromatography DEAE-Biogel and molecular exclusion Sephacryl S-200.
These enzyme presented a molecular mass of about 28.5 kDa. The results, after
kinetic assay with the Litochitinase1 using as substrate p-nitrophenyl-N-acetyl-β-Dglucosaminideo, showed apparent Km of 0.51 mM, optimal activity at pH ranging from
5.0 to 6.0, optimum temperature at 55°C and stability when pre-incubated at
temperatures of 25, 37, 45, 50 and 55°C. The enzyme showed a range of stability at
pH 4.0 to 5.5. HgCl2 inhibited Litochitinase1 while MgCl2 enhances its activity.
Antimicrobial tests showed that Litochitinase1 present activity against gram-negative
bacterium Escherichia coli in the 800 µg/mL concentration. The larvicidal activity
against Aedes aegypti was investigated using crude extracts, F-III (50-80%) and
Litochitinase1 at 24 and 48 hours. The results showed larvicidal activity in all these
samples with EC50 values of 6.59 mg/mL for crude extract, 5.36 mg/mL for F-III and
0.71 mg/mL for Litochitinase1 at 24 hours and 3.22 and 0.49 mg/mL for the F-III and
Litochitinase1 at 48 hours, respectively. Other experiments confirmed the presence
of chitin in the midgut of Aedes aegypti larvae, which may be suffering the action of
Litochitinase1 killing the larvae, but also the absence of contaminating proteins as
serine proteinase inhibitors and lectins in the crude extract, F-III and Litochitinase1,
indicating that the death of the larvae is by action of the Litochitinase1. We also
observed that the enzymes extracted from intestinal homogenate of the larvae no
have activity on Litochitinase1. These results indicate that the enzyme can be used
as an alternative to control of infections caused by Escherichia coli and reducing the
infestation of the mosquito vector of dengue.
Keywords: Glucosidases,
Biotechnology application.
Invertebrate,
Purification,
Characterization
and
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 01
FIGUTA 02
FIGURA 03
FIGURA 04
Estrutura Química da quitina.
(Modificado de SEIDL,
2008).............................................................................................
Representação esquemática das estruturas polimórficas de
quitina, sendo que as setas representam as cadeias
poliméricas no sentido do terminal não redutor para o redutor.
(CAMPANA-FILHO,
2006)............................................................................................
Esquema dos padrões de clivagem de enzimas quitinolíticas.
As subunidades da cadeia da quitina são mostradas em azul
claro e o açúcar redutor em azul escuro. As tesouras
representam as ações enzimáticas. (Modificado de SEIDL,
2008)............................................................................................
Mapa da distribuição geográfica do camarão branco
Litopenaeus schmitti. (MARTINELI, 2005)....................................
21
22
23
29
FIGURA 05
Litopenaeus schmitti.....................................................................
FIGURA 06
Fluxograma do fracionamento com sulfato de amônio.................. 37
FIGURA 07
Atividades enzimáticas presentes no extrato bruto e nas frações
obtidas da precipitação com sulfato de amônio............................
FIGURA 08
FIGURA 09
FIGURA 10
Perfil de eluição protéico da F-III em cromatografia de troca
iônica e de atividade quitinásica ...................................................
Perfil de eluição da Litochitinase1 e atividade quitinásica em
cromatografia de exclusão molecular (Sephacryl S-200).............
SDS-PAGE das amostras protéicas durante o processo de
purificação.....................................................................................
FIGURA 11
Determinação do Km da Litochitinase1..........................................
FIGURA 12
Efeito
da
temperatura
sobre
a
atividade
32
51
52
53
55
56
da
Litochitinase1................................................................................. 57
FIGURA 13
Efeito da pré-incubação a diferentes temperaturas na atividade
da Litochitinase1............................................................................
58
FIGURA 14
Efeito do pH sobre a atividade da Litochitinase1..........................
FIGURA 15
Efeito da pré-incubação a diferentes pHs na atividade da
Litochitinase1.................................................................................
60
..
59
FIGURA 16
Curva de temperatura ótima para a detecção da atividade das
enzimas proteolíticas presentes no homogenato intestinal de
67
larvas de A.aegypti........................................................................
FIGURA 17
Efeito da pré-incubação com as enzimas digestivas de A.aegypti
na atividade da Litochitinase1.......................................................
68
LISTAS DE QUADROS
QUADRO 1
Técnica de Difusão em Disco, cepas selecionadas e
concentrações da quitinase utilizada.......................................... 43
QUADRO 2
Técnica de Microdiluição em Caldo, cepas selecionadas e
concentrações da quitinase ulitizada.......................................... 44
LISTA DE TABELAS
TABELA 1
Família das glicosil-hidrolases que possuem atividade Nacetil-β-D-glucosaminidásica.............................................. 20
TABELA 2
Algumas quitinases já isoladas e caracterizadas...............
28
TABELA 3
Etapas de purificação da Litochitinase1.............................
54
TABELA 4
Efeitos de íons e compostos sobre a
atividade da Litochitinase1..............................
TABELA 5
61
Avaliação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) da
Litochitinase1 do cefalotórax do camarão marinho
Litopenaeus schimitti..........................................................
TABELA 6
Detecção de quitina em intestinos médios de Aedes
aegypti................................................................................
TABELA 7
62
Concentração
efetiva
do
extrato
bruto,
F-III
63
e
Litochitinase1 necessária para matar 50% (EC50) das
larvas L4 de Aedes aegypti em 24 e 48 h.......................... 64
TABELA 8
Inibição de proteases serínicas.......................................... 65
TABELA 9
Atividade Hemaglutinante no extrato bruto, F-III e
Litochitinase1
com
eritrócitos
nativos
e
tratados
enzimaticamente................................................................ 66
LISTA DE ABREVIATURAS
α
Denota anomericidade alfa
ATCC
American Type Culture Collection
β
Denota anomericidade beta
BHI
Brain Heart Infusion
°C
Grau Celsius
cm
Centímetros
CTT
Cloreto de 2,3,5 – trifenil - tetrazólio
DO
Densiometria óptica
EB
Extrato Bruto
EDTA
Acido etilenodiamino tetra-acético
F-I
Extrato protéico precipitado com 0-30% de sulfato de amônio
F-II
Extrato protéico precipitado com 30-50% de sulfato de amônio
F-III
Extrato protéico precipitado com 50-80% de sulfato de amônio
xg
Gravidade
g
Grama
GlcNAc
N-acetil-β-D-glucosamina
HCl
Ácido Clorídrico
IUMBM
International Union of Biochemistry and Molecular Biology
HI
Homogenato intestinal
kDa
Kilodaltons
Km
Constante de Michaelis-Menten
EC50
Concentração Efetiva
M
Molar
mM
Milimolar
min.
Minuto
mg
Miligramas
µg
Microgramas
mL
Mililitro
µl
Microlitro
NaCl
Cloreto de Sódio
NaOH
Hidroxido de Sódio
nm
Nanômetro
pH
Potencial hidrogeniônico
PNF
p-NITROFENIL
SDS
Dodecil sulfato de sódio
t
Tonelada
TCA
Ácido tricloro acético
Tris
Tris hidroximetil aminometano
TEMED
Tetra metileno diaminoetano
[S]
Concentração Molar de Substrato
UH
Unidade de Hemaglutinação
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO................................................................................................ 18
1.1. GLICOSIDASES.......................................................................................... 18
1.1.1. 1.1.1.Glicosil-Hidrolases................................................................................... 19
1.1.2. 1.1.2.Quitinases.................................................................................................
21
1.1.2.1. Ocorrência e Função das Quitinases.................................................
23
1.1.2.2. Aplicações Biotecnologicas................................................................ 26
1.2. Litopenaeus schmitti (BURKENROAD, 1936) COMO FONTE DE
QUITINASES.............................................................................................. 28
2. OBJETIVOS...................................................................................................
2.1. GERAIS.......................................................................................................
2.2. ESPECÍFICOS..........................................................................................
3. MATERIAIS...................................................................................................
31
31
31
32
3.1. MATERIAL BIOLÓGICO............................................................................... 32
3.1.1.
3.1.2.
3.1.3.
4.
3.1.1. Camarão Litopenaeus schmitti.............................................................
3.1.2. Insetos.....................................................................................................
3.1.3. Eritrócitos Humanos...............................................................................
3.1.4. Microorganismos.....................................................................................
3.2. SUBSTRATOS SINTÉTICOS DERIVADOS DE AÇUCAR.......................
3.3. REAGENTES,
SOLUÇÕES,
MEMBRANAS
E
MATRIZES
CROMATOGRÁFICAS.............................................................................
3.4. APARELHOS............................................................................................
4. MÉTODOS......................................................................................................
32
32
33
33
33
33
34
36
4.1. OBTENÇÃO DO EXTRATO BRUTO........................................................... 36
4.2. FRACIONAMENTO COM SULFATO DE AMÔNIO...................................... 36
4.3. DETERMINAÇÃO DAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS COM pNITROFENIL DERIVADOS DE AÇÚCAR.................................................... 37
4.4. DOSAGEM DE PROTEÍNAS.......................................................................
4.5. PURIFICAÇÃO DA ENZIMA........................................................................
4.5.1. Cromatografia de Troca Iônica DEAE-Biogel......................................
4.5.2. Cromatografia de Exclusão Molecular – Sephacryl S – 200..............
38
38
38
38
4.6. ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA EM CONDIÇÕES
DESNATURANTES-SDS/PAGE................................................................
4.7. ESTUDOS CINÉTICOS..............................................................................
4.7.1. Determinação da Constante de Michaelis- Menten (Km)....................
4.7.2. Efeito da temperatura sobre a atividade enzimática...........................
39
40
40
40
4.7.3. Influência do pH sobre a atividade enzimática....................................
41
4.7.4. Influência de diversos sais e EDTA na hidrólise do p-nitofenil-Nacetil-β
β-D-glucosaminídeo..................................................................... 41
4.8. PREPARAÇÃO DA QUITINASE PARA OS ENSAIOS BIOLÓGICOS......... 42
4.9. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA......................................
42
4.9.1. Análise Qualitativa- Técnica de Difusão em Disco.............................
4.9.2. Análise Quantificativa- Determinação da Concentração Inibitória
Mínima (CIM)............................................................................................
4.10. ENSAIOS COM Aedes aegypti................................................................
4.10.1. Obtenção das larvas de Aedes aegypti..............................................
4.10.2. Dissecação das larvas de Aedes aegypti..........................................
4.10.3. Preparo do homogenato intestinal das larvas..................................
4.10.4. Detecção de quitina no intestino das larvas de Aedes aegypti......
42
4.10.5.
4.10.6.
4.10.7.
4.10.8.
45
46
46
Ensaios com larvas de Aedes aegypti...............................................
Determinação da EC50.........................................................................
Análises Estatísticas...........................................................................
Investigação de proteínas bioativas interferentes no processo
digestório nas larvas de Aedes aegypti.............................................
4.10.8.1. Ensaio de inibição de proteases serínicas......................................
a) Preparo do substrato...................................................................................
b) Atividade anti-quimotriptica.......................................................................
c) Atividade anti-triptica..................................................................................
4.10.8.2. Ensaios de hemaglutinação.............................................................
a) Preparo do sangue.....................................................................................
b) Tratamento dos eritrócitos com papaína.................................................
c) Tratamento dos eritrócitos com tripsina..................................................
d) Ensaio...........................................................................................................
4.10.8.3.Efeito do homogenato intestinal das larvas de Aedes aegypti
sobre a atividade quitinolítica...........................................................
a) Determinação de atividade azocaseínolítica.............................................
b) Efeito da temperatura sobre a atividade azocaseínolitica a pH 7,5........
43
44
44
44
45
45
46
46
46
46
47
47
47
47
48
48
48
48
49
c) Influencia das enzimas digestivas do Aedes aegypti na hidrólise do pnitrofenil-N-acetil-β
β-D-glucosaminídeo....................................................... 49
5. RESULTADOS .............................................................................................
50
5.1.IDENTIFICAÇÃO DE GLICOSIDASES E SULFATASES NOS
CEFALOTÓRAX
DOS
CAMARÕES
MARINHOS
litopenaeus
schmitti........................................................................................................... 50
5.2. PURIFICAÇÃO DA QUTINASE.................................................................... 51
5.2.1. Em cromatografia de troca iônica......................................................... 51
5.2.2. Em cromatografia de exclusão molecular S-200................................. 52
5.2.3. Resumo das etapas de purificação....................................................... 53
5.3. PERFIL ELETROFORÉTICO DAS AMOSTRAS EM SDS-PAGE............... 54
5.4. EXPERIMENTOS CINÉTICOS....................................................................
5.4.1. Determinação do Km.............................................................................
5.4.2. Efeito da temperatura sobre a atividade enzimática...........................
5.4.3. Efeito do pH sobre a atividade da Litochitinase1...............................
5.4.4. Efeito de sais e EDTA sobre a atividade enzimática...........................
5.5. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA......................................
5.5.1. Utilizando a técnica de difusão em disco............................................
5.5.2. Utilizando a técnica de microdiluição em caldo para a
determinação da concentração inibitória mínima (CIM)....................
5.6. ENSAIO COM Aedes aegypti......................................................................
5.6.1. Detecção de quitina no intestino médio de larvas de Aedes aegypti
5.6.2. Ensaio larvicida em Aedes aegypti......................................................
5.6.3. Detecção de inibidores de proteases serínicas no EB, FIII e
Litochitinase1.........................................................................................
5.6.4. Atividade hemaglutinante......................................................................
5.6.5. Determinação da temperatura ótima das atividades proteolíticas
presentes no homogenato intestinal das larvas de Aedes
aegypti.....................................................................................................
5.6.6. Influência das enzimas digestivas de Aedes aegypti sobre a
Litochitinase1.........................................................................................
6. DISCUSSÃO...............................................................................................
7. CONCLUSÕES...........................................................................................
REFERÊNCIAS ..........................................................................................
55
55
56
58
60
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79
81
18
INTRODUÇÃO
1. INTRODUÇÃO
1.1 GLICOSIDASES
As glicosidases são um grupo de enzimas que clivam O-glicosídeos, Nglicosídeos e tio-glicosídeos (DUMONT, 2008; WITHERS, 2010). Estando desta
forma diretamente envolvidas no metabolismo de monossacarídeos, dissacarídeos,
oligossacarídeos e até polissacarídeos (FERREIRA, 2001). Dentre elas destacam-se
as endoglicosidases e exoglicosidases. As endoglicosidases são enzimas que
clivam cadeias liberando dissacarídeos ou oligossacarídeos. Já as exoglicosidases
são um grupo de enzimas que clivam a cadeia oligossacarídica através de sua
porção não redutora liberando monossacarídeos (MALLEY et al.,1989).
As glicosidases formam um grupo altamente heterogêneo de enzimas
hidrolíticas (BHATIA et al., 2002). Tais enzimas são encontradas em diversos
organismos, como bactérias (KATAYEVA et al., 1992; PAAVILAINEN et al., 1993;
SESTELO et al., 2004; ARO et al., 2005) fungos (RICCIO et al., 1999; JAGER et
al., 2001; YUN et al., 2001; BELANCIC et al., 2003) plantas (SUE et al., 2000;
CAMERON et al., 2001; GERARDI, 2001; SARRY; GÜNATA, 2004) e animais
(MARANA et al., 1995; HAYS et al., 1998; MARANA, 1999), (PONTOH; LOW, 2002;
DRUMONT, 2008),como por exemplo em crustáceos (KOSTANJNEK et al., 2010;
ALLARDYCE et al., 2010) e o homem (GRACE et al., 1994; DAY et al., 1998;
NEMETH et al., 2003; GERMAIN, 2004).
A principal reação catalisada por estas enzimas é a hidrólise de ligações βglicosídicas. Estas enzimas possuem uma carboxila e um carboxilato responsáveis
pela catálise, um funcionando como nucleófilo e o outro como doador de prótons
(JONES, 2002). A especificidade das β-glicosidases pode variar, pois algumas
destas enzimas podem ser capazes de atuar sobre uma gama enorme de substratos
e outras podem ser mais restritas (FERREIRA, 1998, 2001, 2003; AZEVEDO, 2003).
Desta forma o nome β-glicosidase é dado a diferentes tipos de enzimas capazes de
hidrolisar ligações β-glicosídicas em dissacarídeos, oligossacarídeos e glicosídeos
conjugados (COULON et al., 1998; BHATIA et al., 2002).
