INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Mestrado em Biologia Parasitária
ALTERAÇÕES HEMATOLÓGICAS E PERFIL FENOTÍPICO
DAS CÉLULAS MONONUCLEARES DO SANGUE
PERIFÉRICO DE PACIENTES COM MALÁRIA POR P. vivax
E P. falciparum NA FASE AGUDA E DE CONVALESCENÇA
DA INFECÇÃO
CAROLINA ROSADAS DE OLIVEIRA
Rio de Janeiro
2010
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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
CAROLINA ROSADAS DE OLIVEIRA
Alterações Hematológicas e perfil fenotípico das células mononucleares do sangue periférico
de pacientes com malária por P. vivax e P. falciparum na fase aguda e de convalescença da
infecção
Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz
como parte dos requisitos para obtenção do título de
Mestre em Biologia Parasitária
Orientador (es): Prof. Dra. Dalma Maria Banic
Prof. Dra. Joseli de Oliveira Ferreira
RIO DE JANEIRO
2010
ii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
AUTOR: CAROLINA ROSADAS DE OLIVEIRA
ALTERAÇÕES HEMATOLÓGICAS E PERFIL FENOTÍPICO DAS CÉLULAS MONONUCLEARES
DO SANGUE PERIFÉRICO DE PACIENTES COM MALÁRIA POR P. vivax E P. falciparum NA
FASE AGUDA E DE CONVALESCENÇA DA INFECÇÃO
ORIENTADOR (ES): Prof. Dra. Dalma Maria Banic
Prof. Dra. Joseli de Oliveira Ferreira
Aprovada em: 31/03/2010
EXAMINADORES:
Prof. Dr.
Prof. Dr.
Prof. Dr.
Prof. Dr.
Prof. Dra.
Sergio Coutinho Furtado de Mendonça
Luís Cristóvão de Moraes Sobrino Pôrto
Paulo Renato Zuquim Antas
Maurício Afonso Verícimo
Lilian Rose Pratt-Riccio
Rio de Janeiro, 31 de março de 2010
iii
iv
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
ALTERAÇÕES HEMATOLÓGICAS E PERFIL FENOTÍPICO DAS CÉLULAS MONONUCLEARES DO
SANGUE PERIFÉRICO DE PACIENTES COM MALÁRIA POR P. vivax E P. falciparum NA FASE
AGUDA E DE CONVALESCENÇA DA INFECÇÃO
RESUMO
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Carolina Rosadas de Oliveira
A malária continua sendo uma das doenças parasitárias mais importantes do mundo, sendo
responsável por 300-500 milhões de casos por ano. A resistência dos plasmódios aos
medicamentos antimaláricos e dos vetores aos inseticidas agrava ainda mais a situação. Neste
contexto, o desenvolvimento de novos métodos terapêuticos e profiláticos é de suma
importância. Apesar dos esforços, uma vacina eficaz ainda não foi desenvolvida. Atualmente
sabe-se que a resposta imune antiplasmódio pode ser responsável pela proteção e patogênese
da doença. Porém, os mecanismos envolvidos na imunidade protetora e/ou patológica ainda
não estão esclarecidos. Assim sendo, o presente trabalho objetiva avaliar as alterações
hematológicas e o perfil imunofenotípico de células mononucleares de sangue periférico de
indivíduos naturalmente infectados por P. vivax (n=47) ou por P. falciparum (n=24)
provenientes de área endêmica brasileira (PV-RO), na fase aguda e de convalescença. Para
isso, sangue dos voluntários foi coletado para realização do exame parasitológico, do
hemograma completo e para obtenção de células mononucleadas para a avaliação do perfil
imunofenotípico através de citometria de fluxo. As populações alvo incluíram células CD4 +,
CD8+, linfócitos T, Tγδ, células CD3- e subpopulações produtoras de diferentes citocinas
(IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10); células NK, NKT e subpopulações (CD4+ e CD8+); células
B e subpopulações (incluindo populações produtoras de TGF-β). Na fase aguda, pacientes
com malária vivax e falciparum apresentaram plaquetopenia, leucopenia e aumento no número
de bastões e também apresentaram um aumento no percentual de células CD4+CD8- e redução
no percentual de células B CD5-CD11b-. Pacientes com P. vivax apresentaram aumento no
percentual de: células CD4+, CD8+, TCRγδ+ e CD3- produtoras de TNF-α; células CD8
ativadas, células T e células CD3- produtoras de IL-10; células B expressando TGF-β. Nos
indivíduos infectados por P. falciparum foi observado um aumento de células T TNF-α+ e
redução de células T citotóxicas. Na fase de convalescença, os dois grupos apresentaram
redução de células Tγδ e CD3- produtoras de TNF-α; células CD3-IL-2+; células CD3-IL-10+.
Apenas os indivíduos infectados com P. vivax apresentaram redução de CD4+CD8-; células B
CD5+CD11b-; células CD8+ produtoras de TNF-α e de TNF-α e IFN-γ de forma simultânea;
além do aumento de células B CD5-CD11b-. Tanto o pacientes com P. falciparum quanto com
o P. vivax apresentaram significante diminuição no número de linfócitos e apenas algumas
subpopulações celulares circulantes se encontravam alteradas. Entretanto, alterações
significativas no perfil de expressão de citocinas foram observadas principalmente nos
pacientes com P. vivax. Dentro desse contexto, na fase aguda da malária por P. vivax houve
aumento tanto no percentual de células com marcação para citocinas do tipo 1 quanto para
citocinas do tipo 2. Como todos os pacientes incluídos no trabalho apresentaram malária não
complicada, pode-se supor que o mais importante no controle da gravidade da doença é
justamente o balanço entre resposta pró e anti-inflamatória.
v
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
ALTERAÇÕES HEMATOLÓGICAS E PERFIL FENOTÍPICO DAS CÉLULAS MONONUCLEARES DO
SANGUE PERIFÉRICO DE PACIENTES COM MALÁRIA POR P. vivax E P. falciparum NA FASE
AGUDA E DE CONVALESCENÇA DA INFECÇÃO
ABSTRACT
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Carolina Rosadas de Oliveira
Malaria remains one of the most important parasitic diseases in the world, being
responsible for 300-500 millions cases annually. The resistance of Plasmodium to antimalarial
drugs and the resistance of vectors to insecticides worsens the situation. In this context, the
development of new therapeutics and prophylactics methods is extremely important. Despite
efforts, an effective vaccine has not been developed. Presently it is known that the
antiplasmodial immune response may be responsible for the protection and pathogenesis of the
disease. However, the mechanisms involved in protective and / or pathological immunity
remain unclear. Therefore, this study aims to evaluate the hematological and
immunophenotypic profile of peripheral blood mononuclear cells of naturally infected
individuals with P. vivax (n = 47) or P. falciparum (n = 24) from an endemic area of Brazil
(PV-RO), on the acute phase and convalescence. To achieve the objective, volunteers' blood
was collected for parasitological examination, hemogram and to obtain mononuclear cells to
evaluate the immunophenotypic profile using flow cytometry. The target populations included
CD4+, CD8+, T lymphocytes, Tγδ, CD3- cells, and subpopulations producing different
cytokines (IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10); NK, NKT cells and subpopulations (CD4+ e
CD8+); B cells and subpopulations (including populations that produces TGF-β). In the acute
phase, patients with falciparum and vivax malaria had thrombocytopenia, leukopenia and an
increased number of band cells and also presented an increased percentage of CD4+CD8besides a reduction in the percentage of CD5-CD11b- B cells. Patients with P. vivax showed an
increase in the percentage of TNF-α producing CD4+, CD8+, TCRγδ+ and CD3- cells; activated
CD8 T cells and CD3-cells that produces IL-10; TGF-β expressing B cells. In P. falciparum
infected individuals it was observed an increase in T cell TNF-α+ and a reduction of cytotoxic
T cells. In the convalescence, both groups presented a reduction in TCRγδ+TNF-α+, CD3TNF-α +, CD3-IL-2+ and CD3-IL-10+ cells. Only those individuals infected with P. vivax
showed a decrease of CD4+ CD8-; CD5+CD11b- B cells; CD8+ cells that express TNF-α and
TNF-α and IFN-γ simultaneously; besides there is an increase of CD5-CD11b- B-cell. Either
patients with P. falciparum as in P. vivax infected individuals a significant decrease in the
number of lymphocytes was observed, however only a few circulating lymphocyte subsets
were altered. Indeed, significant changes in the cytokines expression profile were observed in
the P. vivax patients. Within this context, in the acute phase of P. vivax malaria there was an
increase in both the percentage of type 1 and type 2 cytokines producing cells. As all patients
included in the study had uncomplicated malaria, it can be assumed that the most important in
controlling the severity of the disease is precisely the balance between the pro and antiinflammatory response.
vi
DEDICATÓRIAS
vii
A Deus por tudo;
Aos meus pais, Almir e Maria Christina,
pelo amor e apoio incondicionais.
viii
Ao meu noivo, Bruno,
pela compreensão e amor
ix
A minha irmã, Camila, a todos familiares e amigos,
por estarem presentes em todas as horas.
x
Agradecimentos
As minhas queridas orientadoras, Dra. Dalma Maria Banic e Dra. Joseli de Oliveira
Ferreira, por todas as críticas construtivas, dedicação e paciência. Por terem me recebido de
forma tão amável, pela confiança no meu trabalho e pela oportunidade que me deram de
desenvolver este estudo.
Aos amigos e companheiros de trabalho, Luciene de Aquino da Silva e Josué da Costa
Lima Júnior, que dedicaram tanto tempo me ensinando e me ajudando em incontáveis tarefas.
A Dra. Paula Mello de Luca, do Laboratório de Imunoparasitologia do IOC-FIOCRUZ
pelas valiosas contribuições e pelo apoio constante.
Ao Alessandro Marins dos Santos, técnico da plataforma de citometria de fluxo do
Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, exemplo de dedicação e boa vontade, que muito
contribuiu para o meu trabalho.
A Dra. Arlete Baldez, a Dra. Fátima Santos e ao Dr. Fábio Storer pela dedicação e
apoio no trabalho de campo.
Ao Dr. Paulo Zuquim, do Laboratório de Imunologia Clínica do IOC-FIOCRUZ, por
estar sempre a disposição para dividir seu conhecimento, pelas excelentes sugestões e por ter
aceitado participar da banca avaliadora.
Ao Dr. Sergio Coutinho Furtado de Mendonça, do Laboratório de Imunoparasitologia
do IOC-FIOCRUZ, por ter aceitado ser o revisor da dissertação e participar da banca
avaliadora.
Aos Doutores Luís Cristóvão Porto (UERJ) e Maurício Afonso Veríssimo (UFF), e a
Dra. Liliam Rose Pratt Riccio (IOC), por terem aceitado participar da banca avaliadora.
Ao Dr. Cláudio Tadeu Daniel-Ribeiro, do Laboratório de Pesquisas em Malária do
IOC-FIOCRUZ, que tanto contribuiu para o desenvolvimento do meu conhecimento acerca do
tema e por ter me recebido no laboratório
A Dra. Maria de Fátima Ferreira da Cruz, do Laboratório de Pesquisas em Malária do
IOC-FIOCRUZ pela gentileza com que me recebeu no laboratório.
Aos amigos do Laboratório de Pesquisas em Malária, Cesare Bianco Júnior, Daiana de
Souza Perce, Larissa Gomes, Paulo Totino, Vanessa Tosta, Larissa Longi, Dauto Freitas da
Silva, Cláudia Castro e Bianca Gama sempre dispostos a ajudar.
Aos novos amigos do Laboratório de Imunoparasitologia, Rodrigo Nunes, Rafaela
Veiga, Juan Camilo Sanchez Arcila e aos amigos da Pós Graduação em Biologia Parasitária,
Giselle Fagundes, Fernanda Heloíse e Priscila Andrade, pelo apoio e incentivo constantes.
A todos os funcionários e alunos do Laboratório de Imunoparasitologia do Instituto
Oswaldo Cruz, onde sempre fui tão bem recebida.
Ao Alexandre Fialho, do Laboratório de Virologia Comparada, que, sempre que
preciso, gentilmente me ajudava.
xi
Ao Dr. Pedro Cabelo do Laboratório de Genética Humana do IOC-FIOCRUZ, pelas
contribuições acerca das análises estatísticas.
A Fundação Oswaldo Cruz e ao CNPQ por terem financiado meus estudos e o projeto
de pesquisa, possibilitando o desenvolvimento do trabalho.
Ao meu querido sobrinho, João Pedro, companheiro de estudo e de madrugadas.
A todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente para o desenvolvimento
deste projeto.
Principalmente, a todos os voluntários do estudo, que gentilmente aceitaram participar
do projeto. Sem eles nada seria possível.
xii
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS.................................................................................................
xvi
LISTA DE FIGURAS..................................................................................................
xvii
LISTA DE ABREVIATURAS....................................................................................
xx
1. INTRODUÇÃO........................................................................................................ 1
1.1 Malária no Brasil.................................................................................. ............ 2
1.2 Ciclo Biológico do Plasmodium spp. ...............................................................
7
1.3 Aspectos gerais da resposta imune frente ao Plasmodium spp. na fase
eritrocítica................................................................................................................ 9
1.3.1 CÉLULAS DENDRÍTICAS....................................................................
10
1.3.2 CÉLULAS NK ....................................................................................... 11
1.3.3 CÉLULAS NKT.....................................................................................
1.3.4 CÉLULAS T γ/δ ....................................................................................
12
13
1.3.5 CÉLULAS B1......................................................................................... 14
1.3.6 OUTRAS CÉLULAS IMPORTANTES NA IMUNOREGULAÇÃO...
15
1.4 Citocinas na malária........................................................................................
15
1.5 Alterações Hematológicas na malária ............................................................
18
2. OBJETIVOS............................................................................................................
20
2.1 Objetivo Geral..................................................................................................
20
2.2 Objetivos Específicos.......................................................................................
20
3. JUSTIFICATIVA....................................................................................................
21
4. METODOLOGIA....................................................................................................
22
4.1 Área de estudo..................................................................................................
22
4.2 Voluntários......................................................................................................
27
4.2.1 PACIENTES............................................................................................
27
4.2.2 GRUPOS EM ESTUDO...........................................................................
28
4.2.2.1 Grupos de pacientes........................................................................ 28
xiii
4.2.2.2 Grupo Controle.................................................................................
28
4.3 Coleta de sangue..............................................................................................
28
4.4 Exame parasitológico para diagnóstico de malária e avaliação da
parasitemia.............................................................................................................. 28
4.5 Exame hematológico........................................................................................
29
4.6 Obtenção de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e
plasma...................................................................................................................... 29
4.7 Verificação da viabilidade celular e número de PBMC.................................
30
4.8 Congelamento e descongelamento das células mononucleadas do sangue
periférico.................................................................................... .............................. 30
4.9 Análise do fenótipo celular e do padrão de citocinas citoplasmáticas em
leucócitos do sangue periférico por citometria de fluxo........................................ 31
4.9.1 ANÁLISE DOS DADOS OBTIDOS NA CITOMETRIA DE FLUXO......
35
4.9.1.1 Células CD4+ e CD8+.......................................................................
35
4.9.1.2 Avaliação da ativação celular...........................................................
36
4.9.1.3 Linfócitos T e Tγδ............................................................................ 37
4.9.1.4 Células NK e NKT...........................................................................
38
4.9.1.5 Linfócitos B e subopulações.............................................................
40
4.10 Armazenamento dos dados..............................................................................
41
4.11 Análise estatística...........................................................................................
41
5. RESULTADOS........................................................................................................
43
5.1 Perfil da População de Estudo..........................................................................
43
5.2 Hemograma.......................................................................................................
46
5.2.1 AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS DOS
PACIENTES COM MALÁRIA NA FASE AGUDA (D0) .................................. 46
5.2.1.1 Correlações.......................................................................................... 48
5.2.2 COMPARAÇÃO DOS PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS DOS
PACIENTES COM MALÁRIA NA FASE AGUDA (D0) E DE
CONVALESCENÇA (D15) ................................................................................ 49
5.3 Perfil celular....................................................................................................... 53
xiv
5.3.1 AVALIAÇÃO DO PERFIL CELULAR DOS PACIENTES COM
MALÁRIA NA FASE AGUDA (D0) .................................................................. 53
5.3.1.1 Células CD4+, CD8+ e subpopulações produtoras de citocinas........
53
5.3.1.2 Células T (CD3+), Células CD3- e Células Tγδ (TCRγδ+) e
subpopulações produtoras de citocinas ........................................................ 55
5.3.1.3 Células NK, NKT e subpopulações (CD4+ e CD8+)........................
59
5.3.1.4 Células B (CD19+) e subpopulações................................................
59
5.3.2 COMPARAÇÃO DO PERFIL CELULAR EM PACIENTES COM
MALÁRIA NA FASE AGUDA (D0) E DE CONVALESCÊNCIA (D15) .........
61
5.3.2.1 Células CD4+ CD8+ e subpopulações produtoras de citocinas.........
61
5.3.2.2 Células T (CD3+), Células CD3- e Células Tγδ (TCRγδ+)...............
64
5.3.2.3 Células NK, NKT e subpopulações (CD4+, CD8+).................. .......
67
5.3.2.4 Células B (CD19+) e subpopulações................................................
67
6. DISCUSSÃO............................................................................................................
71
7. CONCLUSÃO.......................................................................................................... 77
8. PERSPECTIVAS.....................................................................................................
78
9. REFERÊNCIAS....................................................................................................... 79
10. ANEXOS................................................................................................................
xv
94
LISTA DE TABELAS
Tabela 4.1. Quadro demonstrativo dos anticorpos monoclonais utilizados para
análise de populações, subpopulações e do perfil de citocinas
intracitoplasmáticas
de
leucócitos
do
sangue
periférico
.................................................................................................................................... 32
Tabela 4.2. Quadro demonstrativo dos anticorpos monoclonais utilizados em
cada marcação na citometria de fluxo e os respectivos volumes utilizados ............
34
Tabela 5.1. Resumo do perfil epidemiológico dos pacientes estudados ..................
44
Tabela 5.2. Perfil epidemiológico dos pacientes de acordo com a espécie
plasmodial infectante ............................................................................................... 45
Tabela 5.3. Parâmetros de normalidade e valores hematológicos do Grupo-C e
dos
grupos
Pv
e
Pf
e
na
fase
aguda
da
infecção
(D0)......................................................................................................................... .... 47
Tabela 5.4. Variação dos valores hematológicos do Grupo-Pv, Grupo-Pf em dois
tempos, antes (D0) e pós-tratamento (D15) .............................................................
xvi
50
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1. Distribuição global e endemicidade da malária no mundo, 2009 ........ 2
Figura 1.2. Variação do número de casos de malária no Brasil (1960-2008) .......... 4
Figura 1.3. Casos de malária na Amazônia Legal (2008-2009) ...............................
6
Figura 1.4. Ciclo de biológico do Plasmodium spp. .................................................
8
Figura 4.1. Mapa geográfico de Rondônia ..............................................................
22
Figura 4.2. Evolução do Índice Parasitário Anual (IPA) de Rondônia entre os
períodos de 2003-2009 .............................................................................................. 23
Figura 4.3. Evolução do número de casos de malária diagnosticados no Brasil e
em Rondônia de 1974 a 2007 ................................................................................... 24
Figura 4.4. Evolução do número de casos de malária em Rondônia e em Porto
Velho, por espécie plasmodial durante o período de 2003 a 2009 ........................... 25
Figura 4.5. Caracterização da distribuição heterogênea da malária em Porto
Velho ......................................................................................................................... 26
Figura 4.6. Policlínica e voluntários do estudo.........................................................
27
Figura 4.7. Esquema representativo da análise utilizada para identificação de
células CD4+ e CD8+, e subpopulações produtoras de citocinas, através de
citometria de fluxo............................................................................................... ...... 35
Figura 4.8. Esquema representativo da análise utilizada para avaliação da
expressão do marcador de ativação celular CD25, em diferentes populações
celulares ..................................................................................................................... 36
Figura 4.9. Esquema representativo da análise utilizada para avaliação das
populações CD3+, CD3- e TCRγδ+, e subpopulações produtoras de citocinas,
através de citometria de fluxo............................................................................... .... 37
Figura 4.10. Esquema representativo da análise utilizada para avaliação de
células NKp46+ e subpopulações (CD4+, CD8+, IFN-γ+) .......................................... 38
Figura 4.11. Esquema representativo da análise utilizada para avaliação de
células NKT+ e subpopulações (CD4+, CD8+) .......................................................... 39
Figura 4.12. Esquema representativo da análise utilizada para avaliação de
células B (CD19+) e subpopulações .......................................................................... 40
Figura 4.13. Esquema explicativo da análise realizada............................................