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19
INTRODUÇÃO
1.1.1 GLICOSIL-HIDROLASES
As glicosil-hidrolases são glicosidases que hidrolisam ligações O-glicosídicas
e são classificadas, pela Enzyme Commission Numbers (EC) a International Union of
Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB), com base na sua especificidade pelo
substrato, por exemplo: β-glucosídeo ou β-galactosídeo, e no tipo de ligação, por
exemplo: β-1,4 ou β-1,3. Esta classificação é útil, pois unifica a nomenclatura e evita
as ambigüidades dos nomes triviais. Entretanto, tal classificação não reflete as
características estruturais e correlações evolutivas entre as enzimas (MARANA,
1999).
A fim de estabelecer uma classificação que contemplasse o aspecto estrutural
e evolutivo das glicosil-hidrolases, HENRISSAT (1991), partindo do pressuposto de
que existe uma correlação entre similaridade da seqüência de aminoácidos, e a
estrutura terciária das proteínas, foi realizado um alinhamento de seqüências e
conjuntos de aminoácidos hidrofóbicos das glicosil-hidrolases disponíveis e montouse um sistema de classificação para estas enzimas(CHOTIA; LESK, 1986).
Esta classificação baseou-se em um total de 291 seqüências correspondendo
a 39 diferentes EC que puderam ser classificadas em 35 famílias em seguida
HENRISSAT; BAIROCH, (1993), ampliaram ainda mais o sistema de classificação
atingindo um total de 45 famílias. Agrupando as enzimas de origem evolutiva
comum, independentemente das reações que elas catalisam aproximadamente 90
famílias de glicosil-hidrolases são conhecidas (WITHERS, 2002).
Além do critério de similaridade na seqüência de aminoácidos, elas também
podem ser classificadas segundo mecanismos de reação, que as categoriza
segundo dois mecanismos: o de retenção e o de inversão da configuração do
anômero C1 do anel glicosídico. A hidrólise se dá via catálise ácida, onde há um
doador de prótons e um nucleófilo. Em ambos, o doador de prótons está próximo ao
oxigênio glicosídico e o nucleófilo fica na posição vicinal do carbono 2 do anel. A
diferença é que no mecanismo de inversão a distancia do nucleófilo é maior, a fim
de comportar uma molécula de água. Essa distância é cerca de 5,5 Å no mecanismo
de retenção e ~10 Å no de inversão na formação do complexo enzima substrato.
(DAVIS, 1995; KOSHALND, 1953). O ataque nucleofílico é feito pelos dois resíduos
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20
INTRODUÇÃO
aproximando-se pelo lado oposto da ligação glicosídica e há a retenção ou inversão
da configuração anomérica do anel glicosídico (HENRISSAT, 1995).
A clivagem da ligação glicosídica entre um resíduo de N-acetil-β-Dglucosamina e outro resíduo adjacente, pode ser do tipo exo ou endoglucosidasicas, e essas se encontram distribuídas em seis famílias de glicosilhidrolases: GH3, GH18, GH19, GH20, GH73 e GH84. (LIMA, 2006). A tabela 1
abaixo sumariza as características das seis famílias citadas.
O sistema de classificação glicosil-hidrolase (GH), introduzido e desenvolvido
por HENRISSAT, (1991) e HENRISSAT; BAIROCH, (1993) está disponível em um
banco de dados geral (http://afmb.cnrs-mrs.fr/~CAZY/index.html) (COUTINHO;
HENRISSAT, 1999; LIMA, 2006).
Tabela 1: Família das glicosil-hidrolases que possuem atividade N-acetil-β-Dglucosaminidásica.
Família
GH3
Atividades conhecidas
β-glicosidase (EC 3.2.1. 21); xilano 1,4-β-xilosidase (EC 3.2.1. 37);
β-N-acetilhexosaminidase (EC 3.2.1. 52); glicano 1,3-β-glicosidase
(EC 3.2.1. 58); glicano 1,4-β-glicosidase (EC 3.2.1. 74); exo-1,31,4-glicanase (EC 3.2.1. -); α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1. 55)
GH18
Quitinase (EC 3.2.1. 14); endo-β-N-acetilglicosaminidase (EC
3.2.1. 96)
GH19
Quitinase (EC 3.2.1. 14)
GH20
β-hexosaminidase (EC 3.2.1. 52); lacto-N-biosidase (EC 3.2.1.
140)
GH73
Endo-β-N-acetilglicosaminidase
(EC
3.2.1.
96);
β-1,4-N-
acetilmuramoilhidrolase
GH84
β-N-acetilglicosaminidase (EC 3.2.1. 52); hialuronidase (EC 3.2.1.
35)
Fonte: (modificado de HENRRISAT ; COUTINHO, 1999).
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21
INTRODUÇÃO
1.1.2 QUITINASES
As quitinases são enzimas que clivam ligações O-glicosídicas entre os
carbonos C1 e C4 dos resíduos de β-1,4-N-acetilglucosamina (GlcNAc), constituintes
do polímero de quitina (Figura 01). Estas enzimas são classificadas como glicosil
hidrolases e compreendem cerca de 90 famílias de enzimas descritas. As quitinases
foram colocadas na família 18, 19 e 20, na qual, as da família 18 são encontradas
em vírus, bactérias, fungos filamentosos ou leveduriformes, plantas e animais, e,
portanto, a família é diversa em termos evolucionários. Membros da família 19 são
quase que exclusivas de plantas. A família 20 consiste em N-acetil-β-Dhexosaminidase ou N-acetil-β-D-glucosaminidases de bactérias, fungos e seres
humanos (HORSCH et al., 1997; WITHERS, 2002; SEIDEL, 2008).
Figura 01: Estrutura Química da quitina.
Fonte: (Modificado de SEIDL, 2008)
A quitina é a segunda substância orgânica até então conhecida na biosfera
sendo superada apenas pela celulose, mas supera esta última em termos de taxa de
reposição, que chega a ser duas vezes maior que a da celulose (THARANATHAN;
KITTUR 2003; YEN et al., 2009).
Quitina e celulose possuem características estruturais semelhantes e atuam
como invólucros protetores e materiais de suporte e defesa nos organismos em que
ocorrem. A quitina e/ou polímeros de N-acetil-glucosamina encontra-se na matriz da
estrutura esquelética de invertebrados, como artrópodes, anelídeos, moluscos e
cnidários, em algas diatomáceas, no peptideoglicano da parede celular das bactérias
e também está presente nas paredes celulares de alguns fungos, como
ascomicetos, zigomicetos, basidiomicetos e deuteromicetos (KARAMANOS, 1997;
RIVAS et al., 2002; DUO-CHAN, 2006; ZHANG et al., 2010).
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22
INTRODUÇÃO
Este biopolímero ocorre naturalmente em três diferentes formas α-, β- e γquitina (Figura 02). A α-quitina é encontrada em estruturas rígidas e resistentes,
como a cutícula de artrópodes, e nesses casos ocorre fortemente associada a
proteínas, materiais inorgânicos ou ambos. A α-quitina é a forma mais abundante e
é também considerada a mais estável, visto que a conversão das duas últimas
formas na primeira é irreversível (ROBERTS, 1992). As formas β- e γ-quitina ocorre
em estruturas flexíveis embora também resistentes. Nas lulas do gênero Loligo a αquitina constitui uma fina capa que reveste as paredes do esôfago e do estômago, a
β-quitina ocorre como o principal componente das conchas, ou plumas, e a γ-quitina
integra uma espessa cutícula que recobre outras zonas do estômago (ABRAM;
HIGUERA, 2004).
Figura 02: Representação esquemática das estruturas polimórficas de quitina, sendo que as setas
representam as cadeias poliméricas no sentido do terminal não-redutor para o redutor.
Fonte: (CAMPANA-FILHO, 2006).
As quitinases podem ser classificadas ainda, quanto ao seu modo de ação
sobre o substrato. A nomenclatura enzimática oficial (EC) classifica as enzimas
quitinolíticas em apenas dois grupos de enzimas: as quitinases, também conhecidas
como endoquitinases, que catalizam a hidrólise randômica de ligações β-1,4 de Nacetilglucosamina (GlcNac) liberando produto solúveis como quitotetraoses,
quitotriose e diacetilquitobiose; e as N-acetilglucosaminidases, também conhecidas
como exoquitinases, que clivam a quitina em monômeros N-acetilglucosamina.
Entretanto
algumas
enzimas
quitinolíticas
não
se
encaixam
nessa
classificação. Assim diferentes classificações foram sugeridas. Dependendo dos
seus padrões de clivagem as quitinases foram divididas em três tipos:
endoquitinases, exoquitinases e N-acetil-β-D-glucosaminidases. As endoquitinases
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23
INTRODUÇÃO
clivam as ligações β-1,4 da quitina a partir de qualquer ponto ao longo da cadeia
polimérica liberando produtos (oligossacarídeos) de tamanho aleatório, enquanto as
exoquitinases atuam a partir da porção não-redutora da cadeia e seus produtos
finais geralmente são dímeros de N-acetil-β-D-glucosamina (GlcNAc)2 (SAHAI;
MANOCHA, 1993; SEIDEL, 2008). As N-acetil-β-D-glucosaminidases são um grupo
de enzimas que hidrolisam componentes O-glicosídicos, removendo resíduos
terminais não-redutores de N-acetil-β-D-glucosamina, sendo assim, considerada
uma exoglicosidase (HORSCH et al., 1997). Estas enzimas também são
denominadas de N-acetil-β-D-hexosaminidases (EC 3.2.1. 52), devido ao fato de
possuírem atividade N-acetil-β-glucosaminidásica bem como atividade N-acetil-βgalactosaminidásica (KRESSE; GLOSSL, 1987; HORSCH et al., 1997; NIIMI et al.,
2001).( Figura, 03).
Endoquitinases
Exoquitinases
N-acetilglucosaminidases
Figura 03: Esquema dos padrões de clivagem de enzimas quitinolíticas. As subunidades da cadeia
da quitina são mostradas em azul claro e o açúcar redutor em azul escuro. As tesouras representam
as ações enzimáticas
Fonte: (Modificado de SEIDL, 2008).
1.1.2.1
OCORRÊNCIA E FUNÇÕES DAS QUITINASES
Diversos estudos apontam o papel fisiológico e ecológico das quitinases. Na
maioria destes estudos conclui-se que elas estão envolvidas em processos de
defesa contra patógenos, mas que também desempenham outros papéis
importantes que serão abordados adiante.
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24
INTRODUÇÃO
A quitina, além de estar presente em fungos, também se encontra em insetos
e crustáceos (LENARDON et al., 2010; CHEN et al., 2010; QIN et al., 2010). As
quitinases em crustáceos são associadas à degradação parcial do exoesqueleto
durante seu desenvolvimento, por um mecanismo que parece estar sob o controle
hormonal. Assim como nos crustáceos, o desenvolvimento de insetos está
diretamente relacionado com a regulação da síntese e degradação de quitina, que é
o principal componente do seu exoesqueleto (SPINDLER-BARTH, 1993).
Além do
papel no desenvolvimento, as quitinases também exercem o papel de defesa contra
patógenos em outros invertebrados
Segundo MULLEN et al. (2004), estudos preliminares mostraram a presença
de altos níveis de exo e endoquitinases em corais infectados por fungos.
As quitinases em fungos parecem ser um fator decisivo na colonização e
predação para obtenção de alimentos (BISHOP et al., 2000). A atividade quitinolítica
é de fundamental importância para patogênese de infestação por fungos, como por
exemplo, Metarhizium anisopliae sf. acridum (SCREEN et al., 2001). Através da
indução com quitina, este microorganismo foi capaz de secretar isoformas básicas e
acidas de endoquitinases (KANG et al.,1999). Estas enzimas são largamente
utilizadas por M. anisopliae na colonização de lagartas de Manduca sexta, digerindo
a cutícula e a membrana peritrófica (SCREEN et al., 2001).
No culicídeo Aedes aegypti, a quitina é um dos componentes principais da
membrana peritrófica (MP) formada no meio intestinal da fêmea adulta após o
repasto sanguineo, o que ocasiona a proteção do sangue ingerido contra micróbios
patogênicos, promovendo assim uma barreira a distribuição e crescimento
subseqüente desses patógenos. (FILHO et al., 2002), desta forma a degradação da
membrana
peritrófica
nesses
insetos
pode
ocasionar
crescimento
de
microorganismos promovendo sua infestação como também pode ocasionar a
ruptura no tecido intestinal, o vazamento do fluido celular e o desbalanceamento
osmótico, matando o inseto por desidratação ou inanição (BISHOP et al., 2000).
Estudos mostraram que quando o culicídeo Aedes aegypti se alimenta de
alosamidina X, ocorre a formação atípica da membrana peritrófica (MP), sugerindo a
presença de um sistema quitinolítico no intestino do inseto, responsável pela
modificação e controle da formação da MP. O conhecimento de como este sistema
quitinolítico funciona e sua função na formação da MP pode facilitar o
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25
INTRODUÇÃO
desenvolvimento de estratégias que podem ser usadas para manipular o processo
natural, incluindo a interrupção da invasão de patógenos em mosquitos vetores
(FILHO et al., 2002).
As quitinases são também podem ser encontradas em alguns organismos que
não apresentam a quitina em sua constituição, como em bactérias, nematódeos e
plantas
(COHEN-KUPIEC;
CHET,
1998).
Em
bactérias
como
Serratia
e
Streptomyces como também em nematódeos (Onchocerca gibsoni) (McNAB;
GLOVER, 1991), sua função está relacionada à nutrição. Dessa forma, a hidrólise de
uma variedade de quitinas encontradas na natureza permite ao organismo utilizar
esses polímeros como fonte de energia (VAN AALTEN et al., 2001; COHENKUPIEC; CHET, 1998). Em nematódeos, as quitinases estão presentes na casca do
ovo e contribuem para a manutenção de sua integridade (ARNOLD et al., 1993).
Quitinases em plantas estão associadas à defesa contra patógenos e fazem
parte do grupo de proteínas denominadas PR (Pathogenesis Related Proteins), que
são proteínas capazes de induzir resistência local ou sistêmica ao ataque de fungos
e outros fitopatógenos. Evidências indicam que as quitinases têm um papel direto
nessa defesa por atacar diretamente os polímeros de quitina, que é o maior
componente da parede celular da maioria dos fungos (COLLINGE et al., 1993;
KUPIEC; CHET, 1998; HODGE et al., 1996).
Nesses casos, essas enzimas possuem um papel de defesa contra
organismos que possuem quitina em sua composição, inibindo in vitro o crescimento
de fungos filamentosos, especialmente em combinação com β-1,3-glucanase
(COHEN-KUPIEC; CHET, 1998; ISELI et al.,1996).
Embora animais vertebrados não sejam produtores de quitina, a presença de
quitinases tem sido verificada no organismo de várias espécies desses animais.
Essas enzimas são encontradas em vários órgãos e tecidos, como no trato
digestivo, participando do metabolismo de carboidratos (JEUNIAUX, 1993). Peixes
que se alimentam de crustáceos ou insetos contêm uma grande concentração de
quitinases em seu suco pancreático (ROTTA, 2003).
A expressão de quitinases em mamíferos não havia sido reportada até 1994
quando HOLLACK
et
al.
identificaram a
primeira
quitinase
humana
em
pacientes com a Doença de Gaucher. Em outro estudo BOOT et al. (2001)
identificaram no trato gastrintestinal e pulmões, outra quitinase denominada
AMCase (acidic mammalian chitinase).
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26
INTRODUÇÃO
A ocorrência de quitinases em mamíferos e humanos sugere que sua função
esteja relacionada com a metabolização de carboidratos e de participação em
mecanismos de defesa contra agentes patogênicos. No entanto, seu papel
fisiológico em mamíferos e especialmente em humanos ainda não é completamente
conhecido e parece ser um paradoxo, sendo presença da quitotriosidase fortemente
associada também à arteriosclerose e a presença da AMCase associada à asma.
Esses dados sugerem que essas enzimas possam participar de desordens
inflamatórias (DONNELY; BARNES, 2004).
1.1.2.2 APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS
Extensos estudos sobre quitinases estão sendo desenvolvidos devido ao fato
de sua ampla capacidade de aplicação na biotecnologia, nas mais diversas áreas
como na agricultura, medicina e o setor industrial.
A aplicação de quitinases na agricultura objetiva principalmente o controle
biológico seja pelo desenvolvimento de bioinseticidas para controle de insetos,
fungos fitopatogênicos e bactérias ou pelo desenvolvimento de plantas transgênicas
resistentes
ao
ataque
de
microorganismos
ou
ainda
na
produção
de
quitooligossacarídeos biologicamente ativos (PATIL et al., 2000; FLEURI, 2008).
Muitas quitinases de várias fontes têm apresentado atividade contra patógenos de
plantas e contra insetos que causam pestes na agricultura (DAHYIA et al., 2006).
Quitinases de T. harzianum (DEMARCO et al., 2000), Enterobacter sp. NRG4
(DAHYIA et al., 2005), Cellulosimicrobium cellulans 191 (FLEURI; SATO, 2008)
Clonostachys rósea (LU BECK et al., 2009) e de sementes de Acacia confusa (NG et
al., 2010) , já mostraram atividade inibitória contra alguns desses patógenos,
podendo assim ser utilizados como suplementos na produção de fungicidas e
inseticidas. A partir da bactéria Bacillus circulans foi produzido uma quitinase para
ser usada como suplemento bioinseticida da bactéria entomopatogênica Bacillus
thuringiensis para controle de larvas de lepidópteras. Um sistema lítico composto
das seguintes enzimas: quitinase, protease, β-glucanase e lipase foram utilizadas
para o controle de manchas nas folhas de centeio, causadas por Biopolaris
sorokiniana (FLEURI; SATO, 2005).
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27
INTRODUÇÃO
Tem sido extensamente pesquisada a utilização das quitinases na produção
de quitooligossacarídeos com atividades biológicas. Estes são potencialmente úteis
na medicina. Por exemplo, a quitohexaose e quitoheptaose mostraram atividade
antitumoral. A combinação específica de enzimas quitinolíticas com altos níveis de
endo-quitinases e baixa atividade de N-acetilglucosaminidases e exo-quitinases
podem ser necessárias para obter o oligossacarídeo desejado. Em contrapartida a
produção de N-acetilglucosamina pode ser obtida utilizando altas proporções de
exo-quitinases e N-acetilglucosaminidases. Este açúcar quando aplicado por via
intramuscular ou oral é um potente antiinflamatório podendo ser utilizado no
tratamento de colites ulcerativas ou doenças gastrointestinais (PATIL et. al., 2000).
Quitinases purificadas podem liberar oligômeros de quitina, a partir da parede
celular fúngica (SCHLUMBAUM et al., 1986) como também podem agir
semelhantemente à lisozima, sobre paredes celulares bacterianas (HERGET et al.,
1990; STINTZI et al., 1993).
A quitina também está presente na membrana peritrófica (MP) de insetos
como o Aedes Aegypti. A MP protege o epitélio intestinal e promove a
compartimentalização das enzimas digestivas, sendo fundamental para o processo
digestório. As quitinases podem ter ação inseticida por interferirem na integridade da
MP. Etapas adicionais de purificação dessa (s) quitinase(s) poderão indicar essas
proteínas como candidatas no controle do inseto transmissor da dengue.
Outro campo em que pode haver utilização de quitina é a bioconversão. O
consumo de camarões no mundo é muito grande, principalmente em países
costeiros. No entanto, somente a carne é consumida e o cefalotórax e a casca, são
descartados. Há dados em que alguns países são produzidos mais de 2,5 milhões
toneladas de lixo dessa natureza (HAKI et al., 2003; DAHYIA, 2006). Assim, o
desenvolvimento de métodos de conversão desse rejeito em produtos derivados de
quitina é de grande importância. E esses derivados de quitina podem ser obtidos
pela degradação desses pelas quitinases. Nos últimos anos várias quitinases
derivadas de diversos organismos foram isoladas, clonadas ou expressas na forma
recombinante (Tabela 2).
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28
INTRODUÇÃO
Tabela 2: Algumas quitinases já isoladas e caracterizadas.
Origem
Streptomyces sp. TH-11
Massa
Molecular
(kDa)
29
Penaeus monodon
72,4 e 51,9
PROESPRAIWONG et
al., 2010
Ipomoea carnea
30,6
PATEL et al., 2010
Pennahia argentatus
42
IKEDA et al., 2009
Pieris rapae
59,5 e 57,2
SHI et al., 2006
Bacillus thuringiensis
74
Pseudomonas aeruginosa
385
Pseudomonas sp YHS-A2
58
THOMPSON et al., 2001
67
LEE et al., 2000
1.2 Litopenaeus
schmitti
(BURKENROAD,
Autor/Ano
HOANG et al., 2011
BARBOZA-CORONA et
al., 2002
1936)
COMO
FONTE
DE
QUITINASES
O camarão branco Litopenaeus schmitti, é o único pertencente ao gênero
Litopenaeus que ocorre em águas brasileiras. Assim como várias outras espécies da
família Penaeidae, possuem alta fecundidade, procriam em águas costeiras e
apresentam estágio larval planctônico por uma semana ou mais, sendo facilmente
disperso pelas correntes (LUVESUTO, 2006).
As áreas estuarinas são zonas adequadas para a nutrição e desenvolvimento
dos camarões (GAMBA; RODRIGUEZ, 1987), onde crescem aproximadamente de
10 mm a 75 mm, durante aproximadamente de 6 a 9 meses (EWALD, 1965; NEIVA
et al., 1971). Os machos da espécie crescem em torno de 170 mm e as fêmeas
comumente atingem um tamanho de 200 mm. Os maiores indivíduos devem ter em
torno de 2 anos, uma vez que os camarões peneídeos possuem baixa longevidade
(1,5 a 2 anos) (ROTHLISBERG et al.,1985).
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29
INTRODUÇÃO
A espécie Litopenaeus schmitti popularmente conhecida como “Vila Franca”,
ocorre no Atlântico ocidental desde as Antilhas até o Rio Grande do Sul (Figura 04),
sendo os adultos encontrados em pequenas profundidades de até 47 metros
(PÉREZ-FARFANTE, 1970; SILVA, 1977).
Figura 04: Mapa da distribuição geográfica do camarão branco Litopenaeus schmitti .
Fonte: (MARTINELI, 2005).
O
camarão
branco
apresenta
características
relacionadas
à
sua
distribuição e ao seu ciclo de vida que podem influenciar a estruturação em escala
fina de suas populações, como a ocorrência do acasalamento e postura próximos
a costa (entre 20 e 30 metros) e a permanência dos pré-adultos nas proximidades
de regiões estuarinas (SILVA, 1977). Nesta espécie, a postura aparentemente é
realizada em águas marinhas de pequena profundidade e de salinidade elevada
(EWALD, 1965; PÉREZ-FARFANTE, 1970; COELHO; SANTOS, 1994). A maior
parte das fêmeas em postura tem 7 meses de idade, sendo a idade média da
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30
INTRODUÇÃO
primeira maturação inferior a 6 meses; poucas se reproduzem novamente aos 1012 meses de idade (COELHO; SANTOS, 1994).
Sua distribuição está associada a substratos maciços e lamacentos com um
conteúdo orgânico relativamente alto e alta turbidez da água, característico de águas
estuarinas (DALL et al., 1990).
Há poucos estudos sobre essa espécie de camarão, principalmente quando
se diz respeito à enzimologia. Os trabalhos existentes abrangem outras espécies de
camarão ou aspectos ligados a identificação de genes relacionados ao sistema
imune de Litopenaeus vannamei (LIMA NETO, 2006), bioconversão de resíduos
para produção de quitosana (ASSIS et al., 2008), efeitos de íons mercúrio na
atividade da qutinase (LIN et al., 2005), caracterização dos glicosaminoglicanos
isolados do L. schmitti (SANTOS, 2006) e análise filogenética de quitinases do
camarão Penaeus monodon (PROESPRAIWONG et al., 2010).
Os estudos realizados em nosso laboratório sugerem uma ampla perspectiva
de trabalhos a serem realizados com endo-, exoglicosidases e sulfatases
encontradas em aninais marinhos como, por exemplo, a identificação de
glicodidases e sulfatases em diferentes tecidos do molusco Aplysia cervina (MATTA;
ABREU, 2005), indentificação de uma nova β-N-acetylhexosaminidase do cnidário
Palythoa caribaeorum (SOUZA et al., 2008) e a purificação de uma β-Nacetylhexosaminidase do mamífero marinho Sotalia fluviatilis (GOMES JÚNIOR et
al., 2010).
O estudo e a purificação destas enzimas e suas utilizações biotecnológicas
como antifúngicos, antibacterianos e bioinseticidas é uma das propostas desta
pesquisa e servirão como ferramentas moleculares na elucidação de estrutura
química
de
glicoconjugados,
dissacarídeos
e/ou
oligossacarídeos
e
de
polissacarídeos marinhos de algas marinhas, como ainda a produção de
oligossacarídeos com potenciais atividades farmacológicas.
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31
OBJETIVOS
2. OBJETIVOS:
2.1.
Gerais
Isolar, caracterizar cineticamente e realizar ensaios microbiológicos e larvicida
com a quitinase, obtida do camarão Litopenaeus schmitti.
2.2.
Específicos
•
Extrair glicosidases e sulfatases do cefalotórax do camarão marinho
Litopenaeus schmitti;
•
Fracionar estas enzimas através de precipitação com sulfato de amônio
e identificar glicosidases e sulfatases nestas frações utilizando
substratos sintéticos específicos;
•
Purificar a quitinase utilizando cromatografias;
•
Propor a massa molecular da quitinase isolada;
•
Realizar testes cinéticos com a Litochitinase1;
•
Avaliar a atividade antibacteriana e antifúngica da Litochitinase1 sobre
cepas de Staphylococcus aureus, Candida albicans, Candida tropicalis,
Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa;
•
Investigar a presença de quitina nos intestinos médios das larvas de
Aedes aegypti;
•
Avaliar a atividade larvicida das frações ricas em Litochitinase1 contra
larvas de Aedes aegypti;
•
Identificar a presença de proteínas bioativas como: proteinases serínicas
e lectinas, nas frações ricas em Litochitinase1;
•
Avaliar a influência das enzimas digestivas de A. aegypti sobre a
Litochitinase1.
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32
MATERIAIS
3. MATERIAIS
3.1. Material Biológico
3.1.1 Camarão Litopenaeus schmitti
Surperfilo: Artropoda
Filo: Crustacea
Classe: Malacostraca
Ordem: Decapoda
Família: Penaeidae
Gênero: Litopenaeus
Espécie: Litopenaeus schmitti
Figura 05: Litopenaeus schmitti.
Fonte: Arquivo Próprio
Os camarões da espécie Litopenaeus schmitti foram obtidos no Mercado de
peixes situado na cidade do Natal, Estado do Rio Grande do Norte. Estes foram
mantidos a 4°C durante o transporte e depois armazenados a -20°C até seu
processamento.
3.1.2. Insetos
As larvas do quarto instar de Aedes aegypti foram obtidas da criação mantida
no Laboratório de Entomologia (LABENT) do Departamento de Microbiologia e
Parasitologia da UFRN. Estes experimentos foram realizados com o auxílio da aluna
de pós-graduação, a Veterinária (CRMV- RN 373) Patrícia Barra e da Profa. Dra.
Maria de Fátima F. de M. Ximenes.
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33
MATERIAIS
3.1.3. Eritrócitos Humanos
Os eritrócitos humanos foram obtidos através de doações de bolsas de
sangue pelo HEMOCENTRO-RN. As bolsas fornecidas encontravam-se fora do
prazo de validade para transfusões.
3.1.4. Microorganismos
As cepas de Staphylococcus aureus (25923), Candida tropicalis (13803),
Escherichia coli (25922) e Pseudomonas aeruginosa (27853), foram obtidas do Banco
de Cepas ATCC (Americam Type Culture Collection) e Candida albicans (12) obtida
do banco ICB e mantidas no Laboratório de Micologia Médica e Ambiental (LAMEA)
no Departamento de Microbiologia e Parasitologia da UFRN. Estes experimentos
foram realizados sob a supervisão e orientação da Profa. Dra. Vânia Sousa Andrade e
com o auxílio da aluna de Iniciação Cientifica (Bolsista PROPESQ) Gabriela Medeiros
Araújo.
3.2.
Substratos Sintéticos derivados de açúcares
p-nitofenil-sulfato; p-nitrofenil-N-acetil-β-D-Glucosaminídeo; p-nitrofenil-β-Dglucopiranosídeo;
p-nitrofenil-α-D-glucopiranosídeo;
p-nitrofenil-N-acetil-α-D-
galactosaminídeo; 4-Nitrofenil N, N’-diacetil-β-D-quitobiosideo; 4-Nitrofenil β-D-N, N’,
N’’-triacetilquitotriose foram adquiridos da Sigma Chemical Company (St Louis, MO,
EUA).
3.3.
Reagentes, Soluções, membranas e matrizes cromatográficas
•
Acrilamida e bisacrilamida da Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, EUA),
dodecil sulfato de sódio (SDS) e ácido acético (C2H4O2) da Reagen, Quimibras
Indústrias Químicas S.A. Indústria Brasileira (Rio de Janeiro, RJ, Brasil);
•
Hidróxido de sódio (NaOH), Álcool etílico (C2H6O) foi obtido da CIRQ
Cromato Produtos Químicos LTDA (São Paulo, SP, Brasil);
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34
MATERIAIS
•
Albumina
sérica
bovina,
ácido
etilenodiamino
tretra-acético
(EDTA),
persulfato de amônio, glicina, N, N,N’ tetra-metileno diamino (TEMED), nitrato de
prata, “Coomassie brilhante blue” G 250, Azocaseína, Proteases Serínicas: Tripsina
e Quimotripsina, Protease Cisteínica: Papaína, da Sigma Chemical Company (St
Louis, MO, EUA);
•
Padrões de massa molecular para eletroforese da Fermentas Life Sciences
(Ontário, Canadá);
•
Tiossulfato de sódio (Na2S2O3), acetato de sódio (NaC2H3O2), cloreto de
sódio (NaCl), ácido clorídrico (HCL), cloreto de potássio (KCL), sulfato de amônio
((NH2)2SO4), e fosfato de sódio monobásico (Na2HPO4.H2O), acetona, sulfato de
sódio (Na2SO4), fosfato de sódio dibásico (NaH2PO4) e citrato de sódio (NaC6H5O7)
foram adquiridos da VETEC Química Fina LTDA (Rio de Janeiro, RJ, Brasil); ácido
tricloroacético (CCl3COOH) da MERCK (Darmstadt, Germany);
•
Membranas de diálise (limite de exclusão: 6.000-8.000 e 12.000-14.000
dáltons) da Spectrum Medical Industries, Inc.(Houston TX, EUA);
•
Matriz cromatográfica DEAE-Biogel A 1,5m da Bio Rad Laboratories
(Richmond, CA, EUA);
•
Matriz cromatográfica Sephacryl S-200 da Sigma Chemical Company (St
Louis, MO, EUA).
3.4.
Aparelhos
•
Agitador orbital modelo 2525, Banhos e estufas de temperaturas constantes
da FANEM LTDA (São Paulo, SP, Brasil);
•
Balança analítica – SCIENTECH, obtidos da QUIMIS Aparelhos Científicos
LTDA (Diadema – SP, Brasil);
•
Bomba peristáltica modelo 18-1110-91 e coletor de frações modelo 18-1003-
64, Pharmacia Biotech, (Uppsala, Sweden);
•
Centrifuga refrigerada modelo CR 21 da Hitachi Koki Co. LTDA (Tóquio,
Japão);
•
Concentrador 5301 Eppendorf (Hamburgo, Germany);
•
Espectrofotômetro Hitachi U 2000 (Tóquio, Japão) ;
•
Lupa, Olympus (California, USA)
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35
MATERIAIS
•
Medidor de pH Digimed (São Paulo, SP, Brasil);
•
Microcentrífuga Eppendorf 5410 (Hamburgo, Germany);
•
Sistema de eletroforese em gel vertical, modelo Mini-VE da Amersham
Biosciences (Uppsala, Suécia);
•
Sistema de ultrapurificação de água Millipore modelo Milli-Q Plus (NYE, EUA)
•
Fluxo Lâminar-Purifier Class II Biosafety Cabinet (Kansas City, EUA).