42
Figura 5.1. Comparação entre as médias de valores hematológicos de indivíduos
do Grupo-Pv (n=47), Grupo-Pf (n=24) e do Grupo-C (n=17).................................. 48
xvii
Figura 5.2. Correlação entre parasitemia e número de plaquetas na fase aguda
da infecção (D0) dos pacientes do Grupo-Pv ........................................................... 49
Figura 5.3. Variações da hematimetria, do hematócrito e da plaquetometria em
pacientes do Grupo-Pv (n=40) e do Grupo-Pf (n=15), antes (D0) e pós
tratamento (D15) ...................................................................................................... 51
Figura 5.4. Variações nos valores de leucócitos, eosinófilos, bastões e linfócitos
em pacientes do Grupo-Pv (n=40) e do Grupo Pf (n=15), antes (D0) pós (D15)
tratamento ................................................................................................................. 52
Figura 5.5. Percentual de diferentes tipos celulares (CD4+CD8-, CD8+CD4- e
subpopulações) detectados em indivíduos do Grupo-Pv (n=40), do Grupo-Pf
(n=20) e indivíduos controles (Grupo-C; n=17), no momento do diagnóstico
(D0)............................................................................................................................. 54
Figura 5.6. Gráfico representativo da porcentagem de dupla marcação de
PBMC com anticorpos monoclonais específicos para CD4 e TNF-α; CD8 e TNFα.................................................................................................................................. 55
Figura 5.7. Gráfico representativo da marcação de PBMC com anticorpos
monoclonais específicos para CD3 e TNF-α. Células obtidas a partir do gate
morfológico de linfócitos ........................................................................................... 56
Figura 5.8. Percentual de diferentes tipos celulares (CD3-, CD3+ e
subpopulações) detectados em pacientes do Grupo-Pv ( n=40), do Grupo-Pf
(n=19) e em indivíduos do Grupo-C (n=17), no momento do diagnóstico (D0) .... 57
Figura 5.9. Percentual de células TCRγδ+ TNF-α+ detectados em indivíduos do
Grupo-Pv (n=46), do Grupo-Pf (n=21) e em indivíduos do Grupo-C (n=19), no
momento do diagnóstico (D0) ................................................................................... 58
Figura 5.10. Gráfico representativo da porcentagem de dupla marcação de
PBMC com anticorpos monoclonais específicos para TCRγδ e TNF-α .................. 58
Figura 5.11. Percentual de diferentes subpopulações de células CD19 + em
indivíduos do Grupo-Pv (n=40), do Grupo-Pf (n=20) e em indivíduos do GrupoC (n=18), no momento do diagnóstico (D0) ............................................................. 60
Figura 5.12. Histograma representativo da porcentagem de marcação de PBMC
com anticorpo monoclonal específico para TGF-β .................................................. 60
Figura 5.13. Gráfico representativo da porcentagem de dupla marcação de
PBMC com anticorpos monoclonais específicos para CD4 e CD25 ....................... 61
Figura 5.14. Variação no percentual de células CD4+CD25+ em indivíduos do
Grupo-Pv (n=32) e Grupo-Pf (n=12) antes (D0) e após o tratamento (D15) .......... 62
Figura 5.15. Gráfico representativo da porcentagem de dupla marcação de
PBMC com anticorpos monoclonais específicos para CD8 e TNF-α ...................... 62
xviii
Figura 5.16. Variação no percentual de diferentes tipos celulares (CD4 +CD8- e
subpopulações de CD4+ e CD8+) em indivíduos do Grupo-Pv (n=32) e do GrupoPf (n=12) antes (D0) e após o tratamento (D15) ...................................................... 63
Figura 5.17. Variação no percentual células CD3+ e CD3- em indivíduos do
Grupo-Pv (n=33) e Grupo-Pf (n=12) antes (D0) e após o tratamento (D15) .......... 64
Figura 5.18. Variação no percentual de diferentes tipos celulares (subpopulações
de CD3 – produtoras de diferentes citocinas) em indivíduos do Grupo-Pv (n=33)
e do Grupo-Pf (n=12) antes (D0) e após o tratamento (D15) .................................. 65
Figura 5.19. Gráfico representativo da porcentagem de dupla marcação de
PBMC com anticorpos monoclonais específicos para TCRγδ e TNF-α .................. 66
Figura 5.20. Variação no percentual de células TCRγδ+TNF-α+ em indivíduos do
Grupo-Pv ( n=38) e do Grupo-Pf (n=12) antes (D0) e após o tratamento (D15) .... 66
Figura 5.21. Variação no percentual de células NKp46+CD8+ em indivíduos do
Grupo-Pv (n=36) e do Grupo-Pf (n=12) antes (D0) e após o tratamento (D15) ..... 67
Figura 5.22. Variação no percentual de células CD19+CD5-CD11b- e
CD19+CD5+CD11b- em indivíduos do Grupo-Pv (n=36) e do Grupo-Pf (n=12)
antes (D0) e após o tratamento (D15) ...................................................................... 68
Figura 5.23. Quadro resumo das alterações hematológicas.....................................
69
Figura 5.24. Quadro resumo das alterações no perfil celular .................................. 70
xix
LISTA DE ABREVIATURAS
ADCI - Inibição celular dependente de anticorpos
APC- Aloficocianina
BSA – Albumina Sérica Bovina
CD11b – Grupamento de diferenciação 11b (“Cluster of differentiation 11b”), molécula
expressa em subtipos de células B.
CD25 – Grupamento de diferenciação 25 (“Cluster of differentiation 25”), molécula
expressa em células ativadas
CD3 - Grupamento de diferenciação 3 (“Cluster of differentiation 3”), molécula
expressa em células T
CD4 – Grupamento de diferenciação 4 (“Cluster of differentiation 4”), molécula
expressa na superfície de células T auxiliares e em subpopulações de células NKT e NK.
CD5 – Grupamento de diferenciação 5 (“Cluster of differentiation 5”), molécula
expressa em Células T, subtipo de células B
CD8 – Grupamento de diferenciação 8 (“Cluster of differentiation 8”), molécula
expressa na superfície de linfócitos T citotóxicos, e subpopulções de células NKT e NK.
Cols. - Colaboradores
DC – Células dendríticas
DDT - Dicloro-Difenil-Tricloroetano; Inseticida sintético
DMSO - Dimetilsulfóxido
D0 – Dia do diagnóstico, antes do tratamento
D15 – Quinze dias após o diagnóstico, pós-tratamento, quando os pacientes
encontravam-se curados.
EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético
FITC - Isotiocianato de fluoresceína
FSC – Tamanho (“Forward Scatter”)
GM-CSF – Fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos.
GPI – Glicosilfosfatidil inositol
IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IFN-γ – Interferon gama
IgG – Imunoglobulina G
IL – Interleucina
IPA – Indíce Parasitário Anual
KCl – Cloreto de Potássio
KH2PO4 - Fosfato de potássio monobásico
LT- α – Linfotoxina alfa
MHC – Complexo principal de histocompatibilidade (“Major Histocompability
Complex”)
n – Número de amostras
Na2HPO4.7H2O - Fosfato de sódio heptaidratado
NaCl – Cloreto de Sódio
NK – “Natural Killer”
NKp30 – Molécula expressa na superfície de células NK
NKp44 – Molécula expressa na superfície de células NK
NKp46 – Molécula expressa na superfície de células NK
NKT – “Natural killer like T-cell”
OMS – Organização Mundial de Saúde
PBMC - Células mononucleadas de sangue periférico
PBS – Solução Salina Tamponada com fosfato (“Phosphate- Buffered Saline”)
xx
PE – Ficoeritrina
PE-Cy5 - Ficoeritrina-cianina 5
PE-Cy7 - Ficoeritrina-cianina 7
PE-TR – Ficoeritrina – Texas Red
pH – Potencial hidrogeniônico
PHA - Fito-hemaglutinina
PIACM - Plano de Intensificação das Ações de Controle da Malária
PNCM - Plano Nacional de Controle a Malária
RO – Rondônia
SFB – Soro Fetal Bovino
SIVEP - Sistema de Informação de Vigilância Epidemiológica
SSC – Granularidade (“Side Scatter”)
SVS – Secretaria de Vigilância em Saúde
TCR – Receptor de célula T (“T cell receptor”)
TGF-β – Fator de Crescimento Tumoral Beta (também conhecido como Fator de
Crescimento Transformante Beta)
Th- Células T auxiliares
TNF-α – Fator de necrose tumoral alfa
WHO – Organização Mundial de Saúde
X g – Aceleração da gravidade
xxi
1. INTRODUÇÃO
A malária faz parte da história da humanidade e acomete o homem desde a pré-história.
É uma doença infecciosa de elevada prevalência, morbidade e letalidade, sendo causada por
hematozoários do gênero Plasmodium. As espécies de plasmódios causadoras desta patologia
incluem Plasmodium falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale, sendo que a última
apresenta distribuição limitada ao continente africano. Uma quinta espécie, P. knowlesi,
parasita de macacos, foi descrita recentemente causando infecção em humanos (1). Dentre
essas espécies, P. falciparum e P.vivax são as mais prevalentes no mundo, sendo P.
falciparum a espécie associada com a forma mais grave da doença enquanto a infecção por P.
vivax geralmente é considerada benigna (2). Os vetores de Plasmodium spp. são mosquitos do
gênero Anopheles, destacando-se Anopheles gambiae e Anopheles darlingi como principais
vetores (3, 4).
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), mais da metade da população
mundial está exposta à malária. Em 2008, foram estimados 243 milhões de casos de malária no
mundo e cerca de 863.000 mortes (Figura 1.1) (5). Nas Américas a malária ocorre em 21
países (Figura 1.1), sendo o P. vivax responsável por quase 80% dos casos. Em 2008, foram
notificados 572 mil casos de malária nas Américas, sendo o Brasil responsável por mais de
50% dos casos (5).
1
Figura 1.1. Distribuição global e endemicidade da malária no mundo, 2009.
(Fonte: WHO 2009 (5))
1.1
Malária no Brasil
A malária foi identificada pela primeira vez, nos escritos médicos brasileiros no século
XVI. Nos meados da década de 1870, ocorreu a primeira grande epidemia de malária na
Amazônia, decorrente da migração de indivíduos não imunes para áreas endêmicas de malária,
atraídos pela extração de borracha (6). Nesse mesmo período, no sudeste do país, a transmissão
crescia acentuadamente na Baixada Fluminense e no Vale do Paraíba, em decorrência da abolição da
escravatura que fizeram cessar os trabalhos de combate à malária até então realizados pelos escravos
(7). No início do século XX, a malária encontrava-se disseminada em todo o território nacional,
exceto em alguns estados do sul (6). Na primeira metade do século XX, outras duas grandes
epidemias de malária ocorreram: a primeira durante a construção da Ferrovia Madeira-Mamoré
que resultou em uma nova onda de migração de indivíduos não imunes para áreas de elevada
endemicidade da doença, calcula-se que tenha havido mais de 10 mil mortes entre
trabalhadores (6). A segunda no Nordeste brasileiro, na década de 1930, quando navios
franceses que faziam a rota postal França-Natal via Dakar trouxeram o Anopheles gambiae que invadiu
o Nordeste brasileiro. Esse vetor apresenta elevada capacidade vetorial o que gerou um aumento
estrondoso na transmissão da doença. Em várias localidades, o número de casos atingia cerca
2
de 80-90% da população. O vetor introduzido foi erradicado após grandes esforços e
investimentos realizados pelo Governo Federal e pela Fundação Rockfeller (8, 9).
Após o advento do DDT houve uma drástica redução da malária em diversos países do
mundo, inclusive no Brasil, onde a doença ficou restrita, quase que exclusivamente, à Região
Amazônica. Entretanto, a partir da década de 60, a malária ressurgiu em várias localidades do
planeta. Este aumento está relacionado a diversos fatores como, por exemplo, o aparecimento
de resistência tanto dos anofelinos aos inseticidas quanto dos agentes etiológicos aos antimaláricos e a dificuldade na manutenção de medidas de controle à doença em determinadas
áreas devido a condições precárias de habitação (ausência total ou parcial de paredes para
aplicação de inseticida), ao acesso difícil a muitas localidades e a precariedade dos serviços
permanentes de saúde (10).
A partir da década de 70, observou-se um crescente número de casos de malária no
Brasil (Figura 1.2). Este aumento deveu-se principalmente ao processo de colonização e às
atividades de mineração, ambos incentivados pelo governo brasileiro que pretendia promover o
desenvolvimento da Região Amazônica. Como resultado, houve mais uma vez, um processo
migratório de indivíduos para esta região, com o esperado aumento do número de casos de
malária no país, já que este processo de migração não foi acompanhado pelo desenvolvimento
da estrutura de saúde (11).
No ano 2000 teve início o Plano de Intensificação das Ações de Controle da Malária
(PIACM), criado pelo Ministério da Saúde do Brasil, que resultou em uma série de ações
como contratação e capacitação de recursos humanos além da aquisição de novos
equipamentos. Este projeto teve duração de dois anos e resultou em uma redução significativa
do número de casos da malária na região, conforme pode ser observado na Figura 1.2 (11).
Em 2003 o PIACM foi substituído pelo Plano Nacional de Controle a Malária (PNCM)
que buscava a manutenção dos ganhos obtidos no plano anterior além de uma melhora do
mesmo. Apesar dos esforços, o número de casos de malária voltou a aumentar em 2003. Este
aumento tem sido relacionado com a ocupação desordenada de periferias de cidades como
Manaus (Amazonas), Porto Velho (Rondônia) e Cruzeiro do Sul (Acre), além de atividades
como extração de madeira, criação de gado, agricultura e estabelecimento de assentamentos
não oficiais (12).
3
Figura 1.2. Variação do número de casos de malária no Brasil (1960-2008)
700
Número de Casos (mil)
600
500
400
300
200
100
1960
1983
Casos
1999
P. falciparum
2002
2006
2008
P. vivax
Fonte: Adaptado SVS, 2007 (11)
Após 3 anos de aumento consecutivo, a partir de 2006, o número de casos de malária
no Brasil começou a decair, como resultado de ações integradas de controle, realizadas no
âmbito federal, estadual e municipal. Esses decréscimos estão relacionados a diversos fatores
dentre os quais se destacam a implementação de diagnóstico e tratamento rápidos e precisos,
que também são responsáveis pela diminuição acentuada no número de infecções decorrentes
por P. falciparum (13).
Atualmente, o Brasil é considerado área de transmissão instável de malária (população
exposta contínua ou intermitentemente a taxas de inoculação flutuante) e contribui com o
maior número de casos no continente americano. Na Amazônia Legal, que inclui os estados
do Acre, Amazonas, Amapá, Maranhão, Mato Grosso, Pará, Rondônia, Roraima e Tocantins,
ocorrem mais de 99% dos casos de malária do país, sendo a distribuição não homogênea
(Figura 1.3) (13). Em 2009 foram registrados 306.982 casos de malária no Brasil, sendo
256.383 por P. vivax, 47.475 P. falciparum, 95 por P. malariae e 3 por P. ovale, além de
3.026 infecções mistas (P. vivax e P. falciparum) (14). Como observado, quase a totalidade
dos casos no país é resultante de infecções por P. vivax e/ou por P. falciparum. Infecções por
4
P. malariae são encontradas em um percentual reduzido (Figura 1.3), além de algumas raras
infecções não autóctones por P. ovale (14). Os principais vetores no país são Anopheles
darlingi, A. aquasalis, A. albitarsis e A. marajoara (15).
5
Figura 1.3. Casos de malária na Amazônia Legal (2008-2009)
Fonte: Ministério da Saúde, 2009 (16)
6
1.2
Ciclo biológico do Plasmodium spp.
O ciclo dos plasmódios é complexo, apresentando duas fases no hospedeiro vertebrado:
fase pré-eritrocítica e eritrocítica. Durante o repasto sanguíneo a fêmea do anofelino infectada
inocula esporozoítas na pele do hospedeiro vertebrado. Destes esporozoítas a maioria migra
até capilares sanguíneos onde atingem a circulação para chegarem rapidamente ao fígado.
Recentemente foi demonstrado que alguns dos esporozoítas podem migrar para vasos
linfáticos se localizando, então, nos linfonodos drenantes e que a maioria deles permanece na
derme durante algumas horas (1-3 horas) (17, 18).
Os esporozoítas que chegam ao fígado logo se aderem as células endoteliais dos
sinusóides hepáticos e iniciam o processo de movimentação denominado de gliding, no qual
eles fazem um deslizamento. Em seguida eles atravessam a barreira sinusal, provavelmente via
células de Kupfer. Uma vez no parênquima hepático estes parasitas migram através de diversos
hepatócitos de forma ativa. Em um determinado momento o esporozoíta promove uma adesão
mais firme em um hepatócito e inicia simultaneamente a formação de um vacúolo parasitóforo.
Os fatores que tornam um hepatócito adequado para o desenvolvimento do esporozoíta ainda
não estão esclarecidos (19).
Dentro do vacúolo parasitóforo os esporozoítas iniciam um processo de maturação e
de divisão celular (reprodução assexuada- esquizogonia extra-eritrocítica). Como resultado
desta fase há o desenvolvimento de esquizontes hepáticos, repletos de merozoítas no seu
interior. Durante esta etapa do ciclo a infecção é assintomática. Em um determinado momento
há liberação
dos merozoítas para a circulação sanguínea, ou por ruptura do
hepatócito/esquizonte ou através de merossomas, dando início ao estágio eritrocítico (19, 20).
Os merozoítas invadem o eritrócito de forma ativa e há a formação de um novo
vacúolo parasitóforo. O parasita se diferencia em anel (trofozoíta jovem), que posteriormente
se diferencia em trofozoíta maduro. Esses iniciam novamente um processo de reprodução
assexuada gerando a formação de esquizontes sanguíneos, também repletos de merozoítas. No
final desse estágio os merozoítas recém formados são liberados e invadem outros eritrócitos,
repetindo o ciclo eritrocítico. Alguns merozoítas porém, se diferenciam em gametócitos
masculinos e femininos (forma sexuada do parasita). Estes, quando ingeridos pelos anofelinos,
dão continuidade ao ciclo no interior do hospedeiro invertebrado (19, 20).
No interior do anofelino os gametócitos se diferenciam em gametas, há a fecundação
(reprodução sexuada) com formação do zigoto. O zigoto se diferencia em uma forma móvel
7
(oocineto) que penetra a membrana peritrófica do intestino médio do anofelino. Nessa fase,
inicia-se o processo de multiplicação celular que resulta na formação de diversos esporozoítas
que vão para a glândula salivar do mosquito. Esses quando inoculados no hospedeiro
vertebrado darão prosseguimento ao ciclo, conforme mostrado na figura 1.4.
Figura 1.4. Ciclo de biológico do Plasmodium spp.
Adaptado de (21).
Algumas espécies plasmodiais apresentam importantes particularidades no ciclo. Por
exemplo, enquanto P. vivax parasita apenas reticulócitos e causa uma parasitemia menor, P.
falciparum é capaz de infectar eritrócitos em qualquer estágio de maturação e é responsável,
na maioria dos casos, por intensa parasitemia. A elevada parasitemia aliada ao seqüestro de
hemácias parasitadas por P. falciparum na microcirculação são responsáveis pela maior
mortalidade observada na infecção por esta espécie. P. vivax, no entanto, é capaz de manter-se
na forma de hipnozoíta hepático, fato responsável por episódios de recaídas. Além disso,
apesar da infecção por P. vivax muitas vezes ser considerada benigna, relatos de casos de
malária por esta espécie com complicações graves e fatais vêm sendo reportado desde 1998
inclusive no Brasil. A sintomatologia da malária por P. vivax em geral é até mais intensa do
8
que a maioria das infecções por P. falciparum, embora a noção popular seja o contrário. Esta
noção equivocada associada à preocupação com os altos níveis de mortalidade relacionados ao
P. falciparum, torna, muitas vezes, a infecção por P. vivax negligenciada (22).
1.3 Aspectos gerais da resposta imune frente ao Plasmodium spp. na fase eritrocítica
A fase eritrocítica dos plasmódios é responsável pelas manifestações patológicas da
doença, uma vez que os sintomas clínicos são decorrentes do desenvolvimento parasitário
durante essa fase. Diversos trabalhos têm demonstrado que a imunidade direcionada ao estágio
eritrocítico pode contribuir para a redução/eliminação dos parasitos e para o desenvolvimento
das manifestações clínicas da doença (23).
A aquisição de uma imunidade protetora direcionada à infecção malárica natural pode
ser adquirida, após sucessivas infecções, por populações de área endêmica. Essa imunidade,
denominada de premunição, torna os sintomas clínicos da doença geralmente ausentes
(imunidade clínica ou anti-doença) e os níveis de parasitos sanguíneos extremamente baixos
(imunidade anti-parasito) atingindo níveis subpatentes (24-26). O processo de aquisição de
imunidade na malária é, ainda hoje, pouco compreendido, sendo que inúmeros fatores o
influenciam, como: a complexidade do ciclo biológico dos plasmódios, sua extensa diversidade
antigênica, o perfil de transmissão da área endêmica, a imaturidade do sistema imunológico
relacionado à idade, a mecanismos inatos de resistência que diferem intra e inter-etnicamente
(27-29). É interessante ressaltar que estudos realizados em seres humanos demonstraram que
uma imunidade protetora, similar a adquirida naturalmente, pode ser induzida após sucessivos
inóculos com eritrócitos infectados por P. falciparum (30)
Em regiões de alta transmissão na África, onde o P. falciparum é a espécie
predominante, os recém-nascidos são relativamente resistentes à infecção durante os primeiros
meses de vida. Essa resistência é atribuída principalmente pela transferência passiva de
anticorpos protetores da classe IgG da mãe para o feto durante a gestação (31, 32). O papel
protetor dos anticorpos em seres humanos, foi claramente demonstrado a partir de
experimentos de transferência passiva de anticorpos de soro de adultos imune para crianças
com malária, realizados nas décadas de 60 (33, 34) e 90 (35). Os anticorpos passivamente
transferidos diminuíam a parasitemia e protegiam as crianças da forma grave da doença (36).
Experimentos em modelos simianos demonstraram que a proteção conferida pela transferência
passiva de soro imune era mediada por anticorpos citofílicos IgG1 e IgG3 (37, 38). Com base
9
em experimentos in vitro, os anticorpos citofílicos anti-P. falciparum agiriam bloqueando: a
invasão dos eritrócitos pelos merozoítas, a citoaderência de eritrócitos infectados, e em
colaboração com monócitos e macrófagos o desenvolvimento intra-eritrocítico (inibição
celular dependente de anticorpos – ADCI) (39-41). Corroborando esses dados, BouhaunTayoun e cols. (1990; 1995) (42, 43), propuseram que os anticorpos citofílicos teriam um
papel central na mediação do fenômeno de premunição na malária, tais subclasses são
predominantes em indivíduos protegidos (44, 45). Entretanto, apesar do importante papel dos
anticorpos na imunidade anti-parasitária adquirida contra as formas eritrocíticas, a resposta
imune mediada por células também contribui nesse processo. Estudos realizados em seres
humanos, demonstraram que após repetidos inóculos com doses ultra-baixas de eritrócitos
infectados com P. falciparum, voluntários sadios e sem história prévia de malária foram
capazes de desenvolver uma imunidade protetora contra doença, mediante o desafio com doses
infectantes do parasito, com ausência de parasitemia e sintomas clínicos. A resposta imune
desses indivíduos foi caracterizada, pela resposta proliferativa de células T CD4 + e T CD8+ e
da secreção de interferon (IFN)-γ, porém não de interleucina (IL)-4 e IL-10, consistindo em
uma resposta imunológica do tipo Th1. Além disso, foi observada uma alta concentração da
atividade da enzima óxido nítrico sintase em células mononucleares do sangue periférico (30).
Trabalhos têm sugerido que as interações iniciais entre os parasitos da fase eritrocítica e as
células do sistema imunológico inato são importantes no controle da multiplicação do parasito
e posteriormente na eliminação e resolução da infecção (23). O principal papel da imunidade
inata parece ser a produção de citocinas moduladoras da resposta imune, como a IL-12 e IFNγ, que são críticas para o desenvolvimento de resposta imune tipo Th1 envolvendo células T
CD4+, células B e células efetoras que medeiam a reposta imune adaptativa tanto celular e
quanto humoral (23).
Dentre os componentes envolvidos na imunidade inata se encontram as células
dendríticas, monócitos/macrófagos, células natural killer (NK), células NKT, células T γ/δ e
células B1.
1.3.1 CÉLULAS DENDRÍTICAS
As células dendritícas (DC) desempenham um importante papel na ativação das
respostas imunes inata, adquirida e na indução e na manutenção da tolerância imunológica (46)
devido à sua elevada capacidade em capturar, processar e apresentar antígenos. Cabe ressaltar
que as DC são as únicas células apresentadoras de antígenos capazes de ativar células T não10
primadas (47) e que apresentam um importante papel na amplificação da resposta imune inata,
particularmente estimulando a ativação de células NK (48). Em humanos, as DC constituem
0,1-0,5% das células mononucleares sanguíneas (49). Na malária humana, foi observado que as
populações de células dendríticas estão reduzidas no sangue dos indivíduos infectados por P.
falciparum (23). Há evidências que essas células em contato com as hemácias infectadas por
P. falciparum diminuem a expressão de MHC, de moléculas de adesão e co-estimulatórias e
não secretam IL-12, a principal citocina pró-inflamatória envolvida na polarização da reposta
imune tipo Th1 (50). Esses trabalhos sugerem que a indução da imunodepressão via DC, pelo
P. falciparum, além de ser um mecanismo de escape do parasito talvez seja um fator de
virulência específico desse plasmódio. Para o P. vivax na fase pré-eritrocítica, foi demonstrado
que as DC estimuladas por esporozoítas ativam linfócitos citotóxicos, levando a uma
eliminação específica de hepatócitos infectados (51).
1.3.2 CÉLULAS NK
As células natural killer (NK) são grandes linfócitos granulares derivados da medula
óssea, presentes tanto em órgãos linfóides quanto em tecidos não linfóides periféricos. As
células NK, compõem de 10 a 15% das células mononucleares sanguíneas (52-54). Essas
células são ativadas em resposta às citocinas derivadas principalmente de macrófagos e células
dendríticas como, IL-12, IL-18, IFN-α e IFN-β. Quando ativadas, as células NK secretam
grandes quantidades de IFN-γ, uma citocina pró-inflamatória essencial para o controle da
infecção malárica via indução de mecanismos que incluem a ativação de macrófagos, a
diferenciação de linfócitos T CD4+ e a produção de anticorpos por linfócitos B (52, 55). As
células NK secretam outras citocinas pro-inflamatórias, particularmente a linfotoxina-α (LTα), TNF-α, IL-3, GM-CSF e quimiocinas (52, 56).
Na malária humana por P. falciparum, foi demonstrado, in vitro, que as células NK são
as primeiras a serem ativadas quando células mononucleadas são expostas a hemácias
infectadas por P. falciparum e que as concentrações séricas de IFN-γ e de granzimas A e B se
elevam logo após a detecção de parasitos na circulação e no início dos sintomas (55, 57, 58).
Estes dados sugerem que a rápida produção de IFN-γ pode por um lado ocasionar um
aumento na habilidade de controlar a infecção e por outro predispor o hospedeiro a produção
exagerada de citocinas inflamatórias o que aumentaria o risco de desenvolvimento de malária
severa.
11
As células NK apresentam em sua superfície vários receptores dentre eles: NKp30,
NKp44, NKp46, Ly49D, CD94-NK62A e KIR (do inglês, Killer Immunoglobulin-like
receptor), que são importantes moduladores, pois liberam sinais de ativação ou inibição
dependentes dos ligantes e do polimorfismo dos receptores, principalmente do KIR.
Recentemente, foi observado que as células NK podem expressar em sua superfície moléculas
CD4 e CD8 (59, 60). A expressão de moléculas CD4 pela célula NK parece não interferir em
sua atividade citotóxica. Entretanto, há evidências que as células NK CD4 + secretem maior
quantidade de TNF-α e IFN-γ que as células NK CD4- (59). Cabe ressaltar que, até o presente
momento nenhum trabalho foi publicado sobre as subpopulações de células NK (CD4 +, CD8+)
na malária.
1.3.3 CÉLULAS NKT
As células T natural killer (NKT), são um subgrupo de linfócitos que expressam
marcadores de células NK (CD161 e CD94) bem como receptores de células T (TCR) α/β
(Vα24 Vβ11, em humanos) com um repertório limitado, que os distingue das células NK que
não expressam TCR. Em contraste com as células T, os TCR das células NKT não interagem
com peptídeos apresentados pelas moléculas do complexo principal de histocompatibilidade
(MHC) e sim com glicolipídeos apresentados pelas moléculas CD1d, uma via não clássica de
apresentação de antígenos. Na malária existem algumas evidências de que o GPI (glicosilfosfatidil-inositol) do plasmódio seja um ligante de CD1d (61). Ao reconhecerem os antígenos,
as células NKT são rapidamente ativadas secretando grande quantidade citocinas,
particularmente de IL4 e/ou de IFN-, que modulam tanto a resposta imune inata quanto
adaptativa (62). As células NKT ativadas apresentam também habilidades citotóxicas, secretam
perforina e expressam ligantes FAS e receptores NKG2D (63-65). Dois tipos de células NKT
foram descritas, as que secretam preferencialmente citocinas do perfil Th1 e as que secretam
preferencialmente citocinas do perfil Th2. Dentro das células tipo Th1 há duas subpopulações
definidas: as duplo-negativas CD4-CD8- e as CD8+. As células NKT tipo Th2 expressam em
sua superfície moléculas CD4+ (63). As células NKT, compõem de 0,1 - 0,5% dos leucócitos
sanguíneos (66). Os principais estudos associando a infecção malárica e o papel de células
NKT tem sido realizados em modelo murino (61, 64, 67-70). Esses trabalhos demonstram
claramente que logo após a infecção, as células NKT são ativadas podendo liberar tanto uma
maior quantidade de IFN- que levaria ao predomínio de resposta tipo Th1 quanto uma maior
quantidade de IL-4 que acarretaria no predomínio de resposta tipo Th2 e que o predomínio de
12
resposta é dependente da linhagem de camundongo e da espécie/sub-espécie de plasmódio
infectante. Entretanto, está bem caracterizado que predomínio da resposta tipo Th1 no início
da infecção malárica está associado a um bom prognóstico da evolução da infecção murina
(71). Na malária humana, estudos sobre a atividade de NKT são extremamente escassos.
Nesses estudos foi demonstrado que: i) durante a infecção por P. vivax e P. falciparum há um
aumento das células NKT (70) e; ii) as células NKT são a segunda população ativada quando
células mononucleares são expostas a eritrócitos infectados por P. falciparum e que
provavelmente o GPI do parasito estimula as células NKT a produzirem IL-4 e IFN- γ (55,
68).
1.3.4 CÉLULAS T γ/δ
Os linfócitos Tγδ são distintas dos linfócitos T tradicionais (Tαβ) por apresentarem em
sua superfície TCR formado por cadeias γ e δ, sendo que a maioria das células γ/δ sanguíneas
(75%) expressam o TCR Vγ9Vδ2 (G9D2). Esta subpopulação celular expressa ainda
moléculas de CD3 formando o complexo TCR e podem expressar moléculas CD4 e CD8. O
reconhecimento de antígenos (fosforilados e não peptídicos) ocorre diretamente, sem a
apresentação via MHC (72, 73). Diferente dos linfócitos Tαβ as células Tγδ apresentam uma
diversidade limitada (74). Em indivíduos saudáveis as células Tγδ são encontradas tanto em
tecidos como no sangue, representando 1-10% dos linfócitos do sangue periférico (74, 75).
As Tγδ são fontes importantes de citocinas pró inflamatórias (TNF-α, IFN-γ) e
apresentam atividade citotóxica via perforina/granzima, FasL e TNF-α (Sigal, 2005). Foi
observado que as células TCRγδ+CD4+CD8- secretam elevados níveis de citocinas e
apresentam reduzida atividade citotóxica, enquanto as células TCRγδ +CD4-CD8+ e as
TCRγδ+CD4-CD8- secretam citocinas em baixas concentrações, porém são células com potente
atividade citotóxica (74).
Durante a fase aguda de infecção pelos plasmódios, tanto em humanos quanto em
modelos murinos não imunes, as células Tγδ encontram-se em número bastante elevado na
circulação o que sugere sua importante participação no controle do crescimento do parasito
(20, 76-78).
Apesar da relevância desse fenômeno ainda não ter sido esclarecida, foi
demonstrado que células Tγδ ativadas, com hemácias infectadas por P. falciparum, produzem
uma grande quantidade de IFN-γ, TNF-α e granulisina que apresentam ação antiparasitária
(23).
13
Poucos estudos abordam o papel de células Tγδ na patofisiologia da malária.
Entretanto, em modelo murino, foi observado que na malária cerebral, há um acúmulo destas
células nos vasos cerebrais. Adicionado a este fato, camundongos sensíveis a malaria cerebral
quando depletados de células Tγδ, passam a ser resistentes sugerindo que estas células estejam
diretamente envolvidas no agravamento da malária (79, 80). Na malária humana, há evidências
de que o aumento do percentual de células Tγδ no sangue periférico esteja diretamente
correlacionado com a intensidade de sintomas (78).
1.3.5 CÉLULAS B1
As células B-1 CD5+ (células B1-a), são uma subpopulação de linfócitos B descritas na
década de 80, possuem grande capacidade de apresentação de antígeno e secretam
preferencialmente auto-anticorpos naturais de baixa afinidade e não patológicos da classe IgM
que reagem com uma grande variedade de antígenos próprios ou não (81-84). Os autoanticorpos naturais podem participar no processo de imunoregulação ligando-se a outras
imunoglobulinas, a citocinas, a complexos antígeno-anticorpo, a linfócitos, e a timócitos (81).
Além da função protetora, os anticorpos naturais podem atuar na eliminação de células
apoptóticas (84). Recentemente foi observado que algumas células possuem características
semelhantes às células B1 e não apresentam o marcador CD5. Essas foram denominadas de
células B1-b (85). Em humanos, as células B1 constituem 1-7% das células mononucleares
sanguíneas (86) e o fenótipo dessas células ainda não foi bem definido (87). Sabe-se que
produzem IL-10, citocina antiinflamatória envolvida na resposta de células T reguladoras e na
estimulação de células B (diferenciação, proliferação e produção de anticorpo), podendo
restabelecer o equilíbrio Th1/Th2 e inibir a cascata da resposta inflamatória (84).
Na malária murina, há evidências que ativação de células B-1, no início da infecção,
seja importante na sobrevida dos camundongos provavelmente através da regulação das
subpopulações das células Th1 e Th2 (88). Na malária humana sabe-se que há uma ativação
policlonal de linfócitos B com produção de auto-anticorpos (89, 90), porém, até o momento,
nenhum estudo foi realizado sobre as células B-1 e seu papel na modulação da infecção e da
resposta imune protetora na malária.
14
1.3.6 OUTRAS CÉLULAS IMPORTANTES NA IMUNOREGULAÇÃO
Subpopulações de células T e de células B especializadas na supressão da resposta
imune celular vêm sendo alvo de recentes e intensas investigações. Essas células dotadas de
propriedade antiinflamatórias e que agem tanto através de mecanismos antígenos-específicos
como não-específicos, podem regular a resposta imune inata e adaptativa (91-93).
Vários trabalhos têm demonstrado a importância das células T reguladoras (Tregs) na
modulação de respostas imune de diversas infecções inclusive na malaria humana (94) tanto
pelo contato direto mediando a morte celular via granzimas quanto pela produção de citocinas
imunorregulatórias (IL-10 e TGF-1). Em humanos, as Tregs constituem 1-2% das células T
CD4+ circulantes (95). Tanto a produção de TGF-1 quanto à presença de células Tregs, em
indivíduos experimentalmente infectados, estavam associadas positivamente com as altas taxas
de crescimento do P. falciparum in vivo (96). É possível que, na malária humana, a
estimulação de células Tregs por P. falciparum, no início da parasitemia, possa ser um fator de
virulência específico desse parasita.
As células B reguladoras (Bregs) produzem anticorpos das classes IgG e IgA e
citocinas imunorregulatórias, IL-10 e TGF-. Estudos de várias doenças auto-imunes e
infecciosas em modelo murino, demonstraram que as células Bregs são especificamente
ativadas em processos infecciosos e suprimem a progressão exacerbada da resposta imune,
pela secreção de IL-10 e TGF-1 e pela neutralização de fatores solúveis através da produção
de IgG e IgA e pela depressão da ativação de células dendríticas e macrófagos através pela
interação das IgG com o receptor FcRIIB (97). Nenhum estudo foi realizado sobre as células
Bregs e seu papel na modulação da infecção e da resposta imune protetora na malária murina
ou humana.
1.4
Citocinas na malária
Estudos no modelo murino e em humanos indicam que as citocinas junto com as células
T, células NK, macrófagos, dentre outras contribuem tanto para o controle da infecção
malárica quanto para a persistência e aumento da parasitemia (26, 55, 98-101). O equilíbrio
entre as citocinas Th1 e Th2 parece ser crucial no controle dos sintomas clínicos da doença
livrando o hospedeiro do desenvolvimento dos quadros graves ou moderados da infecção.
Entretanto, o papel de cada citocina em humanos durante a infecção ainda não está claro.
15
Portanto, é extremamente importante a avaliação da expressão de diferentes citocinas por estas
células durante a infecção malárica.
Vários trabalhos mostram que o IFN-γ é o indutor chave dos mecanismos imunes
efetores essenciais para o controle inicial da infecção tanto das formas pre-eritrocíticas quanto
eritrocíticas (101, 102), mas há evidências de que níveis altos de IFN-γ podem contribuir para
o desenvolvimento da patologia (55). Recentemente, Andrade e cols. (2010) (103) mostraram
uma correlação positiva entre concentrações plasmáticas de IFN-γ e severidade da doença.
Kossoda e Grau (1993) (104) destacam que esta citocina pode apresentar papel na patogênese
da malária cerebral, já que a neutralização da mesma preveniu o aparecimento de alterações
neurológicas no modelo murino.
Em crianças e grávidas a produção de IFN-γ em resposta a eritrócitos infectados por P.
falciparum estava correlacionada com proteção clínica (105-107). Foi observado também que
células obtidas de crianças com malária não grave produzem mais IFN-γ quando estimuladas
com antígenos dos esporozoítas ou dos merozoítas quando comparado com células de crianças
com malária grave (108). A produção de IFN-γ foi também correlacionada com a resistência à
reinfecção por P. falciparum e a proteção contra a manifestação clínica da malária (100, 108).
O desenvolvimento de hiperparasitemia em crianças com malária por P. falciparum
parece estar relacionado a baixas concentrações de células T CD4+ secretoras de IFN-γ (109).
Por outro lado, Ong’echa e cols. (2003) (110) destacaram que a presença de IFN-γ no
sobrenadante de cultura celular de crianças naturalmente expostas ao parasita correspondia a
altas concentrações de hemoglobina e a significativa redução na prevalência de anemia grave.
Já Farouk e cols. (2005) (111) mostraram que indivíduos de comunidades africanas menos
susceptíveis à malária apresentam níveis altos de IFN-γ quando comparadas a indivíduos de
outras comunidades mais susceptíveis à infecção, porém com a mesma intensidade de
transmissão.
Outros estudos também relataram associação entre altos níveis de TNF-α e morte do
parasita (112-114). Além disso, o percentual de células T específicas para o P. falciparum
expressando TNF-α já foi associado a menor taxa de reinfecção (115). As hipóteses dos
mecanismos de ação do TNF-α que resultariam em proteção ao plasmódio seriam: aumento da
expressão de receptores Fc com aumento da atividade fagocítica de macrófagos, estimulação
de neutrófilos e regulação da produção de IL-12 por macrófagos (115). Quanto ao papel do
TNF- α na patogênese da malária ainda não se sabe, se ele é resultante de um efeito deletério
direto do próprio, ou se é conseqüência da habilidade desta citocina estimular a produção de
outros mediadores como IFN-γ, IL-1, IL-6, óxido nítrico e espécies reativas do oxigênio.
16
Fatores como a população celular produtora de TNF-α, a presença de outras citocinas no meio
e genótipo do hospedeiro parecem influenciar o papel biológico desta citocina na malária
(115).
A interleucina 2 (IL-2), que também é característica da resposta do tipo 1, é um
produto predominantemente de células CD4+. O efeito desta citocina nas células alvo inclui
mitogênese de células tipo 1 e estimulação de citotoxicidade em células T citotóxicas e NK. O
papel desta citocina na malária ainda não está bem elucidado. Foi observado que células
mononucleadas de crianças com malária não complicada apresentam capacidade de produção
de IL-2 preservada, apesar de estar diminuída durante o desaparecimento dos parasitas
circulantes. Esta citocina parece ter papel ativador de células Tγδ na malária e o tratamento de
camundongos infectados com P. yoelii com IL-2 resultou no acúmulo destas células no
cérebro tornando-os susceptíveis a malária cerebral (116).
A interleucina 4 (IL-4) parece desempenhar um papel regulador na infecção malárica,
através da inibição da resposta Th1. Esta citocina pode ainda atuar através da indução de
anticorpos específicos que podem ser protetores (117). Além disso, estudos demonstraram que
a IL-4 também pode estar envolvida na aquisição de memória na resposta imune à malária na
fase pré-eritrocítica (118-120). Estudos indicam que a produção de IL-4 atua prevenindo o
desenvolvimento de malária cerebral. Através da avaliação de expressão gênica foi
demonstrado que há uma supressão na expressão de IL-4 em camundongos sensíveis a malária
cerebral. Outro dado que colabora para esta observação é que há uma menor produção desta
citocina quando células de camundongos sensíveis a malária cerebral são expostas a eritrócitos
infectados (104). Na malaria humana, um estudo desenvolvido por Cabantous e cols. (2009)
(121) detectou níveis elevados de IL-4 circulante em crianças com malária severa, quando
comparados com aquelas com malária não severa e níveis elevados de IL-4 estavam associados
à anemia severa.
A interleucina 10 (IL-10) foi identificada primariamente como uma citocina
imunorreguladora, com capacidade de inibir a produção de diversas citocinas. Atualmente já se
sabe que ela é pleiotrópica com efeito biológico em vários tipos celulares. Ela atua na
sobrevivência, proliferação e diferenciação de células B (91, 122). Na malária, a resposta de
IL-10 a antígenos hepáticos está associada à proteção a reinfecção (115). A produção de IL-10
por células T (específicas ou não para P. falciparum) de indivíduos com histórico de malária
grave não difere da produção de células de indivíduos com malária não grave (116), por outro
lado, baixas concentrações de IL-10 têm sido associadas à anemia grave (26, 123). Na África,
observou-se em pacientes com malária um aumento de células CD4+ produtoras de IL-10, após
17
o tratamento, e crianças que apresentavam hiperparasitemia, a expressão de IL10 estava
reduzida (124). Andrade e cols. (2010) (103) verificaram que a razão IFN-γ/IL-10 foi maior
em pacientes conforme ocorria aumento da severidade da doença e que há uma redução da
razão IFN-γ/IL-10 e de TNF-α após o tratamento.