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36
MÉTODOS
4.
MÉTODOS
4.1. Obtenção do Extrato Bruto
Os camarões da espécie Litopenaeus schmitti foram descongelados, os
cefalotórax foram cuidadosamente separados da musculatura e homogeneizados
com dois volumes de tampão acetato de sódio 0,1 M pH 5,0, em banho de gelo. Em
seguida centrifugados a 12.000 x g (4°C) e as fases solúveis (extratos brutos)
utilizados para posterior fracionamento utilizando-se sulfato de amônio.
4.2. Fracionamento com Sulfato de Amônio
O fracionamento com sulfato de amônio foi efetuado em três etapas de
saturação: 0-30%, 30-50% e 50-80%. A concentração de sal, correspondente a cada
saturação, foi adicionado lentamente sobre a amostra sofrendo leve agitação e,
posteriormente deixado por 18 horas a 4°C (geladeira). Em seguida foram
centrifugados a 12.000 x g, os precipitados ressuspensos em tampão acetato de
sódio 0,1 M pH 5,0 e dialisados por 18 horas contra o mesmo tampão (quatro
vezes).
Todos estes processos foram executados a 4°C. Estas frações foram
denominadas F-I, F-II e F-III, referindo-se aos percentuais de saturação 0-30%, 3050% e 50-80%, respectivamente (Figura 06).
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37
MÉTODOS
Homogenizado com tampão acetato de sódio 0,1M
pH 5,0 12.000 x g – 30’, 4 ºC
Sobrenadante (Extrato Bruto)
0-30% Sulfato de amônio
12.000 xg –30’, 4 ºC
Precipitado (F-I)
Sobrenadante
30-50% Sulfato de amônio
12.000 xg –30’, 4 ºC
Precipitado (F-II)
Sobrenadante
50-80% Sulfato de amônio
12.000 xg –30’, 4 ºC
Precipitado (F-III)
Figura 06: Fluxograma do fracionamento com sulfato de amônio.
4.3. Determinação das Atividades Enzimáticas Com p-Nitrofenil Derivados de
Açúcar
As incubações com p-nitrofenil derivados de açúcar (p-nitrofenil-α-Dgalactopiranosideo, p-nitrofenil-sulfato, p-nitrofenil-β-D-glucopiranosídeo, p-nitrofenilβ-D-N-acetilglucosaminídeo e p-nitrofenil-α-D-glucopiranosídeo, 4-Nitrofenil N, N’diacetil-β-D-quitobiosideo,
4-Nitrofenil
β-D-N,
N’,
N’’-triacetilquitotriose)
foram
realizadas utilizando-se 10 mM de cada substrato sintético com alíquotas do extrato
bruto, das frações precipitadas com sulfato de amônio e cromatográficas (volume
final de 100 µL). Os ensaios foram realizados no tempo de 30 minutos a 37°C para o
EB e F-III e 2 horas a 55°C para as cromatografias. As reações foram interrompidas
com 1 mL de hidróxido de sódio 0,25 N e o p-nitrofenol liberado lido em
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MÉTODOS
espectrofotômetro a 405 nm. Para cada ensaio foram feitos controles negativos dos
substratos (substrato e tampão no mesmo volume e concentração do ensaio). Uma
unidade de atividade foi definida como a quantidade de enzima capaz de aumentar
em 0,01 unidade de absorbância a 405 nm.
4.4. Dosagem de Proteínas
Para a quantificação das proteínas utilizamos o método de SEDMAK;
GROSSBERG (1977) com albumina sérica bovina como padrão.
4.5. Purificação da Enzima
4.5.1. Cromatografia de Troca Iônica DEAE-Biogel
A fração F-III (9,32 mg), proveniente do fracionamento com sulfato de amônio,
foi submetida à cromatografia de troca-iônica DEAE-Biogel. A coluna com cerca de
10 cm3 de gel foi equilibrada em tampão fosfato de sódio 0,02 M pH 8,0. Para a
remoção das proteínas, que não se complexaram com o gel, foi feita eluição (fluxo
de 1 mL/3min) com o mesmo tampão até que nenhuma proteína fosse detectada no
eluato. Este pico protéico é, geralmente, denominado de não-retido. Em seguida, as
proteínas retidas, foram eluídas da coluna utilizando-se o mesmo tampão, acrescido
de cloreto de sódio nas concentrações de 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0M. Todas as etapas
foram realizadas a 4°C. O perfil de eluição protéica das frações da coluna foi
determinado por absorção a 280 nm. Para determinação das atividades enzimáticas,
alíquotas de 20 µL (0,062 µg) destas frações foram ensaiadas a 37°C durante uma
hora com p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo. O p-nitrofenol liberado foi lido a
405 nm em espectrofotômetro.
4.5.2.
Cromatografia de Exclusão Molecular – Sephacryl S – 200
Cerca de 2 mL (1 mg), da fração eluída a 0,2 M de NaCl proveniente da
cromatografia de troca iônica DEAE-Biogel, foi aplicada em cromatografia de
exclusão molecular Sephacryl S-200 (com diâmetro de 104 cm x 0,9 cm), equilibrada
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39
MÉTODOS
com tampão acetato de sódio 0,1 M pH 5.0. As proteínas foram eluídas utilizando-se
o mesmo tampão com o fluxo de 0,4 mL por minuto, sendo coletadas frações de 2
mL/5 min e armazenadas a 4°C até o uso. O perfil de eluição protéica foi monitorado
em espectrofotômetro a 280 nm e para a determinação das atividades enzimáticas,
alíquotas de 50 µL destas frações foram avaliadas a 45°C durante 2 horas com pnitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo. O p-nitrofenol liberado foi lido a 405 nm em
espectrofotômetro.
4.6. Eletroforese em gel de Poliacrilamida em condições desnaturantesSDS/PAGE
Para avaliar o grau de pureza da quitinase e determinar a massa molecular
aparente, alíquotas (20 µg) das frações: extrato bruto, F-III, pico protéico de maior
atividade quitinásica eluído da cromatografia de troca iônica DEAE-Biogel e exclusão
molecular Sephacryl S-200 foram submetidos a uma eletroforese em gel de
poliacrilamida 10% em presença de SDS, de acordo com a metodologia descrita por
LAEMMLI, (1970). As frações foram precipitadas com acido tricloroacético 90% na
razão de 9:1. Após 30 minutos de precipitação em banho de gelo, as amostras foram
centrifugadas durante 15 minutos a 15.000 x g, o sobrenadante foi descartado e ao
precipitado adicionado acetona e uma nova centrifugação foi realizada nas mesmas
condições da anterior. Uma vez descartado o sobrenadante, o precipitado foi
ressuspenso em 20 µL de tampão de amostra (azul de bromofenol 5%, SDS 20% e
sacarose 10%). A corrida eletroforética foi realizada a uma corrente de 30mA por
aproximadamente 2 horas. Para a revelação das bandas protéicas, o gel foi corado
com coomassie blue R 250 0,1% em solução de metanol 40% e ácido acético 10%,
e descorado com a solução de metanol 40% e ácido acético 10%.
Para a detecção de proteínas na ordem de nanogramas, o gel foi corado com
nitrato de prata de acordo com a seguinte metodologia: O gel corado, como já
descrito, foi desidratado seqüencialmente com três lavagens em solução de etanol
50%, por 20 minutos cada. Em seguida, o gel foi colocado sob agitação durante 1
minuto em solução de tiossulfato de sódio 0,02%. Este foi lavado rapidamente três
vezes com água destilada e, em seguida, foi adicionado solução de nitrato de prata
0,2% acrescida de 74 µl de formaldeído 37% mantendo-se por 20 minutos sob
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40
MÉTODOS
agitação. O gel foi lavado novamente três vezes com água destilada e adicionou-se
solução reveladora de carbonato de sódio 6%, acrescida de 50 µl de formaldeído
37% e 2 mL de tiossulfato de sódio 0,02%. A reação foi interrompida com acido
acético 13% após obtida a coloração desejada.
4.7. Estudos Cinéticos
Os experimentos cinéticos foram realizados incubando-se a quitinase, obtida
purificada da cromatografia de exclusão molecular Sephacryl S-200, com o pnitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo como substrato. Os ensaios foram realizados
em duplicatas, com seus respectivos controles negativos (tampão e substrato no
mesmo volume, concentrações, temperaturas e pH dos ensaios).
4.7.1.
Determinação da constante de Michaelis-Menten (Km)
Com o objetivo de se determinar o Km aparente da quitinase para a hidrólise
do p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo, alíquotas de 50 µl (4,05 µg) da enzima
foram incubadas a 55°C durante 2 h com diferentes concentrações finais do pnitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo (0,25; 0,50; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 e
3,5 mM). Os ensaios foram feitos em duplicatas, sendo interrompidos com 1 mL de
NaOH 0,25 N e o p-nitrofenol liberado lido em espectrofotômetro a 405 nm.
Controles negativos dos substratos foram feitos para cada concentração utilizada.
Os valores de Km foram calculados por meio do programa de computador ORIGIN
5.0.
4.7.2.
Efeito da temperatura sobre a atividade enzimática
A influência da temperatura sobre a atividade da quitinase foi realizada
incubando-se 50 µl (4,05 µg) desta e 1,5 mM do p-nitrofenil-N-acetil-β-Dglucosaminídeo durante 2 horas nas temperaturas de 4; 25; 37; 45; 50; 55; 60; 70 e
80°C. Transcorrido cada ensaio as reações foram interrompidas como descrito em
3.3.
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41
MÉTODOS
A fim de testar a estabilidade da quitinase frente a variadas temperaturas,
foram feitas pré-incubações usando 50 µl (4,05 µg) da enzima durante 30 minutos a
25, 37, 45, 50, 55, 60, 70, 80 e 100°C na ausência do substrato. Transcorrido o
tempo,
o
p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo
foi
adicionado
para
uma
concentração final de 1,5 mM e incubado a 55°C durante 2 h. Em seguida as
reações foram interrompidas como descrito em 3.3.
4.7.3. Influência do pH sobre a atividade enzimática
Para a realização destes experimentos alíquotas de 200 µl (16,2 µg) da
quitinase foram dialisadas durante 18 horas contra os tampões: glicina-HCl pH 3,0;
3,5 e 4,0; acetato de sódio pH 4,0; 5,0 e 5,5; fosfato de sódio pH 5,5; 6,0 e 7,0 e
Tris-HCl pH 7,0; 8,0 e 9,0. Todos os tampões estavam na concentração de 0,1 M.
Após a diálise alíquotas de 50 µl (4,05 µg) da enzima dialisada, nos tampões já
citados, foram incubadas com 1,5 mM de p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo
durante 2 horas a 55°C. Transcorrido o tempo de ensaio as reações foram
interrompidas e quantificadas a 405 nm em espectrofotômetro.
A fim de testar a estabilidade da quitinase frente a variações de pHs,
alíquotas de 200 µl (16,2 µg) da quitinase foram dialisadas durante 18 horas contra
os tampões: glicina-HCl pH 3,0; 3,5 e 4,0; acetato de sódio pH 4,0; 5,0 e 5,5; fosfato
de sódio pH 5,5; 6,0 e 7,0 e Tris-HCl pH 7,0 ;8,0 e 9,0. Foram feitas pré-incubações
usando 50 µl (4,05 µg) da enzima durante 30 minutos a 50°C na ausência do
substrato. Transcorrido o tempo, o p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo foi
adicionado para uma concentração final de 1,5 mM e incubado a 55°C durante 2 h.
Em seguida as reações foram interrompidas como descrito em 3.3.
β4.7.4. Influência de diversos sais e EDTA na hidrólise do p-nitrofenil-N-acetil-β
D-Glucosaminídeo.
Alíquotas de 50 µL (4,05 µg) da enzima foram pré-incubadas a 50°C, durante
15 minutos, na presença de diversos sais e EDTA a uma concentração final de 10
mM.
Transcorrido
este
tempo,
foi
adicionado
o
p-nitrofenol-N-Acetil-β-D-
Glucosaminídeo numa concentração final de 1,5 mM e procedemos com o ensaio a
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42
MÉTODOS
55°C, e após 2 h, os ensaios foram interrompidos com 1mL de NaOH 0,25 N e o pnitrofenil liberado, lido em espectrofotômetro a 405 nm. Os sais utilizados nesse
experimento foram: Cloreto de Magnésio (MgCl2), Cloreto de Potássio (KCl), Cloreto
de Cálcio (CaCl2), Tiossulfato de sódio pentahidratado (Na2S2O25H2O), Sulfato de
sódio (Na2SO4), Fosfato de sódio dibasico (NaH2PO4), Fosfato de sódio monobásico
(Na2HPO4.H2O), Citrato de sódio(NaC6H5O7), cloreto de sódio (NaCl), além do ácido
etilenodiamino tetra-acético (EDTA).
4.8. Preparação da quitinase para os ensaios biológicos
A Litochitinase1, foi submetida a precipitação em 2 volumes de acetona,na
qual esta foi adicionada lentamente sobre a amostra sofrendo leve agitação e,
posteriormente deixada por 18h a 4°C (geladeira). Em seguida foi centrifugada a
12.000 x g, o sobrenadante descartado e o precipitado ressuspenso em tampão
acetato de sódio 0,1 M pH 5,0 para a realização dos ensaios biológicos. Todos estes
processos foram executados a 4°C.
4.9.
4.9.1.
Avaliação da atividade antimicrobiana
Análise Qualitativa- Técnica de Difusão em Disco
Para avaliação in vitro da atividade antimicrobiana da quitinase foi
inicialmente aplicada à técnica de difusão em disco (BAUER et al., 1966). A partir
de cultivo em Ágar Mueller-Hinton e Ágar Saboraund foram preparadas suspensões
ajustadas pela escala 0,5 Mc Farland, para as bactérias (Staphylococcus aureus) e
leveduras (Candida albicans e Candida tropicalis). Em seguida as suspensões foram
plaqueadas em Ágar Mueller-Hinton e Saboraund para as bactérias e leveduras,
respectivamente. Posteriormente Discos de papel filtro (Whatman 6 mm), foram
impregnados, com 20 µL da quitinase nas concentrações de 676 µg/mL e 1600
µg/mL, e fixados sobre a superfície do meio inoculado (Quadro 1). As placas foram
incubadas em estufa bacteriológica por 24 horas, a 35 ºC. Os halos de inibição do
crescimento bacteriano e fúngico foram medidos em milímetros com auxílio de uma
régua milimetrada. Foi realizado o controle negativo utilizando, água destilada e/ ou
tampão acetato de sódio 100 mM, pH 5,0.
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43
MÉTODOS
Quadro 1: Técnica de Difusão em Disco, cepas selecionadas e concentrações da
quitinase utilizada
TÉCNICA
MICROORGANISMO
AMOSTRA TESTADA
(QUITINASE)
Difusão em
disco
S. aureus
676 µg/mL Acetato de sódio 100 mM, pH 5,0
C. albicans
1600 µg/mL Acetato de sódio 100 mM, pH 5,0
1600 µg/mL água
C. tropicalis
4.9.2.
Ánalise
Quantificativa-
1600 µg/mL Acetato de sódio 100 mM, pH 5,0
Determinação
da
Concentração
Inibitória
Mínima (CIM)
A CIM foi obtida por meio do método de Microdiluição em caldo, de acordo
com a metodologia descrita no Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI
2003). Os microorganismos utilizados nesta técnica foram: Staphylococcus aureus,
Candida albicans, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa.
A quitinase apartir de diluições seriadas foi testadas nas concentrações finais
de 800, 400, 200 e 100 µg/mL. O teste foi realizado pela distribuição em placas de
microdiluição estéreis contendo 96 poços, em cada orifício teste e de controle de
crescimento foram adicionados 20 µL de inoculo microbiano e 100 µL dos meios BHI
e caldo Saboraund para bactérias e leveduras, respectivamente. Os orifícios testes
receberam também 50 µL da quitinase na concentração inicial de 1.600 mg/mL, já os
orifício contendos os controles negativos continham 50 µL de tampão acetato de
sódio 100 mM, pH 5,0 e os controles positivos continham 20 µL de gentamicina na
concentração de 40 µg (Quadro 2). Em seguida, as placas foram incubadas em
estufa bacteriológica por 24 horas, a 37 ºC para as bactérias e por 24 horas, a 28 ºC
para as leveduras. Para leitura, que foi realizada visualmente, após o tempo de 3 h,
foram adicionados 20 µL de cloreto de, 2,3,5 – trifenil – tetrazólio (CTT) em cada
orifício, indicador
de
multiplicação
bacteriana,
que apresenta coloração
avermelhada na presença de células viáveis.