O TGF-β é uma citocina antiinflamatória que desempenha papel importante no controle
da resposta imune excessiva frente ao plasmódio (125). Existem indícios de que ela tenha
capacidade de estimular a expressão de FoxP3, promovendo o desenvolvimento de células T
reguladoras (125, 126). Na malária um dos papéis principais desta citocina é reduzir a
produção da óxido sintase induzível (iNOS) (127). Em indivíduos experimentalmente
infectados com esporozoítas de P. falciparum foi observado que a produção de TGF- estava
associada positivamente com as altas taxas de crescimento do P. falciparum in vivo. Esses
resultados corroboram os dados observados na malária murina, que a regulação das células
efetoras Th1 por IL-10 e TGF- é essencial para controlar a imunopatologia, porém que a
indução ou a administração de TGF - no início da fase sangüínea diminui a produção de
citocinas pró inflamatórias, levando a um aumento exacerbado da parasitemia e da gravidade
da doença (127, 128). Indivíduos com malária aguda apresentaram níveis de TGF-β maior que
indivíduos assintomáticos (126).
Face ao exposto, verifica-se que as citocinas são essenciais tanto na resposta imune
inata quanto adaptativa frente ao Plasmodium, podendo atuar tanto na indução como na
regulação das respostas efetoras (115). O equilíbrio entre a produção de citocinas pró e
antiinflamatórias parece ser crucial na determinação da gravidade dos sintomas clínicos, no
grau de parasitemia e ainda na eliminação da doença (115, 129).
1.5
Alterações Hematológicas na Malária
As alterações hematológicas mais frequentemente associadas à infecção malárica são
anemia, leucopenia, trombocitopenia, eosinopenia e neutropenia (130-132). Essas alterações
podem ser transitórias e variar de acordo com a espécie plasmodial infectante, o grau de
endemicidade da área, a idade, fatores sócio-demográficos, as hemoglobinopatias, o estado
nutricional, as parasitoses intestinais e, a imunidade antimalárica (133).
A anemia é descrita como um dos principais agravos na malária ocorrendo
principalmente em primoinfectados, gestantes e crianças (134). Essa manifestação clínica é
descrita em todas as espécies de malária, porém os quadros mais graves são
18
predominantemente observados nas infecções por P. falciparum. Entretanto, as infecções por
P.vivax também podem ser responsáveis por quadros graves de anemia, porém em menores
proporções, uma vez que esta espécie de plasmódio infecta preferencialmente reticulócitos
(135).
O plasmódio é um parasito intracelular obrigatório que infecta e destrói eritrócitos.
Entretanto, as observações de que o grau de anemia não está necessariamente relacionado com
o nível de parasitemia e que a anemia pode surgir depois da completa eliminação do parasito,
sugeriram que a patogenia da anemia na malária seja mutifatorial e que mecanismos
imunológicos estejam envolvidos (136). Dentro desse contexto, diversos estudos vêm
demonstrando uma interação complexa e dinâmica entre o plasmódio, a resposta imune e o
sistema hematopoiético do hospedeiro (137). Os principais mecanismos imunes envolvidos na
anemia da malária têm sido associados: à sensibilização dos eritrócitos por imunocomplexos,
anticorpos contra antígenos plasmodiais e auto-anticorpos que induziria a hemólise (25, 138);
ao aumento da produção de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IFN-γ entre outras) que
estimulariam a eritrofagocitose e a depressão da eritropoese e da mielopoese (139, 140), cabe
ressaltar que a hemozoína é um dos componentes parasitários que estimula produção de
citocinas pró-inflamatórias (141). Em contraste com a associação das citocinas próinflamatórias (reposta imune tipo Th1) com a patogenia da anemia, uma resposta
predominantemente Th2 está relacionada com a proteção de indivíduos contra o
desenvolvimento da anemia grave na malária. Diversos trabalhos têm demonstrando que níveis
plasmáticos mais elevados de IL-10 em relação aos níveis de TNF-α estavam relacionados com
a proteção de pacientes infectados com P. falciparum contra o desenvolvimento quadros
graves da doença, sobretudo a anemia (142, 143). Esses dados ressaltam a importância da
manutenção do equilíbrio entre as respostas imunes tipo Th1 e Th2 no controle da evolução da
doença.
Diversos estudos relataram as alterações hematológicas em pacientes com malária,
porém a grande maioria focou pacientes com P. falciparum, provenientes de áreas
hiperendêmicas. Grande parte deles foi desenvolvida nas populações de maior risco de
desenvolvimento de malária grave (crianças e grávidas). Na América do Sul, porém, onde a
maioria das áreas endêmicas de malária apresenta transmissão instável, a forma grave da
doença pode ocorrer mesmo em adultos. Face ao exposto, fica clara a importância de se avaliar
as alterações hematológicas de indivíduos infectados por plasmódios provenientes da
Amazônia brasileira.
19
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Com o intuito de contribuir para um maior entendimento da resposta imune durante a
infecção por Plasmodium spp. e oferecer suporte para estudos futuros no campo da pesquisa
sobre a imunidade à malária, este trabalho teve como objetivo geral:
“Avaliar alterações hematológicas e o perfil fenotípico de células do sangue periférico de
indivíduos naturalmente infectados com P. vivax ou P. falciparum na fase aguda e de
convalescença e comparar a resposta imune desencadeada por estas duas espécies
plasmodiais”.
2.2. Objetivos Específicos
2.2.1. Estudar de forma descritivo-analítica o perfil imunofenotípico dos leucócitos do sangue
periférico de indivíduos infectados com P. vivax ou P. falciparum na fase aguda e de
convalescença, através da avaliação da distribuição porcentual de:
a) Células CD4 e CD8, células T, CD3-, Células T e subpopulações produtoras de
diferentes citocinas;
b) Células T reguladoras;
c) Subpopulações de linfócitos CD4 e CD8 expressando moléculas de ativação celular
(CD25);
d) Células NK, NKT e subpopulações CD4 e CD8 e células NK produtoras de IFN-;
e) Células B e subpopulações produtoras de TGF-β;
2.2.2 Avaliar perfil hematológico dos pacientes com malária na fase aguda e de
convalescença.
20
3. JUSTIFICATIVA
Sabe-se que a resposta imune na malária pode interferir tanto na manifestação clínica da
doença, quanto na indução de uma resposta protetora duradoura. Os mecanismos exatos
envolvidos na patogênese e na produção de uma resposta imune eficaz ainda não foram bem
esclarecidos. Assim sendo, um melhor entendimento da resposta imune na infecção por P.
falciparum e P. vivax é essencial para desenvolvimento de possíveis adjuvantes, vacinas e de
novos métodos terapêuticos.
21
4. METODOLOGIA
4.1
Área de estudo
A área escolhida para realizar o estudo foi o município de Porto Velho, capital do
Estado de Rondônia. O estado de Rondônia encontra-se localizado na região norte do Brasil,
tendo como divisas o Estado de Amazonas (norte e noroeste), Mato Grosso (leste e sudeste),
Acre (noroeste) e Bolívia (sudeste e oeste) (Figura 4.1). O Estado de Rondônia apresenta 52
municípios e uma área total de 237.576,167 Km2 com cerca de 1,5 milhões de habitantes
(144).
Figura 4.1. Mapa geográfico de Rondônia.
Fonte: Adaptado de Katsuragawa 2008(145) e http://www.brasilrepublica.com/rondonia.htm (146)
O Município de Porto Velho apresenta uma área total de 34.082Km2. No ano de 2009,
a população estimada desta localidade foi 382.829 habitantes. No ano em que foi realizada a
coleta das amostras (2007) a população de Porto Velho era de aproximadamente 369.345
habitantes. Esta cidade encontra-se na região da Amazônia Legal e é formada por planícies
com serras de baixa altitude. Esta área é coberta por floresta tropical e apresenta temperatura
média acima de 28º C e umidade relativa do ar elevadas além de chuvas abundantes (144).
22
Durante o ano de 2007, Rondônia foi o segundo Estado com maior número de casos
positivos para malária no Brasil (81.955 casos), quando Porto Velho contribuía com a grande
maioria de casos (32.934 casos). Nas figuras 4.2 e 4.3 pode-se observar a evolução do IPA e
do número de casos em Rondônia. Dentre os casos notificados em Porto Velho, durante o ano
de 2007, 25.987 foram infecções por P. vivax, 6.541 foram infecções por P. falciparum, 404
foram infecções mistas. Além de um caso de infecção por P. malariae e um por P. ovale. Em
2007, o índice parasitário anual (IPA) de Porto Velho foi de 84,9 (14).
Figura 4.2. Evolução do Índice Parasitário Anual (IPA) de Rondônia entre os
IPA/ 1.000 habitantes
períodos de 2003-2009.
(SIVEP, 2009)(14)
23
Figura 4.3. Evolução do número de casos de malária diagnosticados no Brasil e em
Rondônia de 1974 a 2007
Fonte: Katsuragawa, 2008 (145).
Atualmente, o Estado de Rondônia e sua capital continuam apresentando elevada
incidência de malária, sendo que em 2009 foram diagnosticados 40.806 casos em Rondônia e
Porto Velho foi responsável por 20.283 desses casos (Figura 4.4). Em Porto Velho a
prevalência das espécies plasmodiais foi de 1.974 indivíduos infectados por P. falciparum,
18.216 por P. vivax e 93 infecções mistas. O IPA de Porto Velho em 2009 foi de 48,3 (14).
24
Figura 4.4. Evolução do número de casos de malária em Rondônia e em Porto Velho, por
espécie plasmodial durante o período de 2003 a 2009.
Pf- Plasmodium falciparum; Pv- P. vivax; RO- Rondônia; PV: Porto Velho
A colonização do município de Porto Velho, iniciada a partir do século XIX até a
década de 1960 ocorreu por via fluvial. A população foi atraída primeiramente devido a
extração da borracha, depois pelos garimpos. Assim sendo, esta população migrante foi se
estabelecendo as margens dos rios, constituindo a população de ribeirinhos, composta por
indivíduos com elevada miscigenação com a população indígena local. Após a abertura da
rodovia BR364 e instalação de assentamentos rurais, o município passou a atrair e receber
emigrantes de todo o país por via rodoviária (145). Apesar de ser o principal centro econômico
do estado de Rondônia, Porto Velho ainda apresenta áreas de profundo atraso social, onde há
menos de 30 Km do centro da cidade já podemos observar famílias sem energia elétrica e
saneamento básico, vivendo da agricultura e pesca de subsistência as margens do rio Madeira e
seus afluentes ou até mesmo em assentamentos de terra promovidos pelo governo.
A distribuição da malária em Porto Velho é bastante heterogênea, sendo a região
urbanizada praticamente livre de casos de malária enquanto os bairros periféricos que
apresentam saneamento e drenagem de águas de superfície deficitários e a população ribeirinha
responsáveis pelos maiores índices de malária no município (áreas rurais e suburbanas) (145,
147) (Figura 4.5).
25
Figura 4.5. Caracterização da distribuição heterogênea da malária em Porto Velho: AMapa de Porto Velho, com a distribuição das regiões operacionais para controle da
malária, da Secretaria Municipal de Saúde de Porto Velho (Semusa); B- Evolução do
número de casos de malária em Porto Velho por região operacional durante os anos de
2006 e 2007 (Semusa).
A
B
Fonte: Katsuragawa e cols., 2008(145)
26
4.2
Voluntários
4.2.1 PACIENTES
Foram avaliados indivíduos (n=73) atendidos no Posto de diagnóstico de malária na
Policlínica Ana Adelaide do município de Porto Velho no período de julho a outubro de 2007
(Figura 4.6). Os indivíduos com diagnóstico positivo, foram informados sobre as formas de
transmissão da malária, medidas profiláticas e sobre o projeto de pesquisa. Os indivíduos que
aceitaram participar de nosso estudo leram e assinaram o termo de consentimento que
formaliza a participação desses indivíduos como voluntários (Anexo 1). Após a assinatura,
todos os voluntários participaram de uma cuidadosa entrevista que tinha como objetivo o
preenchimento de um questionário (Anexo 2) de investigação de dados pessoais e
epidemiológicos utilizados para a associação com os dados experimentais. As informações
obtidas incluíram: idade, sexo, número de infecções maláricas anteriores, tempo decorrido
entre o aparecimento dos sintomas e procura do diagnóstico, tempo de residência em área
endêmica, tempo de residência em Rondônia e sintomas apresentados.
O protocolo de pesquisa foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Fundação Oswaldo Cruz- CEP/FIOCRUZ sob o no 354/06 (Data: 27/10/2006).
Eram elegíveis para o estudo indivíduos com exame positivo para malária (gota
espessa) e com idade superior a 12 anos, exceto populações indígenas, presidiários, doentes
mentais, gestantes e parturientes.
Figura 4.6. Policlínica e voluntários do estudo. A- Policlínica Ana Adelaide, Porto
Velho, Rondônia; B - Posto de diagnóstico de malária C - Indivíduo com suspeita de
malária sendo atendido no posto de diagnóstico de malária.
A
B
C
27
4.2.2 GRUPOS EM ESTUDO
4.2.2.1 Grupos de pacientes
Para a análise dos dados os pacientes com malária foram classificados de acordo com a
espécie plasmodial infectante. Esta classificação deu origem ao Grupo P. vivax (Grupo-Pv;
n=47) e P. falciparum (Grupo-Pf; n=24).
4.2.2.2 Grupo controle
Nesse estudo foram avaliados indivíduos residentes no centro de Porto Velho (n=20) no
período de julho a outubro de 2007. Eram elegíveis para o estudo indivíduos com exame
negativo para malária (gota espessa), com idade superior a 12 anos, sem história pregressa de
malária ou que relataram no máximo 4 infecções sendo que a última tenha ocorrido há 1 ano ou
mais, exceto populações indígenas, presidiários, doentes mentais, gestantes e parturientes.
Esses indivíduos constituíram o grupo controle de área endêmica (Grupo-C) pelo fato de residirem
em bairros no centro de Porto Velho, áreas consideradas livre de transmissão.
4.3
Coleta de sangue
As amostras de sangue (30 mL) foram coletadas por venipunctura em tubos
Vaccutainer (BectonDickson, San Jose, CA) contendo heparina sódica em 2 momentos
diferentes da infecção : 1) no dia do diagnóstico e antes do início do tratamento (Dia 0 = D0);
cerca de 15 dias após o D0 (D15= 14,3 ± 2,4) quando os indivíduos já haviam terminado o
tratamento. As amostras de sangue foram processadas em Porto Velho e utilizadas para exame
parasitológico, hemograma, obtenção de células mononucleadas (PBMC) e plasma.
4.4
Exame parasitológico para diagnóstico de malária e avaliação da parasitemia
O diagnóstico de malária foi realizado pelo exame de gota espessa e distensão
sanguínea, ambos corados pelo Giemsa (Sigma Chemical CO., St Louis, EUA). O diagnóstico
inicialmente dado por um dos microscopistas do Posto de Diagnóstico de malária era repetido
28
e confirmado por um pesquisador de nossa equipe. A parasitemia foi avaliada contando o
número de parasitas por 200 leucócitos. Se nove ou menos parasitas fossem encontrados, 300
leucócitos adicionais eram contados. A parasitemia final dos voluntários foi ajustada de acordo
com o número de leucócitos/L de sangue, de cada indivíduo.
Todos os voluntários com malária, logo após a coleta de sangue, foram submetidos ao
tratamento preconizado pelo Ministério da Saúde do Brasil (cloroquina associada a primaquina
para infecções por P. vivax e artemeter com lufemantrina (COARTEN®) para os indivíduos
com P. falciparum) (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009)
4.5
Exame hematológico
No intuito de analisar alterações hematológicas em pacientes com malária e detectar
possíveis diferenças entre os distúrbios causados por diferentes espécies de plasmódios e/ou
em indivíduos com históricos distintos de infecção prévia, as amostras de sangue dos
participantes do estudo foram encaminhadas para o Dr. Fabio Storer do Laboratório São
Lucas (PV-RO) para realização de hemograma completo, contagem de plaquetas e
reticulócitos.
Os hemogramas foram realizados em aparelho automatizado PENTRA da ABX
Diagnostics® (EUA) com avaliação da série branca, vermelha e plaquetária. Adicionalmente,
foi realizado um esfregaço de cada amostra para contagem diferencial dos leucócitos em caso
de flag pelo aparelho (sinalização da necessidade de confirmação manual quando na amostra
havia leucócitos atípicos ou imaturos). Para contagem de reticulócitos foi utilizada a técnica de
azul de cresil brilhante. Os resultados dos exames foram avaliados pela Dra Arlete Baldez,
médica da Fundação Nacional de Saúde em Porto Velho. Quando necessário os pacientes
receberam medicamentos.
4.6
Obtenção de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e plasma.
As amostras de sangue (20 mL) foram centrifugados a 350 X g por 10 min para
separação do plasma dos componentes celulares do sangue. Os plasmas obtidos foram estocados
a -20 C em alíquotas de 500 L. Após a retirada do plasma, a suspensão celular foi
reconstituída ao volume inicial com 0,9% de NaCl e colocada cuidadosamente em tubos
contendo solução de Ficoll-Hypaque – densidade 1,077mg/mL (Histopaque – Sigma
Company), na proporção de 5 mL de Histopaque para 10 mL de sangue. Após a distribuição
29
os tubos foram centrifugados por 30 min a 400 X g e a temperatura de 20 C. As células
mononucleares foram separadas, lavadas três vezes por centrifugação a 350 X g durante 10
min 20 C com salina estéril. Ao final das lavagens as células foram ressuspensas em 2mL de
meio de cultura Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640, Gibco) contendo 2g/L de
bicarbonato de sódio, 10mM de Hepes, 15mM de glutamina, 200U/mL de penicilina, 200ug/mL de
estreptomicina – RPMI incompleto (sem soro bovino fetal) para realização de teste de viabilidade
celular e verificação do número de PBMC recuperado.
4.7
Verificação da viabilidade celular e número de PBMC
Com a finalidade de se verificar a viabilidade celular e quantificar o número de PBMC
recuperado, 5µL da suspensão de PBMC em RPMI Medium 1640 foram colocados em tubo
eppendorf estéril com 45µL de azul de tripan a 0.4% (CellGro, Mediatech, Inc. Manassas,
VA). Essa nova solução foi homogeneizada e rapidamente colocada em câmara de Neubauer
para contagem do número de células em lente de 400x. As células eram consideradas não
viáveis quando estavam incluídas com o azul de Tripan. Foram contadas as células viáveis
presentes nos quatro quadrantes da câmara de Neubauer.
Para a determinação do número total de células (PBMC) de cada amostra, o número
obtido através da fórmula abaixo foi multiplicado pelo volume da suspensão celular (2mL).
Número de PBMC em todos os 4 quadrantes x 10 x 104 = Número de PBMC/mL
4
4.8
Congelamento e descongelamento das células mononucleadas do sangue
periférico
Devido as dificuldades de execução dos testes nas condições de campo, as células
foram criopreservadas e transportadas para Fiocruz e mantidas em nitrogênio liquido até o
momento da realização dos ensaios de citometria de fluxo. Para tanto, após a contagem, as
células obtidas por separação com gradiente de Ficoll Hypaque foram centrifugadas a 350 X g
durante 10 min e ressuspensas em de solução de congelamento a uma concentração de 1 x 10 7
células/mL. Tal solução era constituída de 90% de Soro Fetal Bovino (Hyclone, EUA)
inativado e 10% de dimetilsulfóxido (DMSO-SIGMA, EUA). As células foram então
transferidas para criotubos estéreis que foram então armazenados no criocontainer contendo
30
álcool isopropílico (isopropanol) - Cryo 1C (NALGENE n 5100-0001), que permite a
redução de temperatura de 1C/min. As alíquotas foram mantidas no criocontainer a -70C por
12-24 horas e armazenadas posteriormente em nitrogênio líquido.
No momento do descongelamento os tubos de criopreservação foram retirados do
nitrogênio líquido e levados rapidamente ao banho-maria a 37 ºC. Antes do descongelamento
completo a solução era transferida para tubos cônicos/estéreis de 15mL. Em seguida, a solução
de descongelamento composta por 90% RPMI Medium 1640 (GIBCO, EUA), 10% soro
bovino fetal (Hyclone, EUA) inativado e Benzonase® Nuclease (Novagen, EUA) na
concentração de 100UI/mL foi acrescentada aos tubos em volumes crescentes (0,5, 1,0, 2,0 e
4,0 mL) em intervalos de 1 minuto entre cada adição.
Após a adição da solução de descongelamento os tubos foram centrifugados a 350 X g
durante 10 min a 20 C, seguido de uma lavagem com 10mL RPMI Medium 1640 incompleto.
As células foram então ressuspensas em 2mL de RPMI Medium 1640 incompleto (GIBCO,
EUA) para realização de verificação de viabilidade celular e determinação do número de
PBMC recuperados, conforme descrito no item anterior.
Após a leitura na câmara de Neubauer, as PBMC foram ressuspensas em meio RPMI
Medium 1640 completo, constituído por: 90% de RPMI Medium 1640, 9% de soro bovino
fetal inativado e 1% penicilina/streptomicina de forma que atingissem uma concentração final
de 2 x 106 células viáveis/mL. A recuperação das células após o descongelamento foi em torno
de 85%.