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44
MÉTODOS
Quadro 2: Técnica de Microdiluição em Caldo, cepas selecionadas e
concentrações da quitinase utilizada
TÉCNICA
MICROORGANISMO
AMOSTRA TESTADA
(QUITINASE)
800µg/mL Acetato de sódio 100 Mm, pH 5,0
C. albicans
800 µg/mL água
Microdiluição
em Caldo
S. aureus
800 µg/mL Acetato de sódio 100 Mm, pH 5,0
E. coli
800µg/mL Acetato de sódio 100 Mm, pH 5,0
800 µg/mL água
P.aeruginosa
800µg/mL Acetato de sódio 100 Mm, pH 5,0
*Para os ensaios de microdiluição em caldo foram realizadas diluições seriadas
4.10. Ensaios com Aedes aegypti
4.10.1. Obtenção das larvas de Aedes aegypti
Armadilhas (Ovitrampas) foram colocadas em diversos pontos no Campus
Universitário da UFRN e no Bairro Nordeste (elevado índice de infestação predial),
Natal-RN. Semanalmente as palhetas foram trazidas para o LABENT, Laboratório
de Entomologia Médica da UFRN, e após a contagem dos ovos, foram submersas
em uma bandeja plástica (30 cm x 20 cm x 15 cm) com água limpa contendo ração
para peixes autoclavada. Após a eclosão as palhetas foram removidas e as larvas
identificadas em microscópio estereoscópico como sendo de Aedes aegypti, onde
posteriormente foram utilizadas nos ensaios.
4.10.2. Dissecação das larvas de A. aegypti
Cem larvas de A. aegypti no quarto instar foram dissecadas em banho de
gelo, com o auxílio de uma lupa, e trato intestinal das larvas foi exposto utilizando-se
pinças e transferido para microtubos de ensaio contendo solução tampão Tris-HCl
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45
MÉTODOS
50 mM pH 7,5. Todos os materiais coletados foram mantidos a -20°C, até a extração
do homogenato intestinal e utilização nos ensaios de inibição.
4.10.3.
Preparo do homogenato intestinal das larvas
O homogenato intestinal foi preparado seguindo a metodologia estabelecida
por TERRA et al. (1997), com algumas modificações. Os intestinos das larvas dos
insetos foram homogeneizados com o auxílio de um pistilo em tubos eppendorff, em
banho de gelo, por aproximadamente 10 minutos, usando-se como extrator 800 µL
de Tris-HCl 50 mM pH 7,5. Em seguida os homogenatos foram centrifugados a
10.000 x g durante 15 minutos a 4°C. Os sobrenadantes obtidos foram utilizados
posteriormente para os ensaios de inibição.
4.10.4. Detecção de quitina no intestino das larvas de A. aegypti
Os intestinos das larvas foram retirados com auxílio de pinça e bisturi, e em
seguida reservados. Os intestinos foram então lavados para a remoção dos
conteúdos luminais remanescentes. A presença da quitina foi verificada por meio do
teste de Von Wisselingh (ROGER; PERKINS, 1968). Este teste qualitativo detecta
quitosana produzida após tratamento térmico do material contendo quitina, com
NaOH saturado por 15 minutos a 160 °C. Resíduos foram lavados com diferentes
concentrações de álcool etílico: 10, 20, 30, 40, 80 e 95%. Após a reação, a presença
de quitina foi observada com solução de lugol e, em seguida, ácido sulfúrico a 1%.
Controle positivo foi feito utilizado quitina de lagosta e para controle negativo foi
utilizado celulose.
4.10.5. Ensaios com larvas de A. aegypti
A atividade larvicida da Litochitinase1 foi avaliada utilizando uma adaptação
da Organização Mundial de Saúde (1981). Cinco larvas do quarto estádio (L4) foram
colocadas em recipientes plásticos descartáveis contendo os extratos brutos, F-III e
S-200. As concentrações utilizadas para o extrato bruto foram 1,55; 3,8; 5,7 e 7,22
mg/mL. Já as concentrações para a F-III foram 1,23; 1,84; 3,08 e 4,31 mg/mL e para
a Litochitinase1 foram utilizadas as seguintes concentrações: 0,472; 0,675; 0,9 e
1,12 mg/mL. O volume final do ensaio larvicida foi de 20 mL de solução de teste ou
controle negativo. Os
ensaios foram
realizados em
Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
quadruplicatas
e
a
taxa
Roberta L. N. Godone
46
MÉTODOS
de mortalidade das larvas foi determinada após 24 e 48 h de incubação a 28 ± 2 ° C
com fotoperíodo de 12/12 h (claro-escuro). As larvas foram consideradas mortas
quando não respondiam a estímulos mecânicos como, por exemplo, a agitação aos
recipientes plásticos.
4.10.6. Determinação da EC50
A concentração da quitinase que mata 50% das larvas L4 da Aedes aegypti
foi determinada pela construção de uma curva regressão linear simples a qual
relaciona o percentual de mortalidade com a concentração de enzima utilizada no
ensaio.
4.10.7. Análises Estatísticas
A análise estatística dos dados experimentais foi realizada utilizando o
software de computador GraphPad Prisma 5® para Windows® (GraphPad Software,
Inc, USA), para determinar a significância das diferenças (p <0,05) entre os
tratamentos, por meio dos testes ANOVA e Kruskal-Wallis.
4.10.8. Investigação
de
proteínas
bioativas
interferentes
no
processo
digestório nas larvas de Aedes aegypti
4.10.8.1. Ensaio de inibição de proteases serínicas
a)
Preparo do Substrato
Azocaseína a 1% e 1,5% (substrato protéico) foi solubilizada em 50 mL de
tampão Tris-HCL 50 mM pH 7,5. A solução foi fervida por cerca de 10 minutos. Após
resfriamento o volume foi completado com água destilada. A solução foi conservada
a -20 ºC até sua utilização.
b)
Atividade anti-quimotríptica
A atividade inibitória sobre a quimotripsina foi determinada utilizando 20 µL de
solução de quimotripsina bovina (0,2 mg/mL em tampão Tris-HCL 50 mM, pH 7,5,
contendo CaCl2 20 mM) pré-incubada em tampão Tris-HCL 50 mM, pH 7,5, contendo
CaCl2 20 mM e 100 µL das amostras enzimáticas (EB (1557,7 µg) , F-III (1121,4 µg)
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47
MÉTODOS
e a Litochitinase1 (8,1µg)) por 15 minutos a 37 °C. Após esse período, a reação foi
iniciada adicionando-se 200 µL de azocaseína 1%. Descorridos 30 minutos, a
reação foi interrompida adicionando-se 300 µL de solução de TCA 20%. A mistura
da reação foi centrifugada a 12.000 x g por 10 minutos e o sobrenadante
alcalinizado com NaOH 2 N na proporção de 1:1. A absorbância foi medida em
espectrofotômetro a 440 nm. Provas em branco foram realizadas e os ensaios foram
realizados em triplicatas.
c)
Atividade anti-tríptica
A atividade anti-tríptica foi determinada utilizando azocaseína como substrato
alíquotas de 20 µL de solução de tripsina bovina (0,3 mg/mL em tampão Tris-HCl 50
mM pH 7,5), foram pré-incubadas por 15 minutos a 37 °C, com 120 µL de HCl 2,5
mM, 350 µL de tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5 e 200 µL da amostra (EB (3115,4
µg), F-III (2242,8 µg) e a Litochitinase1(16,1 µg)). Após isso a reação foi iniciada
adicionando-se 200 µL de azocaseína 1%. Descorridos 30 minutos, a reação foi
interrompida adicionando-se 300 µL de solução de TCA 20%. A mistura da reação
foi centrifugada a 12.000 x g por 10 minutos e o sobrenadante alcalinizado com
NaOH 2 N na proporção de 1:1. A absorbância foi medida em espectrofotômetro a
440 nm. Provas em branco foram realizadas e os ensaios foram realizados em
triplicatas.
4.10.8.2. Ensaios de Hemaglutinação
a)
Preparo do sangue
Alíquotas de 2 mL de sangue foram lavadas com 8 mL de solução salina
fisiológica e centrifugadas a 924 x g, até a obtenção de uma massa de eritrócitos
íntegros livre de soro e material hemolisado.
b)
Tratamento dos eritrócitos com Papaína
Uma solução estoque de papaína de 1 mg/mL em solução salina foi
adicionada aos eritrócitos, previamente lavados na proporção de 1:1 (v/v). A mistura
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48
MÉTODOS
foi incubada por 30 minutos a 37 °C, com leve agitação ocasional, Em seguida foi
centrifugada a 924 x g, por 5 minutos e seu precipitado foi lavado 6 vezes com
solução salina. Realizou-se o hematócrito e em seguida uma solução de eritrócitos
na concentração de 4% foi preparada.
c)
Tratamento dos eritrócitos com Tripsina
Uma solução estoque de tripsina na concentração de 1mg/mL foi preparada e
adicionada a 1 mL de eritrócitos, previamente lavados. A mistura foi deixada em
repouso por 1 hora, a temperatura ambiente, com leve agitação ocasional. Em
seguida, foi centrifugada a 924 x g, por 5 minutos e seu precipitado lavado por 6
vezes com solução salina. Realizou-se o hematócrito e uma solução de eritrócitos
diluída a 4% em solução salina foi preparada.
d)
Ensaio
Os testes de hemaglutinação foram realizados por meio de diluição seriada
das amostras testes em microplacas com fundo em “V”. No primeiro poço foram
adicionados 25 µL da amostra (EB (389,4 µg) e/ou F-III (280,3 µg) e/ou
Litochitinase1 (2 µg)) e 25 µL de uma suspensão de eritrócitos a 4% tratados
enzimaticamente enquanto que, a partir do segundo em diante foram adicionados 25
µL de solução salina, 25 µL da amostra diluída seriadamente e 25 µL da suspensão
de eritrócitos a 4%, submetido a tratamentos enzimáticos. A reação foi incubada por
1 hora, a temperatura ambiente. O grau de aglutinação foi observado visualmente e
o título expresso em unidade de hemaglutinação (UH), que é definido como o
inverso da maior diluição da amostra que tenha apresentado nítida aglutinação
(MOREIRA et al., 1977).
4.10.8.3. Efeito do homogenato intestinal das larvas de A. aegypti sobre a
atividade quitinolítica
a)
Determinação de atividade Azocaseinolítica
A atividade azocaseinolítica foi pesquisada por incubação de 30, 50 e 70 µL
de homogenato intestinal com 450 µL de tampão Tris-HCl 50mM pH 7,5 e 500 µL de
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49
MÉTODOS
solução de azocaseína 1,5% por 30 minutos a 37 °C. A reação foi paralisada com
150 µL de TCA 20%. Transcorridos 30 minutos, a suspensão foi centrifugada por 15
minutos, a 12000 x g a temperatura ambiente. Alíquotas de 800 µL do sobrenadante
foram alcalinizadas com 800 µL de NaOH 2 N. Todos os ensaios foram feitos em
triplicatas e provas em branco foram realizadas. A atividade azocaseinolítica foi
medida pela absorbância a 440 nm.
b)
Efeito da temperatura sobre a atividade azocaseinolítica a pH 7,5
O efeito da temperatura foi avaliado utilizando as seguintes temperaturas: 5,
10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 e 90 °C. Os ensaios foram realizados com descrito no
item 4.11.4.
c)
Influência das enzimas digestivas do A. aegypti na hidrólise do pβ-D-Glucosaminídeo
nitrofenil-N-acetil-β
Alíquotas de 50 µL (4,05 µg) da Litochitinase1 foram pré-incubadas a 50°C,
durante 15 minutos, na presença do homogenato intestinal das larvas do mosquito
A. aegypti. Transcorrido este tempo, foi adicionado o p-nitrofenol-N-Acetil-β-DGlucosaminídeo numa concentração final de 1,5 mM e procedemos com o ensaio a
55°C, e após 2 h, o ensaio foi interrompido com 1 mL de NaOH 0,25 N e o pnitrofenil liberado, lido em espectrofotômetro a 405 nm.
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50
RESULTADOS
5. RESULTADOS
5.1. Identificação de glicosidases e sulfatases nos cefalotórax dos camarões
marinhos Litopenaeus schmitti
A identificação das atividades enzimáticas foi pesquisada no EB e nas frações
precipitadas com sulfato de amônio (F-I, F-II e F-III) obtidas dos cefalotórax dos
camarões. Para isso foram utilizados alguns substratos sintéticos derivados de
açúcar. Os resultados mostraram a presença de quase todas as atividades
enzimáticas pesquisadas no extrato bruto, F-I, F-II e F-III (Figura 07).
É possível observar ainda, no gráfico da figura 07, que os ensaios utilizando o
EB e as amostras F-I, F-II e F-III, mostraram que, de todas as atividades
pesquisadas, a N-acetil-β-D-glucosaminidase (quitinase) foi a que mais se
sobressaiu em todos estes testes apresentado maior atividade específica na F-III.
Devido a isto a F-III, foi submetida ao fracionamento em cromatografia de troca
iônica DEAE-Biogel.
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51
RESULTADOS
0,03
β-D-glucosaminidase
0,025
α-D-glucosaminidase
0,02
Sulfatase
0,015
α-D-galactosaminidase
0,01
N-acetil-β-D-glucosaminidase
0,005
0
Bruto
F-I
F-II
F-III
Frações
Figura 07: Atividades enzimáticas presentes no extrato bruto e nas frações obtidas da precipitação
com sulfato de amônio do cefalotórax do camarão marinho Litopenaeus schmitti.
Alíquotas das frações do extrato bruto, F-I, F-II e F-III foram incubadas com cada p-nitrofenil para
uma concentração final de 10 mM a 37 ºC, durante 30 minutos. Estas foram interrompidas pela
adição de 1 mL de NaOH 0,25 N e o p-nitrofenol liberado é lido em espectrofotômetro a 405 nm.
Onde: Bruto, é o extrato bruto antes da precipitação com sulfato de amônio, F-I, F-II e F-III, frações
precipitadas com 0-30%, 30-50% e 50-80% de sulfato de amônio, respectivamente. A atividade
específica foi encontrada através da relação entre a quantidade de p-nitrofenol liberado e a massa
em µg de proteína contida no volume de cada fração ensaiada, por um período de 30 minutos.
5.2.
Purificação da Quitinase
5.2.1. Em cromatografia de troca-iônica DEAE-Biogel
A fração F-III, por ser mais rica na atividade quitinásica, foi submetida (9,32
mg) a cromatografia de troca iônica DEAE-Biogel. Nesta etapa de purificação
observou-se inicialmente a eluição de um pico não retido, eluído com o tampão de
equilíbrio da coluna e, em seguida, a eluição de picos protéicos utilizando-se as
concentrações de NaCl de: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0M (Figura 08). Todas as frações
eluídas
da
cromatografia
foram
incubadas
com
o
p-nitrofenil-N-acetil-β-D-
glucosaminídeo para o acompanhamento da atividade enzimática e eluição da
quitinase. Estes testes mostraram a eluição da quitinase apenas no pico protéico
eluído com 0,2 M de NaCl. Nas outras molaridades de NaCl, não observou-se a
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52
RESULTADOS
presença de atividade enzimática (Figura 08). O pico protéico e de atividade
quitinásica eluído com 0,2 M de NaCl foram reunidos, dialisados contra tampão
acetato de sódio 0,1 M pH 5,0, concentrados com dois volumes de acetona e
NR
0,2
0,18
0,16
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
1
9
0,2 M
17
25
0,4 M
33
proteina
41
0,6 M
49 57 65
Frações
1M
0,8 M
73
81
89
0,5
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
D.O. 405 nm
D.O. 280 nm
aplicado em cromatografia de exclusão molecular Sephacryl S-200.
97 105
Atividade
N-acetil-beta-D-glucosaminidase
Figura 08: Perfil de eluição protéico da F-III em cromatografia de troca iônica e de atividade
quitinásica.