Ensaios de imunofenotipagem celular dos leucócitos foram realizados durante a
padronização dos protocolos de congelamento e descongelamento. Para tal, PBMC frescas e
congeladas, dos mesmos indivíduos, foram testadas com o objetivo de verificar se o processo
de congelamento/descongelamento influenciaria na imunofenotipagem. Para isso, todos os
marcadores utilizados no estudo foram avaliados. Os resultados demonstraram não haver
diferença de marcação entre as amostras frescas e congeladas.
4.9
Análise do fenótipo celular e do padrão de citocinas citoplasmáticas em leucócitos
do sangue periférico por citometria de fluxo
Os ensaios de imunofenotipagem e de marcação intracelular de citocinas em leucócitos
do sangue periférico foram realizados segundo os protocolos propostos pelos fabricantes dos
anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos (Tabela 4.1), com algumas modificações
conforme descrito a seguir.
31
Tabela 4.1. Quadro demonstrativo dos anticorpos monoclonais utilizados para
análise de populações, subpopulações e do perfil de citocinas intracitoplasmáticas de
leucócitos do sangue periférico.
Monoclonal
CD3 APC Alexa-Fluor 750
CD4 APC Alexa-Fluor 750
Fabricante
e-Bioscience
e-Bioscience
Número do Lote
E027272
E028212
População alvo
Linfócitos T*
Células T restritas
pelo MHC tipo II*,
subtipo de células
NK‡ e de células
NKT•
e-Bioscience
E026328
Células T, subtipo
CD5 PE-Cy7
de células B*
Invitrogen
366116 A
Células T restritas
CD8 PE-TR
pelo MHC tipo I*
subtipo de células
NK‡ ‡e de células
NKT
BD Pharmigen
88874
Subtipo de células
CD11b/Mac-1 PE-Cy5
B**
Invitrogen
0400A
Células B*
CD19 PE-TR
BD Pharmigen
82769
Células T e B
CD25 PE-Cy5
ativadas, células T
reguladoras ;
macrófagos
ativados*
BD Pharmigen
04621.
Células NK†
NKp46 PE
BD Pharmigen
71875
Células NKT††
NKT FITC
Invitrogen
363807A
Células Tγδ
TCR γδ TC
BD Pharmigen
94783
Células B naives#
IgD FITC
BD Pharmigen
7547 / 92397
Células T
IFN-γ PE-Cy7
(principalmente
Th1), NK*, NKT#,
B¥, DC
e-Bioscience
E015516
Células T, NK,
TNF-α FITC
mastócitos,
macrófagos*, NKT#
BD Pharmigen
67324
Células T,
TGF-β Biotinilado
macrófago, Treg*,
B¥, DC
e-Bioscience
E024752
Células T
IL-2 APC
(principalmente
CD4)*, NKT#, NK*,
Treg
e-Bioscience
E026828
Células T
IL-4 APC
(principalmente
CD4, mastócitos,
NKT#, B¥
e-Bioscience
E019408
Células T, Treg,
IL-10 PE
macrófagos, alguns
tipos celulares não
linfóides
(queratinócitos),
Breg¥, B¥ e DC
†
* Fonte: Abbas, 2008 ; Fonte:Mandelboin, 2001(148); ‡Bernstein 2006(59); •Jing, 2007 (149); **Kawai,
2005(150). ‡‡Surgita, 2010 (151) # Mercer, 2005 (152); ¥ Bouaziz,2008 (91); †† Tahir, 2001 (153)
32
Às placas estéreis de 96 poços (Becton Dickinson, EUA) foram adicionados 100μL de
suspensões de PBMC na concentração de 2 x 105células por poço. Em seguida, a cada poço
foram adicionados 100 μl de meio RPMI 1640 completo e 10μg/mL de Brefeldina A (SIGMA,
St. Louis, Estados Unidos). Após homogeneização as placas foram mantidas a 37ºC , em
ambiente rico em CO2 (5%) durante, aproximadamente, 15 horas. Após este período as placas
foram lavadas em 200µL/poço de PBS 0,15M estéril (0.15 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 8 mM
Na2HPO4.7H2O, 1.5 mM KH2PO4; pH 7.2) com rotação de 350 X g por 5 min e depois
incubadas em 100µL de solução de PBS/ 0,1% BSA (Sigma, EUA) contendo 5% de leite
desnatado (Molico, Nestlé, Brasil), durante 5 min a 20ºC, para bloqueio do receptor Fc. Em
seguida, 100μL das soluções contendo combinações específicas de anticorpos monoclonais
marcados com fluorocromos distintos (Tabela 4.2) para análise simultânea de marcadores de
superfície celular necessários para a caracterização de populações celulares de interesse, foram
adicionados às placas de 96 poços, em concentrações/volumes previamente estabelecidas
(Tabela 4.2).
Após incubar durante 25 min a 4ºC duas lavagens, com 200 μL tampão PBS/ 0,1%
BSA/poço, foram realizadas por centrifugação a 350 X g durante 5 min a 20º C e o
sobrenadante desprezado. As amostras foram então fixadas com 100μL de solução fixadora
(4% de paraformaldeído em PBS, pH 7) durante 10 min a 20ºC. Em seguida, as amostras
foram lavadas 1 vez com 200 μL tampão PBS/ 0,1% BSA/poço (350 X g, 5 min, 20ºC). Mais
duas lavagens com 200 μL/poço de tampão PBS/ 0,1% BSA/ 0,1% de Saponina (SIGMA, St.
Louis, Estados Unidos) (350 X g, 5 min, 20ºC) foram realizadas. Após as lavagens, as placas
foram incubadas durante 1 hora a 4ºC, em 100μL de tampão PBS/ 0,1% BSA contendo 5% de
leite desnatado e 0,1% de Saponina-A para permeabilização celular. Subseqüentemente a
permeabilização, as misturas de anticorpos para marcação intracelular de citocinas (IL-2, IL-4,
IL-10, IFN-γ, TNF-α e TGF-β) foram adicionadas aos seus respectivos poços, em
concentrações previamente estabelecidas (Tabela 4.2).
Após um período de incubação de 30 min a 4ºC, 200μL de PBS/0,1%BSA/0,1%
Saponina-A foi adicionado nos poços, exceto nos poços da marcação 4 nos quais foram
adicionados streptavidina conjugada com peroxidase. As placas foram incubadas durante 20
min a 4ºC. Duas lavagens por centrifugação a 350 X g, por 5 min a 20ºC foram realizadas.
Uma em PBS/ 0,1% BSA/ 0,1% Saponina seguida de outra com PBS/ 0,1% BSA sem
Saponina. Posteriormente as células foram ressuspensas em 200μL de PBS/ 0,1% BSA e
transferidas para os tubos próprios para leitura. Adicionalmente, 300μL de PBS/ 0,1% BSA
foram adicionados em cada amostra totalizando 0,5mL por tubo.
33
As amostras foram analisadas em um aparelho Cyan (Dako, EUA) da Plataforma de
Citometria de Fluxo do Instituto Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) com o auxílio do técnico da
plataforma Alessandro Marins dos Santos em um período de até 24 horas após o término da
marcação. O programa Summit (Dako, EUA) foi utilizado para obtenção e análise dos dados.
Cerca de 10.000-20.000 células foram adquiridas dentro do gate morfológico de
linfócitos. Como controle positivo, células de alguns pacientes foram estimuladas com PHA.
Tabela 4.2. Quadro demonstrativo dos anticorpos monoclonais utilizados em cada
marcação na citometria de fluxo e os respectivos volumes utilizados.
Marcação extracelular
Marcação Intracelular
Marcação 1
Anti-CD25 PE-Cy5 (2µL), anti-CD4 APC Alexa
Anti-IFN-γ PE-Cy7 (2µL), anti- TNF-α FITC (1µL)*,
População alvo:
750 (2µL), anti-CD8 PE-TR (1µL)
anti-IL-2 APC (2µL)*, anti-IL-10 PE (2µL)*
Marcação 2
Anti-CD3 APC-Alexa 750 (2µL), anti-TCRγδ
Anti-IFN-γ PE-Cy7 (2µL), anti- TNF-α FITC (1µL)*,
População alvo:
TC (1µL)
anti-IL-2 APC (2µL)*.
Marcação 3
Anti-NKT FITC (4µL), anti-CD4 APC Alexa
Anti-IFN-γ PE-Cy7 (2µL), anti-IL-4 APC (2µL)*
População alvo:
750 (2µL), anti-NKp46 PE (2µL), anti-CD8 PE-
Células Tregs e T
ativadas
Linfócitos Tγδ
Células
NK
e
TR (1µL)
NKT
Marcação 4
Anti-CD5 PE-Cy7 (2µL), anti-CD19 PE-TR
Anti-TGF-β biotinilado (1µL) streptavidina-PE
População alvo:
(2µL), anti-CD11b PE-Cy5 (2µL), anti-IgD FITC
(200µL)†
Linfócitos
B e
(2µL)
subpopulações
* Volume utilizado após diluição de 1:10.
†Volume utilizado após diluição de 1:5.000
34
4.9.1 ANÁLISE DOS DADOS OBTIDOS NA CITOMETRIA DE FLUXO
Para análise dos dados obtidos pelo citômetro, primeiro foi realizado um gate
morfológico nos linfócitos de acordo com as características de tamanho (FS) e granularidade
(SS) desta população. Deste gate foram realizados outros histogramas e “dot plots”, de acordo
com os esquemas a seguir.
4.9.1.1 Células CD4+ e CD8+
Para a identificação de células CD4+ e CD8+ e para identificação do porcentual das
mesmas produzindo diferentes citocinas, o esquema de análise abaixo foi realizado:
Figura 4.7. Esquema representativo da análise utilizada para identificação de células
CD8 PE-TR
CD8 PE-TR
CD4+ e CD8+, e subpopulações produtoras de citocinas, através de citometria de fluxo.
CD4 APC Alexa-Fluor
Granularidade (SS)
* Citocinas: IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ, TNF-α
35
4.9.1.2 Avaliação da ativação celular
Para avaliação da ativação celular (expressão de CD25) das populações CD4+ e CD8+
foi realizado um esquema de análise conforme a figura 4.8. A população CD25+IL-10+
também foi avaliada.
Outro objetivo desta marcação era a avaliação de células T reguladoras. Para a
identificação destas células com os marcadores utilizados seria necessária a avaliação da
população com expressão de altas concentrações do receptor CD25 (células CD25 HIGH). Como
não foi possível a identificação desta população nos indivíduos do estudo, esta análise não foi
realizada. A ausência de população CD25HIGH pode ser resultante da metodologia, já que
nenhum estímulo foi realizado.
Figura 4.8. Esquema representativo da análise utilizada para avaliação da expressão do
CD25 PE-Cy5
CD25 PE-Cy5
IL-10 PE
CD25 PE-Cy5
marcador de ativação celular CD25, em diferentes populações celulares.
CD8 PE-TR
CD4 APC Alexa-Fluor
36
4.9.1.3 Linfócitos T e Tγδ:
Para avaliação de linfócitos (CD3+) e de linfócitos Tγδ (TCRγδ+) foi realizada a fenotipagem de
acordo com as etapas ilustradas pela figura 4.9. A marcação ainda permitiu a identificação das
subpopulações de CD3+, CD3- e TCRγδ+ produtoras de diferentes citocinas. Dentre as células CD3com características morfológicas de linfócitos encontram-se as células NK e as células B. Como não foi
possível a avaliação de diferentes citocinas por estas populações celulares devido a limitação de canais
do citômetro, optamos por avaliá-las indiretamente através da população que não expressa a molécula
de CD3 e que apresenta marcação intra-celular para citocinas. (Figura 13)
Figura 4.9. Esquema representativo da análise utilizada para avaliação das populações
CD3+, CD3- e TCRγδ+, e subpopulações produtoras de citocinas, através de citometria de
fluxo.
CD3 APC Alexa-Fluor 750
TCR TC
* Citocinas: IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ, TNF-α
37
4.9.1.4 Células NK e NKT
Com o intuito de se avaliar células NK+, NKT+ e suas subpopulações (CD4+ e CD8+),
um esquema analítico foi realizado a partir de linfócitos (baseada em caracteres morfológicos)
(Figuras 4.10 e 4.11). Nesta marcação ainda pode ser avaliada a presença do fenótipo IFN-γ+
em células NKp46+. Para esta finalidade as seguintes análises foram realizadas:
Figura 4.10. Esquema representativo da análise utilizada para avaliação de células
IFN- PE-Cy7
CD8 PE-TR
CD4 APC Alexa-Fluor
750
NKp46 PE
NKp46+ e subpopulações (CD4+, CD8+, IFN-γ+)
NKp46 PE
NKp46 PE
NKp46 PE
38
Figura 4.11. Esquema representativo da análise utilizada para avaliação de células NKT +
Granularidade (SS)
CD8 PE-TR
NKT FITC
CD4 APC Alexa-Fluor
750
e subpopulações (CD4+, CD8+)
NKT FITC
NKT FITC
39
4.9.1.5 Linfócitos B e subopulações
Para a avaliação dos linfócitos B foi utilizado o anticorpo monoclonal específico antiCD19. As subpopulações de linfócitos foram caracterizadas de acordo com a expressão de
CD11b, CD5 e IgD (Figura 4.12).
O marcador CD5 foi utilizado para caracterização da subpopulação de célula B
CD19+CD5+, que sabidamente são produtoras de autoanticorpos, e equivalem as células B1. O
marcador CD11b foi escolhido baseado no modelo murino em que ele é utilizado para
diferenciação de subpopulações de células B. O marcador IgD foi utilizado para diferenciação
de células B “naives” (IgD+) e células B de memória (IgD-).
A produção de TGF-β por linfócitos, células B e seus subtipos também foi analisada.
Para identificação destas populações celulares foi realizada a análise conforme indicado
na figura 16.
Figura 4.12. Esquema representativo da análise utilizada para avaliação de células B
CD5 Pe-Cy7
IgD FITC
CD5 PE-Cy7
TGF-β biotinilado
( Streptavidina PE)
(CD19+) e subpopulações
CD11b Pe-Cy5
Tamanho (FS)
40
A fim de se obter uma maior precisão dos resultados em todas as marcações foram
descontadas a autofluorescência das células. Isto foi realizado através da subtração da
fluorescência apresentada pelas amostras marcadas daquela obtida em amostras não marcadas
do mesmo indivíduo.
4.10
Armazenamento dos dados
Todas as informações do questionário de investigação de dados pessoais, clínicos e
epidemiológicos e todos os resultados dos exames realizados foram armazenados no Banco de
dados Epi-info (CDC, Atlanta).
Este banco de dados também foi utilizado para as análises estatísticas.
4.11
Análise Estatística
Para análises estatísticas foram utilizados os programas Epi-info (CDC, Atlanta) e
Graphpad Prism versão 5.00 para Windows (San Diego, Califórnia, EUA).
O teste de normalidade D’Agostino-Pearson foi utilizado para verificar se as amostras
apresentavam distribuição gaussiana. Para os dados que obedeciam distribuição normal foram
utilizadas os testes t pareado e não pareado e para as análises dos dados não paramétricos
foram utilizados os testes de Wilcoxon ou Mann-Whitney.
O teste exato de Fisher foi utilizado para verificar se existia relação não randômica
entre duas variáveis, dispostas em tabelas de contingência 2 x 2. Já o coeficiente de correlação
de Spearman foi utilizado para avaliar correlações entre os dados obtidos.
Foram considerados estatisticamente significativos dados que apresentavam P < 0,05.
Para a análise dos resultados, na fase aguda da infecção, o Grupo-Pv e o Grupo-Pf
foram comparados com o Grupo-C. Na fase de convalescença foram comparados apenas os
valores de D0 e D15 de cada grupo. Para isso, foram considerados apenas os indivíduos que
participaram dos dois momentos do estudo. Na figura 4.13 observa-se um esquema
explicativo desta análise.
Só serão apresentados no estudo os resultados estatisticamente significantes.
41
Figura 4.13. Esquema explicativo da análise realizada.
Fase Aguda (D0)
Grupo-Pv
Grupo-Pf
Teste estatístico não
pareado
Grupo-C
Fase de
Convalescença (D15)
Grupo-Pv
Grupo-Pf
D15
D0
D0
Teste
estatístico
pareado
D15
Teste
estatístico
pareado
42
5. RESULTADOS
5.1
Perfil da população de estudo
A tabela 5.1 resume o perfil da população de estudo. Participaram do presente estudo
73 pacientes, sendo 48 (65,7%) com malária vivax, 24 (32,9%) malária falciparum e 1 (1,4%)
com malária mista. A maioria dos pacientes (76%) era do sexo masculino com idade entre 14
e 54 anos (31 11). Segundo os relatos dos pacientes, a maioria era nativa da Região
Amazônica e apenas 12% eram migrantes provenientes de regiões não endêmicas de malária.
Eles residiam em área endêmica de malária em média há 28 anos e em Rondônia em média há
24 anos. Quanto à história pregressa de malária, os pacientes relataram uma média de 5 ( 4.3)
episódios de malária no passado e cerca de 34% (n=25) haviam narrado episódios (1  1,6) de
malária nos últimos 6 meses. Apenas 9 indivíduos relataram nunca ter tido malária e estavam
tendo a primeira infecção no momento do nosso estudo.
No momento da coleta (D0), todos os pacientes apresentavam sintomatologia. Os
sintomas mais freqüentes foram febre e cefaléia (83,6%), sendo a tríade malárica clássica
(febre, cefaléia e calafrio) narrada por 75% dos pacientes. Um paciente apresentou no D0
infecção por P. vivax, no D15 por P. falciparum, e no D30 o exame microscópico de gota
espessa foi negativo. Portanto, esse paciente foi excluído de todas as avaliações. O paciente
que apresentava infecção mista também foi excluído das análises de hemograma e fenótipo
celular.
43
Tabela 5.1. Resumo do perfil epidemiológico dos pacientes estudados (n=73).
Sexo
Feminino
24% (n=17)
Masculino
76% (n=55)
Idade média (DP) (min-max)
31 (11) (14-54)
Espécie plasmodial
P. vivax
65,7% (n=48)
P. falciparum
32,9% (n=24)
P. vivax / P. falciparum
1,4% (n=1)
Início da sintomatologia média (DP)
3 dias (2,1)
4,7 infecções (4,3)
História pregressa de malária média (DP)
Tempo de residência em área endêmica de malária média
28,2 (10) anos
(DP)
Tempo de residência em Rondônia média (DP)
23,8 (11) anos
Parasitemia em D0
(Parasitas/µL de sangue) média geométrica (95% CI)
2.133 (1.572-2.893)
Sintomas
83,6% (n=61)
Febre
Cefaléia
83,6% (n=61)
Calafrio
71,2% (n=52)
Mialgia
71,2% (n=52)
Náusea
53,4% (n=39)
DP: Desvio Padrão; 95% CI: 95% de intervalo de confiança; D0: Dia do diagnóstico
Ao avaliar os pacientes por espécie plasmodial infectante (Tabela 5.2) observa-se que a
média geométrica da parasitemia dos pacientes infectados com P. vivax (2.381/ µL; 95%CI:
1.621-3.499) era aparentemente maior do que nos pacientes infectados por P. falciparum
(1.574 /µL; 95%CI 916,9 - 2.703). Entretanto, essa diferença não foi estatisticamente
44
significante (P > 0.05). O único indivíduo com infecção mista apresentou parasitemia de
12.860/ µL.
Não houve diferença entre a idade e sexo dos indivíduos. Em relação a espécie
plasmodial infectante, a média de idade em ambas as infecções foi 31 anos e a maioria dos
pacientes era do sexo masculino, tanto na infecção por P. vivax / Grupo-Pv (75%), quanto na
infecção por P. falciparum / Grupo-Pf (79%).
Entre os grupos Pv e Pf não houve diferença no tempo de residência em área endêmica
e em Rondônia e nem no número de episódios de malária pregressa. Em ambos os grupos os
pacientes procuraram atendimento 3 dias (média) após o aparecimento dos sintomas.
Tabela 5.2. Perfil epidemiológico dos pacientes de acordo com a espécie plasmodial
infectante.
Parasitemia média geométrica (95%
CI)
Tempo de residência em área
endêmica média (DP), anos
Tempo de residência em
Rondônia média (DP), anos
Idade média (DP), anos
História pregressa de malária
Pv
Pf
(n=47)
(n=24)
2.381
1.574
(1.621-3.499)
(916.9-2.703)
28 (10)
28 (10)
0,8339
23 (12)
24 (9)
0,8843
30 (11,6)
31 (10,2)
0,6570
4,5 (4,5)
4,9 (4,3)
0,5306
3 (1,8)
3 (2,5)
0,9149
Valor de P
0,1997
média (DP)
Início da sintomatologia média
(DP), dias
95% CI: 95% de intervalo de confiança
O Grupo-C (controle de área endêmica) consistiu de 20 indivíduos, sendo 12 do sexo
feminino e 8 do sexo masculino, com idades variando entre 12 e 56 anos (31  11). Oitenta por
cento (n=12) dos indivíduos do Grupo-C eram nativos da Região Amazônica e 20% (n=4)
eram provenientes de áreas não endêmicas brasileiras. Os indivíduos do Grupo-C residiam em
45
área endêmica de malária, em média, há 26 anos ( 14) e em Rondônia há 22 anos ( 15).
Sessenta por cento deles declararam nunca ter sido infectado. Os 40% (n=8) restantes
afirmaram ter tido malária pelo menos uma vez no passado, com uma média de 1  1,6
infecções. O tempo decorrido desde a última infecção variou de 1 a 25 anos, uma média de 13
anos passados desde a última infecção.
Ao comparar os dados epidemiológicos do Grupo-C com os dados dos grupos Pv e Pf,
não houve diferença significante em relação a média de tempo de residência em área endêmica,
nem quanto ao tempo de residência em Rondônia e idade. Quanto ao número de infecções
anteriores, o Grupo-C apresentou média (2,75 + 6,7) menor que o Grupo-Pv (P = 0,0067) e
que o Grupo-Pf (P = 0,0043).
5.2
Hemograma
5.2.1 AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS DOS PACIENTES
COM MALÁRIA NA FASE AGUDA (D0)
Ao avaliar os parâmetros hematológicos dos pacientes percebe-se que, no momento do
diagnóstico (D0), ambos os grupos apresentaram média do número de plaquetas menor que a
média dos indivíduos controles de área endêmica (Grupo-C), além de uma redução na média
do número de leucócitos, linfócitos e um aumento no número de bastões. Observa-se também,
que apenas os pacientes com malária por P. vivax apresentaram um aumento no número de
reticulócitos e redução de eosinófilos (Tabela 5.3 e Figura 5.1).
Apesar da média de hemoglobina dos pacientes com malária estar dentro dos
parâmetros de normalidade, 34% (n=25) dos indivíduos infectados encontravam-se anêmicos
no momento do diagnóstico. Foram considerados anêmicos homens que apresentavam
hemoglobina abaixo de 13g/dL e mulheres abaixo de 12g/dL. A espécie plasmodial não
influenciou a freqüência de indivíduos anêmicos (P = 0,0743).
Apesar de não terem sido observadas grandes diferenças nos níveis de hemoglobina
entre os controles e os pacientes infectados por P. vivax ou P. falciparum, na malária por P.
46
vivax os pacientes apresentavam níveis de hemoglobina menor (P = 0,039) que os pacientes
infectados por P. falciparum.
Tabela 5.3. Parâmetros de normalidade e valores hematológicos do Grupo-C e dos
grupos Pv e Pf e na fase aguda da infecção (D0)
Parâmetro de
Grupo-C
Grupo-Pv
Grupo-Pf
(n=17)
(n=47)
(n=24)
4,6 (4,3-4,8)
4,6 (4,5-4,8)
4,9 (4,6-5,1)
40 (38,3-41,8)
40,9 (39,6-42,2)
41,9 (39,9-44)
12,8 (12,2-13,3)
12,7 (12,3-13,1)
13,3 (12,7-14,0)
0,33 (0,2-0,4)
0,49 (0,4-0,6)
0,38 (0,3-0,5)
273.525
142.147
134.571
(244.684 -
(128.046-
(112.772-
305.766)
157.802)
160.583)
6.646 (5.966-
4.965 (4.475-
4.690 (3.968-
7.403)
5.509)
5.543)
181 (109,6-
41,87 (21,79-
62,02 (24,5-
298,4)
79,61)
154,7)
3.691 (3.211-
2.994 (2.577-
2.662 (2.047-
4.242)
3.480)
3.461)
0,72 (0-2,82)
21,61 (8,9-50,8)
Normalidade
Eritrograma
Hemácias
M:4,4 - 5,9
(x106/µL)
F:4,0 - 5,2
Hematócrito (%)
M:40 – 54
F: 36 - 48
Hemoglobina
M: 13 – 18
(g/dL)
F:12 - 16
Reticulócito (%)
0,5-1,5%
150.000 - 450.000
Plaquetas (/µL)
(adultos)
Leucograma
Leucócitos (/µL)
Eosinófilos (/µl)
Segmentados
4.000 - 11.000
40 - 550
1.600 -7.150
(/µl)
Bastões (/µl)
40 - 770
73,78 (27,71193,8
Basófilos (/µl)
0-1%
Monócitos (/µl)
80 - 1.100
Linfócitos (/µl)
880 - 4.950
0 (0-1,13)
0,37 (0-0,98)
0 (0-0)
336,8 (247,6-
317,2 (263,7-
310,8 (239,5-
458,1)
381,5)
403,4)
2.218 (2.011-
1.066 (935,9-
911,1 (704,1-
2.445)
1.215)
1.179)
Média geométrica (95% Intervalo de Confiança)
M: Indivíduos do sexo masculino; F: Indivíduos do sexo feminino
47
Figura 5.1. Comparação entre as médias de valores hematológicos de indivíduos do
Grupo-Pv (n=47), Grupo-Pf (n=24) e do Grupo-C (n=17)
P = 0,033
400000
2
1
300000
200000
100000
0
0
Pv
C
Pv
Pf
P = 0,0015
C
Pf
P = 0,0013
10000
4000
8000
3000
Linfócitos
(/l)
Leucócitos
(/l)
P < 0,0001
P < 0,0001
500000
Plaquetas
(/L)
Reticulócitos
(%)
3
6000
4000
2000
P < 0,0001
P < 0,0001
2000
1000
0
0
Pv
C
Pv
Pf
C
Pf
P = 0,007
2000
P = 0,0012
P < 0,0001
1500
1000
Bastão
(/l)
Eosinófilos
(/l)
1500
500
1000
500
0
0
Pv
C
Pv
Pf
C
Pf
Média geométrica; 95% Intervalo de Confiança
5.2.1.1 Correlações
Ao avaliar o eritrograma dos pacientes dos Grupos Pv e Pf, no D0, observa-se uma
correlação negativa entre parasitemia e o número de plaquetas somente no Grupo-Pv (Figura
5.2).
48
Figura 5.2. Correlação entre parasitemia e número de plaquetas na fase aguda da
infecção (D0) dos pacientes do Grupo-Pv
Plaquetas
(/L)
300000
200000
r = - 0,3232
100000
0
0
5000
10000
15000
20000
Parasitem ia
(n=47; P = 0,0267)
5.2.2
COMPARAÇÃO
DOS
PARÂMETROS
HEMATOLÓGICOS
DOS
PACIENTES COM MALÁRIA NA FASE AGUDA (D0) E DE CONVALESCENÇA (D15)
Ao analisar os pacientes em dois tempos, D0 e D15, observa-se que nesse intervalo a
média dos valores do número de hemácias e do hematócrito caem significativamente no
Grupo-Pv. Entretanto, no Grupo-Pf apenas a redução no hematócrito foi significativa no D15.
Tanto os indivíduos do Grupo-Pv quanto do Grupo-Pf apresentaram um aumento no número
de plaquetas em D15 (Tabela 5.4 e Figura 5.3).
Em relação ao leucograma, nesse mesmo intervalo, observa-se aumento no número de
linfócitos e eosinófilos e diminuição no número de bastões, em ambos os grupos. Entretanto,
só no Grupo-Pv o aumento no número de leucócitos no D15 é significativo (Tabela 5.4 e
Figura 5.4).
Ao comparar os Grupos Pv e Pf na dase de convalescença, observa-se que os pacientes
do Grupo-Pv apresentam os valores do número de hemácia e do hematócrito menores que dos
pacientes do Gupo-Pf (P = 0,0008; P = 0,0469, respectivamente).
49
Tabela 5.4. Variação dos valores hematológicos do Grupo-Pv, Grupo-Pf em dois
tempos, antes (D0) e pós (D15) tratamento.
Grupo-Pv
Grupo-Pf
(n=40)
(n=15)
D0
D15
D0
D15
4,6 (4,5-4,8)
4,3 (4,2-4,5)
5,1 (4,8-5,4)
4,9 (4,6-5,2)
Hematócrito (%)
40,6 (39,1-42,2)
38,7 (37,4-40)
43 (41,3-44,8)
41,2 (38,8-43,7)
Hemoglobina (g/dL)
12,6 (12,1-13,1)
12,6 (12,2-13)
13,7 (13,1-14,2)
13 (12,1-14)
Reticulócito (%)
0,47 (0,36-0,61)
0,42 (0,34-0,52)
0,30 (0,21-0,44)
0,31 (0,21-0,46)
136.621
283.165
152.979
271.921
(122.107-152.860)
(260.563-307.727)
(120.548-194.136)
(219.718-336.528)
Leucócitos (/µL)
4.928 (4.385-5.538)
5.716 (5.287-6.180)
5.083 (4.312-5.992)
6.074 (4.876-7.567)
Eosinófilos (/µl)
36 (17,7-72,1)
267,3 (203,1-351,8)
63,8 (16,4-239,9)
311,4 (185,6-522,2)
2.961 (2.502-3.503)
2.915 (2.692-3.156)
2.990 (2.235-3.999)
3.009 (2.212-4.093)
Bastões (/µl)
20 (7,4-51,8)
0,9 (0,2-2,2)
88,6 (26,8-287,9)
0,4 (0 - 2)
Basófilos (/µl)
0,37 (0-0,98)
0,1 (0-0,33)
0 (0-0)
0 (0-0)
Monócitos (/µl)
327,3 (269,6-397,4)
348,7 (301,6-403,2)
296,7 (217,1-405,5)
316,5 (252,1-397,4)
Linfócitos (/µl)
1.057 (912,9-1.223)
2.046 (1.865-2.244)
920,4 (628,9-1.347)
2.114 (1.761-2.536)
Eritrograma
Hemácias (x106/µL)
Plaquetas (/µL)
Leucograma
Segmentados (/µl)
Média geométrica (95% Intervalo de Confiança)
D0- Dia do diagnóstico; D15- Quinze dias após D0, pós-tratamento
50
Figura 5.3. Variações da hematimetria, do hematócrito e da plaquetometria em
pacientes do Grupo-Pv (n=40) e do Grupo-Pf (n=15), antes (D0) e pós (D15) tratamento.
7
P = 0,0001
7
6
Hemácias
(x106/L)
Hemácias
(x106/L)
6
5
4
5
4
3
3
D0
D0
D15
D15
P. falciparum
P. vivax
55
55
P = 0,002
50
P = 0,0455
45
Hematócrito
(%)
Hematócrito
(%)
50
40
35
45
40
35
30
30
25
D0
D15
25
D0
P. vivax
D15
P. falciparum
P < 0,0001
600000
P = 0,0006
400000
Plaquetas
(/L)
Plaquetas
(/L)
600000
200000
400000
200000
0
D0
D15
0
D0
P. vivax
D15
P. falciparum
Linha indicativa dos parâmetros de normalidade (mínimo e máximo)
51
Figura 5.4. Variações nos valores de leucócitos, eosinófilos, bastões e linfócitos em
pacientes do Grupo-Pv (n=40) e do Grupo-Pf (n=15), antes (D0) pós (D15) tratamento.
P = 0,0446
15000
Leucócitos
(/l)
Leucócitos
(/l)
15000
10000
5000
10000
5000
0
0
D0
D15
D0
P. vivax
2000
P = 0,0103
P < 0,0001
Eosinófilos
(/l)
2000
Eosinófilos
(/l)
D15
P. falciparum
1500
1000
1500
1000
500
500
0
D0
0
D0
D15
D15
P. falciparum
P. vivax
2000
2000
P < 0,0001
1500
Bastão
(/l)
1500
Bastão
(/l)
P = 0,0031
1000
1000
500
500
0
0
D0
D0
D15
P. vivax
D15
P. falciparum
P < 0,0001
5000
P < 0,0001
5000
Linfócitos
(/l)
4000
Linfócitos
(/l)
4000
3000
3000
2000
2000
1000
1000
0
D0
D15
0
D0
D15
P. falciparum
P. vivax
Linha indicativa dos parâmetros de normalidade (mínimo e máximo)
52
5.3
Perfil celular
Para avaliação do perfil das células mononucleares do sangue periférico foi realizada
fenotipagem por citometria de fluxo, conforme descrito na metodologia.
5.3.1 AVALIAÇÃO DO PERFIL CELULAR DOS PACIENTES COM MALÁRIA NA
FASE AGUDA (D0)
5.3.1.1 Células CD4+, CD8+ e subpopulações produtoras de citocinas
Na fase aguda da infecção, em ambas as espécies plasmodiais estudadas há redução no
porcentual de células CD4+CD8-. Há ainda um aumento no porcentual de células CD4+ e CD8+
produtoras de TNF-α e CD8+ CD25+IL-10+ (células CD8 ativadas produtoras de IL-10), tanto
no Grupo-Pv quanto no Grupo-Pf, porém esta alteração só é significativa no primeiro
(Figuras 5.5 e 5.6).
Comparando os grupos Pv e Pf observa-se uma redução no porcentual de células que
expressam uma maior quantidade do receptor CD8 (característica de linfócito T citotóxico CD8HIGH) em indivíduos infectados com P. falciparum (Figura 5.5).
53
Figura 5.5. Porcentual de diferentes tipos celulares (CD4 +CD8-, CD8+CD4- e
subpopulações) detectados em indivíduos do Grupo-Pv (n=40), do Grupo-Pf ( n=20) e do
Grupo-C (n=17), no momento do diagnóstico (D0).
100
P = 0,0407
P = 0,0193
8
CD8+ TNF-+
(%)
CD4+ CD8(%)
80
60
40
20
P = 0,0132
6
4
2
0
0
Pv
C
Pv
Pf
C
Pf
CD4+ TNF- +
(%)
CD8+CD25+IL-10+
(%)
4
2.5
P = 0,0399
2.0
1.5
1.0
0.5
3
P = 0,0192
2
1
0
Pv
0.0
Pv
C
C
Pf
Pf
P = 0,0021
40
CD8 HIGH
(%)
30
20
10
0
Pv
C
Pf
Média geométrica (95% Intervalo de Confiança).
Nos gráficos CD8+TNF-α+, CD8+TNF-α+ e CD25+IL-10+ e CD8+ uma unidade foi acrescida aos valores de cada indivíduo.
54
Figura 5.6. Gráfico representativo da porcentagem de dupla marcação de PBMC com
anticorpos monoclonais específicos para CD4 e TNF-α (A e B); CD8 e TNF-α (C e D).
Células obtidas a partir do gate morfológico de linfócitos. A;C- Células de indivíduo
controle; B;D- Células de paciente no momento do diagnóstico (D0).
TNF-α FITC
B
TNF-α FITC
A
CD4 APC Alexa-Fluor 750
CD4 APC Alexa-Fluor 750
D
TNF-α FITC
TNF-α FITC
C
CD8 PE-TR
CD8 PE-TR
5.3.1.2 Células T (CD3+), células CD3-, células Tγδ (TCRγδ+) e subpopulações produtoras de
citocinas:
No momento do diagnóstico, apenas o grupo de indivíduos com P. vivax apresentou
um aumento de células CD3- produtoras de TNF-α, IL-10 e IL-2, assim como um aumento de
células T (CD3+) produtoras de IL-10. Por outro lado, o aumento no porcentual destas células
secretando TNF-α (CD3+TNF-α+) só é estatisticamente distinto do controle no Grupo-Pf. É
importante ressaltar que dentre as células CD3-, obtidas a partir do gate morfológico de
linfócitos encontram-se as células NK e linfócitos B (Figuras 5.7 e 5.8).
55
Não foi observada alteração no porcentual de células CD3+.
Figura 5.7. Gráfico representativo da marcação de PBMC com anticorpos monoclonais
específicos para CD3 e TNF-α. Células obtidas a partir do gate morfológico de linfócitos.
A- Células de indivíduo controle; B- Células de paciente no momento do diagnóstico
(D0).
B
TNF-α FITC
TNF-α FITC
A
CD3 APC Alexa-Fluor
CD3 APC Alexa-Fluor
56
Figura 5.8. Porcentual de diferentes tipos celulares (CD3 -, CD3+ e subpopulações)
detectados em pacientes do Grupo-Pv ( n=40), do Grupo-Pf ( n=19) e em indivíduos do
Grupo-C (n=17), no momento do diagnóstico (D0).
CD3- TNF +
(%)
15
P = 0,0483
10
5
0
Pv
Pf
P = 0,0483
8
6
4
2
6
4
2
0
0
Pv
C
Pf
Pv
P = 0,0454
3
CD3+ IL-10+
(%)
3
CD3+ TNF +
(%)
P = 0,0466
10
CD3- IL-2+
(%)
CD3- IL-10+
(%)
8
C
2
1
0
C
Pf
P = 0,0339
2
1
0
Pv
C
Pv
Pf
C
Pf
Média geométrica (95% Intervalo de Confiança).
Em todos os gráficos uma unidade foi acrescida aos valores de cada indivíduo.
Nesta mesma fase da infecção, apesar de não haver alteração no porcentual de células
TCRγδ+ há um aumento no porcentual de células TCRγδ+TNF-α+ no Grupo-Pv (Figuras 5.9 e
5.10).
57
Figura 5.9. Percentual de células TCRγδ+ TNF-α+ detectados em indivíduos do GrupoPv (n=46), do Grupo-Pf (n=21) e em indivíduos do Grupo-C (n=19), no momento do
diagnóstico (D0).
P = 0,0324
2.0
1.5
(%)
TCR  + TNF- +
2.5
1.0
0.5
0.0
Pv
C
Pf
Média geométrica (95% Intervalo de Confiança).
Uma unidade foi acrescida aos valores de cada indivíduo.
Figura 5.10. Gráfico representativo da porcentagem de dupla marcação de PBMC com
anticorpos monoclonais específicos para TCRγδ e TNF-α. Células obtidas a partir do
gate morfológico de linfócitos. A- Células de indivíduo controle; B- Células de paciente
no momento do diagnóstico (D0).
B
TNF-α FITC
TNF-α FITC
A
TCR TC
TCR TC
58
5.3.1.3 Células NK, NKT e subpopulações (CD4+ e CD8+)
Na fase aguda da infecção, nenhuma alteração nas células NK, NKT e subpopulações
pode ser observada.
5.3.1.4 Células B (CD19+) e subpopulações
No D0, tanto os indivíduos com P. vivax, quanto os indivíduos com P. falciparum
apresentaram redução no percentual de células CD19+CD5-CD11b- quando comparados com
os indivíduos clinicamente sadios com diagnóstico negativo para malária (Figura 5.11).
Entretanto, apenas no Grupo-Pv havia um aumento no porcentual de células CD19+
TGF-β+ e CD19+CD5-CD11b-IgD+TGF-β+ (Figuras 5.11 e 5.12).
59
Figura 5.11. Porcentual de diferentes subpopulações de células CD19 + em indivíduos do
Grupo-Pv (n=40), do Grupo-Pf (n=20) e em indivíduos do Grupo-C (n=18), no momento
do diagnóstico (D0).
P = 0,0441
P = 0,032
CD19+CD11b-CD5(%)
100
80
60
40
20
0
CD19+TGF- +
(%)
30
C
P = 0,0283
20
10
Média geométrica (95% Intervalo de Confiança).
0
Pv
C
Pf
CD19+CD11b-CD5-IgD+ TGF- +
(%)
Pv
Pf
50
P = 0,0099
40
30
20
10
0
Pv
C
Pf
Figura 5.12. Histograma representativo da porcentagem de marcação de PBMC com
anticorpo monoclonal específico para TGF-β. Células obtidas a partir do gate
morfológico de linfócitos e do gate em células CD19+. A- Células de indivíduo controle;
B- Células de paciente no momento do diagnóstico (D0).
B
A
TGF-β biotinilado (Streptavidina PE)
TGF-β biotinilado (Streptavidina PE)
60
5.3.2 COMPARAÇÃO DO PERFIL CELULAR EM PACIENTES COM MALÁRIA
NA FASE AGUDA (D0) E DE CONVALESCENÇA (D15)
5.3.2.1 Células CD4+ CD8+ e subpopulações produtoras de citocinas
No D15 em relação ao D0, tanto no Grupo-Pv como no Grupo-Pf, foi observado uma
redução de células CD4+CD25+ (Figuras 5.13 e 5.14). Houve ainda uma redução significativa
de células CD4+CD8- (representadas principalmente por células T auxiliares) e CD8+TNF-α+
apenas no Grupo-Pv (Figuras 5.15 e 5.16).
Figura 5.13. Gráfico representativo da porcentagem de dupla marcação de PBMC com
anticorpos monoclonais específicos para CD4 e CD25. Células obtidas a partir do gate
morfológico de linfócitos. D0- Células de indivíduo infectado no momento do
diagnóstico; D15- Células do mesmo indivíduo 15 dias após o diagnóstico (após
CD25 PE-Cy5
CD25 PE-Cy5
tratamento).
CD4 APC Alexa-Fluor 750
CD4 APC Alexa-Fluor 750
61
Figura 5.14. Variação no porcentual de células CD4+CD25+ em indivíduos do Grupo-Pv
(n=32) e Grupo-Pf (n=12) antes (D0) e após o tratamento (D15).
5
4
4
CD4+ CD25+
(%)
CD4+ CD25+
(%)
P < 0,0001
5
3
2
1
P = 0,008
3
2
1
0
0
D0
D0
D15
D15
P. falciparum
P. vivax
Figura 5.15. Gráfico representativo da porcentagem de dupla marcação de PBMC com
anticorpos monoclonais específicos para CD8 e TNF-α. Células obtidas a partir do gate
morfológico de linfócitos. D0- Células de indivíduo infectado no momento do
diagnóstico; D15- Células do mesmo indivíduo 15 dias após o diagnóstico (após
TNF-α FITC
TNF-α FITC
tratamento).