Cerca de 2 mL da F-III (~9,32 mg) foi submetida a cromatografia de troca iônica. A coluna com cerca
3
de 10 cm de gel foi equilibrada em tampão fosfato de sódio 0,02 M pH 8,0. A eluição (fluxo de 1
mL/3 min) foi realizada com o mesmo tampão até que a leitura de proteínas se aproximasse de zero,
em seguida, utilizamos como tampão de eluição (fosfato de sódio 0,02 M pH 8,0 acrescido de NaCl
nas concentrações de 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1 M). As proteínas das frações eluidas (1 mL) foram lidas a
280 nm e o perfil das atividades realizado com o p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminideo com
leituras a 405 nm.
5.2.2. Em cromatografia de Exclusão molecular
O pico protéico eluído com 0,2 M de NaCl oriundo da cromatografia de trocaiônica que apresentou atividade enzimática, foi aplicado em cromatografia de
exclusão molecular Sephacryl S-200. Esta cromatografia revelou um pico protéico de
elevada absorbância a 280 nm, mas sem atividade enzimática (Figura 09). A
quitinase foi eluída em um pequeno pico protéico, anterior ao principal, e com
elevada atividade específica. Este pico protéico foi visualizado em SDS-PAGE e
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53
RESULTADOS
posteriormente utilizado nos testes cinéticos. Esta fração por ser rica em atividade
quitinásica, a enzima foi denominada Litochitinase1.
Figura 09: Perfil de eluição da Litochitinase1 e atividade quitinásica em cromatografia de exclusão
molecular (Sephacryl S-200).
A coluna foi equilibrada e eluída com tampão acetato de sódio 0,1 M pH 5,0. Foram coletadas
frações de 2 mL/5 min. A eluição das proteínas foi monitorada em espectrofotômetro a 280 nm e o
perfil das atividades com o p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo determinadas por leitura a 405
5.2.3. Resumo das etapas de purificação protéica
As etapas utilizadas na purificação da Litochitinase1 estão sumarizadas na
tabela de purificação (Tabela 3). É possível identificar um índice de purificação final
de 987,32 vezes e uma recuperação de 2,62%, com a remoção de uma grande
quantidade de proteínas durante o processo de isolamento entre as etapas F-III e as
cromatografias.
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54
RESULTADOS
Tabela 3: Etapas de purificação da Litochitinase1
Etapas
Proteína
Ativ. total
Ativ.
Purificação
Recuperação
total (mg)
(U)
Específica
(X)
(%)
(U)
EB
4501,06
1551,200
0,34
1
100
F-III
396,414
265,625
0,67
2
17,12
DEAE-Biogel
51,026
37,050
0,72
2,12
2,38
Litochitinase1
0,12129
40,716
335,69
987,32
2,62
Tabela construída utilizando-se os resultados obtidos nos ensaios enzimáticos com o pnitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminideo. Onde: Atividade Total (U) = 1U corresponde a 0,01
unidade de absorbância a 405 nm; Purificação = Razão entre a atividade específica em cada
passo de purificação e a atividade específica do extrato bruto; Recuperação = Percentual de
atividade total em cada passo de purificação em relação a atividade total no extrato bruto
(100%).
5.3. Perfil eletroforético das amostras em SDS-PAGE
Para avaliar o grau de pureza e determinar a massa molecular aproximada da
Litochitinase1, alíquotas do EB, F-III, pico 0,2 M da DEAE-Biogel e pico de atividade
da S-200 foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de
SDS (Figura 10). A análise do gel mostrou um grau de pureza relevante do pico com
atividade da S-200 onde apenas uma banda protéica é observada na região de 28,5
kDa. Esse valor foi determinado pela correlação entre o logarítimo do peso
molecular das proteínas padrões versus o logarítimo de migração das proteínas.
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55
RESULTADOS
kDa
230
130
95
72
56
36
28,5 kDa
28
M
EB
F-III
0,2 M
Litochitinase1
Figura 10: SDS-PAGE das amostras protéicas durante o processo de purificação
Onde: M- mistura de proteínas de diferentes pesos moleculares utilizadas como padrão, EB- extrato
bruto, F-III, fração precipitada com 50-80% de sulfato de amônio, 0,2M de NaCl na cromatografia de
troca-iônica e Litochitinase1 eluída na cromatografia de exclusão molecular.
5.4. Experimentos cinéticos
A Litochitinase1 foi utilizada para realizar os estudos cinéticos. Nestes
experimentos foi utilizado p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminideo como substrato,
variando-se sua concentração, como também as condições de temperatura e pH dos
ensaios.
5.4.1. Determinação do Km
Estes experimentos foram realizados incubando-se a Litochitinase1 com
diferentes concentrações do substrato (Figura 11). Os resultados mostraram um Km
aparente de 0,51 mM obitido pelo calculo utilizando o programa ORIGIN 5.0.
Observa-se ainda que a partir da concentração de 1,5 mM de substrato, a atividade
enzimática tende a estabilizar até atingir a velocidade máxima da reação.
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RESULTADOS
Velocidade
(V)nm)
Absorbância
(405
0,55
0,50
0,45
0,40
Km 0, 51232
0,35
Data: Data1_mean
Model: Hyperbl
Chi^2 = 0.00046
P1
0.61317
P2
0.51232
0,30
0,25
±0.02175
±0.0667
0,20
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
[S]
Figura 11: Determinação do Km da Litochitinase1
50 µl da quitinase (4,05 µg) foram incubadas a 55 ºC por 2 horas com diferentes concentrações
(0,25; 0,50; 0,75; 1; 1,25; 1,5; 2; 2,5; 3 e 3,5 mM) de p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminideo.
Transcorrido este tempo, as reações foram interrompidas e o p-nitrofenil lido a 405 nm. O
experimento foi realizado em duplicatas e o resultado apresentado, no gráfico representa as
médias com seus respectivos desvios padrões.
5.4.2. Efeito da temperatura sobre a atividade enzimática
Neste estudo incubou-se a Litochitinase1 com o substrato sob diferentes
temperaturas. Após o ensaio foi observado que a 55°C ocorre maior atividade
quitinásica (Figura 12), embora na temperatura de 50°C ainda se observe quase
73% da atividade enzimática, mas esta decai consideravelmente em temperaturas
acima de 55°C.
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57
RESULTADOS
120
100
Atividade %
80
60
40
20
0
4 °C
25°C
37°C
45°C
50°C
55°C
60°C
70°C
80°C
0
Temperatura C
Figura 12: Efeito da temperatura sobre a atividade da Litochitinase1
50 µl da quitinase (4,05 µg) foram incubados com 1,5 mM de p-nitrofenil-N-acetil-β-Dglucosaminideo em diferentes temperaturas durante 2 horas. Transcorrido o tempo, as reações
foram interrompidas como descrito em métodos. O experimento foi realizado em duplicatas e o
resultado apresentado no gráfico representa as médias com seus respectivos desvios padrões.
A estabilidade térmica foi pesquisada pré-incubando a Litochitinase1, em
diferentes temperaturas. A Figura 13 mostra que nas temperaturas de 25, 37 e 45°C
a atividade enzimática permanece estável. No entanto observa-se que nas
temperaturas de 50 e 55°C ocorre uma potencialização da atividade enzimática e
que coincide com a temperatura ótima de atividade da enzima. Ainda observa-se
uma atividade considerável a uma temperatura de 60°C e que cai até a completa
perda de atividade enzimática a 70, 80 e 100°C.
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RESULTADOS
140
Atividade residual (%)
120
100
80
60
40
20
0
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0
Temperatura de pré-incubação ( C)
Figura 13: Efeito da pré-incubação a diferentes temperaturas na atividade da Litochitinase1
50 µl da quitinase (4,05 µg) foi pré-incubada durante 30 minutos a 25, 37, 45, 50, 55, 60, 70, 80 e
100°C na ausência do substrato. Transcorrido o tempo, o p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo foi
adicionado para uma concentração final de 1,5 mM e incubado a 55°C durante 2 h. Em seguida as
reações foram interrompidas como descrito em métodos.
5.4.3. Efeito do pH sobre a atividade da Litochitinase1
O efeito do pH sobre a catálise do substrato foi avaliado. Observou-se que a
maior atividade enzimática sobre o substrato ocorreu na faixa entre os pH 5,0 e 6,0
(Figura 14), embora o gráfico mostre atividade ótima em pH 5,5, os erros
experimentais (não plotados) demonstram que estas diferenças não são
significativas. Em pH 4,0 e 8,0 a atividade da enzima cai consideravelmente.
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59
RESULTADOS
Tampão
Tampão
Tampão
Tampão
120
Atividade (%)
100
Glicina
Acetato de sódio
Fosfato de sódio
Tris
80
60
40
20
0
3
4
5
6
7
8
9
pH
Figura 14: Efeito do pH sobre a atividade da Litochitinase1
Alíquotas de 200 µl (16,2 µg) da quitinase foram dialisadas durante 18 horas contra os tampões:
glicina-HCl pH 3,0; 3,5 e 4,0; acetato de sódio pH 4,0; 5,0 e 5,5; fosfato de sódio pH 5,5; 6,0 e 7,0
e Tris-HCl pH 7,0;8,0 e 9,0. Todos os tampões estavam na concentração de 0,1 M. Após a diálise
alíquotas de 50 µl da enzima foram incubadas com 1,5 mM de p-nitrofenil-N-acetil-β-Dglucosaminídeo durante 2 horas a 55°C. Transcorrido o tempo de ensaio as reações foram
interrompidas e quantificadas a 405 nm em espectrofotômetro.
A estabilidade frente ao pH foi estimada pela determinação da atividade da
Litochitinase1, após pré-incubação por 30 minutos a diferentes pHs. De acordo com
o gráfico da figura 15, a quitinase não é estável em pHs muito ácidos e muito
básicos, perdendo completamente a sua atividade. A estabilidade da enzima é
atingida numa faixa de pH entre 4,0 – 5,5, embora a Litochitinase1 apresente um
pico de atividade no pH 7,0.
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60
Atividade Residual (%)
RESULTADOS
Glicina-HCl
Acetato de Sódio
Fosfato de Sódio
Tris-HCl
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
-10
-20
-30
-40
-50
3
4
5
6
7
8
9
pH
Figura 15: Efeito da pré-incubação a diferentes pHs na atividade da Litochitinase1
Alíquotas de 200 µl da quitinase foram dialisadas durante 18 horas contra os tampões: glicina-HCl pH
3,0 e 3,5; acetato de sódio pH 4,0 e 5,0; fosfato de sódio pH 5,5 e 6,0; e Tris-HCl pH 7,0, 8,0 e 9,0.
Todos os tampões estavam na concentração de 0,1 M. Após a diálise alíquotas de 50 µl das enzimas
foram pré-incubadas durante 30 minutos em suas temperaturas ótimas, na ausência do substrato.
Transcorrido o tempo, o p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo foi adicionado na concentração de
10 mM e incubado na temperatura ótima da enzima durante 2 h. Em seguida as reações foram
interrompidas como descrito na metodologia.
5.4.4. Efeito de sais e EDTA sobre a atividade enzimática
O efeito de sais e EDTA sobre a atividade da Litochitinase1 foi estimada pela
determinação da atividade, após a pré-incubação com vários compostos. De acordo
com a tabela 4, a Litochitinase1 apresentou sua atividade enzimática levemente
reduzida na presença do Na2HPO4 (5%). Por outro lado, os sais NaCl, KCl, NaH2PO4
e HgCl2, afetaram de forma expressiva a atividade enzimática, reduzindo-a em
aproximadamente: 28, 30, 40 e 98%, respectivamente (valores aproximados). O sal
MgCl2 foi o único que estimulou (~8%) levemente a atividade enzimática da
quitinase. CaCl2, Na2SO4, EDTA e o NaC6H5O7 não interferiram na atividade da
enzima.
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61
RESULTADOS
Tabela 4: Efeitos de íons e compostos sobre a atividade da
Litochitinase1
Sais e EDTA
Ativ. Residual (%)
MgCl2
107,6 ± 4,2
KCl
71,4 ± 3,4
CaCl2
100,09 ± 5,3
Na2S2O25H2O
99,09± 4,07
Na2SO4
99,59 ± 2,26
HgCl2
1,09 ± 0,137
NaH2PO4
57,635 ± 7,04
Na2HPO4
91,405 ± 3,68
NaC6H5O7
98,025 ± 1,58
NaCl
80,39 ± 9,07
EDTA
96,075 ± 0,40
A enzima foi pré-incubada durante 15 minutos com cada sal e/ou EDTA antes de
ser iniciado o ensaio. Os resultados foram apresentados com as médias seguidas
de seus respectivos desvios padrões.
5.5.
Avaliação da atividade antimicrobiana
5.5.1. Utilizando a técnica de difusão em disco
Para se avaliar as atividades antimicrobianas foi, inicialmente, utilizada a
técnica de difusão em disco. Os resultados obtidos com a Litochitinase1 em estudo,
não produziram halos de inibição para os microrganismos testados, sugerindo
ausência de atividade antimicrobiana sobre estirpes de: S. aureus, C. tropicalis, e C.
albicans. Os discos utilizados como controle negativo (tampão acetato de sódio 100
mM, pH 5,0/água), também não demonstraram qualquer atividade inibitória sobre os
microorganismos (Dados não mostrados).
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62
RESULTADOS
5.5.2. Utilizando a técnica de microdiluição em caldo para determinação da
Concentração Inibitória Mínima (CIM)
Na técnica de microdiluição em caldo os valores de CIM foram obtidos por
diluições sucessivas e determinados por leitura visual. Os resultados obtidos com a
Litochitinase1, não apresentaram atividade contra os microorganismos: S. aureus, C.
albicans e P. aeruginosa. Apresentando atividade antimicrobiana apenas para o
microorganismo E. coli variando de uma concentração de 800 a 500 µg/mL (Tabela
5).
Tabela 5: Avaliação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) da Litochitinase1
do cefalotórax do camarão marinho Litopenaeus schmitti.
Cepas utilizadas
Concentração
Atividade
utilizada
antimicrobiana
S. aureus
-
-
C. albicans
-
-
E. coli
800 - 500 mg/mL
+
P. aeruginosa
-
-
(-) Não apresentou atividade antimicrobiana nas concentrações testadas; (+) Apresentou atividade
antimicrobiana nas concentrações testadas.
5.6.
Ensaios com os Aedes aegypti
5.6.1. Detecção de quitina no intestino médio de larvas de Aedes aegypti
A fim de detectar a presença de quitina no intestino médio das larvas de Aedes
aegypti foi utilizado o método químico qualitativo de Von Wisseling. Os resultados
confirmaram a presença de quitina no intestino médio de larvas destes insetos
(Tabela 6).
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63
RESULTADOS
Tabela 6: Detecção de quitina em intestinos médios de Aedes aegypti
Teste de Von Wisseling
Coloração marrom
(lugol)
Coloraçao
violeta (H2SO4)
Quitina de lagosta
+
+
Intestinos de Aedes
aegypti
+
+
Algodão
ND
ND
(ND) não detectado; (+) detecção. Controle positivo: quitina de lagosta; Controle negativo:
algodão
5.6.2. Ensaio larvicida em Aedes aegypti
Estes experimentos foram feitos com o intuito de analisar o efeito larvicida da
Litochitinase1 sobre larvas do quarto instar de A. aegypti. Cinco larvas (L4) foram
colocadas em recipientes plásticos descartáveis contendo alíquotas do EB, F-III e a
Litochitinase1, em concentrações crescentes, e seus respectivos controles
negativos, com volume final do ensaio de 20 mL. Os ensaios foram realizados em
quadruplicatas e a taxa de mortalidade das larvas foi determinada após 24 e 48 h de
incubação a 28 ± 2 ° C com fotoperíodo de 12/12 h (claro-escuro). Os resultados
obtidos apontam que todas as amostras testadas apresentaram atividade larvicida
contra A. aegypti de forma dose dependente, onde a Litochitinase1 revelou-se mais
eficiente do que as outras amostras testadas, tendo como valores de EC50 para 24
horas de ensaio 0,71 mg/mL e para 48 horas de 0,49 mg/mL. Para as outras frações
como EB o valor de EC50 foi de 6,59 mg/mL e para F-III a EC50 para 24 e 48 horas
foi de 5,36 e 3,22 respectivamente. No ensaio com o EB, no tempo de 48 horas,
todas as larvas morreram. As análises estatísticas realizadas por meio dos testes
ANOVA e Kruskal-wallis, mostraram significância entre os resultados destes quando
se utilizou o EB, FIII e a Litochitinase1 em diferentes concentrações, nos tempos de
24 e 48 horas, com p< 0,05. As larvas do grupo controle apresentaram grande
mobilidade, cuja locomoção foi percebida por meio das contrações do corpo,
reagindo rapidamente a qualquer toque. Os valores da EC50 estão sumarizados na
tabela 7.