CD8 PE-TR
CD8 PE-TR
Há ainda neste período, no Grupo-Pv, uma redução no porcentual de células CD25+IL10+CD4+ e de células T citotóxicas (CD8+) produtoras de TNF-α e IFN-γ simultaneamente
(células CD8+ TNF-α+ IFN-γ +) (Figura 33).
62
Figura 5.16. Variação no percentual de diferentes tipos celulares (CD4 +CD8- e
subpopulações de CD4+ e CD8+) em indivíduos do Grupo-Pv (n=32) e do Grupo-Pf
(n=12) antes (D0) e após o tratamento (D15).
P = 0,0231
100
100
80
CD4+ CD8(%)
CD4+ CD8(%)
80
60
40
20
60
40
20
0
0
D0
D15
D0
P. vivax
0.25
CD4+ CD25+IL-10+
(%)
CD4+CD25+IL-10+
(%)
P. falciparum
P = 0,0458
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
D0
D15
D0
P. vivax
6
CD8+ TNF +
(%)
CD8+ TNF +
(%)
D15
P. falciparum
P = 0,0005
6
4
2
0
4
2
0
D0
D15
D0
P. vivax
D15
P. falciparum
P = 0,0178
0.5
CD8+ TNF + IFN- +
(%)
0.5
CD8+ TNF + IFN- +
(%)
D15
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
D0
D15
D0
P. vivax
D15
P. falciparum
63
5.3.2.2 Células T (CD3+), Células CD3- e Células Tγδ (TCRγδ+)
Na fase de convalescença, o grupo de indivíduos infectados com P. vivax apresenta
uma redução de células CD3+ e um aumento de células CD3-, respectivamente (Figura 5.17).
Figura 5.17. Variação no porcentual células CD3+ e CD3- em indivíduos do Grupo-Pv
(n=33) e Grupo-Pf (n=12) antes (D0) e após o tratamento (D15).
100
90
90
80
80
CD3+
(%)
CD3+
(%)
P = 0,0118
100
70
70
60
60
50
50
D0
D0
D15
P. falciparum
P. vivax
P = 0,0066
50
40
40
30
30
CD3(%)
CD3(%)
50
D15
20
10
20
10
0
0
D0
D15
D0
P. vivax
D15
P. falciparum
Conforme pode ser observado na figura 5.18 o porcentual de células CD3- produtoras
de IL-2, IL10 e TNF-α diminuem de D0 para D15 nos grupos Pv e Pf. Já o porcentual de
células CD3- produtora de IFN-γ só diminui significativamente neste período no Grupo-Pv.
64
Figura 5.18. Variação no porcentual de diferentes tipos celulares (subpopulações de
CD3– produtoras de diferentes citocinas) em indivíduos do Grupo-Pv (n=33) e do
Grupo-Pf (n=12) antes (D0) e após o tratamento (D15).
P = 0,0011
12
12
10
CD3- TNF +
(%)
CD3- TNF +
(%)
10
8
6
4
P = 0,0091
8
6
4
2
2
0
0
D0
D15
D0
P. vivax
8
P = 0,0314
6
CD3- IL-10+
(%)
CD3- IL-10+
(%)
8
4
2
0
P = 0,0382
6
4
2
0
D0
D15
D0
P. vivax
15
D15
P. falciparum
15
P = 0,0314
CD3- IFN- +
(%)
CD3- IFN- +
(%)
D15
P. falciparum
10
5
10
5
0
0
D0
D15
D0
P. vivax
D15
P. falciparum
P = 0,0053
8
8
6
6
CD3- IL-2+
(%)
CD3- IL-2+
(%)
P = 0,0423
4
2
0
4
2
0
D0
D15
D0
P. vivax
D15
P. falciparum
65
Também foi observada uma redução no porcentual de células TCRγδ+TNF-α+
circulantes na fase de convalescença em indivíduos infectados com P. vivax e com P.
falciparum (Figuras 5.19 e 5.20).
Figura 5.19. Gráfico representativo da porcentagem de dupla marcação de PBMC com
anticorpos monoclonais específicos para TCRγδ e TNF-α. Células obtidas a partir do
gate morfológico de linfócitos. D0- Células de indivíduo infectado no momento do
diagnóstico; D15- Células do mesmo indivíduo 15 dias após o diagnóstico (após
tratamento).
TNF-α FITC
FITC
D15
TNF-α FITC
FITC
D0
TCRγδ TC
TCRγδ TC
Figura 5.20. Variação no porcentual de células TCRγδ+TNF-α+ em indivíduos do GrupoPv ( n=38) e do Grupo-Pf (n=12) antes (D0) e após o tratamento (D15).
P = 0,0262
3
TCR  + TNF- +
TCR  + TNF- +
P = 0,0217
4
4
2
1
3
2
1
0
0
D0
D0
D15
D15
P. falciparum
P. vivax
66
5.3.2.3 Células NK, NKT e subpopulações (CD4+, CD8+)
Ao avaliar os indivíduos infectados por diferentes espécies plasmodiais, percebe-se uma
redução no porcentual de células que coexpressam NKp46 e CD8, do D0 para o D15, apenas
no Grupo-Pf (Figura 5.21).
Figura 5.21. Variação no porcentual de células NKp46+CD8+ em indivíduos do Grupo-
12
10
10
6
4
2
P = 0,0342
8
(%)
NKp46+CD8+
12
8
(%)
NKp46+CD8+
Pv (n=36) e do Grupo-Pf (n=12) antes (D0) e após o tratamento (D15).
6
4
2
0
0
D0
D0
D15
D15
P. falciparum
P. vivax
5.3.2.4 Células B (CD19+) e subpopulações
Conforme pode ser observado na figura 5.22, há uma redução nas células B CD5+ que
não expressam CD11b e um aumento nas células B duplo negativas para CD5 e CD11b do D0
para o D15. Esta alteração só é significativa nos indivíduos infectados com P. vivax (Figura
39).
67
Figura 5.22. Variação no porcentual de células CD19+CD5-CD11b- e CD19+CD5+CD11bem indivíduos do Grupo-Pv (n=36) e do Grupo-Pf (n=12) antes (D0) e após o tratamento
(D15).
P = 0,0374
80
CD19+CD5+CD11b(%)
CD19+CD5+CD11b(%)
80
60
40
20
0
60
40
20
0
D0
D15
D0
P. vivax
D15
P. falciparum
P = 0,0464
100
CD19+CD5-CD11b(%)
CD19+CD5-CD11b(%)
100
80
60
40
20
0
80
60
40
20
0
D0
D15
D0
P. vivax
D15
P. falciparum
68
Figura 5.23. Quadro resumo das alterações hematológicas
Fase de
Fase Aguda
Convalescença
Grupo-C
versus
Grupo-Pv
Grupo-Pf
Grupo-Pv
Grupo-Pf
D0 x D15
D0 x D15
Hemácias
Hematócrito
Hemoglobin
a
Reticulócitos
Plaquetas
Leucócitos
Linfócitos
Eosinófilos
Bastão
Aumento da população
Aumento da população celular no
D15 em relação ao D0
Redução da população celular no
D15 em relação ao D0
Sem alteração estatisticamente
significante
celular em relação ao GrupoC
Redução da população celular
em relação ao Grupo-C
Sem alteração
estatisticamente significante
69
Figura 5.24. Quadro resumo das alterações no perfil celular
Fase de
Fase Aguda
Convalescença
Grupo-C
versus
Grupo-Pv
Grupo-Pv Grupo-Pf
Grupo-Pf
D0 x D15 D0 x D15
CD3+
CD3+TNF-α+
CD3+IL-10+
CD4+CD8CD4+TNF-α+
CD4+CD25+
CD4+CD25+IL-10+
CD8HIGH
CD8+TNF-α+
CD8+TNF-α+IFN-+
CD8+CD25+IL-10+
TCRγδ+TNF-α+
CD3CD3-TNF-α+
CD3-IL-10+
CD3-IFN-+
CD3-IL-2+
NKp46+CD8+
CD19+ CD5- CD11bCD19+ CD5+ CD11bCD19+TGF-β+
CD19+CD5-CD11b-IgD+TGFβ+
Aumento da população celular no
D15 em relação ao D0
Redução da população celular no
D15 em relação ao D0
Sem alteração estatisticamente
significante
Aumento da população celular no
D15 em relação ao D0
Redução da população celular no
D15 em relação ao D0
Sem alteração estatisticamente
significante
70
6. DISCUSSÃO
Na infecção malárica estudos que avaliam os mecanismos imunológicos envolvidos na
infecção mostram que o sistema imune do hospedeiro desenvolve uma potente resposta contra
o parasita, causando alterações em quase todos os componentes do sistema imune (26, 154).
As alterações hematológicas são as complicações mais comuns na malária e tem um
papel importante na gravidade e na fatalidade da doença. Entretanto, estas alterações não são
consistentes em todas as áreas endêmicas de malária e, tanto a patogenia quanto a proteção a
doença, dependem de vários fatores como o nível de endemicidade, fatores genéticos do
hospedeiro e do parasita (133, 154-158).
Diversos estudos relataram as alterações hematológicas em pacientes com malária,
porém a grande maioria focou pacientes com P. falciparum, provenientes de áreas
hiperendêmicas. Grande parte deles foi desenvolvida nas populações de maior risco de
desenvolvimento de malária grave (crianças e grávidas). Na América do Sul, porém, onde a
maioria das áreas endêmicas de malária apresenta transmissão instável, a população mais
afetada são os adultos (159).
No nosso estudo as alterações hematológicas periféricas de pacientes com malária
foram extremamente variáveis. Na fase aguda da infecção, tanto por P. falciparum como por
P.vivax, os valores médios de hemácias, hematócrito e hemoglobina se encontravam dentro
dos padrões de normalidade. Já na fase de convalescença, houve uma redução no número de
hemácias e valores de hematócrito apenas no P. vivax. Apesar da redução no número de
hemácias, hematócrito e hemoglobina serem bastante conhecidas na malária, principalmente
nas infecções por P. falciparum (132, 138, 160), os nossos resultados coincidem com
trabalhos que relatam que na fase aguda da malária não complicada a anemia não é um achado
frequente (157). No entanto, os valores médios de leucócitos, linfócitos e plaquetas se
encontravam abaixo dos valores do controle, provavelmente devido à redistribuição dos
leucócitos para sítios inflamatórios. A redução observada no número de leucócitos e linfócitos
também foi observada em vários trabalhos (132, 133, 137, 155, 157, 161-163). Nos poucos
estudos que comparam o número de leucócitos na infecção por P. falciparum e P. vivax em
pacientes com malária não complicada, um trabalho relata que a redução no número de
71
leucócitos é maior na infecção por P. falciparum e outro no P. vivax (164, 165). No nosso
trabalho a redução foi observada nas duas espécies plasmodiais. Entretanto, na fase de
convalescença, os valores de leucócitos já estavam próximos aos valores normais no P. vivax.
Mesmo assim, a redução no número de leucócitos não é um parâmetro associado à gravidade
da infecção, normalmente atribuída ao P. falciparum.
Da mesma maneira, a redução no número de plaquetas na fase aguda da doença é uma
alteração já bem documentada (132, 133, 137, 157, 160, 162, 166, 167). A relevância clínica
da plaquetopenia ainda precisa ser melhor compreendida, visto que as complicações
hemorrágicas são extremamente raras em pacientes com malária (168) e, como já foi
demonstrado que as plaquetas estão associadas à destruição do parasita (167), é provável que
as plaquetas estejam mais envolvidas na proteção à doença grave, visto que nós observamos
uma correlação negativa entre parasitemia e contagem de plaquetas nos indivíduos infectados,
independente da espécie plasmodial.
Vale ressaltar que na fase de convalescença (D15),
quando os pacientes se encontravam curados, o número de plaquetas dos pacientes era similar
aos dos indivíduos controles, o que sugere que este curto período de tempo é suficiente para
que haja retorno à homeostasia plaquetária. Embora alguns autores descrevam que haja uma
trombocitopenia mais intensa na malária falciparum do que na vivax (168, 169), outros
também descrevem exatamente o contrário (156, 165). Várias hipóteses já foram postuladas
como causas da plaquetopenia associada à malária. Dentre elas destacam-se coagulação
intravascular disseminada, mecanismos imunes, dismegapoese e hiperesplenismo.
Neste estudo a única diferença encontrada entre P. falciparum e P. vivax foi um
aumento de reticulócitos e diminuição de eosinófilos na fase aguda apenas no P. vivax.
Entretanto, na fase de convalescença, o número de eosinófilos aumenta. Tangpukdee e cols.
(2008) (164) relataram uma diminuição de eosinófilos na fase aguda da infecção por P.
falciparum. Tem sido sugerido que o aumento de eosinófilos após o tratamento é um bom
prognóstico na recuperação da infecção (170). O aumento na média geométrica do porcentual
de reticulócitos na infecção por P. vivax foi relatado em pacientes na Colômbia, área
semelhante a nossa em termos de endemicidade (171). Esse aumento poderia ser uma resposta
induzida pelo parasito, já que a células alvo dessa espécie são os reticulócitos. Entretanto, um
aumento de reticulócitos foi também relatado na infecção por P. falciparum (169), sugerindo
que outros fatores podem estar envolvidos.
Um dado interessante do nosso trabalho foi a observação do aumento transitório de
bastões nos indivíduos infectados, sugerindo que em ambas as infecções há uma maior
72
demanda de neutrófilos do que a capacidade do organismo de produzir e maturar os mesmos.
Embora esta alteração seja extremamente frequente em outras doenças (172), existem muito
poucos estudos avaliando alterações deste tipo celular em pacientes com malária, e nenhum, no
nosso conhecimento, que tenha realizado o acompanhamento dos voluntários.
Embora essas alterações hematológicas associadas à malária não sejam um assunto
novo, a escassez de dados como este em populações de área endêmica brasileira são
extremamente importantes e mostra que a malária deve ser considerada no diagnóstico
diferencial de doenças agudas febris que apresentem plaquetopenia, leucopenia e aumento no
número de bastões em indivíduos expostos à infecção. Além disso, na infecção por P. vivax as
alterações hematológicas podem ser semelhantes ou até mais acentuadas do que no P.
falciparum em pacientes com malária não complicada em área endêmica brasileira.
Existem evidências suficientes indicando que na malária várias subpopulações celulares
circulantes estão alteradas e que essas alterações podem estar associadas com a
imunopatologia ou proteção da infecção. Entretanto, a extensão dessas alterações varia em
diferentes áreas geográficas e a maioria dos estudos se concentra na infecção por P.
falciparum em áreas hiperendêmicas. A alteração na contagem dos números totais de
linfócitos, células NK, células Tγδ e células B e a proporção de células T tem sido relatada em
estudos em várias regiões do mundo (20, 26, 76-78, 155, 161, 162, 174-176). Mesmo assim,
existem trabalhos que não encontraram nenhuma diferença significativa no porcentual dessas
subpopulações celulares tanto na infecção por P. falciparum quanto na por P. vivax (155, 177,
178).
Em nosso estudo, embora tenhamos demonstrado que tanto os pacientes com P.
falciparum quanto com P. vivax apresentaram significante diminuição no número de linfócitos,
apenas algumas subpopulações se encontravam alteradas.
Na fase aguda, os pacientes com infecção por P. vivax apresentaram um aumento de
células CD4+CD8-, e uma diminuição das células B (CD5-CD11b-) quando comparados com
indivíduos não infectados. Já na fase de convalescença, as células CD3- e células B (CD5CD11b-) aumentaram e as células CD4+CD8- diminuíram assim como as células T CD3+ e
células B CD5+CD11b- quando comparadas com a fase aguda.
Nos pacientes com P. falciparum também observamos, na fase aguda, um aumento de
células CD4+CD8- e uma diminuição das células CD8High e células B CD5-CD11b- . Na fase de
73
convalescença observamos apenas uma diminuição das células NK CD8+, não havendo
diferença nas demais populações celulares quando comparadas com D0.
O aumento das células CD4+CD8- nos pacientes com P. falciparum e P. vivax na fase
aguda além do aumento do porcentual destas células expressando o marcador de ativação
CD25 sugerem que estas células estejam desempenhando alguma função na infecção malárica.
A redução no porcentual de células B com fenótipo CD19+CD5-CD11b- também foi observada
tanto nos pacientes com P. falciparum quanto no P. vivax. Vale ressaltar que este é o primeiro
estudo, na malária humana, que avalia alterações nestas subpopulações de célula B e existem
evidências de que algumas subpopulações atuam na imunidade inata e desempenham papel
importante na defesa do organismo.
Não observamos nenhuma alteração nas células CD3+, células Tγδ e NK nos pacientes
infectados por P. falciparum e P. vivax e estes dados diferem da maioria dos trabalhos na
literatura. A ausência de pacientes com formas graves da doença e a diferença no grau de
imunidade da população estudada e fatores genéticos do parasita ou do hospedeiro, talvez
possam explicar essa discordância de dados.
O equilíbrio entre as citocinas Th1 e Th2 parece ser crucial no controle dos sintomas
clínicos da malária e da parasitemia, livrando o hospedeiro do desenvolvimento dos quadros
graves. Portanto, avaliamos também o perfil da expressão de diferentes citocinas nas
subpopulações de leucócitos circulantes acima descritos. Os nossos dados mostram que apesar
de poucas populações celulares estarem aumentadas, alterações significativas no perfil de
expressão de citocinas foram observadas.
Na fase aguda os pacientes infectados pelo P. vivax apresentaram alterações
significativas no perfil de expressão de citocinas do tipo Th1 caracterizado pelo aumento das
subpopulações de células CD4+TNF-α+, CD8+TNF-α+, TCRγδ+TNF-α, + CD3-TNF-α+, e CD3IL-2+ e do tipo Th2 pelo aumento das subpopulações CD8+CD25+IL-10+, CD3-IL-10+ e
CD3+IL-10+. Também foi observado um aumento do porcentual de células B CD19 +TGFβ+ e
CD19+CD5-CD11b-IgD+TGFβ+. Na fase de convalescença tanto as citocinas Th1 quanto as
Th2 diminuíram inclusive houve uma redução no porcentual das subpopulações
CD4+CD25+IL-10+, CD8+TNF-α+IFN-γ+, CD3-IFN-γ + quando comparados com a fase aguda
da infecção.
Na fase aguda os pacientes infectados pelo P. falciparum apresentaram apenas um
aumento de células CD3+TNF-α+ e na fase convalescença apresentaram uma diminuição das
células CD3-TNF α+, CD3-IL10+, CD3-IL2+ e TCRγδ+TNF-α+.
74
Os nossos dados mostram que apesar de poucas populações celulares estarem
aumentadas, alterações significativas no perfil de expressão de citocinas foram observadas. Na
fase aguda os indivíduos infectados apresentam um aumento de diversas células positivas para
TNF-α, quando comparados com o Grupo-C. No Grupo-Pv, esta alteração se mantem em
praticamente todos os tipos celulares, exceto para as células CD3 +, onde a alteração não foi
estatisticamente significante. O aumento de TNF-α circulante na malária é um fato bem
conhecido.
Sabe-se que esta citocina gera proteção contra o plasmódio, porém, quando
produzidas em altas concentrações pode agravar a severidade da doença (26, 103, 104, 115,
123, 179, 180). Na malária falciparum a única população celular produtora de TNF-α que
sofreu aumento na fase aguda foi a CD3+.
O presente estudo permitiu verificar que na malária aguda por P. vivax diversos tipos
celulares se tornam fontes produtoras de TNF-α de forma simultânea.
No estudo, a ausência de alteração nas populações produtoras de IFN-γ, uma citocina
extremamente importante na resposta frente ao plasmódio (105, 121), pode ser decorrente da
metodologia utilizada. O uso de células ex vivo, sem estímulo, pode explicar este fato. Como o
objetivo era justamente avaliar o padrão de resposta em indivíduos naturalmente infectados,
optou-se pela não realização de estímulo. Uma das perspectivas do trabalho é a avaliação da
resposta celular destes pacientes frente ao estímulo com peptídeos/proteínas potencialmente
vacinais derivados de P. vivax e/ou P. falciparum.
Alguns trabalhos mostram que pacientes com hiperparasitemia apresentavam redução
na expressão de IL-10 (124), e que baixas concentrações desta citocina estão relacionadas à
anemia severa em indivíduos com malária (26, 123). No nosso estudo aumento de células
CD8+, CD3+ e CD3- produtoras de IL-10 no Grupo-Pv na fase aguda, associado ao fato de
nenhum paciente ter apresentado malária grave sugere um papel protetor desta citocina na
malária, pelo menos frente ao agravamento dos sintomas.
Apesar de existirem relativamente poucos estudos acerca da IL-2 na malária, sabe-se
que a infecção experimental de humanos com P. falciparum gera a produção desta citocina
(124). No presente estudo, o grupo de indivíduos infectados por P. falciparum não apresentou
porcentual de células produtoras de IL-2 significativamente distintos do grupo de indivíduos
controles. Por outro lado, no Grupo-Pv foi verificado um aumento de células CD3-IL-2+.
Apesar de Ramharter e cols. (2004) (116) destacaram que a IL-2 é um produto
predominantemente de células CD4+, os pacientes deste estudo não apresentaram alteração no
porcentual de células duplo positivas para CD4 e IL-2. Os dados indicam que na fase aguda da
75
infecção malárica outra população celular está atuando como fonte desta citocina,
possivelmente células NK.