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64
RESULTADOS
Tabela 7: Concentração Efetiva do Extrato bruto, F-III e
Litochitinase1 necessária para matar 50% (EC50) das larvas L4 de
Aedes aegypti em 24 e 48 h.
Amostras
EC/ Tempo (h)
EC /24h
50
EC /48h
50
EB
6,59 mg/mL
*
F-III
5,36 mg/mL
3,22 mg/mL
Litochitinase1
0,71 mg/mL
0,49 mg/mL
*Todas as larvas mortas. Onde EC: concentração letal de proteínas necessárias
para matar 50% (EC) de larvas de A. aegypti L4 em 24 e 48 h.
5.6.3. Detecção
de
inibidores
de
proteases
serínicas
no
EB,
FIII
e
Litochitinase1
Considerando que as enzimas digestivas de Aedes aegypti são proteases
serinicas e que inibidores destas enzimas poderiam comprometer o processo
digestório e o conseqüente desenvolvimento dessas larvas, foi verificada a presença
de inibidores de proteases. O EB, a F-III e a Litochitinase1, oriundas do cefalotórax
do camarão marinho Litopenaeus schmitti, foram submetidas à avaliação de
atividade inibitória sobre tripsina e quimotripsina. Os resultados confirmaram a
ausência de inibidores de proteinases serinicas em todas as amostras analisadas
(Tabela 8).
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65
RESULTADOS
Tabela 8: Inibição de Proteases Serínicas
Enzimas
Amostras
Inibição
EB
ND
FIII
ND
Litochitinase1
ND
EB
ND
FIII
ND
Litochitinase1
ND
Tripsina
Quimotripsina
(ND) não detectado
5.6.4. Atividade hemaglutinante
Com o objetivo de avaliar a presença de lectinas nas amostras do cefalotórax
do camarão aliquotas do EB, F-III e Litochitinase1, foram submetidas a ensaios de
hemaglutinações com eritrócitos do sistema ABO tratados ou não com enzimas,
visando elucidar qual tipo sanguíneo apresentaria maior título de hemaglutinação e
qual tratamento enzimático se apresentaria mais eficiente na exposição de
carboidratos na superfície das células. Os resultados obtidos não apontaram a
presença de atividade hemaglutinante em nenhuma das frações testadas tanto com
eritrócitos sem tratamento nem com os tratados. No entanto a F-III apresentou um
leve potencial hemolítico em todos os tipos sanguíneos não tratados ou tratados
(Tabela 9).
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66
RESULTADOS
Tabela 9: Atividade hemaglutinante no extrato bruto, F-III e Litochitinase1
com eritrócitos nativos e tratados enzimaticamente
SISTEMA ABO
FRAÇÕES PROTEÍCAS (UH)*
Sem tratamento
EB
F-III
Litochitinase1
A
ND
hemólise
ND
B
ND
hemólise
ND
O
ND
hemólise
ND
A
ND
hemólise
ND
B
ND
hemólise
ND
O
ND
hemólise
ND
A
ND
hemólise
ND
B
ND
hemólise
ND
O
ND
hemólise
ND
Tratamento com tripsina
Tratamento com papaína
*UH: Unidade de hemaglutinação; (ND) não- detectado
5.6.5. Determinação
da
temperatura
ótima
das
atividades
proteolíticas
presentes no homogenato intestinal das larvas de A. aegypti
Para analisar a temperatura ótima de atividade das enzimas proteolíticas no
homogenato intestinal das larvas de A.aegypti, as mesmas foram incubadas com o
substrato azocaseína 1,5% em diferentes temperaturas. As enzimas presentes nos
homogenatos intestinais foram ativas na faixa de temperatura de 10 a 60°C (Figura
16). Sendo assim a temperatura do ensaio realizado para analisar se as enzimas
digestivas dos insetos inibiriam a atividade da Litochitinase1 poderia ser feita na
temperatura ótima desta que é de 55°C.
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67
RESULTADOS
Figura 16: Curva de temperatura ótima para a detecção da atividade das enzimas proteolíticas
presentes no homogenato intestinal de larvas de A.aegypti. Alíquotas de 50 µL de homogenato
intestinal foram utilizadas nos ensaios
5.6.6. Influência das enzimas digestivas do A. aegypti sobre a Litochitinase1
Com o intuito de avaliar se as enzimas digestivas do A. aegypti teriam algum
efeito inibitório ou degradativo sobre a atividade da Litochitinase1, foi realizado um
ensaio por meio da pré-incubação de 50 µl (4,05 µg) desta enzima na presença do
homogenato intestinal do inseto, na temperatura ótima da enzima, por 15 minutos.
Após a pré-incubação, o substrato foi adicionado e incubado na temperatura ótima
da enzima, durante 2 horas. Transcorrido o tempo de ensaio a reação foi
interrompida e quantificada a 405 nm em espectrofotômetro. Controles da enzima
pré-incubada e não-incubada foram feitos. De acordo com o gráfico da figura 17, a
Litochitinase1 apresentou atividade inalterada na presença do homogenato intestinal
do A. aegypti.
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68
RESULTADOS
Figura 17: Efeito da pré-incubação com as enzimas digestivas de A.aegypti na atividade da
Litochitinase1.
50 µl da Litochitinase1 foram pré-incubados durante 15 minutos com o homogenato intestinal, na
ausência do substrato. Transcorrido o tempo, o p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminídeo foi adicionado
na concentração de 10 mM e incubado na temperatura ótima da enzima durante 2 h. Em seguida as
reações foram interrompidas como descrito na metodologia. Onde: CNI- Controle da Litochitinase1
não pré-incubado; CI- Controle da Litochitinase1 pré-incubado sem enzimas do homogenato e EHILitochitinase1 pré-incubada com enzimas do homogenato intestinal.
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70
DISCUSSÃO
6.
DISCUSSÃO
Em 2003, a produção mundial de camarão foi de 4.630.000 toneladas sendo
que 1.630.000 t (35,21% do total) foram produzidas por cultivo (REVISTA
PANORAMA DA AQÜICULTURA, 2004). No Brasil, a pesca extrativa marinha
produziu 35.451,5 toneladas de camarão em 2007 (ESTATÍSTICA DA PESCA,
2007). A carcinicultura, após um pico de produção de 90.190 t em 2003, manteve
uma produção de 65.000 t anuais de camarão no período de 2005 a 2007 (ROCHA,
2008). O processamento de cerca de 100.000 t anuais de camarão no Brasil gera
uma enorme quantidade de rejeitos, principalmente durante a etapa de retirada da
casca e do cefalotórax (GOMES et al., 2010).
Algumas das propostas para eliminar este resíduo da indústria pesqueira
incluem a elaboração de farinha de casca de camarão (para a utilização em
alimentos) e o aproveitamento da quitina para diversos usos, como na produção de
catalisadores, em complementos alimentares para redução do colesterol e controle
do peso (SHAHIDI et al., 1999; KIM; RAJAPAKSE, 2005) ou como agente
imobilizador de enzimas e microorganismos (PALLA et al., 2011). A transformação
dos rejeitos da indústria de processamento do camarão em quitosanas ou
quitinooligossacarídeos com massas molares médias e níveis de desacetilação
controlados seria uma alternativa viável, gerando produtos com alto valor agregado
para usos biotecnológicos (GOMES et al., 2010).
Dentre as principais tecnologias que surgiram desde a década de 70, a
biotecnologia tem atraído maior atenção por ter se revelado capaz de gerar enorme
riqueza e influência em cada setor da economia com destaque para a saúde,
produção e processamento de alimentos, agricultura, proteção ambiental e produção
de materiais (GAVRILESCU; CHISTI, 2005).
A indústria de enzimas é resultado de um desenvolvimento rápido, alcançado
nas últimas quatro décadas, graças à evolução da biotecnologia moderna. O
desenvolvimento dos processos de purificação e fermentação, ocorrido durante a
última metade do século passado, permitiu a produção de enzimas mais puras, bem
caracterizadas e em larga escala (KIRK, 2002). O mercado mundial de enzimas
movimentou em 2007 cerca de 2,3 bilhões de dólares e espera-se para 2012 um
movimento superior a 2,7 bilhões, com um aumento anual de 4% (THAKORE, 2008).
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71
DISCUSSÃO
As enzimas quitinolíticas apresentam inúmeras aplicações biotecnológicas no
ramo da indústria e agricultura. As quitinases podem ser utilizadas no controle de
fungos
patógenos
de
plantas
e
insetos,
como
ainda
na
produção
de
quitinooligossacarídeos biologicamente ativos (PATIL, et al,2000).
O objetivo principal deste trabalho foi estudar uma quitinase purificada e
extraída do cefalotórax do camarão marinho Litopenaeus schmitti, porção esta
normalmente descartada sem qualquer tipo de aproveitamento tecnológico
(FOGAÇA; LEGAT, 2009) e avaliar sua aplicabilidade biotecnológica como agente
microbicida e larvicida.
Os resultados iniciais utilizando os p-nitrofrofenís derivados de açúcar como
substrato mostraram a presença de quase todas as atividades enzimáticas
pesquisadas no EB, F-I, F-II e F-III. Estes não foram tão surpreendentes, pois
extratos enzimáticos nos primeiros passos de purificação geralmente são ricos em
diversas atividades glicosidásicas e sulfatásicas. Fato este já observado nos extratos
dos celenterados Palythae coribaerum (SOUZA, 2003); Palythoa voriabitis
(FERREIRA, 2003); no molusco Aplysia cervina (MATTA; ABREU, 2005);
Echinometra lucunter (LIMA, 2006) e no microcrustáceo Artemia franciscana
(NASCIMENTO, 2008). As possíveis funções dessas enzimas seriam a degradação
de carboidratos complexos, como polissacarídeos e glicosaminoglicanos (KRESSE;
GROSSI, 1987; STAM et al., 2005). De todas as frações testadas com os substratos
sintéticos derivados de açúcar a F-III apresentou maior atividade específica,
ressaltando que nesta fração a atividade quitinásica se sobressai das demais.
Resultados semelhantes foram encontrados no molusco Chiton sp. (VIEIRA, 2002),
Strombus goliath (ARAÚJO, 2002), Paliythoa caribaeorum (SOUZA, 2003) e no
Echinoderma marinho Echinometra lucunter (LIMA, 2006) onde a enzima que
apresentou atividade quitinolítica também mostrou maior atividade específica nas
frações protéicas extraídas destes animais.
Para a obtenção de quitinases purificadas, diferentes métodos são utilizados
tais como, precipitação com sulfato de amônio (IKE et al., 2006), cromatografia de
interação hidrofóbica (DUO-CHAN, 2005), cromatografia de troca iônica (IKE et al.,
2006), cromatografia de afinidade a quitina (KIM et al., 2007) dentre outras. Para
uma purificação total geralmente se faz necessário a utilização de mais de um dos
métodos acima. Para a purificação da quitinase extraída do cefalotórax do camarão
marinho Litopenaeus Schmitti combinou-se cromatografia de troca iônica e exclusão
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72
DISCUSSÃO
molecular S-200, onde foi obtida a enzima purificada 987,32 vezes com um
rendimento de 2,62 %. Este baixo rendimento pode ter sido causado pela perda de
atividade enzimática ao longo do processo de purificação. Acredita-se que, por
serem glicoproteínas, estas enzimas possam perder sua porção carboidrática ao
longo do processo de purificação, o que compromete sua atividade (PASTORE,
2003). A enzima assim purificada recebeu o nome de Litochitinase1.
Resultados de purificações elevadas foram encontrados na literatura com Nacetilhexosaminidases como é o caso de SOUZA (2003) e GOMES-JÚNIOR (2010)
que obtiveram alto grau de purificação, 4826 vezes e 2232 vezes, respectivamente.
Para avaliar o grau de pureza e determinar a massa molecular aproximada da
Litochitinase1
uma
eletroforese
em
gel
de
poliacrilamida
em
condições
desnaturantes revelou que esta possui uma banda protéica com o peso de 28,5 kDa.
Em geral a literatura traz exemplos de quitinases com massas moleculares variando
em uma ampla faixa que vai de 40 a 240 kDa (PETERS et al., 1998; CIFALI; DIAS
FILHO, 1999; AMUTHA, 1999), porém recentemente foi descrito por GOMES et al .
2010 duas quitinases com peso molecular de 24 e 30 kDa extraída de Vitis vinífera e
ainda L. KOPPARAPU et al. (2011) descreveram uma quitinase extraída de Punica
granatum cujo peso molecular é de 29 kDa, peso este bem próximo ao encontrado
no gel de SDS–PAGE apresentado neste trabalho.
O valor de Km aparente de 0,51 mM encontrado demonstra que essa enzima
possui grande afinidade por seu substrato e que sua hidrólise obedeceu à cinética
de Michaelis-Menten. O valor de Km obtido não diferiu significativamente de alguns
valores encontrados em outros trabalhos, como no caso da quitinase de Pennahia
argentatus onde foi observado um Km de 0,52 mM (IKEDA et al., 2009) e da
quitinase de Hexagrammos otakii (MATSUMIYA et al., 2006) que apresentou um Km
de 0,494 mM. Entretanto, muitos estudos encontraram valores de Km mais elevados
como no caso da quitinase de ovos de Halocynthia roretzi (MATSUURA et al., 1993)
que apresentou Km de 1,2 mM, e quitinase do vírus Autographa californica (DI MARO
et al., 2010) onde se observou um Km de 3,5 mM.
A temperatura ótima observada para a Litochitinase1, após duas horas de
ensaio a diferentes temperaturas, foi de 55°C. Essa atividade decai em temperaturas
abaixo e acima deste ponto, podendo indicar desnaturação proteíca. Estudos
cinéticos realizados com exoquitinases de diversas outras fontes demonstraram para
esse tipo de glicosidase temperaturas estáveis entre 37 e 50°C (TSUJIBO et al.,
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73
DISCUSSÃO
1995; MATSUO et al., 1999; KAMEI et al., 1999; ARAÚJO, 2002; VIEIRA, 2002).
Recentemente KOPPARAPU et al. (2011) relataram uma temperatura ótima de 70°C
para a quitinase extraída da romã (Punica granatum). Outras quitinases purificadas
de uva, tamarindo, abacaxi, látex de Ficus microcarpa e do camarão Penaeus
monodon apresentaram temperaturas ótimas de 40, 45, 60 e 55°C, respectivamente
(ANO et al.,
2003; TAIRA et al., 2005a, 2005b; RAO; GOWDA,
2008;
PROESPRAIWONG et al., 2010). Temperaturas estas, muito próximas a
temperatura ótima da quitinase estudada neste trabalho.
A pré-incubação da enzima por 30 minutos a várias temperaturas revelou que
a Litochitinase1 é estável de 25 a 60° C. Entre 50 e 55° C sofre uma leve ativação
aumentando em aproximadamente 20% sua atividade de catálise do substrato. Isto
indica que a Litochitinase1, ao ser submetida a estas temperaturas, de alguma
maneira elas afetam positivamente sua atuação sobre o substrato. Temperaturas
acima de 60ºC as inativaram rapidamente. Recentemente, PATEL et al., (2010),
isolaram uma quitinase do látex de Ipomoea carnea que apresentou estabilidade até
a temperatura de 80ºC. Uma estabilidade relativa até a temperatura de 40ºC foi
observada em uma quitinase recombinante, purificada do camarão tigre negro
(Penaeus monodon) (PROESPRAIWONG et al., 2010).
O pH ótimo encontrado para a hidrólise do p-nitrofenil-N-acetil-β-Dglucosaminídeo foi entre os pH 5,0 e 6,0. Em pH 4,0 e 8,0 a atividade da enzima cai
consideravelmente. Uma quitinase purificada do vírus Autographa californica (DI
MARO et al., 2010) mostrou estabilidade em pH que variava de 5,0 a 7,0, resultado
este semelhante ao encontrado para a enzima aqui estudada. Da mesma forma
CHEN et al., (2011), purificou uma enzima presente no látex do mamão que
apresentava atividade ótima no pH 5,0 e PATEL et al., (2010), purificaram uma
quitinase do látex da Ipomoea carnea que apresentou atividade máxima no pH 5,5.