Uma outra observação importante do nosso trabalho foi a evidência, pela primeira vez
na malária humana, das células B reguladoras circulantes (produtoras de TGF-β) na infecção
por P. vivax na fase aguda da infecção. Essas células, no modelo murino são especificamente
ativadas em processos infecciosos e suprimem a progressão exacerbada da resposta imune pela
secreção de TGF-β e IL-10 e pela neutralização de fatores solúveis através da produção de
IgG e IgA. Assim sendo, estas células podem ter um papel regulador importante na infecção
malárica e precisam ser melhor estudadas.
É importante destacar que a ausência de resultados significativos no que se refere a
populações produtoras de citocinas no Grupo-Pf, diferente do que é relatado na literatura,
pode ser resultado do menor número de amostras deste grupo. Por outro lado, não podemos
descartar a hipótese de que na malária não complicada, em pacientes de área instável e com
maior prevalência de P. vivax, estas alterações não ocorram ou sejam mais significativas em
pacientes graves.
Um dado interessante desse trabalho foi que na fase aguda na malária por P. vivax
houve aumento tanto no porcentual de células com marcação para citocinas do tipo 1 (TNF-α,
por exemplo) como para citocinas do tipo 2 (IL-10). Como todos os pacientes incluídos no
trabalho apresentaram malária não complicada, pode-se supor que o mais importante no
controle da gravidade da doença é justamente o balanço entre resposta pró e anti-inflamatória.
Mais uma vez, estes dados vêm demonstrar a complexidade de resposta frente ao plasmódio.
Mais ainda, fica claro que a resposta imune difere de acordo com a espécie plasmodial
infectante. É importante ressaltar que este estudo foi desenvolvido em área onde o P. vivax é a
espécie mais prevalente, e que devido a resposta frente ao plasmódio ser influenciada por uma
grande variedade de fatores, nem todos os conhecimentos obtidos no presente estudo podem
ser extrapolados para outras áreas do mundo.
76
7. CONCLUSÕES
1) A malária deve ser considerada no diagnóstico diferencial de doenças agudas febris que
apresentem plaquetopenia, leucopenia e aumento no número de bastões em indivíduos
expostos a infecção.
2) Em pacientes com malária não complicada por P. vivax em área endêmica brasileira, as
alterações hematológicas podem ser semelhantes ou até mais acentuadas do que no P.
falciparum
3) Tanto os pacientes com P. falciparum quanto com P. vivax apresentaram significante
diminuição no número de linfócitos. Entretanto, apenas algumas subpopulações
celulares circulantes se encontravam alteradas.
4) Na fase aguda na malária por P. vivax houve aumento tanto no porcentual de células
com marcação para citocinas do tipo 1 quanto para citocinas do tipo 2. Como todos os
pacientes incluídos no trabalho apresentaram malária não complicada, pode-se supor
que o equilíbrio entre resposta pró e anti-inflamatória seja importante no controle da
gravidade da doença.
5) Na malária aguda por P. vivax diversos tipos celulares se tornam fontes produtoras de
TNF-α de forma simultânea enquanto que na malária por P. falciparum a única
população celular produtora de TNF-α que sofreu aumento na fase aguda foi a CD3+.
6) As células B reguladoras circulantes (produtoras de TGF-β) se encontravam
aumentadas na infecção P. vivax na fase aguda da infecção. Este é o primeiro relato e
sugere que estas células podem ter um papel regulador na infecção malárica e precisa
ser melhor estudada.
77
8. PERSPECTIVAS
Esse trabalho serviu de base para um estudo com um maior número de pacientes incluindo
um grupo de pacientes com malária grave. Portanto, as nossas perspectivas para a
continuidade desse estudo são:
1) Avaliar o papel das células B reguladoras na malária;
2) Avaliar as alterações hematológicas e perfil fenotípico celular incluindo células
polifuncionais em pacientes com malária não complicada e malária grave;
3) Avaliar resposta celular dos pacientes frente a estímulo com peptídeos/proteínas
potencialmente vacinais e o perfil fenotípico das células estimuladas;
4) Avaliar a produção de citocinas por células NK;
78
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93
Anexo 1 - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Instituições: Instituto Oswaldo Cruz – Fiocruz, Rio de Janeiro; Laboratório Central de Saúde
– LACEN, Porto Velho; Universidade Estadual do Rio de Janeiro – UERJ, Rio de Janeiro.
Coordenadores da Pesquisa: Dalma Maria Banic e Joseli de Oliveira Ferreira
Endereço: Instituto Oswaldo Cruz – Fiocruz; Pavilhão Leônidas Deane, 5º andar, Av. Brasil
4365 - CEP 21045-900, Rio de Janeiro, RJ - Brasil
Telefones: 021-3865-8115; 069-3216-5300.
Nome do Projeto de Pesquisa: Resposta imune inata
na malária por P. vivax e P.
falciparum: seu perfil e sua influência nas infecções e nas respostas imunes adquiridas a
antígenos candidatos a compor uma vacina.
Nome do Voluntário:____________________________________________________
A malária é uma doença transmitida pela picada do mosquito mas pode ser adquirida por
meio do contato direto com sangue de uma pessoa infectada (como por exemplo, em transfusões,
transplante de órgãos e ainda no compartilhamento de seringas no caso de usuários de drogas
injetáveis). Os principais sintomas de malária na sua fase inicial são a febre alta, associada ou não
a calafrios, tremores e dor de cabeça, pode ter também, dentre outros sintomas, dores pelo
corpo, vômitos, diarréia, dor abdominal, falta de apetite, tonteira e sensação de cansaço.
Não existe vacina para prevenir malária portanto a forma mais eficaz de se proteger é evitar o
contato com o mosquito. Entre as principais medidas de proteção estão o uso de cortinados
sobre a cama ou rede; telas em portas e janelas, inseticidas no ambiente onde se dorme e uso de
repelente no corpo. É importante evitar freqüentar locais próximos a criadouros naturais, como
beiras de rios ou áreas alagadas, no final de tarde, início da noite e nas primeiras horas da
madrugada.
94
A malária é uma doença que tem cura, mas pode evoluir em alguns indivíduos para suas
formas graves em poucos dias se não for diagnosticada e tratada rapidamente. Pelo presente
documento, você está sendo convidado a participar de uma investigação a ser realizada na
Fundação Oswaldo Cruz, com o objetivo de avaliar como o organismo do individuo reage à
malária em diferentes períodos da doença e quais os componentes do sangue (plasma, células e
produtos secretados por elas) estão envolvidos na melhora da doença.
Esse documento procura esclarecê-lo sobre o problema de Saúde em estudo e sobre a
pesquisa que será realizada, prestando informações, detalhando os procedimentos e exames,
benefícios, inconvenientes e riscos potenciais. Caso você necessite de alguma informação ou
esclarecimento durante o período em que estiver participando do estudo, procure Dra Fatima
Santos no Laboratório Central de Saúde – LACEN, Secretaria de Estado da Saúde, Rua Anita
Garibaldi 4130, Bairro Costa Silva, Porto Velho, Rondônia, telefone: 321 65300.
A sua participação nesse estudo é voluntária. Você pode recusar-se a participar de uma ou de
outras etapas da pesquisa ou, mesmo, se retirar dela a qualquer momento, sem que este fato lhe
venha causar qualquer constrangimento ou penalidade. O seu atendimento no posto de Saúde não
será prejudicado caso você decida não participar ou caso decida sair do estudo.
A sua participação com relação ao projeto consiste em autorizar a realização de exames para
avaliar a evolução da sua doença e que esse material seja utilizado neste estudo. Também será
necessária a autorização para que parte das amostras coletadas seja estocada a fim de servir para
outros estudos que tenham como objetivo a melhor compreensão da doença, o desenvolvimento
e avaliação de novos métodos de diagnóstico; avaliação da resposta a antígenos candidatos a uma
vacina etc. desde que tal estudo seja previamente analisado e autorizado por um Comitê de Ética
em Pesquisa. Os exames e procedimentos aplicados serão gratuitos.
Participando deste estudo você terá algumas responsabilidades: seguir as instruções do
médico e comparecer ao Posto de Saúde nas datas marcadas.
Os resultados do estudo poderão ser publicados sem revelar a sua identidade. Entretanto,
se necessário, os registros médicos estarão disponíveis para a equipe envolvida no estudo, para
o Comitê de Ética em Pesquisa, para as autoridades Sanitárias e para você.
Você pode e deve fazer todas as perguntas que julgar necessárias antes de concordar em
participar do estudo, assim como a qualquer momento.
95
Procedimentos, exames e testes que serão utilizados:
Inicialmente haverá coleta de informações sobre a doença através de uma entrevista
detalhada e preenchimento de um questionário por um membro da equipe, exame médico e
coleta de sangue para realização de vários exames (distensão e gota espessa para diagnóstico,
hemograma completo, testes imunológicos, tipagem de células e produtos secretados por elas,
entre outros). Para isto será necessária a coleta 30mL de sangue por via endovenosa em três
ocasiões: no dia do diagnóstico antes do tratamento (D0), 15 dias (D15) e 30 (D30) dias após
o diagnóstico. A retirada do sangue poderá ser feita por um médico, farmacêutico ou biólogo
da equipe de investigadores. Todos os indivíduos serão tratados para malária logo após a
coleta de sangue e acompanhados para verificação de cura após tratamento.
Inconvenientes e riscos principais conhecidos até os dias atuais:
A coleta de sangue poderá causar alguma dor no momento da punção venosa e,
eventualmente, poderá haver formação de uma área arroxeada no local, que voltará ao normal
dentro de alguns dias. Todos os cuidados apropriados serão tomados, como o uso de seringa,
agulha e gaze descartável assim como álcool para assepsia local, entre outros.
Formas de ressarcimento
Quando necessário, nos dias de seu atendimento, poderá ser fornecido um lanche.
Benefícios esperados
Os resultados desse estudo poderão não beneficiá-lo diretamente, mas no futuro,
poderão beneficiar outras pessoas.
96
Declaro que li e entendi todas as informações referentes a este estudo e que todas as
minhas perguntas foram adequadamente respondidas pela equipe, a qual estará à disposição para
responder minhas perguntas sempre que eu tiver dúvidas.
Recebi uma cópia deste termo de consentimento e pelo presente consinto,
voluntariamente, em participar deste estudo permitindo que os procedimentos descritos acima
sejam realizados em minha pessoa.
__________________________________________________Data: _________
Nome do voluntário
__________________________________________________Data:__________
Nome do Pesquisador
__________________________________________________Data:__________
Testemunha 11
_________________________________________________ Data:__________
Testemunha 22
1
2
Apenas no caso de voluntários impossibilitados de manifestar o seu consentimento por escrito.
Apenas no caso de menores de 18 anos, deverá ser assinado pelo pai, mãe ou responsável legal.
97
Anexo 2 - Questionário
REGISTRO N
PROJETO:
Data:
Resposta imune inata na malária por P. vivax e P. falciparum: seu
perfil e sua influência nas infecções e nas respostas imunes adquiridas a
antígenos candidatos a compor uma vacina.
DADOS PESSOAIS
SEXO: F
NOME:
IDADE:
NATURALIDADE:
M
PROCEDÊNCIA:
ENDEREÇO ATUAL:
NÚMERO DE RESIDENTES NO ENDEREÇO ATUAL:
PROFISSÃO:
TEMPO DE RESIDÊNCIA (ANOS):
Área endêmica (anos) :
Rondônia (anos):
Endereço atual:
HISTÓRIA PREGRESSA DE MALÁRIA
NÚMERO DE INFECÇÕES ANTERIORES DE MALÁRIA:
Espécies: P. falciparum
P. vivax
P. malariae
Nenhuma
Não lembra
P. malariae
Nenhuma
Não lembra
P. malariae
Nenhuma
Não lembra
NÚMERO DE INFECÇÕES ESSE ANO (2007):
Espécies: P. falciparum
P. vivax
DATA DA ÚLTIMA INFECÇÃO:
Espécies: P. falciparum
P. vivax
LOCAL PROVAVEL DE INFECÇÃO:
98
FEZ O TRATAMENTO COMPLETO?: Sim Não
JA FOI HOSPITALIZADO COM MALÁRIA: Sim
MALÁRIA GRAVE NA FAMÍLIA: Sim
Não
Data:
Não
Data:
OBS:
TEM ALGUEM NA FAMÍLIA COM MALÁRIA OU TEVE MALÁRIA
RECENTEMENTE? Sim Não
Data:
EXPOSIÇÃO A INFECÇÃO MALÁRICA
LOCALIZAÇÃO DA CASA
Cidade
Periferia
Floresta
Coleção d’água
Nenhuma
TIPO DE CASA (PROTEÇÃO EM RELAÇÃO AO CONTATO COM
MOSQUITO)
Boa
Parcial
Nenhuma
ATIVIDADES AO AMANHECER:
ATIVIDADES AO ANOITECER:
SABE COMO A MALÁRIA É TRANSMITIDA?
Sim
Não  Foi informado  Foi informado, mas não acredita
COMO?:
USO DE MEDIDAS PROFILÁTICAS
Mosquiteiro
Inseticida antimaláricos Outras
Data da última borrifação de inseticida (FNS):
99
Nenhuma
INFECÇÃO ATUAL
SINTOMAS
Febre Cefaléia Calafrios Náusea Mialgia Nenhum
DATA DO INICIO DOS SINTOMAS:
DIAGNÓSTICO:  P. falciparum
P. vivax
P. malariae
PARASITEMIA:
LOCAL PROVÁVEL DE INFECÇÃO:
RECEBEU TRANSFUSÃO DE SANGUE?: Sim Não
É DOADOR DE SANGUE?: Sim Não
Data:
Data da última doação:
COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO
GOTA ESPESSA ESFREGAÇO PLASMA
CÉLULAS
HLA
PARASITAS
OBS:
100
Nenhuma
Anexo 3 – Resumos apresentados em Congresso
XXI Congresso Brasileiro de Parasitologia e II Encontro de Parasitologia do
MERCOSUL

Título:
ALTERAÇÕES
HEMATOLÓGICAS
EM
INDIVÍDUOS
NATURALMENTE INFECTADOS POR Plasmodium spp. EM ÁREA ENDÊMICA
DE MALÁRIA (PV- RO).
Código: 1271
Autores: Carolina R. de Oliveira, Josué da C. L. Junior, Fabio Storer, Fátima Santos,
Luciene de A. Silva, Arlete da G. Baldez, Joseli de O. Ferreira, Dalma M. Banic

Título: PREVALÊNCIA DE PARASITOS INTESTINAIS EM INDIVÍDUOS COM
MALÁRIA RESIDENTES EM PORTO VELHO (RO).
Código: 1276
Autores: Carolina R. de Oliveira , Josué da C. L. Junior, Fabio Storer, Fátima Santos,
Luciene de A. Silva, Arlete da G. Baldez, Dalma M. Banic, Joseli de O. Ferreira
101
ALTERAÇÕES
HEMATOLÓGICAS
EM
INDIVÍDUOS
NATURALMENTE
INFECTADOS POR Plasmodium spp EM ÁREA ENDÊMICA DE MALÁRIA (PVRO).
Carolina R. de Oliveira1, Josué da C. L. Junior1, Fabio Storer2, Fátima Santos2,
Luciene de A. Silva1, Arlete da G. Baldez3, Joseli de O. Ferreira1, Dalma M. Banic1.
1. IOC/FIOCRUZ, 2. LACEN, 3. FNS
email: [email protected]
A malária é uma doença causada por hematozoários do gênero Plasmodium e está
entre as doenças parasitárias mais prevalentes nos países tropicais. A malária
causa diversas alterações hematológicas e o presente trabalho destina-se a
investigar essas alterações em pacientes naturalmente infectados (PV –RO) por P.
vivax (n=48) ou P. falciparum (n=24) na fase aguda (Dia do diagnóstico antes do
inicio do tratamento = D0) e na convalescência (Dia 15 após o início do tratamento =
D15). Indivíduos de mesma localidade (n=21) com diagnóstico negativo para
malária formaram o grupo controle (C). A parasitemia foi avaliada por microscopia.
O hemograma completo e contagem de plaquetas foram realizados através do
aparelho pentra-ABX. Nos pacientes com malária, foi observado uma redução no
número de hemácias e nos valores do hematócrito comparando D0 com D15
(4,84,5 x106/mm3; 41,69,7%; respectivamente, P<0,05). No D0 os pacientes
apresentaram trombocitopenia quando comparados com D15 (plaquetas/mm 3:
D0=146.283, D15=289.025, C=275.278-C; D0 X C e D0 X D15, P<0,05). No D0
tambem foi observada leucopenia (5.164 leucócitos (leu)/mm3, P<0,05) embora os
valores de leu dos pacientes no D15 estarem abaixo dos valores do grupo C (D15=
6.011 leu/mm3 X C= 6.717 leu/mm3, P<0,05). Quando comparamos os valores de
eosinófilos (eos) dos pacientes em relação ao grupo C (281,1 eos/mm3) observamos
uma redução no D0 (172,5 eos/mm3, P<0,05) e um aumento no D15 (394,6 eos/mm3,
P<0,05; D0 X D15, P<0,05). A neutropenia não foi observada. Entretanto, em
relação ao grupo C (3.844 neutrófilos (neu)/mm3) e aos pacientes no D0 (3.498
neu/mm3) os valores de neu dos pacientes no D15 apresentavam-se reduzidos
(3.125 neu/mm3, P<0.05). Nos pacientes há aumento transitório de bastões (bast)
3
em D0 (235,4 bast/mm ) com retorno a valores próximos ao grupo C (16,56
102
bast/mm3, P<0,05) no D15 (15,59 bast/mm3, P<0,05). Não foi observada linfopenia.
Entretanto, em relação ao grupo C (2.201 linfócitos (linf)/mm3) e aos pacientes no
D15 (2.139 linf/mm3).os valores de linf dos pacientes no D0 apresentavam-se
reduzidos (1.115 linf/mm3, P<0.05). Conclui-se que a malária acarreta alterações no
quadro hematológico dos indivíduos de PV-RO, tanto na fase aguda quanto na de
convalescência. Ressalta-se a importância do estudo destes parâmetros para um
melhor entendimento da patogênese da doença, desenvolvimento de novos
métodos de diagnóstico, profilaxia e tratamento. Apoio: DECIT/CNPq.
103
PREVALÊNCIA DE PARASITOS INTESTINAIS EM INDIVÍDUOS COM MALÁRIA
RESIDENTES EM PORTO VELHO (RO).
Carolina R. de Oliveira1, Josué da C. L. Junior1, Fabio Storer2, Fátima Santos2,
Luciene de A. Silva1, Arlete da G. Baldez3, Dalma M. Banic1, Joseli de O. Ferreira1.
1. IOC/FIOCRUZ, 2. LACEN, 3. FNS
email: [email protected]
A co-infecção humana por múltiplas espécies de parasitos na natureza são
comumente observados e recentemente estudos epidemiológicos indicam que essa
interação representa um desafio na ecologia de parasitos e na saúde humana.
Estes agentes que coexistem acarretam modificações no status imunológico do
indivíduo, podendo um patógeno gerar tanto uma resposta protetora quanto
antagonista frente ao outro organismo. Sendo assim, é de suma importância
verificar a prevalência de co-infecções e demonstrar se ocorre ou não alterações de
resposta imune nas co-infecções e no quadro clínico da doença. O objetivo do
estudo foi verificar a concomitância de parasitoses intestinais em pacientes com
malária aguda em área endêmica de malaria de Porto velho (RO). Os pacientes
foram avaliados clinicamente e sangue periférico foi coletado para realização de
diagnóstico microscópico da malária. Exame coproparasitológico (método de Lutz)
foi realizado nas amostras. Participaram do estudo 47 indivíduos, sendo 34 com
infecção por P. vivax, 12 com P. falciparum e um com infecção mista. Protozoários
intestinais foram diagnosticados em 93,6% dos pacientes maláricos e infecções por
helmintos em um percentual reduzido (6,4%), Quanto as infecções com protozoários
intestinais percebe-se que há uma maior incidência de co-infecção por Giardia
lamblia (72,7%), seguida por Endolimax nana (54,5%). Das espécies diagnosticadas
as que apresentaram menor prevalência foram Entamoeba histolitica (2,3%) e
Entamoeba coli (27,3%). Dentre os indivíduos com exame positivo para
protozoários, 29,5% apresentava apenas G. lamblia, 18,2% apresentava apenas E.
nana, e 2,3% apresentava apenas E. coli. Infecção mista por G. lamblia e E. nana foi
observada em 25% destes indivíduos. Outras infecções mistas encontradas foram
G. lamblia e E. coli (13,6%), E. coli e E. nana (4,5%). Um voluntário apresentou E.
histolitica, E. coli e E. nana e dois G. lamblia, E. coli e E. nana simultaneamente.
Analisando a co-infecção com helmintos, um paciente apresentou Hymenolepis
104
nana, um H. diminuta e outro ancilostomídeos. Face ao exposto torna-se claro a
importância da consideração de co-infecções em estudos de avaliação de resposta
imunológica em pacientes maláricos, visto que grande percentual da população
apresenta outros patógenos que poderão influenciar a resposta imune ao
Plasmodium. Estudos para avaliar a resposta imune ao Plasmodium nestes
pacientes
co-infectados
com
parasitas
intestinais
DECIT/CNPq.
105
estão
em
andamento.
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