A Litochitinase1 não é estável em pHs muito ácidos e muito básicos, perdendo
completamente as suas atividades. Isso possivelmente é devido ao fato de que
nesses pHs a enzima perde sua conformação nativa, devido a mudanças no estado
de ionização das cadeias laterais dos aminoácidos localizados no sitio ativo desta,
alterando assim a distribuição de cargas, interferindo de sobremaneira na estrutura
da proteína e na atividade enzimática. A estabilidade da enzima é atingida numa
faixa de pH entre 4,0 – 5,5, embora apresente um pico de atividade no pH 7,0.
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74
DISCUSSÃO
O efeito de vários sais e EDTA sobre a hidrólise do p-nitrofenil-N-acetil-β-Dglucosaminídeo pela Litochitinase1 foi estudado. A enzima apresentou sua atividade
levemente reduzida na presença do Na2HPO4 (5%). Por outro lado, os sais KCl,
HgCl2, NaH2PO4, e NaCl afetaram de forma expressiva a atividade enzimática,
reduzindo sua atividade em 28, 98, 40 e 30%, respectivamente. O MgCl2 estimulou
só levemente (~8%) a atividade da Litochitinase1, porém concentrações mais
elevadas do sal, possam estimular ainda mais a enzima. CaCl2, Na2SO4, EDTA e o
NaC6H5O7 não interferiram na atividade da enzima. O efeito de sais (íons) e
compostos é amplamente variável, dependendo da enzima em estudo. O efeito
inibitório observado com a adição de HgCl2
(íon Hg2+ ) é geralmente observado
em outras glicosidases (CHEN et al., 1994; WEI et al., 1996; NAKANO et al., 1998;
RIOU et al., 1998; HAYASHI et al., 1999; LUCAS et al., 2000; YAZDI et al., 2003;
ZANOELO et al., 2004; LI et al., 2005). O íon Hg2+ é reconhecido agente oxidante de
grupos sulfidril (-SH), e a inibição provocada por este íon pode indicar o
envolvimento de importantes grupos sulfidril no sítio catalítico da enzima (PAINBENI
et al., 1992; GUEGUEN et al., 1995a, 1997b; WEI et al., 1996; NAKANO et al., 1998;
OH et al., 1999). No entanto, a inibição observada na presença de Hg2+ pode não
estar apenas relacionada à ligação deste íon com grupos sulfidril, mas também à
interação deste íon com resíduos de triptofano e/ou grupamentos carboxil em
aminoácidos da enzima (LUSTERIO et al., 1992).
O EDTA, reagente com a capacidade de quelar íons metálicos, é empregado
em diversos testes bioquímicos visando, entre outros, diminuir a ação de
metaloproteinases em extratos brutos. Entretanto, o EDTA pode tornar-se
problemático caso as enzimas dependam de íons como o Ca+2 (MATEO; DI
STEFANO, 1997). Nas concentrações utilizadas, este reagente não apresentou
efeito sobre a atividade da Litochitinase1, desta forma estes estudos sugerem que a
não interferência do EDTA indica que a catálise não é dependente de íons Ca+2,
similarmente a outros estudos, sugerindo que a enzima não requer co-fatores
metálicos (DRIDER et al., 1993; GUEGUEN et al., 1995a; NAKANO et al., 1998;
RIOU et al., 1998; YAN et al., 1998; KIMURA et al., 1999; OH et al., 1999;
ZANOELO et al., 2004; LI et al., 2005; FERREIRA, 2010).
A literatura a respeito da ação antifúngica e antibacteriana de produtos
naturais é escassa, sendo que a maioria dos estudos verifica seu potencial como
antiinflamatórios e produtos dermatológicos. Produtos naturais como substâncias
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75
DISCUSSÃO
antimicóticas e bactericidas derivados de origem protéica não são muito estudados.
A maioria das substâncias empregadas como agentes microbicidas são de origem
vegetal, e já foi demonstrado, por exemplo, o efeito antifúngico de plantas como
estragão e tomilho (DUKE, 1985; BRANTNER et al., 1996), de substancias como o
própolis (NOSTRO et al., 2006; PONTIN et al., 2008), ação antibacteriana do
Anacardiun occidentale (cajueiro) que foi estudado mostrando-se efetivo para
bactérias gram-positivas e gram-negativas (KUDI, 1999) e
antimicrobiana do extrato
bruto
da
folha
de Baccharis
a
atividade
dracunculifolia (DA
SILVA FILHO et al., 2008).
No presente estudo, testes microbiológicos utilizando a quitinase purificada
foram realizados e os resultados obtidos pela técnica de difusão em disco, para as
cepas testadas de S. aureus, as leveduras C. tropicalis e C. albicans não
apresentaram halos de inibição, logo, a Litochitinase1 não foi capaz de inibir o
crescimento desses microorganismos, isto pode ser atribuído a dificuldades na
padronização e comparação de técnicas de difusão em disco, devido à interferência
das características de algumas amostras na capacidade de difusão (SILVEIRA et
al., 2009), pois em se tratando de avaliação de produtos naturais RIBEIRO;
SOARES (2000) afirmam que as características de solubilidade do material em teste
interferem na difusão do mesmo no meio de cultura.
Diferente dos resultados obtidos neste estudo, já é relatado na literatura à
ação de quitinases extraídas do amedoim e do microorganismo Trichoderma
harzianum contra bactérias gram-positivas como S. aureus (WANG et al., 2007; LIN
et al., 2009). Várias enzimas têm sido estudadas como agentes antifúngicos em
potencial. A ação fungicida deve-se principalmente à hidrólise dos componentes da
parede celular (FLEURI; SATO, 2007). Porém a maioria dos estudos relacionados à
ação de quitinases como agentes antifúngicos é aplicada em fungos fitopatogênicos
como revela estudos desenvolvidos por YE; NG (2005), WANG (2007), FLEURI;
SATO (2008) e LAM; NG (2010).
Para os resultados de microdiluição em caldo dentre as quatro cepas testadas,
a Litochitinase1 não apresentou atividade antimicrobiana para S. aureus, C. albicans
e P. aeruginosa. Estudos realizados com quitinases de outras fontes como a da
planta Brassica Junceae se mostraram ativas contra estes microorganismos (GUAN
et al., 2008). No entanto a Litochitinase1 apresentou-se efetiva contra o
microorganismo E. coli, inibindo-o partindo de uma concentração inicial de 800
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76
DISCUSSÃO
µg/mL, concentração bem inferior a de outros trabalhos que utilizaram a mesma
cepa e o mesmo teste de microdiluição, como mostrado no estudo de
CHOWDHURY (2008) onde uma proteína extraída da Solanum villosum consegue
efeito bactericida contra E. coli partindo de uma concentração de 1800 µg/mL.
Escherichia coli é a espécie predominante entre os diversos microrganismos
anaeróbios facultativos e comumente encontrada na microbiota normal no trato
gastrointestinal humano (GILL et al., 2006) e outros vertebrados, com o qual
geralmente estabelece associações comensais. Esse microrganismo pertence à
família Enterobacteriaceae e entre suas principais características destacam-se:
bacilos gram-negativos, não esporulados capazes de fermentar glicose com
produção de ácido e gás (FRANCO; LANDGRAF, 2003).
Seres humanos saudáveis tipicamente, têm mais de um bilhão de células de
E. coli no intestino. Estima-se que metade das células vivas de E. coli estão fora do
seu hospedeiro, em seu habitat secundário (SAVAGEAU, 1983). Além destes
habitats, algumas estirpes têm o potencial de causar um amplo espectro de
doenças intestinais e extra-intestinais, como infecção do trato urinário, septicemia,
meningite e pneumonia em humanos e animais (DONNENBERG, 2002) e como
também aumento da inflamação da mucosa gástrica em pacientes com doença de
Crohn (BARNICH et al., 2010). Com a sua vasta gama de patologias, a E. coli é uma
das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo, causando a
cada ano mais de dois milhões de mortes por diarréia infantil (BISSON et al., 2002;
RODRÍGUEZ-BAÑO et al., 2006) e infecções extra-intestinais (principalmente
septicemia derivados de infecção urinária) e também é responsável por
aproximadamente 150 milhões de casos de cistite simples (DU et al., 2002).
Durante a última década, tem havido um marcado aumento nas infecções por
E. coli resistentes a antibióticos, tais como: Fluoroquinolona. Esta crescente
resistência limita as opções de tratamento e podem afetar o prognóstico da doença
(LAUTENBACH et al., 2001), como também ocorrer o uso inadequado de
antimicrobianos ocasionando atrasos na terapia correta. O aumento da resistencia
bacteriana, justifica a necessidade urgente por novos agentes antibióticos que atuem
por mecanismos de ação diferentes dos fármacos em uso (PAYNE et al., 2007;
COATES; HU, 2007).
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77
DISCUSSÃO
As novas estratégias da pesquisa em produtos naturais, envolvendo a busca
de substâncias pouco exploradas para o acesso da descoberta de novos antibióticos
extremamente importantes num cenário de rápido desenvolvimento de resistência
pelas bactérias aos agentes terapêuticos disponíveis, indica que a Litochitinase1
pode vir a ser utilizada como uma possível alternativa no combate das doenças
causadas pela E.coli.
A dengue é a mais importante e global arbovirose da atualidade, causando de
50-100 milhões de casos/ano em mais de 100 países (REGIS et al., 2008) e
submetendo 2,5 bilhões de pessoas ao risco de se infectarem, principalmente em
países tropicais e subtropicais onde as condições climáticas (temperatura e
umidade) são favoráveis a proliferação do mosquito transmissor, o Aedes aegypti
(POLANCZYK et al., 2003, SIMAS et al., 2004). Como não há vacina disponível para
prevenção, o controle da dengue tem sido limitada ao combate do vetor e centrado
na aplicação de inseticidas químicos (CARVALHO et al., 2004; LIMA et al., 2005a;
MACORIS et al., 2007; SILVA; MENDES, 2007), especialmente os organofosforados
e piretróides para os adultos e organofosforados para as larvas (LIMA et al., 2006).
Todavia, relatos de populações de insetos resistentes (RODRIGUES et al, 2001) a
esses inseticidas apontam para a necessidade de pesquisas que busquem novas
alternativas de controle, isentas de risco para a saúde humana e ao meio ambiente.
Não obstante os trabalhos realizados por COSTA et al. (2005); SILVA et al.
(2007); LUZ et al. (2008); MEDEIROS, (2007) e FERREIRA et al. (2009) utilizando
como fontes produtos naturais contra as larvas de Aedes nenhum utilizavam
quitinases. Por isso resolveu-se verificar o potencial larvicida da Litochitinase1.
Os ensaios in vivo apontam que todas as amostras testadas apresentaram
atividade contra larvas do quarto estádio de A. aegypti de forma dose dependente.
Essa atividade aumenta à medida que se utiliza material com maior grau de
purificação (EB: EC50 6,59 mg/mL, F-III: EC50 5,36, Litochitinase1: EC500,71 mg/mL)
sugerindo que a molécula responsável pela morte das larvas tenha sido a
Litochitinase1, e que, supostamente esta poderia estar atuando na quitina presente
no exoesqueleto e/ou na membrana peritrófica do inseto. A membrana peritrófica é
um revestido do intestino médio constituída por proteínas e quitina, cuja presença foi
confirmada pelo teste de Von Wisselingh, e vem sendo bastante estudada como alvo
para a ação de bioinseticidas (HARPER, HOPKINS; CZAPLA, 2001). A favor dessa
segunda hipótese verificamos a não degradação da Litochitinase1 pelas enzimas
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78
DISCUSSÃO
digestivas de A. aegypti e, adicionalmente, a ausência de outras moléculas bioativas
que poderiam também interferir no processo digestório das larvas, como inibidores
de proteases serinicas e lectinas nas frações testadas, indicando mais uma vez que
a morte das larvas está ocorrendo por ação da Litochitinase1.
As enzimas digestivas de A. aegypti são proteases serinicas tipo tripsina e
quimotripsina (KUNZ, 1978). Ensaios com outros insetos mostram que a inibição
destas
enzimas
compromete
o
processo
digestório
e
o
consequente
desenvolvimento e/ou morte das larvas, por privação de nutrientes. A maioria dos
inibidores de proteases tem sido obtidos de fontes como órgãos de reservas de
plantas (XAVIER-FILHO, 1992; ARAÚJO et al., 2004), todavia trabalhos recentes na
literatura descrevem inibidores de proteinases serínicas em invertebrados marinhos
como no camarão
Fenneropenaeus chinensis (KONG et al., 2009) e Penaeus
momodon (VISETNAN et al., 2009; DONPUDSA et al., 2010). .
Lectinas tem sido encontradas em quase todos os organismos, sendo
amplamente distribuídas entre vegetais, vírus, bactérias, mamíferos e vários grupos
de invetebrados (GERLACH et al., 2005) como por exemplo: nos camarões Penaeus
paulensis (MARQUES; BARRACO, 2000), Penaeus monodon (LUO et al., 2005) e
Penaeus
japonicus
(YANG
et
al.,
2007).
As
lectinas
ligantes
de
N-
acetilglucosamina, oriundas das plantas Moringa Oleifera (COELHO et al., 2009) e
Myracroduom urundeuva (SÁ et al., 2009) mostraram atividade larvicida contra
Aedes aegypti.
Mesmo diante da necessidade de estudos complementares que esclareçam o
mecanismo pelo qual a quitinase provoca a morte de larvas de A. aegypti, e
comprovem a ausência de efeitos deletérios ambientais e sanitários, percebe-se o
potencial dessas moléculas para serem utilizadas como ferramentas auxiliares no
controle do vetor transmissor da dengue.
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79
CONCLUSÃO
7. CONCLUSÃO
•
Pôde-se observar a presença de atividades glicosidásicas e sulfatásicas nos
extratos enzimáticos obtidos do cefalotórax do camarão marinho Litopenaeus
schmitti;
•
A fração F-III (50-80%) apresentou maior atividade quitinolítica;
•
A Litochitinase1 foi purificada na ordem de 987,32 vezes e com recuperação de
2,62% apresentando massa molecular de aproximadamente 28,5 kDa;
•
A temperatura ótima para a catálise do substrato sintético pela Litochitinase1 é
de 55°C e elevada estabilidade térmica permanecendo com 100% de sua
atividade quando pré-incubada nas temperaturas de 25, 37 e 45°C e
apresentando aumento desta nas temperaturas de 50 e 55°C;
•
A atividade ótima para atuação da Litochitinase1 ocorre em uma faixa de pH,
entre 5,0 e 6,0, com faixa de estabilidade nos pHs 4,0 a 5,5;
•
O HgCl2 na concentração de 10mM inibe significativamente a Litochitinase1
enquanto que o MgCl2 na mesma molaridade potencializa sua atividade;
•
A Litochitinase1 apresentou constante de Michaelis-Menten (Km) de 0,51 mM,
indicando que a enzima possui alta afinidade pelo substrato quando comparadas
com dados da literatura;
•
A Litochitinase1 demonstrou potencial microbicida contra a bactéria gramnegativa E. coli demonstrado pela inibição de seu crescimento, avaliado pelo
método de microdiluição em caldo, podendo ser utilizada no combate de
infecções causadas por este patógeno ;
•
A Litochitinase1 apresentou atividade larvicida contra larvas de Aedes aegypti de
maneira dose dependente e, de acordo com os outros resultados obtidos como:
ausência de proteínas contaminantes como inibidores de proteinases serínicas e
lectinas, esta atividade se confirma indicando-a para ser usada como alternativa
de controle eficaz na redução da infestação pelo mosquito vetor.
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CONCLUSÃO
•
No Brasil, a carcinicultura marinha é uma das atividades agroindustriais mais
atrativas economicamente, concentrando 93% de sua produção no Nordeste. No
entanto, durante o processamento do camarão, cerca de 50% do peso do animal
resulta em subproduto (cefalotórax, segmentos abdominais e carapaças),
descartado sem qualquer tipo de aproveitamento tecnológico (FOGAÇA; LEGAT,
2009). Diante de tal fato, a utilização dos cefalotórax para extração de enzimas
com
enormes
aplicabilidades,
constitui-se
numa
via
alternativa
de
aproveitamento destes resíduos.
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